KR20240099302A - c-Met에 결합하는 항체 및 이의 용도 - Google Patents
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- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
Abstract
본 발명은 c-Met에 결합하는 항체 및 이의 용도에 관한 것이며; 구체적으로, 단일 가변 도메인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 c-Met에 결합하는 융합 단백질뿐만 아니라 상기 생성물을 암호화하는 핵산, 핵산을 포함하는 벡터, 벡터를 포함하는 세포, 및 이를 포함하는 약제학적 조성물이 제공되며; 또한 이의 검출, 약제학적 및 치료학적 용도가 제공된다.
Description
본 개시 내용은 분자 생물학의 기술 분야에 관한 것이며, 특히 c-Met에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 이의 용도에 관한 것이다.
c-중간엽-상피 전이 인자(c-Met)는 수용체 티로신 키나아제 중 하나이며, 50 kDa 세포외 사슬(α 사슬)과 145 kDa 막관통 사슬(β 사슬)을 연결하여 형성된 대략 190 kDa의 이종이량체이다. 막관통 사슬(β 사슬)은 SEMA 도메인(sema 상동성 영역, SEMA), PSI 도메인(플렉신 세마포린-인테그린, PSI), 4개의 면역글로불린 유사 반복 도메인(플렉신 및 전사 인자의 면역글로불린 유사 영역, IPT), 막관통 도메인, 막근접 도메인(juxtamembrane domain, JM), 티로신 키나아제 도메인(tyrosine kinase domain, TK) 및 카르복시-말단 꼬리 영역(carboxyl terminal, CT)을 포함한다. c-Met는 세포 표면에 발현되는 수용체로서, SEMA 도메인은 리간드 결합에 중요한 요소 중 하나이며, 이의 리간드인 간세포 성장 인자(HGF)의 결합 부위로 간주된다. HGF는 중간엽 세포, 섬유아세포, 평활근 세포에 의해 합성되며, 측분비(paracrine) 메커니즘을 통해 HGF/c-Met 신호를 활성화시켜 생물학적 기능을 발휘한다.
다양한 종양에서 c-Met 및 HGF의 과발현과 HGF 및 c-Met에 의해 형성된 측분비 및 자가분비 양성 피드백 루프로 인해 HGF/c-Met 신호전달 경로가 비정상적으로 활성화되고 종양 세포의 성장, 침습, 이동 및 혈관 신생이 촉진된다. c-Met 유전자의 비정상적인 발현은 뇌암, 유방암, 대장암, 위암, 두경부암, 폐암 및 간암과 같은 많은 암 유형에서 존재한다. c-Met에 결합하는 항체와 같은 면역치료제는 HGF와 c-Met의 결합을 차단할 수 있다. c-Met이 잠재적인 치료 표적이 됨에 따라 일부 c-Met 표적 항체가 개발되었지만 여전히 제한적이다. 더 많은 사용 가능한 옵션이 필요하다.
4개 사슬 구조의 기존 IgG1 외에도, 낙타과 동물에서 IgG 항체에는 경쇄가 없는 자연 발생 IgG2 및 IgG3 중쇄 항체(HcAb)도 포함된다. 중쇄 항체의 단일 가변 영역 도메인(VHH)은 항원에 특이적으로 결합할 수 있으며 항원에 대한 친화도가 상대적으로 높다. 이들의 고유성을 기반으로, 항체 또는 항원-결합 단편의 일부로서 사용되는 VHH 도메인은 기존의 항체 단편(예컨대 scFv 및 Fab)에 비해 더 중요한 이점을 갖는데: 예를 들어, 높은 친화성을 갖는 항원에 특이적으로 결합하기 위해서는 단일 도메인만 필요하고; 그들은 다가 및 다중특이적 형식으로 쉽게 변환될 수 있고; VHH 도메인은 고도로 용해성이며 응집되는 경향이 없고; VHH 분자는 작기 때문에 상대적으로 높은 조직 투과성을 가지고; VHH는 경쇄와 쌍을 이룰 필요가 없으며, 따라서 이중특이적 또는 다중특이적 항체 형성에 관한 경쇄 및 중쇄 불일치 문제가 없다.
본 개시 내용은 단일 가변 도메인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 c-Met에 결합하는 융합 단백질을 제공한다. 또한, 본 개시 내용은 제공된 단일 가변 도메인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 융합 단백질을 암호화하는 핵산, 벡터, 세포, 제조 방법, 조성물 및 용도를 제공한다.
일 양태에서, 본 개시 내용은 c-Met에 결합하는 단리된 단일 가변 도메인을 제공하며, 여기서 단일 가변 도메인은 서열번호: 24, 26, 28, 30, 32, 또는 34에 제시된 아미노산 서열에서 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다.
일 양태에서, 본 개시 내용은 c-Met에 결합하는 단리된 단일 가변 도메인을 제공하며, 여기서 단일 가변 도메인은 다음의 상보성 결정 영역을 포함한다: (a) 서열번호 5, 8, 11, 14, 17, 또는 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열번호 6, 9, 12, 15, 18 또는 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열번호 7, 10, 13, 16, 19 또는 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3.
일 양태에서, 본 개시 내용은 c-Met에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단일 가변 도메인을 포함하며, 여기서 단일 가변 도메인은 서열번호: 24, 26, 28. 30, 32 또는 34에 제시된 아미노산 서열에서 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다.
일 양태에서, 본 개시 내용은 c-Met에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단일 가변 도메인을 포함하며, 여기서 단일 가변 도메인은 다음의 상보성 결정 영역을 포함한다: (a) 서열번호: 5, 8, 11, 14, 17 또는 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열번호: 6, 9, 12, 15, 18 또는 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열번호: 7, 10, 13, 16, 19 또는 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3.
일 양태에서, 본 개시 내용은 c-Met에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단일 가변 도메인을 포함하며, 여기서 단일 가변 도메인은 본 개시 내용의 단일 가변 도메인 중 어느 하나와 동일한 에피토프에 결합한다.
일 양태에서, 본 개시 내용은 c-Met에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단일 가변 도메인을 포함하며, 여기서 단일 가변 도메인은 본 개시 내용의 단일 가변 도메인 중 어느 하나와 c-Met에 결합하기 위해 경쟁한다.
일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 VHH, 바람직하게는 낙타류 VHH 또는 인간화 VHH이다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 키메라 또는 인간화된다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 낙타과의 동물로부터 유래되거나 인간화된다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG의 Fc를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 IgG의 Fc, 바람직하게는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 Fc를 포함한다.
일 양태에서, 본 개시 내용은 본 개시 내용의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
일 양태에서, 본 개시 내용은 본 개시 내용의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물 제공한다.
일 양태에서, 본 개시 내용은 본 개시 내용의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다.
일 양태에서, 본 개시 내용은 본 개시 내용의 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
일 양태에서, 본 개시 내용은 본 개시 내용의 단리된 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
일 양태에서, 본 개시 내용은 본 개시 내용의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 발현된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 단리하는 단계를 포함하는, 본 개시 내용의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 벡터는 발현 벡터이다.
또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 종양을 갖는 대상체를 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한 본 개시 내용의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 종양을 갖는 대상체를 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한 본 개시 내용의 융합 단백질의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 종양을 갖는 대상체를 치료하기 위한 약제를 제조를 위한 본 개시 내용의 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 샘플을 본 개시 내용의 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계 및 결합 복합체를 검출 또는 측정하는 단계를 포함하는, 샘플에서 c-Met를 검출 또는 측정하기 위한 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 유효량의 본 개시 내용의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 융합 단백질, 또는 약제학적 조성물을 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 세포에서 c-Met 신호전달을 억제, 감소 또는 차단하기 위한 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 유효량의 본 개시 내용의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 융합 단백질, 또는 약제학적 조성물을 종양 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 종양 세포의 성장을 억제하거나 종양 세포를 사멸시키기 위한 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 치료학적 유효량의 본 개시 내용의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 융합 단백질, 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 종양을 갖는 대상체를 치료하기 위한 방법을 제공한다.
도 1a는 H1993 세포에 대한 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체의 결합에 대한 유세포 분석 검정(flow cytometry assay)의 곡선을 나타낸다.
도 1b는 MKN45 세포에 대한 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체의 결합에 대한 유세포 분석 검정의 곡선을 나타낸다.
도 1c는 KP4 세포에 대한 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체의 결합에 대한 유세포 분석 검정의 곡선을 나타낸다.
도 1d는 4MBr-5 세포에 대한 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체의 결합에 대한 유세포 분석 검정의 곡선을 나타낸다.
도 2a는 c-Met에 대한 HGF의 결합에 대한 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체의 차단 효과에 대한 경쟁적 ELISA 검정 결과를 나타낸다.
도 2b는 c-Met에 대한 HGFβ의 결합에 대한 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체의 차단 효과에 대한 경쟁적 ELISA 검정 결과를 나타낸다.
도 3은 H441 세포에서 HGF에 의해 자극된 c-Met 인산화에 대한 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체의 억제 효과의 검정 결과를 나타낸다.
도 4는 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체에 의한 KP4 세포 증식 억제에 대한 CCK8 검정 결과를 나타낸다.
도 1b는 MKN45 세포에 대한 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체의 결합에 대한 유세포 분석 검정의 곡선을 나타낸다.
도 1c는 KP4 세포에 대한 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체의 결합에 대한 유세포 분석 검정의 곡선을 나타낸다.
도 1d는 4MBr-5 세포에 대한 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체의 결합에 대한 유세포 분석 검정의 곡선을 나타낸다.
도 2a는 c-Met에 대한 HGF의 결합에 대한 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체의 차단 효과에 대한 경쟁적 ELISA 검정 결과를 나타낸다.
도 2b는 c-Met에 대한 HGFβ의 결합에 대한 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체의 차단 효과에 대한 경쟁적 ELISA 검정 결과를 나타낸다.
도 3은 H441 세포에서 HGF에 의해 자극된 c-Met 인산화에 대한 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체의 억제 효과의 검정 결과를 나타낸다.
도 4는 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체에 의한 KP4 세포 증식 억제에 대한 CCK8 검정 결과를 나타낸다.
정의
달리 명시되지 않는 한, 본 개시 내용에서 사용되는 다음 용어들은 다음과 같은 의미를 가질 것이다. 특정 용어는, 달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 모호하거나 불분명한 것으로 간주되어서는 안 되며, 당해 기술분야에서 그 통상적인 의미에 따라 해석되어야 한다.
"항체"라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며, 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 단일클론 항체, 다클론 항체 및 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체 또는 삼중특이적 항체)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 항체 구조를 포함한다.
"항원-결합 단편"이라는 용어는 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv, Fd, Fd', a 단일 가변 도메인(예를 들어, VHH), 및 당업계에 알려진 다른 항체 단편을 포함하는, 전장 항체의 항원-결합 기능을 보유하는 단편 또는 상기 단편에 기초하여 당업계에 알려진 임의의 변형에 의해 변형된 단편을 지칭한다.
"가변 도메인" 또는 "가변 영역"이라는 용어는 항원에 대한 항체의 결합에 관여하는 항체의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 각 가변 도메인은 본질적으로 4개의 프레임워크 영역과 3개의 상보성 결정 영역으로 구성된다. 4개의 "프레임워크 영역"은 당업계 및 본원에서 "프레임워크 영역 1" 또는 "FR1", "프레임워크 영역 2" 또는 "FR2", "프레임워크 영역 3" 또는 "FR3", 및 "프레임워크 영역 4" 또는 "FR4"로 지칭된다. 프레임워크 영역은 당업계 및 본원에서 "상보성 결정 영역 1" 또는 "CDR1", "상보성 결정 영역 2" 또는 "CDR2", 및 "상보성 결정 영역 3" 또는 "CDR3"으로 지칭되는 3개의 상보성 결정 영역 CDR에 의해 분리된다. 따라서, 가변 도메인의 일반적인 구조 또는 서열은 다음과 같이 표시될 수 있다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. 가변 도메인은 항원-결합 부위를 갖는 덕분에 항체에 항원에 대한 특이성을 부여한다.
"단일 가변 도메인"이라는 용어는 다른 가변 도메인과 쌍을 이루지 않고 항원 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 가변 도메인을 갖는 것을 지칭한다. 단일 가변 도메인의 항원 결합 부위는 전형적으로 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)로 형성되며 단일 도메인에 존재한다. 일부 경우에, 단일 가변 도메인은 단일 항원-결합 단위(즉, 본질적으로 단일 가변 도메인으로 구성된 기능적 항원-결합 단위; 이러한 방식으로, 단일 항원-결합 도메인은 다른 가변 도메인과 상호작용하지 않고 기능적 항원-결합 단위를 형성할 수 있음)를 형성할 수 있는 한 중쇄 가변 도메인(예를 들어, VH) 또는 이의 적합한 단편일 수 있다. 단일 가변 도메인의 또 다른 예는 VHH 도메인, VHH 또는 VHH로도 알려진 낙타과의 "VHH 도메인"이다.
"VHH 도메인"이라는 용어는 이들 가변 도메인을 기존의 4개 사슬 항체에 존재하는 중쇄 가변 도메인(본원에서 "VH 도메인" 또는 "VH"로 지칭됨) 및 기존의 4개 사슬 항체에 존재하는 경쇄 가변 도메인(본원에서 "VL 도메인" 또는 "VL"로 지칭됨)과 구별하기 위해 사용된다. VHH 도메인은 추가적인 항원-결합 도메인 없이 에피토프에 특이적으로 결합한다(이는 기존의 4개 사슬 항체의 VH 또는 VL 도메인과 상이하며, 이 경우 에피토프는 VL 및 VH 도메인 둘 모두에 의해 인식된다). VHH 도메인은 단일 도메인으로부터 형성된 작고 안정적이며 효율적인 항원 인식 단위이다.
"프레임워크 영역"(FR) 잔기라는 용어는 본원에 정의된 CDR 잔기 이외의 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다.
"상보성 결정 영역"(CDR)은 "초가변 영역(HVR)"으로도 지칭된다. 천연 4개 사슬 항체는 전형적으로 6개의 CDR을 포함하는데, 3개는 중쇄 가변 영역(중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3)에, 3개는 경쇄 가변 영역(경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3)에 있다. 중쇄 항체 또는 단일 가변 도메인에는 전형적으로 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)이 있다. CDR3은 세 가지 CDR 중 가장 다양하며 항체에 미세한 특이성을 부여하는 데 독특한 역할을 하는 것으로 여겨진다.
CDR을 정의하는 방법에는 현재 여러 가지가 있다. Kabat 방식은 서열 가변성을 기반으로 CDR을 정의하며 가장 일반적으로 사용되는 반면(Elvin A. Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)), Chothia 방식은 구조적 루프의 위치를 기반으로 CDR을 정의한다(Cyrus Chothia, et al., Canonical Structures for the Hypervariable Regions of Immunoglobulins, J. Mol. Biol. 196:901-917(1987)). Kabat 방식과 Chothia 방식 사이의 절충안인 AbM 방식은 Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. "접촉"은 사용 가능한 복합체의 결정 구조 분석을 기반으로 CDR을 정의한다. 그러나, 상이한 방법 및 정의에 기반한 동일한 항체의 가변 영역의 CDR의 경계는 상이할 수 있으며, 즉, 상이한 방법에 의해 정의되는 동일한 항체의 가변 영역의 CDR 서열은 상이할 수 있음에 유의해야 한다. 따라서, 본원에 정의된 특정 CDR 서열로 정의된 항체를 참조하는 경우, 항체의 범위는 또한 다른 임의의 정의(예를 들어, IMGT, Chothia, AbM 정의 중 하나 이상의 조합 등)로 전환되는 CDR 서열에 의해 정의된 항체를 포함한다.
"인간 컨센서스 프레임워크" 또는 "수용체 인간 프레임워크"라는 용어는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열을 선택할 때 가장 빈번하게 발생하는 아미노산 잔기의 프레임워크를 지칭한다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열은 가변 도메인 서열의 서브그룹으로부터 선택된다. 일반적으로, 서열의 서브그룹은 문헌(Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))에 있는 서열이다. 예를 들어 다음을 포함한다: VL의 경우, 서브그룹은 Kabat 등에 의해 기재된 서브그룹 κI, κII, κIII 또는 κIV일 수 있다(상기 기술된 것과 동일한 공급원으로부터). 또한, VH의 경우, 서브그룹은 Kabat 등에 의해 기재된 서브그룹 I, 서브그룹 II 또는 서브그룹 III일 수 있다. 대안적으로, 인간 컨센서스 프레임워크 영역은 상기 기재된 특정 잔기로부터 유도될 수 있으며; 예를 들어, 공여체 프레임워크 영역 서열을 다양한 인간 프레임워크 영역 서열의 세트에 정렬시킴으로써, 공여체 프레임워크 영역에 대한 인간 프레임워크 영역 잔기의 상동성에 따라 인간 프레임워크 잔기가 선택되는 경우, 인간 컨센서스 프레임워크 영역으로부터 "유래된" 수용체 인간 프레임워크는 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 기존의 아미노산 서열 변이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 기존의 아미노산 변화의 수는 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 또는 2 이하이다.
"Fc 도메인" 또는 "Fc"라는 용어는 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 및 변이체 Fc를 포함한다. Fc의 C-말단 라이신(EU 번호 체계에 따른 Lys447)이 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있다.
EC50이라는 용어는 특정 화합물(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편) 분자의 최대 반응의 50%인 유효 농도를 지칭한다. "IC50"이라는 용어는 특정 화합물(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편) 분자의 최대 반응의 50%인 억제 농도를 지칭한다. EC50 및 IC50 둘 모두는 ELISA 또는 FACS 검정 또는 당업계에 알려진 임의의 다른 방법에 의해 측정될 수 있다.
"Ka" 또는 "결합 속도 상수"라는 용어는 항원에 결합하여 복합체를 형성하는 특정 화합물(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편) 분자의 결합 속도 상수를 지칭한다. 용어 "Kd" 또는 "해리 속도 상수"는 복합체로부터 특정 화합물(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편) 분자의 해리의 해리 속도 상수를 지칭한다. "KD" 또는 "평형 해리 상수"라는 용어는 적정 측정에서 평형 상태에서 얻거나 해리 속도 상수(Kd)를 결합 속도 상수(Ka)로 나누어 얻은 값을 지칭한다. 특정 화합물 분자와 항원 사이의 결합 친화도는 Ka, Kd, 및 KD를 사용하여 표현된다. Ka, Kd 및 KD의 값을 결정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
"약제학적으로 허용되는"이라는 용어는 본원에 기재된 화합물의 생물학적 활성 또는 특성을 제거하지 않는 담체 또는 희석제와 같은 물질을 지칭한다. 그러한 물질은 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하거나 그것이 함유된 조성물의 성분 중 어느 것과도 유해한 방식으로 상호 작용하지 않고 개체에게 투여된다.
"약제학적으로 허용되는 담체"라는 용어는 당업자에게 잘 알려진 임의의 모든 용매, 분산 매체, 코팅 재료, 계면활성제, 산화방지제, 방부제(예를 들어, 항균제 및 항진균제), 동장화제, 흡수지연제, 염, 보존제, 약물안정제, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미료, 향미제, 염료 등 및 이들의 조합물을 포함한다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329). 유효 성분과 양립할 수 없는 한, 치료학적 또는 약제학적 조성물에 임의의 통상적인 담체를 사용하는 것이 고려된다.
"치료하는" 또는 "치료"라는 용어는 치료받은 개체에서 질환의 자연 경과를 변경하려는 시도를 지칭하며, 예방을 위해 또는 임상 병리학 과정 동안 수행되는 임상적 개입일 수 있다. 원하는 치료 효과에는 질환의 발생 또는 재발 예방, 증상 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적인 병리학적 결과 감소, 전이 예방, 질환 진행 속도 둔화, 질환 상태 개선 또는 완화, 및 예후 퇴행 또는 개선이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료학적 유효량"이라는 용어는 대상체에게 치료적 이득을 제공하기 위해 필요한 화합물, 약제학적 조성물, 또는 약제학적 조합의 양을 지칭한다.
"대상체"라는 용어는 인간 또는 인간이 아닌 동물을 포함한다. "비-인간 동물"이라는 용어는 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물 및 비포유동물, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류 및 파충류를 포함한다. 바람직하게는, 본 개시 내용에 따른 대상체는 인간이다. "환자"와 "대상체"라는 용어는 달리 명시되지 않는 한 상호교환적으로 사용된다.
"특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합한다"라는 용어는 결합이 항원에 대해 선택적이고, 바람직하지 않거나 비특이적인 상호작용과 구별될 수 있음을 의미한다. 특정 항원 결정기에 대한 특정 화합물(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편) 분자의 결합 능력은 효소-결합 면역흡착 검정(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA) 또는 당업자에게 친숙한 다른 기술, 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명(표면 플라즈몬 공명: SPR) 기술(Biacore 기기에 대한 분석)에 의해 측정될 수 있다.
"단리된"이라는 용어는 표적 화합물, 예컨대 항체 또는 이의 항원-결합 단편, VHH, 또는 핵산이 이의 자연 환경으로부터 단리되었음을 의미한다.
서열 "동일성"이라는 용어는 일관성으로도 알려져 있다. 두 서열 사이의 동일성 퍼센트는 서열이 공유하는 동일한 위치의 함수이며(즉, %동일성 = 동일한 위치 수/위치의 총수 × 100), 여기서 두 서열의 최적 정렬을 생성하기 위해 도입해야 하는 간격의 수와 각 간격의 길이를 고려해야 한다. 다음의 비제한적인 예에 나타낸 바와 같이, 서열의 비교 및 두 서열 사이의 동일성 퍼센트 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 두 아미노산 서열 사이의 동일성 퍼센트는 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합되고 갭 길이 페널티가 12이고 갭 페널티가 4인 PAM120 잔류 중량 테이블을 사용하는 E. Meyers 및 W. Miller의 알고리즘(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17(1988))을 사용하여 결정할 수 있다. 또한, 두 아미노산 서열의 동일성 퍼센트는 GCG 소프트웨어 패키지(www.gcg.com에서 이용 가능함)의 GAP 프로그램에 통합되고 갭 가중치가 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4이고 길이 가중치가 1, 2, 3, 4, 5 또는 6인 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스를 사용하는 Needleman 및 Wunsch(J. Mol. Biol., 4844453(1970))의 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "약"은 특정 값에 대해 당업자에 의해 결정된 허용 가능한 오차 범위 내에 있음을 의미하며, 이는 값이 측정되거나 결정되는 방법, 즉 측정 시스템에 의한 제한에 부분적으로 좌우될 것이다. 예를 들어, "약"은 당업계에서 실행되는 바와 같이, 1 표준 편차 또는 1 초과의 표준 편차 이내에 있음을 의미할 수 있다. 대안적으로, 약은 최대 20%(즉, ± 20%)의 범위를 의미할 수 있으며, 예를 들어, ± 10%, ± 5%, ± 2%, ± 1% 또는 ± 0.5%로 주어진 특정 수치 범위 내에서 변동한다. 더욱이, 특히 생물학적 시스템 또는 방법과 관련하여, 상기 용어는 특정 값의 최대 10배 또는 최대 5배인 것을 의미할 수 있다. 본 개시 내용 또는 청구범위에 특정 값이 주어지는 경우, 달리 명시되지 않는 한, "약"은 해당 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 내에 있는 것을 의미하는 것으로 간주되어야 한다.
단백질의 아미노산 잔기는 다음과 같이 축약된다: 페닐알라닌은 Phe 또는 F이고; 류신은 Leu 또는 L이고; 이소류신은 Ile 또는 I이고; 메티오닌은 Met 또는 M이고; 발린은 Val 또는 V이고; 세린은 Ser 또는 S이고; 프롤린은 Pro 또는 P이고; 트레오닌은 Thr 또는 T이고; 알라닌은 Ala 또는 A이고; 티로신은 Tyr 또는 Y이고; 히스티딘은 His 또는 H이고; 글루타민은 Gln 또는 Q이고; 아스파라긴은 Asn 또는 N이고; 라이신은 Lys 또는 K이고; 아스파르트산은 Asp 또는 D이고; 글루탐산은 Glu 또는 E이고; 시스테인은 Cys 또는 C이고; 트립토판은 Trp 또는 W이고; 아르기닌은 Arg 또는 R이고; 글리신은 Gly 또는 G이다.
본 개시 내용의 다양한 양태는 다음 섹션에서 더 상세히 설명될 것이다.
단일 가변 도메인
본 개시 내용은 c-Met(예컨대 인간 c-Met)에 결합하는 단리된 단일 가변 도메인을 제공한다. 단일 가변 도메인은 c-Met 표적화 약물의 개발 또는 약물 제조를 위한 더 많은 이용 가능한 옵션을 제공한다. 단일 가변 도메인은 인간 c-Met에 대한 우수한 친화성, c-Met에 대한 리간드 HGF 또는 이의 β 사슬 결합을 차단하는 능력, 및 HGF 자극에 의해 야기되는 c-Met 인산화의 억제 중 하나 이상과 같은 다수의 바람직한 치료 특성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 서열번호: 24에 제시된 가변 영역 서열의 1개, 2개 또는 3개 모두의 CDR을 포함하는 c-Met에 결합한다. 구체적인 일 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 서열번호: 24에 제시된 가변 영역 서열의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 c-Met에 결합한다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 서열번호: 26에 제시된 가변 영역 서열의 1개, 2개 또는 3개 모두의 CDR을 포함하는 c-Met에 결합한다. 구체적인 일 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 서열번호: 26에 제시된 가변 영역 서열의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 c-Met에 결합한다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 서열번호: 28에 제시된 가변 영역 서열의 1개, 2개 또는 3개 모두의 CDR을 포함하는 c-Met에 결합한다. 구체적인 일 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 서열번호: 28에 제시된 가변 영역 서열의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 c-Met에 결합한다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 서열번호: 30에 제시된 가변 영역 서열의 1개, 2개 또는 3개 모두의 CDR을 포함하는 c-Met에 결합한다. 구체적인 일 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 서열번호: 30에 제시된 가변 영역 서열의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 c-Met에 결합한다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 서열번호: 32에 제시된 가변 영역 서열의 1개, 2개 또는 3개 모두의 CDR을 포함하는 c-Met에 결합한다. 구체적인 일 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 서열번호: 32에 제시된 가변 영역 서열의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 c-Met에 결합한다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 서열번호: 34에 제시된 가변 영역 서열의 1개, 2개 또는 3개 모두의 CDR을 포함하는 c-Met에 결합한다. 구체적인 일 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 서열번호: 34에 제시된 가변 영역 서열의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 c-Met에 결합한다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 낙타과의 동물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 인간화된다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 수용체 인간 프레임워크를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 c-Met에 결합하며, 이는 하기로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 CDR을 포함한다: (a) 서열번호: 5, 8, 11, 14, 17, 또는 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열번호: 6, 9, 12, 15, 18 또는 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열번호: 7, 10, 13, 16, 19 또는 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 c-Met에 결합하고, 이는 다음의 상보성 결정 영역을 포함한다: (a) 서열번호: 5, 8, 11, 14, 17, 또는 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열번호: 6, 9, 12, 15, 18 또는 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열번호: 7, 10, 13, 16, 19 또는 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 낙타과의 동물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 인간화된다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 수용체 인간 프레임워크를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 c-Met에 결합하고, 이는 서열번호: 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다, 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 c-Met에 결합하고, 이는 서열번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 c-Met에 결합하고, 이는 서열번호: 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 c-Met에 결합하고, 이는 서열번호: 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 c-Met에 결합하고, 이는 서열번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 c-Met에 결합하고, 이는 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1. 서열번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2. 및 서열번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 낙타과의 동물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 인간화된다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 수용체 인간 프레임워크를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 c-Met에 결합하고, 이는 서열번호: 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 c-Met에 결합하고, 이는 서열번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1. 서열번호: 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2. 및 서열번호: 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 c-Met에 결합하고, 이는 서열번호: 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1. 서열번호: 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2. 및 서열번호: 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 c-Met에 결합하고, 이는 서열번호: 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1. 서열번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2. 및 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 c-Met에 결합하고, 이는 서열번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1. 서열번호: 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2. 및 서열번호: 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 c-Met에 결합하고, 이는 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1. 서열번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2. 및 서열번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 낙타과의 동물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 인간화된다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 수용체 인간 프레임워크를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 c-Met에 결합하고, 이는 서열번호: 24, 26, 28, 30, 32, 또는 34에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 선택적으로, 단일 가변 도메인은 상기 기재된 특정 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 c-Met에 결합하고, 이는 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 단일 가변 도메인은 서열번호: 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 c-Met에 결합하고, 이는 서열번호: 26에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 단일 가변 도메인은 서열번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 c-Met에 결합하고, 이는 서열번호: 28에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 단일 가변 도메인은 서열번호: 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 c-Met에 결합하고, 이는 서열번호: 30에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 단일 가변 도메인은 서열번호: 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2. 및 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 c-Met에 결합하고, 이는 서열번호: 32에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 단일 가변 도메인은 서열번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 c-Met에 결합하고, 이는 서열번호: 34에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 단일 가변 도메인은 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1. 서열번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2. 및 서열번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 단일 가변 도메인 아미노산 서열은 참조 서열과 비교하여 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 포함하지만; 서열을 포함하는 단일 가변 도메인은 c-Met에 결합하는 능력을 유지한다. 일부 실시양태에서, 총 1-18, 1-16, 1-14, 1-12, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 또는 1-2개의 아미노산은 서열번호: 24, 26, 28, 30, 32, 및 34로부터 선택된 아미노산 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 일부 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외부 영역에서(즉, FR에서) 발생한다. 일부 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 영역에서, 예를 들어, CDR1, CDR2, 및 CDR3 중 1개, 2개 또는 3개에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 영역 및 비-CDR 영역에서 발생한다. 선택적으로, 단일 가변 도메인은 서열의 변역 후 변형을 포함하여 서열번호: 24, 26, 28, 30, 32, 및 34로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 c-Met에 결합하고, 이는 서열번호: 24, 26, 28, 30, 32, 또는 34에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인(상기 기재된 임의의 실시양태, 예를 들어, 특정 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3을 포함하는 상기 기재된 단일 가변 도메인 포함)은 VHH이다. 일부 구체적인 실시양태에서, VHH는 N-말단에서 C-말단까지 다음 구조를 갖는다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.
일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인(상기 기재된 임의의 실시양태, 예를 들어, 특정 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3을 포함하는 상기 기재된 단일 가변 도메인 포함)은 인간화 VHH이다. 비인간 기원의 VHH는 원래 VHH의 아미노산 서열에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기를 인간의 통상적인 4개 사슬 항체의 VH 도메인에 있는 상응하는 위치에 존재하는 하나 이상의 아미노산 잔기로 대체함으로써 "인간화"될 수 있다. 면역원성을 감소시키기 위해 인간화가 바람직할 수 있다.
일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 c-Met에 결합하고, 이의 아미노산 서열은 서열번호: 24, 26, 28, 30, 32, 또는 34에 제시되어 있다.
본 개시 내용은 또한 본 개시 내용의 단일 가변 도메인 중 어느 하나와 동일한 에피토프에 결합하는 단일 가변 도메인을 제공한다. 일부 구체적인 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 서열번호: 24, 26, 28, 30, 32, 또는 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단일 가변 도메인과 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 동일한 에피토프에 결합하는 단일 가변 도메인은 낙타과의 동물로부터 유래되거나 인간화된다.
동일한 에피토프에 대한 결합에 기초하여, 단일 가변 도메인의 경쟁적 스크리닝은 당업자에게 알려진 통상적인 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 항원에 결합하기 위해 서로 경쟁하는 단일 가변 도메인을 얻기 위해 경쟁 연구를 수행할 수 있다. 따라서, 본 개시 내용은 또한 본 개시 내용에서 설명된 단일 가변 도메인 중 어느 하나와 c-Met에 대한 결합을 위해 경쟁하는 단일 가변 도메인을 제공한다. 일부 구체적인 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 서열번호: 24, 26, 28, 30, 32, 또는 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단일 가변 도메인과 c-Met에 결합하기 위해 경쟁한다. c-Met에 대한 결합은 ELISA, 유세포 분석 또는 표면 플라즈몬 공명(SPR) 검정, 또는 당업계에 알려진 임의의 다른 방법에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, c-Met에 결합하기 위해 경쟁하는 단일 가변 도메인은 낙타과의 동물로부터 유래되거나 인간화된다.
일부 실시양태에서, 상기 기재된 실시양태 중 어느 하나에 따른 단일 가변 도메인은 다음 특성 및 특징 중 하나 또는 여러 개를 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다:
(i) 인간 c-Met 또는/및 원숭이 c-Met에 결합하는 것;
(ii) c-Met에 대한 HGF 또는 이의 β 사슬의 결합을 차단하는 것;
(iii) HGF 자극에 의해 야기된 c-Met 인산화를 억제하는 것;
일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 c-Met에 결합한다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 c-Met에 대한 HGF 또는 이의 β 사슬의 결합을 차단한다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 HGF 자극에 의해 야기되는 c-Met 인산화를 억제한다.
본 개시 내용은 c-Met에 결합하는 일부 예시적인 단일 가변 도메인을 제공한다. 본 개시 내용에 의해 제공된 예시적인 단일 가변 도메인의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)의 아미노산 서열은 아래 표 S1에 제공된다. 예시적인 단일 가변 도메인의 전장 아미노산 서열은 아래 표 S2에 제공된다.
[표 S1] 예시적인 단일 가변 도메인의 CDR 서열
[표 S2] 예시적인 단일 가변 도메인의 전장 서열
항체 또는 이의 항원-결합 단편
본 개시 내용은 c-Met(예컨대 인간 c-Met)에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 본 개시 내용의 적어도 하나의(하나 이상의) 단일 가변 도메인을 포함한다.
본 개시 내용에 의해 제공되는 c-Met에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 c-Met에 대한 우수한 친화성, c-Met에 대한 리간드 HGF 또는 이의 β 사슬의 결합을 차단하는 능력, HGF 자극에 의해 야기되는 c-Met 인산화의 억제, c-Met 발현 수준이 상이한 세포에 대한 우수한 결합 성능 및 종양 세포 사멸 중 하나 이상과 같은 다수의 바람직한 치료 특성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 c-Met에 결합하고, 적어도 하나(하나 이상)의 단일 가변 도메인을 포함하며, 여기서 단일 가변 도메인은 서열번호: 24에 제시된 가변 영역 서열의 1개, 2개 또는 3개 모두의 CDR을 포함한다. 구체적인 일 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 c-Met에 결합하고, 적어도 하나(하나 이상)의 단일 가변 도메인을 포함하며, 여기서 단일 가변 도메인은 서열번호: 24에 제시된 가변 영역 서열의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 c-Met에 결합하고, 적어도 하나(하나 이상)의 단일 가변 도메인을 포함하며, 여기서 단일 가변 도메인은 서열번호: 26에 제시된 가변 영역 서열의 1개, 2개 또는 3개 모두의 CDR을 포함한다. 구체적인 일 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 c-Met에 결합하고, 적어도 하나(하나 이상)의 단일 가변 도메인을 포함하며, 여기서 단일 가변 도메인은 서열번호: 26에 제시된 가변 영역 서열의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 c-Met에 결합하고, 적어도 하나(하나 이상)의 단일 가변 도메인을 포함하며, 여기서 단일 가변 도메인은 서열번호: 28에 제시된 가변 영역 서열의 1개, 2개 또는 3개 모두의 CDR을 포함한다. 구체적인 일 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 c-Met에 결합하고, 적어도 하나(하나 이상)의 단일 가변 도메인을 포함하며, 여기서 단일 가변 도메인은 서열번호: 28에 제시된 가변 영역 서열의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 c-Met에 결합하고, 적어도 하나(하나 이상)의 단일 가변 도메인을 포함하며, 여기서 단일 가변 도메인은 서열번호: 30에 제시된 가변 영역 서열의 1개, 2개 또는 3개 모두의 CDR을 포함한다. 구체적인 일 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 c-Met에 결합하고, 적어도 하나(하나 이상)의 단일 가변 도메인을 포함하며, 여기서 단일 가변 도메인은 서열번호: 30에 제시된 가변 영역 서열의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 c-Met에 결합하고, 적어도 하나(하나 이상)의 단일 가변 도메인을 포함하며, 여기서 단일 가변 도메인은 서열번호: 32에 제시된 가변 영역 서열의 1개, 2개 또는 3개 모두의 CDR을 포함한다. 구체적인 일 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 c-Met에 결합하고, 적어도 하나(하나 이상)의 단일 가변 도메인을 포함하며, 여기서 단일 가변 도메인은 서열번호: 32에 제시된 가변 영역 서열의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 c-Met에 결합하고, 적어도 하나(하나 이상)의 단일 가변 도메인을 포함하며, 여기서 단일 가변 도메인은 서열번호: 34에 제시된 가변 영역 서열의 1개, 2개 또는 3개 모두의 CDR을 포함한다. 구체적인 일 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 c-Met에 결합하고, 적어도 하나(하나 이상)의 단일 가변 도메인을 포함하며, 여기서 단일 가변 도메인은 서열번호: 34에 제시된 가변 영역 서열의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 낙타과의 동물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 인간화된다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 수용체 인간 프레임워크를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 c-Met에 결합하고, 적어도 하나(하나 이상)의 단일 가변 도메인을 포함하며, 여기서 단일 가변 도메인은 다음으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 CDR을 포함한다: (a) 서열번호: 5, 8, 11, 14, 17, 또는 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열번호: 6, 9, 12, 15, 18, 또는 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열번호: 7, 10, 13, 16, 19, 또는 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 c-Met에 결합하고, 적어도 하나(하나 이상)의 단일 가변 도메인을 포함하며, 여기서 단일 가변 도메인은 다음의 상보성 결정 영역을 포함한다: (a) 서열번호: 5, 8, 11, 14, 17, 또는 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열번호: 6, 9, 12, 15, 18, 또는 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열번호: 7, 10, 13, 16, 19, 또는 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 낙타과의 동물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 인간화된다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 수용체 인간 프레임워크를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (b) 서열번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (c) 서열번호: 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (d) 서열번호: 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2. 및 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (e) 서열번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 (f) 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1. 서열번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2. 및 서열번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 낙타과의 동물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 인간화된다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 수용체 인간 프레임워크를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 다음을 포함한다: (a) 서열번호: 5에 제시된 아미노산 서열의 CDR1, 서열번호: 6에 제시된 아미노산 서열의 CDR2, 및 서열번호: 7에 제시된 아미노산 서열의 CDR3; (b) 서열번호: 8에 제시된 아미노산 서열의 CDR1. 서열번호: 9에 제시된 아미노산 서열의 CDR2. 및 서열번호: 10에 제시된 아미노산 서열의 CDR3; (c) 서열번호: 11에 제시된 아미노산 서열의 CDR1. 서열번호: 12에 제시된 아미노산 서열의 CDR2. 및 서열번호: 13에 제시된 아미노산 서열의 CDR3; (d) 서열번호: 14에 제시된 아미노산 서열의 CDR1. 서열번호: 15에 제시된 아미노산 서열의 CDR2 및 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열의 CDR3; (e) 서열번호: 17에 제시된 아미노산 서열의 CDR1. 서열번호: 18에 제시된 아미노산 서열의 CDR2 및 서열번호: 19에 제시된 아미노산 서열의 CDR3; 또는 (f) 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열의 CDR1. 서열번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호: 22에 제시된 아미노산 서열의 CDR3. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 낙타과의 동물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 인간화된다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 수용체 인간 프레임워크를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 서열번호: 24, 26, 28, 30, 32, 또는 34에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 서열번호: 24, 26, 28, 30, 32, 또는 34에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 단일 가변 도메인은 상기 기재된 특정 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 단일 가변 도메인은 서열번호: 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 서열번호: 26에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 단일 가변 도메인은 서열번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 서열번호: 28에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 단일 가변 도메인은 서열번호: 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 서열번호: 30에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 단일 가변 도메인은 서열번호: 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2. 및 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 서열번호: 32에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 단일 가변 도메인은 서열번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 서열번호: 34에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 단일 가변 도메인은 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1. 서열번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2. 및 서열번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 단일 가변 도메인 아미노산 서열은 참조 서열과 비교하여 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 포함하지만; 서열을 포함하는 단일 가변 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 c-Met에 결합하는 능력을 유지한다. 일부 실시양태에서, 총 1-18, 1-16, 1-14, 1-12, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 또는 1-2개의 아미노산은 서열번호: 24, 26, 28, 30, 32, 및 34로부터 선택된 아미노산 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 일부 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외부 영역에서(즉, FR에서) 발생한다. 일부 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 영역에서, 예를 들어, CDR1, CDR2, 및 CDR3 중 1개, 2개 또는 3개에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 영역 및 비-CDR 영역에서 발생한다. 선택적으로, 단일 가변 도메인은 서열의 변역 후 변형을 포함하여 서열번호: 24, 26, 28, 30, 32, 및 34로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인은 서열번호: 24, 26, 28, 30, 32, 또는 34에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
항체 또는 이의 항원-결합 단편이 2개 이상의 단일 가변 도메인을 포함하는 경우, 동일하거나 상이한 단일 가변 도메인이 선택될 수 있다. 항체는 단일클론 항체, 다클론 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체 또는 삼중특이적 항체), 또는 당업계에 알려진 다른 구성의 항체일 수 있다. 항원-결합 단편은 단일 가변 도메인일 수 있다. 구체적인 일 실시양태에서, 항체는 단일특이적 항체이다. 구체적인 일 실시양태에서, 항체는 이중특이적 항체이다.
일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인(상기 기재된 임의의 실시양태, 예를 들어, 특정 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3을 포함하는 상기 기재된 단일 가변 도메인 포함)은 VHH이다. 일부 구체적인 실시양태에서, VHH는 N-말단에서 C-말단까지 다음 구조를 갖는다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.
일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인(상기 기재된 임의의 실시양태, 예를 들어, 특정 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3을 포함하는 상기 기재된 단일 가변 도메인 포함)은 인간화 VHH이다. 비인간 기원의 VHH는 원래 VHH의 아미노산 서열에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기를 인간의 통상적인 4개 사슬 항체의 VH 도메인에 있는 상응하는 위치에 존재하는 하나 이상의 아미노산 잔기로 대체함으로써 "인간화"될 수 있다. 면역원성을 감소시키기 위해 인간화가 바람직할 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 낙타과의 동물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 키메라이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG 불변 영역, 바람직하게는 인간 IgG 불변 영역, 보다 바람직하게는 인간 IgG1 불변 영역, 인간 IgG2 불변 영역, 인간 IgG3 불변 영역, 또는 인간 IgG4 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG의 Fc를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 IgG의 Fc를 포함하고; 바람직하게는, Fc는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 Fc이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간화된다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 수용체 인간 프레임워크를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 37, 39, 41, 43, 45, 또는 47에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 37, 39, 41, 43, 45, 또는 47에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 본 개시 내용에 기재된 단일 가변 도메인에 특정 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 37, 39, 41, 43, 45, 또는 47에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 적어도 하나의 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 서열번호: 37, 39, 41, 43, 45, 또는 47에 제시되어 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 2개의 동일한 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 여기서 각각의 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 서열번호: 37, 39, 41, 43, 45, 또는 47에 제시되어 있다.
본 개시 내용은 또한 본 개시 내용의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 중 어느 하나와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 구체적인 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 37, 39, 41, 43, 45, 또는 47에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 동일한 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 낙타과의 동물로부터 유래되거나, 키메라이거나 인간화된다.
동일한 에피토프에 대한 결합에 기초하여, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 경쟁적 스크리닝은 당업자에게 알려진 통상적인 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 항원에 결합하기 위해 서로 경쟁하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 얻기 위해 경쟁 연구를 수행할 수 있다. 따라서, 본 개시 내용은 또한 본 개시 내용에 설명된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 중 어느 하나와 c-Met에 대한 결합을 위해 경쟁하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 구체적인 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 37, 39, 41, 43, 45, 또는 47에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 c-Met에 결합하기 위해 경쟁한다. c-Met에 대한 결합은 ELISA, 유세포 분석 또는 표면 플라즈몬 공명(SPR) 검정, 또는 당업계에 알려진 임의의 다른 방법에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, c-Met에 결합하기 위해 경쟁하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 낙타과의 동물로부터 유래되거나, 키메라이거나 인간화된다.
일부 실시양태에서, 상기 기재된 실시양태 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음 특성 및 특성 중 하나 또는 여러 개를 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다:
(a) 인간 c-Met 또는/및 원숭이 c-Met에 결합하는 것;
(b) c-Met에 대한 HGF 또는 이의 β 사슬의 결합을 차단하는 것;
(c) HGF 자극에 의해 야기된 c-Met 인산화를 억제하는 것;
(d) 종양 세포에 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 효과를 발휘하는 것.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 c-Met, 예를 들어, 원숭이 c-Met 및/또는 인간 c-Met에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 시노몰구스 원숭이 c-Met에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 c-Met에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 c-Met에 대해 다음과 같은 결합 친화도(KD)를 갖는다: 약 1E-11 M 내지 약 1E-07 M, 약 1E-10 M 내지 약 1E-08 M, 또는 약 2.00E-10 M 내지 약 8.25E-09 M의 범위. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 c-Met에 대해 다음과 같은 결합 친화도(KD)를 갖는다: 약 1E-07 M 이하, 약 1E-08 M 이하, 약 8.25E-09 M 이하, 약 1E-09 M 이하, 약 2.00E-10 M 이하, 약 1E-10 M 이하, 또는 약 1E-11 M 이하. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용에 의해 제공되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 결합 친화도 KD는 Biacore에 의해 측정된다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 c-Met에 대한 HGF 또는 이의 β 사슬의 결합을 차단한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 HGF 자극에 의해 야기되는 c-Met 인산화를 억제한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 종양 세포에 ADCC 효과를 발휘한다. 일부 실시양태에서, 종양 세포는 c-Met 발현 종양 세포이다.
본 개시 내용은 예시적인 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 예컨대 단일특이적 항체(키메라 항체 1B-3B11-Fc, 1B-1B6-Fc, 1B-1C7-Fc, 1B-1A8-Fc, 1B-1B2-Fc 및 3B-1C7-Fc 포함)를 제공한다. 단일 가변 도메인은 인간 IgG1과 융합되어 Fc를 통해 동종이량체를 형성한다. 예시적인 항체의 아미노산 서열은 아래 표 S3에 제공된다.
[표 S3] 예시적인 항체의 전장 서열
융합 단백질
본 개시 내용의 단일 가변 도메인, 및 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 임의의 원하는 융합 단백질을 구성하는데 사용될 수 있으며, 이에 따라 c-Met에 대한 표적화된 결합 특성 또는 단일 가변 도메인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 갖는 다른 특성을 융합 단백질에 부여할 수 있다. 따라서, 본 개시 내용은 본 개시 내용의 단일 가변 도메인, 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편 중 적어도 하나(하나 이상)를 포함하는 단리된 융합 단백질을 제공한다.
일부 구체적인 실시양태에서, 융합 단백질은 본 개시 내용의 예시적인 CDR 서열, 단일 가변 도메인 서열, 또는 항체 서열, 예를 들어, 표 S1의 임의의 단일 가변 도메인에 1개, 2개, 또는 3개의 CDR 서열, 표 S2의 임의의 단일 가변 도메인 서열, 또는 표 S3의 임의의 항체 서열을 포함하고; 선택적으로, 융합 단백질은 당업계에 알려진 임의의 변형(예를 들어, 글리코실화 변형 또는 화학적 변형)을 받을 수 있다.
융합 단백질이 2개 이상의 단일 가변 도메인을 포함하는 경우, 동일하거나 상이한 단일 가변 도메인이 선택될 수 있다.
약제학적 조성물
본 개시 내용은 본 개시 내용의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 개시 내용은 또한 본 개시 내용의 융합 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 1B-3B11-Fc, 1B-1B6-Fc, 1B-1C7-Fc, 1B-1A8-Fc, 1B-1B2-Fc, 및 3B-1C7-Fc 항체 중 어느 하나 이상, 및 약제학적으로 허용되는 담체가 약제학적 조성물로 형성된다.
단리된 핵산
본 개시 내용은 본 개시 내용에 기재된 단일 가변 도메인, 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다. 본 개시 내용은 또한 본 개시 내용에 기재된 융합 단백질을 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 단일 가변 도메인, 예컨대 1B-3B11-Fc, 1B-1B6-Fc, 1B-1C7-Fc, 1B-1A8-Fc, 1B-1B2-Fc, 또는 3B-1C7-Fc의 단일 가변 도메인을 암호화한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 예컨대 1B-3B11-Fc, 1B-1B6-Fc, 1B-1C7-Fc, 1B-1A8-Fc, 1B-1B2-Fc, 또는 3B-1C7-Fc를 암호화한다.
예로서, 일부 단일 가변 도메인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 핵산 서열이 서열 목록에 나열되어 있다.
벡터
본 개시 내용은 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 클로닝 벡터이고; 일부 다른 실시양태에서, 벡터는 발현 벡터이다. 발현 벡터는 선택적으로 본 개시 내용에 기재된 단일 가변 도메인, 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 발현할 수 있는 임의의 발현 벡터이다. 발현 벡터는 선택적으로 본 개시 내용에 기재된 융합 단백질을 발현할 수 있는 임의의 발현 벡터이다. 구체적인 예로서, 발현 벡터는 pcDNA3.1이다.
숙주 세포
본 개시 내용은 본 개시 내용에 기재된 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하며, 숙주 세포는 단일 가변 도메인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 클로닝 또는 발현하는데 적합한 숙주 세포이다. 본 개시 내용은 또한 본 개시 내용에 기재된 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하며, 숙주 세포는 융합 단백질을 클로닝 또는 발현하는데 적합한 숙주 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 원핵 세포이다. 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 효모 세포, 포유류 세포, 및 단일 가변 도메인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 융합 단백질을 제조하는데 적합한 다른 세포로부터 선택된다. 포유류 세포는, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(Chinese hamster ovary: CHO) 세포 또는 CHO-S 세포이다.
단일 가변 도메인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 융합 단백질을 제조하는 방법
본 개시 내용은 본 개시 내용의 단일 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계 및 숙주 세포 또는 숙주 세포 배양 배지로부터 단일 가변 도메인을 회수하는 단계를 포함하는, 단일 가변 도메인을 제조하는 방법을 제공한다. 본 개시 내용은 또한 본 개시 내용의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계 및 숙주 세포 또는 숙주 세포 배양 배지로부터 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는 방법을 제공한다. 본 개시 내용은 또한 본 개시 내용의 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계 및 숙주 세포 또는 숙주 세포 배양 배지로부터 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
단일 가변 도메인, 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하기 위해, 단일 가변 도메인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 핵산을 숙주 세포에서의 추가 클로닝 또는/및 발현을 위해 벡터에 삽입한다. 융합 단백질을 생성하기 위해, 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 숙주 세포에서 추가 클로닝 또는/및 발현을 위해 벡터에 삽입한다. 핵산은 유전자 스플라이싱 및 화학적 합성과 같은 당업계에 알려진 다양한 방법을 사용하여 얻을 수 있다.
용도
본 개시 내용은 본 개시 내용의 단일 가변 도메인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 융합 단백질의 용도를 제공한다. 본 개시 내용은 또한 본 개시 내용의 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
본 개시 내용은 종양을 갖는 대상체를 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한 본 개시 내용의 단일 가변 도메인의 용도를 제공한다. 본 개시 내용은 또한 종양을 갖는 대상체를 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한 본 개시 내용의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 용도를 제공한다. 본 개시 내용은 또한 종양을 갖는 대상체를 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 본 개시 내용의 융합 단백질의 용도를 제공한다. 본 개시 내용은 또한 종양을 갖는 대상체를 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 본 개시 내용의 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
본 개시 내용은 샘플을 본 개시 내용의 단일 가변 도메인, 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 샘플과 접촉시키는 단계 및 결합 복합체를 검출 또는 측정하는 단계를 포함하는, 샘플에서 c-Met를 검출 또는 측정하는 방법을 제공한다. 본 개시 내용은 또한 샘플을 본 개시 내용의 융합 단백질과 접촉시키는 단계 및 결합 복합체를 검출 또는 측정하는 단계를 포함하는, 샘플에서 c-Met를 검출 또는 측정하는 방법을 제공한다.
본 개시 내용은 유효량의 본 개시 내용에 기재된 단일 가변 도메인, 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 세포에서 c-Met 신호전달을 억제, 감소 또는 차단하는 방법을 제공한다. 본 개시 내용은 또한 세포에서 c-Met 신호전달을 억제, 감소 또는 차단하기 위한 약제를 제조하기 위한 본 개시 내용의 단일 가변 도메인, 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 용도를 제공한다. 본 개시 내용은 유효량의 본 개시 내용에 기재된 융합 단백질을 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 세포에서 c-Met 신호전달을 억제, 감소 또는 차단하는 방법을 제공한다. 본 개시 내용은 또한 세포에서 c-Met 신호전달을 억제, 감소 또는 차단하기 위한 약제를 제조하기 위한 본 개시 내용의 융합 단백질의 용도를 제공한다. 본 개시 내용은 유효량의 본 개시 내용에 기재된 약제학적 조성물을 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 세포에서 c-Met 신호전달을 억제, 감소 또는 차단하는 방법을 제공한다. 본 개시 내용은 또한 세포에서 c-Met 신호전달을 억제, 감소 또는 차단하기 위한 약제를 제조하기 위한 본 개시 내용의 약제학적 조성물의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 종양 세포이다.
본 개시 내용은 유효량의 본 개시 내용의 단일 가변 도메인, 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 종양 세포에 투여하는 단계를 포함하는 종양 세포 성장을 억제하거나 종양 세포를 사멸시키는 방법을 제공한다. 본 개시 내용은 또한 종양 세포 성장을 억제하거나 종양 세포를 사멸시키기 위한 약제를 제조하기 위한 단일 가변 도메인, 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 용도를 제공한다. 본 개시 내용은 유효량의 본 개시 내용의 융합 단백질을 종양 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 종양 세포 성장을 억제하거나 종양 세포를 사멸시키는 방법을 제공한다. 본 개시 내용은 또한 종양 세포 성장을 억제하거나 종양 세포를 사멸시키기 위한 약제를 제조하기 위한 융합 단백질의 용도를 제공한다. 본 개시 내용은 유효량의 본 개시 내용의 약제학적 조성물을 종양 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 종양 세포 성장을 억제하거나 종양 세포를 사멸시키는 방법을 제공한다. 본 개시 내용은 또한 종양 세포 성장을 억제하거나 종양 세포를 사멸시키기 위한 약제의 제조를 위한 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
본 개시 내용은 치료학적 유효량의 본 개시 내용에 기재된 단일 가변 도메인, 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 종양을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 본 개시 내용은 또한 치료학적 유효량의 본 개시 내용에 기재된 융합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 종양을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 본 개시 내용은 또한 치료학적 유효량의 본 개시 내용에 기재된 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 종양을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 치료가 필요한 대상체에는 질환 또는 병태가 있는 사람뿐만 아니라 질환 또는 병태가 있을 수 있고 질환 또는 병태를 예방, 지연 또는 완화하는 것이 목적인 사람이 포함된다.
일부 실시양태에서, 상술한 종양은 c-Met 발현 종양이다. 일부 실시양태에서, 상기 기재된 종양은 c-Met 과발현 종양이다. 일부 실시양태에서, 상기 기재된 종양은 고형 종양이다. 일부 실시양태에서, 상기 기재된 종양은 비-고형 종양이다. 일부 실시양태에서, 상기 기재된 종양은 뇌암, 두경부암, 폐암, 식도암, 인두암, 비강암, 설암, 구강암, 갑상선암, 피부암, 골암, 연조직 육종, 골수종, 위암, 위식도접합선암종, 유방암, 간암, 신장암, 췌장암, 비장암, 림프종, 흉선암, 방광암, 질암, 고환암, 자궁암, 자궁경부암, 결장직장암, 항문암, 유두암종, 전립선암, 난소암, 상피세포암, 또는 혈액 종양이다. 일부 실시양태에서, 폐암은 비-소세포 폐암이다. 일부 실시양태에서, 뇌암은 교모세포종이다.
본 개시 내용은 다음의 구체적인 실시양태를 추가로 제공하지만, 이는 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 아니다:
실시양태 1. 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 c-Met에 결합하고, 적어도 하나의 단일 가변 도메인을 포함하며, 여기서 단일 가변 도메인은 다음의 상보성 결정 영역을 포함하는 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
a) 서열번호: 5, 8, 11, 14, 17, 또는 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
b) 서열번호: 6, 9, 12, 15, 18, 또는 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
c) 서열번호: 7, 10, 13, 16, 19, 또는 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3.
실시양태 2. 실시양태 1에 있어서, 단일 가변 도메인은 다음을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
a) 서열번호: 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
b) 서열번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
c) 서열번호: 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
d) 서열번호: 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2. 및 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
e) 서열번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는
f) 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1. 서열번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2. 및 서열번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3.
실시양태 3. 실시양태 2에 있어서, 단일 가변 도메인은 서열번호: 24, 26, 28, 30, 32, 또는 34에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
실시양태 4. 실시양태 3에 있어서, 단일 가변 도메인은 서열번호: 24, 26, 28, 30, 32, 또는 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
실시양태 5. 실시양태 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 단일 가변 도메인이 VHH인, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
실시양태 6. 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 키메라 또는 인간화되는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
실시양태 7. 실시양태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 IgG의 Fc, 바람직하게는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 Fc를 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
실시양태 8. 실시양태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 37, 39, 41, 43, 45, 또는 47에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
실시양태 9. 실시양태 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음 특성 및 특징 중 하나 또는 여러 개를 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
실시양태 10. 인간 c-Met 또는/및 원숭이 c-Met에 결합하는 것;
실시양태 11. c-Met에 대한 HGF 또는 이의 β 사슬의 결합을 차단하는 것;
실시양태 12. HGF 자극에 의해 야기된 c-Met 인산화를 억제하는 것;
실시양태 13. 종양 세포에 ADCC 효과를 발휘하는 것.
실시양태 14. 실시양태 1 내지 9 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원- 결합 단편을 포함하는, 융합 단백질.
실시양태 15. 실시양태 1 내지 9 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 실시양태 10에 따른 융합 단백질, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
실시양태 16. 실시양태 1 내지 9 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원- 결합 단편 또는 실시양태 10에 따른 융합 단백질을 암호화하는, 단리된 핵산.
실시양태 17. 실시양태 12에 따라 단리된 핵산을 포함하는, 벡터.
실시양태 18. 실시양태 12에 따른 핵산 또는 실시양태 13에 따른 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
실시양태 19. 실시양태 14에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계 및 발현된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 단리하는 단계를 포함하는, 실시양태 1 내지 9 중 어느 하나에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는 방법으로서, 여기서 벡터는 발현 벡터인, 방법.
실시양태 20. 종양을 갖는 대상체를 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한 실시양태 1 내지 9 중 어느 하나에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도.
실시양태 21. 종양을 갖는 대상체를 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한 실시양태 10에 따른 융합 단백질의 용도.
실시양태 22. 종양을 갖는 대상체를 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한 실시양태 11에 따른 약제학적 조성물의 용도.
실시양태 23. 실시양태 16 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 종양은 뇌암, 두경부암, 폐암, 식도암, 인두암, 비강암, 설암, 구강암, 갑상선암, 피부암, 골암, 연조직 육종, 골수종, 위암, 위식도접합선암종, 유방암, 간암, 신장암, 췌장암, 비장암, 림프종, 흉선암, 방광암, 질암, 고환암, 자궁암, 자궁경부암, 결장직장암, 항문암, 유두암종, 전립선암, 난소암, 상피세포암, 또는 혈액 종양인, 용도.
실시양태 24. 샘플을 실시양태 1 내지 9 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계 및 결합 복합체를 검출 또는 측정하는 단계를 포함하는, 샘플에서 c-Met를 검출 또는 측정하는, 방법.
실시양태 25. 유효량의 실시양태 1 내지 9 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 실시양태 10에 따른 융합 단백질, 또는 실시양태 11에 따른 약제학적 조성물을 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 세포에서 c-Met 신호전달을 억제, 감소 또는 차단하는, 방법,
실시양태 26. 유효량의 실시양태 1 내지 9 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 실시양태 10에 따른 융합 단백질, 또는 실시양태 11에 따른 약제학적 조성물을 종양 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 종양 세포 성장을 억제하거나 종양 세포를 사멸시키는, 방법
실시양태 27. 치료학적 유효량의 실시양태 1 내지 9 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 실시양태 10에 따른 융합 단백질, 또는 실시양태 11에 따른 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 종양을 갖는 대상체를 치료하는, 방법.
실시양태 28. 실시양태 22 또는 23에 있어서, 종양은 뇌암, 두경부암, 폐암, 식도암, 인두암, 비강암, 설암, 구강암, 갑상선암, 피부암, 골암, 연조직 육종, 골수종, 위암, 위식도접합선암종, 유방암, 간암, 신장암, 췌장암, 비장암, 림프종, 흉선암, 방광암, 질암, 고환암, 자궁암, 자궁경부암, 결장직장암, 항문암, 유두암종, 전립선암, 난소암, 상피세포암, 또는 혈액 종양인, 방법.
상기 언급한 발명은 명확한 이해를 목적으로 예시 및 실시예를 제공함으로써 상당히 상세하게 설명되었지만, 첨부된 청구범위의 사상 또는 범위를 벗어나지 않으면서 본 개시 내용에 특정 변경 및 수정이 이루어질 수 있다는 것은 본 개시 내용의 교시에 비추어 당업자에게 명백할 것이다. 다음 실시예는 설명 목적으로만 제공되며 제한하려는 의도는 아니다. 당업자는 실질적으로 유사한 결과를 생성하도록 변경 또는 수정될 수 있는 다양한 중요하지 않은 매개변수를 용이하게 식별할 수 있을 것이다.
실시예 1. 항-c-Met VHH 파지 디스플레이 라이브러리 제조
1.1 동물 면역화
재조합 인간 c-Met-Fc 융합 단백질(SinoBiological, 제품 카탈로그 번호 10692-H02H)을 1:1 부피비로 완전 프로인트 보조제와 혼합하고 유화시켰다. 박트리아 낙타(bactrian camel)를 먼저 피하 다점(multipoint) 주사로 면역화한 다음, 불완전 프로인트 보조제와 1:1의 부피비로 혼합 및 유화시킨 재조합 인간 c-Met-Fc 융합 단백질을 2주 간격으로 부스터로서 면역화하였다. 4차 또는 5차 면역화 후에 혈청을 수집하고, 항-인간 c-Met 항체 역가에 대해 검정하였다. 여러 라운드의 면역화 후, 박트리아 낙타의 말초 혈액을 채취하여 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 단리하였다.
1.2 RNA 추출
총 RNA는 TRIzol™ 시약을 사용하여 PBMC(1.1에서)에서 추출하였다. 추출된 총 RNA의 품질은 1% 아가로스 겔 전기영동에 의해 평가하였다. 정량화는 260 nm 및 280 nm에서 흡광도를 측정하여 수행하였다. OD260 nm/OD280 nm 비율은 1.8에서 2.0 사이여야 한다.
1.3 VHH 증폭
총 RNA는 지침에 따라 cDNA 합성 키트 PrimeScript™ II 1st Strand cDNA 합성 키트(TAKARA, 제품 카탈로그 번호 6210A)를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 낙타 항체의 가변 영역(VHH) 서열을 중첩된 PCR에 의해, 구체적으로 다음과 같이 증폭시켰다: cDNA를 주형으로, 프라이머 Call001(서열번호: 1) 및 Call002(서열번호: 2)를 사용하여 1차 라운드 PCR 증폭을 수행하였다. 증폭으로부터 짧은 단편으로 얻어진 DNA 생성물을 겔 회수 키트(QIAGEN, 제품 카탈로그 번호 28706)를 사용하여 정제하였다. 1차 라운드 PCR의 산물을 주형으로 하여 프라이머 V-Back(서열번호: 3) 및 V-Fwd(서열번호: 4)를 사용하여 2차 라운드 PCR 증폭을 수행하였다. 증폭으로부터 얻어진 DNA 산물은 VHH 암호화 단편이고, 이어서 겔 회수 키트(QIAGEN, 제품 카탈로그 번호 28706)를 사용하여 정제하였다.
Call001(서열번호: 1): GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG
Call002(서열번호: 2): GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC
V-Back(서열번호: 3): GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG
V-Fwd(서열번호: 4): CTAGTGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCTGGGT
1.4 VHH 파지 라이브러리 제조
증폭으로부터 얻어진 VHH 암호화 단편을 PstI/NotI 엔도뉴클레아제로 분해하고, 파지미드 벡터 pMECS(NTCC Plasmid Vector, Strain, Cell and Gene Collection, 제품 카탈로그 번호 pMECS)에 삽입하여 재조합 벡터를 제조한 다음, 에스케리키아 콜리(Escherichia coli) TG1(Lucigen, 제품 카탈로그 번호 60502-1)에 전기적으로 전달하였다. 형질전환된 박테리아 액체의 작은 부분을 희석한 다음, 100 μg/mL 암피실린을 함유하는 선택적 플레이트에 적용하였다. 라이브러리 용량은 콜로니 계수에 의해 계산되었으며, 라이브러리 품질을 평가하기 위한 서열분석을 위해 100개의 무작위 클론을 선택하였다. 남은 박테리아 액체를 100 μg/mL 암피실린을 함유하는 선택적 플레이트에 적용하였다. 박테리아 콜로니의 박테리아 잔디를 플레이트에서 긁어내고 글리세롤을 보충하고, 라이브러리 스톡으로 -80℃에서 냉동보존하였다. 라이브러리 스톡을 대수 성장기로 증폭시켰다. 라이브러리 증폭은 M13KO7 헬퍼 파지(New England Biolabs, 제품 카탈로그 번호 N0315S)를 첨가하여 수행했으며, 28℃에서 200 rpm으로 밤새 진탕하였다. 박테리아 액체를 원심 분리하고, 상층액을 수집하였다. PEG6000/NaCl 용액의 1/4 상층액 부피(20% PEG6000(w/v), 2.5 M NaCl)을 첨가하였다. 혼합물을 1 내지 2시간 동안 얼음 위에서 인큐베이션하여 파지를 침전시켰다. 침전된 파지를 원심분리하여 수집하고, PBS에 재현탁시킨 다음, 20% 글리세롤을 첨가하였다. 현탁액은 VHH 파지 디스플레이 라이브러리로서 -80℃에서 보존하였다.
실시예 2. 항-인간 c-Met VHH 스크리닝
2.1 패닝
VHH 파지 디스플레이 라이브러리는 고체상 패닝을 거쳤다. 재조합 c-Met-Avitage™(ACRO, 제품 카탈로그 번호. MET-H82E1)를 고흡착 마이크로플레이트에 고정하였다. 블로킹 후, 1.4에서 얻어진 파지를 웰 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 1 내지 2시간 동안 배양하였다. 플레이트를 Tween(PBST)이 포함된 인산염-완충 식염수로 10회 세척하여 비특이적으로 결합된 파지를 제거하였다. PBS로 세척한 후, 결합된 파지를 트립신으로 용출시켰다. 효소를 4-(2-아미노에틸)벤젠설포닐 불루오라이드 하이드로클로라이드(AEBSF)로 중화시키고, 용출된 파지를 사용하여 에스케리키아 콜리 TG1을 감염시켰다. 증폭 후, 또 다른 라운드의 라이브러리 패닝을 수행하였다. 2 내지 3회 라운드의 패닝 및 농축 후, 수집된 파지를 사용하여 에스케리키아 콜리 TG1을 대수 성장기에서 감염시켰다. 박테리아를 20%(w/v) 글루코스와 100μg/mL 암피실린을 함유하는 선택적 플레이트에 적용하였다. 단일 클론을 골라 배양하였다. 이소프로필-β-D-티오갈락토시드(IPTG)에 의해 발현을 유도하고, 상층액을 수집하였다.
2.2 양성 클론 식별
선택된 클론은 인간 c-Met-His(SinoBiological, 제품 카탈로그 번호 10692-H08H)에 대한 간접 ELISA에 의해 양성 식별을 거쳤다. 인간 c-Met-His 또는 대조군 단백질 인간 Fc 단백질(ACRO, 제품 카탈로그 번호. FCC-H5214)을 고흡착 마이크로플레이트에 코팅한 다음, 플레이트를 차단 완충액으로 차단하였다. 2.1에서 제조한 상층액을 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척한 후, HRP-접합 항-HA 태그 2차 항체(GenScript, 제품 카탈로그 번호 A01296)를 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 0.5시간 동안 배양한 다음, 5회 세척하고, 발색을 위해 발색 기질을 첨가하였다. 450 nm의 파장 및 650 nm의 기준 파장에서의 광 흡수 신호 값을 측정하였다. 상대적으로 높은 신호 값을 갖는 인간 c-Met-His에만 결합하는 양성 클론을 보존을 위해 선택하고 서열분석하였다.
양성 클론 1B-1B2, 1B-3B11, 1B-1C7, 1B-1B6, 1B-1A8 및 3B-1C7을 스크리닝으로부터 얻었다. 서열 분석은 1B-3B11의 VHH가 서열번호: 23에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖고, 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 가지며; 1B-1B6의 VHH가 서열번호: 25에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖고, 서열번호: 26에 제시된 아미노산 서열을 가지며; 1B-1C7의 VHH가 서열번호: 27에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖고, 서열번호: 28에 제시된 아미노산 서열을 가지며; 1B-1A8의 VHH가 서열번호: 29에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖고, 서열번호: 30에 제시된 아미노산 서열을 가지며; 1B-1B2의 VHH가 서열번호: 31에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖고, 서열번호: 32에 제시 아미노산 서열을 가지며; 3B-1C7의 VHH가 서열번호: 33에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖고, 서열번호: 34에 제시된 아미노산 서열을 갖는다는 것을 나타낸다.
실시예 3. 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체의 제조
3.1 VHH-Fc 키메라 항체의 제조
스크리닝으로부터 얻은 양성 클론의 VHH 서열을 인간 Fc 영역에 연결하여 VHH-Fc 키메라 항체를 제조하였다. 구체적으로, 2.2에서 서열분석된 VHH 서열은 인간 IgG1 Fc 영역을 함유하는 pCDNA3.1 진핵 발현 벡터에 삽입하였다. 이들 VHH-Fc 키메라 항체는 Expifectamine™ CHO 형질감염 키트 일시적 발현 시스템(Thermo Fisher Scientific Inc., 제품 카탈로그 번호 A29129)을 사용하여 발현하였다.
서열 분석은 1B-3B11-Fc의 전장이 서열번호: 37에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 서열번호: 36에 제시된 뉴클레오티드 서열을 가지며; 1B-1B6-Fc의 전장이 서열번호: 39에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 서열번호: 38에 제시된 뉴클레오티드 서열을 가지며; 1B-1C7-Fc의 전장이 서열번호: 41에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 서열번호: 40에 제시된 뉴클레오티드 서열을 가지며; 1B-1A8-Fc의 전장이 서열번호: 43에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 서열번호: 42에 제시된 뉴클레오티드 서열을 가지며; 1B-1B2-Fc의 전장이 서열번호: 45에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 서열번호: 44에 제시된 뉴클레오티드 서열을 가지며; 3B-1C7-Fc의 전장이 서열번호: 47에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 서열번호: 46에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는다는 것을 나타낸다.
3.2 표면 플라즈몬 공명에 의한 인간 c-Met 및 시노몰구스 원숭이 c-Met에 대한 VHH-Fc 키메라 항체의 친화도 결정
항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체는 생체분자 상호작용 분석 시스템(GE, Biacore T200)을 사용하여 친화도에 대해 테스트하였다. 항-hIgG(Fc) 항체(GE, 제품 카탈로그 번호. BR-1008-39)를 CM5 센서 칩에 아미노 결합시켰다. 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체를 러닝 완충액(running buffer)(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4ㆍ12H2O, 1.8 mM KH2PO4, 0.05% 계면활성제 P-20(w/v), pH 7.4)을 사용하여 1 μg/mL로 희석하고, 30 μL/min의 유속으로 실험 채널을 통해 희석액을 통과시킴으로써 포획을 허용하였다. 인간 c-Met-His(SinoBiological, 제품 카탈로그 번호 10692-H08H) 또는 시노몰구스 원숭이 c-Met-His(SinoBiological, 카탈로그 번호 90304-C08H)를 러닝 완충액을 사용하여 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM 및 3.125 nM으로 희석하고, 50 μL/min의 유속으로 희석액을 통과시킴으로써 200초 동안 결합을 허용하였다. 이어서, 샘플 주입을 중지하여 800초 동안 해리를 허용하였다. 데이터 신호는 BiaControl 소프트웨어 2.0으로 실시간으로 수집되었으며, BiaEvaluation Software 2.0으로 분석하였다. 피팅은 Langmuir 1:1 모델을 사용하여 수행하였고, 결합 속도 상수 Ka(1/Ms), 해리 속도 상수 Kd(1/s) 및 평형 해리 상수 KD(M)를 계산하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다. 1B-1B2-Fc, 1B-3B11-Fc, 1B-1C7-Fc, 1B-1B6-Fc, 1B-1A8-Fc 및 3B-1C7-Fc는 모두 인간 c-Met 단백질에 대해 상대적으로 높은 친화력을 가지며 모두 시노몰구스 원숭이 c-Met 단백질과 교차 반응을 갖는다.
[표 1] 인간 c-Met 및 시노몰구스 원숭이 c-Met에 대한 VHH-Fc 키메라 항체의 친화도
실시예 4. c-Met를 발현하는 천연 세포주에 대한 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체의 결합
4.1 세포에 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체를 결합하기 위한 유세포 분석 검정
다양한 c-Met 발현 수준을 갖는 표적 세포에 대한 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체의 결합은 유세포 분석으로 검출하였다. H1993 세포(Beina Bio, 제품 카탈로그 번호. BNCC342186)는 c-Met 발현 수준이 높은 인간 폐 선암 세포주이고, MKN45 세포(Nanjing Cobioer Biosciences Co., Ltd., 제품 카탈로그 번호. CBP60541)는 c-Met 발현 수준이 중간 정도인 인간 위암 세포주이고, KP4 세포(Nanjing Cobioer Biosciences Co., Ltd., 제품 카탈로그 번호 CBP60541)는 c-Met 발현 수준이 낮은 인간 췌장암 세포주이다. 2×105개 표적 세포를 얼음 위에서 연속적으로 희석된 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체(초기 농도 100 nM에서 7 농도로 5배 연속적으로 희석됨)와 함께 1시간 동안 배양한 후, 세포를 세척하였다. PE-표지된 항-인간 IgG Fc 항체(Jackson Immuno Research, 제품 카탈로그 번호 109-116-170)를 첨가하고, 혼합물을 얼음 위에서 0.5시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세척한 다음, 유세포 분석기(Thermo Fisher Scientific Inc., Attune NXT)를 사용하여 테스트하였다. 그 결과를 도 1A-1C 및 표 2에 나타내었다. 1B-1B2-Fc, 1B-3B11-Fc, 1B-1C7-Fc, 1B-1B6-Fc, 1B-1A8-Fc 및 3B-1C7-Fc는 모두 c-Met 발현 수준이 상이한 표적 세포에 대해 상대적으로 높은 결합 능력을 가지고 있다.
[표 2] 표적 세포에 대한 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체의 결합
4.2 짧은꼬리원숭이(macaque) c-Met를 발현하는 세포에 대한 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체의 결합을 위한 유세포 분석 검정
짧은꼬리원숭이 상피 세포 4MBr-5(Shanghai Qingqi Biotechnology Development Co., Ltd., 제품 카탈로그 번호 BFN60807362)에 대한 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체의 결합은 4.1의 방법을 참조하여 유세포 분석으로 검출하였다. 그 결과를 도 1d 및 표 3에 나타내었다. 1B-1B2-Fc, 1B-3B11-Fc, 1B-1C7-Fc, 1B-1B6-Fc, 1B-1A8-Fc 및 3B-1C7-Fc는 모두 c-Met를 발현하는 짧은꼬리원숭이 상피 세포 4MBr-5를 효과적으로 표적화하고 이에 결합할 수 있다.
[표 3] 짧은꼬리원숭이 상피 세포에 대한 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체의 결합
실시예 5. 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체 및 항체 에피토프 경쟁 분석에 의한 수용체/리간드 결합의 차단
5.1 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체에 의한 c-Met 수용체에 대한 HGF 및 HGFβ의 결합 차단
항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체가 c-Met 수용체에 대한 간세포 성장 인자(HGF)의 결합을 차단할 수 있는지 여부는 경쟁적인 ELISA 방법으로 분석하였다. 구체적으로, 2 μg/mL 인간 c-Met-His 단백질(SinoBiological, 제품 카탈로그 번호 10692-H08H)을 고흡착 마이크로플레이트에 코팅한 다음, 플레이트를 3%(w/v) BSA 차단 완충액으로 차단하고, 세척한 다음, 80 ng/mL 비오틴 접합 HGF(SinoBiological, 제품 카탈로그 번호 10463-HNAS) 및 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체(초기 농도 100 nM에서 7 농도로 5배 연속적으로 희석됨)를 첨가하고, 25℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척한 후, HRP-접합 스트렙타비딘(eBioscience, 제품 카탈로그 번호 18-4100-51)을 첨가하였다. 플레이트를 25℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 5회 세척하고, TMB 기질 용액(TIANGEN, 제품 카탈로그 번호 PA107)을 발색을 위해 100 μL/웰에서 첨가하였다. 450 nm의 파장 및 650 nm의 기준 파장에서 광 흡수 신호 값을 측정하였다. 곡선(도 2a)을 피팅하고, IC50 값(표 4)을 계산하였다.
동일한 방법을 사용하여 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체가 c-Met 수용체에 대한 HGF의 β 사슬(HGFβ, NP_000592.3, Val495-Ser728)의 결합을 차단할 수 있는지 여부를 분석하였다. HGFβ는 서열번호: 35에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 그 결과에 기초하여 곡선(도 2b)을 피팅하고, IC50 값을 계산하였다(표 4).
그 결과, 1B-3B11-Fc, 1B-1B2-Fc, 1B-1C7-Fc, 1B-1B6-Fc, 1B-1A8-Fc 및 3B-1C7-Fc는 모두 c-Met 수용체에 대한 HGF의 결합을 차단할 수 있고; 1B-3B11-Fc, 1B-1C7-Fc, 1B-1B6-Fc 및 1B-1A8-Fc는 c-Met 수용체에 대한 HGFβ의 결합을 차단할 수 있고, 1B-1B2-Fc 및 3B-1C7-Fc는 c-Met 수용체에 대한 HGFβ의 결합을 차단할 수 없다.
[표 4] 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체에 의한 c-Met 수용체에 대한 HGF 및 HGFβ의 결합 차단
5.2 표면 플라즈몬 공명에 의한 항-인간 c-Met VHH-Fc의 다양한 클론 간의 경쟁 관계 조사
에피토프 경쟁 관계 분석은 생체분자 상호작용 시스템(Fortebio, 제품 카탈로그 번호 Octet RED96)을 사용하여 수행하였다. 항-펜타-HIS(HIS1K) 센서(Fortebio, 제품 카탈로그 번호 18-5120)를 사용하였고, c-Met-His 단백질(SinoBiological, 제품 카탈로그 번호 10692-H08H)을 러닝 완충액을 사용하여 약 5 μg/mL로 희석하였다. 센서를 희석된 항원 샘플에 담갔다. 고정화 높이는 결합 시간을 조절하여 약 1 nm로 조절하였다. 이어서, 항원 샘플은 제1 항체 A와 제2 항체 B와 순서대로 상호작용하고, B 항체 결합 신호를 검출하여 두 항체가 동일한 에피토프를 인식하는지 여부를 결정하였다. 그 결과를 표 5-1 및 표 5-2에 나타내었다. 결정 기준은 다음과 같았다: 60% 초과 값은 2개의 항체가 전혀 경쟁하지 않는다는 것을 나타내었고; 20% 내지 60%의 값은 2개 항체의 부분적 경쟁을 나타내었고(에피토프에서 교차가 있을 수 있음); 20% 미만 값은 2개의 항체가 완전히 경쟁하는 것을 나타내었다. 자가 반응 신호(회색 부분)가 20% 미만인 경우, 데이터가 유효한 것으로 판단되었다.
표 5-1의 데이터에서 알 수 있듯이, 두 항체 1B-3B11-Fc 및 1B-1A8-Fc는 완전히 경쟁하였으며; 1B-3B11-Fc 및 1B-1A8-Fc는 다른 3개의 후보 항체와 뚜렷한 경쟁 관계가 없었고 각각 다른 에피토프에 속하였다. 따라서, 항체 1B-3B11-Fc 및 1B-1B2-Fc, 1B-3B11-Fc 및 1B-1C7-Fc, 1B-3B11-Fc 및 1B-1B6-Fc, 1B-1A8-Fc 및 1B-1B2-Fc, 1B-1A8-Fc 및 1B-1C7-Fc, 1B-1A8-Fc 및 1B-1B6-Fc, 1B-1B2-Fc 및 1B-1C7-Fc, 1B-1B2-Fc 및 1B-1B6-Fc, 및 1B-1C7-Fc 및 1B-1B6-Fc는 c-Met 항원의 상이한 에피토프에 동시에 결합할 수 있다.
표 5-2의 데이터에서 알 수 있는 바와 같이, 두 항체 3B-1C7-Fc 및 1B-1B2-Fc는 완전히 경쟁하였다. 따라서, 표 5-1로부터의 데이터를 조합함으로써, 항체 1B-1A8-Fc 및 3B-1C7-Fc, 3B-1C7-Fc 및 1B-1C7-Fc, 및 3B-1C7-Fc 및 1B-1B6-Fc는 c-Met 항원의 상이한 에피토프에 동시에 결합할 수 있음을 알 수 있다.
[표 5-1] 표면 플라즈몬 공명에 의한 에피토프 차이 분석
[표 5-2] 표면 플라즈몬 공명에 의한 에피토프 차이 분석
실시예 6. 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체에 의한 H441 세포에서의 c-Met 인산화의 억제
H441 세포(Beina Bio, 제품 카탈로그 번호. BNCC292357)에서 HGF 자극에 의한 c-Met 인산화에 대한 항체의 억제 효과는 Phospho-c-Met(Tyr1234/1235) AlphaLISA SureFire 울트라 검정 키트(PerkinElmer, 제품 카탈로그 번호 ALSU-PC-MET-A500)를 사용하여 검출하였다. 공급업체의 지침에 따라, H441 세포를 채취하여 96웰 플레이트에서 100 μL/웰 및 10000 세포/웰로 접종하였다. 6 내지 16시간 인큐베이션한 후, 세포를 무혈청 배양 배지에서 밤새 기아 상태로 두었다. 상층액을 버리고, 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체(1000 nM의 초기 농도에서 7 농도로 10배 연속적으로 희석됨)를 45 μL/웰로 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 인큐베이션하고, 15분 동안 자극을 위해 5 μL의 HGF를 첨가하였다. 상층액을 버리고, 100 μL의 새로 제조된 1× 용해 완충액을 첨가하였다. 10분 인큐베이션한 후, AlphaLISA 모듈을 사용하여 플레이트를 판독하였다. 그 결과를 도 3 및 표 6에 나타내었다. 1B-1B2-Fc, 1B-3B11-Fc, 1B-1C7-Fc, 1B-1B6-Fc, 1B-1A8-Fc 및 3B-1C7-Fc는 모두 HGF 자극에 의해 야기된 H441 세포의 c-Met 다운스트림 인산화를 효과적으로 억제할 수 있다.
[표 6] 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체에 의한 H441 세포에서의 c-Met 인산화 억제
실시예 7. 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체에 의한 KP4 세포의 증식 억제
KP4 세포의 증식에 대한 항체의 억제 효과는 Cell Counting 키트 8(DOJINDO Laboratories, Lot.SH797) 방법을 사용하여 검출하였다. 구체적으로, KP4 세포를 96웰 세포 배양 플레이트에 1000 세포/웰로 첨가하고 37℃의 5% CO2 이산화탄소 세포 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 세포를 벽에 부착시킨 후, 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체(900 nM의 초기 농도에서 7 농도로 2배 연속적으로 희석됨)를 세포에 첨가하였다. 120시간 인큐베이션한 후, 10 μL의 CCK-8 용액을 각 웰에 첨가하였다. 1시간 인큐베이션한 후, 450 nm에서의 흡광도는 마이크로플레이트 리더를 사용하여 측정하였다. 그 결과를 도 4 및 표 7에 나타내었다. 1B-3B11-Fc, 1B-1C7-Fc, 1B-1B6-Fc, 1B-1A8-Fc 및 3B-1C7-Fc는 모두 KP4 세포의 증식을 효과적으로 억제할 수 있다.
세포 생존율 계산식은 다음과 같다.
세포 생존율 = [(As - Ab)/(Ac - Ab)] Х 100%,
As = 실험 웰 흡광도(세포, 배양 배지, CCK-8 및 테스트 항체를 포함하는 웰의 흡광도),
Ab = 블랭크 웰 흡광도(배양 배지 및 CCK-8을 포함하는 웰의 흡광도),
Ac = 대조군 웰 흡광도(세포, 배양 배지 및 CCK-8을 포함하는 웰의 흡광도);
증식 억제율 = 100% - 세포 생존율.
[표 7] 항-인간 c-Met VHH-Fc 키메라 항체에 의한 KP4 세포의 증식 억제
서열목록 전자파일 첨부
Claims (18)
- 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 c-Met에 결합하고 적어도 하나의 단일 가변 도메인을 포함하며, 상기 단일 가변 도메인은 다음의 상보성 결정 영역을 포함하는 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
(a) 서열번호: 11, 8, 5, 14, 17, 또는 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열번호: 12, 9, 6, 15, 18, 또는 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열번호: 13, 10, 7, 16, 19, 또는 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3. - 제1항에 있어서, 단일 가변 도메인은 다음을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
(a) 서열번호: 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
(b) 서열번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
(c) 서열번호: 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
(d) 서열번호: 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
(e) 서열번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는
(f) 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3. - 제2항에 있어서, 단일 가변 도메인은 서열번호: 24, 26, 28, 30, 32, 또는 34에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나,
단일 가변 도메인은 서열번호: 24, 26, 28, 30, 32, 또는 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 가변 도메인은 VHH이고; 선택적으로, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 키메라 또는 인간화된 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 IgG의 Fc, 바람직하게는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 Fc를 포함하고; 선택적으로, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 37, 39, 41, 43, 45, 또는 47에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음 특성 및 특징 중 하나 또는 여러 개를 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
(a) 인간 c-Met 또는/및 원숭이 c-Met에 결합하는 것;
(b) c-Met에 대한 HGF 또는 이의 β 사슬의 결합을 차단하는 것;
(c) HGF 자극에 의해 야기된 c-Met 인산화를 억제하는 것;
(d) 종양 세포에 ADCC 효과를 발휘하는 것. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 융합 단백질.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제7항에 따른 융합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 제7항에 따른 융합 단백질을 암호화하는, 단리된 핵산.
- 제9항에 따른 단리된 핵산을 포함하는, 벡터.
- 제9항에 따른 핵산 또는 제10항에 따른 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
- 제11항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계 및 발현된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 단리하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는 방법으로서, 여기서 벡터는 발현 벡터인, 방법.
- 종양을 갖는 대상체 치료용 약제를 제조하기 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 제7항에 따른 융합 단백질, 또는 제8항에 따른 약제학적 조성물의 용도로서, 바람직하게는 상기 종양은 뇌암, 두경부암, 폐암, 식도암, 인두암, 비강암, 설암, 구강암, 갑상선암, 피부암, 골암, 연조직 육종, 골수종, 위암, 위식도접합선암종(gastroesophageal junction adenocarcinoma), 유방암, 간암, 신장암, 췌장암, 비장암, 림프종, 흉선암, 방광암, 질암, 고환암, 자궁암, 자궁경부암, 대장암, 항문암, 유두암, 전립선암, 난소암, 상피세포암, 또는 혈액 종양인, 용도.
- 샘플을 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계, 및 결합 복합체를 검출 또는 측정하는 단계를 포함하는, 샘플 내 c-Met를 검출 또는 측정하는 방법.
- 유효량의 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 제7항에 따른 융합 단백질, 또는 제8항에 따른 약제학적 조성물을 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 세포에서 c-Met 신호전달을 억제, 감소 또는 차단하는 방법.
- 유효량의 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 제7항에 따른 융합 단백질, 또는 제8항에 따른 약제학적 조성물을 종양 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 종양 세포 성장을 억제하거나 종양 세포를 사멸시키는, 방법.
- 치료학적 유효량의 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 제7항에 따른 융합 단백질, 또는 제8항에 따른 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 종양을 갖는 대상체를 치료하는, 방법.
- 제16항 또는 제17항에 있어서, 종양은 뇌암, 두경부암, 폐암, 식도암, 인두암, 비강암, 설암, 구강암, 갑상선암, 피부암, 골암, 연조직 육종, 골수종, 위암, 위식도접합선암종, 유방암, 간암, 신장암, 췌장암, 비장암, 림프종, 흉선암, 방광암, 질암, 고환암, 자궁암, 자궁경부암, 결장직장암, 항문암, 유두암종, 전립선암, 난소암, 상피세포암, 또는 혈액 종양인, 방법.
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