KR20240082386A - 글루카곤 및 ampk 활성화제의 공액체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 글루카곤 수용체에서 천연 글루카곤의 적어도 0.1% 활성도를 나타내는 펩타이드 및 AMP-활성 단백질 인산화효소(AMPK) 활성화제를 포함하는 공액 분자, 직접적으로 또는 링커를 통해 AMPK 활성화제에 공유 결합되는 펩타이드, 치료에 사용하기 위한 공액 분자, 공액 분자를 포함하는 약학 조성물, 공액 분자를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 포유동물의 체중 감소 방법, 및 공액 분자를 포유동물에 경구 투여하는 단계를 포함하는 포유동물의 체중 감소를 위한 비치료적 치료 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 일반적으로 치료용 공액체 분야에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 글루카곤 수용체 활성도(activity) 및 AMP-활성 단백질 인산화효소(AMPK) 활성화제를 갖는 공액체에 관한 것이다.
대사 장애는 정상적인 대사, 즉 세포 수준(cellular level)에서 음식을 에너지로 전환하는 과정을 방해하는 모든 질병 또는 장애이다. 대사 장애의 발병은, 유전적(선천적) 결핍, 특정 호르몬이나 효소의 결핍과 같은 다양한 결핍, 또는 특정 식품의 과도한 섭취로 인해 발생할 수 있다. 대사 장애를 치료하지 않고 방치할 경우, 비알코올성 지방간염(NASH), 제1형 또는 제2형 당뇨병, 심장 질환, 이상지질혈증, 및 비만과 같은 지방간 질환을 포함하되 이에 국한되지 않는, 생명을 위협하는 여러 질병으로 진행될 수 있다.
풍요로운 사회에서, 비만은 인간과 개, 고양이와 같은 가축에게서 볼 수 있는 가장 흔한 영양성질환(nutritional disease)으로, 영양결핍질환(nutritional deficiency disease)의 수를 월등히 능가한다. 비만대사수술(bariatric surgery)의 대안으로써, 비만 치료를 위한 체중 감량 약물을 설계하려는 시도가 있었으며, 그 결과, 장에서 리파아제 억제제로 작용함으로써 지방의 흡수를 방지하는 기능을 갖거나, 시상하부에서 선택적 세로토닌 수용체 2C 아고니즘(agonism)을 통해 음식 섭취를 억제하는 기능을 갖는 약물이 개발되었다.
비알코올성 지방간염(NASH)은 비알코올성 지방간 질환(NAFLD)의 두 번째 단계로, 간세포에 지방이 축적되고 염증이 동반될 때 발생한다. 이를 치료하지 않고 방치할 경우, NASH는 섬유증(fibrosis)으로 진행되고, 더 나아가 간경변(cirrhosis)으로 진행되며, 종국에는 간 이식을 필요로 하게 된다. NASH는 장기간에 걸친 칼로리 과다 섭취 및 좌식 생활 등 생활 습관의 영향을 많이 받으며, 알코올 남용(alcohol abuse) 또는 약물 부작용으로 인한 다른 지방간 질환과는 구별된다. 현재까지, NASH에 대해 FDA 승인을 받은 약물 요법은 없으므로 체중 감량과 생활 습관의 변화가 여전히 1차적인 치료법으로 남아있다. NASH에 대한 새로운 치료 요법의 필요성이 증가함에 따라, 오베티콜산(obeticholic acid), 엘라피브라노(Elafibranor) 및 아람콜(Aramchol)과 같은 여러 NASH 약물들이 개발되고 있고 또한 테스트되고 있다. 그러나, 이러한 약물들은 간독성 및 LDL 콜레스테롤 상승을 포함한 부작용을 일으키고 있으므로, NASH 치료에 적합한 약물이 여전히 필요한 현황이다.
글루카곤은 프로글루카곤 펩타이드의 조직-특이적 변역 후 처리 과정(tissue-specific posttranslational processing)에서 파생되는 29개 아미노산으로 구성된 펩타이드 호르몬이다. 글루카곤은 췌장의 알파 세포에서 주로 분비되며, 포도당대사, 지방분해, 케톤생성(ketogenesis), 에너지소비(energy expenditure), 식욕 및 음식 섭취에서 입증된 역할을 한다. 글루카곤은 순환계 및 간에서 지질을 낮추는 등 혈당 효과(glycemic effect)와는 별개로 대사 질환에 많은 이점을 제공한다. 대사 질환의 치료를 위한 글루카곤의 사용은 종래 기술로부터 알려져 있다. US 2020352900 A1은 인슐린 저항성 및 비만과 관련된 다양한 질환의 치료에 글루카곤을 포함하는 호르몬 펩타이드의 사용을 개시하고 있다. US 2006014670 A1은 당뇨병의 효과적인 조절을 치료적으로 달성하기 위한 것뿐만 아니라 당뇨병 환자의 저혈당을 예방하기 위해 글루카곤 및 인슐린의 사용을 개시하고 있다. 그러나, 대사 질환의 치료에서 글루카곤의 사용은 혈당 수치를 증가시키는 글루카곤 고유의 효과로 인해 중단된다.
AMP-활성 단백질 인산화효소(AMPK)는 에너지 항상성의 핵심 조절자(central regulator)이며, 대사 경로를 조절함으로써 영양소 공급과 에너지 수요의 균형을 맞춘다. 대사에 대한 AMPK 활성화제의 유리한 생리학적 결과로 인해, AMPK는 대사 증후군 및 암을 비롯한 인간 질병을 제어하기 위한 중요한 치료 표적(therapeutic target)으로 간주되고 있다. 최근 몇 년 동안, 여러 기업에서 AMPK 활성화제 개발에 대한 의약 화학(medicinal chemistry) 캠페인을 실시해왔으므로, AMPK 활성화제는 종래 기술로 알려져 있다. 최근 확인된 간접적인 및 직접적인 AMPK 활성화제 목록은 Steinberg et al. (Nat Rev Drug Dis 2019; 18(7): 527-55141)로부터 제공된다. Myers et al. (Science 2017; 357(6350): 507-511)은, 인슐린에 의존한 포도당 흡수 및 글리코겐 합성에 효과적인, 경구용 AMPK 활성화제(MK-8722로 알려진, (3R,3aR,6R,6aR)-6-((6-([1,1'-바이페닐]-4-일)-7-클로로-3H-이미다조[4,5-b]피리딘-2-일)옥시)헥사하이드로푸로[3,2-b]푸란-3-올((3R,3aR,6R,6aR)-6-((6-([1,1'-biphenyl]-4-yl)-7-chloro-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-2-yl)oxy)hexahydrofuro[3,2-b]furan-3-ol))를 개시하고 있으며, 결과적으로 혈당증은 개선되었음을 확인할 수 있다. 그러나, MK-8722에 의해 심장비대증(cardiac hypertrophy)이 유발됨에 따라 해당 화합물의 사용은 중단되었다. 따라서, 현재까지 AMPK 활성화제의 임상적 사용은 대사 경로에 대한 화합물의 부작용으로 인해 제한 받고 있다.
따라서, 더 큰 효능 및 높은 안정성(낮은 독성학적 효과)을 갖고, 또한 편리하고 안전한 투여 옵션도 제공하는, 대사 질환 치료에 적합한 새로운 치료 요법에 대한 필요성이 증가하고 있는 현황이다.
따라서, 본 발명의 목적은, 비만 및 NASH를 포함하는 대사성질환의 치료가 필요한 환자들에게 효과적이고 안전한 치료제를 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명의 제1 양상은, 글루카곤 수용체에서 천연 글루카곤의 적어도 0.1% 활성도를 나타내는 펩타이드 및 AMP-활성 단백질 인산화효소(AMPK) 활성화제를 포함하되, 상기 펩타이드는 직접적으로 또는 링커를 통해 상기 AMPK 활성화제에 공유 결합되는 것을 특징으로 하는 공액 분자에 관한 것이다.
본 발명의 발명자는 놀랍게도, 글루카곤 아고니즘 효과를 야기하는 펩타이드, 및 AMPK 활성화제의 공액체가, 비만 환자의 혈장 콜레스테롤 수치 및 혈당 수치를 낮추고, 비만을 효과적으로 개선시키기 위한 새로운 의학적 전략을 제시한다는 것을 발견하였다. 이 전략에 기초한 공액체는, 도 3에 도시된 바와 같이, 글루카곤 단독 처리 또는 MK-8722의 단독 처리에 비해 체중 감소가 더 뛰어났다. 또한, 도 4 및 도 5에 도시된 바와 같이, 본 발명의 공액체에 의해 달성된 체중의 현저한 감소는 먹이 섭취와는 무관함을 알 수 있다. 또한, 도 6 내지 도 8에 도시된 바와 같이, 공액체는 혈당 및 콜레스테롤 수치를 감소시키는 데에도 효과적임을 알 수 있다. 본 발명의 발명자는, 글루코스 항상성(glucose homeostasis)을 개선하는 AMPK의 능력이 글루카곤의 당뇨병 위험(diabetic liabilities)을 제거하는데 효과적인 반면, 글루카곤에 의해 달성된 특이적 표적화(specific targeting)가 심장 조직에서 AMPK의 활성화를 제한한다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 공액체는 특징적인 부작용을 회피하면서, 각각의 개별 성분으로부터 지질 대사에 유익한 약리학적 효과를 가진다. 특정 이론에 얽매이지 않으면서, 본 발명의 발명자는 이 효과가, 지방분해 자극 약물 및 표적화제로서의 이중 기능 역할을 수행하고, 그렇지 않다면 비특이적 AMPK 활성화제를 부위 선택적으로 간에 전달하는 것을 허용하는, 펩타이드 호르몬에 의해 달성된다고 추측한다. 또한, 대체 글루카곤 펩타이드 변이체(SEQ ID NO:3) 및 대체-천연 AMPK 활성화제에 기초한 공액체는, 도 20 및 도 21에 도시된 바와 같이, 임상에서 공지된 단일 AMPK 활성화제 및 표준 AMPK 활성화제와 비교하였을 때, 유사하거나 향상된 AMPK 활성도를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이들 추가 공액체는, 비만 환자의 혈장 콜레스테롤 및 혈당을 낮추고 비만을 개선한다는 관점에서 긍정적인 결과를 나타낼 것으로 예상된다. 이러한 추측은, 도 21에 도시된 바와 같이, AMPK 활성화제(MK-8722)와 공액된, SEQ ID NO:4~6에 따른 이중작용제(co-agonist) 및 삼중작용제(tri-agonist)가 화합물부하검사(compound tolerance test) 이후의 생쥐의 혈당에 대한 개선된 효과를 나타낸다는 추가 발견에 의해 뒷받침된다. 또한, 개발된 공액체는, AMPK 활성화제와 글루카곤 작용제를 결합하고, 간 지방산 산화에 관여하는 두 가지 별개의 경로를 타겟팅할 수 있다는 점에서, 이중 기능성(dual functionality)을 갖는다.
펩타이드는 아미노 말단 및 카르복실 말단을 가질 수 있다. 본 발명에서, 아미노 말단 및 카르복실 말단은 각각 N-말단 및 C-말단, 및 상응하는 유도 형태로 지칭될 수 있다.
펩타이드는, 유전자 코드에 의해 암호화된 아미노산으로 구성될 수 있거나, 유전자 코드에 의해 암호화된 아미노산 및 유전자 코드에 의해 암호화되지 않은 천연 아미노산(가령, 하이드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, 오르니틴(ornithine), 포스포세린, D-알라닌(dAla), 및 D-글루타민)을 포함할 수 있다. 또한, 펩타이드는, D-알라닌, 및 D-류신, 또는 a-아미노이소부티르산(Aib), d-세린(dSer), N-메틸-세린과 같은, 합성 아미노산을 포함할 수 있다.
펩타이드는 임의의 공급원으로부터 얻을 수 있거나 원하는 방식에 따라 제조될 수 있다. 일례로, 펩타이드는 조직(tissue)으로부터 분리될 수 있거나, 공지된 기술을 통해 당업자로부터 재조합적으로 제조되거나 합성될 수 있다.
공액 분자는 펩타이드를 포함하며, 펩타이드(유리 형태(free form))는 글루카곤 수용체에서 천연 글루카곤의 적어도 0.1% 활성도를 나타낸다. 본 발명의 맥락에서, 글루카곤 활성화라고도 지칭될 수 있는 글루카곤 수용체 활성도는 글루카곤 수용체(GCCR)를 과발현하는 HEK293 세포 내의 cAMP 유도를 측정함으로써 생체외(in vitro) 분석으로 측정될 수 있다. 일례로, 분석은 본 명세서에 참조로서 포함된 Finan et al., Cell 167.3: 843-857 (2016)에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 일 실시예에서, 공액체의 펩타이드는 천연 글루카곤의 적어도 1%(가령, 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 또는 30%) 활성도를 나타낸다.
공액 분자의 펩타이드는, 글루카곤 수용체에서 천연 글루카곤의 적어도 0.1% 활성도를 갖는 임의의 펩타이드일 수 있다. 일 실시예에서, 공액체의 펩타이드는 글루카곤-슈퍼패밀리에 속한다. 상기 글루카곤-슈퍼패밀리는, 이들의 N-말단 영역 및 C-말단 영역의 구조와 관련된 펩타이드군이다(본 명세서에 참조로서 포함된 Sherwood et al., Endocrine Reviews 21: 619-670 (2000)를 예시로서 참조). 해당 그룹의 구성원에는, 변형된 글루카곤(SEQ ID NO:1) 및 변형되지 않은 글루카곤(SEQ ID NO:2)을 포함하는 글루카곤 관련 펩타이드, 유사체, 및 천연 펩타이드에 비해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 변형을 갖는 유도체 또는 공액체가 포함되나, 이에 국한되지는 않는다. 또한, SEQ ID NO:3에 따른 변형된 글루카곤 유사체도 고려된다. 이러한 펩타이드는 글루카곤 수용체 슈퍼패밀리의 수용체(바람직하게는, 글루카곤 수용체)와 상호작용하는 능력을 보유한다.
또한, 글루카곤 수용체 슈퍼패밀리의 다른 수용체에 결합하는 능력을 갖는 이중작용제 및 삼중작용제 활성을 갖는 펩타이드도 고려된다. 일 실시예에서, 이러한 이중작용제 및 삼중작용제는, 글루카곤 유사 펩타이드 1(GLP-1)/글루카곤 수용체 이중작용제(SEQ ID NO:4), 위억제폴리펩타이드(gastric inhibitory polypeptide, GIP)/글루카곤 수용체 이중작용제(SEQ ID NO:5), 및 GLP-1/GIP/글루카곤 수용체 삼중작용제(SEQ ID NO:6)로부터 선택될 수 있다.
일 실시예에서, 공액체의 펩타이드는 SEQ ID NO:1과 적어도 80%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 일례로, 펩타이드는, SEQ ID NO:1과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 97% 초과의 동일성을 가질 수 있다. 일 실시예에서, 펩타이드는 SEQ ID NO:1과 적어도 80%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 또 다른 실시예에서, 펩타이드는 SEQ ID NO:1과 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 특정 실시예에서, 펩타이드는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는다. 이러한 펩타이드는 글루카곤 수용체에서의 천연 글루카곤에 비해 글루카곤 수용체에서 훨씬 더 큰 글루카곤 활성도를 가질 수 있다. 따라서, 펩타이드는, AMPK 활성화제가 공액된 경우, 글루카곤 수용체 부위에 더 빠른 속도로 축적될 수 있으며, 이는 AMPK 활성화제의 더 큰 효능을 야기할 수 있다. SEQ ID NO:1과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 공액체의 펩타이드의 예시가 도 22에 도시되어 있으며, 여기서 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:4(이중작용제 GLP-1/글루카곤) 및 SEQ ID NO:6(삼중작용제 GLP-1/GIP/글루카곤)의 글루카곤 펩타이드의 아미노산 서열 배열을 확인할 수 있다. 도 22에 도시된 바와 같이, SEQ ID NO:1의 글루카곤과 이중작용제(SEQ ID NO:4) 및 삼중작용제(SEQ ID NO:6) 사이의 아미노산 차이는 각각 6개의 아미노산이므로, 각각 80% 및 85%의 서열 동일성을 갖는 것을 확인할 수 있다.
공액 분자의 펩타이드는, 펩타이드(유리 형태)가 글루카곤 수용체에서 천연 글루카곤의 적어도 0.1% 활성도를 나타내기에 충분한 길이를 가질 것이다. 일반적으로, 이는 적어도 10개의 아미노산을 포함하는 펩타이드에서 관찰될 수 있으나, 60개 초과의 아미노산을 포함하는 펩타이드의 경우 활성도가 표시되지 않을 수 있다. 따라서, 일 실시예에서, 펩타이드는 10개 내지 60개의 아미노산 범위(가령, 20개 내지 50개의 아미노산)를 갖는다. 다른 펩타이드 서열과 일정 비율로 동일한 본 발명의 아미노산 서열은, 당업자에 의한 서열의 수동 평가, 또는 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)와 같은 알고리즘을 사용한 컴퓨터-자동 서열 비교 및 식별에 의해, 해당 펩타이드의 추정 식별(putative identification)을 제공할 만큼 충분한 펩타이드의 아미노산 서열을 포함(가령 10개의 아미노산)하여야 한다(검토를 위해 Altschul, et al., Meth Enzymol. 266: 460,1996; and Altschul, et al., Nature Genet. 6: 119, 1994 참조).
본 발명의 맥락에서, 펩타이드는, 천연 또는 합성 아미노산의 치환, 삽입, 및/또는 아미노산 결실을 가짐으로써 %-동일성이 상이할 수 있다.
일 실시예에서, 펩타이드는, 아세틸화, 지방산 공액, 이산(diacid) 공액, 알부민 공액, 소분자 알부민 바인더, 및/또는 PEG 공액에 의해 변형된다. 항체와 같은 담체 단백질(carrier protein)과 연결됨으로써 변형된 펩타이드 역시 고려된다. 변형은, 바람직하게는 SEQ ID NO:1 내의 펩타이드의 16, 17, 20, 21, 24, 및 29 내지 40번째 위치(N-말단으로부터 카운트됨), C-말단 영역 내, 또는 C-말단 아미노산에서 일어날 것이다. SEQ ID NO:1의 29 내지 40번째 위치에 있는 아미노산 중 그 어느 것도 펩타이드와 글루카곤 수용체의 결합에 직접적으로 관여하지 않으므로, 이들 아미노산은 펩타이드와 글루카곤 수용체의 결합에 영항을 주지 않고 치환 및 변형될 수 있다. 공액은, 이황화물, 말레이미드, 알파-케톤, 또는 클릭 화학(click chemistry) 기반의 공액과 같은, 임의의 적합한 링커에 의해 이루어질 수 있다. 당업자는 이러한 공액체를 제조하는 방법에 대해 알고 있다. 바람직하게는, PEG 분자는 1 kDa보다 클 수 있고, 지방산 및 이산은 12개 초과의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 일반적으로 변형체(PEG/지방산/이산)와 펩타이드 사이에 스페이서를 추가하는 것이 바람직하며, 링커는, 짧은 PEG 사슬인 감마-글루 링커가 바람직하다.
공액 분자는 AMPK 활성화제를 포함한다. 임의의 AMPK 활성화제가 공액체와 함께 사용될 수 있다. 그러나, AMPK 활성화제는 소분자(가령, 900 kDa까지)인 것이 바람직하다. 일례로, 일 실시예에서, AMPK 활성화제는, 5-아미노이미다졸-4-카르복스아미드 1-β-D-리보푸라노사이드 (AICAR), (3R,3aR,6R,6aR)-6-((6-([1,1'-바이페닐]-4-일)-7-클로로-3H-이미다조[4,5-b]피리딘-2-일)옥시)헥사하이드로푸로[3,2-b]푸란-3-올 (MK-8722), (3R,3aR,6R,6aR)-6-((6-클로로-5-(4-(1-(하이드록시메틸)사이클로프로필)페닐)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)옥시)헥사하이드로푸로[3,2-b]푸란-3-올 (PF-739), 6-클로로-5-[4-(1-하이드록시사이클로부틸)페닐]-1H-인돌-3-카복실산 (PF-06409577), 1,1-디메틸비구아나이드 염산염 (메트포르민), 4-하이드록시-3-(2'-하이드록시-1,1'-바이페닐-4-일)-6-옥소-6,7-디하이드로티에노[2,3-b]피리딘-5-카르보니트릴 (A-769662), 2-클로로-5-[[5-[[5-(4,5-디메틸-2-니트로페닐)-2-푸라닐]메틸렌]-4,5-디하이드로-4-옥소-2-티아졸일]아미노]벤조산 (PT-1), 2-[[2-(2-브로모-4-메틸페녹시)에틸]티오]-피리미딘 (ZLN024), 2-[[4-(디에틸아미노)-2-하이드록시페닐]메틸렌]히드라지드-4-피리딘카복실산 (RSVA-405), 및 이들의 유사체로부터 선택된다. MK-8722, PF-739 및 PF-06409577이 바람직하다. 또 다른 실시예에서, AMPK 활성화제는 PF-06409577의 단순화된 유사체이다. 이러한 PF-06409577의 단순화된 유사체의 합성은, 예시 3에 기재된 화합물 14a-14e, 및 도 17의 스킴(scheme) 1에 도시된 화합물 14a-14e에 의해 예시된다.
본 발명의 펩타이드와 AMPK 활성화제는 공유 결합된다. 본 발명의 맥락에서, 공액 분자는 또한 펩타이드-약물-공액체(peptide-drug-conjugate(PDC))로 지칭될 수 있다. 펩타이드와 AMPK 활성화제는 서로 직접적으로 결합될 수 있다. 일례로, AMPK 활성화제는, 에테르 결합, 에스테르 결합, 카바메이트 결합, 카보네이트 결합, 트리아졸 결합, 말레이미드 결합, 및 아미드 결합을 통해 공유 결합될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 직접적으로 공유 결합된다는 것은 펩타이드가 AMPK 활성화제와 공유 결합을 갖는다는 것을 의미하며, 가령, 링커 그룹(linker group)과 같이 두 분자 사이에 추가적인 화학 그룹(chemical group)이 존재하지 않음을 의미한다.
일 실시예에서, AMPK 활성화제는 펩타이드의 C-말단 영역과 공유 결합된다. 본 발명의 맥락에서, C-말단 영역은, C-말단으로부터 카운트할 경우, 전체 아미노산의 50%까지 일 수 있으며, 가령 C-말단으로부터 카운트할 경우, 전체 아미노산의 40%, 30%, 25%, 20%, 또는 10%까지 일 수 있다. 일례로, SEQ ID NO:1의 C-말단 영역은, N-말단으로부터 카운트할 경우, 15 내지 40, 26 내지 40, 또는 30 내지 40일 수 있다. 따라서, AMPK 활성화제는 직접적으로 또는 링커를 통해 C-말단으로부터 카운트된 10개의 아미노산 중 어느 하나에 결합될 수 있다. 이로써 AMPK 활성화제는 펩타이드의 N-말단에서 입체 장해(steric hindrance)를 거의 또는 전혀 생성하지 않는다. 또한, 둘 이상의 AMPK 활성화제가 동일 펩타이드 분자에 결합될 수 있을 것으로 고려된다.
펩타이드와 AMPK 활성화제는 링커를 통해 결합될 수 있으며, 어떠한 링커도 사용될 수 있다. 그러나, 일반적으로 링커는 30개까지의 원자 길이를 갖는 것이 바람직하다. 사슬이 길수록, 펩타이드가 글루카곤 수용체와 상호작용할 때 AMPK 활성화제가 펩타이드에 대한 입체 장해가 없거나 거의 없도록, AMPK 활성화제를 펩타이드로부터 거리를 둘 수 있게 한다는 이점을 가질 수 있으며, 사슬이 짧을수록 그 반대에 해당될 것이다. 펩타이드의 입체 장해가 없거나 낮을 경우, 글루카곤 수용체에 더 큰 친화력을 제공하게 된다. 글루카곤 수용체에 대해 더 큰 친화력을 갖는 공액체는 글루카곤 수용체 부위에 더 큰 축적을 가질 가능성이 있다.
일 실시예에서, AMPK 활성화제는 화학 절단형 링커(cleavable chemical linker)를 통해 펩타이드에 공유 결합되고, 화학 절단형 링커는 산-절단형 링커(acid-cleavable linker), 효소-절단형 링커, 펩타이드-절단형 링커, 및 이황화기(disulfide group)를 포함하는 링커로부터 선택된다. 이러한 링커는 일반적으로 펩타이드-약물 공액체에 사용되는 것으로 당업계에 잘 알려져 있다. 일례로, 이러한 절단형 링커는, 글루쿠로니드(glucuronide), 베타-갈락토시드, 이황화물, 하이드라존(hydrazone)을 포함하는 화합물, 및/또는 갈락토시다아제, 글루쿠로니다아제(glucuronidase), 피로포스파타아제(pyrophospatase), 포스파타아제(phosphatase), 아릴설파타아제(arylsulfatase), 프로테아제(protease), 또는 에스테라아제(esterase)에 의해 절단 가능한 화합물이다. 링커는 바람직하게는 AMPK 활성화제를 유리 형태(즉, 천연 형태)로 분리하며, 이는 본 명세서에 기재된 이황화 링커와 같은 링커 화학(linker chemistry)에 의해 달성될 수 있다. 이들 링커 화학 및 추가적인 링커 화학은 당업자에게 잘 알려져 있다.
바람직한 실시예에서, AMPK 활성화제는 이황화기를 포함하는 화학적 링커를 통해 펩타이드에 공유 결합된다. 이황화기는 화학적으로 환원될 때 펩타이드로부터 AMPK 활성화제의 분리를 허용한다. 또한, 이황화 링커로 알려진 이황화기를 포함하는 화학적 링커는, 체순환 동안 공액체의 펩타이드와 AMPK 활성화제가 장기간 공액된 상태로 유지되도록 한다. 세포내 환경과 같은 환원 환경에서 이황화 링커의 이황화기는 환원될 수 있으며, 이에 따라 공액체가 절단됨으로써, 공액체의 펩타이드 부분이 공액체의 AMPK 활성화제 부분과 분리된다. 환원은, 글루타티온(glutathione)과 같은 티올(thiol) 또는 세포내 단백질 이성질화 효소(disulfide isomerase)와 같은 환원효소와의 이황화물 교환(disulfide exchange)을 통해 이루어질 수 있다.
화학적 링커는 일반식 R'-S-S-R"를 갖는 당업계에 공지된 화학적 링커로부터 선택될 수 있으며, 여기서 R'기와 R"기는 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 유리하게는, 공액체는 글루카곤 수용체에 대한 펩타이드의 친화성으로 인해 신체 내 글루카곤 수용체 부위 및/또는 그 부위와 근접한 곳에 축적될 수 있고, AMPK 활성화제는 글루카곤 수용체 부위 및/또는 그 부위와 근접한 곳에서 분리될 수 있다. 공액체의 펩타이드 부분이 없는 경우, AMPK 활성화제는 부위-특이적(site-specific) AMPK 활성화제로서 적절한 효과를 가질 수도 있다. 본 발명의 발명자는, 공액체가 글루카곤 수용체를 보유하는 세포에 바로 인접한 세포외 환경에서 절단될 수 있거나, 공액체가 글루카곤 수용체를 보유하는 세포에 의해 내재화(internalize)되어 세포의 환원 환경에서 절단될 수 있다고 추측한다.
일 실시예에서, 공액 분자는 화학적 링커를 통해 공액되고, 상기 화학적 링커는 화학식 R1-R3-S-S-R4-R5-O-CO-R2를 가지며, R1은 펩타이드이고, R2는 AMPK 활성화제이며, R3은 선택적이고, 존재할 경우 C(CH3)2, CH2-CH2, 또는 CH2 중에서 선택되며, 펩타이드의 측쇄(side chain) 또는 펩타이드의 주쇄(backbone chain)의 탄소 원자에 결합되고, R4는 (CH2)n 또는 C6H4이며, R5는 선택적이고, 존재할 경우 C(CH3)2, CH-CH3, CH2-CH2, 또는 CH2 중에서 선택되며, n은 1, 2, 또는 3이다. 화학적 링커가 환원될 경우, 공액체의 유리된 AMPK 활성화제 부분이 분자 내 고리화됨으로써 AMPK 활성화제가 유리 형태로 분리된다.
일 실시예에서, 화학적 링커는 화학식 R1-R3-S-S-(CH2)n-NH-CO-R2를 가지며, R1은 펩타이드이고, R2는 AMPK 활성화제이며, R3은 선택적이고, 존재할 경우 C(CH3)2, CH2-CH2, 또는 CH2 중에서 선택되며, 펩타이드의 측쇄 또는 펩타이드의 주쇄의 탄소 원자에 결합되고, n은 1, 2, 또는 3이다.
일 실시예에서, 화학적 링커는 화학식 R1-R4-R3-S-S-(CH2)n-NH-CO-R2를 가지며, R1은 펩타이드이고, R2는 AMPK 활성화제이며, R3은 선택적이고, 존재할 경우 CH(CH3)2, CH2-CH2, 또는 CH2 중에서 선택되며, 펩타이드의 측쇄 또는 펩타이드의 주쇄의 탄소 원자에 결합되고, R4는 선택적이며, 존재할 경우 CH(CH3)2, CH2-CH2, 또는 CH2 중에서 선택되고, 펩타이드의 측쇄 또는 펩타이드의 주쇄의 탄소 원자에 결합되며, n은 1, 2, 또는 3이다.
일 실시예에서, 제2 라디칼 결합(radical bond)은 본 발명의 펩타이드의 주쇄에 대한 것이다.
또 다른 실시예에서, 제2 라디칼 결합은 본 발명의 펩타이드의 측쇄에 대한 것이다.
본 발명의 맥락에서, R1 이 펩타이드의 주쇄에 결합되는 경우, C(CH3)2 (L-페니실라민)는 Pen으로서 지칭될 수 있고, CH2-CH2 (L-호모시스테인)는 hCys로 지칭될 수 있으며, CH2 (L-시스테인)는 Cys로 지칭될 수 있다.
본 명세서에서 기재된 바와 같이, 제1 및 제2 라디칼 결합은 본 명세서에 개시된 화학적 링커 내 적어도 2개의 자유 결합(free bond)이 존재함을 나타내기 위해 사용된다.
또 다른 실시예에서, AMPK 활성화제는 비절단형 링커를 통해 펩타이드에 공유 결합되고, 비절단형 링커는, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커, 탄소 링커(carbon linker), 말레이미드계의 공액 화학(conjugation chemistry)과 관련된 mc 및 SMCC, 에테르계, 아미드계, 트리아졸계, 이황화물, 및 티오에테르로부터 선택된다
본 발명은 화학적 링커를 통해 부착된 AMPK 활성화제 및 펩타이드를 포함하는 공액 분자의 라이브러리의 설계 및 합성을 용이하게 한다. 도 1은 이러한 공액 분자가 어떻게 설계될 수 있는지를 보여준다. 도 1에 도시된 바와 같이, 공액체는 AMPK 활성화제(도 1의 MK-8722)를 펩타이드에 화학적으로 결합시킴으로써 제조될 수 있다. 당업자는 본 명세서에 개시된 방법 및 문헌에 보고된 다른 방법들을 통해 방대한 수의 서로 다른 화학적 링커가 제조될 수 있음을 알 것이며, 이러한 화학적 링커는, 본 명세서에 개시된 방법, 및 다른 곳에서 보고된 공지 기술에 펩타이드 및 AMPK 활성화제를 첨가하는데 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명의 발명자는 놀랍게도 본 발명의 펩타이드가 체중 감량 약물 및 표적화제로서 두 가지 기능의 역할을 할 수 있음을 발견하였고, 그렇지 않다면 AMPK 활성화제와 같은 비특이적 저분자를 부위 선택적으로 간에 전달할 수 있음을 발견하였다. 또한, 본 발명의 펩타이드의 표적화 특성은, 가령 내분비 췌장과 같은, 다른 부위로 AMPK 활성화제의 전달을 촉진할 수도 있음을 이해하여야 한다.
본 명세서에 개시된 공액 분자는 선택성(selectivity)을 제공하고, 또한 표적화된 영역에서 약물 작용을 상향-집중시킨다. 공액 분자에 의해 실현되는 이러한 표적화는 개선된 치료 지수(therapeutic index)(즉, 더 낮은 최소 유효 농도)를 가능하게 한다. 더욱이, 커플링을 통해 글루카곤 수용체 표적 약물의 효능에 대사 약물 작용의 또 다른 효능을 추가할 수 있다.
본 발명의 발명자는 체중 감소에 대한 본 발명의 공액체의 놀라운 상승효과(synergistic effect)를 입증하였으며, 이는 펩타이드 또는 약물 단독 투여로 얻은 효과에 비해 현저히 우수함을 확인할 수 있었다(도 3 참조). 도 4 및 도 5를 참조하면, 흥미롭게도, 먹이 섭취량에 의한 체중 감소와 식욕 억제는 서로 관련이 없다는 것을 확인할 수 있었으며, 그 효과가 순전히 에너지 소비 증가에 의해 주도된다는 것을 암시할 수 있었다.
본 발명의 발명자는 혈당 및 혈장 콜레스테롤을 감소시키는 놀라운 상승효과를 추가로 입증하였으며, 이는 펩타이드 또는 약물 단독 투여로 얻은 효과에 비해 현저히 우수함을 확인할 수 있었다(도 6 내지 도 8 참조). 본 발명의 공액체의 놀라운 상승효과는, SEQ ID NO:3에 따른 글루카곤 및 AMPK 활성화제의 공액체(상기 공액체의 합성 방법은 예시 3에 기재되어 있음)의 AMPK 활성도를 나타내는 도 20에 도시된 결과, 및 화합물부하검사 이후의 생쥐의 혈당에 대한 이중작용제 펩타이드 및 삼중작용제 펩타이드(SEQ ID Nos:4-6)/MK8722 공액체의 효과를 나타내는 도 21에 도시된 결과에 의해 더욱 뒷받침된다.
본 발명의 일 실시예에서, 공액 분자는 치료에 사용하기 위한 것이다.
일 실시예에서, 본 발명의 공액 분자는, 비만, 제2형 당뇨병, 고인슐린혈증(hyperinsulinemia), 인슐린 저항성, 내당능장애(impaired glucose tolerance), 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolaemia), 비알코올성지방간(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD), 비알코올성지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, NASH), 및 이상지질혈증(dyslipidemia)의 치료에 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 양상은, 본 발명에 따른 공액 분자 및 약학적으로 허용가능한 담체(carrier)를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 공액 분자의 임의의 실시예가 상기 약학 조성물에 사용될 수 있다.
본 발명은 약학 조성물의 제조에 있어서 본 발명에 따른 공액 분자의 사용에 관한 것이다. 특히, 약학 조성물은, 비만, 제2형 당뇨병, 고인슐린혈증, 인슐린 저항성, 내당능장애, 고콜레스테롤혈증, 비알코올성지방간, 비알코올성지방간염, 및 이상지질혈증의 치료에 사용하기 위한 것이다. 공액 분자의 임의의 실시예가 상기 약학 조성물의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명에 개시된 데이터는 생쥐를 대상으로 한 연구로부터 획득되었으나, 결론적으로 인간에게도 동일하게 적용될 것인데, 이는, 인간과 생쥐 사이에서 에너지 대사를 좌우하는 주요 호르몬 경로가 서로 유사하고, 양자는 유사한 수용체 발현 프로파일을 나타내기 때문이다.
본 발명의 공액체는 약학 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은, 본 발명의 공액체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 추가로 제공한다. 약제학적 제제(pharmaceutical formulation)는 통상의 기술에 의해 제조될 수 있다. 간략히 설명하자면, 약학적으로 허용가능한 담체는 고체 또는 액체일 수 있다. 고형 제제는, 분말, 정제, 알약, 캡슐, 카세(cachet), 좌약, 및 분산성 과립(dispersible granule)을 포함한다. 고형 담체는, 희석제, 가용화제(solubilizer), 윤활제, 현탁제(suspending agent), 결합제, 방부제, 습윤제, 정제 붕해제(tablet disintegrating agent) 또는 캡슐화 물질(encapsulating material)로도 작용할 수 있는, 하나 이상의 부형제(excipient)일 수 있다.
약제학적 제제에 포함된 공액체는, 멸균 고형을 무균 분리하거나, 적합한 운반체(vehicle)(가령, 멸균 주사용 증류수(sterile pyrogen free water))와 함께 사용하기 이전에 구조(constitution)를 위해 용액으로부터 동결건조하여 얻은, 분말 형태일 수 있다.
일 실시예에서, 약학 조성물은, 피하 투여, 근육내 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 또는 경구 투여에 적합하다. 이에 따라, 본 발명의 조성물은, 앰풀(ampoule), 충진된 주사기, 소량 주입 또는 다회용(multi-dose) 컨테이너의 단위 용량 형태(unit dose form)로 제공될 수 있으며, 선택적으로 방부제가 첨가될 수 있다. 조성물은 유성(oily) 또는 수성 운반체의 에멀젼, 용액 또는 현탁액과 같은 형태를 취할 수 있다.
본 개시내용에 따르면, 글루카곤 활성도를 갖는 펩타이드의 체중 감소 효과가 AMPK 활성화제와 단일 방식으로 결합되는, 약학 조성물이 제공된다. 글루카곤 활성도를 갖는 펩타이드를 통한 간(肝)으로의 활성 전달(active delivery)은, AMPK 활성화에 의해 유발되는 심장 비대와 같은 원치 않은 부작용을 회피할 수 있다. AMPK 활성화제의 긍정적인 대사 효과에는, 포도당 흡수, 지방산 산화, 미토콘드리아 생합성(mitochondrial biogenesis), 및 인슐린 감수성의 개선이 포함될 수 있으며, 이는 인간 또는 포유동물의 비만, 및 비만 관련 대사 장애를 줄이는데 도움이 될 수 있다.
따라서, 본 발명의 펩타이드와 AMPK 활성화제의 페어(pair)의 치료적 유용성은 비만, 및 이와 관련된 대사 장애의 치료를 위한 새로운 접근법을 제공한다.
본 발명의 추가적인 양상은, 본 발명의 공액 분자 또는 본 발명의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 포유동물의 체중 감소 방법에 관한 것이다.
공액 분자 또는 약학 조성물은, 피하, 경구, 근육내, 복강내, 또는 정맥내로 투여될 수 있다.
공액 분자, 및 이에 따른 약학 조성물은 또한 체중 감소에도 효과적이다. 따라서, 공액 분자 및 약학 조성물은 어떠한 수준의 비만 치료에도 사용될 수 있다. 비만은 체질량지수(BMI)로 서술될 수 있으며, 체질량을 신장의 제곱으로 나눈 값(가령, kg/m2 단위로 표현됨)으로 정의된다. 이론에 얽매이지 않으면서, 본 발명의 발명자는 BMI가 병원성 비만(pathogenic obesity)과 비병원성 비만(non-pathogenic obesity) 사이의 경계(limit)를 구분하는데 사용될 수 있다고 생각한다. 일례로, 본 발명의 맥락에서, 30 kg/m2 의 BMI는 병원성 비만과 비병원성 비만 사이를 구분 짓기 위한 경계치로 해석될 수 있으나, BMI의 다른 값들을 고려하여 병원성 비만과 비병원성 비만 사이의 경계를 결정할 수도 있다. 이에 따라, 일례로, 병원성 비만과 비병원성 비만 사이의 경계를 결정하기 위해 24 kg/m2, 25 kg/m2, 26 kg/m2, 27 kg/m2, 28 kg/m2, 29 kg/m2, 30 kg/m2, 31 kg/m2, 32 kg/m2, 33 kg/m2, 34 kg/m2, 및 35 kg/m2 의 BMI 값이 고려된다.
추가적인 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 공액 분자를 포유동물에게 경구 투여하는 단계를 포함하는 상기 포유동물의 체중 감소를 위한 비치료적 치료 방법에 관한 것이다. 일례로, 포유동물은 비병원성 BMI를 가질 수 있다. 특히, 상기 방법은 비병원성 비만으로 구분 짓는 경계치 미만의 BMI를 갖는 대상자에게 공액 분자를 경구 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
이상에서, 본 발명은 주로 몇몇 실시예들을 참조로 하여 기술되었다. 그러나, 당업자가 용이하게 이해할 수 있는 바와 같이, 전술된 것 이외의 다른 실시예들도 본 발명의 범위 내에서 동일하게 실시 가능한 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 다른 양상들 및 유리한 특징들은 아래의 비제한적인 작업 실시예들을 통해 상세히 설명되고 예시된다.
일반적으로, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어들은, 달리 명시적으로 정의되거나 기재되지 않는 한, 기술 분야에서 통용되는 의미에 따라 해석되어야 하며, 본 발명의 모든 양상들 및 실시예들에 적용될 수 있다. "a/an/the [공액체, 분자, 링커, 펩타이드 등]"에 대한 모든 언급들은, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 상기 공액체, 제제, 분자, 링커, 펩타이드 등의 적어도 하나의 예시를 언급하는 것으로 넓게 해석되어야 한다.
본 발명의 맥락에서, 글루카곤이라는 용어는 글루카곤-슈퍼패밀리의 펩타이드를 의미한다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 체중 조절 호르몬 펩타이드 일 수 있으며, 또한 본 발명의 공액 분자의 활성 전달제로서 간에서 기능하는 것으로 고려될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 연결된 10개 내지 60개의 아미노산의 스트레치(stretch)로 구성된 화합물을 의미한다.
글루카곤 펩타이드 및 AMPK 활성화제와 관련하여 본 명세서에 사용된 용어 "유사체"는, 유사하거나 유사한 생물학적 특성 및 효과를 갖는 펩타이드 또는 화합물 또는 약물을 의미한다.
펩타이드 또는 아미노산과 관련하여 본 명세서에 사용된 용어 "유도체"는, 화학적으로 변형된 펩타이드 또는 아미노산을 의미하며, 이때, 적어도 하나의 치환기는, 변형되지 않은 펩타이드 또는 아미노산 또는 이의 유사체(즉, 공유 결합으로 변형된 펩타이드 또는 아미노산)에 존재하지 않는다. 대표적인 변형체는 아미드, 탄수화물, 아실기, 에스테르 등이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "백분율 동일성" 또는 "% 동일성"은, 특히 BLAST 알고리즘을 사용하여 비교된 두 개의 펩타이드 사이의 동일한 아미노산 %를 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "AMPK 활성화제"는 AMP-활성 단백질 인산화효소(AMPK)의 활성화제 또는 작용제 또는 자극제인 화합물을 의미한다. 일례로, AMPK 활성화제는, 5-아미노이미다졸-4-카르복스아미드 1-β-D-리보푸라노사이드 (AICAR), (3R,3aR,6R,6aR)-6-((6-([1,1'-바이페닐]-4-일)-7-클로로-3H-이미다조[4,5-b]피리딘-2-일)옥시)헥사하이드로푸로[3,2-b]푸란-3-올 (MK-8722), (3R,3aR,6R,6aR)-6-((6-클로로-5-(4-(1-(하이드록시메틸)사이클로프로필)페닐)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)옥시)헥사하이드로푸로[3,2-b]푸란-3-올 (PF-739), 6-클로로-5-[4-(1-하이드록시사이클로부틸)페닐]-1H-인돌-3-카복실산 (PF-06409577), 1,1-디메틸비구아나이드 염산염 (메트포르민), 4-하이드록시-3-(2'-하이드록시바이페닐-4-일)-6-옥소-6,7-디하이드로티에노[2,3-b]피리딘-5-카르보니트릴 (A-769662), 2-클로로-5-[[5-[[5-(4,5-디메틸-2-니트로페닐)-2-푸라닐]메틸렌]-4,5-디하이드로-4-옥소-2-티아졸일]아미노]벤조산 (PT-1), 2-[[2-(2-브로모-4-메틸페녹시)에틸]티오]-피리미딘 (ZLN024), 2-[[4-(디에틸아미노)-2-하이드록시페닐]메틸렌]히드라지드-4-피리딘카복실산 (RSVA-405)을 포함하지만, 이에 한정하지는 않는다.
본 발명의 상기 내용뿐만 아니라 추가적인 주제, 특징, 및 이점은 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 대한 다음의 예시적이고 비제한적인 상세한 설명을 통해 더 잘 이해된다:
도 1은, 펩타이드 및 AMPK 활성화제의 공액체의 일례를 도시한 것이고,
도 2는, 도 1의 공액체로부터 MK-8722가 분리되는 메커니즘을 도시한 것이며,
도 3은, SEQ ID NO:1의 펩타이드 및 MK-8722의 공액체(글루카곤 Pen40/MK-8722)의 체중 감소 효과를 도시한 것이고,
도 4는, 생쥐의 일일 먹이 섭취량에 대한 글루카곤 Pen40/MK-8722 공액체의 효과를 도시한 것이며,
도 5는, 생쥐의 누적 먹이 섭취량에 대한 글루카곤 Pen40/MK-8722 공액체의 효과를 도시한 것이고,
도 6은, 화합물부하검사(compound tolerance test, CTT) 이후의 생쥐의 혈당에 대한 글루카곤 Pen40/MK-8722 공액체의 효과를 도시한 것이며,
도 7은, 복강내 당부하검사(intraperitoneal glucose tolerance test, IpGTT) 이후 생쥐의 혈당에 대한 글루카곤 Pen40/MK-8722 공액체의 효과를 도시한 것이고,
도 8은, 생쥐의 혈장 콜레스테롤에 대한 글루카곤 Pen40/MK-8722 공액체의 효과를 도시한 것이며,
도 9는, SEQ ID NO:1의 펩타이드 및 AICAR의 공액체(글루카곤 Pen40/AICAR)의 체중 감소 효과를 도시한 것이고,
도 10은, 생쥐의 일일 먹이 섭취량에 대한 글루카곤 Pen40/AICAR 공액체의 효과를 도시한 것이며,
도 11은, 생쥐의 누적 먹이 섭취량에 대한 글루카곤 Pen40/AICAR 공액체의 효과를 도시한 것이고,
도 12는, 화합물부하검사(CTT) 이후의 생쥐의 혈당에 대한 글루카곤 Pen40/AICAR 공액체의 효과를 도시한 것이며,
도 13은, 복강내 당부하검사(IpGTT) 이후 생쥐의 혈당에 대한 글루카곤 Pen40/AICAR 공액체의 효과를 도시한 것이고,
도 14는, 생쥐의 혈장 콜레스테롤에 대한 글루카곤 Pen40/AICAR 공액체의 효과를 도시한 것이며,
도 15는, AICAR로부터 유도된 화학적 링커의 합성 경로를 도시한 것이고,
도 16은, MK-8722로부터 유도된 화학적 링커의 합성 경로를 도시한 것이며,
도 17은, 예시 3에 따라 합성된, SEQ ID NO:3의 글루카곤 펩타이드 및 AMPK 활성화제 화합물의 공액체에 대한 합성 경로 일부를 도시한 것이고,
도 18은, 예시 3에 따라 합성된, SEQ ID NO:3의 글루카곤 펩타이드 및 AMPK 활성화제 화합물의 공액체에 대한 합성 경로의 추가 부분을 도시한 것이며,
도 19는, 예시 3에 따라 합성된, SEQ ID NO:3의 글루카곤 펩타이드 및 AMPK 활성화제 화합물의 공액체에 대한 합성 경로의 더 추가된 부분을 도시한 것이고,
도 20은, 예시 3에 따라 합성된, SEQ ID NO:3의 글루카곤 펩타이드 및 AMPK 활성화제의 공액체를 테스트한 AMPK 활성도 분석 결과를 도시한 것이며,
도 21은, 화합물부하검사 이후의 생쥐의 혈당에 대한 AMPK 활성화제 MK8722와 공액된 SEQ ID Nos:4-6의 다양한 이중작용제 펩타이드 및 삼중작용제 펩타이드의 효과를 도시한 것이고,
도 22는, SEQ ID Nos:4-6의 이중작용제 펩타이드 및 삼중작용제 펩타이드와 SEQ ID NO:1의 글루카곤 펩타이드 사이의 아미노산 서열 정렬을 도시한 것이다.
도 1은, 펩타이드 및 AMPK 활성화제의 공액체의 일례를 도시한 것이고,
도 2는, 도 1의 공액체로부터 MK-8722가 분리되는 메커니즘을 도시한 것이며,
도 3은, SEQ ID NO:1의 펩타이드 및 MK-8722의 공액체(글루카곤 Pen40/MK-8722)의 체중 감소 효과를 도시한 것이고,
도 4는, 생쥐의 일일 먹이 섭취량에 대한 글루카곤 Pen40/MK-8722 공액체의 효과를 도시한 것이며,
도 5는, 생쥐의 누적 먹이 섭취량에 대한 글루카곤 Pen40/MK-8722 공액체의 효과를 도시한 것이고,
도 6은, 화합물부하검사(compound tolerance test, CTT) 이후의 생쥐의 혈당에 대한 글루카곤 Pen40/MK-8722 공액체의 효과를 도시한 것이며,
도 7은, 복강내 당부하검사(intraperitoneal glucose tolerance test, IpGTT) 이후 생쥐의 혈당에 대한 글루카곤 Pen40/MK-8722 공액체의 효과를 도시한 것이고,
도 8은, 생쥐의 혈장 콜레스테롤에 대한 글루카곤 Pen40/MK-8722 공액체의 효과를 도시한 것이며,
도 9는, SEQ ID NO:1의 펩타이드 및 AICAR의 공액체(글루카곤 Pen40/AICAR)의 체중 감소 효과를 도시한 것이고,
도 10은, 생쥐의 일일 먹이 섭취량에 대한 글루카곤 Pen40/AICAR 공액체의 효과를 도시한 것이며,
도 11은, 생쥐의 누적 먹이 섭취량에 대한 글루카곤 Pen40/AICAR 공액체의 효과를 도시한 것이고,
도 12는, 화합물부하검사(CTT) 이후의 생쥐의 혈당에 대한 글루카곤 Pen40/AICAR 공액체의 효과를 도시한 것이며,
도 13은, 복강내 당부하검사(IpGTT) 이후 생쥐의 혈당에 대한 글루카곤 Pen40/AICAR 공액체의 효과를 도시한 것이고,
도 14는, 생쥐의 혈장 콜레스테롤에 대한 글루카곤 Pen40/AICAR 공액체의 효과를 도시한 것이며,
도 15는, AICAR로부터 유도된 화학적 링커의 합성 경로를 도시한 것이고,
도 16은, MK-8722로부터 유도된 화학적 링커의 합성 경로를 도시한 것이며,
도 17은, 예시 3에 따라 합성된, SEQ ID NO:3의 글루카곤 펩타이드 및 AMPK 활성화제 화합물의 공액체에 대한 합성 경로 일부를 도시한 것이고,
도 18은, 예시 3에 따라 합성된, SEQ ID NO:3의 글루카곤 펩타이드 및 AMPK 활성화제 화합물의 공액체에 대한 합성 경로의 추가 부분을 도시한 것이며,
도 19는, 예시 3에 따라 합성된, SEQ ID NO:3의 글루카곤 펩타이드 및 AMPK 활성화제 화합물의 공액체에 대한 합성 경로의 더 추가된 부분을 도시한 것이고,
도 20은, 예시 3에 따라 합성된, SEQ ID NO:3의 글루카곤 펩타이드 및 AMPK 활성화제의 공액체를 테스트한 AMPK 활성도 분석 결과를 도시한 것이며,
도 21은, 화합물부하검사 이후의 생쥐의 혈당에 대한 AMPK 활성화제 MK8722와 공액된 SEQ ID Nos:4-6의 다양한 이중작용제 펩타이드 및 삼중작용제 펩타이드의 효과를 도시한 것이고,
도 22는, SEQ ID Nos:4-6의 이중작용제 펩타이드 및 삼중작용제 펩타이드와 SEQ ID NO:1의 글루카곤 펩타이드 사이의 아미노산 서열 정렬을 도시한 것이다.
도 1은, 이황화기(105)를 포함하는 화학적 링커(104), 상기 화학적 링커(104)를 통해 SEQ ID NO:1의 펩타이드(103)의 C-말단 시스테인(102)에 화학적으로 부착된 MK-8722로 구성된, 펩타이드 및 AMPK 활성화제의 공액체의 일례를 도시한 것이다. C-말단 시스테인(102)의 측쇄(106)는, 측쇄(106)의 길이인 n이 1개 또는 2개의 탄소 원자가 되도록, 선택적으로 유도될 수 있다. hCys40이라고 불리는 측쇄(106)의 변형체는 n=2의 탄소 원자 길이를 가지며 R은 수소이다. hCys40이라고 불리는 측쇄(106)의 변형체는 n=1의 탄소 원자 길이를 가지며 R은 메틸이다. 보통의 시스테인은 Cys40이라고 불리운다.
도 2는, 도 1의 공액체(100)로부터 MK-8722가 분리되는 메커니즘을 도시한 것이다. 이황화기(105)를 포함하는 화학적 링커(104)는 자가-희생기(self-immolative)이고, 세포내 환경과 같은 환원 환경(미도시)에서 환원되어 티올기를 형성할 수 있으며, 공액체(100)의 펩타이드 부분(103)을 공액체의 MK-8722 부분(101)으로부터 분리할 수 있다. 분자의 MK-8722 부분(101)에서, 유리된 친핵성 티올(109)이 자발적인 분자내 고리화를 거쳐 MK-8722를 천연의 비변형체인 MK-8722 약물(MK-8722의 유리 형태)로 분리된다.
도 3 내지 도 14는, 예시 2에 개시된 생체내(in vivo) 생쥐 연구의 결과를 도시한 것이다.
도 3은, 도 1 및 도 2에 도시된, SEQ ID NO:1의 펩타이드 및 링커를 통해 화학적으로 결합된 MK-8722의 공액체(글루카곤-Pen40/MK-8722)(100 nmol/kg), 및 등몰 용량(equimolar doses)의 SEQ ID NO:1의 펩타이드(글루카곤 Pen40) 또는 MK-8722로, 7일간 치료된, 먹이로 비만을 유발시킨(diet-induced obesity, DIO) 생쥐의 체중 백분율(BW%)과 체중 감소 효과를 도시한 것이다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되며, N은 그룹당 8마리이다. 글루카곤 Pen40 또는 MK-8722의 단일요법(monotherapy)으로 처리된 생쥐는 체중이 약 4% BW% 감소로 약간 감소한 것으로 나타났다. BW%의 가장 높은 감소는 글루카곤 Pen40/MK-8722로 처리된 DIO 생쥐에서 관찰되었으며, 해당 공액체는 치료 7일 후 대략 10% BW% 감소를 일으켰다. 추가적으로, 곡선의 기울기를 근거로, 만약 치료가 연장될 경우 글루카곤 Pen40/MK-8722에 대해 추가적인 체중 감소를 기대할 수 있을 것으로 여겨진다.
도 4는, 7일간 치료된 DIO 생쥐의 일일 먹이 섭취량(g/일)에 대한 글루카곤 Pen40/MK-8722, 또는 등몰 용량의 글루카곤 Pen40 또는 MK-8722의 효과를 도시한 것이다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되며, N은 그룹당 8마리이다. 치료 7일간, 글루카곤 Pen40, MK-8722, 또는 글루카곤 Pen40/MK-8722로 처리된 생쥐는 식염수를 운반체(Vehicle)로서 주사한 대조군 생쥐와 비교하여 비슷한 일일 먹이 섭취량을 나타내었다. 연구 종료 시점에는, 글루카곤 Pen40으로 처리된 생쥐는 대조군(운반체)에 비해 먹이 섭취량이 약간 감소한 것으로 나타났다.
도 5는, 6일간 치료된 DIO 생쥐의 누적 먹이 섭취량(누적 FI, g/일)에 대한 글루카곤 Pen40/MK-8722, 및 등몰 용량의 글루카곤 Pen40 또는 MK-8722의 효과를 도시한 것이다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되며, N은 그룹당 8마리이다. 치료 과정에서, 글루카곤 Pen40, MK-8722, 또는 글루카곤 Pen40/MK-8722로 처리된 생쥐는 운반체로 표시되는 대조군 생쥐(즉, 식염수를 주사한 생쥐)와 비교하여 비슷한 누적 먹이 섭취량을 나타내었다.
도 6 및 도 7은, 화합물부하검사(CTT)(도 6) 또는 복강내 당부하검사(ipGTT)(도 7)를 실시한 치료 과정 7일차의 DIO 생쥐의 혈당 수치(mmol/L)와 대조군 생쥐(즉, 식염수를 주사한 생쥐)의 혈당 수치(mmol/L)를 서로 비교함으로써, 글루카곤 Pen40/MK-8722, 및 등몰 용량의 글루카곤 Pen40 또는 MK-8722의 효과를 나타낸 것이다. 혈당 수치는, 40시간(CTT, 도 6) 및 2시간(IPGTT, 도 7)에 걸쳐 측정되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되며, N은 그룹당 5~6마리이다. 일반적으로, 글루카곤 Pen40/MK-8722는 대조군에 비해 혈당 초기 증가 수치(스트레스 직후, >1시간)가 현저히 낮았다.
도 8은, 7일간 치료된 DIO 생쥐의 혈장 콜레스테롤 수치(mg/dL)와 대조군 생쥐(운반체, 즉, 식염수를 주사한 생쥐)의 혈장 콜레스테롤 수치(mg/dL)를 서로 비교함으로써, 글루카곤 Pen40/MK-8722, 및 등몰 용량의 글루카곤 Pen40 또는 MK-8722의 효과를 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되며, N은 그룹당 5~6마리이다. 글루카곤 Pen40/MK-8722로 처리한 생쥐는 혈장 콜레스테롤 수치가 크게 감소한 것으로 관찰되었다. 더욱이, 공액체로 처리한 생쥐는 운반체와 비교하여 훨씬 더 낮은 혈장 콜레스테롤 수치(100 mg/dL vs. 200 mg/dL)를 나타냈을 뿐만 아니라, 공액체는 또한 단일요법으로 투여된 글루카곤 Pen40 및 MK-8722보다 뚜렷한 성능을 나타내었다.
도 9는, 도 1 및 도 2에 도시된, SEQ ID NO:1의 펩타이드 및 링커를 통해 화학적으로 결합된 AICAR의 공액체(글루카곤-Pen40/AICAR)(100 nmol/kg), 및 등몰 용량의 SEQ ID NO:1의 펩타이드(글루카곤 Pen40) 또는 AICAR로, 7일간 치료된, 먹이로 비만을 유발시킨(DIO) 생쥐의 체중 백분율(BW%)과 체중 감소 효과를 도시한 것이다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되며, N은 그룹당 8마리이다. 글루카곤 Pen40 또는 AICAR의 단일요법, 또는 공액체(글루카곤 Pen40/AICAR)로 처리된 생쥐는, 대조군 생쥐(즉, 식염수를 주사한 생쥐)에 비해 체중이 약 4% BW% 감소로 약간 감소한 것으로 나타났다. BW%의 가장 높은 감소는, 글루카곤 Pen40 단독 처리, 또는 글루카곤 Pen40/AICAR 공액체로 처리된 DIO 생쥐에서 관찰되었으며, 양자는 치료 7일 후 대략 5% BW% 감소를 일으켰다.
도 10은, 7일간 치료된 DIO 생쥐의 일일 먹이 섭취량(g/일)에 대한 글루카곤 Pen40/AICAR(100 nmol/kg), 또는 등몰 용량의 글루카곤 Pen40 또는 AICAR의 효과를 도시한 것이다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되며, N은 그룹당 8마리이다. 치료 7일간, 글루카곤 Pen40, AICAR, 또는 글루카곤 Pen40/AICAR로 처리된 생쥐는 대조군 생쥐(즉, 식염수를 주사한 생쥐)와 비교하여 비슷한 일일 먹이 섭취량을 나타내었다. 연구 종료 시점에는, 글루카곤 Pen40 또는 글루카곤 Pen40/AICAR로 처리된 생쥐가 대조군(운반체) 및 AICAR로 처리된 생쥐보다 먹이 섭취량이 약간 감소한 것으로 나타났다. 곡선의 기울기를 근거로, 만약 치료가 연장될 경우, 글루카곤 Pen40/AICAR 또는 글루카곤 Pen40에 대해 부정적인 먹이 섭취 경향이 예상될 수 있을 것으로 여겨진다.
도 11은, 6일간 치료된 DIO 생쥐의 누적 먹이 섭취량(누적 FI, g/일)에 대한 글루카곤 Pen40/AICAR, 및 등몰 용량의 글루카곤 Pen40 또는 AICAR의 효과를 도시한 것이다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되며, N은 그룹당 8마리이다. 치료 과정에서, 글루카곤 Pen40, AICAR, 또는 글루카곤 Pen40/AICAR로 처리된 생쥐는 대조군 생쥐(즉, 식염수를 주사한 생쥐)와 비교하여 비슷한 누적 먹이 섭취량을 나타내었다.
도 12 및 도 13은, CTT(도 12) 또는 ipGTT(도 13)를 실시한 치료 과정 7일차의 DIO 생쥐의 혈당 수치(mmol/L)와 대조군 생쥐(즉, 식염수를 주사한 생쥐)의 혈당 수치(mmol/L)를 서로 비교함으로써, 글루카곤 Pen40/AICAR, 및 등몰 용량의 글루카곤 Pen40 또는 AICAR의 효과를 나타낸 것이다. 혈당 수치는, 40시간(CTT, 도 12) 및 2시간(IpGTT, 도 13)에 걸쳐 측정되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되며, N은 그룹당 5~6마리이다. 두 개의 스트레스 테스트 모두에서, 글루카곤 Pen40/AICAR은 대조군에 비해 혈당 초기 증가 수치(스트레스 직후, >1시간)가 현저히 낮았다.
도 14는, 7일간 치료된 DIO 생쥐의 혈장 콜레스테롤 수치(mg/dL)와 대조군 생쥐(운반체, 즉, 식염수 처리된 생쥐)의 혈장 콜레스테롤 수치(mg/dL)를 서로 비교함으로써, 글루카곤 Pen40/AICAR, 및 등몰 용량의 글루카곤 Pen40 또는 AICAR의 효과를 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되며, N은 그룹당 5~6마리이다. 혈장 콜레스테롤 수치의 가장 높은 감소는, 글루카곤 Pen40, 또는 글루카곤 Pen40/AICAR로 처리된 생쥐에서 관찰되었다. AICAR 단독으로 처리된 생쥐는 대조군 생쥐와 유사한 혈장 콜레스테롤 수치를 보였으며, 혈장 콜레스테롤에 대한 AICAR의 영향은 제한적이라는 결론을 내렸다.
도 20은, AMPK 활성화제 화합물 및 SEQ ID NO:3의 글루카곤 펩타이드의 합성 공액체 화합물(22a-22d 및 23a-23e)(예시 3)의 AMPK 활성도 분석(예시 4) 결과를 도시한 것이다. 결과는, 합성 공액체 화합물(22a~22d 및 23a~23e)이 대조 화합물(PF-06409577(PF) 및 MK-8722(Glixx lab; GLXC-11445))와 비교하여 유사하거나 향상된 AMPK 활성도를 나타냄을 보여준다.
도 21은, 급성 화합물부하검사(acute compound tolerance test)를 실시한 DIO 생쥐의 혈당 수치(mM)와 대조군 그룹(운반체, 즉, 식염수를 주사한 생쥐)의 혈당 수치(mM)를 서로 비교함으로써, 이중작용제(co-agonist) 및 삼중작용제(tri-agonist) 펩타이드(SEQ ID NOs:4~6), 및 MK8722의 서로 다른 공액체의 효과를 나타낸 것이다. 혈당 수치는 피하주사 24시간 후 측정되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되며, N은 그룹당 8마리이다. 일반적으로, 3개의 공액체(글루카곤/GLP-1/MK8722, 글루카곤/GIP/MK8722, 및 글루카곤/GLP-1/GIP/MK8722(도 21에서 "삼중작용제/MK8722"로 표시됨))는, 운반체, 또는 이중작용제 및 삼중작용제 펩타이드를 단독으로 처리한 그룹에 비해 현저히 낮은 혈당 수치를 나타냈다.
도 22는, 약물 공액체에 사용된, SEQ ID Nos:4~6의 이중작용제 및 삼중작용제 펩타이드와 SEQ ID NO:1의 글루카곤 펩타이드 사이의 아미노산 서열 정렬을 도시하고 있으며, 여기서 X1은, D-알라닌, D-세린, 알파-아미노이소부티르산(alpha-aminoisobutyric acid), N-메틸-세린, 글리신 또는 발린이고, X2는, 시스테인(hCys40/Cys40) 또는 L-페니실라민(Pen40)이다.
결론
제시된 데이터는 글루카곤 유사체와 AMPK 활성화제의 화학적 공액이, 비만, 당뇨병, 및 NASH를 포함한, 대사 장애를 효과적으로 개선시키기 위한 새로운 의학적 전략을 나타냄을 보여준다. 이 전략에 기초한 공액체는, 글루카곤 대조군에 비해 체중과 콜레스테롤 수치를 낮추는데 우수하며, AMPK 활성화제의 부작용과 같은 결함이 없다.
예시
예시 1: 펩타이드 및 펩타이드-AMPK 활성화제 공액체의 제조
재료: 모든 용매와 시약은 시중에서 구입되어 추가 정제 없이 사용되었다. H-링크 아미드 켐매트릭스® 레진(H-Rink amide ChemMatrix® Resin)은 펩타이드 신장에 사용되었다. 달리 명시되지 않는 한, Fmoc-보호(9-플루오레닐메틸 카바메이트) 아미노산(Fmoc-protected(9-fluorenylmethyl carbamate) amino acids)은 Iris-Biotech 또는 Gyros Protein Technologies로부터 구입하였으며, 0.40 - 0.60 mmol/g 적재의, 35-100 메시(mesh)의, H-링크 아미드 켐매트릭스® 레진은 Sigma Aldrich로부터 구입하였다. 상업적으로 이용 가능한 N α -Fmoc 아미노산 빌딩 블록은 다음과 같은 측쇄 보호 유사체로서 구입되었다: Arg, Pmc; Asp, OtBu; Cys, Trt; Gln, Trt; His, Trt; Lys, Trt; Ser, tBu; 및 Trp, Boc (여기서, Pmc는 2,2,5,7,8-펜타메틸코만-6-술포닐(2,2,5,7,8-pentamethylchoman-6-sulfonyl)이고, OtBu는 tert-부틸 에스테르이며, Trt는 트리틸(trityl)이고, Boc는 tert-부틸옥시카르보닐이며, tBu는 tert-부틸 에테르이다).
모든 펩타이드, 그리고 펩타이드 및 AMPK 활성화제의 모든 공액체는, 분석적 RP-UPLC(reverse phase ultra-performance liquid chromatography)(Waters제), 및 C18 컬럼(Zorbax Eclipse, XBD-C18, 4.6 × 50 mm)을 갖는 Agilent 6410 삼중 사중극자 질량필터(Triple Quadrupole Massfilter)를 결합한 ESI-LCMS(electrospray ionization liquid chromatography mass spectrometry)로 특성화되었다. ESI-LCMS는 분당 0.75 mL의 유속에서의 H2O:MeCN:TFA (A: 95:5:0.1, B: 5:95:0.1)로 구성된 바이너리 버퍼 시스템(binary buffer system)을 통해 용리되었다. 순도는, 분당 0.45 mL의 유속에서의 H2O:MeCN:TFA (A: 95:5:0.1, B: 5:95:0.1)로 구성된 바이너리 버퍼 시스템을 통해 용리하는, C18 컬럼(Acquity UPLC BEH C18, 1.7 ㎛, 2.1 × 50 mm)을 갖춘 RP-UPLC에 의해 결정되었다.
Fmoc-보호 스킴을 위한 자동화된 펩타이드 합성 프로토콜: 펩타이드는, 10 mL 유리 용기, 및 인덕션 가열 기능이 있는 펩타이드 합성장치인 Prelude X(Gyros Protein Technologies, Tucson, AZ, USA)를 사용하여, C-말단이 아미드화된 유도체로 제조되었다. 모든 시약은, DMF: Fmoc-보호 아미노산(0.2 M), HCTU(0.5 M), DIPEA(1.0 M), 및 피페리딘(20% v/v)의 저장 용액으로서 새로 제조되었다. 펩타이드 신장은 아래의 프로토콜을 사용하여 연속적인 합성 조작에 의해 달성되었다: 탈보호(2 × 2분, RT, 300 rpm 진동) 및 커플링(2 × 5분, 75℃, 300 rpm 진동, Arg 및 His의 경우 2 × 5분, 50℃, 300 rpm 진동). 펩타이드는, 레진 대비 5배 이상의 AA/HCTU/DIPEA(비율 1:1.25:2.5)로 구성된, 이중 및 삼중 커플링을 사용하여 제조되었다.
정제: 정제 전에, 펩타이드 및 AMPK 활성화제의 공액체 또는 크루드 펩타이드(crude peptide)를 RP-UPLC 및 ESI-LCMS 또는 MALDI-TOF 질량 분석법으로 분석하였다. 정제는, 역상 C18 컬럼(Zorbax, 300 SB-C18, 21.2 × 250 mm)이 장착되고 H2O:MeCN:TFA (A: 95:5:0.1; B: 5:95:0.1)의 바이너리 버퍼 시스템을 이용하여 선형 그레디언트(유량 20 mL/분)를 통해 용리하는, 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 시스템(Waters제)을 통해 수행되었다. 여액(fraction)은 0.3분 간격으로 수집되었으며, ESI-LCMS로 특성화되었다. 순도는 214 nm에서 RP-UPLC에 의해 결정되었고, 순도가 >95%인 여액은 모아서 동결건조하였다. 동결건조된 최종 생성물은 추가 실험에서 사용되었다.
펩타이드 및 AMPK 활성화제의 공액체의 어셈블리를 위한 공액 프로토콜: 순수 펩타이드 및 티오피리딜(thiopyridyl)로 활성화된 순수 AMPK 활성화제의 공액체를 바이너리 용매계(A: DMF; pH=8인 1.5M 이미다졸, 6M 구아니딘 H2O용액) (비율 7:1)에 용해시키고, 2시간 이상 교반하였다. 크루드 반응 혼합물은 분석용 RP-UPLC 및 ESI-LCMS에 의해 모니터링되었다. 교반이 완료되면, 반응 혼합물을 버퍼 A 및 버퍼 B로 희석하고, 선형 그레디언트를 통해 용리하는 RP-HPLC를 사용하여 직접 정제하였다.
탈염(desalting): 모든 펩타이드는 생물학적 실험 이전에 탈염되었다. 탈염은, 펩타이드 또는 펩타이드 및 AMPK 활성화제의 공액체를 묽은 0.01 M HCl 수용액에 연달아 재용해시킨 후 동결건조시키는 과정을 3회 반복함으로써 수행되었다. 펩타이드 또는 공액체의 순도는, 생체내 또는 생체외 실험에 사용하기 이전에, RP-UPLC 및 ESI-LCMS에 의해 측정되었다.
2-(피리딘-2-일디설판일)에탄-1-아민 염산염(2-(pyridin-2-yldisulfaneyl)ethan-1-amine hydrochloride). N2-대기 하의 자석 마그네틱바(magnetic stirring bar)를 갖춘 건조된 둥근바닥 쉬링크 플라스크에서, 2'-알드리티올(2'-aldrithiol)(5.00 g, 22.70 mmol, 3.0 당량)을 건조 MeOH(20 mL)에 용해시킨 후 시스테아민 염산염(cysteamine hydrochloride)(859.5 mg, 7.57 mmol, 1.0 당량)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반한 후 진공에서 농축시켰다. 크루드 황색 오일을 실리카겔 플래시 컬럼 크로마토그래피로 정제하거나, MeOH에 재용해하고 차가운 에테르로 침전시켜, 백색 결정으로서 2-(피리딘-2-일디설판일)에탄-1-아민 염산염(1.39 g, >95%)을 획득하였다. R f = 0.22; UPLC/MS (ESI): m/z calcd. for C7H10N2S2 [M+H]+ = 187.0, found 187.2; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.51 (dt, J = 4.9, 1.4 Hz, 1H), 8.23 (s, 3H), 7.84 (td, J = 7.7, 1.9 Hz, 1H), 7.78 - 7.72 (m, 1H), 7.30 (ddd, J = 7.4, 4.8, 1.1 Hz, 1H), 3.14 - 3.06 (m, 4H); 13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 158.05, 149.83, 137.91, 121.64, 120.08, 37.67, 34.79.
5-아미노-1-((3a R ,4 R ,6 R ,6a R )-6-(하이드록시메틸)-2,2-디메틸테트라하이드로푸로[3,4- d ][1,3]디옥솔-4-일)-1 H -이미다졸-4-카르복스아미드(5-amino-1-((3a R ,4 R ,6 R ,6a R )-6-(hydroxymethyl)-2,2-dimethylte-trahydrofuro[3,4- d ][1,3]dioxol-4-yl)-1 H -imidazole-4-carboxamide). 자석 마그네틱바를 갖춘 플레임-건조된 둥근바닥 쉬링크 플라스크에서, 과염소산(perchloric acid)(70 %, 2.38 mL, 27.69 mmol, 1.3 당량)을, 건조 아세톤(360 mL) 및 AICAR(5.50 g, 21.3 mmol, 1.0 당량)의 교반 현탁액에 첨가하였다. 실온에서 3시간 동안 교반한 후, 0℃에서 수산화암모늄(4.04 mL, 29.83 mmol, 1.4 당량)을 적가하여 반응을 멈추었다. 획득한 고체를 여과하고 건조하여, 백색 결정으로서 5-아미노-1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(하이드록시메틸)-2,2-디메틸테트라하이드로푸로[3,4-d][1,3]디옥솔-4-일)-1H-이미다졸-4-카르복스아미드(4.26 g, 67%)를 획득하였다. 순도 >95%(HPLC, 20분 내 0-50B), R t = 16.60 분; UPLC/MS (ESI): m/z calcd. for C12H19N4O5 [M+H]+ = 299.1, found 299.4; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.37 (s, 1H), 6.74 (d, J = 50.9 Hz, 2H), 5.93 (s, 2H), 5.75 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 5.27 (t, J = 4.9 Hz, 1H), 5.08 (dd, J = 6.3, 3.7 Hz, 1H), 4.87 (dd, J = 6.4, 2.9 Hz, 1H), 4.10 (q, J = 3.7 Hz, 1H), 3.52 (tq, J = 11.7, 6.1, 4.7 Hz, 2H), 3.31 (s, 1H), 1.53 (s, 3H), 1.32 (s, 3H); 13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 166.60, 142.75, 128.16, 113.38, 112.82, 88.58, 84.97, 82.31, 80.53, 61.00, 26.96, 25.20.
((3aR,4R,6R,6aR)-6-(5-아미노-4-카르바모일-1H-이미다졸-1-일)-2,2-디메틸테트라하이드로푸로[3,4-d][1,3]디옥솔-4-일)메틸(2-(피리딘-2-일디설판일)에틸)카바메이트(((3aR,4R,6R,6aR)-6-(5-amino-4-carbamoyl-1H-imidazol-1-yl)-2,2-dimethyltetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioxol-4-yl)methyl (2-(pyridin-2-yldisulfaneyl)ethyl)carbamate). N2-대기 하의 자석 마그네틱바를 갖춘 플레임-건조된 둥근바닥 쉬링크 플라스크에서, 5-아미노-1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(하이드록시메틸)-2,2-디메틸테트라하이드로푸로[3,4-d][1,3]디옥솔-4-일)-1H-이미다졸-4-카르복스아미드(600.0 mg, 2.01 mmol, 1.0 당량)를 건조 DMF (20 mL) 내에서 용해시킨 후, N,N-카르보닐디이미다졸(N,N-Carbonyldiimidazole)(391.0 mg, 2.41 mmol, 1.2 당량) 및 건조 피리딘(488 μL, 6.03 mmol, 3.0 당량)을 첨가하였다. 반응은 UPLC-MS에 의해 지속적으로 관찰되었다. 활성 카바메이트로 완전히 전환(full conversion)되면, 2-(피리딘-2-일디설판일)에탄-1-아민 염산염(468.4 mg, 3.02 mmol, 1.5 당량)을 첨가하고 오일배스(oil bath)를 사용하여 반응물을 45℃로 가열하며 22시간 동안 교반하였다. 반응이 진행됨에 따라 화합물 2-(피리딘-2-일디설판일)에탄-1-아민 염산염은 용해되었다. 반응이 완료되면(UPLC-MS에 의해 관찰됨), 반응물을 CH2Cl2 (75 mL)와 함께 분별 깔대기로 옮기고, 물(3 × 50 ml) 및 염수(2 × 50 mL)로 세척하였다. 유기층을 MgSO4 로 건조시키고 진공에서 농축하였다. 구배(CH2Cl2 -> CH2Cl2:MeOH 19:1 -> CH2Cl2:MeOH 9:1)를 이용하여 원유를 실리카겔 플래시 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 백색 결정성 고체로서 ((3aR,4R,6R,6aR)-6-(5-아미노-4-카르바모일-1H-이미다졸-1-일)-2,2-디메틸테트라하이드로푸로[3,4-d][1,3]디옥솔-4-일)메틸(2-(피리딘-2-일디설판일)에틸)카바메이트(916 mg, 89%)를 획득하였다; 순도 >95% (HPLC, 20분 내 0-50B), R t = 16.60 분; UPLC/MS (ESI): m/z calcd. for C20H27N6O6S2 [M+H]+ = 511.1, found 511.2; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.51 - 8.28 (m, 1H), 7.86 - 7.73 (m, 2H), 7.51 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.39 (s, 1H), 7.24 (ddd, J = 7.3, 4.8, 1.2 Hz, 1H), 6.76 (d, J = 31.7 Hz, 2H), 5.90 (s, 2H), 5.78 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 5.17 (dd, J = 6.3, 3.5 Hz, 1H), 4.84 (dd, J = 6.3, 3.0 Hz, 1H), 4.24 (q, J = 4.4 Hz, 1H), 4.11 - 3.97 (m, 2H), 3.28 (q, J = 6.5 Hz, 2H), 2.90 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 2.52 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 1.53 (s, 3H), 1.32 (s, 3H). 13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 166.42, 159.01, 155.61, 149.58, 142.90, 137.79, 127.51, 121.19, 119.29, 113.72, 112.47, 87.60, 82.49, 82.27, 80.52, 63.70, 37.53, 26.87, 25.19.
(2 R ,3 S ,4 R ,5 R )-5-(5-아미노-4-카르바모일-1 H -이미다졸-1-일)-3,4-디하이드록시테트라하이드로푸란-2-일)메틸(2-(피리딘-2-일디설판일)에틸)카바메이트((2 R ,3 S ,4 R ,5 R )-5-(5-amino-4-carbamoyl-1 H -imidazol-1-yl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyl(2-(pyridin-2-yldisulfaneyl)ethyl)carbamate). 스크류 캡이 있는 10 mL 바이알에서, ((3aR,4R,6R,6aR)-6-(5-아미노-4-카르바모일-1H-이미다졸-1-일)-2,2-디메틸테트라하이드로푸로[3,4-d][1,3]디옥솔-4-일)메틸(2-(피리딘-2-일디설판일)에틸)카바메이트(80.0 mg, 0.16 mmol, 1.0 당량)를, MeCN 및 1.0 M 수성 HCl의 1:3 혼합물에 용해시키고 3시간 동안 진탕기(shaker)에 방치(HPLC 및 UPLC-MS에서 완전한 전환이 나타날 때까지)하였다. 이어서, 반응물을 냉동건조하여, 디하이드로클로라이드 염(dihydrochloride salt)으로서 (2R,3S,4R,5R)-5-(5-아미노-4-카르바모일-1H-이미다졸-1-일)-3,4-디하이드록시테트라하이드로푸란-2-일)메틸(2-(피리딘-2-일디설판일)에틸)카바메이트(84 mg, >95%)를 획득하였다; 순도 >95% (HPLC, 20분 내 0-50B), R t = 11.62 분; UPLC/MS (ESI): m/z calcd. for C17H23N6O6S2 [M+H]+ = 471.1, found 471.4; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d 6) δ 8.82 (s, 1H), 8.46 (dd, J = 5.0, 1.8 Hz, 1H), 7.85 (td, J = 7.8, 1.9 Hz, 1H), 7.79 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.60 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 7.26 (ddd, J = 7.5, 4.8, 1.1 Hz, 1H), 5.78 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 4.37 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 4.19 (m, 2H), 4.03 (m, 1H), 3.29 (q, J = 6.4 Hz, 2H), 2.92 (m, 2H); 13C NMR (151 MHz, DMSO) δ 162.32, 161.07, 158.92, 155.79, 149.35, 142.90, 138.13, 127.63, 121.31, 119.51, 103.12, 88.46, 83.31, 73.73, 69.93, 63.80, 37.58.
(3 S ,3a S ,6 S ,6a S )-6-((5-([1,1'-바이페닐]-4-일)-6-클로로-1 H -이미다조[4,5- b ]피리딘-2-일)옥시)헥사하이드로푸로[3,2- b ]푸란-3-일(2-(피리딘-2-일디설판일)에틸)카바메이트((3 S ,3a S ,6 S ,6a S )-6-((5-([1,1'-biphenyl]-4-yl)-6-chloro-1 H -imidazo[4,5- b ]pyridin-2-yl)oxy)hexahydrofuro[3,2- b ]furan-3-yl(2-(pyridin-2-yldisulfaneyl)ethyl)carbamate). 아르곤 대기 하의 플레임-건조된 둥근바닥 플라스크에서, MK-8722(12 mg, 0.027 mmol, 1.0 당량), N,N-카르보닐디이미다졸(5.2 mg, 0.032 mmol, 1.2 당량), 및 건조 피리딘(6.5 μL, 0.08 mmol, 3.0 당량)을 건조 DMF (1 mL) 내에서 용해시킨 후, 주위 온도에서 하룻밤 동안 진탕기(500 rpm)에 방치하였다. 활성 카바메이트의 생성은 UPLC-MS에 의해 확인되었다; UPLC/MS (ESI): m/z calcd. for C28H24ClN5O5 [M+2H]2+ = 272,6 found 272.4. UPLC-MS에 의해 관찰된 바와 같이 완전히 전환되면, 건조 DMF (1 mL)에 포함된 2-(피리딘-2-일디설판일)에탄-1-아민 염산염(7.48 mg, 0.040 mmol, 1.5 당량)을 실린지를 통해 첨가하였고, 온도를 50℃로 증가시켜 하룻밤 동안 방치하였다. 반응 혼합물을 H2O:MeCN (1:1)으로 희석하였고 분취용 HPLC(0-100% B의 구배로 20 mL/분 이상 용리함)로 정제하였으며, 냉동건조하여 백색 고체로서 (3S,3aS,6S,6aS)-6-((5-([1,1'-바이페닐]-4-일)-6-클로로-1H-이미다조[4,5-b]피리딘-2-일)옥시)헥사하이드로푸로[3,2-b]푸란-3-일(2-(피리딘-2-일디설판일)에틸)카바메이트(11.6 mg, 66%)를 획득하였다; 순도 >95% (HPLC), RT = 16.77 분; UPLC-MS; UPLC/MS (ESI): m/z calcd. for C32H30ClN5O5S2 [M+2H]2+ = 331,6 found 331.5; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d 6) δ 8.49 - 8.43 (m, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.83 (td, J = 7.7, 1.9 Hz, 1H), 7.81 - 7.72 (m, 7H), 7.59 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.50 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 7.43 - 7.37 (m, 1H), 7.32 - 7.21 (m, 1H), 5.48 (q, J = 5.9 Hz, 1H), 4.94 (td, J = 6.9, 5.4 Hz, 1H), 4.87 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 4.65 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 4.13 (dd, J = 9.5, 6.1 Hz, 1H), 3.93 (ddd, J = 16.9, 9.2, 6.3 Hz, 2H), 3.68 (dd, J = 8.8, 7.3 Hz, 1H), 3.35 - 3.22 (m, 2H), 2.92 (t, J = 6.8 Hz, 2H); 13C NMR (151 MHz, DMSO) δ 160.21, 159.06, 155.38, 149.57, 146.90, 139.69, 139.63, 137.88, 137.85, 130.09, 129.01, 127.65, 126.70, 126.09, 121.79, 121.22, 119.31, 116.22, 114.30, 80.44, 80.07, 78.61, 73.33, 70.12, 69.79, 37.59.
(페니실라민으로 링크된) 글루카곤 Pen40/AICAR의 제조: 글루카곤 펩타이드 유도체는 위에 개시된 Fmoc 프로토콜을 사용하여 합성되었으며, 화학적 링커인 유도체화된 AICAR 유사체와 공액되었다. 화학적 링커인 유도체화된 AICAR의 화학적 합성은 도 15에 도시된 합성 경로를 통해 수행되었다.
글루카곤 Pen40/MK-8722: 공액체는, 상기 개시된 공액 프로토콜의 사용, 그리고 도 16에 도시된 화학 반응에 의해 제조되었으며, 상기 화학 반응은 6M 구아니딘, 1.5M 이미다졸 버퍼에서 2시간 동안 실온에서 진행되었다. RP-UPLC 및 ESI-LCMS 분석 결과 순도는 >95%임이 확인되었다.
예시 2: 먹이로 비만을 유발시킨(DIO) 생쥐의 생체내 약리학 연구.
C57BL6J 수컷 생쥐는, 먹이로 비만을 유발시킨(DIO) 생쥐로서 아래에 언급되며, 고지방 식이(지방으로부터 58%의 에너지를 획득함)를 유지하였으며, 각 연구에서, 연구 시작 전의 평균 체중은 45g 초과였다. 생쥐는 개별적으로 또는 두 마리로 수용(double-housed)되었다. 생쥐는 21-23℃에서 12시간 주야-싸이클(dark-light cycle)로 유지되었다. 화합물을 1일 1회(오후 2시에서 오후 5시 사이) 피하 투여하고, 해당 시간에서 먹이 섭취량(FI) 및 체중(BW)을 측정하였다. 체성분의 경우, 연구 전(연구 시작 1~3일 전)과 연구 마지막 날에 MRI 스캐너(EchoMRI)를 사용하여 체지방량(fat mass) 및 제지방량(lean mass)을 측정하였다. 운반체(식염수)를 주사한 생쥐 그룹은 대조군 역할을 하였다.
예시 3: 변형된 글루카곤(SEQ ID NO:3) 및 AMPK 활성화제의 공액체 제조
4'-(5-시아노-4-하이드록시-6-옥소-6,7-디하이드로티에노[2,3-
b
]피리딘-3-일)-[1,1'-바이페닐]-2-일 (2-(피리딘-2-일디설판일)에틸)카바메이트 (4'-(5-cyano-4-hydroxy-6-oxo-6,7-dihydrothieno[2,3-
b
]pyridin-3-yl)-[1,1'-biphenyl]-2-yl (2-(pyridin-2-yldisulfaneyl)ethyl)carbamate) (402)
N2-대기 하의 자석 마그네틱바를 갖춘 플레임-건조된 둥근바닥 플라스크에서, A-769662(100 mg, 0.28 mmol, 1.0 당량)와 건조 Et3N(116 μL, 0.83 mmol, 3.0 당량)이 건조 CH2Cl2(5 mL) 내에서 용해되었다. 니트로페닐 클로로포르메이트(nitrophenyl chloroformate)(62 mg, 0.31 mmol, 1.1 당량)를 첨가하기 전에 반응 혼합물을 냉수조(ice-water bath)에서 0℃로 냉각하였다. 반응은 UPLC-MS에 의해 관찰되었다. 반응이 완료되면, 137 (57 mg, 0.31 mmol, 1.1 당량)을 첨가하고, 반응물을 50℃로 가열하여 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 H2O:MeCN (1:1)으로 희석하였고 분취용 HPLC(0-100% B의 구배로 20 mL/분 이상 용리함)로 정제하였으며, 냉동건조하여 백색 고체로서 402를 획득하였다; LC/MS (ESI): m/z calcd. for C28H21N4O4S3 [M+H]+ = 573.1, found 573.1; 1 H NMR (600 MHz, DMSO-d 6) δ 12.57 (s, 1H), 8.49 - 8.42 (m, 1H), 7.95 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 7.77 (td, J = 7.7, 1.9 Hz, 1H), 7.76 - 7.70 (m, 1H), 7.52 - 7.45 (m, 2H), 7.48 - 7.40 (m, 2H), 7.43 - 7.35 (m, 2H), 7.34 (td, J = 7.5, 1.3 Hz, 1H), 7.26 - 7.21 (m, 1H), 7.19 (dd, J = 8.0, 1.3 Hz, 1H), 7.05 (s, 1H), 3.30 (q, J = 6.4 Hz, 2H), 2.84 (t, J = 6.7 Hz, 2H); 13 C NMR (151 MHz, DMSO) δ 162.47, 159.49, 155.03, 150.06, 148.39, 138.22, 137.32, 136.67, 135.54, 134.44, 130.86, 129.82, 128.96, 128.22, 126.34, 124.18, 121.66, 119.73, 116.35, 40.41, 37.89.
tert
-부틸 (2-하이드록시에틸)카바메이트 (
tert
-butyl (2-hydroxyethyl)carbamate) (2) (도 17, 스킴 1)
N2-대기 하의 자석 마그네틱바를 갖춘 플레임-건조된 둥근바닥 플라스크에서, 디-tert-부틸 디카보네이트(Di-tert-butyl dicarbonate)(7.86 g, 36.01 mmol, 1.10 당량)를 무수 CH2Cl2(30 mL)이 포함된 건조 Et3N(6.70 mL, 49.11 mmol, 1.5 당량) 및 2-에타놀 아민(2-ethanol amine)(1.98 mL, 32.74 mmol, 1.0 당량)의 교반 용액에 첨가하여 하룻밤 동안 방치하였다. 반응 혼합물을 진공에서 농축시켰고, EtOAc(100 mL)에 재용해시켰으며, 유기층을 0.5 N 수성 HCl(2×50 mL) 및 염수(50 mL)의 용액으로 세척하였고, MgSO4로 건조시켰으며, 여과하고 진공에서 농축하여 무색 오일로서 2 (5.21 g, >95%)를 획득하였다. 1 H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 5.06 (s, 1H), 3.66 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 3.25 (q, J = 5.4 Hz, 2H), 1.42 (s, 9H); 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 156.94, 79.72, 62.54, 46.15, 28.49.
2-((
tert
-부톡시카르보닐)아미노)에틸 4-메틸벤젠설포네이트 (2-((
tert
-butoxycarbonyl)amino)ethyl 4-methylbenzenesulfonate) (3) (도 17, 스킴 1)
N2-대기 하의 자석 마그네틱바를 갖춘 플레임-건조된 둥근 바닥 플라스크에서, 2 (5.28 g, 32.74 mmol, 1.0 당량) 및 건조 Et3N를 무수 CH2Cl2(100 mL)에 용해시키고, p-톨루엔 술포닐 염화물(p-toluene sulfonyl chloride)(9.36 g, 49.12 mmol, 1.5 당량)을 첨가하여 하룻밤 동안 방치하였다. 반응물을 CH2Cl2(100 mL)와 함께 분별 깔대기로 옮기고, 혼합된 유기층을 H2O(3 × 50 mL) 및 염수(50 mL)로 세척하였으며, Na2SO4 로 건조시킨 후 진공에서 농축하였다. CombiFlash에 의한 정제(0-50 구배로 45분 이내 용리함) 결과, 갈색 오일로서 3 (8.98 g, 87%)을 획득하였다. R f = 0.61 (1:1, EtOAc:헵탄); 1 H NMR (600 MHz, 클로로포름-d) δ 7.90 - 7.69 (m, 2H), 7.40 - 7.33 (m, 2H), 4.85 (s, 1H), 4.06 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 3.37 (q, J = 5.5 Hz, 2H), 2.44 (s, 3H), 1.40 (s, 9H); 13 C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 155.73, 145.14, 132.83, 130.08, 128.05, 79.89, 69.57, 39.88, 28.40, 21.75.
tert
-부틸 (2-(4-브로모페녹시)에틸)카바메이트 (
tert
-butyl (2-(4-bromophenoxy)ethyl)carbamate) (4) (도 17, 스킴 1)
N2-대기 하의 자석 마그네틱바를 갖춘 플레임-건조된 둥근바닥 플라스크에서, 3 (2.5 g, 13.92 mmol, 1.0 당량), 4-브로모페놀(2.65 g, 15.31 mmol, 1.1 당량), 및 오븐 건조된 K2CO3(5.76 g, 41.2 mmol, 3.0 당량)을 건조 DMF(20 mL)에서 60℃로 하룻밤 동안 현탁시켰다. 그런 다음, 반응 혼합물에 물을 첨가하였고, 수성층을 EtOAc (3 × 100 mL)로 추출하였다. 혼합된 유기층을 0.1N 수성 NaOH(100 mL) 및 염수(100 mL)로 세척하였고, MgSO4로 건조하였으며, 여과하고 진공에서 농축하여 4 (4.09 g, 93%)를 획득하였다; UPLC/MS (ESI): m/z calcd. for C9H10BrNO2 [M+H-tBu]+ = 260.0, found 260.1; 1 H NMR (600 MHz, 클로로포름-d) δ 7.62 - 7.28 (m, 2H), 6.90 - 6.63 (m, 2H), 4.98 (s, 1H), 3.97 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.51 (dt, J = 5.5 Hz, 2H), 1.44 (s, 9H); 13 C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 157.82, 155.98, 132.44, 116.38, 116.38, 113.34, 79.73, 67.54, 40.16, 28.51.
tert
-부틸 (2-(4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페녹시)에틸)카바메이트 (
tert
-butyl (2-(4-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)phenoxy)ethyl)carbamate) (5) (도 17, 스킴 1)
자석 마그네틱바를 갖춘 플레임-건조된 둥근바닥 플라스크에서, 4 (2.04 g, 6.5 mmol, 1.0 당량), 비스(피나콜라토)디보론(bis(pinacolato)diboron)(3.30 g, 13.02 mmol, 2.0 당량), AcOK(3.44 g, 35 mmol, 5.4 당량), 및 Pd(dppf)Cl2·CH2Cl2(508 mg, 0.65 mmol, 0.1 당량)을 건조 탈기된 DMSO(30 mL)와 혼합하고, 반응 혼합물을 빠르게 탈기한 후, 80℃에서 13시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 Celite® 패드를 통해 여과한 후, 여과액을 물(100 mL)과 함께 분별 깔대기로 옮기고, 수성층을 EtOAc(3 × 75 mL)로 추출하였다. 혼합된 유기층을 H2O(3 × 100 mL) 및 염수(2 × 100 mL)로 세척하였고, Na2SO4로 건조하였으며, 여과하고 진공에서 농축시켰다. 구배(헵탄:EtOAc, 20:1 내지 5:1)로 용리하는, 실리카 겔 플래시 컬럼 크로마토그래피(silica gel flash column chromatography)를 통해 크루드 블랙 오일(crude black oil)이 정제되었으며, 무색 오일로서 5 (1.73 g, 73%) 를 획득하였다. UPLC/MS (ESI): m/z calcd. for C15H23BNO5 [M+H-tBu]+ 308.2, found 308.3; 1 H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 7.93 - 7.34 (m, 2H), 6.93 - 6.67 (m, 2H), 4.04 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 3.53 (q, J = 5.2 Hz, 2H), 1.44 (s, 9H), 1.32 (s, 12H);
1-(5-브로모-6-클로로-1
H
-인돌-3-일)-2,2,2-트리플루오로에탄-1-온 (1-(5-bromo-6-chloro-1
H
-indol-3-yl)-2,2,2-trifluoroethan-1-one) (7) (도 17, 스킴 1)
N2-대기 하의 자석 마그네틱바를 갖춘 플레임-건조된 둥근바닥 플라스크에서, 5-브로모-6-클로로-1H-인돌(2.22 g, 9.54 mmol, 1.0 당량)을 무수 DMF(50 mL)에 용해시키고, 냉수조에서 0℃로 냉각하였다. 트리플루오로아세트산 무수물(trifluoroacetic acid anhydride)(5.3 mL, 38.2 mmol, 4.0 당량)을 교반 용액에 적가하였다. 반응물을 포화 Na2CO3 수용액과 함께 교반한 후 멈추어 침전을 일으켰다. 침전물을 여과하고 수집하여 7 (퀀트(quant).)을 획득하였다. UPLC/MS (ESI): m/z calcd. for C10H5BrClF3NO [M+H]+ = 327.9, found 328.0; 1 H NMR (600 MHz, DMSO-d 6) δ 8.33 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 8.27 (dp, J = 3.9, 2.0 Hz, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.70 (d, J = 1.8 Hz, 1H); 13 C NMR (151 MHz, DMSO-d 6) δ 171.26 (q, CO-CF3), 147.33, 145.16, 129.68, 125.47, 118.14 (q, CO-CF3), 117.85, 115.23, 114.20, 108.97.
5-브로모-6-클로로-1
H
-인돌-3-산 (5-bromo-6-chloro-1
H
-indole-3-acid) (8) (도 17, 스킴 1)
자석 마그네틱바를 갖춘 둥근바닥 플라스크에서, 7 (3.11 g, 9.54 mmol, 1.0 당량)을 3.0N 수성 NaOH(50 mL)에 현탁시키고, 16시간 동안 환류시켰다. 반응 혼합물은 상온에서 냉각된 후, 5.0N 수성 HCl의 사용을 통해 pH 1-2로 산성화되었으며, EtOAc(3 × 50 mL)로 추출되었다. 혼합된 유기층을 염수(50 mL)로 세척하였고, Na2SO4로 건조하였으며, 여과하고 진공에서 농축하여, 갈색 고체로서 중간체 카르복실산 8 (퀀트.)을 획득하였다. UPLC/MS (ESI): m/z calcd. for C10H4BrClNO2 [M-H]- = 273.9, found 273.9.
메틸 5-브로모-6-클로로-1
H
-인돌-3-카르복실레이트 (methyl 5-bromo-6-chloro-1
H
-indole-3-carboxylate) (9) (도 17, 스킴 1)
자석 마그네틱바를 갖춘 플레임-건조된 둥근바닥 플라스크에서, 크루드 8 (2.34 g, 7.71 mmol, 1.0 당량)을 건조 MeOH(50 mL)에서 용해시키고, 발연 황산(1.0 mL)을 적가한 후 12시간 동안 가열 환류시켰다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하여, 적색 고체로서 메틸 에스테르 9 (1.90 g, 86%)를 획득하였다. UPLC/MS (ESI): m/z calcd. for C10H6BrClNO2 [M-H]- = 287.9, found 288.0; 1 H NMR (600 MHz, DMSO-d 6) δ 12.18 (s, 1H), 8.27 (s, 1H), 8.19 (s, 1H), 7.75 (s, 1H), 3.82 (s, 3H); 13 C NMR (151 MHz, DMSO) δ 164.59, 136.31, 135.24, 126.96, 126.48, 125.00, 114.51, 114.37, 106.51, 51.45.
메틸 5-(4-(2-((
tert
-부톡시카르보닐)아미노)에톡시)페닐)-6-클로로-1
H
-인돌-3-카르복실레이트 (methyl 5-(4-(2-((
tert
-butoxycarbonyl)amino)ethoxy)phenyl)-6-chloro-1
H
-indole-3-carboxylate) (10) (도 17, 스킴 1)
N2 대기 하의 자석 마그네틱바를 갖춘 둥근바닥 플라스크에서, 9 (1g, 3.47 mmol, 1.0 당량) 및 5 (1.22 g, 3.47 mmol, 1.0 당량)를 톨루엔(66 mL)에 용해시켰다. K2CO3(3.02 g, 21.85 mmol, 7.0 당량)을 H2O(33 mL)에 용해시키고, 용액을 반응 혼합물에 첨가한 후, 반응 혼합물을 통해 N2를 버블링하여 10분 동안 탈기시켰다. Pd(dppf)Cl2·CH2Cl2 (247 mg, 0.34 mmol, 0.1 당량)을 첨가하였고, 반응물을 3시간 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 진공에서 농축시키고, EtOAc(100 mL)에 재용해시켰으며 Celite® 패드를 통해 여과하였다. CombiFlash에 의한 정제(0-50 구배로 50분 이내 용리함) 결과, 갈색 고체로서 10 (1.33 g, 93%)을 획득하였다. R f = 0.61 (1:1, EtOAc:헵탄); UPLC/MS (ESI): m/z calcd. for C18H18ClN2O3 [M+H-Boc]+ = 345.1, found 345.4; 1 H NMR (600 MHz, 클로로포름-d) δ 9.00 - 8.91 (s, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.53 (s, 1H), 7.43 - 7.37 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.95 (d, J = 8.7, 2H), 5.06 (s, 1H), 4.08 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.57 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 1.47 (s, 9H); 13 C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 165.38, 157.98, 135.75, 134.60, 133.32, 132.18, 131.31, 128.31, 127.94, 124.94, 123.77, 114.89, 113.97, 112.55, 109.15, 77.37, 77.16, 76.95, 67.33, 51.46, 51.34, 28.56, 25.01, 24.74.
5-(4-(2-((
tert
-부톡시카르보닐)아미노)에톡시)페닐)-6-클로로-1
H
-인돌-3-카르복실산 (5-(4-(2-((
tert
-butoxycarbonyl)amino)ethoxy)phenyl)-6-chloro-1
H
-indole-3-carboxylic acid) (11) (도 17, 스킴 1)
자석 마그네틱바를 갖춘 둥근바닥 플라스크에서, 10 (685 mg, 1.54 mmol, 1.0 당량)을 THF:MeOH:H2O(12 mL, 1:1:1)로 구성된 용매계(solvent system)에 용해시키고, NaOH(185 mg, 4.62 mmol, 3.0 당량)를 첨가하여 하룻밤 동안 환류시켰다. 그런 다음, 반응물을 진공에서 농축시킨 뒤, pH = 3-4로 산성화시켰다. 수성층을 EtOAc(3 × 50 mL)로 추출하고, MgSO4로 건조하였으며, 여과하고 진공에서 농축시켰다. CombiFlash에 의한 정제(헵탄 내 50-100% EtOAc 구배로 용리함) 결과, 갈색 고체로서 11 (597 mg, 90%)을 획득하였다. R f = 0.43 (EtOAc); UPLC/MS (ESI): m/z calcd. for C22H22ClN2O5 [M-H]- = 429.1, found 429.3; 1 H NMR (600 MHz, DMSO-d 6) δ 12.09 (s, 1H), 11.91 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 8.07 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.61 (s, 1H), 7.34 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.01 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 4.01 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.33 (t, 6,1 2H), 1.40 (s, 9H); 13 C NMR (151 MHz, DMSO) δ 165.55, 157.63, 155.68, 135.89, 133.75, 132.78, 132.44, 130.74, 125.79, 125.24, 122.68, 114.01, 112.83, 107.56, 77.76, 73.49, 66.41, 28.22.
알릴 5-(4-(2-((
tert
-부톡시카르보닐)아미노)에톡시)페닐)-6-클로로-1
H
-인돌-3-카르복실레이트 (allyl 5-(4-(2-((
tert
-butoxycarbonyl)amino)ethoxy)phenyl)-6-chloro-1
H
-indole-3-carboxylate) (12) (도 17, 스킴 1)
N2 대기 하의 자석 마그네틱바를 갖춘 플레임-건조된 둥근바닥 플라스크에서, 11 (500 mg, 1.16 mmol, 1.0 당량) 및 NaHCO3(157 mg, 1.86 mmol, 1.6 당량)을 건조 DMF(10 mL) 내에서 현탁시킨 후, 실린지를 통해 알릴 브로마이드(151 μL, 1.74 mmol, 1.5 당량)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃로 가열하고 12시간 동안 교반하였다. 반응물을 H2O(20 mL)에 담구어 반응을 멈추고, CH2Cl2(50 mL)와 함께 분별 깔대기로 옮겼다. 유기층을 H2O(5 × 30 mL) 및 염수 (2 × 30 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조시켰으며, 여과하고 진공에서 농축하여, 갈색 고체로서 12 (543 mg, >95 %)를 획득하였다. UPLC/MS (ESI): m/z calcd. for C25H26ClN2O5 [M-H]- = 469.2, found 469.4; 1 H NMR (600 MHz, 클로로포름-d) δ 8.95 - 8.92 (m, 1H), 8.13 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 7.95 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 7.54 (s, 1H), 7.44 - 7.38 (m, 2H), 6.98 - 6.93 (m, 2H), 6.04 (ddt, J = 17.3, 10.9, 5.6 Hz, 1H), 5.39 (dq, J = 17.2, 1.6 Hz, 1H), 5.26 (dq, J = 10.5, 1.4 Hz, 1H), 5.05 (s, 1H), 4.82 (tt, J = 6.8, 1.5 Hz, 2H), 4.08 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 3.57 (q, J = 5.2 Hz, 2H), 1.47 (s, 9H); 13 C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 164.50, 157.97, 156.12, 135.75, 134.64, 133.30, 132.89, 132.24, 131.31, 128.33, 125.06, 123.80, 118.02, 113.97, 112.57, 109.07, 79.73, 77.37, 77.16, 76.95, 67.34, 64.77, 40.35, 28.57.
알릴 5-(4-(2-아미노에톡시)페닐)-6-클로로-1
H
-인돌-3-카르복실레이트 (allyl 5-(4-(2-aminoethoxy)phenyl)-6-chloro-1
H
-indole-3-carboxylate) (13) (도 17, 스킴 1)
자석 마그네틱바를 갖춘 둥근바닥 플라스크에서, 12 (500 mg, 1.06 mmol, 1.0 당량)를 CH2Cl2(25 mL)에 용해시키고, 냉수조를 사용하여 0℃로 냉각한 뒤, CH2Cl2(8 mL)에 50% TFA 첨가물을 적가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반한 후 진공에서 농축시켰다. 오일은 여러 라운드(multiple rounds)의 에테르로 공동-증발(co-evaporate)되어, 갈색 고체로서 13 (385 mg, >95%)를 획득하였다. UPLC/MS (ESI): m/z calcd. for C20H20ClN2O3 [M+H]+ = 371.1, found 371.4; 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 12.13 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 8.20 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 8.03 (s, 3H), 7.95 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.66 (s, 1H), 7.46 - 7.32 (m, 2H), 7.20 - 7.01 (m, 2H), 6.03 (ddt, J = 17.2, 10.5, 5.3 Hz, 1H), 5.38 (dq, J = 17.2, 1.7 Hz, 1H), 5.23 (dq, J = 10.5, 1.5 Hz, 1H), 4.76 (dt, J = 5.3, 1.6 Hz, 2H), 4.23 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 3.27 (h, J = 4.7 Hz, 2H); 13 C NMR (101 MHz, DMSO) δ 162.28, 157.10, 135.96, 133.27, 133.00, 132.98, 130.83, 126.05, 124.91, 122.43, 117.28, 114.23, 113.10, 106.33, 64.42, 63.64, 38.43.
4-((2-(4-(3-((알릴옥시)카르보닐)-6-클로로-1
H
-인돌-5-일)페녹시)에틸)아미노)-4-옥소부탄산 (4-((2-(4-(3-((allyloxy)carbonyl)-6-chloro-1
H
-indol-5-yl)phenoxy)ethyl)amino)-4-oxobutanoic acid) (14a) (도 17, 스킴 1)
N2-대기 하의 자석 마그네틱바를 갖춘 플레임-건조된 플라스크에서, 13 (75 mg, 0.20 mmol, 1.0 당량) 및 건조 Et3N(83 μL, 0.60 mmol, 3.0 당량)을 건조 CH2Cl2(5 mL)에 용해시킨 후, 실린지를 통해 메틸 숙시닐 클로라이드(methyl succinyl chloride)(75 μL, 0.4 mmol, 2.0 당량)를 첨가하였다. 반응물을 2시간 동안 교반한 뒤, 증발 건조시켰다(이중으로 아실화된 중간체를 형성함). 크루드 반응 혼합물을 THF와 H2O(1:1, 4 mL)의 혼합물에 재용해시키고, NaOH(30 mg, 0.7 mmol, 3.5 당량)를 첨가하여 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하고, 실리카 상에 흡착시켰으며, 플래시 크로마토그래피(EtOAc + 1% AcOH)를 통해 정제하여, 백색 고체로서 14a (43 mg, 45%)를 획득하였다. R f = 0.11 (EtOAc + 1% AcOH); UPLC/MS (ESI): m/z calcd. for C24H22ClN2O6 [M-H]- = 469.9, found 469.4; 1 H NMR (600 MHz, DMSO-d 6) δ 12.09 (s, 1H), 8.19 (s, 1H), 8.15 (q, J = 5.6, 4.7 Hz, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.36 - 7.33 (m, 2H), 7.07 - 7.00 (m, 2H), 6.03 (ddt, J = 17.3, 10.5, 5.3 Hz, 1H), 5.38 (dq, J = 17.2, 1.7 Hz, 1H), 5.23 (dq, J = 10.5, 1.5 Hz, 1H), 4.76 (dt, J = 5.3, 1.6 Hz, 2H), 4.04 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.45 (q, J = 5.6 Hz, 2H), 2.44 (dd, J = 7.3, 6.1 Hz, 2H), 2.36 (t, J = 6.7 Hz, 2H); 13 C NMR (151 MHz, DMSO) δ 173.84, 171.34, 163.58, 157.67, 135.90, 134.19, 133.27, 133.13, 132.39, 130.74, 126.11, 124.87, 122.45, 117.31, 114.07, 113.05, 106.37, 66.38, 63.66, 38.30, 29.93, 29.13.
6-((2-(4-(3-((알릴옥시)카르보닐)-6-클로로-1
H
-인돌-5-일)페녹시)에틸)아미노)-6-옥소헥산산 (6-((2-(4-(3-((allyloxy)carbonyl)-6-chloro-1
H
-indol-5-yl)phenoxy)ethyl)amino)-6-oxohexanoic acid) (14b) (도 17, 스킴 1)
N2-대기 하의 자석 마그네틱바를 갖춘 플레임-건조된 플라스크에서, 13 (75 mg, 0.20 mmol, 1.0 당량) 및 건조 Et3N(83 μL, 0.60 mmol, 3.0 당량)을 건조 CH2Cl2(5 mL)에 용해시킨 후, 실린지를 통해 메틸 아디포일 클로라이드(methyl adipoyl chloride)(67 μL, 0.4 mmol, 2.0 당량)를 첨가하였다. 반응물을 2시간 동안 교반한 뒤, 증발 건조시켰다(이중으로 아실화된 생성물을 형성함). 크루드 반응 혼합물을 THF와 H2O(1:1, 4 mL)의 혼합물에 재용해시키고, NaOH (30 mg, 0.7 mmol, 3.5 당량)를 첨가하여 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하고, 실리카 상에 흡착시켰으며, 플래시 크로마토그래피(39:1 EtOAc:MeOH + 1% AcOH)를 통해 정제하여, 백색 고체로서 14b (40.3 mg, 40%)를 획득하였다. R f = 0.23 (39:1 EtOAc:MeOH + 1% AcOH); UPLC/MS (ESI): m/z calcd. for C26H26ClN2O6 [M-H]- = 398.0, found 397.4; 1 H NMR (600 MHz, DMSO-d 6) δ 12.08 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 11.98 (s, 1H), 8.19 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 8.07 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.37 - 7.32 (m, 2H), 7.05 - 7.00 (m, 2H), 6.03 (ddt, J = 17.2, 10.5, 5.3 Hz, 1H), 5.38 (dq, J = 17.3, 1.7 Hz, 1H), 5.23 (dq, J = 10.5, 1.5 Hz, 1H), 4.76 (dt, J = 5.3, 1.6 Hz, 2H), 4.04 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.45 (q, J = 5.6 Hz, 2H), 2.20 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.11 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 1.56 - 1.43 (m, 4H); 13 C NMR (151 MHz, DMSO) δ 174.35, 172.25, 163.58, 157.67, 135.89, 134.19, 133.27, 133.13, 132.37, 130.73, 126.10, 124.86, 122.44, 117.31, 114.06, 113.04, 106.37, 66.36, 63.65, 38.18, 34.96, 33.40, 24.76, 24.12.
8-((2-(4-(3-((알릴옥시)카르보닐)-6-클로로-1
H
-인돌-5-일)페녹시)에틸)아미노)-8-옥소옥탄산 (8-((2-(4-(3-((allyloxy)carbonyl)-6-chloro-1
H
-indol-5-yl)phenoxy)ethyl)amino)-8-oxooctanoic acid) (14c) (도 17, 스킴 1)
N2-대기 하의 자석 마그네틱바를 갖춘 플레임-건조된 플라스크에서, 13 (75 mg, 0.20 mmol, 1.0 당량) 및 건조 Et3N(83 μL, 0.60 mmol, 3.0당량)을 건조 CH2Cl2(5 mL)에 용해시킨 후, 실린지를 통해 메틸 옥타노에이트 클로라이드(methyl octanoate chloride)(121 μL, 0.4 mmol, 2.0 당량)를 첨가하였다. 반응물을 2시간 동안 교반한 뒤, 증발 건조시켰다(이중으로 아실화된 중간체를 형성함). 크루드 반응 혼합물을 THF와 H2O(1:1, 4 mL)의 혼합물에 재용해시키고, NaOH(30 mg, 0.7 mmol, 3.5 당량)를 첨가하여 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하고, 실리카 상에 흡착시켰으며, 플래시 크로마토그래피(EtOAc + 1% AcOH)를 통해 정제하여, 백색 고체로서 14c (43 mg, 45%)를 획득하였다. R f = 0.31 (EtOAc + 1% AcOH); UPLC/MS (ESI): m/z calcd. for C28H30ClN2O6 [M-H]- = 525.2, found 525.5; 1 H NMR (600 MHz, DMSO-d 6) δ 12.49 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 8.14 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.52 - 7.25 (m, 2H), 7.25 - 6.94 (m, 2H), 6.02 (ddt, J = 17.3, 10.5, 5.3 Hz, 1H), 5.37 (dq, J = 17.2, 1.7 Hz, 1H), 5.23 (dq, J = 10.5, 1.5 Hz, 1H), 4.75 (dt, J = 5.3, 1.6 Hz, 2H), 4.03 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 3.43 (q, J = 5.7 Hz, 2H), 2.08 (dt, J = 17.5, 7.4 Hz, 4H), 1.53 - 1.39 (m, 2H), 1.24 (m, 4H); 13 C NMR (151 MHz, DMSO) δ 175.64, 172.52, 163.61, 157.66, 135.98, 134.10, 133.28, 133.05, 132.39, 130.74, 125.98, 124.86, 122.39, 117.28, 114.04, 113.15, 106.22, 66.32, 63.62, 38.14, 35.27, 28.60, 28.49, 25.19, 25.11.
알릴 6-클로로-5-(4-(2-(10-메톡시-10-옥소데칸아미도)에톡시)페닐)-1-(10-메톡시-10-옥소데카노일)-1
H
-인돌-3-카르복실레이트 (allyl 6-chloro-5-(4-(2-(10-methoxy-10-oxodecanamido)ethoxy)phenyl)-1-(10-methoxy-10-oxodecanoyl)-1
H
-indole-3-carboxylate) (14d') (도 17, 스킴 1)
N2-대기 하의 자석 마그네틱바를 갖춘 플레임-건조된 둥근바닥 플라스크에서, 13 (75 mg, 0.20 mmol, 1.0 당량), HBTU(118 mg, 0.30 mmol, 1.5 당량), 모노메틸 세바스산염(monomethyl sebacate)(70 mg, 0.3 mmol, 1.5 당량)을 건조 DMF(5 mL)에 현탁시킨 후, 건조 Et3N(83 μL, 0.6 mmol, 3.0 당량)을 첨가하였다. 반응물을 4시간 동안 교반하였다. 그런 다음, 반응 혼합물을 EtOAc(50 mL)와 함께 분별 깔대기로 옮겼다. 유기층을 포화 NaHCO3 수용액(3 × 50 mL)과 염수(50 mL)로 세척하였고, MgSO4로 건조하였으며, 여과하고 진공에서 농축시켰다. 실리카 상에서 크루드 잔여물을 증발시켰으며, 플래시 크로마토그래피(1:1 EtOAc:헵탄 + 1% AcOH)를 통해 정제하여, 백색 고체로서 이중으로 아실화된 중간체인 14d' (90 mg, 54%)를 획득하였다. R f = 0.15 (1:1 EtOAc:헵탄 + 1% AcOH); 1 H NMR (600 MHz, 클로로포름-d) δ 8.64 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.43 - 7.39 (m, 2H), 7.02 - 6.77 (m, 2H), 6.10 - 5.98 (m, 1H), 5.96 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 5.41 (dq, J = 17.2, 1.5 Hz, 1H), 5.30 (dq, J = 10.4, 1.3 Hz, 1H), 4.85 (dt, J = 5.8, 1.4 Hz, 2H), 4.11 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 3.71 (q, J = 5.3 Hz, 2H), 3.67 (s, 3H), 3.65 (s, 3H), 2.97 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.30 (dt, J = 17.0, 7.5 Hz, 4H), 2.22 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.86 (p, J = 7.4 Hz, 2H), 1.62 (dq, J = 20.4, 7.2 Hz, 4H), 1.52 - 1.43 (m, 2H), 1.42 - 1.25 (m, 16H); 13 C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 174.44, 174.40, 171.58, 163.43, 158.12, 137.16, 135.38, 132.82, 132.29, 131.43, 131.22, 131.00, 126.32, 123.57, 118.83, 117.90, 114.07, 113.59, 67.05, 65.48, 51.61, 51.58, 39.13, 36.85, 35.70, 34.22, 34.20, 29.32, 29.27, 29.24, 29.19, 29.13, 25.79, 25.03, 24.47.
10-((2-(4-(3-((알릴옥시)카르보닐)-6-클로로-1
H
-인돌-5-일)페녹시)에틸)아미노)-10-옥소데칸산 (10-((2-(4-(3-((allyloxy)carbonyl)-6-chloro-1
H
-indol-5-yl)phenoxy)ethyl)amino)-10-oxodecanoic acid) (14d) (도 17, 스킴 1)
자석 마그네틱바를 갖춘 둥근바닥 플라스크에서, 14d' (90 mg, 0.13 mmol, 1.0 당량)을 THF와 H2O(6 mL, 1:1)로 구성된 용매계에 용해시킨 후, NaOH(17.6 mg, 0.46 mmol, 3.5 당량)를 첨가하였다. 반응물을 6시간 동안 교반한 뒤, 진공에서 농축시켰다. 실리카 상에서 크루드 잔여물을 증발시켰으며, 플래시 크로마토그래피(EtOAc + 1% AcOH)를 통해 정제하여, 백색 고체로서 14d (36 mg, 52%)를 획득하였다. R f = 0.19 (EtOAc + 1% AcOH); UPLC/MS (ESI): m/z calcd. for C30H34ClN2O6 [M-H]- = 553.2, found 553.5; 1 H NMR (600 MHz, DMSO-d 6) δ 12.09 (s, 1H), 8.19 (s, 1H), 8.04 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.34 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.04 - 6.96 (m, 2H), 6.03 (ddt, J = 17.3, 10.5, 5.3 Hz, 1H), 5.38 (dq, J = 17.2, 1.7 Hz, 1H), 5.23 (dq, J = 10.5, 1.5 Hz, 1H), 4.76 (dt, J = 5.3, 1.6 Hz, 2H), 4.04 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.44 (q, J = 5.6 Hz, 2H), 2.16 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.09 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.52 - 1.40 (m, 4H), 1.23 (m, 8H); 13 C NMR (151 MHz, DMSO) δ 174.50, 172.47, 163.57, 157.70, 135.90, 134.19, 133.27, 133.12, 132.36, 130.73, 126.09, 124.86, 122.44, 117.29, 114.04, 113.05, 106.36, 66.37, 63.65, 38.19, 35.28, 33.75, 28.64, 28.62, 28.58, 28.53, 25.22, 24.50.
20-((2-(4-(3-((알릴옥시)카르보닐)-6-클로로-1H-인돌-5-일)페녹시)에틸)아미노)-20-옥소이코산산 (20-((2-(4-(3-((allyloxy)carbonyl)-6-chloro-1H-indol-5-yl)phenoxy)ethyl)amino)-20-oxoicosanoic acid) (14e) (도 17, 스킴 1)
N2 대기 하의 자석 마그네틱바를 갖춘 플레임-건조된 둥근바닥 플라스크에서, 13 (75 mg, 0.20 mmol, 1.0 당량), 옥타데칸디오산 모노-tert-부틸 에스테르(Octadecanedioic acid mono-tert-butyl ester)(121 mg, 0.30 mmol, 1.5 당량), 및 HBTU(115 mg, 0.30 mmol, 1.5 당량)를 건조 DMF(5 mL)에 현탁시킨 후, 건조 Et3N(83 μL, 0.60 mmol, 3.0 당량)을 첨가하였다. 반응물을 2시간 동안 교반한 뒤, H2Cl2(25 mL)로 희석하고, 유기층을 NaHCO3로 세척하였으며, MgSO4로 건조시킨 후, 여과하고 진공에서 농축하였다. 크루드 중간체를 CH2Cl2(10 mL)에 재용해시키고, 냉수조를 사용하여 0℃로 냉각한 뒤, CH2Cl2(4 mL)에서 50% TFA 처리하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반한 후 진공에서 농축시켰다. 플래시 크로마토그래피(1:1 EtOAc:헵탄 + 1% AcOH)를 통해 정제하여, 백색 고체로서 14e (44.5 mg, 32%)를 획득하였다. R f = 0.28 (1:1 EtOAc:Heptanes + 1% AcOH); UPLC/MS (ESI): m/z calcd. for C38H51ClN2O5 [M+H]+ = 667.3, found 667.1; 1 H NMR (600 MHz, DMSO-d 6) δ 12.07 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 11.97 - 11.90 (m, 1H), 8.19 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 8.04 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.37 - 7.31 (m, 2H), 7.06 - 6.99 (m, 2H), 6.09 - 5.97 (m, 1H), 5.38 (dq, J = 17.2, 1.6 Hz, 1H), 5.23 (dddq, J = 10.4, 5.9, 4.4, 1.5 Hz, 1H), 4.76 (dt, J = 5.3, 1.6 Hz, 2H), 4.04 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.44 (q, J = 5.6 Hz, 2H), 2.16 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 2.09 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.54 - 1.41 (m, 6H), 1.30 - 1.15 (m, 26H); 13 C NMR (151 MHz, DMSO) δ 174.45, 172.48, 163.56, 157.72, 135.89, 133.26, 130.71, 126.08, 124.88, 122.46, 117.27, 114.02, 113.03, 106.38, 66.40, 63.64, 48.62, 38.20, 35.29, 33.64, 29.02, 29.00, 28.96, 28.94, 28.87, 28.79, 28.70, 28.57, 28.52, 25.25, 24.46.
N
,
N
-디메틸피리딘-4-아미늄 5-브로모-1-(
tert
-부톡시카르보닐)-6-클로로-1
H
-인돌-3-카르복실레이트 (
N
,
N
-dimethylpyridin-4-aminium 5-bromo-1-(
tert
-butoxycarbonyl)-6-chloro-1
H
-indole-3-carboxylate) (15) (도 18, 스킴 2)
N2-기밀(protection) 하의 자석 마그네틱바를 갖춘 플레임-건조된 둥근바닥 플라스크에서, 7 (3.71 g, 16.05 mmol, 1.0 당량) 및 N,N-디메틸 아미노피리딘(N,N-dimethyl aminopyridine)(0.98 g, 8.03 mmol, 0.5 mmol)을 건조 CH2Cl2 (100 mL)에 현탁시킨 후, tert-부틸 디카보네이트 (3.85 g, 17.67 mmol, 1.1 당량)를 일부 첨가하고 생성된 혼합물을 6시간 동안 교반하였다. 반응물을 물에 담구어 반응을 멈추고 EtOAc(200 mL)로 추출하였다. 혼합된 유기층을 H2O(3 × 100 mL) 및 염수(100 mL)로 세척하였고, MgSO4로 건조하였으며, 여과하고 진공에서 농축시켰다. 크루드 고체를 EtOAc로부터 재결정화하여, DMAP 염으로서 15 (2.51 g, 64%)를 획득하였다. UPLC/MS (ESI): m/z calcd. for C14H12BrClNO4 [M-H]- = 374.0, found 374.2; 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.39 (s, 1H), 8.23 (s, 1H), 8.17 - 8.12 (m, 2H), 8.12 (s, 1H), 6.69 - 6.64 (m, 2H), 2.99 (s, 6H), 1.64 (s, 9H); 13 C NMR (101 MHz, DMSO) δ 164.67, 154.56, 147.95, 147.08, 134.34, 132.49, 128.96, 128.19, 125.67, 116.27, 116.24, 113.40, 106.70, 85.79, 27.44.
1-(
tert
-부틸) 3-(4-메톡시벤질) 5-브로모-6-클로로-1
H
-인돌-1,3-디카르복실레이트 (1-(
tert
-butyl) 3-(4-methoxybenzyl) 5-bromo-6-chloro-1
H
-indole-1,3-dicarboxylate) (16) (도 18, 스킴 2)
N2 대기 하의 자석 마그네틱바를 갖춘 플레임-건조된 둥근바닥 플라스크에서, 15 (2.50 g, 5.04 mmol, 1.0 당량), p-메톡시벤질 염화물(p-methoxybenzyl chloride)(1.03 mL, 7.56 mmol, 1.5 당량), 및 무수 K2CO3(1.39 g, 10.08 mmol, 2.0 당량)을 건조 DMF(20 mL)에 현탁시켰다. 반응물을 50℃로 가열하고 3시간 동안 교반하였다. 그런 다음, 반응물을 CH2Cl2(200 mL)와 함께 분리기로 옮겼다. 유기층을 H2O(5 × 100 mL) 및 염수(2 × 100 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조시켰으며, 여과하고 진공에서 농축시켰다. CombiFlash에 의한 정제(45분에 걸쳐 헵탄에서 10% EtOAc 로 용리함) 결과, 흰색 고체로서 16 (2.49 g, >95%)을 획득하였다. R f = 0.35; UPLC/MS (ESI): m/z calcd. for C22H20BrClNO5 [M-H]- = 494.0, found 494.2; 1 H NMR (600 MHz, 클로로포름-d) δ 8.42 (s, 1H), 8.33 (s, 1H), 8.21 (s, 1H), 7.44 - 7.38 (m, 2H), 6.96 - 6.86 (m, 2H), 5.33 (s, 2H), 3.82 (s, 3H), 1.67 (s, 9H); 13 C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 163.49, 159.92, 148.46, 134.92, 133.26, 131.24, 130.41, 130.37, 129.56, 128.18, 127.62, 126.29, 118.13, 117.05, 114.21, 113.95, 111.62, 86.25, 66.38, 55.47, 28.18.
메틸 4-(4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페녹시)부타노에이트 (methyl 4-(4-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)phenoxy)butanoate) (18) (도 18, 스킴 2)
N2-대기 하의 자석 마그네틱바를 갖춘 플레임-건조된 둥근바닥 플라스크에서, 메틸 4-브로모부타노에이트(methyl 4-bromobutanoate)(1.8 mL, 13.63 mmol, 1.2 당량), 4-하이드록시페닐보론산 피나콜 에스테르(4-Hydroxyphenylboronic acid pinacol ester)(2.50 g, 11.36 mmol, 1.0 당량), 및 오븐 건조된 K2CO3(5.65 g, 40.89 mmol, 3.0 당량)를 건조 DMF(40 mL)에서 50℃로 하룻밤 동안 현탁시켰다. 그런 다음, 반응 혼합물에 물을 첨가하였고, 수성층을 EtOAc(3×100 mL)로 추출하였다. 혼합된 유기층을 H2O(3 × 100 mL) 및 염수(100 mL)로 세척하였고, MgSO4로 건조하였으며, 여과하고 진공에서 농축시켰다. CombiFlash에 의한 정제(50분에 걸쳐 헵탄에서 20% EtOAc 구배로 용리함) 결과, 투명한 오일로서 18 (3.21 g, 88%)을 획득하였다. R f = 0.21 (1:4, EtOAc:헵탄); 1 H NMR (600 MHz, 클로로포름-d) δ 7.88 - 7.55 (m, 2H), 6.99 - 6.73 (m, 2H), 4.03 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 3.68 (s, 3H), 2.53 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.14 - 2.08 (m, 2H), 1.33 (s, 12H); 13 C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 173.77, 161.54, 136.66, 113.97, 83.69, 66.61, 51.77, 30.67, 25.00, 24.74.
1-(
tert
-부틸) 3-(4-메톡시벤질) 6-클로로-5-(4-(4-메톡시-4-옥소부톡시)페닐)-1
H
-인돌-1,3-디카르복실레이트 (1-(
tert
-butyl) 3-(4-methoxybenzyl) 6-chloro-5-(4-(4-methoxy-4-oxobutoxy)phenyl)-1
H
-indole-1,3-dicarboxylate) (19) (도 18, 스킴 2)
N2 대기 하의 자석 마그네틱바를 갖춘 둥근바닥 플라스크에서, 16 (804 mg, 1.56 mmol, 1.0 당량) 및 18 (500 mg, 1.56 mmol, 1.0 당량)을 톨루엔(30 mL)에 용해시켰다. K2CO3(1.51 g, 10.93 mmol, 7.0 당량)을 H2O(15 mL)에 용해 시키고, 용액을 반응 혼합물에 첨가한 후, 반응 혼합물을 통해 N2를 버블링하여 10분 동안 탈기시켰다. Pd(dppf)Cl2·CH2Cl2(128 mg, 0.16 mmol, 0.1 당량)을 첨가하였고, 반응물을 3시간 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 진공에서 농축시키고, EtOAc(100 mL)에 재용해시켰으며, Celite® 패드를 통해 여과하였다. 여과액을 EtOAc(100 mL)와 함께 분별 깔대기로 옮겼다. 혼합된 유기층을 H2O(3 × 100 mL) 및 염수(100 mL)로 세척하였으며, 여과하고 진공에서 농축시켰다. CombiFlash에 의한 정제(50분에 걸쳐 헵탄에서 20% EtOAc 구배로 용리함) 결과, 백색 고체로서 19 (907 mg, >95%)를 획득하였다. R f = 0.21 (1:4, EtOAc:헵탄); UPLC/MS (ESI): m/z calcd. for C33H36ClNO8 [M+H]+ = 608.2, found 607.6; 1 H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 8.30 (s, 1H), 8.24 (s, 1H), 8.11 (s, 1H), 7.45 - 7.33 (m, 4H), 6.98 - 6.92 (m, 2H), 6.90 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 5.31 (s, 2H), 4.07 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 3.81 (s, 3H), 3.71 (s, 3H), 2.57 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.22 - 2.10 (m, 2H), 1.69 (s, 9H); 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 173.83, 163.84, 159.82, 158.42, 148.77, 136.51, 134.90, 132.82, 132.39, 131.12, 130.26, 128.38, 126.67, 123.89, 116.54, 114.15, 114.05, 112.37, 85.84, 66.85, 66.17, 55.45, 51.80, 30.75, 28.22, 24.85.
4-(4-(1-(
tert
-부톡시카르보닐)-6-클로로-3-(((4-메톡시벤질)옥시)카르보닐)-1
H
-인돌-5-일)페녹시)부탄산 (4-(4-(1-(
tert
-butoxycarbonyl)-6-chloro-3-(((4-methoxybenzyl)oxy)carbonyl)-1
H
-indol-5-yl)phenoxy)butanoic acid) (20) (Fig. 18, Scheme 2)
자석 마그네틱바를 갖춘 둥근바닥 플라스크에서, 메틸 에스테르 19 (300 mg, 0.49 mmol, 1.0 당량)를 H2O:THF(1:1) 혼합물에 용해시키고, NaOH(22 mg, 0.54 mmol, 1.1 당량)를 첨가하여 6시간 동안 교반하였다. 반응이 완료되면(UPLC-MS에 의해 관찰됨), 반응물을 진공에서 농축시키고, EtOAc(50 mL)에서 재용해시켰으며, 0.05N 수성 HCl(1 × 20 mL)로 세척하였고, MgSO4로 건조시켰으며, 여과하고, 진공에서 농축시켰다. 실리카 겔 플래시 크로마토그래피 (헵탄 내 50% EtOAc로부터 EtOAc까지의 구배로 용리함)를 통해 정제하여, 백색 고체로서 20 (139 mg, 47%)를 획득하였다. UPLC/MS (ESI): m/z calcd. for C32H33ClNO8 [M+H]+ = 594.2, found 593.6; 1 H NMR (600 MHz, DMSO-d 6) δ 12.16 (s, 1H), 8.26 (s, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.97 (s, 1H), 7.44 - 7.39 (m, 2H), 7.38 - 7.32 (m, 2H), 7.05 - 7.00 (m, 2H), 6.97 - 6.91 (m, 2H), 5.29 (s, 2H), 4.05 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.75 (s, 3H), 3.74 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 2.42 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.99 (h, J = 6.9, 6.5 Hz, 2H), 1.65 (s, 9H); 13 C NMR (151 MHz, DMSO) δ 174.07, 162.72, 159.21, 158.08, 147.97, 135.65, 134.14, 132.95, 131.12, 130.62, 130.02, 128.73, 127.98, 126.12, 123.13, 115.91, 114.13, 113.89, 111.14, 86.06, 66.65, 65.61, 55.09, 30.13, 27.45, 24.25.
글루카곤 유사체; C-말단 리신 동족체(homolog) (21) (도 19, 스킴 3 및 스킴 4)
레진-결합 펩타이드(SEQ ID NO:3)는, 자동화된 펩타이드 합성을 위한 일반적인 절차에 따라 ChemMatrix® Rinkamide 레진(0.50 mmol/g)에서 0.05 mmol 규모로 합성되었다. 별표로 표시된 이중 커플링 및 삼중 커플링으로 커플링 반응을 수행하였다. 지속적인 합성을 위해 C_말단 리신에 직교 탈보호(orthogonal deprotection)를 허용하기 위한 Mtt 보호기가 도입되었다. 분석에서 대조군으로 사용하기 위해 절단 칵테일(cleavage cocktail) A를 사용하여 펩타이드 중 일부를 절단하였다. 분취용 HPLC(C18, 10-60% B 50분 동안)에 의한 정제로, 동결건조 후 백색 분말로서 글루카곤 유사체 21을 획득하였다(16.6 mg, 5.3%). 분석용 HPLC 순도: >95% (λ=214 nm). LCMS m/z: [M+4H]4+ Calcd. for C193H288N56O61S4+ 1101.1; found 1101.2.
변형된 글루카곤 및 AMPK 활성화제 공액체; PEG-링커: 1 유닛 (22a) (도 19, 스킴 3).
레진-결합 펩타이드 21 (SEQ ID NO:3)은, Fmoc-Lys(Mmt)-OH가 위치 40의 리신에 사용되었고 Boc-His(Trt)-OH가 위치 1의 히스티딘에 사용되었음을 제외하면, 자동화된 펩타이드 합성을 위한 일반적인 절차에 따라 ChemMatrix® Rinkamide 레진(0.50 mmol/g)에서 0.05 mmol 규모로 합성되었다. 별표로 표시된 이중 커플링 및 삼중 커플링으로 커플링 반응을 수행하였다. 레진 상의 Mmt 탈보호는 Mmt 탈보호를 위한 일반적인 절차를 통해 달성되었다. 수동 HBTU 커플링을 위한 일반적인 절차를 사용하여 Fmoc-amino-EG-CH2CH2COOH를 유리된 아민에 커플링시킨 후, 수동 Fmoc 탈보호를 위한 표준적인 절차를 사용하여 Fmoc 탈보호를 수행하였다. 마지막으로, 20은 HBTU 커플링에 대한 표준적인 절차를 사용하여 이중 결합되었다. 절단 칵테인 A를 사용하여 공액체를 절단하였다. 분취용 HPLC(C18, 10-60% B 50분 동안)에 의한 정제로, 동결건조 후 백색 분말로서 아실화된 GLP-1 동족체 22를 획득하였다(5.1 mg, 3.4%). 분석용 HPLC 순도: >95% (λ=214 nm). LCMS m/z: [M+4H]4+ Calcd. for C217H315ClN58O67S4+ 1218.8; found 1218.8.
변형된 글루카곤 및 AMPK 활성화제 공액체. PEG-링커: 2 유닛 (22b) (도 19, 스킴 3).
레진-결합 펩타이드 21 (SEQ ID NO:3)은, Fmoc-Lys(Mmt)-OH가 위치 40의 리신에 사용되었고 Boc-His(Trt)-OH가 위치 1의 히스티딘에 사용되었음을 제외하면, 자동화된 펩타이드 합성을 위한 일반적인 절차에 따라 ChemMatrix® Rinkamide 레진(0.50 mmol/g)에서 0.05 mmol 규모로 합성되었다. 별표로 표시된 이중 커플링 및 삼중 커플링으로 커플링 반응을 수행하였다. 레진 상의 Mmt 탈보호는 Mmt 탈보호를 위한 일반적인 절차를 통해 달성되었다. 수동 HBTU 커플링을 위한 일반적인 절차를 사용하여 Fmoc-amino-PEG2-CH2CH2COOH를 유리된 아민에 커플링시킨 후, 수동 Fmoc 탈보호를 위한 표준적인 절차를 사용하여 Fmoc 탈보호를 수행하였다. 마지막으로, 20은 HBTU 커플링에 대한 표준적인 절차를 사용하여 이중 결합되었다. 절단 칵테인 A를 사용하여 공액체를 절단하였다. 분취용 HPLC(C18, 10-60% B 50분 동안)에 의한 정제로, 동결건조 후 백색 분말로서 아실화된 GLP-1 동족체 22를 획득하였다(6.9 mg, 4.3%). 분석용 HPLC 순도: 98% (λ=214 nm). LCMS m/z: [M+4H]4+ Calcd. for C219H319ClN58O68S4+ 1229.6; found 1229.7.
변형된 글루카곤 및 AMPK 활성화제 공액체. PEG-링커: 3 유닛 (22c) (도 19, 스킴 3).
레진-결합 펩타이드 21 (SEQ ID NO:3)은, Fmoc-Lys(Mmt)-OH가 위치 40의 리신에 사용되었고 Boc-His(Trt)-OH가 위치 1의 히스티딘에 사용되었음을 제외하면, 자동화된 펩타이드 합성을 위한 일반적인 절차에 따라 ChemMatrix® Rinkamide 레진(0.50 mmol/g)에서 0.05 mmol 규모로 합성되었다. 별표로 표시된 이중 커플링 및 삼중 커플링으로 커플링 반응을 수행하였다. 레진 상의 Mmt 탈보호는 Mmt 탈보호를 위한 일반적인 절차를 통해 달성되었다. 수동 HBTU 커플링을 위한 일반적인 절차를 사용하여 Fmoc-amino-PEG3-CH2COOH를 유리된 아민에 커플링시킨 후, 수동 Fmoc 탈보호를 위한 표준적인 절차를 사용하여 Fmoc 탈보호를 수행하였다. 마지막으로, 20은 HBTU 커플링에 대한 표준적인 절차를 사용하여 이중 결합되었다. 절단 칵테인 A를 사용하여 공액체를 절단하였다. 분취용 HPLC(C18, 10-60% B 50분 동안)에 의한 정제로, 동결건조 후 백색 분말로서 아실화된 GLP-1 동족체 22를 획득하였다(1.8 mg, 1.5%). 분석용 HPLC 순도: >95% (λ=214 nm). LCMS m/z: [M+4H]4+ Calcd. for C220H320ClN58O69S4+ 1237.1; found 1237.2.
변형된 글루카곤 및 AMPK 활성화제 공액체. PEG-링커: 4 유닛 (22d) (도 19, 스킴 3).
레진-결합 펩타이드 21 (SEQ ID NO:3)은, Fmoc-Lys(Mmt)-OH가 위치 40의 리신에 사용되었고 Boc-His(Trt)-OH가 위치 1의 히스티딘에 사용되었음을 제외하면, 자동화된 펩타이드 합성을 위한 일반적인 절차에 따라 ChemMatrix® Rinkamide 레진(0.50 mmol/g)에서 0.05 mmol 규모로 합성되었다. 별표로 표시된 이중 커플링 및 삼중 커플링으로 커플링 반응을 수행하였다. 레진 상의 Mmt 탈보호는 Mmt 탈보호를 위한 일반적인 절차를 통해 달성되었다. 수동 HBTU 커플링을 위한 일반적인 절차를 사용하여 Fmoc-PEG4-CH2COOH를 유리된 아민에 커플링시킨 후, 수동 Fmoc 탈보호를 위한 표준적인 절차를 사용하여 Fmoc 탈보호를 수행하였다. 마지막으로, 20은 HBTU 커플링에 대한 표준적인 절차를 사용하여 이중 결합되었다. 절단 칵테인 A를 사용하여 공액체를 절단하였다. 분취용 HPLC(C18, 10-60% B 50분 동안)에 의한 정제로, 동결건조 후 백색 분말로서 아실화된 GLP-1 동족체 22를 획득하였다(3.7 mg, 2.6%). 분석용 HPLC 순도: >95% (λ=214 nm). LCMS m/z: [M+4H]4+ Calcd. for C222H325ClN58O70S4+ 1248.1; found 1248.2.
변형된 글루카곤 및 AMPK 활성화제 공액체. C4 링커 (23a) (도 19, 스킴 4).
레진-결합 펩타이드 21 (SEQ ID NO:3)은, Fmoc-Lys(Mmt)-OH가 위치 40의 리신에 사용되었고 Boc-His(Trt)-OH가 위치 1의 히스티딘에 사용되었음을 제외하면, 자동화된 펩타이드 합성을 위한 일반적인 절차에 따라 ChemMatrix® Rinkamide 레진(0.50 mmol/g)에서 0.05 mmol 규모로 합성되었다. 별표로 표시된 이중 커플링 및 삼중 커플링으로 커플링 반응을 수행하였다. 레진 상의 Mmt 탈보호는 Mmt 탈보호를 위한 일반적인 절차를 통해 달성되었다. PyBOP 커플링을 위한 일반적인 절차를 사용하여 화합물 14a를 유리된 아민에 커플링시켰다. 알릴 탈보호를 위한 일반적인 절차를 사용하여 알릴 에스테르를 탈보호하고, 절단 칵테일 A를 사용하여 공액체를 레진 공액체로부터 유리시켰다. 분취용 HPLC(C18, 10-60% B 50분 동안)에 의한 정제로, 동결건조 후 백색 분말로서 아실화된 GLP-1 동족체 23a를 획득하였다(9.1 mg, 6.9%). 분석용 HPLC 순도: >95% (λ=214 nm). LCMS m/z: [M+4H]4+ Calcd. for C214H309ClN58O66S4+ 1204.2; found 1202.0.
변형된 글루카곤 및 AMPK 활성화제 공액체. C6 링커 (23b) (도 19, 스킴 4).
레진-결합 펩타이드 21 (SEQ ID NO:3)은, Fmoc-Lys(Mmt)-OH가 위치 40의 리신에 사용되었고 Boc-His(Trt)-OH가 위치 1의 히스티딘에 사용되었음을 제외하면, 자동화된 펩타이드 합성을 위한 일반적인 절차에 따라 ChemMatrix® Rinkamide 레진(0.50 mmol/g)에서 0.05 mmol 규모로 합성되었다. 별표로 표시된 이중 커플링 및 삼중 커플링으로 커플링 반응을 수행하였다. 레진 상의 Mmt 탈보호는 Mmt 탈보호를 위한 일반적인 절차를 통해 달성되었다. PyBOP 커플링을 위한 일반적인 절차를 사용하여 화합물 14b를 유리된 아민에 커플링시켰다. 알릴 탈보호를 위한 일반적인 절차를 사용하여 알릴 에스테르를 탈보호하고, 절단 칵테일 A를 사용하여 공액체를 레진 공액체로부터 유리시켰다. 분취용 HPLC(C18, 10-60% B 50분 동안)에 의한 정제로, 동결건조 후 백색 분말로서 아실화된 GLP-1 동족체 23b를 획득하였다(2.3 mg, 3.1%). 분석용 HPLC 순도: >95% (λ=214 nm). LCMS m/z: [M+4H]4+ Calcd. for C216H313ClN58O66S4+ 1211.3; found 1211.3.
변형된 글루카곤 및 AMPK 활성화제 공액체. C8 링커 (23c) (도 19, 스킴 4).
레진-결합 펩타이드 21 (SEQ ID NO:3)은, Fmoc-Lys(Mmt)-OH가 위치 40의 리신에 사용되었고 Boc-His(Trt)-OH가 위치 1의 히스티딘에 사용되었음을 제외하면, 자동화된 펩타이드 합성을 위한 일반적인 절차에 따라 ChemMatrix® Rinkamide 레진(0.50 mmol/g)에서 0.05 mmol 규모로 합성되었다. 별표로 표시된 이중 커플링 및 삼중 커플링으로 커플링 반응을 수행하였다. 레진 상의 Mmt 탈보호는 Mmt 탈보호를 위한 일반적인 절차를 통해 달성되었다. PyBOP 커플링을 위한 일반적인 절차를 사용하여 화합물 14c를 유리된 아민에 커플링시켰다. 알릴 탈보호를 위한 일반적인 절차를 사용하여 알릴 에스테르를 탈보호하고, 절단 칵테일 A를 사용하여 공액체를 레진 공액체로부터 유리시켰다. 분취용 HPLC(C18, 10-60% B 50분 동안)에 의한 정제로, 동결건조 후 백색 분말로서 아실화된 GLP-1 동족체 23c를 획득하였다(4.7 mg, 3.0%). 분석용 HPLC 순도: >95% (λ=214 nm). LCMS m/z: [M+4H]4+ Calcd. for C218H313ClN58O66S4+ 1218.3; found 1218.6.
변형된 글루카곤 및 AMPK 활성화제 공액체. C10 링커 (23d) (도 19, 스킴 4).
레진-결합 펩타이드 21 (SEQ ID NO:3)은, Fmoc-Lys(Mmt)-OH가 위치 40의 리신에 사용되었고 Boc-His(Trt)-OH가 위치 1의 히스티딘에 사용되었음을 제외하면, 자동화된 펩타이드 합성을 위한 일반적인 절차에 따라 ChemMatrix® Rinkamide 레진(0.50 mmol/g)에서 0.05 mmol 규모로 합성되었다. 별표로 표시된 이중 커플링 및 삼중 커플링으로 커플링 반응을 수행하였다. 레진 상의 Mmt 탈보호는 Mmt 탈보호를 위한 일반적인 절차를 통해 달성되었다. PyBOP 커플링을 위한 일반적인 절차를 사용하여 화합물 14d를 유리된 아민에 커플링시켰다. 알릴 탈보호를 위한 일반적인 절차를 사용하여 알릴 에스테르를 탈보호하고, 절단 칵테일 A를 사용하여 공액체를 레진 공액체로부터 유리시켰다. 분취용 HPLC(C18, 10-60% B 50분 동안)에 의한 정제로, 동결건조 후 백색 분말로서 아실화된 GLP-1 동족체 23d를 획득하였다(4.6 mg, 4.0%). 분석용 HPLC 순도: >95% (λ=214 nm). LCMS m/z: [M+4H]4+ Calcd. for C220H321ClN58O66S4+ 1225.3; found 1225.4.
변형된 글루카곤 및 AMPK 활성화제 공액체. C18 링커 (23e) (도 19, 스킴 4).
레진-결합 펩타이드 21 (SEQ ID NO:3)은, Fmoc-Lys(Mmt)-OH가 위치 40의 리신에 사용되었고 Boc-His(Trt)-OH가 위치 1의 히스티딘에 사용되었음을 제외하면, 자동화된 펩타이드 합성을 위한 일반적인 절차에 따라 ChemMatrix® Rinkamide 레진(0.50 mmol/g)에서 0.05 mmol 규모로 합성되었다. 별표로 표시된 이중 커플링 및 삼중 커플링으로 커플링 반응을 수행하였다. 레진 상의 Mmt 탈보호는 Mmt 탈보호를 위한 일반적인 절차를 통해 달성되었다. PyBOP 커플링을 위한 일반적인 절차를 사용하여 화합물 14e를 유리된 아민에 커플링시켰다. 알릴 탈보호를 위한 일반적인 절차를 사용하여 알릴 에스테르를 탈보호하고, 절단 칵테일 A를 사용하여 공액체를 레진 공액체로부터 유리시켰다. 분취용 HPLC(C18, 10-60% B 50분 동안)에 의한 정제로, 동결건조 후 백색 분말로서 아실화된 GLP-1 동족체 23e를 획득하였다(5.5 mg, 3.7%). 분석용 HPLC 순도: >95% (λ=214 nm). LCMS m/z: [M+4H]4+ Calcd. for C228H337ClN58O66S4+ 1253.1; found 1253.5.
예시 4: AMPK 활성도 분석에서 변형된 글루카곤(SEQ ID NO:3)과 AMPK 활성화제의 공액체 검사.
AMPK 활성도는, 1 uM MK-8722(양성 대조군), 1 uM PF-06409577(양성 대조군), 또는 PF-06409577-글루카곤 공액체(0-1000 nM)의 존재 하에, 50 ng의 재조합 이형삼량체(recombinant heterotrimeric) AMPK a1b1y1(Signalchem P47-110GH를, 분석용 버퍼(50 mM HEPES (pH 7.4), 10 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 및 1 mM DTT), 200 μM 합성 펩타이드 기질(synthetic peptide substrate)(AMARA), 및 100 μM [γ-32P]-ATP(PerkinElmer)를 사용하여 평가되었다. 반응은 30℃에서 수행되었으며, P81 포스포셀룰로스 종이(phosphocellulose paper)(Whatman)에 35 ㎕ 를 얼룩지게 함으로써 30분 후에 종료되었다. 각 샘플의 방사능은 체렌코프 계수(Cherenkov counting)에 의해 측정되었다.
예시 5: 내당능 및 화합물부하검사.
내당능: 생쥐를 5시간 동안 금식시킨 뒤 등장성 식염수(isotonic saline)에 용해된 포도당 1.75 g/kg를 복강내 주사하였다. 꼬리 부분의 혈당 농도는, 주사 후 0, 15, 30, 60, 90, 및 120분에, 휴대용 혈당계(Contour XT, Bayers)를 통해 측정되었다.
화합물부하: 화합물부하는, 실험 화합물을 피하 주사한 뒤, 달리 명시하지 않는 한, 주사 후 0, 1, 2, 4, 및 12시간에, 휴대용 혈당계(Contour XT, Bayers)를 통해 꼬리 부분의 혈당 농도를 측정함으로써 평가되었다. 도 21의 경우, 이중작용제 및 삼중작용제의 혈당 수치는 24시간 후에 측정되었다.
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Claims (15)
- 글루카곤 수용체에서 천연 글루카곤의 적어도 0.1% 활성도(activity)를 나타내는 펩타이드, 및 AMP-활성 단백질 인산화효소(AMPK) 활성화제를 포함하되,
상기 펩타이드는 직접적으로 또는 링커를 통해 상기 AMPK 활성화제에 공유 결합되는 것을 특징으로 하는 공액 분자. - 제1항에 있어서,
상기 펩타이드는 글루카곤-슈퍼패밀리에 속하는 것을 특징으로 하는 공액 분자. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 펩타이드는 SEQ ID NO:1과 적어도 80%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 공액 분자. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 펩타이드는 적어도 10개의 아미노산, 그리고 60개 이하의 아미노산으로 구성되는 것을 특징으로 하는 공액 분자. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 AMPK 활성화제는 화학 절단형 링커(cleavable chemical linker)를 통해 상기 펩타이드에 공유 결합되고, 상기 화학 절단형 링커는, 산-절단형 링커(acid-cleavable linker), 효소-절단형 링커, 펩타이드-절단형 링커, 및 이황화기(disulfide group)를 포함하는 링커로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 공액 분자. - 제5항에 있어서,
상기 화학적 링커는 상기 화학식 R1-R3-S-S-R4-R5-NH-CO-R2를 가지며, R1은 상기 펩타이드이고, R2는 상기 AMPK 활성화제이며, R3은 선택적이고, 존재할 경우 C(CH3)2, CH2-CH2, 또는 CH2 중에서 선택되며, 상기 펩타이드의 측쇄(side chain) 또는 상기 펩타이드의 상기 주쇄(backbone chain)의 탄소 원자에 결합되고, R4는 (CH2)n 또는 C6H4이며, R5는 선택적이고, 존재할 경우 C(CH3)2, CH-CH3, CH2-CH2, 또는 CH2 중에서 선택되며, n은 1, 2, 3 또는 4인 것을 특징으로 하는 공액 분자. - 제1항 내지 제4항에 있어서,
상기 AMPK 활성화제는 비절단형 링커를 통해 상기 펩타이드에 공유 결합되고, 상기 비절단형 링커는, 폴리에틸렌 글리콜 링커, 탄소 링커, 말레이미드계의 공액 화학(conjugation chemistry)과 관련된 mc 및 SMCC, 에테르계, 아미드계, 트리아졸계, 이황화물, 및 티오에테르로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 공액 분자. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 AMPK 활성화제는, 5-아미노이미다졸-4-카르복스아미드 1-β-D-리보푸라노사이드 (AICAR), (3R,3aR,6R,6aR)-6-((6-([1,1'-바이페닐]-4-일)-7-클로로-3H-이미다조[4,5-b]피리딘-2-일)옥시)헥사하이드로푸로[3,2-b]푸란-3-올 (MK-8722), (3R,3aR,6R,6aR)-6-((6-클로로-5-(4-(1-(하이드록시메틸)사이클로프로필)페닐)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)옥시)헥사하이드로푸로[3,2-b]푸란-3-올 (PF-739), 6-클로로-5-[4-(1-하이드록시사이클로부틸)페닐]-1H-인돌-3-카복실산 (PF-06409577), 1,1-디메틸비구아나이드 염산염 (메트포르민), 4-하이드록시-3-(2'-하이드록시바이페닐-4-일)-6-옥소-6,7-디하이드로티에노[2,3-b]피리딘-5-카르보니트릴 (A-769662), 2-클로로-5-[[5-[[5-(4,5-디메틸-2-니트로페닐)-2-푸라닐]메틸렌]-4,5-디하이드로-4-옥소-2-티아졸일]아미노]벤조산 (PT-1), 2-[[2-(2-브로모-4-메틸페녹시)에틸]티오]-피리미딘 (ZLN024), 2-[[4-(디에틸아미노)-2-하이드록시페닐]메틸렌]히드라지드-4-피리딘카복실산 (RSVA-405), 및 이들의 유사체로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 공액 분자. - 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 공액 분자.
- 비만, 제2형 당뇨병, 고인슐린혈증(hyperinsulinemia), 인슐린 저항성, 내당능장애(impaired glucose tolerance), 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolaemia), 비알코올성지방간(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD), 비알코올성지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, NASH), 및 이상지질혈증(dyslipidemia)의 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 공액 분자.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 상기 공액 분자 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 약학적으로 허용가능한 담체(carrier)를 포함하는 약학 조성물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 상기 공액 분자 또는 제11항에 따른 상기 약학 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 상기 포유동물의 체중 감소 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 상기 공액 분자 또는 제11항에 따른 상기 약학 조성물을 포유동물에게 경구 투여하는 단계를 포함하는 상기 포유동물의 체중 감소를 위한 비치료적 치료 방법(non-therapeutic treatment).
- 제13항에 있어서,
상기 포유동물은 비병원성 체질량지수(BMI)를 갖는 것을 특징으로 하는 상기 포유동물의 체중 감소를 위한 비치료적 치료 방법. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 상기 공액 분자 또는 제11항에 따른 상기 약학적 조성물을 포유동물에게 경구 투여하는 단계를 포함하는 상기 포유동물의 혈장 콜레스테롤(plasma cholesterol)을 감소시키기 위한 비치료적 치료 방법.
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