KR20240082353A - Frataxin 유전자 요법 - Google Patents

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KR20240082353A
KR20240082353A KR1020247012580A KR20247012580A KR20240082353A KR 20240082353 A KR20240082353 A KR 20240082353A KR 1020247012580 A KR1020247012580 A KR 1020247012580A KR 20247012580 A KR20247012580 A KR 20247012580A KR 20240082353 A KR20240082353 A KR 20240082353A
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acid sequence
fxn
promoter
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드와이파얀 센
존 티. 그레이
조슈아 씨. 창
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아스텔라스 진 테라피스, 인크.
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Publication date
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Abstract

본 발명은 인간 프라탁신 유전자의 발현을 자극하는 조성물 및 방법을 제공한다. 본 명세서에 기재된 조성물은, 예를 들어, 특정 세포 유형에서 발현을 위해 최적화된 유전자 및 RNA 등가물을 생성하는 데 사용될 수 있다. 상기 조성물 및 방법은 프리드라이히 운동실조증을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 개시내용의 조성물 및 방법을 이용하여, 프리드라이히 운동실조증이 있는 환자(예를 들어, 포유류 환자, 예컨대, 인간 환자)는 인간 프라탁신 유전자(hFXN) 또는 이의 RNA 등가물을 포함하는 플라스미드(예를 들어, 바이러스 벡터)가 투여될 수 있다.

Description

FRATAXIN 유전자 요법
서열목록
본 출원은 XML 형식으로 전자적으로 제출되고 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된 서열목록을 포함한다. 2022년 9월 9일자로 생성된 상기 XML 사본은 파일명이 51037-060WO4_Sequence_Listing_9_8_22_ST26.XML이고, 용량이 23,124 바이트이다.
기술분야
본 발명은 핵산 생명공학 분야에 관한 것이고, 예를 들어, 표적 세포 또는 조직에서 유전자 발현을 향상시키기 위한 코돈-최적화된 핵산의 생산을 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
프리드라이히 운동실조증(Friedreich ataxia)은 가장 흔한 상염색체 열성 유전 운동 장애이고, 6,000명의 미국인이 이 질환을 진단받았으며, 전세계적으로 대략 15,000 내지 20,000명의 환자가 진단받았다. 프리드라이히 운동실조증의 임상 증상은 프라탁신 단백질 결핍의 결과이며, 사례의 95%는 GAA 반복부 확장을 야기하는 돌연변이로부터 초래된다. 프라탁신은 편재하여 발현되는 미토콘드리아 철-결합 단백질이며, 후근 신경절 뉴런을 포함하는 심장, 소뇌 및 척수의 기능에 중요하다. 프리드라이히 운동실조증의 표현형에는 척수소뇌 후근 신경절 뉴런의 퇴행 및 탈수초화가 포함되어, 점진적 약화, 경직 및 감각 상실을 야기하고; 대부분의 프리드라이히 환자는 20세가 되면 휠체어에 의지하게 된다(Dun and Brice,　Curr Opin Neurol　(2000) 13:407-413). 더 나아가, 프리드라이히 운동실조증이 있는 대부분의 환자는 심장 이상(예를 들어, 좌심실 비대)이 발생되어, 환자의 60%가 약 30 내지 40세에 심부전으로 사망하게 된다. 프리드라이히 운동실조증의 치료를 위한 유전자 요법의 개발은 영향받은 조직에서 치료적 유효량의 프라탁신의 발현을 달성하는 것과 관련된 어려움으로 인해 방해를 받았으며, 현재 승인된 질환-변형 치료는 존재하지 않는다. 이러한 장애를 다루는 일련의 조성물 및 방법에 대한 요구가 남아있다.
본 개시내용은 프리드라이히 운동실조증을 치료하기 위해 사용될 수 있는 조성물 및 방법을 제공한다. 본 개시내용의 조성물 및 방법을 이용하여, 프리드라이히 운동실조증이 있는 환자(예를 들어, 포유류 환자, 예컨대, 인간 환자)에게 인간 프라탁신 유전자(human frataxin: hFXN) 또는 이의 RNA 등가물을 함유하는 플라스미드(예를 들어, 바이러스 벡터)가 투여될 수 있다.
일 양상에서, 본 개시내용은 hFXN을 암호화하는 DNA 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 RNA 등가물을 제공하되, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 핵산 서열을 갖는다.
다른 양상에서, 본 개시내용은 앞서 언급한 양상의 조성물을 포함하는 벡터를 제공하되, 벡터는 플라스미드, DNA 벡터, RNA 벡터, 비리온 또는 바이러스 벡터이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus: AAV)이다.
앞서 언급한 양상의 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 근육 특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결되되, 선택적으로 프로모터는 폴리뉴클레오타이드에 대해 5'에 위치된다.
일부 실시형태에서, 벡터는 폴리아데닐화 부위(polyadenylation site: pA)를 더 포함하되, 선택적으로 pA는 폴리뉴클레오타이드에 대해 3'에 위치된다.
일부 실시형태에서, 벡터는 인트론을 더 포함하되, 선택적으로 인트론은 프로모터에 대해 3' 및 폴리뉴클레오타이드에 대해 5'에 위치된다.
일부 실시형태에서, AAV는 2개의 반전 말단 반복부(inverted terminal repeat: ITR)를 더 포함하되, 2개의 ITR은 제1 ITR(ITR1) 및 제2 ITR(ITR2)을 포함하되, ITR1은 폴리뉴클레오타이드에 대해 5'에 위치되고, ITR2는 폴리뉴클레오타이드에 대해 3'에 위치되어 ITR1-hFXN-ITR2를 포함하는 카세트를 형성한다.
일부 실시형태에서, ITR1과 ITR2 사이의 핵산의 길이는 약 3.7Kb 내지 약 4.3Kb(예를 들어, 약 3.8Kb 내지 약 4.2Kb 또는 약 3.9Kb 내지 약 4.1Kb)이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, ITR1과 ITR2 사이의 핵산의 길이는 약 3.8Kb 내지 약 4.2Kb이다. 일부 실시형태에서, ITR1과 ITR2 사이의 핵산의 길이는 약 3.9Kb 내지 약 4.1Kb이다. 일부 실시형태에서, ITR1과 ITR2 사이의 핵산의 길이는 약 4.0Kb이다.
다른 양상에서, 본 개시내용은 앞서 언급한 양상의 바이러스 벡터를 암호화하는 플라스미드를 제공한다.
다른 양상에서, 본 개시내용은 ITR1; hFXN 또는 이의 RNA 등가물; 및 ITR2를 포함하는, 핵산 분자를 제공하되; 구성성분은 ITR1-hFXN-ITR2와 같이 5'에서 3' 방향으로 서로 작동 가능하게 연결되고; ITR1과 ITR2 사이의 핵산의 길이는 약 3.7Kb 내지 약 4.3Kb(예를 들어, 약 3.8Kb 내지 약 4.2Kb 또는 약 3.9Kb 내지 약 4.1Kb)이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, ITR1과 ITR2 사이의 핵산의 길이는 약 3.8Kb 내지 약 4.2Kb이다. 일부 실시형태에서, ITR1과 ITR2 사이의 핵산의 길이는 약 3.9Kb 내지 약 4.1Kb이다. 일부 실시형태에서, ITR1과 ITR2 사이의 핵산의 길이는 약 4.0Kb이다.
앞서 언급한 양상 중 어느 것의 일부 실시형태에서, ITR1과 ITR2를 포함하여 이들 사이의 핵산의 길이는 약 3.9Kb 내지 약 4.7Kb(예를 들어, 약 4.0Kb 내지 약 4.6Kb, 약 4.1Kb 내지 약 4.5Kb, 약 4.2Kb 내지 약 4.4Kb, 또는 약 4.3Kb)이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, ITR1과 ITR2를 포함하여 이들 사이의 핵산의 길이는 약 4.0Kb 내지 약 4.6Kb이다. 일부 실시형태에서, ITR1과 ITR2를 포함하여 이들 사이의 핵산의 길이는 약 4.1Kb 내지 약 4.5Kb이다. 일부 실시형태에서, ITR1과 ITR2를 포함하여 이들 사이의 핵산의 길이는 약 4.2Kb 내지 약 4.4Kb이다. 일부 실시형태에서, ITR1과 ITR2를 포함하여 이들 사이의 핵산의 길이는 약 4.3Kb이다.
일부 실시형태에서, 핵산 분자는 진핵 프로모터(PEuk)를 추가로 포함하되, 구성성분은 ITR1-PEuk-hFXN-ITR2와 같이 5'에서 3' 방향으로 서로 작동 가능하게 연결된다.
일부 실시형태에서, PEuk는 근육 특이적 프로모터이다.
앞서 언급한 양상 중 어느 것의 일부 실시형태에서, 근육 특이적 프로모터는 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터, 데스민 프로모터, 근육 크레아틴 키나제 프로모터, 미오신 경쇄 프로모터, 미오신 중쇄 프로모터, 심장 트로포닌 C 프로모터, 트로포닌 I 프로모터, myoD 유전자 패밀리 프로모터, 액틴 알파 프로모터, 액틴 베타 프로모터, 액틴 감마 프로모터 또는 안구쌍 유사 호메오도메인 3의 인트론 1 내의 프로모터, 거대세포바이러스 프로모터 또는 닭-β-액틴 프로모터이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 근육 특이적 프로모터는 PGK 프로모터이다.
앞서 언급한 양상 중 어느 것의 일부 실시형태에서, PGK 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 85%(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 핵산 서열을 갖는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, PGK 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, PGK 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 PGK 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, PGK 프로모터는 서열번호 2의 핵산을 갖는다.
일부 실시형태에서, 핵산 분자는 pA를 추가로 포함하되, 구성성분은 ITR1-PEuk-hFXN-pA-ITR2와 같이 5'에서 3' 방향으로 서로 작동 가능하게 연결된다.
앞서 언급한 양상 중 어느 것의 일부 실시형태에서, pA 부위는 시미안 바이러스 40(SV40) 후기 폴리아데닐화 부위, SV40 초기 폴리아데닐화 부위, 인간 β-글로빈 폴리아데닐화 부위 또는 소성장 호르몬 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, pA 부위는 SV40 후기 폴리아데닐화 부위를 포함한다.
일부 실시형태에서, 핵산 분자는 인트론을 추가로 포함하되, 구성성분은 ITR1-PEuk-인트론-hFXN-pA-ITR2와 같이 5'에서 3' 방향으로 서로 작동 가능하게 연결된다.
앞서 언급한 양상 중 어느 것의 일부 실시형태에서, 인트론은 SV40 인트론이다.
일부 실시형태에서, hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 85%(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 단백질을 암호화한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, hFXN 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 단백질을 암호화하되, 선택적으로 hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화한다.
앞서 언급한 양상 중 어느 것의 일부 실시형태에서, hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 85%(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 핵산 서열을 갖는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 86% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 87% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 88% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 89% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 91% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 92% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 93% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 94% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 97% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 98% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 99% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열을 갖는다.
다른 양상에서, 본 개시내용은 앞서 언급한 양상 중 어느 것의 조성물 또는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공하되, 벡터는 플라스미드, DNA 벡터, RNA 벡터, 비리온 또는 바이러스 벡터이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다.
앞서 언급한 양상 중 어느 것의 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 AAV, 아데노바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 단순포진 바이러스, 백시니아 바이러스 및 합성 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 AAV이다. 일부 실시형태에서, AAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10 또는 AAVrh74 혈청형이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 위형 AAV이다. 일부 실시형태에서, 위형 AAV는 AAV2/8 또는 AAV2/9이되, 선택적으로 위형 AAV는 AAV2/8이다.
앞서 언급한 양 중 어느 것의 일부 실시형태에서, ITR1 및/또는 ITR2는 파보바이러스 ITR이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 파보바이러스 ITR은 AAV ITR이다. 일부 실시형태에서, AAV ITR은 AAV 혈청형 2 ITR이다.
앞서 언급한 양상 중 어느 것의 일부 실시형태에서, AAV는 재조합 캡시드 단백질을 포함한다.
앞서 언급한 양상 중 어느 것의 일부 실시형태에서, 벡터는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 85%(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 핵산 서열을 갖는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 벡터는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 벡터는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 벡터는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 벡터는 서열번호 4의 핵산을 갖는다.
다른 양상에서, 본 개시내용은 앞서 언급한 양상 중 어느 하나의 바이러스 벡터를 암호화하는 플라스미드를 제공한다.
앞서 언급한 양상의 일부 실시형태에서, 플라스미드는 하나 이상의 스페이서(SS)를 더 포함하되, 하나 이상의 SS는 ITR1에 대해 5' 및/또는 ITR2에 대해 3'에 위치된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 플라스미드는 2개의 SS를 포함하되, 2개의 SS는 제1 스페이서(SS1) 및 제2 스페이서(SS2)를 포함하고, SS1은 ITR1에 대해 5'에 위치되고, SS2는 ITR2에 대해 3'에 위치된다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 SS는 100개 초과의 아미노산 길이인 오픈 리딩 프레임을 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 SS는 원핵 전사 인자 결합 부위를 포함하지 않는다.
앞서 언급한 양상 중 어느 것의 일부 실시형태에서, SS1은 약 1.0Kb 내지 약 5.0Kb(예를 들어, 1.5Kb 내지 약 4.5Kb, 약 2.0Kb 내지 약 4.0Kb, 또는 약 3.0Kb) 길이이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, SS1은 약 2.0Kb 내지 약 5.0Kb 길이이다.
앞서 언급한 양상 중 어느 것의 일부 실시형태에서, SS2는 약 1.0Kb 내지 약 5.0Kb(예를 들어, 1.5Kb 내지 약 4.5Kb, 약 2.0Kb 내지 약 4.0Kb, 또는 약 3.0Kb) 길이이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, SS2는 약 2.0Kb 내지 약 5.0Kb 길이이다.
일부 실시형태에서, 플라스미드는 ITR1에 대해 5'에 위치된 하나 이상의 SS에 대해 5'에 위치되거나 ITR2에 대해 3'에 위치된 하나 이상의 SS에 대해 3'에 위치된 선택 가능 마커 유전자에 작동 가능하게 연결된 원핵 프로모터를 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 선택 가능한 마커 유전자는 항생제 내성 유전자이다.
일부 실시형태에서, 플라스미드는 ITR1에 대해 5'에 위치된 하나 이상의 SS에 대해 5'에 위치되고/되거나 ITR2에 대해 3'에 위치된 하나 이상의 SS에 대해 3'에 위치된 원핵 복제기점을 추가로 포함한다.
다른 양상에서, 본 개시내용은 앞서 언급한 양상 중 어느 것의 조성물, 핵산 분자, 벡터 또는 플라스미드 및 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
다른 양상에서, 본 개시내용은 프리드라이히 운동실조증의 치료를 필요로 하는 인간 환자의 프리드라이히 운동실조증의 치료 방법을 제공하고, 상기 방법은 치료적 유효량의 앞서 언급한 양상 중 어느 것의 조성물, 핵산 분자, 벡터, 플라스미드 또는 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양상에서, 본 개시내용은 프리드라이히 운동실조증이 있는 것으로 진단된 인간 환자에서의 프라탁신 발현을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료적 유효량의 앞서 언급한 양상 중 어느 것의 조성물, 핵산 분자, 벡터, 플라스미드 또는 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 환자는 3세 내지 17세(예를 들어, 4세 내지 16세, 5세 내지 15세, 6세 내지 14세, 7세 내지 13세, 8세 내지 12세, 9세 내지 11세, 또는 10세)이다.
일부 실시형태에서, 앞서 언급한 양상 중 어느 것의 조성물, 핵산 분자, 벡터, 플라스미드 또는 약제학적 조성물을 환자에게 투여 시, 환자는 전혈 프라탁신 수준의 변화를 나타내되, 선택적으로 환자는 투여 후 약 12주까지의 전혈 프라탁신 수준의 변화를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 앞서 언급한 양상 중 어느 것의 조성물, 핵산 분자, 벡터, 플라스미드 또는 약제학적 조성물을 환자에게 투여 시, 환자는 총 프리드라이히 운동실조증 평가 척도(FARS) 점수의 감소를 나타내되, 선택적으로 환자는 투여 후 약 12주까지의 총 FARS 점수의 감소를 나타낸다.
다른 양상에서, 본 개시내용은 앞서 언급한 양상 중 어느 것의 조성물, 핵산 분자, 벡터, 플라스미드 또는 약제학적 조성물; 및 포장 삽입물을 포함하는 키트를 제공하되, 포장 삽입물은 키트의 사용자가 프리드라이히 운동실조증이 있는 것으로 진단된 조성물 또는 벡터를 인간 환자에게 투여하도록 지시한다.
도 1은 인간 프라탁신(FXN) 변이체 1(H.FXN.WT)을 암호화하는 유전자의 잔기 위치 1 내지 270번에서의 핵산 변이 확률을 각각 도시하는 개략도이다. 통합된 DNA 기술(Integrated DNA Technologies: IDT) 및 GENEWIZ(GeneWiz) 코돈 최적화 도구를 이용하여, 잔기 최적화를 데이터베이스 및 잔기 위치 전반에 걸쳐 비교하였다. 잔기 1 내지 270이 본 명세서에 도시되지만, 잔기 1 내지 633을 포함하는 인간 FXN 변이체 1 유전자의 모든 잔기에 걸쳐 코돈 최적화가 수행되었다. 상단의 서열은 데이터세트에 걸친 각 잔기 위치에서의 가장 빈번한 핵산을 나타낸다. 화살표는 코돈-최적화된 인간 FXN 변이체 1 작제물(H.FXN.ATX.Co 또는 hFXNco로 상호 호환 가능하게 약칭됨)의 변형을 위해 선택된 잔기를 나타낸다. 예를 들어, 잔기 12는 야생형 사이토신(C)이 구아닌(G)으로 변경되었다는 것을 나타낸다.
도 2는 코돈-최적화된 인간 FXN 변이체 1 유전자(hFXNco)의 발현을 위한 예시적인 위형 아데노-연관 바이러스(AAV) 2/8(AAV2/8) 바이러스 벡터의 맵이다. 좌측에서 우측으로, 음영 화살표는 5'에서 3'으로 제1 스페이서, 제1 반전 말단 반복부(ITR1), 인간 포스포글리세레이트 키나제(hPGK) 프로모터, hFXNco, 시미안 바이러스 40(SV40) 후기 폴리아데닐화 부위(SV4 LpA), 제2 ITR(ITR2), 원핵 복제기점(ori) 및 카나마이신(kan) 선택 유전자를 포함하는 핵산 분자를 함유하는 플라스미드를 나타내되, 페이로드(예를 들어, hPGK 및 hFXNco)를 포함하는 ITR1과 ITR2 사이의 길이는 약 4.3Kb 길이이다.
도 3A 및 도 3B는 각각 항-프라탁신 면역형광 발현-기반 역가 분석을 나타내는 사진 및 그래프이다. 도 3A는 hFXNco의 발현을 위한 AAV2/8 바이러스 벡터의 1×107(1e7)개의 바이러스 게놈(vg)/세포로 형질도입 후 프라탁신에 대해 염색된 뮤린 골근육(C2C12)으로부터 유래된 세포의 사진 세트이다. 도 3B는 훽스트 대조염색(Hoechst counter-stain)의 강도로 정규화된 바와 같은, 감염 다중도(multiplicity of infection: MOI)의 함수로서 도 3A에 기재된 프라탁신 면역형광을 도시한 그래프이다.
도 4는 도 1 및 도 2에 기재된 바와 같이, 각각 1×106(1e6) vg/세포 또는 1×107(1e7) vg/세포의 양으로 hFXNco의 발현을 위한 예시적인 AAV2/8 바이러스 벡터로 형질도입된 C2C12 세포에서의 프라탁신의 중간체 및 성숙 아이소폼의 발현을 나타내는 웨스턴 블롯이다.
도 5는 비형질도입 대조군(비히클 야생형(WT) 및 비히클 KO)과 비교할 때, 3×1013(3e13) vg/㎏ 또는 1×1014(1e14) vg/㎏의 양으로 hPGK 프로모터-유도 hFXNco 또는 뮤린 FXN 변이체 1(mFXN)의 발현을 위한 예시적인 AAV2/8 바이러스 벡터의 정맥내(i.v.) 투여 후 시간에 따른 FXN 넉아웃(KO) 마우스의 생존 확률을 도시한 그래프이다.
도 6A 내지 도 6E는 비형질도입 대조군(WT 비히클 및 FRDA 비히클)과 비교할 때 3×1013 vg/㎏ 또는 1×1014 vg/㎏의 양으로 hPGK 프로모터-유도 hFXNco(hFXN) 또는 mFXN의 발현을 위한 예시적인 AAV2/8 바이러스 벡터의 i.v. 투여 후 FXN KO 마우스의 생존, 체중 및 심장 파라미터를 나타낸다. 도 6A는 시간에 따른 FXN KO 마우스의 생존 확률을 도시하는 그래프이다. 생존 데이터는 마우스가 예정된 부검 전에 20% 초과의 체중 감소, 호흡곤란 징후, 의미있는 자극에 대한 무반응 및/또는 전반적으로 불량한 신체 상태를 나타낸 경우 마우스를 안락사시킨 주령으로 표시된다. 도 6B는 시간에 따른 FXN KO 마우스의 수컷 및 암컷 체중을 도시하는 그래프이다. 도 6C는 치료 전(6주령), 치료 후(9 내지 10주령) 및 수명(18 내지 19주) 체중으로 정규화된 좌심실 질량에 따른 FXN KO 마우스의 심장 무게를 보여주는 그래프이다. 도 6D는 치료 전(6주령), 치료 후(9 내지 10주령) 및 수명(18 내지 19주)에 따른 FXN KO 마우스의 박출분율을 보여주는 그래프이다. 도 6E는 치료 전(6주령), 치료 후(9 내지 10주령) 및 수명(18 내지 19주)에 따른 FXN KO 마우스의 심근장애의 마커인 미오신 경쇄 3을 보여주는 그래프이다.
도 7A 및 도 7B는 비형질도입 대조군(비히클 WT 및 비히클 KO)과 비교할 때 3×1013 vg/㎏ 또는 1×1014 vg/㎏의 양으로 hFXNco 또는 mFXN의 발현을 위한 예시적인 AAV2/8 바이러스 벡터의 i.v. 투여 후 FXN KO 마우스에서의 심장의 프라탁신 발현을 보여주는 일련의 그래프이다. 도 7A는 데시그램(DG)당 벡터 복제수(vector copy number: VCN)의 함수로서 심장에서의 용량-의존적 프라탁신 발현을 도시하는 그래프인 반면, 도 7B는 샘플링된 생검 심장 조직의 ㎎당 단백질의 나노그램(ng)으로서 프라탁신 발현을 도시한다.
도 8은 비형질도입 대조군(WT 비히클 및 FRDA 비히클)과 비교할 때 3×1013 vg/㎏ 또는 1×1014 vg/㎏의 양으로 hFXNco 또는 mFXN의 발현을 위한 예시적인 AAV2/8 바이러스 벡터의 투여 후 제4주(도 8A) 및 제12주(도 8B)에 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 측정한 바와 같은 심장 조직에서의 프라탁신 단백질 수준을 나타내는 그래프이다.
도 9A 및 도 9B는 비형질도입 대조군(WT 비히클 및 FRDA 비히클)과 비교할 때 3×1013 vg/㎏ 또는 1×1014 vg/㎏의 양으로 hFXNco 또는 mFXN의 발현을 위한 예시적인 AAV2/8 바이러스 벡터의 투여 후 제4주 및 제12주에 qPCR로 측정한 바와 같은 심장 조직에서 검출된 이배체 게놈당 벡터 복제물의 수를 보여주는 그래프이다.
도 10A는 심장 조직에서의 프라탁신 발현의 면역조직화학이다. 도 10B는 3×1013 vg/㎏ 또는 1×1014 vg/㎏의 양으로 hFXNco 또는 mFXN의 발현을 위한 예시적인 AAV2/8 바이러스 벡터의 투여 4주 후에 약한, 중간의 또는 강한 프라탁신 발현을 나타내는 백분율을 나타내는 그래프이다.
도 11A 및 도 11B는 비형질도입 대조군(비히클 대조군)에 비교할 때 hFXNco (AAV2/8-PGK-FXN V2)의 발현을 위한 AAV2/8 바이러스 벡터의 버전 2의 1×107(1e7) 바이러스 게놈(vg)/세포에 의한 형질도입 후 프라탁신에 대해 염색한 세포의 사진 및 마우스 골근육(도 11A) 및 인간 골근육(도 11B)에 대한 훽스트 대조염색의 강도로 정규화된 바와 같이, 감염 다중도(MOI)의 함수로서 기재된 프라탁신 면역형광을 도시하는 그래프이다.
도 12는 AAV2/8-PGK-FXN 버전 1(V1) 및 버전 2(V2)의 비교이다. 도 12A는 비형질도입 대조군(비히클 대조군)에 비교할 때 AAV2/8-PGK-FXN V1 또는 V2의 1×107(1e7) 바이러스 게놈(vg)/세포에 의한 이들의 형질도입 후 프라탁신에 대해 염색된 마우스 골근육(C2C12) 세포의 사진 수집이다. 도 12B는 AAV2/8-PGK-FXN V1 또는 V2에 대해, 훽스트 대조염색(Hoechst counter-stain)의 강도로 정규화된 바와 같은, 감염 다중도(MOI)의 함수로서 기재된 프라탁신 면역형광을 도시한 그래프이다. 도 12C는 1×106(1e6) vg/세포 또는 1×107(1e7) vg/세포의 양으로 AAV2/8-PGK-FXN V1 또는 V2로 형질도입된 C2C12 세포에서의 프라탁신의 성숙 아이소폼의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯이다.
도 13은 야생형 FXN(WT) 또는 코돈-최적화된 FXN(CO) 중 하나를 발현시키는 FXN(AAV2/8-PGK-FXN V2)의 발현을 위해 AAV2/8 바이러스 벡터의 버전 2에 대해 훽스트 대조염색의 강도로 정규화된 바와 같은, 감염 다중도(MOI)의 함수로서 도시된 프라탁신 면역형광을 도시하는 그래프의 수집이다. 도 13A는 형질도입된 마우스 골근육(C2C12) 세포에 상응하고, 도 13B는 형질도입된 인간 세포에 상응한다.
도 14는 비형질도입 대조군(비히클 WT 및 비히클 돌연변이체)과 비교할 때 다양한 용량의 바이러스 게놈(vg)/킬로그램(㎏)으로 AAV2/8-PGK-FXN 버전 1(V1) 또는 버전 2(V2)의 정맥내 투여 후 시간에 따른 FXN KO 마우스의 생존을 도시하는 그래프이다. 생존 데이터는 마우스가 예정된 부검 전 다음의 조건 중 어느 것을 나타낸 경우 마우스가 안락사된 일령으로 표시된다: 체중의 20% 초과의 감소, 호흡곤란 징후의 입증, 의미있는 자극에 대한 무반응 및/또는 전반적으로 불량한 신체 상태.
도 15는 5주령(WOA), 9 내지 10 WOA, 및 18 내지 19 WOA에, 비형질도입 대조군(비히클 WT 및 비히클 돌연변이체)과 비교할 때, 다양한 용량의 바이러스 게놈(vg)/킬로그램(㎏)으로 AAV2/8-PGK-FXN V1 또는 V2의 정맥내 투여 후 FXN KO 마우스에 대한 심장의 박출분율을 나타내는 그래프의 수집이다.
도 16은 5주령(WOA), 9 내지 10 WOA, 및 18 내지 19 WOA에, 비형질도입 대조군(비히클 WT 및 비히클 돌연변이체)과 비교할 때, 다양한 용량의 바이러스 게놈(vg)/킬로그램(㎏)으로 AAV2/8-PGK-FXN V1 또는 V2의 정맥내 투여 후 FXN KO 마우스에 대한 심장의 구획단축률의 백분율을 나타내는 그래프의 수집이다.
도 17은 5주령(WOA), 9 내지 10 WOA, 및 18 내지 19 WOA에, 비형질도입 대조군(비히클 WT 및 비히클 돌연변이체)과 비교할 때, 다양한 용량의 바이러스 게놈(vg)/킬로그램(㎏)으로 AAV2/8-PGK-FXN V1 또는 V2의 정맥내 투여 후 FXN KO 마우스에 대한 심장의 좌심실 질량을 나타내는 그래프의 수집이다.
도 18은 9 내지 10주령(WOA), 및 18 내지 19 WOA에, 비형질도입 대조군(비히클 WT 및 비히클 돌연변이체)과 비교할 때, 다양한 용량의 바이러스 게놈(vg)/킬로그램(㎏)으로 AAV2/8-PGK-FXN V1 또는 V2의 정맥내 투여 후 FXN KO 마우스에 대한 혈청 심장 트로포닌을 나타내는 그래프의 수집이다.
도 19는 9 내지 10주령 WOA(WOA), 및 18 내지 19 WOA에, 비형질도입 대조군(비히클 WT 및 비히클 돌연변이체)과 비교할 때, 다양한 용량의 바이러스 게놈(vg)/킬로그램(㎏)으로 AAV2/8-PGK-FXN V1 또는 V2의 정맥내 투여 후 FXN KO 마우스에 대한 혈청 미오신 경쇄를 나타내는 그래프의 수집이다.
도 20은 9 내지 10주령 WOA(WOA), 및 18 내지 19 WOA에, 비형질도입 대조군(비히클 WT 및 비히클 돌연변이체)과 비교할 때, 다양한 용량의 바이러스 게놈(vg)/킬로그램(㎏)으로 AAV2/8-PGK-FXN V1 또는 V2의 정맥내 투여 후 FXN KO 마우스에 대한 혈청 아스파르테이트 트랜스아미나제(AST)를 나타내는 그래프의 수집이다.
도 21은 9 내지 10주령 WOA(WOA), 및 18 내지 19 WOA에, 비형질도입 대조군(비히클 WT 및 비히클 돌연변이체)과 비교할 때, 다양한 용량의 바이러스 게놈(vg)/킬로그램(㎏)으로 AAV2/8-PGK-FXN V1 또는 V2의 정맥내 투여 후 FXN KO 마우스에 대한 혈청 알라닌 트랜스아미나제(ALT)를 나타내는 그래프의 수집이다.
도 22는 다양한 용량의 바이러스 게놈(vg)/킬로그램(㎏)으로 AAV2/8-PGK-FXN V1 또는 V2의 정맥내 투여 후 제4주 및 제12주에 FXN KO 마우스의 심장 및 사두근에서의 AAV2/8-PGK-FXN의 데시그램(DG)당 벡터 복제수(VCN)를 보여주는 그래프의 수집이다.
도 23은 다양한 용량의 바이러스 게놈(vg)/킬로그램(㎏)으로 AAV2/8-PGK-FXN V1 또는 V2의 정맥내 투여 후 제4주 및 제12주에 FXN KO 마우스의 심장 및 사두근에서의 AAV2/8-PGK-FXN의 데시그램(DG)당 벡터 복제수(VCN)를 비교하는 그래프의 수집이다.
도 24는 다양한 용량의 바이러스 게놈(vg)/킬로그램(㎏)으로 AAV2/8-PGK-FXN V1 또는 V2의 정맥내 투여 후 제4주 및 제12주에 FXN KO 마우스의 간에서의 AAV2/8-PGK-FXN의 데시그램(DG)당 벡터 복제수(VCN)를 보여주는 그래프의 수집이다.
도 25는 다양한 용량의 바이러스 게놈(vg)/킬로그램(㎏)으로 AAV2/8-PGK-FXN V1 또는 V2의 정맥내 투여 후 FXN KO 마우스의 심장 및 사두근(Quad)에서의 RNA 상대 정량화(RQ)로서 FXN mRNA 전사체를 나타내는 그래프이다.
도 26은 비형질도입 대조군(WT 비히클 및 KO 비히클)과 비교할 때 다양한 용량의 바이러스 게놈(vg)/킬로그램(㎏)으로 AAV2/8-PGK-FXN V1 또는 V2의 정맥내 투여 후 제4주 및 제12주에 FXN KO 마우스의 심장에서의 FXN 단백질 발현을 나타내는 그래프이다.
도 27은 비형질도입 대조군(WT 비히클 및 KO 비히클)과 비교할 때 다양한 용량의 바이러스 게놈(vg)/킬로그램(㎏)으로 AAV2/8-PGK-FXN V1 또는 V2의 정맥내 투여 후 제4주 및 제12주에 FXN KO 마우스의 간에서의 FXN 단백질 발현을 나타내는 그래프이다.
도 28은 비형질도입 대조군(WT 비히클 및 KO 비히클)과 비교할 때 다양한 용량의 바이러스 게놈(vg)/킬로그램(㎏)으로 AAV2/8-PGK-FXN V1 또는 V2의 정맥내 투여 후 제4주 및 제12주에 FXN KO 마우스의 사두근에서의 FXN 단백질 발현을 나타내는 그래프이다.
도 29는 비형질도입 대조군(비히클 대조군 및 비히클 돌연변이체)과 비교할 때 다양한 용량의 바이러스 게놈(vg)/동물로 AAV8-PGK-FXN V1 또는 V2의 뇌실내(ICV) 투여 후 FXN KO 마우스가 로타로드(rotarod)에서 떨어지는 데 걸리는 시간(초)을 도시하는 그래프이다. 6 내지 8주령(WOA), 11 내지 12 WOA, 13 내지 14 WOA, 및 16 내지 18 WOA에 측정하였고, 8 WOA에 ICV 투여하였다.
도 30은 다양한 용량의 바이러스 게놈(vg)/동물에서의 AAV8-PGK-FXN V2의 뇌실내(ICV) 투여 후 FXN KO 마우스에 대한 꼬리 척수, 소뇌, 피질, 입쪽 척수, 좌골신경, 꼬리 후근 신경절(DRG), 좌측 간엽 절반, 심장 절반 및 입쪽 DRG에서의 부검 시 AAV8-PGK-FXN의 데시그램(DG)당 벡터 복제수(VCN)를 나타내는 그래프의 수집이다. ICV 투여는 8주령에 이루어졌다.
도 31은 다양한 용량의 바이러스 게놈(vg)/동물에서의 AAV8-PGK-FXN V2의 뇌실내(ICV) 또는 뇌실질내(IPC) 투여 후 FXN KO 마우스에 대한 소뇌, 피질, 심장 및 간에서의 부검 시 AAV8-PGK-FXN의 데시그램(DG)당 벡터 복제수(VCN)를 나타내는 그래프의 수집이다. 동물은 8주령에 투약되었다. ICV-투약 마우스로부터의 조직은 투약 후 10 내지 11주에 분석되었고, IPC-투약 마우스로부터의 조직은 투약 후 5주에 분석되었다.
도 32는 다양한 용량의 바이러스 게놈(vg)/동물에서의 AAV8-PGK-FXN V1 또는 V2의 뇌실내(ICV) 또는 뇌실질내(IPC) 투여를 통해 야생형(WT), 비형질도입(FXNPAV/null) 및 형질도입된 FXN KO 마우스에 대한 부검 시 피질 및 소뇌에서의 FXN 단백질을 나타내는 그래프의 수집이다. 동물은 8주령에 투약되었다. ICV-투약 마우스로부터의 조직은 투약 후 10주에 분석되었고, IPC-투약 마우스로부터의 조직은 투약 후 5주에 분석되었다.
도 33은 AAV8-PGK-FXN V2의 뇌실내(ICV) 또는 뇌실질내(IPC) 투여 후 FXN KO 마우스에 대한 피질, 소뇌, 심장 및 간에서의 벡터 복제수(VCN)당 FXN 단백질을 보여주는 그래프이다. 조직은 주사 후 5주(weeks post injection: wpi)에 분석되었다. ICV는 출생 후 제2일(PND2)에 투여되었다.
도 34는 비형질도입 대조군(WT 비히클 및 KO 비히클)과 비교할 때 다양한 용량의 바이러스 게놈(vg)/동물에서의 AAV8-PGK-FXN V1 또는 V2의 투여 후 FXN KO 마우스에 대한 신경미세섬유 경쇄(NFLC)(밀리리터(㎖)당 피코그램(pg))를 나타내는 그래프이다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 용어 "약"은 기재 중인 값의 10% 초과 또는 미만 이내인 값을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "아데노-연관 바이러스"(AAV)는 1형 AAV, 2형 AAV, 3형 AAV(3A 및 3B형 포함), 4형 AAV, 5형 AAV, 6형 AAV, 7형 AAV, 8형 AAV, 9형 AAV, 10형 AAV, 11형 AAV, 12형 AAV, 13형 AAV, 뱀 AAV, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 양 AAV, 염소 AAV, 새우 AAV, 및 현재 알려진 또는 이후에 발견되는 임의의 다른 AAV를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 문헌[Fields et al. Virology, 4th ed. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996] 참조. 추가 AAV 혈청형 및 계통군은 최근에 확인되었다. (예를 들어, 문헌[Gao et al. J. Virol. 78:6381 (2004); Moris et al. Virol. 33:375 (2004)] 참조. AAV의 다양한 혈청형의 게놈 서열뿐만 아니라 천연 ITR, Rep 단백질 및 캡시드 서브유닛의 서열은 당업계에 알려져 있다. 이러한 서열은 문헌에서 또는 GenBank와 같은 공공 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 예를 들어, GenBank 수탁 번호 NC_002077, NC_001401, NC_001729, NC_001863, NC_001829, NC_001862, NC_000883, NC_001701, NC_001510, NC_006152, NC_006261, AF063497, U89790, AF043303, AF028705, AF028704, J02275, J01901, J02275, X01457, AF288061, AH009962, AY028226, AY028223, AY631966, AX753250, EU285562, NC_001358, NC_001540, AF513851, AF513852 및 AY530579를 참조하며; 이의 개시내용은 AAV 핵산 및 아미노산 서열을 교시하기 위해 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 또한, 예를 들어, 문헌[Bantel-Schaal et al. J. Virol. 73:939 (1999); Chiorini et al. J. Virol. 71:6823 (1997); Chiorini et al. J. Virol. 73:1309 (1999); Gao et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:11854 (2002); Moris et al. Virol. 33:375 (2004); Muramatsu et al. Virol. 221:208 (1996); Ruffing et al. J. Gen. Virol. 75:3385 (1994); Rutledge et al. J. Virol. 72:309 (1998); Schmidt et al. J. Virol. 82:8911 (2008); Shade et al. J. Virol. 58:921 (1986); Srivastava et al. J. Virol. 45:555 (1983); Xiao et al. J. Virol. 73:3994 (1999)]; WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; 및 US 6,156,303을 참조하며; 이들의 개시내용은 AAV 핵산 및 아미노산 서열을 교시하기 위해 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "캡시드 단백질"은 AAV8 및 AAV9를 비롯한 AAV 바이러스 입자의 구성성분인 AAV 캡시드 단백질 중 어느 것을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "클로닝 부위"는 적합한 응집성 또는 평활 말단을 포함하는 핵산의 결찰에 의한 제한 엔도뉴클레아제-매개 클로닝을 위한 제한 부위, "오버랩 PCR 스티칭"의 상동성 및 확장에 의한 삽입 DNA의 PCR-매개 클로닝을 위한 프라이밍 부위로서 작용하는 핵산의 영역, 또는 재조합-교환 반응에 의한 표적 핵산의 재조합효소-매개 삽입을 위한 재조합 부위 또는 표적 핵산의 트랜스포존 매개 삽입뿐만 아니라 당업계에서 통상적인 다른 기법을 위한 모자이크 말단을 포함하는 핵산 서열을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "코돈"은 특정 아미노산 또는 번역을 위한 개시 또는 정지 신호를 구체화하는 주어진 전령 RNA 분자, 또는 DNA의 암호화 가닥에서의 3개의 연속적인 뉴클레오타이드 염기의 임의의 그룹을 지칭한다. 코돈이라는 용어는 또한 DNA 가닥에서의 염기 트리플렛을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, "코돈 최적화"는 DNA 암호화에 있어서 동의어 코돈(synonymous codon)(예를 들어, 동일한 아미노산을 암호화하는 코돈)의 발생 빈도가 상이한 종에서 편향된다는 원칙에 따라 핵산 서열을 변형시키는 과정을 지칭한다. 이러한 코돈 축퇴(codon degeneracy)는 동일한 폴리펩타이드가 다양한 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 것을 가능하게 한다. 이 방법에서 변형된 서열은 본 명세서에서 "코돈 최적화"로서 지칭된다. 이 과정은 발현 또는 안정성을 향상시키기 위해 본 명세서에 기재된 서열 중 어느 것에 대해 수행될 수 있다. 코돈 최적화는 각각 본 명세서에 참조에 의해 원용되는, 예를 들어, 미국 특허 제7,561,972호, 제7,561,973호 및 제7,888,112호에 기재된 것과 같은 당업계에 알려진 방식으로 수행된다. 예를 들어, 번역 개시 부위를 둘러싸는 서열은 공지된 방법에 따라 공통 Kozak 서열로 전환될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된 문헌[Kozak et al, Nucleic Acids Res.15 (20): 8125-8148]을 참조한다. 다수의 정지 코돈이 혼입될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "코돈-최적화된 인간 프라탁신 유전자" 및 "hFXNco"는 프라탁신 단백질 변이체 1(예를 들어, 서열번호 5)을 암호화하는 내인성 RNA 분자와 적어도 95%(예를 들어, 95%, 97%, 98% 또는 99%)의 서열 동일성을 나타내는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 일부 실시형태에서, hFXNco는 서열번호 1과 동일하다.
본 명세서 및 청구범위 전체적으로, 단어 "포함하다(comprise)" 또는 "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"과 같은 변형어는 언급된 정수 또는 정수의 그룹의 포함을 나타내는 것으로 이해될 것이지만, 임의의 다른 정수 또는 정수의 그룹을 제외하지는 않는다는 것이 이해될 것이다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 용어 "보존적 돌연변이", "보존적 치환" 및 "보존적 아미노산 치환"은 유사한 물리화학적 특성, 예컨대, 극성, 정전하 및 입체적 용적을 나타내는 하나 이상의 상이한 아미노산의 하나 이상의 아미노산으로의 치환을 지칭한다. 이들 특성은 이하의 표 1에서 20개의 천연 유래 아미노산 각각에 대해 요약된다.
이 표로부터, 보존적 아미노산 패밀리는, 예를 들어, (i) G, A, V, L, I, P 및 M; (ii) D 및 E; (iii) C, S 및 T; (iv) H, K 및d R; (v) N 및 Q; 및 (vi) F, Y 및 W를 포함한다. 따라서, 보존적 돌연변이 또는 치환은 하나의 아미노산을 동일한 아미노산 패밀리의 구성원으로 치환하는 것(예를 들어, Thr의 Ser으로의 또는 Arg의 Lys으로의 치환)이다).
"CpG 부위"는 사이토신 뉴클레오타이드가 길이를 따라서 뉴클레오타이드의 선형 핵산 서열에서 구아닌 뉴클레오타이드 옆에 있는 DNA 영역, 예를 들어, -C-포스페이트-G-, 1개의 포스페이트에 의해서만 분리되는 사이토신 및 구아닌, 또는 구아닌 뉴클레오타이드에 대해 5'에 있는 사이토신을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "내인성"은 특정 유기체(예를 들어, 인간)에서 또는 유기체 내의 특정 위치(예를 들어, 기관, 조직 또는 세포, 예컨대, 인간 세포)에서 자연적으로 발견되는 분자(예를 들어, 폴리펩타이드, 핵산 또는 보조인자)를 설명한다.
용어 "프라탁신"은 프라탁신 단백질을 지칭하고, 용어 "FXN"은 프라탁신 단백질을 암호화하는 유전자를 지칭한다(당업계에서 "FA", "X25", "CyaY", "FARR" 및 "MGC57199"로도 지칭됨). 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "프라탁신" 및 "FXN"은 다형성 변이체, 대립유전자, 돌연변이체 및 하기의 종간 상동체를 포함하는 폴리펩타이드 및 핵산을 각각 상호 호환 가능하게 지칭한다: (1) 바람직하게는 적어도 약 25, 50, 100, 200, 300, 400개 이상의 아미노산의 영역에 걸쳐, 또는 전장에 걸쳐, FXN 핵산에 의해 암호화된 아미노산 서열에 대해 약 905 초과의 아미노산 서열 동일성, 예를 들어, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고(서열번호 5; 예를 들어, GenBank 수탁번호 NM-000144.4(아이소폼 1) 참조; 또는 프라탁신 폴리펩타이드의 아미노산 서열(서열번호 3; 예를 들어, GenBank 수탁번호 NP-000135.2(아이소폼 1); 참조); 바람직하게는 적어도 약 25, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000개 이상의 뉴클레오타이드의 영역에 걸쳐, 또는 전장에 걸쳐, FXN 핵산(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 프라탁신 폴리뉴클레오타이드, 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 프라탁신 폴리펩타이드를 암호화하는 FXN 폴리뉴클레오타이드)에 대해 약 95% 초과, 예를 들어, 약 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 뉴클레오타이드 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "프리드라이히 운동실조증"은 염색체 9에 위치된 프라탁신을 암호화하는 유전자 FXN에서의 돌연변이(이전에 X25로 알려짐)에 의해 야기된 상염색체 열성 선천적 운동실조증을 지칭한다. 프리드라이히 운동실조증에 대한 유전적 기초는 프라탁신을 암호화하는 유전자의 인트론 영역에 GAA 트라이뉴클레오타이드 반복부와 관련된다. 이 세그먼트는 FXN 유전자 내에서 보통 5 내지 33회 반복된다. 프리드라이히 운동실조증이 있는 사람에서, GAA 세그먼트는 66 내지 1,000배 초과로 반복된다. 300배 미만으로 반복되는 GAA 세그먼트를 갖는 사람은 더 큰 GAA 트라이뉴클레오타이드 반복부를 갖는 사람보다 증상이 더 늦게(25세 이후) 나타나는 경향이 있다. 이러한 반복부의 존재는 유전자의 감소된 전사 및 발현을 초래한다. 프라탁신은 미토콘드리아 철 함량을 조절에 관련된다. FXN 유전자의 돌연변이는 신경계에 대한 진행성 손상을 야기하여, 보행 장애부터 언어 문제의 범위에 있는 증상을 초래하고; 또한 심장병 및 당뇨병으로 이어질 수 있다. 프리드라이히 운동실조증의 운동실조증은 척수에서, 특히 (소뇌와의 연결을 통해) 팔과 다리의 근육 움직임을 지시하는 데 필수적인 감각 뉴런의 퇴행으로부터 초래된다. 척수는 점점 더 얇아지고 신경 세포는 이들의 수초(신경 자극을 전달하는 데 도움이 되는 일부 신경 세포 상의 절연 덮개) 중 일부를 상실한다. 프리드라이히 운동실조증이 있는 대상체는 다음의 증상 중 하나 이상을 나타낼 수 있다: 팔다리의 근육 쇠약, 협응의 상실, 시각 장애, 청각 장애, 불분명한 발음, 척추 만곡(척추측만증), 높은 족저 아치(발의 오목발 변형), 탄수화물 불내성, 진성 당뇨병, 심장 장애(예를 들어, 심방세동, 심박 급속증 (빠른 심박수) 및 비대성 심근병증). 프리드라이히 운동실조증이 있는 대상체는 추가로 비자발적 및/또는 빠른 안구 운동, 심부건 반사의 상실, 신근 족저 반응의 상실, 진동 및 고유 감각의 상실, 심장비대, 대칭적 비대, 심장잡음 및 심장 전도 결함을 나타낼 수 있다. 병리학적 분석은 후근 신경절, 척수 소뇌로, 외측 피질 척수로 및 후주의 경화증 및 퇴행을 나타낼 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "GC 함량"은 핵산 분자에 존재하는 뉴클레오타이드의 총량에 대한 구아노신(G) 또는 사이티딘(C) 중 하나인 특정 핵산 분자, 예컨대, DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오타이드에서의 뉴클레오사이드의 양을 지칭한다. GC 함량은, 예를 들어, 다음의 식에 따라 백분율로 표현될 수 있다:
GC 함량 = ((구아노신 뉴클레오사이드의 총량) + (사이티딘 뉴클레오사이드의 총량)/(뉴클레오사이드의 총량))×100
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "유전자"는 단백질을 암호화하는 DNA의 영역을 지칭한다. 유전자는 조절 영역 및 단백질-암호화 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자는 2개 이상의 인트론 및 3개 이상의 엑손을 포함하되, 각각의 인트론은 두 엑손 사이에 개재 서열을 형성한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "인트론"은 유전자의 암호화 영역 내의 영역을 지칭하며, 이의 뉴클레오타이드 서열은 대응하는 단백질의 아미노산 서열로 번역되지 않는다. 용어 인트론은 또한 유전자로부터 전사된 RNA의 상응하는 영역을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 유전자는, 예를 들어, 최소 2개의 인트론을 포함할 수 있으며, 이들 각각은 두 엑손 사이에 개재 서열을 형성한다. 인트론은 프리(pre)-mRNA로 전사되지만, 가공 동안 제거되고, 성숙 mRNA에 포함되지 않는다.
"ITR"은 회문구조 핵산, 예를 들어, 약 120개 뉴클레오타이드 내지 약 250개 뉴클레오타이드 길이이고 헤어핀을 형성할 수 있는 반전 말단 반복부이다. 용어 "ITR"은 파보바이러스 단백질(예를 들어, Rep78/68)에 의해 인식되고 결합될 수 있는 바이러스 게놈 복제 부위를 포함한다. ITR은 임의의 아데노-연관 바이러스(AAV)로부터 유래될 수 있고, 혈청형 2가 바람직하다. ITR은 복제 단백질 결합 요소(RBE) 및 말단 분해 서열(TRS)을 포함한다. 용어 "ITR"은, ITR이 바이러스 패키징, 복제, 통합 및/또는 프로바이러스 구제(provirus rescue) 등을 매개하도록 작용하는 한, 야생형 파보바이러스 ITR(예를 들어, 야생형 핵산 서열은 삽입, 결실, 절단 또는 미스센스 돌연변이에 의해 변경될 수 있음)을 필요로 하지 않는다. "5' ITR"은 핵산 분자의 5' 경계에 위치된 파보바이러스 ITR을 의미하는 것으로 의도되며; 용어 "3' ITR"은 핵산 분자의 3' 경계에 위치된 파보바이러스 ITR을 의미하는 것으로 의도된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "변형된 뉴클레오타이드"는 하나 이상의 효소 또는 합성 화학 형질전환에 의해 변경된 뉴클레오타이드 또는 이의 일부(예를 들어, 아데노신, 구아노신, 티미딘, 사이티딘 또는 유리딘)을 지칭한다. 본 명세서에 기재되거나 당업계에 알려진 변형된 뉴클레오타이드에서 관찰된 예시적인 변경은 2-데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드의 하나 이상의 위치(예를 들어, 2', 3' 및/또는 5' 위치)에 화학적 치환체, 예컨대, 할로, 티오, 아미노, 아지도, 알킬, 아실 또는 다른 작용기의 도입을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "돌연변이"는 유전자의 뉴클레오타이드의 변화 또는 단백질의 폴리펩타이드 서열의 변화를 지칭한다. 유전자 또는 단백질의 돌연변이는, 예를 들어, DNA 복제의 오류, DNA 수선, 방사선 조사 및 발암물질에 대한 노출의 결과로서 자연적으로 발생될 수 있거나, 돌연변이는 돌연변이체 유전자를 발현시키는 이식유전자의 투여 결과로서 유도될 수 있다. 돌연변이는 단일 또는 다중 뉴클레오타이드 삽입, 결실 또는 치환으로부터 초래될 수 있다.
본 명세서에 상호 호환 가능하게 사용되는 바와 같은 "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다.
"본 명세서에 기재된 바와 같은 용어 "작동 가능하게 연결된"은 제2 모듈에 결합된 제1 분자를 지칭하되, 분자는 제1 분자가 제2 분자의 기능에 영향을 미치도록 배열된다. 두 분자는 단일 인접 분자의 부분일 수도 있고 부분이 아닐 수도 있으며, 인접할 수도 있고 인접하지 않을 수도 있다. 예를 들어, 프로모터가 세포에서 관심 대상의 전사 가능한 폴리뉴클레오타이드 분자의 전사를 조절한다면, 프로모터는 전사 가능한 폴리뉴클레오타이드 분자에 작동 가능하게 연결된다. 추가적으로, 전사 조절 요소의 두 부분은, 한 부분의 전사-활성화 기능성이 다른 부분의 존재에 의해 부정적으로 영향받지 않도록 이들이 결합된다면, 서로 작동 가능하게 연결된다. 두 전사 조절 요소는 링커 핵산(예를 들어, 개재 비-암호화 핵산)에 의해 서로 작동 가능하게 연결될 수 있거나 또는 존재하는 개재 뉴클레오타이드 없이 서로 작동 가능하게 연결될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "파보바이러스"는 자율 복제 파보바이러스 및 데펜도바이러스(dependovirus)를 포함하는 파보바이러스과(Parvoviridae)를 포괄한다. 자율 파보바이러스는 파보바이러스, 에리트로바이러스(Erythrovirus), 덴소바이러스(Densovirus), 이테라바이러스(Iteravirus) 및 콘트라바이러스(Contravirus) 속의 구성원을 포함한다. 예시적인 자율 파보바이러스는 미세 마우스 바이러스, 소 파보바이러스, 개 파보바이러스, 닭 파보바이러스, 고양이 범백혈구 감소증 바이러스, 고양이 파보바이러스, 거위 파보바이러스, H1 파보바이러스, 머스코비 오리 파보바이러스, 뱀 파보바이러스 및 B19 바이러스를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다른 자율 파보바이러스는 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Fields et al. Virology, 4th ed. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996] 참조. 데펜도바이러스 속에는 1형 AAV, 2형 AAV, 3형 AAV(3A형 및 3B형 포함), 4형 AAV, 5형 AAV, 6형 AAV, 7형 AAV, 8형 AAV, 9형 AAV, 10형 AAV, 11형 AAV, 12형 AAV, 13형 AAV, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 염소 AAV, 뱀 AAV, 말 AAV 및 양 AAV를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 아데노-연관 바이러스(AAV)가 포함된다.
참조 폴리뉴클레오타이드 도는 폴리펩타이드 서열에 대해 "서열 동일성 백분율(%)"은, 필요한 경우, 최대 서열 동일성 백분율을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후에, 참조 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열에서의 핵산 또는 아미노산과 동일한 후보 서열에서의 핵산 또는 아미노산의 백분율로서 정의된다. 핵산 또는 아미노산 서열 동일성을 결정하는 목적을 위한 정렬을 당업자의 능력 내에 있는 다양한 방법으로, 예를 들어, 공개적으로 입수 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대, BLAST, BLAST-2 또는 Megalign 소프트웨어를 이용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교 중인 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는 정렬 서열에 대해 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 예를 들어, 서열 동일성 백분율 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 BLAST를 이용하여 생성될 수 있다. 예로서, 주어진 핵산 또는 아미노산 서열인 B에, 이와의 또는 이에 대한 주어진 핵산 또는 아미노산 서열인 A의 서열 동일성 백분율(주어진 핵산 또는 아미노산 서열인 B에, 이와의 또는 이에 대해 특정 서열 동일성 백분율을 갖는 주어진 핵산 또는 아미노산 서열로서 대안적으로 표현될 수 있음)은 다음과 같이 계산된다:
100×(분수 X/Y)
여기서, X는 A 및 B의 해당 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램(예를 들어, BLAST)에 의해 동일한 매치로서 점수가 매겨진 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 수이고, Y는 B에서의 핵산의 총 수이다. 핵산 또는 아미노산 서열 A의 길이가 핵산 또는 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우에, B에 대한 A의 서열 동일성 백분율은 A에 대한 B의 서열 동일성 백분율과 동일하지 않을 것임이 인식될 것이다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "서열 동일성 백분율"을 결정 목적을 위해, RNA 분자에서의 유리딘 뉴클레오사이드는 DNA 분자의 티미딘 뉴클레오사이드와 동등한 것으로 간주된다. 따라서, RNA 등가물 및 DNA 폴리뉴클레오타이드가 RNA 등가물의 유리딘 뉴클레오사이드의 DNA 폴리뉴클레오타이드의 티미딘 뉴클레오사이드로의 치환에 의해서만 서로 다른 경우에, RNA 등가물은 DNA 폴리뉴클레오타이드와 100% 서열 동일성을 갖는 것으로 간주될 수 있다.
용어 "폴리아데닐화 신호" 또는 "폴리아데닐화 부위"는 세포에서 발현되는 RNA 분자에 대한 폴리아데노신 리보핵산의 첨가를 지시하는 데 충분한 핵산 서열을 의미하기 위해 본 명세서에서 사용된다.
"프로모터"는 전령 RNA에서의 유전자 전사의 개시를 가능하게 하는 핵산이며, 이러한 전사는 프로모터 상에서 또는 근처에서의 RNA 중합효소의 결합에 의해 개시된다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 용어 "약제학적 조성물"은 대상체에 영향을 미치거나 영향을 미칠 수 있는 특정 질환 또는 병태를 예방, 치료 또는 제어하기 위해, 대상체, 예컨대, 포유류, 예를 들어, 인간에게 투여될 치료 화합물을 함유하는 혼합물을 지칭한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 및 합리적인 유해/유익비와 비례하는 다른 문제 합병증 없이 대상체, 예컨대, 포유류(예를 들어, 인간) 조직과 접촉하는 데 적합한, 해당 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투약 형태를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 유전자의 "RNA 등가물"은 유전자를 암호화하는 DNA 폴리뉴클레오타이드에 상응하는 RNA 폴리뉴클레오타이드, 예컨대, 유전자를 포함하는 DNA 폴리뉴클레오타이드의 전사에 의해 얻을 수 있는 RNA 전사체를 지칭한다. 예시적인 RNA 등가물은 합성에 의해, 예컨대, 당업계에 알려지고/지거나 본 명세서에 기재된 고체상 핵산 합성 기법에 의해서 뿐만 아니라 재조합 핵산 제조 방법에 의해 생산된 mRNA 전사체를 포함한다.
"스페이서"는 100개 미만의 아미노산의 오픈 리딩 프레임(open reading frame: ORF)을 포함하는 적어도 1.0Kb의 임의의 폴리뉴클레오타이드이고; 총 핵산 서열의 1% 미만인 CpG 함량을 갖거나; 또는 전사 인자(TF) 결합 부위(예를 들어, 원핵 또는 바큘로바이러스 전사 인자에 의해 인식된 부위)를 포함하지 않는다. 용어 스페이서는 원핵 또는 바큘로바이러스 기점의 핵산을 포함하지 않는다. 스페이서는 천연 유래 공급원으로부터 단리되거나 변형되어, 예를 들어, ORF의 크기, CpG 함량 또는 전사 인자 결합 부위 수를 감소시킬 수 있다. 스페이서는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 촉진시키는 천연 유래 핵산, 예를 들어, ORF에 인접하여 발견된 인트론 또는 전사 개시 부위 근처에서 발견되는 인핸서로부터 선택될 수 있다. 본 명세서에 정의된 바와 같은 "스페이서"의 사용은 바이러스 입자에 패키징된 오염 핵산의 감소를 초래한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 용어 "전사 조절 요소"는 적어도 부분적으로 관심 대상의 유전자의 전사를 제어하는 핵산을 지칭한다. 전사 조절 요소는 유전자 전사를 제어하거나 제어하도록 돕는 프로모터, 인핸서 및 다른 핵산(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)을 포함할 수 있다. 전사 조절 요소의 예는, 예를 들어, 문헌[Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, CA, 1990)]에 기재되어 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 원치않는 생리적 변화, 예컨대, 프리드라이히 운동실조증을 방지하거나 늦추는(줄이는) 목적의 치료적 처치를 지칭한다. 유리한 또는 목적하는 임상 결과는 검출 가능하든 검출 가능하지 않든, 증상의 경감, 질환 정도의 축소, 안정화된(즉, 악화되지 않는) 질환 상태, 질환 진행의 지연 또는 늦춤, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 관해(부분적이든 전체적이든)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 프리드라이히 운동실조증과 관련하여, 환자의 치료는 한 가지 이상의 검출 가능한 변화, 예컨대, 프라탁신을 암호화하는 프라탁신 또는 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA, 예컨대, mRNA) 농도의 (예를 들어, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 10-배, 20-배, 30-배, 40-배, 50-배, 60-배, 70-배, 80-배, 90-배, 100-배, 500-배, 1,000-배 이상만큼의) 증가에서 나타날 수 있다. 프라탁신의 농도는 본 명세서에 기재된 ELISA 분석을 비롯한 당업계에 공지된 단백질 검출 분석을 이용하여 결정될 수 있다. 프라탁신-암호화 핵산의 농도는 본 명세서에 기재된 핵산 검출 분석(예를 들어, RNA Seq 분석)을 이용하여 결정될 수 있다. 프라탁신 단백질 및 핵산의 검출을 위한 예시적인 프로토콜은 아래의 실시예 3에 제공된다. 추가적으로, 프리드라이히 운동실조증을 앓고 있는 환자의 치료는 환자의 근기능(예를 들어, 심장 또는 골격근 기능)의 개선뿐만 아니라 근육 협응의 개선으로 나타날 수 있다. 예를 들어, 프리드라이히 운동실조증을 앓고 있는 환자의 치료는 총 프리드라이히 운동실조증 평가 척도(FARS) 점수의 (예를 들어, 치료 후 약 12주만큼) 감소로 나타날 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 용어 "벡터"는, 예컨대, 복제 및/또는 발현의 목적을 위해 세포(예를 들어, 포유류 세포, 예컨대, 인간 세포)에의 관심 대상의 유전자 전달을 위한 비히클로서 작용할 수 있는 핵산, 예를 들어, DNA 또는 RNA를 지칭한다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 함께 유용한 예시적인 벡터는 플라스미드, DNA 벡터, RNA 벡터, 비리온 또는 다른 적합한 레플리콘(예를 들어, 바이러스 벡터)이다. 원핵 또는 진핵 세포에 외인성 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 전달을 위해 다양한 벡터가 개발되었다. 이러한 발현 벡터의 예는, 예를 들어, WO 1994/11026에 개시되어 있으며, 이의 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 본 명세서에 기재된 발현 벡터는 폴리뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라, 예를 들어, 단백질의 발현 및/또는 포유류 세포 게놈에의 이들 폴리뉴클레오타이드 서열의 통합을 위해 사용되는 추가적인 서열 요소를 함유한다. 본 명세서에 기재된 이식유전자의 발현을 위해 사용될 수 있는 특정 벡터는 유전자 전사를 지시하는 조절 서열, 예컨대, 프로모터 및 인핸서 영역을 포함하는 플라스미드를 포함한다. 이식유전자의 다른 유용한 벡터는 이들 유전자의 번역 속도를 향상시키거나 유전자 전사로부터 초래되는 mRNA의 안정성 또는 핵 유출을 개선시키는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 이들 서열 요소는 발현 벡터 상에서 운반된 유전자의 효율적인 전사를 지시하기 위해, 예를 들어, 5' 및 3' 비번역 영역, 내부 리보솜 유입 부위(IRES), 및 폴리아데닐화 신호 부위를 포함한다. 본 명세서에 기재된 발현 벡터는 또한 이러한 벡터를 함유하는 세포의 선택을 위해 마커를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 적합한 마커의 예는 항생제, 예컨대, 암피실린, 클로람페니콜, 카나마이신 또는 노우르세오트리신(nourseothricin)에 대한 내성을 암호화하는 유전자를 포함한다.
상세한 설명
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 인간 프라탁신 단백질의 발현을 자극시키고 프라탁신 유전자(FXN)의 돌연변이와 관련된 장애, 예컨대, 프리드라이히 운동실조증을 치료하는 데 유용하다. 본 명세서에 기재된 조성물은 세포에서 프라탁신 단백질의 발현을 위한 코돈-최적화된 인간 FXN(hFXNco) 또는 이의 RNA 등가물을 암호화하는 플라스미드(예를 들어, 바이러스 벡터 예를 들어, 아데노-연관 바이러스(AAV))를 포함한다. 본 명세서에 기재된 플라스미드는 2개의 반전 말단 반복부(ITR; 예를 들어, 제1 ITR(ITR1) 및 제2 ITR(ITR2))를 포함하는 AAV를 포함하되, ITR1 및 ITR2를 포함하는 이들 사이의 핵산 길이는 약 3.9Kb 내지 약 4.7Kb이다. 메커니즘에 의해 제한되는 일 없이, 본 명세서에 기재된 조성물은 인간 프라탁신 단백질의 발현을 효과적으로 자극함으로써 프리드라이히 운동실조증과 관련된 병리를 개선시킬 수 있다.
본 발명은, ITR1-hFXNco-ITR2를 포함하는 핵산 분자의 전달이 세포에서의 인간 프라탁신 단백질의 발현을 유도하는 놀랍게 우수한 능력을 야기하되, ITR1 및 ITR2를 포함하는 이들 사이의 핵산 길이는 약 3.9Kb 내지 약 4.7Kb라는 발견에 적어도 부분적으로 기반한다. 이런 특성은 포유류 게놈에서, 예컨대, 프리드라이히 운동실조증이 있는 인간 환자의 게놈에서의 FXN 유전자의 돌연변이의 출현을 고려하여 특히 유익하다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법을 이용하여, 중요한, 건강한 FXN 또는 이의 RNA 전사체 및 이들의 암호화된 프라탁신 단백질 산물의 발현은 효과적으로 향상될 수 있다.
다음의 부문은 예시적인 코돈-최적화의 설명 및 본 명세서에 기재된 이러한 작제물을 암호화하는 벡터와 함께 사용될 수 있는 hFXNco를 생산하기 위한 이의 생성 방법 및 프리드라이히 운동실조증을 치료하기 위해 사용될 수 있는 방법을 제공한다.
치료 단백질
본 명세서에 기재된 방법에 따라 플라스미드(예를 들어, 바이러스 벡터)에 혼입될 수 있는 유전자는 단백질의 결핍을 특징으로 하는 질환 또는 병태(예를 들어, 프리드라이히 운동실조증)를 앓고 있는 대상체(예를 들어, 인간 환자)에게 전달될 수 있는 것과 같은 치료 단백질(예를 들어, 프라탁신)을 암호화하는 것을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 환자에게 전달될 수 있는 유전자는 프라탁신을 암호화하는 유전자를 포함한다.
한 접근에서, 본 발명은 프라탁신 단백질 변이체 1(예를 들어, 서열번호 5)을 암호화하는 내인성 RNA 분자와 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 인간 FXN(hFXN) 또는 이의 RNA 등가물을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 프라탁신 단백질 변이체 1(예를 들어, 서열번호 5)을 암호화하는 내인성 RNA 분자에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 프라탁신 단백질 변이체 1(예를 들어, 서열번호 5)을 암호화하는 내인성 RNA 분자에 대해 적어도 96%의 서열 동일성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 프라탁신 단백질 변이체 1(예를 들어, 서열번호 5)을 암호화하는 내인성 RNA 분자에 대해 적어도 97%의 서열 동일성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 프라탁신 단백질 변이체 1(예를 들어, 서열번호 5)을 암호화하는 내인성 RNA 분자에 대해 적어도 98%의 서열 동일성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 프라탁신 단백질 변이체 1(예를 들어, 서열번호 5)을 암호화하는 내인성 RNA 분자에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 프라탁신 단백질 변이체 1(예를 들어, 서열번호 5)을 암호화하는 내인성 RNA 분자와 동일하다.
일부 실시형태에서, hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 85%(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 단백질을 암호화한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 86% 동일한 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 87% 동일한 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 88% 동일한 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 89% 동일한 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 91% 동일한 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 92% 동일한 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 93% 동일한 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 94% 동일한 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 96% 동일한 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 동일한 단백질을 암호화한다.
코돈 최적화
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은, 예를 들어, 특정 세포 유형의 단백질의 향상된 발현을 달성하기 위해 관심 단백질(예를 들어, 프라탁신)을 암호화하는 유전자 또는 이의 RNA 등가물(예를 들어, FXN)의 핵산 서열을 최적화하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법을 이용하여, 유전자 및 이의 RNA 등가물은 암호화된 단백질(예를 들어, 프라탁신)의 조직-특이적 발현을 위해 최적화될 수 있다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법을 이용하여 최적화된 유전자 및 이의 RNA 등가물은 화학적 합성에 의해 합성될 수 있고, 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR)-기반 증폭 방법을 이용하여 또는 외인성 핵산을 복제할 수 있는 박테리아 세포 또는 포유류 세포와 같은 세포에 유전자의 형질감염에 의해 증폭될 수 있다.
본 명세서에 기재된 유전자 및 RNA 등가물은 중요한 임상 효용을 가질 수 있다. 프리드라이히 운동실조증과 같은 유전성 유전자 장애를 포함하는 다양한 질환 및 병태는 천연 단백질(예를 들어, 프라탁신)의 결핍증의 징후이다. 유전자 요법의 출현에 의해, 표적 세포(예를 들어, 인간 세포) 내로 외인성 단백질-암호화 핵산의 도입을 위한 다양한 벡터 및 유전자 전달 기법이 개발되었다. 그러나, 관심 세포에서 암호화된 단백질의 강하고 안정한 발현을 달성하기 위해 외인성 핵산에 의해 암호화된 이식유전자의 최적화된 변이체에 대한 요구가 남아있다.
CpG 함량 및 동형중합체 함량의 감소
코돈 최적화는 당업계에 알려진 기법에 의해 수행될 수 있다. 비제한적 예로서, 당업자는 유전자의 CpG 함량 및/또는 동형중합체 함량을 줄이는 코돈 치환을 혼입함으로써 표적 유전자의 단백질-암호화 유전자 서열을 조작할 수 있다. 예를 들어, 야생형 유전자 서열로 시작하고, 암호화된 단백질 서열의 동일성을 보존하면서 유전자의 CpG 함량 및/또는 동형중합체 함량을 감소시키는 치환(예를 들어, 단일-뉴클레오타이드 치환)을 도입할 수 있다. 이어서, 관심 세포 유형에서 암호화된 유전자(예를 들어, FXN)와 최소로 유사한 유전자 서열을 얻기 위해 위에 그리고 실시예 1에 기재한 서열 동일성 최소화 과정에 따를 수 있다. 대안적으로, 위에 기재된 서열 동일성 최소화 과정에 따라 코돈-최적화된 서열로 시작할 수 있고, 후속적으로 유전자의 CpG 함량 및/또는 동형중합체 함량을 감소시키는 돌연변이(예를 들어, 단일-뉴클레오타이드 치환)의 도입에 의해 조작될 수 있다. CpG 부위 및 동형중합체는 mRNA 번역 과정 동안 +1 틀이동을 촉진시킬 수 있다. 대안적으로, 동형중합체가 단백질 기능에 필수적이지 않은 아미노산 잔기를 암호화하는 경우(예를 들어, 암호화된 아미노산이 암호화된 효소의 활성 부위 내에 또는 다른 생물학적 분자에 대한 비공유 결합에 필수적인 부위 내에 존재하지 않는 경우), 당업자는 동형중합체를 방해하고 상응하는 아미노산의 부위에서 암호화된 단백질에 보존적 치환을 도입하는 코돈 치환을 혼입할 수 있다.
코돈-최적화된 유전자의 제조
일단 설계되면, 최종 코돈-최적화된 유전자는, 예를 들어, 당업계에 알려진 고상 핵산 절차에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자, 예컨대, DNA, RNA 등의 화학적 합성을 수행하기 위해, 포스포아미다이트 방법을 이용하는 고상 합성 과정이 사용될 수 있다. 이 절차에 따르면, 핵산은 일반적으로 다음의 단계에 의해 합성된다.
우선, 합성될 핵산의 3' 말단 단부에서 생길 5-OH-보호된 뉴클레오사이드는 뉴클레오사이드를 절단 가능 링커에 현수시킴으로써 3'-OH 작용기를 통해 고체 지지체에 대해 에스터화된다. 이어서, 뉴클레오사이드가 고정된 고상 합성을 위한 지지체는 자동화된 핵산 합성기 상에서 설정된 반응 칼럼에 위치될 수 있다.
이후에, 다음의 단계를 포함하는 반복 합성 공정은 자동화된 핵산 합성기의 합성 프로그램에 따라 반응 칼럼에서 수행될 수 있다:
Figure pct00002
(1) (예를 들어, 산-불안정 하이드록실 보호기를 제거하기 위해 다이클로로메탄 용액 중 트라이클로로아세트산 등과 같은 산에 의한) 보호된, 고정 뉴클레오사이드의 5'-OH 모이어티의 탈보호 단계;
Figure pct00003
(2) 활성제(예를 들어, 테트라졸 등)의 존재 하에 고정된 뉴클레오사이드의 탈보호된 5'-OH 기와 5-OH-보호된 뉴클레오사이드포스포아미다이트의 커플링 단계;
Figure pct00004
(3) (예를 들어, 아세트산 무수물 등에 의한) 3'-말단의 뉴클레오사이드의 비반응 5'-OH 기의 캡핑 단계; 및
Figure pct00005
(4) (예를 들어, 수성 아이오딘 등에 의한) 고정된 포스파이트 치환체의 산화 단계.
위의 과정은 필요한 경우 3'에서 5' 방향으로 핵산을 연장시키는 것이 반복될 수 있다. 5' 말단 방향은 촉진되고, 목적하는 서열을 갖는 핵산은 합성된다.
마지막으로, 절단 가능 링커는 (예를 들어, 수성 암모니아, 메틸아민 용액 등에 의해) 가수분해되어 고상 지지체로부터 합성 핵산을 절단한다. 핵산의 화학적 합성을 위한 앞서 언급한 것과 같은 절차는 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제8,835,656호에 기재되어 있고, 이의 본 개시내용은 핵산 분자의 합성을 위한 프로토콜에 관한 것으로 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
추가로, 제조된 유전자는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 또는 당업계에 알려진 PCR-기반 기법을 이용하여, 그리고/또는 설계된 유전자를 포함하는 플라스미드에 의한 DH5α 이콜라이(E. coli)의 형질전환에 의해 증폭될 수 있다. 박테리아는 후속적으로 그 안의 DNA를 증폭시키기 위해 배양될 수 있고, 유전자는 당업계에 알려진 플라스미드 정제 기법으로 단리된 후에, 선택적으로 제한효소 분해 및/또는 플라스미드의 서열분석으로 코돈-최적화된 유전자의 동일성을 확인할 수 있다.
예시적인 코돈-최적화된 인간 FXN
하나의 접근에서, 본 발명은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 85%(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 hFXNco 또는 이의 RNA 등가물을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, hFXNco 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 86% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXNco 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 87% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXNco 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 88% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXNco 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 89% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXNco 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXNco 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 91% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXNco 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 92% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXNco 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 93% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXNco 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 94% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXNco 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXNco 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXNco 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 97% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXNco 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 98% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXNco 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 99% 동일한 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, hFXNco 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열을 갖는다.
표적 세포에 대한 외인성 핵산의 전달을 위한 방법
형질감염 기법
이식유전자, 예컨대, 본 명세서에 기재된 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 이식유전자를 표적 세포에 도입하기 위해 사용될 수 있는 기법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 전기천공법은 관심 대상의 세포에 대한 정전위의 적용에 의해 포유류 세포(예를 들어, 인간 표적 세포)를 침투하는 데 사용될 수 있다. 이런 방식에서 외부 전기장 처리된 포유류 세포, 예컨대, 인간 세포는 후속적으로 외인성 핵산의 흡수의 성향이 있다. 포유류 세포의 전기천공법은, 예를 들어, 문헌[Chu et al., Nucleic Acids Res 15:1311 (1987)]에서 상세하게 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 유사한 기법인 Nucleofection™은 진핵 세포의 핵에 외인성 폴리뉴클레오타이드의 흡수를 자극하기 위해 인가된 전기장을 이용한다. Nucleofection™ 및 본 기법을 수행하는 데 유용한 프로토콜을, 예를 들어, 문헌[Distler et al., Exp. Dermatol. 14:315 (2005)]에서뿐만 아니라 US 2010/0317114에서 상세하게 기재하며, 이들 각각의 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
표적 세포의 형질감염에 유용한 추가적인 기법은 스퀴즈-포레이션 방법(squeeze-poration methodology)을 포함한다. 이 기법은 인가된 응력에 반응하여 형성되는 막 기공을 통해 외인성 DNA 흡수를 자극하기 위한 세포의 빠른 기계적 변형을 유도한다. 이 기법은 벡터가 세포, 예컨대, 인간 표적 세포에 핵산을 전달하는 데 필요하지 않다는 점에서 유리하다. 스퀴즈-포레이션은, 예를 들어, 문헌[Sharei et al., JoVE 81:e50980 (2013)]에 상세하게 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
리포펙션은 표적 세포의 형질감염에 유용한 다른 기법을 나타낸다. 이 방법은 리포좀 내로의 핵산의 부하를 수반하는데, 이는 리포좀 외부를 향해 양이온성 작용기, 예컨대, 4차 또는 양성자화된 아민을 종종 제시한다. 이는 세포막의 음이온성 특성으로 인한 리포좀과 세포 사이의 정전기적 상호작용을 촉진시키며, 이는 궁극적으로는 외인성 핵산의 흡수, 예를 들어, 세포막과 리포좀의 직접 융합에 의한 또는 복합체의 엔도사이토시스에 의한 외인성 핵산의 흡수를 야기한다. 리포펙션은, 예를 들어, 미국 특허 제7,442,386호에 상세하게 기재되며, 이의 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 외래 핵산의 흡수를 유발하는 세포막과의 이온성 상호작용을 이용하는 유사한 기법은 세포를 양이온성 중합체-핵산 복합체와 접촉시키는 것을 포함한다. 세포막과의 상호작용을 위한 바람직한 양전하를 부여하기 위해 폴리뉴클레오타이드와 회합하는 예시적인 양이온성 분자는 활성화된 덴드리머(예를 들어, 문헌[Dennig, Top Curr Chem 228:227 (2003)]에 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용됨) 및 다이에틸아미노에틸(DEAE)-덱스트란이며, 형질감염제로서의 이의 용도는, 예를 들어, 문헌[Gulick et al., Curr Protoc Mol Biol 40:I:9.2:9.2.1 (1997)]에 상세하게 기재되며, 이의 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 자기 비드는 순하고 효율적인 방식으로 표적 세포를 형질감염시키는 데 사용될 수 있는 다른 도구인데, 이 방법이 핵산의 흡수를 지시하기 위해 인가된 자기장을 이용하기 때문이다. 이 기술은, 예를 들어, US 2010/0227406호에 상세하게 기재되며, 이의 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
표적 세포에 의한 외인성 핵산 흡수를 유도하기 위한 다른 유용한 도구는 세포를 부드럽게 투과하고 폴리뉴클레오타이드가 세포막을 침투하도록 하기 위해 특정 파장의 전자기 방사선에 세포를 노출시키는 것을 수반하는 기법인 레이저펙션(laserfection)이다. 이 기법은, 예를 들어, 문헌[Rhodes et al., Methods Cell Biol. 82:309 (2007)]에 상세하게 기재되며, 이의 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
미세소포는 본 명세서에 기재된 방법에 따른 표적 세포의 게놈을 변형시키기 위해 사용될 수 있는 다른 잠재적 비히클을 나타낸다. 예를 들어, 당단백질 VSV-G와, 예를 들어, 게놈-변형 단백질, 예컨대, 뉴클레아제와의 공동과발현에 의해 유도된 미세소포는 세포내로 단백질을 효율적으로 전달하는 데 사용될 수 있으며, 이는 후속적으로, 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드, 예컨대, 유전자 또는 조절 서열의 공유 혼입을 위한 세포 게놈을 제조하기 위해 내인성 폴리뉴클레오타이드 서열의 부위-특이적 절단을 촉매한다. 진핵 세포의 유전자 변형을 위해 Gesicle로도 지칭되는 이러한 소수포의 용도는, 예를 들어, 문헌[Quinn et al., Genetic Modification of Target Cells by Direct Delivery of Active Protein [abstract]. In: Methylation changes in early embryonic genes in cancer [abstract], in: Proceedings of the 18th Annual Meeting of the American Society of Gene and Cell Therapy; 2015 May 13, Abstract No. 122]에 상세하게 기재되어 있다.
유전자 편집 기법에 의한 표적 유전자의 혼입
상기에 추가로, 표적 세포, 예컨대, 인간 세포에 관심 대상의 유전자의 혼입을 위해 사용될 수 있는 다양한 도구가 개발되었다. 표적 세포에 표적 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 혼입하기 위해 사용될 수 있는 한 가지 이러한 방법은 트랜스포존의 사용을 수반한다. 트랜스포존은 트랜스포사제 효소를 암호화하고 5' 및 3' 절단 부위에 측접되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 관심 대상의 유전자를 함유하는 폴리뉴클레오타이드이다. 일단 트랜스포존이 세포에 전달되면, 트랜스포사제 유전자의 발현이 시작되고 트랜스포존으로부터 관심 대상의 유전자를 절단하는 활성 효소를 생성한다. 이 활성은 트랜스포사제에 의한 트랜스포존 절단 부위의 부위-특이적 인식에 의해 매개된다. 일부 예에서, 이들 절단 부위는 말단 반복부 또는 역위 말단 반복부(ITR)일 수 있다. 일단 트랜스포존으로부터 절단되면, 관심 대상의 유전자는 세포의 핵 게놈 내에 존재하는 유사한 절단 부위의 트랜스포사제-촉매화된 절단에 의해 포유류 세포의 게놈에 통합될 수 있다. 이는 상보성 절단 부위에서 관심 대상의 유전자가 절단된 핵 DNA 내로 삽입되는 것을 가능하게 하며, 포유류 세포 게놈의 DNA에 관심 대상의 유전자를 결합시키는 포스포다이에스터 결합의 후속적 공유 결찰은 혼입 과정을 완료한다. 특정 경우에, 트랜스포존은, 표적 유전자를 암호화하는 유전자가 RNA 생성물로 처음 전사되고 이어서, 포유류 세포 게놈에 혼입 전에 DNA로 역전사되도록, 레트로트랜스포존일 수 있다. 예시적인 트랜스포존 시스템은 piggybac 트랜스포존(예를 들어, WO 2010/085699에 상세하게 기재됨) 및 잠자는 미녀(sleeping beauty) 트랜스포존(예를 들어, US 2005/0112764에 상세하게 기재됨)이며, 이들 각각의 개시내용은 이들이 관심 대상의 세포에 대한 유전자 전달에서 사용하기 위한 트랜스포존에 관한 것이라면 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
표적 세포의 게놈 내로 표적 유전자의 통합을 위한 다른 도구는 바이러스 감염에 대해 박테리아 및 고세균에서의 적응 방어 메커니즘으로서 본래 진화된 시스템인, 규칙적으로 삽입되어 있는 반복적인 짧은 회문구조 반복부(clustered regularly interspaced short palindromic repeats: CRISPR)/Cas 시스템이다. CRISPR/Cas 시스템은 플라스미드 DNA 및 회합된 Cas9 뉴클레아제 내의 회문구조 반복부 서열을 포함한다. DNA 및 단백질의 이런 앙상블은 외래 DNA를 CRISPR 좌위에 처음 혼입함으로써 표적 서열의 부위 특이적 DNA 절단을 지시한다. 이들 외래 서열 및 CRISPR 좌위의 반복부-스페이서 요소(repeat-spacer element)를 함유하는 폴리뉴클레오타이드는 결국 숙주 세포에서 전사되어 가이드 RNA를 생성하고, 이는 후속적으로 표적 서열로 어닐링되고, Cas9 뉴클레아제를 이 부위에 국재화할 수 있다. 이런 방식에서, 고도로 부위-특이적인 cas9-매개 DNA 절단은 cas9를 표적 DNA 분자의 근위 내로 가져오는 상호작용이 RNA:DNA 혼성화에 의해 지배되기 때문에 외래 폴리뉴클레오타이드에서 조작될 수 있다. 결과로서, 관심 대상의 임의의 표적 DNA 분자를 절단하기 위한 CRISPR/Cas 시스템을 설계할 수 있다. 이 기법은 진핵 게놈을 편집하는 데 이용될 수 있고(Hwang et al., Nat. Biotechnol. 31:227 (2013)), 표적 유전자를 암호화하는 유전자의 혼입 전에 DNA를 절단하기 위해 표적 세포 게놈을 부위 특이적으로 편집하는 것의 효율적인 수단으로서 사용될 수 있다. 유전자 발현을 조절하기 위한 CRISPR/Cas의 사용은, 예를 들어, 미국 특허 제8,697,359호에 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 게놈 편집을 위한 CRISPR/Cas 시스템의 사용에 관한 것이기 때문에 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 표적 세포에서의 관심 대상의 유전자의 혼입 전에 게놈 DNA를 부위 특이적으로 절단하기 위한 대안의 방법은 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 및 전사 활성체-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN)의 사용을 포함한다. CRISPR/Cas 시스템과 달리, 이들 효소는 특정 표적 서열에 국재화되는 가이딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하지 않는다. 표적 특이성은 대신에 이들 효소 내의 DNA 결합 도메인에 의해 제어된다. 게놈 편집 적용분야에서의 ZFN 및 TALEN의 용도는, 예를 들어, 문헌[Urnov et al., Nat. Rev. Genet. 11:636 (2010); 및 Joung et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14:49 (2013)]에 기재되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 게놈 편집을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이라면 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
표적 세포의 게놈 내로 표적 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 혼입하는 데 사용될 수 있는 추가적인 게놈 편집 기법은 게놈 DNA를 부위 특이적으로 절단하기 위해 합리적으로 설계될 수 있는 ARCUS™ 메가뉴클레아제의 사용을 포함한다. 포유류 세포의 게놈 내로 표적 유전자를 암호화하는 유전자의 혼입을 위한 이들 효소의 사용은 이러한 효소에 확립된 정해진 구조-활성 관계를 고려하여 유리하다. 측쇄 메가뉴클레아제는 목적하는 위치에서 DNA를 선택적으로 절단하여 표적 세포의 핵 DNA에 표적 유전자의 부위 특이적 혼입할 수 있게 하는 뉴클레아제를 생성하기 위해, 특정 아미노산 위치에서 변형될 수 있다. 이들 측쇄 뉴클레아제는, 예를 들어, 미국 특허 제8,021,867호 및 미국 특허 제8,445,251호에 광범위하게 기재되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 게놈 편집을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이라면 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
표적 세포에 대한 외인성 핵산의 전달을 위한 벡터
핵산 전달을 위한 바이러스 벡터
바이러스 게놈은 표적 세포(예를 들어, 포유류 세포, 예컨대, 인간 세포)의 게놈에 관심 대상의 유전자의 효율적인 전달을 위해 사용될 수 있는 벡터의 풍부한 공급원을 제공한다. 바이러스 게놈은, 이러한 게놈 내에 함유된 폴리뉴클레오타이드가 일반화 또는 전문화된 형질도입에 의해 표적 세포의 게놈에 전형적으로 혼입되기 때문에 유전자 전달을 위한 특히 유용한 벡터이다. 이들 과정은 천연 바이러스 복제 주기의 부분으로서 생기며, 유전자 통합을 유도하기 위해 첨가된 단백질 또는 시약을 필요로 하지 않는다. 바이러스 벡터의 예는 AAV, 레트로바이러스, 아데노바이러스(예를 들어, Ad5, Ad26, Ad34, Ad35 및 Ad48), 파보바이러스(예를 들어, 아데노-연관 바이러스), 코로나바이러스, 음성 가닥 RNA 바이러스, 예컨대, 오쏘믹소바이러스(예를 들어, 인플루엔자 바이러스), 랍도바이러스(예를 들어, 광견병 및 수포성 구내염 바이러스), 파라믹소바이러스(예를 들어, 홍역 및 센다이), 양성 가닥 RNA 바이러스, 예컨대, 피코르나바이러스 및 알파바이러스 및 이중 가닥 DNA 바이러스, 예를 들어, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스(예를 들어, 1 및 2형 단순포진바이러스, 엡스타인-바르 바이러스, 거대세포바이러스), 및 폭스바이러스(예를 들어, 백시니아, 변형된 백시니아 앙카라(MVA), 계두 및 카나리아 두창)를 포함한다. 본 발명의 항체 경쇄 및 중쇄 또는 항체 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 전달하는 데 유용한 다른 바이러스는, 예를 들어, 노워크 바이러스, 토가바이러스, 플라비바이러스, 레오바이러스, 파포바바이러스, 헤파드나바이러스 및 간염 바이러스를 포함한다. 레트로바이러스의 예는 조류 백혈증-육종, 포유류 C-형, B-형 바이러스, D-형 바이러스, HTLV-BLV 그룹, 렌티바이러스, 스푸마바이러스를 포함한다(Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996). 다른 예는 뮤린 백혈병 바이러스, 뮤린 육종 바이러스, 마우스 유선 종양 바이러스, 소 백혈병 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 육종 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 인간 T-세포 백혈병 바이러스, 개코원숭이 내인성 바이러스, 깁본 유인원 백혈병 바이러스, 메이슨 화이자(Mason Pfizer) 원숭이 바이러스, 시미안 면역결핍 바이러스, 시미안 육종 바이러스, 라우스 육종 바이러스 및 렌티바이러스를 포함한다. 벡터의 다른 예는, 예를 들어, 미국 특허 제5,801,030호에 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 유전자 요법에서의 사용을 위한 바이러스 벡터에 관한 것이라면 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
핵산 전달을 위한 AAV 벡터
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법의 핵산은 세포 내로 이들의 도입을 용이하게 하기 위해 재조합 AAV(rAAV) 벡터 및/또는 비리온에 혼입된다. 본 발명에서 유용한 rAAV 벡터는 (1) 발현될 이식유전자(예를 들어, 프라탁신 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드) 및 (2) 이종성 유전자의 통합 및 발현을 용이하게 하는 바이러스 핵산을 포함하는 재조합 핵산 작제물이다. 바이러스 핵산은 복제 및 비리온 내로의 DNA의 패키징(예를 들어, 기능성 ITR)을 위해 시스로 요구되는 AAV의 해당 서열을 포함할 수 있다. 전형적인 적용분야에서, 이식유전자는 프리드라이히 운동실조증을 앓고 있는 환자에서 프라탁신-결핍증을 고치는 데 유용한 프라탁신을 암호화한다. 이러한 rAAV 벡터는 또한 마커 또는 리포터 유전자를 함유할 수 있다. 유용한 rAAV 벡터는 전체 또는 부분적으로 결실된 AAV WT 유전자 중 하나 이상을 갖지만, 기능성의 측접하는 ITR 서열을 보유한다. AAV ITR은 특정 적용분야에 적합한 임의의 혈청형(예를 들어, 혈청형 2로부터 유래)을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, AAV ITR은 AAV 혈청형 2 ITR일 수 있다. rAAV 벡터를 이용하기 위한 방법은, 예를 들어, 문헌[Tal et al., J. Biomed. Sci. 7:279-291 (2000), 및 Monahan and Samulski, Gene Delivery 7:24-30 (2000)]에 기재되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 유전자 전달을 위한 AAV 벡터에 관한 것이라면 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
본 명세서에 기재된 핵산 및 벡터는 세포 내로 핵산 또는 벡터의 도입을 용이하게 하기 위해 rAAV 비리온에 혼입될 수 있다. AAV의 캡시드 단백질은 비리온의 외부, 비-핵산 부분을 구성하며 AAV 캡 유전자에 의해 암호화된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 AAV는 재조합 캡시드 단백질을 포함한다. cap 유전자는 비리온 조립체에 필요한 3가지 외피 단백질, 즉, VP1, VP2 및 VP3을 암호화한다. rAAV 비리온의 작제는, 예를 들어, 미국 특허 제5,173,414호; 제5,139,941호; 제5,863,541호; 제5,869,305호; 제6,057,152호; 및 제6,376,237호뿐만 아니라; 문헌[Rabinowitz et al., J. Virol. 76:791-801 (2002) 및 Bowles et al., J. Virol. 77:423-432 (2003)]에 기재되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 유전자 전달을 위한 AAV 벡터에 관한 것이라면 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 함께 유용한 rAAV 비리온은 AAV 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9를 포함하는 다양한 AAV 혈청형으로부터 유래된 것을 포함한다. 근세포를 표적화하기 위해, 적어도 하나의 혈청형 1 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 비리온이 특히 유용할 수 있다. 적어도 하나의 혈청형 6 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 비리온이 또한 특히 유용할 수 있는데, 혈청형 6 캡시드 단백질은 혈청형 1 캡시드 단백질과 구조적으로 유사하고, 따라서, 근세포에서 FXN의 높은 발현을 초래하는 것으로 또한 예상되기 때문이다. rAAV 혈청형 9는 또한 근세포의 효율적인 형질도입기인 것이 발견되었다. 상이한 혈청형의 AAV 벡터 및 AAV 단백질의 작제 및 용도는, 예를 들어, 문헌[Chao et al., Mol. Ther. 2:619-623 (2000); Davidson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3428-3432 (2000); Xiao et al., J. Virol. 72:2224-2232 (1998); Halbert et al., J. Virol. 74:1524-1532 (2000); Halbert et al., J. Virol. 75:6615-6624 (2001); 및 Auricchio et al., Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081 (2001)]에 기재되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 유전자 전달을 위한 AAV 벡터에 관한 것이라면 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
또한 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 함께 위형 rAAV 벡터가 유용하다. 위형 벡터는 주어진 혈청형(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 등) 이외의 혈청형으로부터 유래된 캡시드 유전자를 갖는 주어진 혈청형(예를 들어, AAV9) 위형의 AAV 벡터를 포함한다. 예를 들어, 대표적인 위형 벡터는 AAV 혈청형 2로부터 유래된 캡시드 유전자를 갖는 치료 단백질(예를 들어, 프라탁신) 위형을 암호화하는 AAV8 또는 AAV9 벡터이다. 위형 rAAV 비리온의 작제 및 용도에 관한 기법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Duan et al., J. Virol. 75:7662-7671 (2001); Halbert et al., J. Virol. 74:1524-1532 (2000); Zolotukhin et al., Methods, 28:158-167 (2002); 및 Auricchio et al., Hum. Molec. Genet., 10:3075-3081 (2001)]에 기재되어 있다.
비리온 캡시드 내에 돌연변이를 갖는 AAV 비리온은 비돌연변이 캡시드 비리온보다 더 효과적으로 특정 세포 유형을 감염시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 적합한 AAV 돌연변이체는 특정 세포 유형에 대한 AAV 표적화의 용이함을 위해 리간드 삽입 돌연변이를 가질 수 있다. 삽입 돌연변이체, 알라닌 선별 돌연변이체 및 에피토프 태그 돌연변이체를 포함하는 AAV 캡시드 돌연변이체의 작제 및 특성규명은 문헌[Wu et al., J. Virol. 74:8635-45 (2000)]에 기재되어 있다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 다른 rAAV 비리온은 바이러스의 분자 육종에 의해서 뿐만 아니라 엑손 셔플링에 의해 생성되는 해당 캡시드 혼성체를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Soong et al., Nat. Genet., 25:436-439 (2000) 및 Kolman and Stemmer, Nat. Biotechnol. 19:423-428 (2001)]을 참조한다.
예시적인 AAV 벡터
본 명세서에 기재된 바와 같이, 예시적인 AAV 벡터 구성성분은 프로모터, 인트론, 인간 FXN을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 hFXNco를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리아데닐화 부위(pA)를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, AAV는 원핵 프로모터(PEuk)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, AAV는 근육 특이적 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 근육 특이적 프로모터는 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터, 데스민 프로모터, 근육 크레아틴 키나제 프로모터, 미오신 경쇄 프로모터, 미오신 중쇄 프로모터, 심장 트로포닌 C 프로모터, 트로포닌 I 프로모터, myoD 유전자 패밀리 프로모터, 액틴 알파 프로모터, 액틴 베타 프로모터, 액틴 감마 프로모터, 또는 안구쌍 유사 호메오도메인 3의 인트론 1 내의 프로모터, 거대세포바이러스 프로모터 또는 닭-β-액틴 프로모터이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 근육 특이적 프로모터는 PGK 프로모터이다.
일부 실시형태에서, PGK 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 85%(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 핵산 서열을 갖는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, PGK 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 86% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, PGK 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 87% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, PGK 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 88% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, PGK 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 89% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, PGK 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, PGK 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 91% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, PGK 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 92% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, PGK 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 93% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, PGK 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 94% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, PGK 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, PGK 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, PGK 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 97% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, PGK 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 98% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, PGK 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 99% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, PGK 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 동일한 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, AAV는 인트론을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인트론은 SV40 인트론이다.
일부 실시형태에서, 인트론은 폴리뉴클레오타이드에 대해 5'에 위치된다.
일부 실시형태에서, hFXN 또는 이의 RNA 등가물은 프라탁신 단백질 변이체 1(예를 들어, 서열번호 5)을 암호화하는 내인성 RNA 분자와 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 프라탁신 단백질 변이체 1(예를 들어, 서열번호 5)을 암호화하는 내인성 RNA 분자에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 프라탁신 단백질 변이체 1(예를 들어, 서열번호 5)을 암호화하는 내인성 RNA 분자에 대해 적어도 96% 서열 동일성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 프라탁신 단백질 변이체 1(예를 들어, 서열번호 5)을 암호화하는 내인성 RNA 분자에 대해 적어도 97% 서열 동일성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 프라탁신 단백질 변이체 1(예를 들어, 서열번호 5)을 암호화하는 내인성 RNA 분자에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 프라탁신 단백질 변이체 1(예를 들어, 서열번호 5)을 암호화하는 내인성 RNA 분자에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 프라탁신 단백질 변이체 1(예를 들어, 서열번호 5)을 암호화하는 내인성 RNA 분자와 동일하다.
일부 실시형태에서, hFXN 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 85%(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 단백질을 암호화한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, hFXN 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 86% 동일한 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, hFXN 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 87% 동일한 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, hFXN 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 88% 동일한 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, hFXN 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 89% 동일한 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, hFXN 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, hFXN 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 91% 동일한 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, hFXN 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 92% 동일한 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, hFXN 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 93% 동일한 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, hFXN 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 94% 동일한 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, hFXN 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, hFXN 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 96% 동일한 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, hFXN 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, hFXN 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, hFXN 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, hFXN 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 동일한 단백질을 암호화한다.
일부 실시형태에서, hFXNco 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 85%(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, hFXNco 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 86% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXNco 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 87% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXNco 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 88% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXNco 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 89% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXNco 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXNco 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 91% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXNco 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 92% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXNco 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 93% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXNco 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 94% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXNco 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXNco 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXNco 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 97% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXNco 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 98% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, hFXNco 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 99% 동일한 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1의 핵산 서열과 동일한 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, AAV는 폴리아데닐화 부위(pA)를 포함한다. 예를 들어, pA 부위는 SV40 후기 폴리아데닐화 부위, SV40 초기 폴리아데닐화 부위, 인간 β-글로빈 폴리아데닐화 부위 또는 소성장 호르몬 폴리아데닐화 부위를 포함하는 비제한적 목록으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, AAV는 SV40 후기 폴리아데닐화 부위를 포함한다.
일부 실시형태에서, pA는 폴리뉴클레오타이드에 대해 3'에 위치된다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 명세서에 기재된 바와 같은 인간 포스포글리세레이트 키나제(hPGK) 프로모터, hFXNco를 포함하는 예시적인 AAV 벡터 구성성분은 아래에 나타내는 표 2의 핵산 서열, 시미안 바이러스 40(SV40) 인트론 및 SV40 후기 폴리아데닐화 부위에 의해 예시된다.
일부 실시형태에서, AAV는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 85%(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 핵산 서열을 갖는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, AAV는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 86% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, AAV는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 87% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, AAV는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 88% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, AAV는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 89% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, AAV는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, AAV는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 91% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, AAV는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 92% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, AAV는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 93% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, AAV는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 94% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, AAV는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, AAV는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, AAV는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 97% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, AAV는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 98% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, AAV는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 99% 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, AAV는 서열번호 4의 핵산 서열과 동일한 핵산 서열을 갖는다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 서열번호 4의 핵산 서열을 갖는 예시적인 AAV2/8 벡터를 아래에 나타낸다:
일부 실시형태에서, 구성성분은 ITR1-FXN-ITR2와 같이 5'에서 3' 방향으로 서로 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 구성성분은 ITR1- PEuk -FXN-ITR2와 같이 5'에서 3' 방향으로 서로 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 구성성분은 ITR1-PEuk-FXN-pA-ITR2와 같이 5'에서 3' 방향으로 서로 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 구성성분은 ITR1-PEuk-인트론-FXN-pA-ITR2와 같이 5'에서 3' 방향으로 서로 작동 가능하게 연결된다.
일부 실시형태에서, 구성성분은 ITR1-hFXNco-ITR2와 같이 5'에서 3' 방향으로 서로 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 구성성분은 ITR1-프로모터-hFXNco-ITR2와 같이 5'에서 3' 방향으로 서로 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 구성성분은 ITR1-프로모터- hFXNco-pA-ITR2와 같이 5'에서 3' 방향으로 서로 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 구성성분은 ITR1-프로모터-인트론- hFXNco-pA-ITR2와 같이 5'에서 3' 방향으로 서로 작동 가능하게 연결된다.
일부 실시형태에서, ITR1-FXN-ITR2는 함께 약 3.7Kb 내지 약 4.3Kb(예를 들어, 3.8Kb 내지 약 4.2Kb 또는 약 3.9Kb 내지 약 4.1Kb)이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, ITR1-FXN-ITR2는 함께 약 3.8Kb 내지 약 4.2Kb 길이이다. 일부 실시형태에서, ITR1-FXN-ITR2는 함께 약 3.9Kb 내지 약 4.1Kb 길이이다. 일부 실시형태에서, ITR1-FXN-ITR2는 함께 약 4.0Kb 길이이다.
일부 실시형태에서, ITR1-FXN-ITR2는 함께 약 3.7Kb 길이이다. 일부 실시형태에서, ITR1-FXN-ITR2는 함께 약 3.8Kb 길이이다. 일부 실시형태에서, ITR1-FXN-ITR2는 함께 약 3.9Kb 길이이다. 일부 실시형태에서, ITR1-FXN-ITR2는 함께 약 4.0Kb 길이이다. 일부 실시형태에서, ITR1-FXN-ITR2는 함께 약 4.1Kb 길이이다. 일부 실시형태에서, ITR1-FXN-ITR2는 함께 약 4.2Kb 길이이다. 일부 실시형태에서, ITR1-FXN-ITR2는 함께 약 4.3Kb 길이이다.
일부 실시형태에서, ITR1-hFXNco-ITR2는 함께 약 3.7Kb 내지 약 4.3Kb(예를 들어, 3.8Kb 내지 약 4.2Kb 또는 약 3.9Kb 내지 약 4.1Kb)이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, ITR1-hFXNco-ITR2는 함께 약 3.8Kb 내지 약 4.2Kb 길이이다. 일부 실시형태에서, ITR1-hFXNco-ITR2는 함께 약 3.9Kb 내지 약 4.1Kb 길이이다. 일부 실시형태에서, ITR1-hFXNco-ITR2는 함께 약 4.0Kb 길이이다.
일부 실시형태에서, ITR1-hFXNco-ITR2는 함께 약 3.7Kb 길이이다. 일부 실시형태에서, ITR1-hFXNco-ITR2는 함께 약 3.8Kb 길이이다. 일부 실시형태에서, ITR1-hFXNco-ITR2는 함께 약 3.9Kb 길이이다. 일부 실시형태에서, ITR1-hFXNco-ITR2는 함께 약 4.0Kb 길이이다. 일부 실시형태에서, ITR1-hFXNco-ITR2는 함께 약 4.1Kb 길이이다. 일부 실시형태에서, ITR1-hFXNco-ITR2는 함께 약 4.2Kb 길이이다. 일부 실시형태에서, ITR1-hFXNco-ITR2는 함께 약 4.3Kb 길이이다.
일부 실시형태에서, ITR1과 ITR2를 포함하여 이들 사이의 핵산의 길이는 약 3.9Kb 내지 약 4.7Kb(예를 들어, 약 4.0Kb 내지 약 4.6Kb, 약 4.1Kb 내지 약 4.5Kb, 약 4.2Kb 내지 약 4.4Kb, 또는 약 4.3Kb)이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, ITR1과 ITR2를 포함하여 이들 사이의 핵산의 길이는 약 4.0Kb 내지 약 4.7Kb이다. 일부 실시형태에서, ITR1과 ITR2를 포함하여 이들 사이의 핵산의 길이는 약 4.1Kb 내지 약 4.7Kb이다. 일부 실시형태에서, ITR1과 ITR2를 포함하여 이들 사이의 핵산의 길이는 약 4.2Kb 내지 약 4.7Kb이다. 일부 실시형태에서, ITR1과 ITR2를 포함하여 이들 사이의 핵산의 길이는 약 4.3Kb 내지 약 4.7Kb이다. 일부 실시형태에서, ITR1과 ITR2를 포함하여 이들 사이의 핵산의 길이는 약 4.4Kb 내지 약 4.7Kb이다. 일부 실시형태에서, ITR1과 ITR2를 포함하여 이들 사이의 핵산의 길이는 약 4.5Kb 내지 약 4.7Kb이다.
일부 실시형태에서, ITR1과 ITR2를 포함하여 이들 사이의 핵산의 길이는 약 3.9Kb이다. 일부 실시형태에서, ITR1과 ITR2를 포함하여 이들 사이의 핵산의 길이는 약 4.0Kb이다. 일부 실시형태에서, ITR1과 ITR2를 포함하여 이들 사이의 핵산의 길이는 약 4.1Kb이다. 일부 실시형태에서, ITR1과 ITR2를 포함하여 이들 사이의 핵산의 길이는 약 4.2Kb이다. 일부 실시형태에서, ITR1과 ITR2를 포함하여 이들 사이의 핵산의 길이는 약 4.3Kb이다. 일부 실시형태에서, ITR1과 ITR2를 포함하여 이들 사이의 핵산의 길이는 약 4.4Kb이다. 일부 실시형태에서, ITR1과 ITR2를 포함하여 이들 사이의 핵산의 길이는 약 4.5Kb이다. 일부 실시형태에서, ITR1과 ITR2를 포함하여 이들 사이의 핵산의 길이는 약 4.6Kb이다. 일부 실시형태에서, ITR1과 ITR2를 포함하여 이들 사이의 핵산의 길이는 약 4.7Kb이다.
일부 실시형태에서, 플라스미드(예를 들어, 전달 벡터)는 본 명세서에 기재된 바와 같이 AAV를 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라스미드는 1개 이상의(예를 들어, 2개의) 스페이서를 포함할 수 있다. 스페이서는 천연 유래 핵산 분자 또는 합성 핵산 분자를 포함할 수 있다. 천연 유래 스페이서 분자는 온라인 웹 툴, 예를 들어, UCSC 게놈 브라우저를 이용하여 확인될 수 있고, 핵산 분자의 내재된 특징, 예를 들어, 전사 개시 부위에 인접한 핵산의 자연적 발생에 기반하여 선택될 수 있다. 스페이서는 바이러스 입자에 의해 도입된 경우 독성을 생성하거나 바이러스 입자의 기능성을 억제할 수 있는 잠재적으로 부정적인 특징을 제거하도록 조작될 수 있다. 독성 및 기능성 억제 특징의 예시적인 출처는 패키징될 바이러스 게놈을 암호화하는 핵산에 인접하여 빈번하게 발견되는 오염 핵산에서 발견된다. 이러한 오염 핵산은 원핵(예를 들어, 박테리아 및 바큘로바이러스) 핵산(예를 들어, 복제기점, 2% 초과의 CpG 함량을 갖는 핵산, 오픈 리딩 프레임 및 전사 인자 결합 부위)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 오염 핵산의 포함을 최소화하도록 설계된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 SS는 100개 초과의 아미노산 길이인 오픈 리딩 프레임을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 스페이서는 원핵 전사 인자 결합 부위를 포함하지 않는다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 플라스미드는 2개의 스페이서를 포함하되, 2개의 스페이서는 제1 스페이서(SS1) 및 제2 스페이서(SS2)를 포함한다. 일부 실시형태에서, SS1 ITR1에 대해 5'에 위치되고, SS2는 ITR2에 대해 3'에 위치된다. 일부 실시형태에서, SS1은 약 1.0Kb 내지 약 5.0Kb(예를 들어, 약 1.5 내지 약 4.5Kb, 약 2.0 내지 약 4.0Kb, 또는 약 3.0Kb) 길이이다. 일부 실시형태에서, SS2는 약 1.0Kb 내지 약 5.0Kb(예를 들어, 약 1.5 내지 약 4.5Kb, 약 2.0 내지 약 4.0Kb, 또는 약 3.0Kb) 길이이다.
치료 방법
프리드라이히 운동실조증
프리드라이히 운동실조증은 프라탁신 폴리펩타이드 발현을 감소시키는 프라탁신 유전자의 유전적 변경으로부터 초래되는 신경- 및 심장 퇴행성 질환이다. 프리드라이히 운동실조증의 요법에 효과적인 제제의 확인은 영향받은 조직에서 치료적 유효량의 프라탁신의 발현을 달성하는 것과 관련된 어려움으로 인해 이전에 방해를 받았다.
본 발명은 프리드라이히 운동실조증 또는 다른 신경퇴행성 질환을 치료하기 위한 여러 기존 제제에 대한 새로운 용도의 확인에 부분적으로 기반한다. 이러한 제제는 본 명세서에 기재된 핵산 분자를 포함한다. 이러한 제제는 프리드라이히 운동실조증의 유전자이식 마우스 모델에서 프리드라이히 운동실조증의 특징적인 결핍인 프라탁신 단백질 수준을 증가시킨다.
치료를 받을 수 있는 환자는 질환 위험이 있지만 증상을 나타내지 않는 개체뿐만 아니라 현재 증상을 나타내는 환자를 포함한다. 일반적으로, 대상체는 프라탁신의 발현 수준을 저해 또는 감소시키는 돌연변이(GAA 확장 또는 점 돌연변이)에 동형접합적이다. 프라탁신 폴리펩타이드의 불충분한 발현 수준을 초래하는 프라탁신 유전자의 돌연변이에 동형접합적인 대상체에 대해, 프리드라이히 운동실조증의 증상이 발생할 위험은 일반적으로 연령에 따라 증가한다. 따라서, 프라탁신 폴리펩타이드의 불충분한 발현 수준을 초래하는 프라탁신 유전자의 돌연변이에 동형접합적인 무증상 대상체에서, 특정 실시형태에서, 예방적 적용은 3세 이상의 대상체, 예를 들어, 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16세 이상의 대상체에 대해 상정된다. 위에 기재된 바와 같은 질환의 발병이 늦거나 매우 늦은 대상체가 또한 치료될 수 있다.
일부 실시형태에서, 대상체는 프리드라이히 운동실조증의 증상, 예를 들어, 발다리의 근육 쇠약, 협응 상실(loss of coordination), 심부건 반사 상실(loss of deep tendon reflexes), 신근 족저 반응 상실(loss of extensor plantar responses), 진동 및 고유 감각의 상실, 시각 장애, 비자발적 및/또는 빠른 안구 운동, 청각 장애, 불분명한 발음, 척추 만곡(척추측만증), 높은 족저 아치(발의 오목발 변형), 탄수화물 불내성, 진성 당뇨병 및 심장 장애(예를 들어, 심방세동, 심박 급속증(빠른 심박수), 비대성 심근병증, 심장비대, 대칭적 비대, 심장잡음 및 심장 전도 결함)을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 프리드라이히 운동실조증의 치료를 필요로 하는 인간 환자의 프리드라이히 운동실조증의 치료 방법을 제공하고, 상기 방법은 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 프리드라이히 운동실조증이 있는 것으로 진단된 인간 환자에서 프라탁신 발현을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
모니터링 효능
임상 효능은 방법 중에서도 바이오마커를 이용하여 모니터링될 수 있다. 효능을 모니터링하기 위한 측정 가능한 바이오마커는 발다리의 근육 쇠약, 협응 상실, 심부건 반사의 상실, 신근 족저 반응 상실, 진동 및 고유 감각의 상실, 시각 장애, 비자발적 및/또는 빠른 안구 운동, 청각 장애, 불분명한 발음, 척추 만곡(척추측만증), 높은 족저 아치(발의 오목발 변형), 탄수화물 불내성, 진성 당뇨병 및 심장 장애(예를 들어, 심방세동, 심박 급속증(빠른 심박수), 비대성 심근병증, 심장비대, 대칭적 비대, 심장잡음 및 심장 전도 결함)를 포함하는 프리드라이히 운동실조증의 신체 증상 중 하나 이상을 모니터링하는 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 하나 이상의 증상의 안정화, 개선 및/또는 반전의 관찰은 치료 또는 예방 요법이 효과적이라는 것을 나타낸다. 하나 이상의 증상의 진행, 증상 또는 악화의 관찰은 치료 또는 예방 요법이 효과적이지 않다는 것을 나타낸다. 프리드라이히 운동실조증에서 치료를 평가하기 위한 바람직한 바이오마커는 프라탁신의 수준이다. 이 마커는 바람직하게는 단백질 수준에서 평가되지만, 프라탁신을 암호화하는 mRNA의 측정은 프라탁신 발현의 대리 척도로서 사용될 수 있다. 이러한 수준은 혈액 샘플에서 측정될 수 있다. 이러한 수준은 비질환 개체의 대조군 집단에 비해 프리드라이히 운동실조증이 있는 대상체에서 감소된다. 따라서, 수준의 증가는 바람직한 치료 반응의 표시를 제공하는 반면, 비변화 또는 감소된 수준은 바람직하지 않은 또는 적어도 최적이 아닌 치료 반응의 표시를 제공한다.
효능은 또한 후근 신경절, 척수 소뇌로, 외측 피질 척수로 및 후주의 경화증 및/또는 퇴행 수준을 결정함으로써 결정될 수 있다. 이는 의학적 영상화 기법, 예를 들어, 자기 공명 영상화 또는 단층촬영 기법, 예를 들어, 컴퓨터 단층촬영(CT) 스캔 또는 컴퓨터축단층촬영(computerized axial tomography: CAT) 스캔을 이용하여 달성될 수 있다. 경화증 및/또는 퇴행의 동일한 수준 또는 반전을 유지하는 대상체는 치료 또는 예방이 효과적이라는 것을 나타낸다. 대조적으로, 경화증 및/또는 퇴행의 높은 수준 또는 진행을 나타내는 치료 또는 예방 요법이 효과적이지 않았다는 것을 나타낸다.
특정 실시형태에서, 모니터링 방법은 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드 또는 플라스미드(예를 들어, 바이러스 벡터)의 투약량을 투여하기 전에 대상체에서 측정 가능한 바이오마커 또는 질환 파라미터의 기준선 값을 결정하는 단계, 및 치료 과정 후에 이를 동일한 측정 가능한 바이오마커 또는 파라미터에 대한 값과 비교하는 단계를 수반할 수 있다.
다른 방법에서, 측정 가능한 바이오마커 또는 파라미터의 대조군 값(즉, 평균 및 표준 편차)은 대조군 집단에 대해 결정된다. 특정 실시형태에서, 대조군 집단의 개체는 사전 치료를 받은 적이 없고, 프리드라이히 운동실조증도 갖지 않고, 프리드라이히 운동실조증이 발생할 위험도 없다. 이러한 경우에, 측정 가능한 바이오마커 또는 임상 파라미터의 값이 대조군 값에 접근하면, 치료는 효과적인 것으로 간주된다. 다른 실시형태에서, 대조군 집단의 개체는 사전 치료를 받은 적이 없고, 프리드라이히 운동실조증으로 진단되었다. 이러한 경우에, 측정 가능한 바이오마커 또는 임상 파라미터의 값이 대조군 값에 접근하면, 치료는 효과적이지 않은 것으로 간주된다.
다른 방법에서, 현재 치료를 받고 있지 않지만 이전의 치료 과정을 겪은 적이 있는 대상체는 치료의 재개가 필요한지의 여부를 결정하기 위해 바이오마커 또는 임상 파라미터 중 하나 이상에 대해 모니터링된다. 대상체에서 바이오마커 또는 임상 파라미터 중 하나 이상의 측정된 값은 이전의 치료 과정 후에 대상체에서 이전에 달성된 값과 비교될 수 있다. 대안적으로, 대상체에서 측정된 값은 치료 과정을 겪은 후 대상체 집단에서 결정된 대조군 값(평균에 표준 편차를 더한 것)과 비교될 수 있다. 대안적으로, 대상체에서 측정된 값은 질환의 증상이 없이 남아있는 예방적으로 치료된 대상체의 집단 또는 질환 특징의 개선을 나타내는 치료적으로 치료된 대상체의 집단과 비교될 수 있다. 이러한 경우에, 측정 가능한 바이오마커 또는 임상 파라미터의 값이 대조군 값에 접근하면, 치료는 효능있는 것으로 간주되고, 재개될 필요가 없다. 이러한 경우 모두에서, 대조군 수준에 대한 유의미한 차이(즉, 표준편차를 초과함)는 치료가 대상체에서 재개되어야 한다는 지표이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 핵산 분자의 투여 시, 환자는 전혈 프라탁신 수준의 변화를 나타낸다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 환자는 투여 후 약 12주까지의 전혈 프라탁신 수준의 변화를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 핵산 분자의 투여 시, 환자는 총 프리드라이히 운동실조증 평가 척도(FARS) 점수의 감소를 나타낸다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 환자는 투여 후 약 12주까지 총 FARS 점수의 감소를 나타낸다.
유전자 발현의 측정 방법
단세포 또는 세포 유형(예를 들어, 특정 조직에 속하는 세포)에 의해 발현되는 유전자의 발현 수준은, 예를 들어, 관심 유전자의 전사로부터 유래된 RNA 전사체(예를 들어, mRNA))의 농도 또는 상대 존재비를 평가함으로써 확인될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 유전자 발현은 관심 유전자의 전사 및 번역에 의해 생성된 단백질의 농도 또는 상대 존재비를 평가함으로써 결정될 수 있다. 관심 유전자가 효소 또는 전사 조절제를 각각 암호화하는 경우에, 단백질 농도는 또한 기능적 분석, 예컨대, 효소 분석 또는 유전자 전사 분석을 이용하여 평가될 수 있다. 다음의 부문은 관심 세포, 세포 유형 또는 세포 집단에서, 예를 들어, 단세포 또는 세포 집단 수준에서 유전자의 발현 수준을 측정하고 순위화하는 데 사용될 수 있는 예시적인 기법을 설명한다. 샘플 중의 유전자 발현은 핵산 서열분석, 마이크로어레이 분석, 단백질체학, 인시츄 혼성화(예를 들어, 형광 인시츄 혼성화(FISH)), 증폭-기반 분석, 인시츄 혼성화, 형광 활성화 세포 분류(FACS), 노던 분석 및/또는 mRNA의 PCR 분석을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다수의 방법에 의해 분석될 수 있고, 이들 중 다수는 당업계에 알려져 있고, 당업자에 의해 이해된다.
(i) 핵산 검출
표적 세포-특이적 유전자 발현의 분석에 적합한 핵산-기반 데이터세트는 관심 세포에서 발현된 유전자의 동일성을 나타내는 유전자 발현 프로파일 형태, 및 관심 세포, 세포 유형 또는 세포 집단 내의 유전자 발현 수준의 순위를 결정하기 위해 사용될 수 있는 유전자가 발현되는 정도를 가질 수 있다. 이러한 프로파일은 전체 전사체 서열분석 데이터(예를 들어, RNA-Seq 데이터), mRNA의 패널, 비암호화 RNA 또는 게놈 DNA로부터 발현될 수 있는 임의의 다른 핵산 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법으로 사용하기에 적합한 다른 핵산 데이터세트는 영상화-기반 기법(예를 들어, 당업계에 알려진 노던 블롯팅 또는 서던 블롯팅)에 의해 수집된 발현 데이터를 포함할 수 있다. 노던 블롯 분석은 당업계에 잘 알려진 통상적인 기법이고, 예를 들어, 문헌[Molecular Cloning, a Laboratory Manual, second edition, 1989, Sambrook, Fritch, Maniatis, Cold Spring Harbor Press, 10 Skyline Drive, Plainview, NY 11803-2500]에 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 유전자 상태 및 유전자 산물을 평가하기 위한 전형적인 프로토콜은, 예를 들어, 문헌[Ausubel et al., eds., 1995, Curr Protoc Mol Biol, Units 2 (Northern Blotting), 4 (Southern Blotting), 15 (Immunoblotting) 및 18 (PCR Analysis)]에서 발견되며, 이의 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
본 명세서에 기재된 방법과 함께 분석될 유전자 발현 프로파일은, 예를 들어, 마이크로어레이 데이터 또는 당업계에 알려진 서열분석 방법(예를 들어, 고속대량 서열분석 또는 심층 서열분석으로도 알려진 생어 서열분석 및 차세대 서열분석 방법)에 의해 생성된 핵산 서열분석 데이터를 포함할 수 있다. 예시적인 차세대 서열분석 기술은 Illumina 서열분석, Ion Torrent 서열분석, 454 서열분석, SOLiD 서열분석 및 나노포어 서열분석 플랫폼을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 당업계에 알려진 추가적인 서열분석 방법이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, mRNA 발현 수준은 RNA-Seq를 이용하여 결정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Mortazavi et al., Nat. Methods 5:621-628 (2008)]에 기재된 바와 같으며, 이의 개시내용은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용됨). RNA-Seq는 샘플 내 RNA 분자의 직접 서열분석에 의해 발현을 모니터링하기 위한 당업계에 알려진 강한 기술이다. 간략하게, 이 방법은 200개 뉴클레오타이드의 평균 길이로 RNA의 단편화, 무작위 프라이밍에 의한 cDNA로의 전환, 및 이중 가닥 cDNA의 합성(예를 들어, Agilent Technology로부터의 Just cDNA DoubleStranded cDNA 합성 키트 이용)을 수반할 수 있다. 이어서, cDNA는 각 라이브러리(예를 들어, Illumina®/Solexa제)에 대한 서열 어댑터의 첨가에 의한 서열분석용 분자 라이브러리로 전환되고, 얻어진 50 내지 100개의 뉴클레오타이드 판독은 게놈 상에 맵핑된다.
마이크로어레이 기술이 고분해능을 제공하기 때문에, 유전자 발현 수준은 마이크로어레이-기반 플랫폼(예를 들어, 단일-뉴클레오타이드 다형성(SNP) 분석)을 이용하여 결정될 수 있다. 다양한 마이크로어레이 방법의 상세한 설명은 문헌에서 찾을 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,232,068호 및 문헌[Pollack et al., Nat. Genet. 23:41-46 (1999)]을 참조하며, 이들 각각의 개시내용은 본 명세서에 이들의 전문이 참조에 의해 원용된다. 핵산 마이크로어레이를 이용하여, mRNA 샘플은 역전사되고, 표지되어 cDNA를 생성한다. 이어서, 프로브는 하나 이상의 상보적 핵산에 혼성화되어 고체 지지체 상에 어레이되고 고정될 수 있다. 예를 들어, 어레이의 각 구성원의 서열 및 위치가 알려지도록, 어레이가 구성될 수 있다. 특정 어레이 구성원과 표지된 프로브의 혼성화는 프로브가 파생된 샘플이 해당 유전자를 발현시킨다는 것을 나타낸다. 발현 수준은 혼성화된 프로브-샘플 복합체로부터 검출된 신호의 양에 따라 정량화될 수 있다. 전형적인 마이크로어레이 실험은 다음의 단계를 수반한다: 1) 샘플로부터 단리된 RNA로부터 형광 표지된 표적의 제조, 2) 마이크로어레이에 대한 표지된 표적의 혼성화, 3) 어레이의 세척, 염색 및 스캐닝, 4) 스캐닝된 영상의 분석 및 5) 유전자 발현 프로파일의 생성. 마이크로어레이 프로세서의 일례는 상업적으로 입수 가능하며 유리 표면 상에서의 올리고뉴클레오타이드의 직접 합성에 의해 제작된 어레이를 포함하는 Affymetrix GENECHIP® 시스템이다. 다른 시스템은 당업자에게 알려진 바와 같이 사용될 수 있다.
증폭-기반 분석은 또한 하나 이상의 마커(예를 들어, 유전자)의 발현 수준을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 분석에서, 유전자의 핵산 서열은 증폭 반응(예를 들어, PCR, 예컨대, qPCR)에서 주형으로서 작용한다. 정량적 증폭에서, 증폭 산물의 양은 본래 샘플에서 주형의 양에 비례한다. 적절한 대조군과의 비교는 본 명세서에 기재된 원칙에 따라 사용된 특정 프로브에 상응하는 유전자의 발현 수준의 척도를 제공한다. TaqMan 프로브를 이용하는 실시간 qPCR의 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 실시간 qPCR에 대한 상세한 프로토콜은, 예를 들어, 문헌[Gibson et al., Genome Res. 6:995-1001 (1996) 및 Heid et al., Genome Res. 6:986-994 (1996)]에 제공되며, 이들 각각의 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 본 명세서에 기재된 유전자 발현 수준은 RT-PCR 기술에 의해 결정될 수 있다. PCR을 위해 사용되는 프로브는 검출 가능 마커, 예를 들어, 방사성동위원소, 형광 화합물, 생발광 화합물, 화학발광 화합물, 금속 킬레이터 또는 효소로 표지될 수 있다.
(ii) 단백질 검출
유전자 발현은 관심 유전자에 의해 암호화된 대응하는 단백질 산물의 농도 또는 상대 존재비를 측정함으로써 추가로 결정될 수 있다. 단백질 수준은 당업계에 알려진 표준 검출 기법을 이용하여 평가될 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법에 의한 사용에 적합한 데이터를 생성하는 단백질 발현 분석의 예는 단백질체학 접근, 면역조직화학 및/또는 웨스턴 블롯 분석, 면역침전, 분자 결합 분석, ELISA, 효소-결합 면역여과 분석(ELIFA), 질량분석법, 질량분석 면역분석, 및 생화학적 효소 활성 분석을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특히, 단백질체학 방법은 다중분석에서 대규모 단백질 발현 데이터세트를 생성하는 데 사용될 수 있다. 단백질체학 방법은 샘플(예를 들어, 단세포 샘플 또는 다세포 집단)에서 발현되는 단백질의 발현 수준을 확인 및 측정하기 위해 표적 단백질의 패널에 특이적인 포획 시약(예를 들어, 항체)를 이용하여 폴리펩타이드(예를 들어, 단백질) 및/또는 펩타이드 마이크로어레이를 검출 및 정량화하도록 질량분석법을 이용할 수 있다.
예시적인 펩타이드 마이크로어레이는 기질-결합된 복수의 폴리펩타이드를 갖고, 복수의 결합된 폴리펩타이드 각각에 대한 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드 또는 단백질의 결합은 별개로 검출 가능하다. 대안적으로, 펩타이드 마이크로어레이는 단클론성 항체, 다클론성 항체, 파지 디스플레이 결합제, 효모 2-혼성체 결합제, 앱타머를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 복수의 결합제를 포함할 수 있으며, 이는 특정 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드 또는 단백질의 결합을 특이적으로 결합할 수 있다. 펩타이드 어레이의 예는 미국 특허 제6,268,210호, 제5,766,960호 및 제5,143,854호에서 찾을 수 있으며, 이들 각각의 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
질량 분석법(MS)은 단세포 또는 다세포 집단의 유전자 발현을 확인 및 특성규명하기 위해 본 명세서에 기재된 방법과 함께 사용될 수 있다. 당업계에 알려진 임의의 MS 방법, 예를 들어, LC-MS, ESI-MS, ESI-MS/MS, MALDI-TOF-MS, MALDI-TOF/TOF-MS, 탠덤 MS 등은 관심 펩타이드 또는 펩타이드를 결정, 검출 및/또는 측정하기 위해 사용될 수 있다. 질량분석기는 일반적으로 이온 공급원 및 광학 장치, 질량 분석기 및 데이터 처리 전자 장치를 포함한다. 질량 분석기는 비행시간(time-of-flight: TOF) 및 쿼드러플(Q)과 같은 스캐닝 및 이온-빔 질량 분석기, 및 트래핑 질량 분석기, 예컨대, 이온 트랩(IT), 오비트랩(Orbitrap) 및 퓨리에 변환 이온 사이클로트론 공명(FT-ICR)을 포함하며, 본 명세서에 기재된 방법에서 사용될 수 있다. 다양한 MS 방법의 상세한 설명은 문헌에서 찾을 수 있다. 예를 들어, 문헌[Yates et al., Annu. Rev. Biomed. Eng. 11:49-79 (2009)]을 참조하며, 이의 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
MS 분석 전에, 샘플에서 단백질은 화학적(예를 들어, 사이아노겐 브로마이드 절단을 통해) 또는 효소적(예를 들어, 트립신) 분해에 의해 더 작은 펩타이드로 처음 분해될 수 있다. 복합체 펩타이드 샘플은 또한 프런트-엔드(front-end) 분리 기법, 예를 들어, 2D-PAGE, HPLC, RPLC 및 친화도 크로마토그래피의 사용으로부터 유익을 얻는다. 이어서, 분해 및 선택적으로 분리된 샘플은 이온 공급원을 이용하여 이온화되어 추가 분석을 위한 하전된 분자를 생성한다. 샘플의 이온화는, 예를 들어, 전기분무 이온화(ESI), 대기압 화학 이온화(APCI), 광 이온화, 전자 이온화, 고속 원자 충격(fast atom bombardment: FAB)/액체 2차 이온화(LSIMS), 기질 보조 레이저 탈착/이온화(MALDI), 전계 전리, 전계 탈리, 열분사/플라즈마스프레이 이온화 및 입자빔 이온화에 의해 수행될 수 있다. 이온화 방법 선택에 관한 추가적인 정보는 당업자에게 알려져 있다.
이온화 후에, 이어서, 분해된 펩타이드는 단편화되어 서명 MS/MS 스펙트럼을 생성할 수 있다. MS/MS로도 알려진 탠덤 MS는 이온화를 가능하게 하는 본 명세서에 기재된 방법 다음에 복잡한 펩타이드 샘플의 단편화, 예컨대, 본 명세서에 기재된 다세포 집단으로부터 얻은 샘플에 특히 유용할 수 있다. 탠덤 MS는 MS 선택의 여러 단계를 수반하며, 단계들 사이에서 이온 단편화의 일부 형태가 발생되는데, 이는 공간에서 분리된 개개 질량 분석기 구성요소에 의해 또는 시간에 따라 분리된 MS 단계가 있는 단일 질량 분석기를 이용하여 수행될 수 있다. 공간적으로 분리된 탠덤 MS에서, 구성요소는 물리적으로 분리되고 구별되며, 요소 간 물리적 연결을 통해 고진공을 유지한다. 일시적으로 분리된 탠덤 MS에서, 시간에 따라 여러 분리 단계가 발생되면서 동일한 위치에 이온이 갇혀 분리가 달성된다. 이어서, 서명 MS/MS 스펙트럼은 펩타이드 서열 데이터베이스(예를 들어, SEQUEST)와 비교될 수 있다. 펩타이드에 대한 번역 후 변형은 또한, 예를 들어, 특정 펩타이드 변형을 가능하게 하면서 데이터베이스에 대한 스펙트럼을 검색함으로써 결정될 수 있다.
약제학적 조성물
본 명세서에 기재된 조성물, 핵산 분자 및 플라스미드는 생체내 투여에 적합한 생물학적으로 양립 가능한 형태로 프리드라이히 운동실조증을 나타내거나 이의 위험에 있는 환자, 예컨대, 인간 환자에 투여하기 위한 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 이식유전자를 포함하는 핵산 분자를 함유하는 약제학적 조성물은 전형적으로 약제학적으로 허용 가능한 희석제 또는 담체를 포함한다. 약제학적 조성물은, 예를 들어, 멸균 식염수 용액 및 핵산을 포함할 수 있다(예를 들어, 이루어질 수 있다). 멸균 식염수는 전형적으로 약제학적 등급 식염수이다. 약제학적 조성물은, 예를 들어, 멸균수 및 핵산을 포함할 수 있다(예를 들어, 이루어질 수 있다). 멸균수는 전형적으로 약제학적 등급수이다. 약제학적 조성물은, 예를 들어, 인산염-완충 식염수(PBS) 및 핵산을 포함할 수 있다(예를 들어, 이루어질 수 있다). 멸균 PBS는 전형적으로 약제학적 등급 PBS이다.
특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 1종 이상의 조성물 또는 핵산 분자 및 1종 이상의 부형제를 포함한다. 특정 실시형태에서, 부형제는 물, 염 용액, 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토스, 아밀라제, 스테아르산마그네슘, 활석, 규산, 점성 파라핀, 하이드록시메틸셀룰로스 및 폴리비닐피롤리돈으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 핵산 분자는 약제학적 조성물 또는 제형의 제조를 위해 약제학적으로 허용 가능한 활성 및/또는 비활성 물질과 혼합될 수 있다. 약제학적 조성물의 제형을 위한 조성물 및 방법은 투여 경로, 질환의 정도 또는 투여될 용량을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 기준에 따른다.
특정 실시형태에서, 핵산 분자를 포함하는 약제학적 조성물은 저해제의 임의의 약제학적으로 허용 가능한 염, 저해제의 에스터 또는 이러한 에스터의 염을 포괄한다. 특정 실시형태에서, 핵산 분자를 포함하는 약제학적 조성물은, 대상체(예를 들어, 인간)에게 투여 시, 생물학적 활성 대사물질 또는 이의 잔여물을 (직접 또는 간접적으로) 제공할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 개시내용은 또한 저해제의 약제학적으로 허용 가능한 염, 프로드러그, 이러한 프로드러그의 약제학적으로 허용 가능한 염, 및 다른 생물 등가물에 관한 것이다. 적합한 약제학적으로 허용 가능한 염은 나트륨 및 칼륨 염을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 프로드러그는 핵산 분자에 부착된 하나 이상의 접합기를 포함하되, 접합기는 신체 내의 내인성 뉴클레아제에 의해 절단된다.
지질 모이어티는 다양한 방법으로 핵산 요법에서 사용되었다. 특정 이러한 방법에서, 핵산은 양이온성 지질 및 중성 지질의 혼합물로 이루어진 미리 형성된 리포솜 또는 리포플렉스(lipoplex)에 도입된다. 특정 방법에서, 모노- 또는 폴리-양이온성 지질과의 DNA 복합체는 중성 지질의 존재 없이 형성된다. 특정 실시형태에서, 지질 모이어티는 특정 세포 또는 조직에 대한 약제학적 제제의 분포를 증가시키도록 선택된다. 특정 실시형태에서, 지질 모이어티는 지방 조직에 대한 약제학적 제제의 분포를 증가시키도록 선택된다. 특정 실시형태에서, 지질 모이어티는 근육 조직에 대한 약제학적 제제의 분포를 증가시키도록 선택된다.
특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 전달 시스템을 포함한다. 전달 시스템의 예는 리포솜 및 에멀션을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 전달 시스템은 소수성 화합물을 포함하는 것을 포함하는 특정 약제학적 조성물을 제조하는 데 유용하다. 특정 실시형태에서, 다이메틸설폭사이드와 같은 특정 유기 용매가 사용된다.
특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 발명의 1종 이상의 약제학적 제제를 특정 조직 또는 세포 유형에 전달하도록 설계된 하나 이상의 조직-특이적 전달 분자를 포함한다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 조직-특이적 항체로 코팅된 리포솜을 포함한다.
특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 공용매 시스템을 포함한다. 이러한 특정 공용매 시스템은, 예를 들어, 벤질 알코올, 비극성 계면활성제, 수혼화성 유기 중합체 및 수성상을 포함한다. 특정 실시형태에서, 이러한 공용매 시스템은 소수성 화합물에 대해 사용된다. 이러한 공용매 시스템의 비제한적 예는 3% w/v 벤질 알코올을 포함하는 무수 에탄올, 8% w/v의 비극성 계면활성제 Polysorbate 80™ 및 65% w/v 폴리에틸렌 글리콜 300의 용액인, VPD 공용매 시스템이다. 이러한 공용매 시스템의 비율은 이들의 용해도 및 독성 특징을 유의미하게 변경하는 일 없이 상당히 달라질 수 있다. 더 나아가, 공용매 성분의 동일성은 달라질 수 있으며: 예를 들어, 기타 계면활성제가 Polysorbate 80™ 대신 사용될 수 있고; 폴리에틸렌 글리콜의 분획 크기는 달라질 수 있고; 다른 생체 적합 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 예를 들어, 폴리비닐 피롤리돈을 대체할 수 있고; 기타 당 또는 다당류는 덱스트로스를 대체할 수 있다.
특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 경구 투여용으로 제조된다. 특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 협측 투여용으로 제조된다. 특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 주사(예를 들어, 안구내(예를 들어, 유리체내), 정맥내, 피하, 근육내, 척추강내, 뇌실내, 뇌실질내 등)에 의한 투여용으로 제조된다. 특정 이러한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 담체를 포함하고, 수용액, 예컨대 물 또는 생리적으로 양립 가능한 완충제, 예컨대, 행크스 용액, 링거 용액 또는 생리 식염수 완충제에서 제형화된다. 특정 실시형태에서, 기타 성분(예를 들어, 용해성을 돕거나 보존제로서 작용하는 성분)이 포함된다. 특정 실시형태에서, 주사 가능 현탁액은 적절한 액체 담체, 현탁제 등을 이용하여 제조된다. 주사를 위한 특정 약제학적 조성물은 단위 투약 형태로, 예를 들어, 앰플 도는 다회 용량 용기에 제공된다. 주사를 위한 특정 약제학적 조성물은 현탁액, 유성 또는 수성 비히클 중의 용액 또는 에멀션이고, 현탁제, 안정제 및/또는 분산제와 같은 제형 제제를 함유할 수 있다. 주사용 약제학적 조성물에서 사용하기에 적합한 특정 용매는 친유성 용매 및 지방 오일, 예컨대, 참깨유, 합성 지방산 에스터, 예컨대, 에틸 올리에이트 또는 트라이글리세라이드 및 리포솜을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
키트
본 명세서에 기재된 조성물은 프리드라이히 운동실조증을 치료하는 데 사용하기 위한 키트로 제공될 수 있다. 키트는 본 명세서에 기재된 바와 같은 1종 이상의 조성물, 핵산 분자, 플라스미드 또는 약제학적 조성물을 포함할 수 있다. 키트는 의사와 같은 키트의 사용자가 본 명세서에 기재된 방법 중 어느 하나를 수행하도록 지시하는 포장 삽입물을 포함할 수 있다. 키트는 선택적으로 조성물을 투여하기 위한 주사기 또는 다른 장치를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키트는 1종 이상의 추가 치료제를 포함할 수 있다.
실시예
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법이 어떻게 사용되고, 평가될 수 있는지의 설명을 당업자에게 제공하기 위해 다음의 실시예를 제시하며, 본 발명을 순전히 예시하는 것으로 의도하며, 본 발명자들의 발명으로서 본 발명자들이 간주하는 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1. 물질 및 방법
효과적인 단백질 발현을 위한 프라탁신 유전자의 코돈 최적화 및 프리드라이히 운동실조에서 인트론 트라이뉴클레오타이드 반복부 GAA 확장의 복원
인트론 DNA를 제외한 FXN 아이소폼 1 유전자 서열은 다음과 같다:
프라탁신 아이소폼 1 아미노산 서열은 다음과 같다:
서열번호 5의 분석은 유전자 전체적으로 다양한 아미노산에 대해 특정 코돈 선호도를 나타낸다. 코돈 빈도의 검사는 특정 아미노산의 경우, 특정 코돈이 지배적으로 사용되는 한편 다른 코돈은 덜 빈번하게 사용되거나 전혀 사용되지 않는다는 것을 나타낸다. 당업자는 FXN 유전자의 변이체를 합리적으로 설계하여, 예를 들어, 단백질 안정성을 증가시키고/시키거나 국소 GC 함량을 감소시키고/시키거나, mRNA 2차 구조 및 불안정 모티프를 감소시킬 수 있다. 프라탁신의 번역을 향상시키기 위해 감소된 CpG 함량 및/또는 감소된 동형중합체 함량을 포함하는 FXN 유전자의 코돈-최적화된 설계 변이체. 예를 들어, 당업자는 설계된 FXN 유전자의 CpG 함량 및/또는 동형중합체 함량을 감소시키는 코돈 치환을 혼입시킴으로써 프라탁신-암호화 유전자 서열을 조작할 수 있다(도 1). 예를 들어, 위의 FXN 아이소폼 1 유전자 서열에, 동형중합체 GGGGGG의 예가 있다. 동형중합체는 mRNA 전사체의 형성에서 그리고/또는 번역 과정 동안 틀이동 돌연변이 부위일 수 있다. 이런 동형중합체 서열이 표적 세포에서 내인성으로 발현된 유전자에 비해 유전자의 서열 동일성을 최소화한 후조차 코돈-최적화된 FXN 유전자에 남아있는 경우, 당업자는 암호화된 단백질의 동일성을 보존하면서 이런 동형중합체를 방해하는 추가 돌연변이를 혼입할 수 있다. 대안적으로, 동형중합체가 단백질 기능에 필수적이지 않은 아미노산 잔기를 암호화하는 경우(예를 들어, 암호화된 아미노산이 프라탁신의 기능을 매개하는 활성 부위(예를 들어, 철-황 클러스터의 조립체를 매개하는 활성 부위) 내에 존재하지 않는 경우), 당업자는 동형중합체를 방해하고 상응하는 아미노산의 부위에서 암호화된 단백질에 보존적 치환을 도입하는 코돈 치환을 혼입할 수 있다.
더 나아가, 최종 코돈-최적화된 유전자는 프라탁신 변이체 1(서열번호 5)을 암호화하는 내인성 RNA 분자와 적어도 95% 서열 동일성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 최종 코돈-최적화된 유전자는 프라탁신 변이체 1(서열번호 5)을 암호화하는 내인성 RNA 분자와 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타낼 수 있다. 다른 예에서, 최종 코돈-최적화된 유전자는 서열번호 1의 핵산 서열과 동일한 핵산 서열을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 코돈-최적화된 인간 FXN 유전자는 서열번호 5의 핵산 8 내지 15에 비해 핵산 서열: CCACCATG(서열번호 6)를 포함하는 변형된 Kozak 서열을 포함할 수 있다.
일단 설계되면, 최종 코돈-최적화된 유전자는, 예를 들어, 당업계에 알려진 고상 핵산 절차에 의해 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 고상 합성을 위한 기법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제5,541,307호에 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 고상 폴리뉴클레오타이드 합성 및 정제에 관한 것으로 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 추가로, 제조된 유전자는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 또는 당업계에 알려진 PCR-기반 기법을 이용하여, 그리고/또는 설계된 유전자를 포함하는 플라스미드에 의한 DH5α 이콜라이(E. coli)의 형질전환에 의해 증폭될 수 있다. 박테리아는 후속적으로 그 안의 DNA를 증폭시키기 위해 배양될 수 있고, 유전자는 당업계에 알려진 플라스미드 정제 기법으로 단리된 후에, 선택적으로 제한효소 분해 및/또는 플라스미드의 서열분석으로 코돈-최적화된 유전자의 동일성을 확인할 수 있다.
면역형광
생검 심장을 밤새 10% 포말린에 고정시켰고, 이어서, 70% 에탄올에 보존하였다. 조직을 파라핀에 포매시키고, 5-㎛ 절편으로 절단하였다.
면역형광 분석을 위해, 조직을 투과시키고, 슬라이드를 세척하고 나서, 5% 염소 혈청으로 30분 동안 차단시켰다. 절편을 1차 항체 항-프라탁신(Abcam 175402; 2㎍/㎖; 인간, 마우스 및 래트를 인식함)과 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 슬라이드를 2차 염소 항-토끼 항체(Thermo A11008; AlexaFluor 488 접합체, 4㎍/㎖)와 함께 30분 동안 인큐베이션시켰다. 평가는 프라탁신 발현의 상세한 정량화를 포함하였다.
코돈-최적화된 인간 프라탁신 작제물
PCR에 의해 HEK293 세포로부터 단리시킨 게놈 DNA로부터의 FXN 핵산 서열의 633개의 염기쌍에 결합하고 이를 증폭시키기 위해 PCR 프라이머를 설계하였다. 위에 기재한 코돈-최적화 방법을 이용하여, 단리된 FXN을 부위-지정 돌연변이유발(Stratgene)에 의해 변형시켜 CpG 함량을 감소시켰다. 얻어진 변형된 증폭 산물을 겔 정제하고, 당업계에 알려진 방법에 의해 서열분석하였다.
위형 아데노-연관 바이러스(AAV) 2/8(AAV 2/8) 원형 모 벡터를 코돈 최적화된 인간 FXN 변이체 1(hFXNco)에 대한 목표 벡터로서 사용하였다. 모 벡터는 다음의 구성성분을 갖는 핵산 분자를 포함한다: 제1 스페이서(SS1), 제1 AAV2 반전 말단 반복부(ITR1), 합성 DNA 스터퍼(stuffer), 인간 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 인트론, 후기 SV40 폴리아데닐화 부위(pA), 제2 합성 DNA 스터퍼, 제2 AAV2 ITR(ITR2), 원핵 복제기점, 제2 스페이서(SS2) 및 카나마이신 항생제 선택 유전자(KanR)(도 2). 모 벡터는 또한 제1 AAV2 ITR1에 대해 5'인 PmeI 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 포함하는 클로닝 부위; 및 제2 AAV2 ITR2에 대해 3'인 SwaI 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 포함하는 클로닝 부위를 포함한다. hFXNco를 모 벡터에 클로닝시켰고, 얻어진 벡터는: 16℃에서 1시간 동안 T4 DNA 결찰효소에 의한 결찰에 의해 매개된 바와 같은 SS1-AAV2 ITR1-PGK-SV40 인트론-SV40 LpA-AAV2 ITR2-SS2-oriC-KanR과 같이 5'에서 3' 방향으로 작동 가능하게 연결된 핵산 성분에 포함되었다. 얻어진 벡터는 서열이 확인되었다. 이러한 위에 언급된 AAV2/8-PGK-FXN 작제물은 버전 2(V2)를 나타내고, 합성 스터퍼 DNA를 결여하고 ITR1와 ITR2 사이에 1.5Kb의 더 짧은 길이를 갖는 본래의 버전(V1)을 생성하였다.
마우스 골근육 세포(C2C12)로부터 유래된 세포주를 이용하여 원리검증 실험을 수행하였다. 결과에서, 벡터 제제는 면역형광에 의해 입증된 바와 같이 형질도입된 C2C12 세포에서 강한 프라탁신 발현을 수득하였다(도 3A 및 도 3B).
프리드라이히 운동실조증 마우스 모델
FXN의 조건적 대립유전자에 대한 마우스 동형 접합체(FXN L3 /L3)를 가로무늬근-제한 엑손 4 결실을 유도하기 위해 근육 크레아틴 키나제(MCK) 프로모터의 제어 하에 근육-특이적 Cre 재조합효소 이식유전자를 지니는 FXN　엑손 4의 결실에 이형접합적인 마우스(FXN Δ /+)와 교배시켰다(예를 들어, 문헌[Puccio et al., Nat. Genet. 27(2) (2001): 181-186] 참조). 일반적으로는, 돌연변이체는 대략 7주에 체중이 감소되기 시작하고, 점진적으로 피로 증상이 나타나며, 76±10일에 사망한다.
프리드라이히 운동실조에 대한 모델로서 MCK 넉아웃(KO) 마우스를 이용하여, 코돈-최적화된 인간 프라탁신 작제물의 안전성 및 효능을 실시예 2에 기재한 바와 같이 입증하였다.
면역블롯 분석
방사면역침강법(RIPA) 완충제를 이용하여 제조된 전체 세포 추출물에 대해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 단백질을 4 내지 15% 폴리아크릴아마이드 구배-도데실 황산나트륨(SDS) 겔(Bio-Rad) 상에서 분리시키고, 나이트로셀룰로스 막(Invitrogen) 상에 옮겼다. 향상된 화학발광(Enhanced Chemiluminescence)(Perkin-Elmer)에 의해 웨스턴 블롯을 시각화하였다. 프라탁신에 대해 1차 항체를 사용하였고(Invitrogen #45-6300) 2차 항체는 Licor IR Dye 800 CW 당나귀 항-마우스였다. 결과에서, hFXNco를 암호화하는 위형 AAV2/8 바이러스 벡터는 FXN의 성숙 아이소폼을 효과적으로 발현시켰다(도 4).
실시예 2. 프리드라이히 운동실조증의 모델에서 심장 표현형에 대한 코돈-최적화된 인간 FXN 의 유효성 및 사망률
본 실시예는, 예를 들어, 심장 표현형의 개선 및 프리드라이히 운동실조증과 관련된 조기 사망률에 대해 프리드라이히 운동실조의 뮤린 모델에서 인간 및 이의 뮤린 유전자를 포함하는 코돈 최적화된 FXN 유전자의 안전성 및 효능을 기재한다.
물질 및 방법
물질 및 방법을 실시예 1에 기재한다. 본 실시예는 AAV2/8-PGK-FXN 버전 2 (V2)를 시험하였다.
결과
도 5 및 도 6A은 hFXNco(hFXN) 또는 이의 뮤린 등가물(mFXN)의 발현을 유도하기 위해 인간 PGK 프로모터를 암호화하는 예시적인 AAV2/8의 3×1013 vg/㎏ 또는 1×1014 vg/㎏; 또는 비히클 대조군을 정맥내로 투여한 FRDA MCK KO 마우스의 생존 확률을 나타낸다. 투약 4주(wk) 후에, 비히클 KO 마우스는 생존 확률의 급격한 감소를 나타낸 반면, hFXN 또는 mFXN을 투여한 마우스는 비히클 WT 대조군과 동일하게 생존하였다. 추가로, 비히클 KO 마우스와 비교할 때, hFXN 또는 mFXN을 투여한 KO 마우스에서, 암컷 및 수컷 체중(도 6B), 체중에 의해 정규화된 심장 중량(도 6C) 및 박출분율(도 6D)에서 상당한 구제(rescue)가 관찰되었다. 도 7A 및 도 7B는 각각 웨스턴 블롯으로 측정하고 벡터 복제수(VCN; 도 7A) 또는 프라탁신 단백질 수준(도 7B)에 의해 정량화한 바와 같이, 동일한 실험의 마우스로부터 취한 심장의 생검에서 프라탁신 발현 수준을 나타낸다. 심장에서, 정맥내 투여의 4주 후에 용량 수준 간에 VCN의 차이는 관찰되지 않았다. 도 7B에 나타낸 바와 같이, 도 5에 나타낸 판독과 관련하여 비히클-처리 WT 마우스(WT 평균 대략 136 ng/㎎)와 비교할 때, mFXN으로 처리한 KO 마우스에서 심장 프라탁신의 3.7 및 13.4배 증가가 관찰되었다. 더 나아가, 도 6A에 나타낸 후속 판독과 관련하여 비히클-처리 WT 마우스와 비교할 때 hFXN 또는 mFXN으로 처리한 KO 마우스에서 심장 프라탁신의 3.7- 및 23-배 증가가 관찰되었다. 도 8은 AAV2/8-PGK-FXN 투여의 4주 및 12주 후에 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)으로 측정할 때 심장 조직의 프라탁신 단백질 수준을 나타낸다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 투여 4주 후에, 비히클-처리 WT 마우스에 비해 mFXN으로 처리한 KO 마우스에서 심장 프라탁신의 3- 및 13-배 증가가 있었고, 비히클-처리 WT 마우스에 비해 hFXN으로 처리한 KO 마우스에서 심장 프라탁신의 7.3배 증가가 관찰되었다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 투여 12주 후에, 비히클-처리 WT 마우스에 비해 mFXN으로 처리한 KO 마우스에서 심장 프라탁신의 5- 및 21.2-배 증가가 있었고, 비히클-처리 WT 마우스에 비해 hFXN으로 처리한 KO 마우스에서 심장 프라탁신의 17.9배 증가가 관찰되었다. 도 9는 투약 4주 및 12주 후에 qPCR에 의해 측정된 바와 같이 심장 조직에서 검출된 이배체 게놈당 벡터 복제물 수를 나타낸다. 벡터 DNA는 투약의 4주 및 12주 후에 모든 AAV2/8-PGK-FXN 처리 KO 마우스의 심장 조직에서 검출되었지만, 시점 중 하나에서 비히클 처리 마우스에서는 검출되지 않았다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 투약 후 12주에, 3×1013 vg/㎏ mFXN 처리 마우스에 비해, hFXN 또는 1×1014 vg/㎏ mFXN 처리 마우스에서 게놈당 유의미하게 더 많은 벡터 복제물이 검출되었다.
심장 조직에서의 프라탁신 발현의 면역조직화학을 도 10A에 나타낸다. 프라탁신 발현을 나타내는 세포의 백분율은 mFXN을 암호화하는 AAV2/8 플라스미드의 3×1013 vg/㎏을 투여한 KO 마우스에서 유사하였지만(58.6%), WT 마우스(54.4%)에 비해 hFXN 또는 mFXN을 암호화하는 AAV2/8 플라스미드의 1×1014 vg/㎏을 투여한 KO 마우스에서 증가되었다(78 내지 85%)(도 10B).
웨스턴 블롯 분석은 hFXN 또는 mFXN으로 처리한 마우스로부터 채취한 조직에서의 프라탁신의 성숙 아이소폼의 발현을 나타냈다. 추가로, 심근장애 마커, 미오신 경쇄는 hFXN 또는 mFXN으로 처리한 마우스의 혈청에서 감소되었지만(도 6E), 투약 4주 후에 처리 마우스의 심장에서 겉보기 독성 또는 섬유증은 관찰되지 않았다.
종합하면, 이러한 결과는 hFXNco를 암호화하는 예시적인 AAV2/8 플라스미드가 사망률을 구하였고, 프리드라이히 운동실조의 뮤린 모델에서 심장에서 프라탁신의 상당한 발현을 유발하였다는 것을 입증하였다.
실시예 3. 프리드라이히 운동실조의 치료를 위한코돈-최적화된 FXN 유전자의 사용
프라탁신을 암호화하는 유전자는 본 명세서에 기재된 절차를 이용하여(예를 들어, 위의 실시예 1에 기재된 바와 같이) 코돈-최적화될 수 있다. 유전자는, 예를 들어, 위의 실시예 1에 기재한 바와 같이 최적화된 FXN 유전자 서열에 코돈 치환을 도입함으로써, mRNA 전사체에서 CpG 함량 및/또는 동형중합체 함량을 감소시키거나 코돈 편향을 수용하는 목적으로 코돈-최적화될 수 있다. 예를 들어, 최종 코돈-최적화된 FXN 유전자는 프라탁신 변이체 1(서열번호 5)을 암호화하는 내인성 RNA 분자와 적어도 95% 서열 동일성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 최종 코돈-최적화된 FXN 유전자는 프라탁신 변이체 1(서열번호 5)을 암호화하는 내인성 RNA 분자와 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타낼 수 있다. 다른 예에서, 최종 코돈-최적화된 유전자는 서열번호 1의 핵산 서열과 동일한 핵산 서열을 가질 수 있다.
유전자는 후속적으로 바이러스 벡터와 같은 플라스미드에 혼입되고, 프리드라이히 운동실조증을 앓고 있는 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 프리드라이히 운동실조증, 즉, FXN 유전자의 돌연변이를 특징으로 하는 장애를 앓고 있는 환자에게, 인간 세포, 예컨대, 인간 근육 세포에서의 발현을 위한 적합한 프로모터의 제어 하에 코돈-최적화된 FXN 유전자를 함유하는 바이러스 벡터를 투여할 수 있다. 예를 들어, 벡터의 5'과 3' 반전 말단 반복부 사이에 코돈-최적화된 FXN 유전자를 혼입시키는 AAV 벡터, 예컨대, 위형 AAV2/8 벡터를 생성할 수 있고, 유전자는 PGK 프로모터와 같은 근육-특이적 프로모터의 제어 하에 놓일 수 있다. AAV 벡터를 대상체에게 전신 투여할 수 있다.
당업자는 다양한 방법에 의해 코돈-최적화된 FXN 유전자의 발현을 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 당업자는 환자의 근육에서 코돈-최적화된 유전자의 발현을 모델링하기 위해 코돈-최적화된 유전자가 있는 배양 세포, 예컨대, C2C12 세포를 형질감염시킬 수 있다. 후속적으로, 암호화된 단백질의 발현을, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 발현 분석, 예컨대, qPCR, RNA-Seq, ELISA 또는 웨스턴 블롯 절차를 이용하여 모니터링할 수 있다. 유전자 발현 분석으로부터 얻은 데이터에 기반하여, 예를 들어, mRNA 전사체에서 CpG 함량 및 동형중합체 함량을 추가로 감소시키기 위해 코든 최적화 절차의 추가 반복을 수행할 수 있다. 포유류 대상체, 예컨대, 프리드라이히 운동실조증의 동물 모델 또는 인간 환자에 대한 적합한 벡터에 혼입 및 투여를 위해 시험관내 최적 발현 패턴을 갖는 후보 유전자 서열을 후속적으로 제조할 수 있다.
실시예 4. 코돈-최적화된 인간 FXN 의 투여에 의한 인간 환자에서의 프리드라이히 운동실조증의 치료
본 개시내용의 조성물 및 방법을 이용하여, 프리드라이히 운동실조증이 있는 환자(예를 들어, 3세 내지 17세)에게 PGK 프로모터에 작동 가능하게 연결된 코돈-최적화된 인간 FXN 변이체 1 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 위형 AAV2/8 벡터, 예를 들어, 서열번호 4의 핵산을 갖는 AAV 벡터를 투여할 수 있다.
코돈-최적화된 인간 FXN 변이체 1 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 위형 AAV2/8 벡터를 환자에게 투여 시, 환자는 전혈 프라탁신 수준의 변화를 나타낸다. 예를 들어, 환자는 코돈-최적화된 인간 FXN 변이체 1을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 위형 AAV2/8 벡터를 환자에게 투여한 후 약 12주까지 전혈 프라탁신 수준의 변화를 나타낸다. 추가로 또는 대안적으로, 예를 들어, 코돈-최적화된 인간 FXN 변이체 1 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 위형 AAV2/8 벡터를 환자에게 투여 시, 환자는 총 프리드라이히 운동실조증 평가 척도(FARS) 점수의 감소를 나타낸다. 예를 들어, 환자는 코돈-최적화된 인간 프라탁신 변이체 1을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 위형 AAV2/8 벡터를 환자에게 투여한 후 약 12주까지 총 FARS 점수의 감소를 나타낸다.
실시예 5. 프리드라이히 운동실조의 치료를 위한 짧은 ITR1-대-ITR2 길이를 갖는 핵산 분자 및 FXN 유전자의 사용
프라탁신을 암호화하는 유전자는 본 명세서에 기재된 절차를 이용하여(예를 들어, 위의 실시예 1에 기재된 바와 같이) 플라스미드(예를 들어, 바이러스 벡터)에 클로닝될 수 있다. 모 플라스미드는 페이로드, 예를 들어 약 3.7Kb 내지 약 4.3Kb(예를 들어, 약 3.8Kb 내지 약 4.2Kb 또는 약 3.9Kb 내지 약 4.1Kb)을 포함하는 짧은 ITR1-대-ITR2 길이를 포함할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, ITR1과 ITR2를 포함하여 이들 사이의 핵산의 길이는 약 3.9Kb 내지 약 4.7Kb(예를 들어, 약 4.0Kb 내지 약 4.6Kb, 약 4.1Kb 내지 약 4.5Kb, 약 4.2Kb 내지 약 4.4Kb, 또는 약 4.3Kb)일 수 있다. 후속적으로 모 플라스미드를 프리드라이히 운동실조증을 앓고 있는 환자에게 투여할 수 있다. 예를 들어, 프리드라이히 운동실조증, 즉, FXN 유전자의 돌연변이를 특징으로 하는 장애를 앓고 있는 환자에게 ITR1-FXN-ITR2를 포함하는 핵산 분자를 포함하는 플라스미드를 포함하는 바이러스 벡터를 투여할 수 있되, ITR1-FXN-ITR2는 함께 약 3.7Kb 내지 약 4.3Kb 길이이다. FXN 유전자는 인간 세포, 예컨대, 인간 근육 세포에서 발현을 위한 적합한 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 예를 들어, 벡터의 5'과 3' 반전 말단 반복부 사이에 코돈-최적화된 FXN 유전자를 혼입시키는 AAV 벡터, 예컨대, 위형 AAV2/8 벡터를 생성할 수 있고, 유전자는 PGK 프로모터와 같은 근육-특이적 프로모터의 제어 하에 놓일 수 있다. AAV 벡터를 대상체에게 전신 투여할 수 있다. 유전자는, 예를 들어, 위의 실시예 1에 기재한 바와 같이 최적화된 FXN 유전자 서열에 코돈 치환을 도입함으로써, mRNA 전사체에서 CpG 함량 및/또는 동형중합체 함량을 감소시키거나 코돈 편향을 수용하는 목적으로 코돈-최적화될 수 있다. 다른 예에서, 최종 코돈-최적화된 유전자는 서열번호 1의 핵산 서열과 동일한 핵산 서열을 가질 수 있다.
당업자는 다양한 방법에 의해 코돈-최적화된 FXN 유전자의 발현을 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 당업자는 환자의 근육에서 코돈-최적화된 유전자의 발현을 모델링하기 위해 코돈-최적화된 유전자가 있는 배양 세포, 예컨대, C2C12 세포를 형질감염시킬 수 있다. 후속적으로, 암호화된 단백질의 발현을, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 발현 분석, 예컨대, qPCR, RNA-Seq, ELISA 또는 웨스턴 블롯 절차를 이용하여 모니터링할 수 있다. 유전자 발현 분석으로부터 얻은 데이터에 기반하여, 예를 들어, mRNA 전사체에서 CpG 함량 및 동형중합체 함량을 추가로 감소시키기 위해 코든 최적화 절차의 추가 반복을 수행할 수 있다. 포유류 대상체, 예컨대, 프리드라이히 운동실조증의 동물 모델 또는 인간 환자에 대한 적합한 벡터에 혼입 및 투여를 위해 시험관내 최적 발현 패턴을 갖는 후보 유전자 서열을 후속적으로 제조할 수 있다.
실시예 6. 짧은 ITR1-대-ITR2 길이 및 FXN 유전자 핵산 분자의 투여에 의한 인간 환자에서의 프리드라이히 운동실조증의 치료
본 개시내용의 조성물 및 방법을 이용하여, 프리드라이히 운동실조증이 있는 환자(예를 들어, 3세 내지 17세)에게 프라탁신을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 위형 AAV2/8 벡터를 투여할 수 있되, AAV2/8은 FXN 유전자에 측접하는 ITR1 및 ITR2를 포함하고, ITR1-FXN-ITR2는 함께 약 3.7Kb 내지 약 4.3Kb(예를 들어, 약 3.8Kb 내지 약 4.2Kb 또는 약 3.9Kb 내지 약 4.1Kb) 길이이다. 추가로 또는 대안적으로, ITR1과 ITR2를 포함하여 이들 사이의 핵산의 길이는 약 3.9Kb 내지 약 4.7Kb(예를 들어, 약 4.0Kb 내지 약 4.6Kb, 약 4.1Kb 내지 약 4.5Kb, 약 4.2Kb 내지 약 4.4Kb, 또는 약 4.3Kb)일 수 있다. FXN 유전자는 인간 세포, 예컨대, 인간 근육 세포에서 발현을 위한 적합한 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 예를 들어, 유전자는 PGK 프로모터와 같은 근육-특이적 프로모터의 제어 하에 놓일 수 있다. 유전자는, 예를 들어, 위의 실시예 1에 기재한 바와 같이 최적화된 FXN 유전자 서열에 코돈 치환을 도입함으로써, mRNA 전사체에서 CpG 함량 및/또는 동형중합체 함량을 감소시키거나 코돈 편향을 수용하는 목적으로 코돈-최적화될 수 있다. 다른 예에서, 최종 코돈-최적화된 유전자는 서열번호 1의 핵산 서열과 동일한 핵산 서열을 가질 수 있다.
약 3.7Kb 내지 약 4.3Kb인 ITR1-FXN-ITR2 길이를 포함하는 위형 AAV2/8 벡터를 환자에게 투여 시, 환자는 전혈 프라탁신 수준의 변화를 나타낸다. 예를 들어, 환자는 약 3.7Kb 내지 약 4.3Kb인 ITR1-FXN-ITR2 길이를 포함하는 위형 AAV2/8 벡터를 환자에게 투여한 후 약 12주까지 전혈 프라탁신 수준의 변화를 나타낸다. 추가로 또는 대안적으로, 예를 들어, 약 3.7Kb 내지 약 4.3Kb인 ITR1-FXN-ITR2 길이를 포함하는 위형 AAV2/8 벡터를 환자에게 투여 시, 환자는 총 프리드라이히 운동실조증 평가 척도(FARS) 점수의 감소를 나타낸다. 예를 들어, 환자는 약 3.7Kb 내지 약 4.3Kb인 ITR1-FXN-ITR2 길이를 포함하는 위형 AAV2/8 벡터를 환자에게 투여한 후 약 12주까지 총 FARS 점수의 감소를 나타낸다.
실시예 7. 1.5Kb 및 4.3Kb의 ITR1- FXN -ITR2 길이를 갖는 위형 AAV2/8 벡터에서 코돈-최적화된 인간 FXN 의 발현의 비교
hFXNco의 발현을 유도하기 위해 인간 PGK 프로모터를 암호화하는 예시적인 위형 AAV 2/8 벡터의 본래 버전(V1)을 위의 실시예 1에 기재한 바와 같이 생성하였다. AAV 2/8 벡터는 다음의 구성성분을 갖는 핵산 분자를 포함한다: 제1 스페이서(SS1), 제1 AAV2 반전 말단 반복부(ITR1), 인간 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 인트론, 코돈-최적화된 인간 FXN 유전자(hFXNco) 후기 SV40 폴리아데닐화 부위(pA), 제2 AAV2 ITR(ITR2), 원핵 복제기점, 제2 스페이서(SS2) 및 카나마이신 항생제 선택 유전자(KanR).
hFXNco의 발현을 유도하기 위해 인간 PGK 프로모터를 암호화하는 예시적인 위형 AAV 2/8 벡터의 제2 버전(V2)을 위의 실시예 1에 기재한 바와 같이 생성하였다. AAV 2/8 벡터는 다음의 구성성분을 갖는 핵산 분자를 포함한다: 제1 스페이서(SS1), 제1 AAV2 반전 말단 반복부(ITR1), 합성 DNA 스터퍼, 인간 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 인트론, 코돈-최적화된 인간 FXN 유전자(hFXNco) 후기 SV40 폴리아데닐화 부위(pA), 제2 합성 DNA 스터퍼, 제2 AAV2 ITR(ITR2), 원핵 복제기점, 제2 스페이서(SS2) 및 카나마이신 항생제 선택 유전자(KanR)(도 2). AAV2/8-PGK-FXN의 이런 제2 버전(V2)은 4.3Kb의 ITR1과 ITR2 사이의 최적 서열 길이를 달성하기 위해 2개의 합성 DNA 스터퍼의 존재에 의해 V1이 다르다. AAV2/8-PGK-FXN V1과 V2의 비교를 아래의 표 3에 요약한다.
AAV2/8-PGK-FXN V2에서 FXN의 발현을 시험하기 위해, 마우스 및 인간 근육 세포주를 증가된 용량에서 AAV2/8-PGK-FXN V2로 형질도입하였다. 마우스(도 11A) 및 인간(도 11B) 근육 세포주에서 AAV2/8-PGK-FXN V2에 의한 형질도입 후 용량-의존적 FXN 발현이 관찰되었다. AAV2/8-PGK-FXN V1과 비교할 때, V2를 동일한 수준에서 발현시키고(도 12A 및 도 12B), 정확하게 가공하여 14kDa 성숙 FXN을 수득하였다(도 12C). C2C12 또는 AB1079 세포를 처리하였을 때 코돈-최적화된 인간 FXN은 AAV2/8-PGK-FXN V2에서 WT 인간 FXN과 유사한 수준의 발현을 나타냈다(도 13).
실시예 8. 프리드라이히 운동실조증의 마우스 모델에서 심장 표현형에 대한 코돈-최적화된 인간 FXN 의 유효성 및 사망률
본 실시예는, 심장 표현형의 개선 및 프리드라이히 운동실조증과 관련된 조기 사망률에 대해 프리드라이히 운동실조의 뮤린 모델에서 코돈 최적화된 FXN(hFXNco) 유전자의 안전성 및 효능을 기재한다.
물질 및 방법
프리드라이히 운동실조증 마우스 모델(위의 실시예 1에 기재)에서 코돈 최적화된 FXN 유전자의 효능 및 독성을 평가하기 위해 6주령에 hFXNco(AAV8-PGK-FXN)의 발현을 유도하기 위한 인간 PGK 프로모터를 암호화하는 예시적인 AAV8 벡터의 단일 용량의 버전 1(V1 양성 대조군) 또는 버전 2(V2)를 마우스에 정맥내로 투여하였다. 각 처리군에 대한 연구 파라미터를 아래의 표 4에 기재한다.
결과
사망률에 대한 hFXNco의 효과를 평가하기 위해 생존 연구를 수행하였다. 동물이 예정된 부검 전 다음의 조건 중 어느 것을 나타낸 경우 마우스를 안락사시켰다: 체중의 20% 초과의 감소, 호흡곤란 징후의 입증, 의미있는 자극에 대한 무반응 및/또는 전반적으로 불량한 신체 상태. 안락사 시 중앙값 연령은 비히클 처리(비형질도입 대조군)과 모든 다른 처리군 사이에 유의미한 차이가 있었고, AAV8-PGK-FXN V1 및 V2 처리 동물로부터 사망률의 용량-의존적 구제가 관찰되었다(도 14).
심장 기능은 6주령(WOA)에 시작하여 종점인 9 내지 10 WOA 또는 18 내지 19 WOA 중 하나의 연구 과정에 걸쳐 고주파 초음파를 이용하여 평가하였다(표 4에서 상세하게 설명함). AAV8-PGK-FXN V1 및 V2의 투여는 박출분율(도 15) 및 구획단축률(도 16)의 증가 및 좌심실 질량의 감소(도 17)에 의해 입증되는 바와 같이 심장 기능을 구하였다. AAV8-PGK-FXN V1 및 V2는 혈청에서 심장 손상 마커 심장 트로포닌(도 18) 및 미오신 경쇄(도 19)의 수준을 감소시켰지만, AST 및 ALT의 유의미한 변화는 관찰되지 않았다(도 20 및 도 21).
심장, 간 및 사두근에서의 벡터 복제수(VCN), mRNA 및 FXN 단백질 발현을 측정함으로써 AAV8-PGK-FXN V2의 형질도입 및 발현을 평가하였다. 심장, 간 및 사두근에서 용량-의존적 VCN이 검출되었고(도 22 내지 도 24), 대부분의 그룹의 경우 심장에서보다 사두근에서 VCN이 대략 3배 더 낮았는데(도 23), 이는 사두근보다 심장에서의 더 양호한 형질도입을 나타낸다. AAV8-PGK-FXN V2로 처리한 돌연변이체 마우스에 대해 돌연변이체 마우스의 심장 및 사두근에서 FXN mRNA가 용량-의존적 방식으로 검출되었다(도 25). 심장(도 26), 간(도 27) 및 사두근(도 28)에서 FXN 단백질 발현의 용량-의존적 증가가 있었고, AAV8-PGK-FXN V2-유도 단백질은 심장에서보다 사두근에서 훨씬 더 낮은 발현을 나타낸다.
결론
종합하면, 이러한 결과는 인간 PGK 프로모터의 제어 하에 hFXNco를 암호화하는 예시적인 AAV8 플라스미드의 V2가 사망률 및 심장 기능을 구하였고, 프리드라이히 운동실조증이 뮤린 모델에서 심장, 간 및 사두근에서 프라탁신의 상당한 발현을 유발하였다는 것을 입증한다.
실시예 9. 프리드라이히 운동실조증의 뉴런-특이적 마우스 모델에서 중추 신경계 표현형에 대한 코돈-최적화된 인간 FXN 의 유효성
본 실시예는 프리드라이히 운동실조증과 관련된 중추 신경계(CNS) 표현형의 개선을 위해 뉴런-특이적 프리드라이히 운동실조증 마우스 모델에서 코돈 최적화된 인간 FXN(hFXNco) 유전자의 효능을 기재한다.
물질 및 방법
뉴런-특이적 프리드라이히 운동실조증 마우스 모델에서 코돈 최적화된 FXN 유전자의 효능 및 독성을 평가하기 위해 8주령에 hFXNco(AAV8-PGK-FXN)의 발현을 유도하기 위한 인간 PGK 프로모터를 암호화하는 예시적인 AAV8 벡터의 단일 뇌실내(ICV) 또는 뇌실질내(IPC) 용량의 버전 1(V1 양성 대조군) 및 버전 2(V2)를 마우스에 투여하였다.
프라탁신 플록스(floxed) 엑손 2에 동형 접합적인 마우스를 PV-Cre 넉인과 프라탁신 글로벌(global) KO 둘 다에 대해 이형접합적인 마우스와 교배하여 Fxnflox/null::PV-Cre 유전자형을 유도하였고, 이는 프라탁신 좌위에서 이형접합적(각 상동 염색체 상에서 플록스 엑손 2 및 글로벌 KO)이고 PV-Cre 넉인 대립유전자에 대해 이형접합적인 화합물이다. Fxnflox/null::PV-Cre 마우스는 Cre-조건적 프라탁신 대립유전자, 글로벌 넉아웃 프라탁신 대립유전자, 파브알부민 뉴런-특이적 Cre 재조합효소 넉인 대립유전자를 가져서, 프리드라이히 운동실조증의 연구에 유용한 조기 발병 운동실조증 마우스 모델을 생성한다.
프리드라이히 운동실조에 대한 모델로서 Fxnflox/null::PV-Cre 넉아웃(KO) 마우스를 이용하여, 코돈-최적화된 인간 프라탁신 작제물의 효능을 입증하였다.
각 처리군에 대한 연구 파라미터를 아래의 표 5에 기재한다.
결과
로타로드 성능 시험을 이용하여 운동 협응에 대한 hFXNco의 효과를 평가하였다. AAV8-PGK-FXN V2에 의한 처리는 비히클(비형질도입 대조군) 돌연변이체와 비교할 때 떨어지는 시간을 유의미하게 개선시켰다(도 29).
CNS 조직에서의 벡터 복제수(VCN) 및 FXN 단백질 발현을 측정함으로써 AAV8-PGK-FXN V2의 형질도입 및 발현을 평가하였다. 8주령에 ICV를 통해 투약한 동물에서 용량-의존적 VCN 결과가 관찰되었고, 뇌 VCN은 높은 가변성을 나타낸다(도 30). IPC-투약 동물은 8주령에 ICV를 통해 투약한 동물보다 소뇌에서 100배 더 높은 VCN 및 피질에서 약 10배 더 높은 VCN을 나타냈다(도 31). 8주령에 AAV8-PGK-FXN V2를 투약한 동물에 대해 피질 및 소뇌에서 FXN 단백질 발현이 관찰되었고, IPC 주사는 소뇌에 대한 AAV8-PGK-FXN V2 전달을 개선시켰다(도 32).
질환이 뇌의 소뇌 부분에 대한 손상을 야기하기 때문에, 소뇌는 프리드라이히 운동실조증의 중요한 표시이다. AAV8-PGK-FXN V2 투약 후에, 소뇌는 다른 조직보다 동일한 양의 VCN당 더 다량의 FXN 단백질을 생성하였고(도 33), 이는 소뇌에서 치료적 유익을 위해 더 적은 AAV8-PGK-FXN V2가 필요하다는 것을 나타낸다.
신경세사 경쇄(NFLC)는 축삭 손상 후 세포외 유체에 방출되고 다수의 신경퇴행성 질환에서 중요한 바이오마커로서 인식되는 뉴런-특이적 세포골격 단백질이다. AAV8-PGK-FXN V2로 처리 후, 돌연변이체 마우스는 저하된 수준의 NFLC 신경 손상 마커를 갖는 것으로 발견되었다(도 34).
결론
종합하면, 이러한 결과는 인간 PGK 프로모터의 제어 하에 hFXNco를 암호화하는 예시적인 AAV8 플라스미드의 V2가 CNS 표현형을 구하였고, 프리드라이히 운동실조증의 뉴런-특이적 마우스 모델에서의 CNS 조직에서 프라탁신의 발현을 유발하였다는 것을 입증한다.
기타 실시형태
본 명세서에서 언급되는 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 독립적 간행물 또는 특허 출원이 참조에 의해 원용된 것으로 구체적이고 개별적으로 표시되는 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
본 발명이 이의 구체적 실시형태와 관련하여 기재되었지만, 추가 변형이 가능할 수 있고 본 출원은 일반적으로, 본 발명의 원칙에 따라 그리고 본 발명이 속하는 기술 내의 공지된 또는 관례적인 실행 내인 본 발명으로부터의 이러한 일탈을 포함하여 본 발명의 임의의 변화, 용도 또는 각색을 아우르는 것으로 의도되고 본 명세서에서 앞서 제시된 필수 특징에 적용될 수 있고, 청구범위의 범주에 따른다는 것이 이해될 것이다.
다른 실시형태는 청구범위 이내이다.
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Claims (111)

  1. 인간 프라탁신(human frataxin: hFXN) 또는 이의 RNA 등가물을 암호화하는 DNA 폴리뉴클레오타이드로서, 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖는, DNA 폴리뉴클레오타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한 핵산 서열을 갖는, 폴리뉴클레오타이드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 97% 동일한 핵산 서열을 갖는, 폴리뉴클레오타이드.
  4. 제3항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 98% 동일한 핵산 서열을 갖는, 폴리뉴클레오타이드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 99% 동일한 핵산 서열을 갖는, 폴리뉴클레오타이드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1의 핵산 서열을 갖는, 폴리뉴클레오타이드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로서, 선택적으로 상기 벡터는 플라스미드, DNA 벡터, RNA 벡터, 비리온 또는 바이러스 벡터인, 벡터.
  8. 제7항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터인, 벡터.
  9. 제8항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus: AAV), 아데노바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 단순포진 바이러스, 백시니아 바이러스 및 합성 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된, 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 AAV인, 벡터.
  11. 제10항에 있어서, 상기 AAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10 및 AAVrh74로 이루어진 군으로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터의 캡시드 단백질을 포함하는, 벡터.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 위형(pseudotyped) AAV인, 벡터.
  13. 제12항에 있어서, 상기 위형 AAV는 AAV2/8 또는 AAV2/9이되, 선택적으로 상기 위형 AAV는 AAV2/8인, 벡터.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV는 재조합 캡시드 단백질을 포함하는, 벡터.
  15. 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 근육 특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결되되, 선택적으로 상기 프로모터는 상기 폴리뉴클레오타이드에 대해 5'에 위치된, 벡터.
  16. 제15항에 있어서, 상기 근육 특이적 프로모터는 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터, 데스민 프로모터, 근육 크레아틴 키나제 프로모터, 미오신 경쇄 프로모터, 미오신 중쇄 프로모터, 심장 트로포닌 C 프로모터, 트로포닌 I 프로모터, myoD 유전자 패밀리 프로모터, 액틴 알파 프로모터, 액틴 베타 프로모터, 액틴 감마 프로모터, 또는 안구쌍 유사 호메오도메인 3의 인트론 1 내의 프로모터인, 벡터.
  17. 제16항에 있어서, 상기 근육 특이적 프로모터는 PGK 프로모터인, 벡터.
  18. 제17항에 있어서, 상기 PGK 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 벡터.
  19. 제18항에 있어서, 상기 PGK 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 벡터.
  20. 제19항에 있어서, 상기 PGK 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 PGK 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열을 갖는, 벡터.
  21. 제20항에 있어서, 상기 PGK 프로모터는 서열번호 2의 핵산을 갖는, 벡터.
  22. 제7항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 폴리아데닐화 부위(polyadenylation site: pA)를 더 포함하되, 선택적으로 상기 pA는 상기 폴리뉴클레오타이드에 대해 3'에 위치된, 벡터.
  23. 제22항에 있어서, 상기 pA 부위는 시미안 바이러스 40(SV40) 후기 폴리아데닐화 부위, SV40 초기 폴리아데닐화 부위, 인간 β-글로빈 폴리아데닐화 부위 또는 소성장 호르몬 폴리아데닐화 부위를 포함하는, 벡터.
  24. 제23항에 있어서, 상기 pA 부위는 상기 SV40 후기 폴리아데닐화 부위를 포함하는, 벡터.
  25. 제15항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 인트론을 더 포함하되, 선택적으로 상기 인트론은 상기 프로모터에 대해 3'에 그리고 상기 폴리뉴클레오타이드에 대해 5'에 위치된, 벡터.
  26. 제25항에 있어서, 상기 인트론은 SV40 인트론인, 벡터.
  27. 제10항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV는 2개의 반전 말단 반복부(inverted terminal repeat: ITR)를 더 포함하되, 상기 2개의 ITR은 제1 ITR(ITR1) 및 제2 ITR(ITR2)을 포함하고, ITR1은 상기 폴리뉴클레오타이드에 대해 5'에 위치되고 ITR2는 상기 폴리뉴클레오타이드에 대해 3'에 위치되어 ITR1-hFXN-ITR2를 포함하는 카세트를 형성하는, 벡터.
  28. 제27항에 있어서, ITR1과 ITR2 사이의 핵산의 길이는 약 3.7Kb 내지 약 4.3Kb인, 벡터.
  29. 제28항에 있어서, ITR1과 ITR2 사이의 상기 핵산의 길이는 약 3.8Kb 내지 약 4.2Kb인, 벡터.
  30. 제29항에 있어서, ITR1과 ITR2 사이의 상기 핵산의 길이는 약 3.9Kb 내지 약 4.1Kb인, 벡터.
  31. 제30항에 있어서, ITR1과 ITR2 사이의 상기 핵산의 길이는 약 4.0Kb인, 벡터.
  32. 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, ITR1과 ITR2를 포함하여 이들 사이의 상기 핵산의 길이는 약 3.9Kb 내지 약 4.7Kb인, 벡터.
  33. 제32항에 있어서, ITR1과 ITR2를 포함하여 이들 사이의 상기 핵산의 길이는 약 4.1Kb 내지 약 4.5Kb인, 벡터.
  34. 제33항에 있어서, ITR1과 ITR2를 포함하여 사이의 상기 핵산의 길이는 약 4.3Kb인, 벡터.
  35. 제27항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2개의 ITR은 AAV 혈청형 2 ITR인, 벡터.
  36. 제8항 내지 제35항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터를 암호화하는 플라스미드.
  37. 제36항에 있어서, 상기 플라스미드는 하나 이상의 스페이서 요소(spacer element)(SS)를 더 포함하는, 플라스미드.
  38. 제37항에 있어서, 상기 하나 이상의 SS는 100개 초과의 아미노산 길이인 오픈 리딩 프레임을 포함하지 않는, 플라스미드.
  39. 제37항에 있어서, 상기 하나 이상의 SS는 원핵 전사 인자 결합 부위를 포함하지 않는, 플라스미드.
  40. 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 2개의 스페이서 요소인 제1 스페이서 요소(SS1) 및 제2 스페이서 요소(SS2)를 포함하는, 플라스미드.
  41. 제40항에 있어서, 상기 SS1은 약 1.0Kb 내지 약 5.0Kb 길이인, 플라스미드.
  42. 제41항에 있어서, 상기 SS1은 약 2.0Kb 내지 약 5.0Kb 길이인, 플라스미드.
  43. 제40항 내지 제42항 중 한 항에 있어서, 상기 SS2는 약 1.0Kb 내지 약 5.0Kb 길이인, 플라스미드.
  44. 제43항에 있어서, 상기 SS2는 약 2.0Kb 내지 약 5.0Kb 길이인, 플라스미드.
  45. 제37항 내지 제44항 중 한 항에 있어서, 상기 SS는 ITR1에 대해 5'에 그리고/또는 ITR2에 대해 3'에 위치된, 플라스미드.
  46. 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SS1은 ITR1에 대해 5'에 위치되고, 상기 SS2는 ITR2에 대해 3'에 위치된, 플라스미드.
  47. 약제학적 조성물로서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물, 제7항 내지 제35항 중 어느 한 항의 벡터 또는 제36항 내지 제46항 중 어느 한 항의 플라스미드 및 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  48. 핵산 분자로서,
    (i) ITR1;
    (ii) hFXN 또는 이의 RNA 등가물; 및
    (iii) ITR2
    를 포함하되;
    상기 구성성분은 ITR1-hFXN-ITR2와 같이 5'에서 3' 방향으로 서로 작동 가능하게 연결되고; ITR1과 ITR2 사이의 핵산의 길이는 약 3.7Kb 내지 약 4.3Kb인, 핵산 분자.
  49. 제48항에 있어서, ITR1과 ITR2 사이의 상기 핵산의 길이는 약 3.8Kb 내지 약 4.2Kb인, 핵산 분자.
  50. 제49항에 있어서, ITR1과 ITR2 사이의 상기 핵산의 길이는 약 3.9Kb 내지 약 4.1Kb인, 핵산 분자.
  51. 제50항에 있어서, 상기 ITR1과 ITR2 사이의 상기 핵산의 길이는 약 4.0Kb인, 핵산 분자.
  52. 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, ITR1과 ITR2를 포함하여 이들 사이의 상기 핵산의 길이는 약 3.9Kb 내지 약 4.7Kb인, 핵산 분자.
  53. 제52항에 있어서, ITR1과 ITR2를 포함하여 이들 사이의 상기 핵산의 길이는 약 4.1Kb 내지 약 4.5Kb인, 핵산 분자.
  54. 제53항에 있어서, 상기 ITR1과 ITR2를 포함하여 이들 사이의 상기 핵산의 길이는 약 4.3Kb인, 핵산 분자.
  55. 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자는
    (iv) 진핵 프로모터(PEuk)
    를 더 포함하되,
    상기 구성성분은 ITR1-PEuk-hFXN-ITR2와 같이 5'에서 3' 방향으로 서로 작동 가능하게 연결된, 핵산 분자.
  56. 제55항에 있어서, 상기 PEuk는 근육 특이적 프로모터인, 핵산 분자.
  57. 제56항에 있어서, 상기 근육 특이적 프로모터는 PGK 프로모터, 데스민 프로모터, 근육 크레아틴 키나제 프로모터, 미오신 경쇄 프로모터, 미오신 중쇄 프로모터, 심장 트로포닌 C 프로모터, 트로포닌 I 프로모터, myoD 유전자 패밀리 프로모터, 액틴 알파 프로모터, 액틴 베타 프로모터, 액틴 감마 프로모터, 또는 안구쌍 유사 호메오도메인 3의 인트론 1 내의 프로모터, 거대세포바이러스 프로모터 또는 닭-β-액틴 프로모터인, 핵산 분자.
  58. 제57항에 있어서, 상기 근육 특이적 프로모터는 PGK 프로모터인, 핵산 분자.
  59. 제58항에 있어서, 상기 PGK 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 분자.
  60. 제59항에 있어서, 상기 PGK 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 분자.
  61. 제60항에 있어서, 상기 PGK 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 PGK 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 분자.
  62. 제61항에 있어서, 상기 PGK 프로모터는 서열번호 2의 핵산을 갖는, 핵산 분자.
  63. 제55항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자는,
    (v) pA를 더 포함하되,
    상기 구성성분은 ITR1-PEuk-hFXN-pA-ITR2와 같이 5'에서 3' 방향으로 서로 작동 가능하게 연결된, 핵산 분자.
  64. 제63항에 있어서, 상기 pA 부위는 SV40 후기 폴리아데닐화 부위, SV40 초기 폴리아데닐화 부위, 인간 β-글로빈 폴리아데닐화 부위 또는 소성장 호르몬 폴리아데닐화 부위를 포함하는, 핵산 분자.
  65. 제64항에 있어서, 상기 pA 부위는 상기 SV40 후기 폴리아데닐화 부위를 포함하는, 핵산 분자.
  66. 제63항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자는
    (vi) 인트론을 더 포함하되,
    상기 구성성분은 ITR1-PEuk-인트론-hFXN-pA-ITR2와 같이 5'에서 3' 방향으로 서로 작동 가능하게 연결된, 핵산 분자.
  67. 제66항에 있어서, 상기 인트론은 SV40 인트론인, 핵산 분자.
  68. 제48항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 hFXN 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는, 핵산 분자.
  69. 제68항에 있어서, 상기 hFXN 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는, 핵산 분자.
  70. 제69항에 있어서, 상기 hFXN 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는, 핵산 분자.
  71. 제48항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 hFXN 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 분자.
  72. 제71항에 있어서, 상기 hFXN 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 분자.
  73. 제72항에 있어서, 상기 hFXN 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 분자.
  74. 제73항에 있어서, 상기 hFXN, 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 97% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 분자.
  75. 제74항에 있어서, 상기 hFXN 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 98% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 분자.
  76. 제75항에 있어서, 상기 hFXN 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 99% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 분자.
  77. 제76항에 있어서, 상기 hFXN 또는 이의 RNA 등가물은 서열번호 1의 핵산 서열을 갖는, 핵산 분자.
  78. 제48항 내지 제77항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터로서, 선택적으로 상기 벡터는 플라스미드, DNA 벡터, RNA 벡터, 비리온 또는 바이러스 벡터인, 벡터.
  79. 제78항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터인, 벡터.
  80. 제79항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 AAV, 아데노바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 단순포진 바이러스, 백시니아 바이러스 및 합성 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된, 벡터.
  81. 제80항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 AAV인, 벡터.
  82. 제81항에 있어서, 상기 AAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10 및 AAVrh74로 이루어진 군으로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터의 캡시드 단백질을 포함하는, 벡터.
  83. 제81항 또는 제82항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 위형 AAV인, 벡터.
  84. 제83항에 있어서, 상기 위형 AAV는 AAV2/8 또는 AAV2/9이되, 선택적으로 상기 위형 AAV는 AAV2/8인, 벡터.
  85. 제78항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, ITR1 및/또는 ITR2는 파보바이러스 ITR인, 벡터.
  86. 제85항에 있어서, 상기 파보바이러스 ITR은 AAV ITR인, 벡터.
  87. 제86항에 있어서, 상기 AAV ITR은 AAV 혈청형 2 ITR인, 벡터.
  88. 제81항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV는 재조합 캡시드 단백질을 포함하는, 벡터.
  89. 제7항 내지 제35항 및 제78항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 벡터.
  90. 제89항에 있어서, 상기 벡터는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 벡터.
  91. 제90항에 있어서, 상기 벡터는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 벡터는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열을 갖는, 벡터.
  92. 제91항에 있어서, 상기 벡터는 서열번호 4의 핵산을 갖는, 벡터.
  93. 제79항 내지 제92항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터를 암호화하는, 플라스미드.
  94. 제93항에 있어서, 상기 플라스미드는 하나 이상의 SS를 더 포함하되, 상기 하나 이상의 SS는 ITR1에 대해 5'에 그리고/또는 ITR2에 대해 3'에 위치된, 플라스미드.
  95. 제94항에 있어서, 상기 플라스미드는 2개의 SS를 포함하되, 상기 2개의 SS는 SS1 및 SS2를 포함하고, SS1 ITR1에 대해 5'에 위치되고 SS2는 ITR2에 대해 3'에 위치된, 플라스미드.
  96. 제94항 또는 제95항에 있어서, 상기 하나 이상의 SS는 100개 초과의 아미노산 길이인 오픈 리딩 프레임을 포함하지 않는, 플라스미드.
  97. 제94항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 SS는 원핵 전사 인자 결합 부위를 포함하지 않는, 플라스미드.
  98. 제95항 내지 제97항 중 한 항에 있어서, 상기 SS1은 약 1.0Kb 내지 약 5.0Kb 길이인, 플라스미드.
  99. 제98항에 있어서, 상기 SS1은 약 2.0Kb 내지 약 5.0Kb 길이인, 플라스미드.
  100. 제95항 내지 제99항 중 한 항에 있어서, 상기 SS2는 약 1.0Kb 내지 약 5.0Kb 길이인, 플라스미드.
  101. 제100항에 있어서, 상기 SS2는 약 2.0Kb 내지 약 5.0Kb 길이인, 플라스미드.
  102. 제95항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라스미드는 ITR1에 대해 5'에 위치된 상기 하나 이상의 SS에 대해 5'에 위치되거나 ITR2에 대해 3'에 위치된 상기 하나 이상의 SS에 대해 3'에 위치된 선택 가능 마커 유전자에 작동 가능하게 연결된 원핵 프로모터를 더 포함하는, 플라스미드.
  103. 제102항에 있어서, 상기 선택 가능한 마커 유전자는 항생제 내성 유전자인, 플라스미드.
  104. 제102항 또는 제103항에 있어서, 상기 플라스미드는 ITR1에 대해 5'에 위치된 상기 하나 이상의 SS에 대해 5'에 위치되고/되거나 ITR2에 대해 3'에 위치된 상기 하나 이상의 SS에 대해 3'에 위치된 원핵 복제기점을 더 포함하는, 플라스미드.
  105. 약제학적 조성물로서, 제48항 내지 제77항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 제78항 내지 제92항 중 어느 한 항에 벡터 또는 제93항 내지 제104항 중 어느 한 항의 플라스미드 및 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  106. 프리드라이히 운동실조증(Friedreich ataxia)의 치료를 필요로 하는 인간 환자의 프리드라이히 운동실조증의 치료 방법으로서, 치료적 유효량의 제1항 내지 제6항 및 제48항 내지 제77항 중 어느 한 항의 핵산, 제7항 내지 제35항 및 제78항 내지 제92항 중 어느 한 항의 벡터, 제36항 내지 제46항 및 제93항 내지 제104항 중 어느 한 항의 플라스미드 또는 제47항 또는 제105항의 약제학적 조성물을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  107. 프리드라이히 운동실조증이 있는 것으로 진단된 인간 환자의 프라탁신 발현을 증가시키는 방법으로서, 치료적 유효량의 제1항 내지 제6항 및 제48항 내지 제77항 중 어느 한 항의 핵산, 제7항 내지 제35항 및 제78항 내지 제92항 중 어느 한 항의 벡터, 제36항 내지 제46항 및 제93항 내지 제104항 중 어느 한 항의 플라스미드 또는 제47항 또는 제105항의 약제학적 조성물을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  108. 제106항 또는 제107항에 있어서, 상기 환자는 3세 내지 17세인, 방법.
  109. 제106항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산, 벡터, 플라스미드 또는 약제학적 조성물을 상기 환자에게 투여 시, 상기 환자는 전혈 프라탁신 수준의 증가를 나타내되, 선택적으로 상기 환자는 투여 후 약 12주까지 전혈 프라탁신의 증가를 나타내는, 방법.
  110. 제106항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산, 벡터, 플라스미드 또는 약제학적 조성물을 상기 환자에게 투여 시, 상기 환자는 총 프리드라이히 운동실조증 평가 척도 점수의 감소를 나타내되, 선택적으로 상기 환자는 투여 후 약 12주까지 총 FARS 점수의 감소를 나타내는, 방법.
  111. 키트로서, (i) 제1항 내지 제6항 및 제48항 내지 제77항 중 어느 한 항의 핵산, 제7항 내지 제35항 및 제78항 내지 제92항 중 어느 한 항의 벡터, 제36항 내지 제46항 및 제93항 내지 제104항 중 어느 한 항의 플라스미드, 또는 제47항 또는 제105항의 약제학적 조성물, 및 (ii) 포장 삽입물을 포함하되, 상기 포장 삽입물은 상기 키트의 사용자가 핵산, 벡터, 플라스미드 또는 약제학적 조성물을 프리드라이히 운동실조증이 있는 것으로 진단된 인간 환자에게 투여하도록 지시하는, 키트.
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