KR20240095003A - 새로운 알데히드탈수소효소를 함유하는 떨림 또는 이상 동작 개선용 식품 조성물과 의약 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 새로운 알데히드탈수소효소를 함유하는, 떨림 또는 이상 동작(movement disorder)개선을 위한 식품 그리고 의약 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 서열번호1의 유전자와 98% 이상의 상동성을 갖는 유전자에 의하여, 특히 서열번호2를 포함하는 서열번호 1의 유전자에 의하여 코딩되는 알데히드탈수소효소를 함유하는, 떨림 또는 이상 동작 개선을 위한 식품 그리고 의약 조성물에 대한 것이다. 또한 본 발명은 KCTC13925BP, KCTC14122BP, KCTC14123BP, KCTC14983BP, KCTC14984BP 그리고 KCTC14985BP으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이들이 혼합된 효모 용해물(lysate)에 함유된 알데히드탈수소효소를 함유하는, 식품 조성물과 의약 조성물에 대한 것이다.

Description

새로운 알데히드탈수소효소를 함유하는 떨림 또는 이상 동작 개선용 식품 조성물과 의약 조성물{Food and Drug Composition Containin Novel Aldehyde Dehydrogenase for Suppressing Tremor or Movement Disorder}
본 발명은 새로운 알데히드탈수소효소를 함유하는, 떨림(tremor) 또는 이상 동작(movement disorder)개선을 위한 식품 그리고 의약 조성물에 관한 것이다.
보다 구체적으로는, 본 발명은 서열번호1의 유전자와 98% 이상의 상동성을 갖는 유전자에 의하여, 특히 서열번호2를 포함하는 서열번호 1의 유전자에 의하여 코딩되는 알데히드탈수소효소를 함유하는, 떨림 또는 이상 동작 개선을 위한 식품 그리고 의약 조성물에 대한 것이다.
보다 상세하게는, 본 발명은 수탁번호 KCTC13925BP, KCTC14122BP, KCTC14123BP, KCTC14983BP, KCTC14984BP 그리고 KCTC14985BP으로 이루어지는 군에서 선택되는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)돌연변이 효모 어느 하나 또는 이들이 혼합된 돌연변이 효모의 건조물 또는 용해물(lysate)에 함유된, 서열번호2를 포함하는 서열번호1의 유전자에 의해 코딩되는 알데히드탈수소효소를 함유하는, 떨림 또는 이상 동작 개선용 식품 조성물과 의약 조성물에 대한 것이다.
떨림 또는 이상 동작(movement disorder) 증상(이하, 진전으로 약칭함)은, 손 이외에도 머리, 목, 턱, 혀, 목소리에서도 나타나는 떨림 현상이다. 이러한 진전 증상은 드물지만, 다리, 발 등 전신에서 발생될 수 있다.
진전 증상은, 본태성 진전(essential tremor), 안정시 진전(resting tremor), 파킨슨 진전(parkinsonian tremor), 심인성 진전(psychogenic tremor), 소뇌성 진전(cerebellar tremor), 의도 진전(intention tremor), 알코올 금단에 의한 진전증(alcohol withdrawal tremor), 기립성 진전(orthostatic tremor)으로 분류된다.
본태성 진전(essential tremor) 경우 원인이 아직 규명되지 아니하였다. 50% 이상의 본태성 진전 환자가 가족력이 있다. 본태성 진전은 전연령대에서 발병한다. 특히 65세 이상의 나이에서 발병되는 본태성 진전을, 노인성 진전(Senile tremor)이라고 지칭한다.
안정시 진전(Resting tremor)과 파킨슨씨병 진전(Parkinsonian tremor)은, 파킨슨씨병 환자에게서 나타난다. 이러한 진전은 환자가 가만히 쉬고 있을 때 주로 나타나며, 환자가 목적하는 행동을 진행하는 동안에는 감소되거나 사라진다.
인위적인 진전 또는 심인성 진전(factitious or Psychogenic tremor)은, 히스테리성 진전이라고도 한다. 이러한 진전에서는, 떨림 현상이 나타나고 있는 부위로부터 환자의 관심을 다른 곳으로 돌리면, 떨림이 없어지는 현상을 나타낼 수 있다.
이상 동작이 계속되거나 세밀한 동작 조절이 필요한 경우에 규칙적이지 못한 떨림이 일시적으로 나타나는 경우가 있다. 이를 소뇌성 진전(cerebellar tremor), 의도 진전(intention tremor)하고 한다. 이런 형태의 진전 증상은 대부분 소뇌나 소뇌와의 연결 부분의 이상에 의해 나타나게 된다. 소뇌 기능장애가 있는 환자들은 동작실조나 동작 조절 곤란 등의 이상 동작 증상이 나타난다.
불안 및 초조감, 무대 공포증, 중요한 시합이 있는 경우 등 어떤 이유로 떨림의 진폭이 커져 육안으로 관찰되는 떨림을, 강조된 생리적 진전(Enhanced physiologic tremor)이라고 한다.
이러한 진전 증상들 이외에도, 알코올 금단에 의한 진전(Alcohol withdrawal tremor) 및 기립성 진전(Orthostatic tremor)등이 있다.
또한 음주 과다로 인하여 발생하는 숙취 현상의 원인이 되는 아세트알데히드도, 떨림(tremor) 또는 이상 동작(movement disorder) 증상을 야기한다. 축구나 농구완 같은 격렬한 운동 경기 도중에 운동 선수들의 체내에 급격하게 증가하는 말론디알데히드는, 통증을 수반하는 근육 경련과 같은 떨림(tremor) 또는 이상 동작(movement disorder) 증상을 야기한다.
수전증은 일반적으로 손이 떨리는 진전(tremor) 증상이 나타나는 경우를 말한다. 수전증에는, 안정시 떨림(resting tremor), 자세 떨림(postural tremor), 운동 떨림(Kinetic tremor), 작업 관련 떨림(task-specific tremor) 및 의도 떨림(intention tremor)이 포함된다.
수전증은 신경의 기능적 이상으로 인해 발생하는 가장 흔한 동작 장애 질환 중 하나이다. 수전증은 전 세계 인구의 약 1%에 영향을 미치며, 발생률은 나이가 들수록 증가한다.
수전증의 주요 증상은 활동 떨림이며, 자발적인 활동 중에 발생하는 떨림이다. 수전증은 노화가 진행되면서 점진적으로 발전하여, 결국 식사 및 운전 등과 같은 일상 활동에 어려움을 초래할 뿐 아니라, 삶의 질을 저해하는 문제를 초래한다.
진전(떨림) 환자를 진찰하고 증상을 객관적으로 평가하기 위해 기본적인 신경학적 진찰 외에 몇 가지 방법이 사용된다. 학술적인 목적으로 FTM (Fahn-Tolosa-Marin scale)방법이 널리 사용되며[9], 일상생활장애 평가도 시행한다.
환자에게 아르키메데스 나선(archimedes spiral)을 그리게 하거나 글씨체와 글씨쓰는 모습을 관찰하여,동작 떨림을 객관적으로 평가할 수 있다. 가속도 측정 이용하여 떨림 증상을 객관적으로 측정할 수 있다. 대부분의 환자에게서 떨림 증상에 대한 자세한 육안 관찰이 진단에 중요하다.
본 명세서에의 "진전"이라고 표현된 단어의 의미는, 이상에서 열거한 각종 떨림(tremor) 또는 이상 동작(movement disorder) 증상을 모두 포함한다.
본태성 진전(떨림)의 치료에는 증상을 호전시키기 위한 약물이 사용된다. 가장 널리 사용되고 있는 약물은 프로프라놀롤(propranolol)과 프리미돈(primidone)이다. 프로프라놀롤은 비 선택적인 beta-adrenergic antagonist이며, 프리미돈은 항전간제로 개발된 약물이다. 이들은 본태성 떨림에 억제 효과를 나타낸다.
프리미돈은 프로프라놀롤과 함께 사용할 때, 단독요법 보다 더 큰 치료 효과를 나타낸다. 클로나제팜(clonazepam)은 당뇨와 천식 환자들 또는 프리미돈 투여가 어려운 환자들에게 적합한 진전(떨림) 치료 약물이다.
본태성 떨림은 흔한 증상이고 치료를 통해 호전될 수 있다. 그러나, 많은 환자들이 본태성 떨림이 나이 때문에 생기는 현상으로 인식하여 치료를 받지 아니한다. 본태성 떨림은 매우 다양한 원인에 의해 발생하기 때문에, 떨림의 원인을 정확하게 진단해야 한다.
이런 본태성 떨림을 포함한 알츠하이머병(AD) 및 파킨슨병(PD)과 같은 신경 퇴행성 질환들의 정확한 원인은 아직 정확하게 규명되지 아니하였다. 최근 연구들에 따르면, 신경퇴행성 질환의 주된 요인은 신경 세포의 산화 스트레스 증가인 것으로 추정되고 있다.
산화 스트레스는 반응성 알데히드(Reactive aldehyde)의 세포내 축적에 기인한다. 이러한 반응성 알데히드는, 글루타민으로부터 유래되는 Glutamate semialdehyde(GSA), Succini semialdehyde(SSA), 또는 에탄올로부터 생성되는 아세트알데히드와 같은 내인성 알데히드가 포함된다.
이러한 반응성 알데히드들은 산화 스트레스를 증가시키고, 체내의 주요 단백질, DNA, 지질 등과 결합하여 염증 반응을 유발한다. 인체의 산화 스트레스와 만성 염증은 인체의 노화를 촉진시킨다. 이러한 노화에 따라 떨림 또는 이상 동작을 야기하는 신경퇴행성 질환이 발생하기도 한다.
인체에는 이러한 내인성 알데히드를 분해할 수 있는 약19종류의 이상의 ALDH(aldehyde dehydrogenase)가 존재한다. 이러한 ALDH들 중에서 미토콘드리아 ALDH2는 내인성 알데히드 분해 과정에서 중요한 역할을 수행한다.
ALDH는 이러한 내인성 알데히드를 제거하는 역할을 담당하여 산화 스트레스로부터 세포를 보호한다. ALDH는 활성산소 소거제 역할을 통해 세포를 안정화시키고 활성 알데히드의 체내 축적을 예방한다. 결과적으로, ALDH는 신경 세포 사멸을 방어하여 신경 퇴행에 따른 떨림 또는 이상 동작 발생을 억제한다.
본 발명의 식품 조성물과 의약 조성물이 예방 또는 치료하고자 하는 질환인 진전 증상의 원인으로서, 내인성 아세트알데히드, 말론디알데히드, 신경전달 물질로 기능하는 글루타메이트(Glu, Glutamate)로 부터 유래되는 Glutamate semialdehyde(GSA)와 Succinic semialdehyde(SSA)가 주목되고 있다.
GABA는 전구체인 glutamate으로부터 체내에서 생성된다[17]. MAOB(monoamine oxidase B)의 작용에 의해 GABA aldehyde로 변환된다. [13]. GABA aldehyde (Succinic semialdehyde, 이하 SSA로 약칭함)는 인체내의 ALDH의 작용에 의해 숙신산(Succinic acid)으로 산화된다.
한편, 경직성하반신 마비(spacitic paraplegia)증상의 발현 과정에서 나타나는 떨림(tremor) 증상은, 글루타메이트(Glutamate)의 대사체인 글루타메이트세미알데히드(GSA, Glutamate-5-semialdehyde)의 관련이 있다.
인체의 알데히드탈수소효소(ALDH) 발현이 줄어들거나 돌연변이가 발생하는 경우, 인체내에서 아세트알데히드, 말론디알데히드, Glutamate semialdehyde(GSA)와 Succinic semialdehyde(SSA)의 분해가 지연된다. 그 결과 인체의 산화스트레스가 증가하고 운동 신경의 이상을 초래하여, 진전(떨림) 증상 또는 이상 동작(movement disorder) 증상이 나타난다.
미합중국 특허출원 공개공보US-2021-0254023-Al 2021.8.19(USSN17/176,365호)
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이상과 같은 다양한 선행 연구를 통하여, 아세트알데히드, 말론디알데히드, Glutamate semialdehyde(GSA) 또는 Succini semialdehyde(SSA)가 체내에 증가하면서, 진전(떨림) 또는 이상 동작(movement disorder) 증상이 발생하는 것으로 규명되고 있다.
따라서 본 발명은, 아세트알데히드, 말론디알데히드, 글루타메이트로부터 유래되는 내인성 알데히드인 Glutamate Semialdehyde(GSA) 그리고 Succini semialdehyde(SSA)를 산(acid) 화합물로 신속하게 전환시키는, 알데히드탈수소효소를 함유하는 식품 조성물과 의약 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
즉, 본 발명은, 인체내의 알데히드 탈수소 효소(ALDH)의 작용이 완전하지 아니하여, 아세트알데히드, 말론디알데히드, Glutamate semialdehyde (GSA), Succini semialdehyde(SSA)의 산화와 배출 과정 이상 때문에 발생하는 다양한 진전 증상을 억제하는 식품 조성물이나 의약 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은, 서열번호 2를 포함하는 것을 특징으로 하는 서열번호 1의 유전자에 의해 코딩되는 알데히드탈수소 효소(ALDH)를 함유하는, 진전 억제용 식품 조성물이나 의약 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, KCTC13925BP, KCTC14122BP, KCTC14123BP KCTC14983BP, KCTC14984BP, KCTC14985BP의 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 효모들로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물의 용해물의 건조 분말(이하, KARC로 약칭함)을 함유하는, 진전 억제용 식품 조성물이나 의약 조성물을 제공하는 것이다.
이상과 같은 본 발명의 목적은, KCTC13925BP, KCTC14122BP, KCTC14123BP KCTC14983BP, KCTC14984BP, KCTC14985BP의 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 효모 어느 하나 또는 이들이 혼합된 돌연변이 효모 용해물의 건조 분말을 제공함으로써 달성된다.
본 발명의 또 다른 목적은, 아세트알데히드, Glutamate semialdehyde(GSA), Succini semialdehyde(SSA)를 산(acid)화합물로 전환시키는, KCTC13925BP, KCTC14122BP, KCTC14123BP KCTC14983BP, KCTC14984BP, KCTC14985BP의 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 효모들 중에서 선택되는 어느 하나의 건조물 또는 용해물(lysate)의 혼합한 것(KARC)을 함유하는, 진전 억제용 식품 조성물이나 의약 조성물을 제공함으로써 달성된다.
[도 1, 2]은 생체 내인성 알데히드의 생성 및 분해 과정을 나타내는 화학식이다.
알코올 섭취, 의약품 복용, 스트레스 증가 등에 의해 생체내에서 생성된 다양한 종류의 내인성 에탄올(R1-C2H4-OH)들은 알코올탈수소효소(Alcohol dehydrogenase, ADH) 및 알데히드탈수소효소(ALDH)의 효소 반응으로 독성 물질인 아세트알데히드(R1-CH2-CHO)를 거쳐 최종적으로 아세트산(R1-CH2-CO2H)의 형태로 분해되며, 이를 알코올 대사 혹은 아세트알데히드 무독화대사라 한다.
내인성 모노아민(R2-C2H4-NH2)은 마오(MAO) 효소에 의해 알데히드(R2-CH2-CHO)로 변환된 후, 알코올 대사와 같은 방식으로 알데히드탈수소효소 및 알코올탈수소효소반응 등에 의해 아세트산(R2-CH2-CO2H)으로 무독화 분해가 이뤄진다.
[도 3]은 감마아미노부틸산(GABA)의 분해과정을 나타내는 화학식이다.
모노아민 신경물질인 가바(GABA)는 2개의 탄소사슬과 1개의 아민(R-CH2-CH2-NH2)으로 이루어진 구조적 특징을 가지며, 마오(monoamine oxidase, MAO) 효소에 의해 산화되어 내인성 알데히드(-CHO)인 Succinic semialdehyde (SSA)로 전환되어 주변의 단백질과 결합, 변성을 유도하는 등 세포 독소로 작용한다.
이러한 독성 알데히드들은 알데히드탈수소효소(ALDH)에 의해 산화되어 무독화되며, 최종적으로 산(-CO2H) 물질인 숙신산(Succinic acid)로 전환된다.
[도 4]는 본 발명의 KARC의 인체내 아세트알데히드 분해능력을 보여주는 그래프이다.
[도 5]는 본 발명의 KARC에 의한 인체내 말론디알데히드 분해 능력을 보여주는 그래프이다.
[도 6]은 KARC에 의한 생체내 아세트알데히드 분해능력을 보여주는 그래프이다. 이 결과는 인체내의 혈중 아세트알데히드 감소[도 4]와 혈중 말론디알데히드 감소[도 5] 확인 시험에서, 본 발명의 KARC 복용에 의한 숙취 및 피로와 심혈관질환 생체마커인 아세트알데히드와 말론디알데히드 감소 효과가 확인되었고, [도 6]에서는 의약품 복용 등에 의해 산화스트레스가 높아진 상태에서 본 발명의 KARC 복용 후, 산화스트레스와 활성산소의 생체마커인 말론디알데히드가 낮아졌다. 이는 음주 및 피로 등에 의한 산화스트레스를 낮추어 손 떨림을 포함하는 진전 증상 또는 이상 동작을 억제할 수 있음을 보여준다.[도 4, 5, 6]
[도 7]과 [도 8]에서는 의약품 복용 등에 의해 산화 스트레스의 혈중 말론디알데히드를 증가시킨 동물 실험에서, KARC가 산화스트레스와 활성산소의 생체마커인 말론디알데히드가 감소되는 결과를 보여준다. 본 발명의 KARC는 혈중 말론디알데히드를 감소시켜 생체내 산화 스트레스를 낮추어 주기 때문에, 진전 증상 완화 효과를 나타낸다.
[도 9]는 본 발명의 KARC에 포함되는 KwonP-1 균주를 경구투여하였을 때 효소활성의 변화이다.
[도 10]은 본 발명의 KARC에 포함되는 KwonP-2 균주를 경구투여하였을 때 효소활성의 변화이다.
[도 11]은 본 발명의 KARC에 포함되는 KwonP-3 균주를 경구투여하였을 때 효소활성의 변화이다.
[도 12]는 본 발명의 KARC에 포함되는 PicoYP 균주를 경구투여하였을 때 효소활성의 변화이다.
[도 13]은 본 발명의 KARC에 포함되는 PicoYP-01 균주를 경구투여하였을 때 효소활성의 변화이다.
[도 14]는 본 발명의 KARC에 포함되는 PicoYP-02 균주를 경구투여하였을 때 효소활성의 변화이다.
[도 9, 10, 11, 12, 13, 14]에서는 위장의 소화과정과 유사한 조건인 1<pH<5의 및 약 90분의 조건에서 KwonP-1, KwonP-2, KwonP-3, PicoYP, PicoYP-01,PicoYP-2를 경구 투여하였을때, ALDH 효소 활성의 변화를 측정하였다. 음식물의 섭취시에 관찰되는 산성조건인 pH = 5 에서 ALDH 효소 활성이 최소 37.29 unit/g 에서 최대 52.24% 유지되어 음식물과 함께 KARC 의 경구 투여시 효소 활성이 유지 됨을 확인하였다.
[도 15]은 본 발명의 KwonP-1 균주를 5L 발효조에 배양하였을 때 성장곡선 및 효소활성을 보여준다.
[도 16]는 본 발명의 KwonP-2 균주를 5L 발효조에 배양하였을 때 성장곡선 및 효소활성을 보여준다.
[도 17]는 본 발명의 KwonP-3 균주를 5L 발효조에 배양하였을 때 성장곡선 및 효소활성을 보여준다.
[도 18]은 본 발명의 PicoYP 균주를 5L 발효조에 배양하였을 때 성장곡선 및 효소활성을 보여준다.
[도 19]은 본 발명의 PicoYP-01 균주를 5L 발효조에 배양하였을 때 성장곡선 및 효소활성을 보여준다.
[도 20]은 본 발명의 PicoYP-02 균주를 5L 발효조에 배양하였을 때 성장곡선 및 효소활성을 보여준다.
[도 15, 16, 17, 18, 19, 20]에서는 KwonP-1, KwonP-2, KwonP-3, PicoYP, PicoYP-01, PicoYP-01을 각각 동딜 조건인 5L 배양조에서 YPD 배지릉 사용하여 30℃, 200 rpm에서 48시간 동안 진행하였다. 각각의 균들의 성장곡선(OD660nm)과 ALDH 효소 활성을 Type strain 과 비교하였을 때, ALDH 효소 활성은 최소 10.5배 에서 최대 18.75배 더 높았다. PicoYP-01는 ALDH 활성은 52.68 unit/g 으로 제일 높았으며 KwonP-3에서 29.5 unit/g의로 가장 낮았다.
[도 21]는 증류수와 SSA 혼합물의 HPLC 스펙트럼이다.
[도 22]은 본 발명의 KARC와 SSA의 혼합물을 1시간 동안 37˚C에서 유지한 이후의 HPLC 스펙트럼이다.
[도 23]는 본 발명의 KARC와 SSA의 혼합물을 3시간 동안 37˚C에서 유지한 이후의 HPLC 스펙트럼이다.
[도 21, 22, 23] 에서, 37℃에서 KARC 를 처리하였을 때, 1시간 동안 55% 감소하였고 3시간 동안 74.9%가 감소하였다. KARC가 GABA가 대사될때 만들어내는 알데히드 SSA를 산화시켰다.
이하 본 발명의 돌연변이 효모 제조 과정과 돌연변이 효모에 함유된 신규한 알데히드탈수소 효소(ALDH)가 아세트알데히드, 말론디알데히드, Glutamate semialdehyde(GSA) 또는 Succini semialdehyde(SSA)를 분해하여, 진전(떨림) 또는 이상 동작(movement disorder)증상을 완화시키는 실시예들을 제시하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 이러한 실시예들은 본 발명의 권리범위를 이러한 예시로만 한정하고자 하는 것은 아니다.
따라서 이하에서 설명하는 실시예들의 내용을 일부 변경하더라도, 이 기술 분야의 통상의 지식을 가진자라면 본 발명의 균등 범위에서 본 발명의 다양한 변형 실시가 가능하다.
[실시예 1]
돌연변이를 진행할 야생 효모 모균주(parent strain) 선별
본 발명에서는 한국의 전통주인 국산 막걸리에 0.9% NaCl 용액을 혼합하여 막걸리 현탁액을 제조하였다. 막걸리 현탁액을 200rpm으로 1시간 동안 교반하였다. 효모 야생균주가 포함된 상층액을 YPD(yeast extract peptone dextrose broth) 배지로 희석하였다. 희석액은 원액의 10-6 배율이 되도록 제조하였다.
YPD 한천 배지에 희석액을 도말하였다. 한천 배지는 30℃, 호기성 조건에서 1주일간 정치배양을 하였다. 사카로마이세스 세레비지에는 콜로니의 형태학적 특징, YM 배지에서의 성장 특징, 현미경 관찰을 기준으로 1차 선별하였다.
선별된 사카로마이세스 세레비지에는 알데히드탈수효소 활성과 글루타치온 함량을 측정하였다. 알데히드탈수소효소 활성과 글루타치온 생산량을 기준으로 모균주(parent strain)를 선별하였다.
1-1: 알데히드탈수소효소 측정
아세트알데히드는 DNPH(Dinitrophenylhydrazine)와 반응하여 아세트알데히드-하이드라존(Ach-DNPH) 화합물을 형성하였다. Ach-DNPH 화합물은 C18 column이 장착된 HPLC에 의해 360nm에서 검출하였다. 검출된 Ach-DNPH 화합물의 양을 통해 알데히드탈수소효소(ALDH)가 분해시키는 반응으로 감소된 알데히드의 양을 정량하였다.
효소 반응은 reaction mixture[50mM potassium phosphate buffer(pH 8.0), 1.5mM acetaldehyde and 3mM NADP+] 990ul와 효모 lysate 10ul를 혼합하여 30℃에서 진행하였다. 효소 반응이 종료된 혼합액은 10mM DNPH 50 ul를 첨가하여 Ach-DNPH 형성을 유도하였다. Ach-DNPH 형성은 22℃에서 1시간동안 진행되었다.
Ach-DNPH 형성은 3M Sodium acetate(pH 9)의 첨가로 종료되었다. 2배 부피의 acetonitrile을 첨가하여 형성된 Ach-DNPH 화합물을 분리하였다. 분리된 Ach-DNPH 화합물(in ACN)을 HPLC에 주입하여 분석하였다.
Ach-DNPH 화합물의 농도는 C18 컬럼에 1ml/min의 속도로 이동상(acetonitril, water)을 전개하는 조건으로 HPLC를 세팅하여 360nm 파장에서 분석하였다. HPLC 결과로 얻어진 크로마토그램의 면적 값은 aldehyde-DNPH(Sigma-Aldrich)의 물질 표준곡선을 이용해 변환하여 Ach-DNPH 화합물의 농도를 정량하였다. 분당 감소된 Ach-DNPH의 농도 1mM을 알데히드탈수소효소의 1 unit으로 계산하였다. 알데히드탈수소효소의 활성은 Unit/mg-protein 통일하였다.
1-2: 글루타치온 측정 방법
사카로마이세스 세레비지에 배양액 1ml을 원심분리하여 균체를 수확하였다. 균체에 1ml의 물을 첨가하여 현탁액을 제조하였다. 현탁액을 2시간 동안 85℃에서 1,000rpm으로 교반하여 글루타치온을 추출하였다. 현탁액을 원심분리하여 균체를 제거하고, 상등액을 0.22 μm 필터로 여과하여 글루타치온이 포함된 시료를 확보하였다.
시료 내 글루타치온의 농도는 C18 컬럼을 장착한 HPLC(Shimazu LC-20AD)로 분석하였다. 글루타치온의 농도는 1ml/min의 속도로 이동상(2.02 g/L Sodium 1-heptanesulfonate monohydrate, 6.8 g/L Potassium dihydrogen phosphate, pH 3.0, 메탄올 혼합)을 전개하는 조건으로 210nm 파장에서 분석하였다. HPLC 결과로 얻어진 크로마토그램의 면적 값은 글루타치온의 표준곡선을 이용해 분석하였다.
한국산 막걸리에서 얻어진 200종의 서로 다른 효모를 대상으로 알데히드탈수소효소 활성과 글루타치온 함량을 분석하였다. 표 1에 정리한 10종의 효모는 다른 효모 대비 알데히드탈수소효소 활성 혹은 글루타치온 생성 능력이 높았다.
Yeast #97의 알데히드탈수소효소 활성은 0.10 Unit/mg-protein으로 전체에서 2번째로 높았다. Yeast #97의 글루타치온 함량은 0.42%로 전체에서 가장 높았다. Yeast #97를 모균주(parent strain)으로 선정하여 돌연변이 유도 절차를 수행하였다.
[실시예 2] 본 발명의 돌연변이 과정에 사용된 모 균주의 동정
야생형 모균주(Yeast #97, Wild-type yeast)의 정확한 균종을 확인하기 위해 동정을 수행하였다. 효모의 단일 집락을 YPD 한천 배지 전체에 도말하여 DNA 추출에 필요한 충분한 균을 확보하였다. HiGeneTM Genomic DNA prep kit(BIOFACT Co., Ltd, Daejeon, Korea)를 제조사의 사용지침에 따라 수행하여 DNA를 추출하였다.
효모의 ITS region rRNA 유전자를 증폭하기 위해 효모의 chromosomal DNA를 ITS5(forward) 및 ITS4(reverse)를 primer로 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하였다. PCR 결과물의 염기서열을 분석하였다.
Bioedit 프로그램을 통해 모 균주의 DNA 염기서열을 분리하였다. PCR 결과물의 reverse strand를 reverse complete process 기능을 이용하여 상보적인 염기서열로 변환하였다.
Clustal X 프로그램을 통해, forward strand의 염기서열과 reverse strand에 상보적인 염기서열이 일치함을 확인하였다. 상기 실험 과정을 통해 확인된 서열정보와 일치하는 모균주를 미국 국립생명공학정보센터(NCBI)에서 제공하는 BLAST 데이터베이스를 이용하여 동정(확인)하였다. 동정 결과, 모균주의 ITS rRNA는 사카로마이세스 세레비지에와 100% 일치함을 확인하였다.
[실시예 3] 알데히드탈수소효소 생산 능력이 우수한 돌연변이 후보 균주의 선별
본 발명의 야생형(wild-type) 사카로마이세스 세레비지에 모균주(parent strain)에 대한 돌연변이 유도 과정은, 미합중국 특허출원 제 17/176,365호에 기재된 방법에 따라 진행하였다.
효모 모균주에 돌연변이를 유도하기 위해 알데히드탈수소효소와 글루타치온을 모두 생산하는 야생 효모 균주를 에틸메탄설포네이트(EMS) 또는 니트로소구아니딘(NGD)으로 처리하였다. 돌연변이가 유도된 효모 균주를 다양한 농도의 메틸글리옥살에 노출시켰다. 메틸글리옥살에 적응력이 우수한 돌연변이 균주를 선택하였다. 선택된 효모 균주를 다양한 농도의 라이신에 노출시켰다. 라이신에 적응력이 우수한 돌연변이 균주를 선택하였다. 메틸글리옥살과 라이신에 적응력이 뛰어난 돌연변이 균주 30종을 확보하였다. 확보된 30종의 돌연변이 균주들의 성장곡선, ALDH 및 ADH 효소 활성, 조효소 함량, 글루타치온 함량을 기준으로 선별을 진행하였다.
3-1: 성장곡선(Growth characteristics)
사카로마이세스 세레비지에는 크랩트리 효과(Crabtree effect)가 positive인 미생물로서, 호기 조건에서 성장과 동시에 에탄올을 생성한다. 높은 수율로 효모 균을 성장시키기 위해서는, 높은 에탄올 저항성을 가진 사카로마이세스 세레비지에가 필요하다.
0, 5, 7, 10%의 각기 다른 농도의 에탄올이 함유된 YPD 배지와 OD660nm 값이 1이 되도록 농도를 조정한 사카로마이세스 세레비지에 배양액을 99:1로 혼합하였다. 효모가 혼합된 YPD배지는 30℃, 200rpm에서 진탕배양하였다. 돌연변이 균주의 성장곡선은 48시간 동안 3시간 간격으로 측정하였다. 돌연변이 균주의 성장특성은 유도기(lag phase)의 시간, 대수 증식기(exponential phase)의 비 증식속도(specific growth rate, OD660nm/hr), 최종 성장 정도(OD660nm)를 기준으로 평가하였다.
YPD배지의 에탄올 농도가 증가함에 따라 유도기(lag phase)의 시간은 증가하였으며, 최종 성장정도와 비증식속도는 감소하였다. 저농도(에탄올 5%) 및 고농도(에탄올 10%)에서 돌연변이 균주들의 최종 성장 정도를 상대비교한 결과, 9종의 돌연변이 균주에서 저농동에서의 성장 대비 고농도에서의 성장이 50% 유지 되었다. 다른 균주와 구별되는 9종의 돌연변이 균주들의 성장 특성은 고농도 에탄올에서의 짧은 유도기, 높은 비 증식속도였다.
# 5% ethanol 7% ethanol 10% ethanol 선별
hr OD660nm/hr OD660nm hr OD660nm/hr OD660nm hr OD660nm/hr OD660nm
1 9 0.6477 22.2 15 0.5210 16.5 24 0.1968 4.81
2 12 0.3675 12.34 24 0.1835 4.11 36 0.0140 0.212
3 9 0.4285 15.8 15 0.2888 9.12 24 0.0880 2.16
4 15 0.9683 25.3 15 0.8815 25.3 15 0.4085 12.4 K-1
5 12 0.7368 14.12 15 0.7337 12.23 21 0.2205 5.68
6 12 0.9683 9 15 0.8815 5.44 33 0.6269 0.448
7 24 0.9664 22.3 27 0.8467 16.8 30 0.2673 5.17
8 6 0.7268 23 9 0.6222 21.5 15 0.3778 12.11 K-2
9 6 0.8433 22.12 9 0.7484 25.34 15 0.3005 9.41
10 3 0.4880 14.5 18 0.2013 6.12 24 0.0808 2.14
11 3 0.2766 11.15 9 0.2223 8.22 24 0.0988 2.41
12 6 0.7149 21.68 9 0.5969 20.52 17 0.3317 11.4 K-3
13 9 0.6106 22.4 12 0.4906 16.4 15 0.1813 5.68
14 12 0.6136 20.6 24 0.3060 6.85 36 0.0278 0.41
15 12 0.4759 15.45 18 0.1751 5.41 33 0.0707 0.896
16 9 0.8533 23.8 15 0.8065 20.9 21 0.4953 12.1 K-4
17 21 0.6016 14.85 24 0.3955 8.45 24 0.0547 1.26
18 12 0.7766 19.25 18 0.4437 12.4 24 0.1219 2.85
19 3 0.5050 14.75 9 0.4463 14.6 21 0.2521 6.23
20 27 0.0666 1.41 36 0.0278 0.36 - - -
21 3 0.6044 22.14 9 0.6051 20.64 12 0.3247 11.1 K-5
22 24 0.5798 13.4 27 0.5080 10.1 30 0.1604 3.1
23 15 0.6455 16.9 15 0.5877 16.9 15 0.2003 6.3
24 3 0.7269 20.4 6 0.6375 18.6 12 0.3522 10.5 K-6
25 9 0.4858 16.7 15 0.3908 12.4 24 0.1476 3.6
26 6 0.6559 17.2 9 0.5821 19.7 15 0.3177 9.6 K-7
27 9 0.2857 10.5 15 0.1925 6.1 24 0.0587 1.4
28 12 0.6315 12.1 15 0.6289 10.5 21 0.1890 4.9
29 6 0.5451 17.3 9 0.4667 16.1 15 0.2834 9.1 K-8
30 9 0.7826 21.8 9 0.6614 19.9 21 0.3267 10.6 K-9
3-2:알코올탈수소효소와 알데히드탈수소효소 활성 측정
알코올탈수소효소(ADH)의 활성은 990μl reaction mixture[50mM potassium phosphate buffer(pH 8.0), 2mM NAD+, 1% ethanol]에 10μl의 본 발명의 효모 용해물(Lysate)를 첨가하여 측정하였다. 알데히드탈수소효소(ALDH)의 활성은 990μl reaction mixture[50mM potassium phosphate buffer(pH 8.0), 3mM NAD+, 1.5mM acetaldehyde]에 10μl의 본 발명의 효모 용해물(Lysate)를 첨가하여 측정하였다. 알코올탈수소효소 및 알데히드탈수소효소의 효소 반응은 30℃에서 5분간 진행하였으며, 효소 반응 결과 생성된 NAD(P)H의 농도는 340nm에서의 흡광도를 통해 측정하였다.
본 발명에서 선별된 돌연변이 균주 9종(K-1 내지 K-9)의 효소 활성을 측정하였다. 돌연변이 균주의 알코올탈수소효소 활성은 최소 382.69unit/g, 최대 975.29unit/g이었다. 돌연변이 균주의 효소 활성은 type-strain(대조용 기준 효모, KCTC7296)의 효소 활성 대비 최소 5.1, 최대 13.1 배 증가하였다. 돌연변이 균주의 알데히드탈수소효소 활성은 최소 15.23 unit/g, 최대 72.16 unit/g 이었다. 돌연변이 균주의 알데히드탈수소효소 활성은 type-strain의 효소 활성 대비 최소 5.3, 최대 24.9 배 증가하였다.
Type-strain과 비교하여, 6종의 돌연변이 균주(K-1, 4, 6, 7, 8, 9)는 ADH와 ALDH 효소 활성 증가 비율이 유사하였다. Type-strain과 비교하여, 3종의 돌연변이 균주(K-2, 3, 5)의 ALDH 효소 활성 증가율은 각각 18.3, 23.2, 24.9배 높았다. Type-strain과 비교하여, 3종의 돌연변이 균주(K-2, 3, 5)의 ADH 효소 활성 증가율은 각각 9.7, 11.6, 13.1배 높았다. 3종의 돌연변이 균주(K-2, 3, 5)의 ALDH 효소 활성 증가율은 ADH 효소 활성 증가율 보다 2배 높았다.
본 발명자는 알데히드탈수소효소(ALDH) 활성 증가에 특화된 3종의 돌연변이 균주(K-2, 3, 5)를 각각 PicoYP, PicoYP-01, PicoYP-02로 명명하였다. 3종의 신규 돌연변이 균주를 한국생명공학연구원의 생물자원센터에 기탁하여 KCTC14983BP, KCTC14984BP, KCTC14985BP의 기탁번호를 각각 부여받았다.
3-3: 본 발명의 돌연변이 균주들의 조효소(NAD, NADP) 생성 능력 비교
NADH/NAD quantification kit 및 NADPH/NADP quantification kit를 이용하여, 본 발명의 돌연변이 균주 용해물(lysate)의 NADtotal 및 NADPtotal 함량을 측정하였다. NAD(P) cycling buffer와 NAD(P) cycling enzyme mix를 이용하여 시료 내 NAD(P)를 NAD(P)H로 전환하였다. NAD(P) developer를 이용하여 발색 반응을 유도하였다. 발색 반응 결과는 450nm에서의 흡광도로 측정하였다. 측정된 흡광도는 표준 곡선에 대입하여 효모 용해물 내에 존재하는 NAD(P)total의 함량을 계산하였다.
본 발명에서 선별된 돌연변이 균주 9종(K-1 내지 K-9)의 조효소 함량을 측정하였다. 돌연변이 균주의 NADtotal 함량은 최소 126 nmole/g, 최대 195 nmole/g 이었다. 돌연변이 균주의 NADtotal 함량은 type-strain 대비 최소 7.3배, 최대 10.8배 증가하였다. 돌연변이 균주의 NADPtotal 함량은 최소 2.4 nmole/g, 최대 5.8 nmole/g 이었다. 돌연변이 균주의 NADPtotal 함량은 type-strain 대비 최소 11.4배, 최대 27.6배 증가하였다.
6종의 돌연변이 균주(K-1, 4, 6, 7, 8, 9)의 NADPtotal 함량 증가율은 NADtotal 함량 증가율 대비 2배 미만이었다. 본 발명의 신규 돌연변이 균주 3종(PicoYP, PicoYP-01, PicoYP-02)의 NADPtotal 함량 증가율은 각각 25.7, 22.9, 27.6배였다. 본 발명의 신규 돌연변이 균주 3종의 NADtotal 함량 증가율은 각각 10.8, 9.9, 11.3배였다. 본 발명의 신규 돌연변이 균주 3종의 NADPtotal 증가율은 NADtotal 증가율 대비 2배 이상이었다.
3-4: 돌연변이 사카로마이세스 세레비지에의 글루타치온 생산력 비교
본 발명의 돌연변이 균주 9종의 글루타치온 함량은 실시예 1-2와 동일한 방법으로 측정하였다. 돌연변이 균주의 글루타치온 함량은 최저 0.85%, 최고 1.05%였다. 돌연변이 균주의 글루타치온 함량은 type strain 대비 최저 2.7, 최고 3.3배 증가하였다. 본 발명의 신규 돌연변이 균주 3종(PicoYP, PicoYP-01, PicoYP-02)은 나머지 효모 대비 알데히드탈수소효소의 활성 증가율과 조효소의 함량 증가율이 높았다.
본 발명의 신규 돌연변이 효모 3종(PicoYP, PicoYP-01, PicoYP-02)은 기존의 기탁 균주(Kwon P-1, Kwon P-2, Kwon P-3)와 글루타치온 생산 능력이 비슷했다. 반면, 본 발명의 신규 돌연변이 효모 3종은 기존의 기탁 균주 대비 ADH 및 ALDH 효소 활성, 조효소 함량이 유의미하게 증가하였다.
Strain Enzyme activity* Coenzyme concentration** GSH(%) Name
ADH ALDH NADtotal NADPtotal
Type-strain 74.6 2.9 17.2 0.21 0.32 대조용균주 KCTC7296
K-1 542.26 23.11 169.8 4.1 1.00 KwonP-1 KCTC13925BP
K-2 725.11 53.1 185 5.4 0.86 PicoYP KCTC14983BP
K-3 866.41 67.4 171 4.8 0.85 PicoYP-01 KCTC14984BP
K-4 625.11 31.4 176 5.1 0.98 KwonP-2 KCTC14122BP
K-5 975.29 72.16 195 5.8 0.89 PicoYP-02 KCTC14985BP
K-6 458.88 16.21 154 3.1 1.05 -
K-7 382.69 15.23 126 2.4 1.00 -
K-8 422.17 16.19 142 2.9 0.99 -
K-9 533.54 20.68 167 3.2 1.00 KwonP-3 KCTC14123BP
대조용기준 균주 Type-strain 대비 증가율(배)을 [표 3]에 나타내었다.
Strain Enzyme activity* Coenzyme concentration** GSH(%) Name
AD.H ALDH NADtotal NADPtotal
Type-strain 1 1 1 1 1 - KCTC7296
K-1 7.3 8.0 9.9 19.5 3.1 KwonP-1 KCTC13925BP
K-2 9.7 18.3 10.8 25.7 2.7 PicoYP KCTC14983BP
K-3 11.6 23.2 9.9 22.9 2.7 PicoYP-01 KCTC14984BP
K-4 8.4 10.8 10.2 17.1 3.1 KwonP-2 KCTC14122BP
K-5 13.1 24.9 11.3 27.6 2.8 PicoYP-02 KCTC14985BP
K-6 6.2 5.6 9.0 14.8 3.3 -
K-7 5.1 5.3 7.3 11.4 3.1 -
K-8 5.7 5.6 8.3 13.8 3.1 -
K-9 7.2 7.1 9.7 15.2 3.1 KwonP-3 KCTC14123BP
[실시예 4] 돌연변이 균주들의 탄소원 이용 정도 측정(API test)비교
본 발명자가 2020년 2월18일에 한국특허 출원하였던 "ALDH와 글루타치온 동시 생산을 위한 돌연변이 균주 3종" (KwonP-1:KCTC13925BP, KwonP-2:KCTC14122BP, KwonP-3:14123BP)들이 성장에 이용하는 각종 탄소원을 측정하였다. 대조용 기준 효모 균주(KCTC7296)가 성장에 이용하는 각종 탄소원을 측정하였다. 본 발명의 ALDH 생산 능력 극대화를 위한 신규 돌연변이 균주 3종 (PicoYP, PicoYP-01, PicoYP-02)들이 성장에 이용하는 각종 탄소원을 측정하였다.
각 균주의 당 이용에 관한 특성 및 신규성은 API 50 CHL kit(API systems, BioMreus, SA, France)로 분석하였다.
8ml YPD 배지를 15ml conical tube에 분주하였다. 7종의 효모를 서로 다른 conical tube에 접종하였다.
30℃, 200rpm의 조건에서 24시간 배양하여, 급속성장단계(대수증식기, exponential growth phase) 구간에서 대수 증식기의 각각의 돌연변이 균주를 분리 및 확보하였다. 배지 내 탄소원의 영향을 제거하기 위해 원심분리기를 이용하여 효모를 3회 세척하였다. API 50 CHL medium을 이용하여 2McFarland 농도의 효모 현탁액을 제조하였다. 제조된 효모 현탁액을 strip의 튜브에 채웠다. 현탁액을 분주한 strip을 30℃에서 24시간 배양하였다.
API test에 이용되는 API 50 CHL medium은 보라색이었다. 에너지 대사에 의해 산이 생성되면 API 50 CHL medium은 파란색, 초록색을 거쳐 최종적으로 노란색으로 변하였다. API 50 CHL medium의 색 변화를 기준으로 탄소원의 사용 여부를 판단하였다.
탄소원 사용 정도 및 효모의 성장 정도를 +의 개수로 표시하여 기록하였다(보라색: X, 파란색: +, 초록색: ++, 노란색: +++).
실험에 이용된 7종의 효모는 모두 19종의 탄소원(L-arabinose, ribose, D-xylose, D-galactose, D-glucose, D-fructose, D-mannose, mannitol, N-acetyl-glucosamine, arbutin, salicin, cellobiose, maltose, lactose, melibiose, sucrose, trehalose, raffinose, gentiobiose)을 에너지원으로 이용하였다..
Rhamnose는 3종의 효모(KwonP-1, PicoYP-01, PicoYP-02)가 성장을 위한 탄소원으로 이용하였다. Sorbitol은 4종의 효모(KwonP-2, KwonP-3, PicoYP-01, PicoYP-02)가 성장을 위한 탄소원으로 이용하였다. α-methyl-D-mannoside는 4종의 효모(type-strain, KwonP-1, KwonP-2, PicoYP-02)가 성장을 위한 탄소원으로 이용하였다. Amygdalin은 6종의 효모(KwonP-1, KwonP-2, KwonP-3, PicoYP, PicoYP-01, PicoYP-02)가 성장을 위한 탄소원으로 이용하였다. D-turanose는 4종의 효모(type-strain, KwonP-1, KwonP-3, PicoYP-02)가 성장을 위한 탄소원으로 이용하였다. D-tagatose는 3종의 효모(type-strain, KwonP-3, PicoYP-02)가 성장을 위한 탄소원으로 이용하였다. Gluconate는 type-strain 만이 성장을 위한 탄소원으로 이용하였다.
알코올성 탄소원에 해당하는 mannitol과 sorbitol는 효모의 성장에 유의한 영향을 주었다. 본 발명의 신규 돌연변이 균주 3종(PicoYP, PicoYP-01, PicoYP-02)은 성장에 이용하는 당의 종류가 나머지 4종의 효모(type-strain, KwonP-1, KwonP-2, KwonP-3)와 달랐다. 돌연변이 균주 간에도 선호하는 당의 종류에 차이가 있었다.
  대조용 기준 균주 KwonP-1 KwonP-2 KwonP-3 Pico
YP
Pico
YP-01
Pico
YP-02
L-Arabinose ++ +++ ++ +++ ++ ++ +++
Ribose +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
D-Xylose + ++ + + ++ ++ +
D-Galactose + +++ ++ ++ +++ ++ ++
D-Glucose ++ +++ +++ ++ +++ ++ ++
D-Fructose ++ +++ ++ ++ +++ ++ ++
D-Mannose ++ +++ +++ ++ +++ ++ ++
Rhamnose   + ++ ++
Mannitol + + + + ++ +++ +++
Sorbitol   + + +++ +++
α-Methyl-D-Mannoside +++ + +   +++
N-Acetyl-Glucosamine +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
Amygdalin   + + + ++ ++ ++
Arbutin +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
Salicin +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
Cellobiose +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
Maltose ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
Lactose ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
Melibiose ++ + +++ +++ ++ ++ +++
Sucrose ++ +++ ++ ++ +++ +++ ++
Trehalose ++ + ++ ++ ++ ++ ++
Raffinose ++ + + ++ ++ ++ +++
Gentiobiose ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
D-Turanose + + +     +
D-Tagatose ++ +     ++
Gluconate +      
[실시예 5] 위산에서 돌연변이 균주의 알데히드탈수소효소 활성 변화
KARC가 경구로 투여될 때, 장내에서 효소활성이 유지되기 위해서는 펩신(pepsin)과 같은 강력한 단백질 분해 효소를 분비하는 위산에 의해 효소 활성이 파괴되지 않고, 안전하게 통과되어야 한다.
위에서 음식물을 섭취하였을 때의 환경을 조성하기 위해 인공 위액(Artificial gastric juice, pH 1.17)을 NaOH 용액을 이용해 pH 3과 pH 5로 제조하였다. 본 발명의 KARC 1g에 인공위액(pH 1.17, 3, 5) 7ml을 넣고 36.5℃에서 5, 30, 60, 90분 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 다음 sodium hydroxide (NaOH) 용액을 이용해 반응 혼합물을 pH 7로 중화하여 최종 부피가 10ml인 혼합물을 제조하였다. 본 발명의 돌연변이 균주의 알데히드탈수소효소(ALDH) 활성을 측정하였다.
pH 1.17의 위액과 본 발명의 돌연변이 균주를 반응시킨 결과, 반응 5분 후에 알데히드탈수소효소(ALDH) 활성은 대조군 대비 평균 92.88% 이상 감소하였다. 반응시간이 길어질수록 알데히드탈수소효소(ALDH) 활성은 감소하여 반응 90분 후에는 대조군 대비 평균 98.89% 감소하였다. pH 3 및 pH 5에서는 좀 더 높은 효소 활성이 유지되었으며, 반응 90분 후 pH 3에서는 대조군 대비 평균 96.66%, pH 5에서는 56.83% 감소하였다.
보다 상세하게는, 위액(pH 1.17)과 KwonP-1(KCTC13925BP)을 반응시켰을 때, 반응5분 후 알데히드탈수소효소(ALDH) 활성은 대조군 대비 90.94% 감소하여, 5.57 unit/g으로 측정되었다. 반응시간이 길어질수록 효소의 활성은 감소하였고, 반응 90분 후에는 대조군 대비 98.57% 감소하여 0.88 unit/g으로 측정되었다[도 9]. pH 3 및 pH 5에서는 효소의 활성이 pH 1.17보다 더 높게 유지되었다. 반응시간 90분 후 효소의 활성은 pH 3에서는 대조군에 비하여 96.66% 감소한 2.05 unit/g, pH 5에서는 대조군에 비하여 47.76% 감소한 32.12 unit/g으로 측정되었다.
위액(pH 1.17)과 KwonP-2(KCTC14122BP)을 반응시킨 결과, 효소 반응 5분 후 ALDH의 활성은 대조군에 비하여 91.18% 감소하였고, 5.43 unit/g으로 측정되었다. 반응시간이 길어질수록 효소 활성은 감소하였고, 반응 90분 후에는 대조군에 비하여 98.81% 감소하여 0.73 unit/g으로 측정되었다[도 10]. pH 3 및 pH 5에서는 pH 1.17보다 더 높은 효소 활성이 유지되었다. 반응시간 90분 후 효소 활성은 pH 3에서는 대조군에 비하여 97.62% 감소한 1.47 unit/g, pH 5에서는 대조군에 비하여 56.11% 감소한 26.99 unit/g으로 측정되었다.
위액(pH 1.17)과 KwonP-3(KCTC14123BP)을 반응시킨 결과, 반응 5분 후 ALDH 활성은 대조군 대비 89.99% 감소하여, 6.16 unit/g으로 측정되었다. 반응시간이 길어질수록 효소의 활성은 감소하였고, 반응 90분 후에는 대조군 대비 97.85% 감소하여 1.32 unit/g으로 측정되었다[도 11]. pH 3 및 pH 5에서는 pH 1.17보다 더 높은 효소 활성이 유지되었다. 반응시간 90분 후 효소의 활성은 pH 3에서는 대조군 대비 92.61% 감소한 4.55 unit/g, pH 5에서는 대조군 대비 62.31% 감소한 23.18 unit/g으로 측정되었다.
위액(pH 1.17)과 PicoYP(KCTC14983BP)을 반응시킨 결과, 반응 5분 후 ALDH 활성은 대조군 대비 92.84% 감소하여, 4.40 unit/g으로 측정되었다. 반응시간이 길어질수록 효소 활성은 감소하였고, 반응 90분 후에는 대조군 대비 98.33% 감소하여 1.03 unit/g으로 측정되었다[도 12]. pH 3 및 pH 5에서는 더 높은 효소 활성이 유지되었다. 반응시간 90분 후 효소의 활성은 pH 3에서는 대조군 대비 96.66% 감소한 2.05 unit/g, pH 5에서는 대조군 대비 53.97% 감소한 28.31 unit/g으로 측정되었다.
위액(pH 1.17)과 PicoYP-01(KCTC14984BP)을 반응시킬 때, 반응 5분 후 ALDH 활성은 대조군 대비 95.71% 감소하여, 2.64 unit/g으로 측정되었다. 반응시간이 길어질수록 효소 활성은 감소하였고, 반응 90분 후에 효소 활성은 대조군 대비 99.76% 감소하여 0.15 unit/g으로 측정되었다[도 13]. pH 3 및 pH 5에서는 위액보다 더 높은 효소 활성이 유지되었다. 반응시간 90분 후 효소 활성은 pH 3에서는 대조군 대비 98.21% 감소한 1.10 unit/g, pH 5에서는 대조군 대비 58.74% 감소한 25.38 unit/g으로 측정되었다.
위액(pH 1.17)과 PicoYP-02(KCTC14985BP)을 반응시킬 때, 반응 5분 경과한 후 ALDH 활성은 대조군 대비 96.66% 감소하여, 2.05 unit/g으로 측정되었다. 반응시간이 길어질수록 효소 활성은 감소하여, 반응 90분 후에는 효소 활성이 관찰되지 않았다[도 14]. pH 3 및 pH 5에서는 위액에서보다 더 높은 효소 활성이 유지되었다. 반응시간이 90분 경과한 후 효소 활성은 pH 3에서는 대조군 대비 98.21% 감소한 1.10 unit/g, pH 5에서는 대조군 대비 62.08% 감소한 23.32 unit/g으로 측정되었다.
pH 1.17은 극단적인 수치로, 음식물을 섭취할 때 분비되는 위액 원액의 pH이다. 위액 원액과 음식물이 위에서 섞이면 pH가 3에서 5로 올라가기 때문에 pH 1.17이 될 가능성은 희박하다. 그럼에도 본 발명의 돌연변이 균주에 함유된 ALDH는 극단적인 조건인 pH 1.17에서도 효소활성이 남아있었다.
이상과 같은 결과에서, 본 발명의 신규한 돌연변이 효모 균주(PicoYP, PicoYP-01, PicoYP-02)가 극단적인 pH 1.17에서 5분 동안 반응했을 때는, 효소활성이 심하게 92-97% 파괴된다. 하지만 효소활성이 2-5 unit 남는데, 이는 장내에서 충분히 작용할 수 있는 값이다. pH 3, 5에서는 상당량의 효소활성이 잔존하였다. 본 발명의 돌연변이 균주 유래 효소를 경구 투여용으로 사용할 수 있다는 결론을 얻었다.
[실시예 6] 5L 배양조 배양 시험
YPD 액체배지(2% peptone, 1% yeast extract, 2% glucose)에 효모를 접종하고 30℃, 200 rpm에서 18시간 동안 1차 종균 배양을 진행하였다. YPD 액체배지 1980 ml에 종균 배양액 20ml을 접종하여 5L 배양조 배양을 하였다. 5L 배양조 배양은 30℃, 200 rpm에서 48시간 동안 진행하였다. 배양 중 배양액 10ml을 채취하여 균의 성장(OD660nm) 및 효소 활성의 변화를 측정하였다.
KwonP-1(KCTC13925BP)의 최종 성장(OD660nm)는 134.4 이었다. KwonP-1의 최종 성장은 type-strain(KCTC7296) 대비 4.35% 높았다. KwonP-1의 성장곡선의 특징 및 비성장속도(OD660nm/hr)는 type-strain과 유사하였다. KwonP-1의 ALDH 활성은 33.6 unit/g 이었다. KwonP-1의 ALDH 활성은 type-strain 대비 11.96배 높았다[도 15].
KwonP-2(KCTC14122BP)의 최종 성장(OD660nm)는 133.8 이었다. KwonP-2의 최종 성장은 type-strain 대비 3.88% 높았다. KwonP-2의 성장은 type-strain 보다 일찍 종료되었다. KwonP-2의 비성장속도(OD660nm/hr)는 type-strain 대비 14.8% 높았다. KwonP-2의 ALDH 활성은 31.5 unit/g 이었다. KwonP-2의 ALDH 활성은 type-strain 대비 11.21배 높았다[도 16].
KwonP-3(KCTC14123BP)의 최종 성장(OD660nm)는 134.1 이었다. KwonP-3의 최종 성장은 type-strain 대비 4.12% 높았다. KwonP-3의 성장은 type-strain 보다 일찍 종료되었다. KwonP-3의 비성장속도(OD660nm/hr)는 type-strain 대비 6.08% 높았다. KwonP-3의 ALDH 활성은 29.5 unit/g 이었다. KwonP-3의 ALDH 활성은 type-strain 대비 10.5 배 높았다[도 17].
PicoYP(KCTC14983BP)의 최종 성장(OD660nm)는 123.8 이었다. PicoYP의 최종 성장은 type-strain 대비 3.88% 높았다. PicoYP의 성장곡선의 특징은 type-strain과 유사하였다. PicoYP의 비성장속도(OD660nm/hr)는 type-strain 대비 6.22% 높았다. PicoYP의 ALDH 활성은 44.2 unit/g 이었다. PicoYP의 ALDH 활성은 type-strain 대비 15.73 배 높았다[도 18].
PicoYP-01(KCTC14984BP)의 최종 성장(OD660nm)는 126.9이었다. PicoYP-01의 최종 성장은 type-strain 대비 1.47% 높았다. PicoYP-01의 성장곡선의 특징은 type-strain과 유사하였다. PicoYP-01의 비성장속도(OD660nm/hr)는 type-strain 대비 2.14% 높았다. PicoYP-01의 ALDH 활성은 47.1 unit/g 이었다. PicoYP-01의 ALDH 활성은 type-strain 대비 16.76 배 높았다[도 19].
PicoYP-02(KCTC14985BP)의 최종 성장(OD660nm)는 148.1 이었다. PicoYP-02의 최종 성장은 type-strain 대비 14.99% 높았다. PicoYP-02의 성장곡선은 type-strain 대비 상단에 위치하였다. PicoYP-02의 비성장속도(OD660nm/hr)는 type-strain 대비 9.64% 낮았다. PicoYP-02의 ALDH 활성은 52.68 unit/g 이었다. PicoYP-02의 ALDH 활성은 type-strain 대비 18.75 배 높았다[도 20].
[실시예 7] 본 발명의 돌연변이 균주 용해물(KARC)의 제조
본 발명의 돌연변이 효소 용해물에 포함된 효소(ALDH, ADH)의 보존을 위해 단백질 분해효소(protease)를 제거 및 억제하였다. 본 발명의 돌연변이 효소 용해물에 포함된 효소(ALDH, ADH)의 보존을 위해 세포 구조물(cell debris)을 제거하였다. 그 후 돌연변이 균주들의 건조물 또는 용해물(lysate)을 혼합하여, 본 발명의 KARC 조성물을 제조하였다.
본 발명의 돌연변이 균주와 이를 배양한 배지에는 효모의 대사산물과 효모가 분비하는 단백질 분해효소 등 다양한 물질이 존재하였다. 효모에 존재하는 알데히드탈수소효소 및 조효소, 글루타티온을 추출 및 보존하기 위해서는 효모 균 외부의 물질을 충분히 제거할 필요가 있으며, 이를 위해 세척 과정을 수행하였다. 돌연변이 균주의 세척은 50ml conical tube에 40ml씩 배양액을 분주하고, 13,000rpm에서 15분간 원심분리 후 상등액을 제거하여 진행하였다.
원심분리 결과, 효모 균들이 뭉쳐서 생성되는 펠렛(pellet) 내부에 잔여 배지가 남아있었다. 30ml 정제수를 첨가한 후, vortexing을 통해 펠렛을 충분히 풀어주었고, 이전의 과정을 3회 반복하여 잔여 배지를 충분히 제거하였다.
효모의 에탄올 저항성은 최대 13%으로 알려져 있으며, 높은 농도의 에탄올에 노출되면 효모 균이 사멸하게 된다. 세척된 펠렛을 효모 균의 사멸을 유도하기 위해 20% 에탄올 용액 10ml을 이용하여 충분히 풀어주었다. 그 후 에탄올에 풀어준 펠렛을 100rpm에서 30분간 교반하여 효모 균의 사멸 공정을 진행하였다. 반응시간이 종료되면 30ml 정제수를 첨가하여 에탄올 농도를 5%까지 낮추었다. 이전의 세척 과정을 3회 반복하여 에탄올을 충분히 제거하였다.
효모 세포 내에 존재하는 단백질 분해효소의 분해작용으로부터 ALDH 및 ADH를 보존하기 위해 단백질 분해효소 억제제(Pierce protease inhibitor mini tablets, EDTA-free, Thermo Scientific) 2 tablet을 녹인 1X PBS 10ml을 준비하였다. 위 용액을 세척이 종료된 효모 균 펠렛에 첨가하여 충분히 풀어주었다.
본 발명에서 제조한 돌연변이 균주의 용해물을 제조하고자 유리 구슬(Glass beads) 4g을 투여 및 교반하여 효모 세포벽을 파괴하였다. 그 후 효모 균의 파쇄 과정에서 발생하는 열에 의한 효소의 변성을 방지하기 위해 30초 vortexing, 30초 ice incubation을 6회 반복하여 수행하였다.
효모 균의 세포벽 파쇄가 완료된 후에 100mM potassium phosphate buffer 10ml을 첨가하고 3-5 초 동안 vortexing 하여 혼합하였다. 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 효모 세포벽 등의 세포 구조물과 유리 구슬을 제거하였다. 이후 상등액을 0.2μm 필터(Minisartⓡ Syringe Filter, Sartorius, Goettingen, Germany)로 여과하여, 본 발명의 KARC 조성물을 제조하였다.
본 발명의 돌연변이 효소 용해물에 포함된 효소(ALDH, ADH)의 보존을 위하여 세포 내 단백질 분해효소(protease)를 제거 및 억제하고, 세포벽 등의 세포 구조물(cell debris)을 제거하였다. 이를 통해 KwonP-1, KwonP-2, KwonP-3, PicoYP, PicoYP-01, PicoYP-02의 돌연변이 균주들 중에서 선택되는 어느 하나의 용해물(lysate) 또는 이들이 자유로운 비율로 혼합된 본 발명의 KARC 조성물을 제조하였다(표 6).
KwonP-1로부터 제조한 KARC1의 ADH, ALDH 효소 활성은 각각 461.4 unit/g, 28.6 unit/g으로 나타났다. KwonP-1로부터 제조한 KARC1의 조효소인 NADtotal 및 NADPtotal 함량은 각각 176.2 μmole/g, 5.1 μmole/g으로 나타났다. KwonP-1로부터 제조한 KARC1의 GSH 함량은 0.98 wt%로 나타났다.
KwonP-2로부터 제조한 KARC2의 ADH, ALDH 효소 활성은 각각 482.1 unit/g, 29.8 unit/g으로 나타났다. KwonP-2로부터 제조한 KARC2의 조효소인 NADtotal 및 NADPtotal 함량은 각각 175.4 μmole/g, 5.2 μmole/g으로 나타났다. KwonP-2로부터 제조한 KARC2의 GSH는 0.96 wt%로 나타났다.
KwonP-3로부터 제조한 KARC3의 ADH, ALDH 효소 활성은 각각 477.5 unit/g, 28.1 unit/g으로 나타났다. KwonP-3로부터 제조한 KARC3의 조효소인 NADtotal 및 NADPtotal 함량은 각각 177.2 μmole/g, 5.1 μmole/g으로 나타났다. KwonP-3로부터 제조한 KARC3의 GSH는 1.00 wt%로 나타났다.
PicoYP로부터 제조한 KARC4의 ADH, ALDH 효소 활성은 각각 586.8 unit/g, 33.8 unit/g으로 나타났다. PicoYP로부터 제조한 KARC4의 조효소인 NADtotal 및 NADPtotal 함량은 각각 184.3 μmole/g, 5.7 μmole/g으로 나타났다. PicoYP로부터 제조한 KARC4의 GSH는 0.84 wt%로 나타났다.
PicoYP-01로부터 제조한 KARC5의 ADH, ALDH 효소 활성은 각각 621.6 unit/g, 38.2 unit/g으로 나타났다. PicoYP-01로부터 제조한 KARC5의 조효소인 NADtotal 및 NADPtotal 함량은 각각 186.9 μmole/g, 5.6 μmole/g으로 나타났다. PicoYP-01로부터 제조한 KARC5의 GSH는 0.83 wt%로 나타났다.
PicoYP-02로부터 제조한 KARC6의 ADH, ALDH 효소 활성은 각각 664.1 unit/g, 41.6 unit/g으로 나타났다. PicoYP-02로부터 제조한 KARC6의 조효소인 NADtotal 및 NADPtotal 함량은 각각 195.0 μmole/g, 5.8 μmole/g으로 나타났다. PicoYP-02로부터 제조한 KARC6의 GSH는 0.88 wt%로 나타났다.
본 발명의 KARC는 본 발명자가 기탁한 돌연변이 균주 6종의 용해물의 혼합물이었다. KARC의 알코올탈수소효소(ADH, ADH) 및 알데히드탈수소효소(ALDH, ALDH) 활성은 각각 547.6 unit/g, 33.1 unit/g으로 나타났다. KARC 내 조효소인 NADtotal, NADPtotal의 함량은 각각 180.4 μmole/g, 5.4 μmole/g으로 나타났다. KARC의 글루타티온(glutathione, GSH) 함량은 0.84 wt%로 나타났다.
이 결과를 통해 본 발명의 KARC의 알데히드 분해 능력이 용해물(lysate) 제조 과정에서 유지됨을 확인할 수 있었다. 또한 높은 알데히드 탈수소 반응을 촉진하는 능력으로 인하여, 인체 내에서 생성되는 HNE, MDA, 3,4-dihydroxyphenyl acetaldehyde(DOPAL) 등의 독성 알데히드를 제거하는 능력을 나타내었다.
명칭 균주 ADH
(Unit/g)
ALDH
(Unit/g)
NADtotal
(nmole/g)
NADPtotal
(nmole/g)
GSH
(wt %)
KARC1 KwonP-1 461.4 28.6 176.2 5.1 0.98
KARC2 KwonP-2 482.1 29.8 175.4 5.2 0.96
KARC3 KwonP-3 477.5 28.1 177.2 5.1 1.00
KARC4 PicoYP 586.8 33.8 184.3 5.7 0.84
KARC5 PicoYP-01 621.6 38.2 186.9 5.6 0.83
KARC6 PicoYP-02 664.1 41.6 195.0 5.8 0.88
KARC 전체 평균 547.6 33.1 180.4 5.4 0.91
[실시예 8] 본 발명의 돌연변이 균주가 함유하는 알데히드탈수소효소의 염기서열 분석
본 발명의 돌연변이 균주의 알데히드탈수소효소와 돌연변이 이전의 모균주의 알데히드탈수소효소의 유전자 염기서열의 차이를 확인하였다. 모균주 및 KwonP-1, KwonP-2, KwonP-3, PicoYP, PicoYP-01, PicoYP-02의 돌연변이 균주들의 유전자 염기서열 분석(Whole genome sequencing)를 진행하였다. 돌연변이 균주들의 순수한 콜로니를 고체 배지 전체에 도말하여 균을 확보하였다. 확보된 균의 유전자 염기서열 분석을 진행하였다.
효모 균주들이 각각 생산하는 알데히드탈수소효소(ALD, Yeast aldehyde dehydrogenases) 효소 중, ALD2(서열번호3번), ALD3(서열번호4번)는 13번 염색체(chromosome)에 연속적으로 연결되어 위치하고 있었다. ALD2(서열번호3번), ALD3(서열번호4번) 사이에는 689개 염기서열로 구성된 non-coding region이 존재하였다.
효모 균들의 ALD2, ALD3는 같은 유전체에 연속되게 존재하였다. ALD2와 ALD3는 각각의 알데히드탈수소효소를 코딩하고 있었다. ALD2와 ALD3는 각각 1,521개 염기(nucleotide)로 구성되며, 506개 아미노산(amino acid)을 코딩하고 있는 등 유사한 점이 있다. 125개 염기서열(8.2%)에서 서로 차이를 보이는 서로 다른 별개의 알데히드탈수소효소로 확인되었다.
본 발명자가 기탁한 6종의 돌연변이 균주(KwonP-1, KwonP-2, KwonP-3, PicoYP, PicoYP-01, PicoYP-02)들에서는, ALD2 염기서열 말단에 종결 코돈이 존재하지 않아 연속적으로 단백질이 합성된다. 그 결과 ALD2의 일부분과 ALD3이 연결된 거대해진 신규한 알데히드탈수소효소를 생성한다[서열번호1].
보다 상세하게는, 기존의 대조용 효모균주(KCTC7296)의 알데히드탈수소효소(ALD2)[서열번호3]는 3말단에 종결 코돈을 제외한 9개 아미노산 (N-VHINLSLDN-C)을 코딩하고 있는 30개의 염기서열 (5'-GTTCACATAAATCTCTCTTTGGACAACTAA-3')이 존재하였다.
본 발명의 6종의 돌연변이 균주의 알데히드탈수소효소들의 ALD2와 ALD3의 5말단 사이에는 14개 아미노산(N-RYRLYTFRKLAKRK-C)를 코딩하는 42개의 염기서열(5'-AGATATAGATTATACACATTTAGAAAATTAGCCAAAAGAAAA-3')의 특징적인 염기서열이 존재하였다[서열번호2]
이와 같이, 본 발명의 돌연변이 균주 6종에서는 ALD2의 1,492번째 염기부터 non-coding region의 647번째 염기까지 소멸하였다. 결과적으로 ALD2의 종결 코돈이 없어지게 되어 총 3,054개 염기로 이루어진 새로운 유전자가 신규한 알데히드탈수소효소를 코딩하고 있었다. [서열번호1]
[실시예 9]
본 발명의 KARC에 의한 GABA aldehyde(SSA) 화합물의 분해대사
본 발명의 KARC에 의한 Succinic semialdehyde (SSA)가 Succinic acid로 전환되는 정도를 관찰하였다.
9-1: In vitro SSA 분해 실험
50mM, pH 7.5 HEPES 완충액에 KCl을 200 mM이 되도록 녹였다. 이 완충액 845μl를 마이크로튜브에 분주하고, 100mM EDTA 수용액 15μl, 100mM NADP+ 수용액 30μl, 10mM GBA in acetonitrile 용액 100μl, 300mg/mL KARC 10μl를 추가 분주하였다. 음성 대조군으로, 완충액 845μl를 마이크로튜브에 분주하고, 100mM EDTA 수용액 15μl, 100mM NADP+ 수용액 30μl, 10mM SSA in acetonitrile 용액 100μl, 증류수 10μl를 추가 분주하였다.
반응물은 Hot plate stirrer를 이용하여 30℃ 또는 37℃에서 1시간 또는 3시간 동안 교반되었다. 반응이 끝난 후, 각 반응물로부터 500μl를 분주하여 마이크로튜브에 분주하였다. 용기에 메탄올 470μl, 50mM DNPH (2,4-Dinitrophenyl hydrazine in acetonitrile) 용액 20μl, 6N HCl 10μl를 추가 분주하고, 70℃에서 40분 가열하였다. 가열한 반응물을 식힌 뒤, 10μl를 정량하여 HPLC에 주입하여 분석하였다.
HPLC 분석 조건은 C18 컬럼을 사용하여 용매(Acetonitrile(1v/v% Trifluoroacetic acid), water(1v/v% Trifluoroacetic acid))를 Water(1v/v% Trifluoroacetic acid) 80%에서 시작하여 15분 후 20%가 되도록 역상으로 흘려, 자외선 검출기 360nm 파장에서 얻어 분석하였다. 결과는 음성대조군 대비 실험군 내 DNPH-SSA 복합체의 감소량을 통해 알데히드가 소모되는 반응의 진행 정도를 확인하였다[도 21, 22, 23].
37℃에서 1시간 반응시켰을 때, 반응물 내 DNPH-GBA 복합체의 양은 55.0% 감소하였다[도 22]. 37℃에서 3시간 반응시켰을 때, 반응물 내 DNPH-GBA 복합체의 양은 74.9% 감소하였다[도 23].
이러한 결과는, 알데히드탈수소효소(ALDH)를 함유하는 본 발명의 효모 조성물(KARC)에 의해, GABA 유래 알데히드인 SSA가 인체에 무해한 Succinic acid로 전환되는 사실을 보여준다.
[실시예 10]
KARC 경구투여에 의한 아세트알데히드와 말론디알데히드(MDA) 분해 시험
아세트알데히드 및 MDA 동물 실험에는 5주령 수컷 Sprague Dawley(SD) 쥐(Rat)를 사용하였다. KARC 조성물을 10unit/kg 또는 20unit/kg 쥐(Rat)에게 경구 투여하였고, KARC 주입 30분 후에 쥐(Rat)에게 알코올(3g/kg)를 경구 투여하였다. 투여 처리가 끝난 후 KARC 주입 후 0, 1, 3, 5, 8 시간에 꼬리 정맥에서 혈액 샘플을 채취하였으며, 원심분리 후 혈장(plasma)를 -80℃에서 보관하였다[4, 5].
10-1: KARC 경구투여에 의한 아세트알데히드의 감소 효과
KARC 경구 투여에 의한 총 아세트알데히드 감소 효과는 Acetaldehyde assay kit(LSBio, Seattle, WA, USA)를 사용하였다. 각 샘플은 96 well plate의 2개 well에 20μl씩 분주한 후, 1개의 well에는 80μl의 working reagent(75 μl assay buffer, 8 μl NAD/MTT, 1 μl Enzyme A, 1 μl Enzyme B)을, 나머지 1개의 well에는 80μl의 blank working reagent(75 μl assay buffer, 8 μl NAD/MTT, 1 μl Enzyme B)를 분주하였다. Plate를 가볍게 섞어준 후 상온에서 30분간 반응시켰다. 반응이 종료되면 565nm(520-600nm)에서 흡광도를 측정하였다.
아세트알데히드의 농도는 에탄올 투여 1시간 후 최대치에 도달하였고, KARC 조성물 투여군에서 감소하는 경향을 보였다. KARC 투여군에서 에탄올 투여 1시간, 3시간 및 5시간 후 대조군(Vehicle) 대비 아세트알데히드 농도가 유의하게 감소하였으며, 특히, KARC 고용량 투여군(F)에서 혈중 아세트알데히드 농도는 각각 0.356, 0.224, 0.091mM로 대조군 대비 각각 39.2%, 58.4%, 72.1% 감소하였다[도 4].
10-2: KARC 경구투여에 의한 MDA의 감소 효과
혈액 내 총 말론디알데히드 함량은, 제조사(ZeptoMetric, Buffalo, NY, USA)의 포로토콜에 따라 OxiTecTM TBARS assay kit를 사용하여 분석하였다. Conical tube에 100μl 샘플과 100μl 8.1% SDS solution, 4ml의 색 지시약(TBA, 10% NaOH 용액, 20% 아세트산)을 첨가한 후, 95℃의 항온수조에서 60분간 반응시켰다. 반응 종료 후, 샘플을 4℃, 1,600rpm에서 10분간 원심 분리하여 상온에서 30분간 안정화시켰다. 96 well plate에 상등액 150μl를 옮기고, 530-540nm에서 흡광도를 측정하였다.
대조군(Vehicle)에서 에탄올 투여 3시간 후에 혈중 MDA의 농도가 최대값에 도달한 반면, KARC를 투여한 군에서는 에탄올 투여 1시간 후에 최대 값에 도달했다. 이후 혈중 MDA 농도가 감소하여 에탄올 투여 3시간 및 5시간 후 대조군과 유의미한 차이를 보였다. KACR 고용량 투여군(F)의 혈중 MDA 농도는 각각 0.232, 0.137μM로 대조군 대비 80.4%, 86.3% 감소하였다[도 5].
이러한 결과는, KARC의 경구 투여가 혈액 내 아세트알데히드(Ach) 및 말론디알데히드(MDA) 등 다양한 내인성 알데히드를 감소시키는 효과를 나타내었다.
[실시예 11]
KARC 경구 투여에 의한 산화스트레스 감소 효과.
활성산소나 산화 스트레스는 음주시 알코올이 알코올탈수소효소(ADH)에 의해서 과잉의 아세트알데히드(Ach)가 생성되어 증가하지만, 알데히드탈수소효소(ALDH)가 작용하여 초산으로 전환시켜 체외로 배출시킨다. 알데히드탈수소효소 유전자 돌연변이로 인한 경우이거나 알코올 과잉에 의한 알데히드 과잉 상태는 지방의 과산화 반응(Lipid peroxidation)을 유발한다.
그 결과 생성되는 아세트알데히드와 말론디알데히드는 산화스트레스를 악화시키고 미토콘드리아 에너지 대사를 방해한다. 또한 세포에 변성 단백질 축적을 통해 소포체 스트레스를 유발시켜 세포가 사멸하게 된다.
음주 후 시간에 따른 혈중 아세트알데히드의 농도를 측정하였다[도 6]. 그 결과 혈중 아세트알데히드(Ach)의 곡선 하부 면적(Area under the curve; AUC)은 알코올 단독 섭취시 13.02 ± 1.18 mg h/dL이었다. 10unit/kg KARC 복용시에는 혈중 아세트알데히드(Ach)의 곡선 하부 면적이 9.39 ± 1.07 mg h/dL 로 알코올 단독 섭취시 대비 26.13% 통계적으로 유의하게 감소하였다(P=0.005).
20unit/kg KARC 복용시에는 혈중 아세트알데히드(Ach)의 곡선 하부 면적이 5.22 ± 0.99 mg h/dL으로 알코올 단독 섭취시 대비 통계적으로 유의하게 55.71% 감소하였다(P<0.001). 또한 10unit/kg KARC 복용군과 20unit/kg KARC 복용군을 비교했을 때도, 20unit/kg KARC 복용군의 혈중 아세트알데히드(Ach)가 유의하게 감소하였다(P=0.034). 이로 인해, KARC는 용량 의존적으로 시간에 따른 혈중 아세트알데히드(Ach)의 총량을 감소시켰다.
결론적으로, KARC 복용에 따른 아세트알데히드(Ach) 혈중 농도의 감소는 산화스트레스를 감소시킴으로 건강에 긍정적인 영향을 나타낸다.
항암 치료(chemotherapy) 기간 중 혈중 말론디알데히드(MDA)의 농도를 측정했다[도 7]. 그 결과 대조군의 혈중 말론디알데히드(MDA)의 농도는 0.607 ± 0.161 μM 이었다. KARC를 복용하며 치료를 진행한 군의 혈중 말론디알데히드(MDA)의 농도는 0.223 ± 0.033 μM로 대조군 대비 63.3% 유의하게 감소하였다(P<0.001).
또한, 대조군에서는 혈중 말론디알데히드(MDA)의 농도가 최저 0.427 μM, 최고 0.885 μM로 편차가 매우 컸지만, KARC 복용군에서는 최저 0.158 μM, 최고 0.269 μM로 편차가 큰 폭으로 감소하였다. 이를 통해 혈중 말론디알데히드(MDA)의 농도를 감소시킬 뿐 아니라 안정화시키는 효과를 확인하였다[도 8].
약물 복용, 과도한 스트레스, 극렬한 운동 등은 인체내 활성산소(ROS, reactive oxygen species)를 증가시켜서, 지질과산화(Lipid peroxidation)를 유발하여 말론디알데히드(MDA), 아세트알데히드(Ach)를 증가시킨다. 신경전달물질에서 유래되는 glutamate semialdehyde(GSA) 그리고 succinic semialdehyde(SSA)도 증가된다. 이러한 반응성 알데히드 물질이 세포에 축적되면 진전(떨림) 증상 또는 이상 동작(movement disorder) 증상이 야기된다.
특히, 격렬한 운동을 통하여 산화 스트레스가 과도하게 발생하면, 말론디알데히드, 아세트알데히드, Glutamate semialdehyde(GSA) 그리고 succinic semialdehyde(SSA)가 체내에 증가하면서, 진전(떨림) 증상 또는 이상 동작(movement disorder) 증상이 발생한다.
또한 이렇게 생성된 반응성 알데히드는 주변 단백질과 반응하거나 또는 이차 대사 과정을 통해 Malondialdehyde-acetaldehyde adduct(MAA), Malonedialdehyde lysine adducts(M-lys adducts) 등 반응성 알데히드의 안정화된 최종산물(Advanced Lipidperoxidation End Product)로 축적되어 다양한 세포에 독소로 작용하여 산화스트레스 더욱 악화시키는 상승 작용을 일으킨다.
돌연변이 효모 조성물인 KARC는, 말론디알데히드, 아세트알데히드, Glutamate semialdehyde(GSA) 그리고 succinic semialdehyde(SSA)를 동시에 감소시켜 인체 내 활성산소와 산화스트레스를 감소시켜, 진전(떨림) 증상 또는 이상 동작(movement disorder) 증상 억제 효과를 나타낸다.[도 4] 내지 [도 8], [도 15] 내지 [도 18].
[실시예 12] 본 발명의 조성물의 단기투여 독성 시험
실시예 12-1. 실험 동물의 준비
실험동물은 암컷, 수컷 ICR 마우스(7 주령)를 분양받아 7일간 순화시켰으며 순화 기간 중 일반증상을 관찰하여 건강한 동물만 시험에 사용하였다. 사료와 물은 자유 섭취시켰고 경구투여 전날 평균 체중 약 20g을 기준으로 각 군별 암,수 5수씩 총 10수가 되도록 군 분리를 진행하였다.
실시예 12-2 시험 물질의 투여
시험 물질은 본 발명의 돌연변이 효모 용해물 KARC의 함량을 기준으로 실험동물의 투여용량이 각 0, 750, 3000, 5000mg/Kg이 되도록 생리식염수에 녹여 제조하였다.
투여 용량의 기준은 식약처의 Korea national Toxicology Program(KNTP) 독성 시험 매뉴얼에 따랐다. KNTP 매뉴얼에서 가이드하는 적용 최대 용량 5000mg/Kg을 본 실험의 최대 농도로 적용하였다. 각 군별로 준비된 시료를 시험동물에 대하여 각 1회 경구투여를 실시 하였으며, 정상군(G1)의 경우 생리식염수를 투여하였다.
실시예 12-3. 관찰 및 부검
모든 시험군의 동물에 대하여 입수일부터 부검일까지 매일 1회 이상 증상관찰을 실시하였으며, 경구투여 후 7일 동안 증상을 관찰하였다. 증상 관찰 종류 후, 부검을 진행하였고 부검 시 육안으로 각 장기에 대한 변화를 관찰하였다.
마우스를 사용하여 본 발명의 ALDH 함유 KARC 조성물의 단회 투여독성 시험을 실시한 결과, 돌연변이 효모 KARC 5000mg/kg까지의 농도에서 7일간 사망예를 관찰할 수 없었으며, 체중증가, 사료 섭취량 등의 특이점을 발견할 수 없었다. 또한 관찰 종료 후 진행한 부검 결과에서도 특이한 소견은 발견되지 아니하였다.
[실시예 13]
말론디알데히드, 아세트알데히드, Glutamate semialdehyde(GSA) 그리고 succinic semialdehyde(SSA)를 감소시켜, 진전(tremor and movement disorder) 증상을 억제하는 식품 또는 의약 조성물의 제조:
본 발명의 KARC를 유효성분으로서 함유하는, 진전(떨림) 그리고 이상 동작(movement disorder) 증상을 억제하는 식품 조성물과 의약 조성물을 제조하였다. 본 발명의 KARC 분말을 함유하는 다양한 조성비의 식품 또는 의약 조성물의 제조가 가능하지만, 하나의 예시로서, 본 발명에 따르는 분말 조성물은 1일 2회, 1회 13g 조성물 섭취를 통하여 진전(떨림) 그리고 이상 동작(movement disorder) 증상을 억제하는 식품 조성물과 의약 조성물의 성분과 성분간 중량 비율을 [표 6]에 나타내었다.
원 재 료 명 중량비 (wt%)
진전(떨림) 그리고 이상 동작(movement disorder) 증상을 억제하는 식품 조성물과 의약 조성물 KARC 건조 분말 50
프락토올리고당 9
효소처리 스테비아 5
무수구연산 10
이소말토 4.3
자일리톨 2.5
감귤과즙분말 6.2
감귤향분말 13
본 발명의 식품과 의약 조성물에는 KARC건조 분말과, 부형제 및 감미료로서 프락토 올리고당, 효소처리 스테비아, 무스구연산, 이소말토, 자일리톨 천연 감미료와 감귤과즙 분말 그리고 감귤향 분말을 첨가하였다. 본 발명의 식품 또는 의약 조성물의 원료와 최종 제품의 가공과 검사는, 대한민국 식품 공전에 기재된 일반시험법과 건강기능식품법에 따라 진행하였다.
이상의 실시예들을 통하여 본 발명의 알데히드탈수소효소(ALDH)를 함유하는 돌연변이 효모 조성물인 KARC의, 진전(tremor and movement disorder) 증상을 억제하거나 개선하는 조성물의 제조 방법, 약리 효과, 투여방법, 유효량, 단기투여 급성 독성과 이를 함유하는 식품 또는 의약조성물에 대한 대표적인 사례들을 상세하게 설명하였지만, 이들은 본 발명의 하나의 사례에 불과하다.
따라서 이 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 전술한 본 발명의 실시 사례로부터 다양한 변형 및 본 발명과 균등한 또 다른 실시예를 용이하게 도출할 수 있다.
따라서 특허청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 요지를 구현하는 변형된 형태의 알데히드탈수소효소를 함유하는 식품이나 치료제라도, 본 발명의 법률적 보호범위에 속한다.
한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC) KCTC13925BP 20190822 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC) KCTC14122BP 20200130 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC) KCTC14123BP 20200130 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC) KCTC14983BP 20220527 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC) KCTC14984BP 20220527 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC) KCTC14985BP 20220527
서열목록 전자파일 첨부

Claims (11)

  1. 서열번호 1의 유전자와 98% 이상의 상동성을 갖는 유전자에 의하여 코딩되는 알데히드탈수소효소를 함유하는, 진전 또는 이상 동작(movement disorder) 억제 식품 조성물.
  2. 제1항의 진전 또는 이상 동작(movement disorder) 억제 식품 조성물에 있어서, 서열번호 2를 포함하는 서열번호 1의 유전자에 의해 코딩되는 알데히드탈수소효소를 포함하는, 진전 또는 이상 동작(movement disorder) 억제 식품 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항의 진전 또는 이상 동작(movement disorder) 억제 식품 조성물에 있어서, 상기 알데히드가 생체 내인성 알데히드인 것을 특징으로 하는, 진전 또는 이상 동작(movement disorder) 억제 식품 조성물.
  4. 제3항의 진전 또는 이상 동작(movement disorder) 억제 식품 조성물에 있어서, 상기 내인성 알데히드가, 알콜 또는 내인성아민 화합물의 산화로 인하여 생성되는 내인성 알데히드인 것을 특징으로 하는, 진전 또는 이상 동작(movement disorder) 억제 식품 조성물.
  5. 제4항의 진전 또는 이상 동작(movement disorder) 억제 식품 조성물에 있어서, 상기 내인성알데히드가 아세트알데히드, 말론디알데히드, Glutamate semialdehyde(GSA) 그리고 Succinic semialdehyde(SSA)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로하는, 진전 또는 이상 동작(movement disorder) 억제 식품 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항의 알데히드탈수소효소가, KCTC13925BP, KCTC14122BP, KCTC14123BP KCTC14983BP, KCTC14984BP, KCTC14985BP의 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 효모들로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물에서 유래되는, 진전 또는 이상 동작(movement disorder) 억제 식품 조성물.
  7. KCTC13925BP, KCTC14122BP, KCTC14123BP, KCTC14983BP, KCTC14984BP 그리고 KCTC14985BP으로 이루어지는 군에서 선택되는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)돌연변이 효모 어느 하나 또는 이들이 혼합된 돌연변이 효모의 건조물 또는 용해물(lysate)을 함유하는, 진전 또는 이상 동작(movement disorder) 억제 식품 조성물.
  8. 서열번호 1의 유전자와 98% 이상의 상동성을 갖는 유전자에 의하여 코딩되는 알데히드탈수소효소를 함유하는, 진전 또는 이상 동작(movement disorder) 억제용 의약 조성물.
  9. 제8항의 진전 또는 이상 동작(movement disorder) 억제용 의약 조성물이, 서열번호 2를 포함하는 서열번호 1의 유전자에 의해 코딩되는 알데히드탈수소효소를 포함하는, 진전 또는 이상 동작(movement disorder) 억제용 의약 조성물.
  10. 제8항 또는 제9항의 알데히드탈수소효소가, KCTC13925BP, KCTC14122BP, KCTC14123BP KCTC14983BP, KCTC14984BP, KCTC14985BP로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물에서 유래된, 진전 또는 이상 동작(movement disorder) 억제용 의약 조성물.
  11. KCTC13925BP, KCTC14122BP, KCTC14123BP, KCTC14983BP, KCTC14984BP 그리고 KCTC14985BP으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이들이 혼합물의 용해물(lysate)을 함유하는, 진전 또는 이상 동작(movement disorder) 억제용 의약 조성물.
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