KR20240079094A - 칸디다 알비칸즈에 대하여 항균 활성을 갖는 신규한 균주 및 이의 용도 - Google Patents
칸디다 알비칸즈에 대하여 항균 활성을 갖는 신규한 균주 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 질염의 원인이 되는 칸디다 알비칸즈(Candida albicans)의 증식 및 활성을 억제하는 균주에 관한 것으로, 상세하게는 클로스트리디움(Clostridium), 엔테로코커스(Enterococcus), 트렙토코커스(Streptococcus), 박테로이데스(Bacteroides) 속의 균주에 관한 것이며, 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물, 상기 배양물의 추출물 및 상기 균주의 사균체로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 질염 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물 및 질염 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 질염의 원인이 되는 칸디다 알비칸즈(Candida albicans)의 증식 및 활성을 억제하는 균주에 관한 것으로, 상세하게는 클로스트리디움(Clostridium), 엔테로코커스(Enterococcus), 트렙토코커스(Streptococcus), 박테로이데스(Bacteroides) 속의 균주에 관한 것이며, 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물, 상기 배양물의 추출물 및 상기 균주의 사균체로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 질염 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물 및 질염 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
건강한 여성의 질 내 산도는 pH 3.8 ~ 4.5이다. 질 내 유용 유산균총이 pH를 산성으로 유지하게 해주어 외부의 감염원으로부터 질 내부를 보호한다. 질 내 유용 유산균으로는 Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus coleohominis 등이 알려져 있다.
질 내부 균총에 변화가 생기면 pH가 증가하게 되고 질염의 감염확률이 증가한다. 질염에 감염되면 주로 항생제가 쓰이는데 세균성 질증치료제로는 metronidazole, tinidazole과 clindamycin이 사용되며, 칸디다성 질염에는 miconazole과 terconazole이 사용되는데 질염을 치료하지만 항생제 내성균을 야기함과 동시에 질 내 유용 유산균에도 영향을 미친다.
이에 부작용이 적은 식물성 천연물에 대한 관심이 증가하였으며 항균활성 연구가 많이 보고되고 있다. 식물성 천연물 추출물은 인체 내에서 식균작용을 활성화하고, 항체의 생성을 촉진시키는 등 면역력을 증가시켜 질병을 예방하고 치료한다.
질염은 여성이 감기만큼 자주 걸리는 질환으로 면역력이 약해지면 나타나는 질병 중 하나이다. 또한 재발률이 높은 질병이기에 여성은 항상 질염의 위험에 노출되어있다. 질염은 크게 세균성 질증과 칸디다성 질염, 트리코모나스 질염으로 나뉜다(Van 2010). 세균성 질증을 유발하는 세균이 질 상피세포에 부착되어 biofilm을 형성하고, 칸디다성 질염을 유발하는 Candida albicans가 질 상피 세포에서 biofilm을 형성하여 숙주에 감염된다.
본 발명은 칸디다 질염 원인균에 대하여 항균 활성을 갖는 클로스트리듐 부틸리쿰(Clostridium butyricum) BM-02 균주(KCTC 14663BP), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) LCM001 균주(KCTC 14669BP), 엔테로코커스 라티(Enterococcus ratti) BM-05 균주(KCTC 14665BP), 스트렙토코커스 히요인테스티날리스(Streptococcus hyointestinalis) BM-08 균주(KCTC 14668BP) 또는 박테로이데스 수이스(Bacteroides suis) BM-01 균주(KCTC 14662BP)를 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 실시예에서, 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물, 상기 배양물의 추출물 및 상기 균주의 사균체로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 질염 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물, 식품 조성물 및 건강기능식품 조성물을 제공하고자 한다.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기탁번호 KCTC 14663BP로 기탁되고, 질염 원인균에 대하여 항균 활성을 갖는 클로스트리듐 부틸리쿰(Clostridium butyricum) BM-02 균주를 제공한다.
다른 실시예에서, 본 발명은 기탁번호 KCTC 14669BP로 기탁되고, 질염 원인균에 대하여 항균 활성을 갖는 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) LCM001 균주를 제공한다.
다른 실시예에서, 본 발명은 기탁번호 KCTC 14665BP로 기탁되고, 질염 원인균에 대하여 항균 활성을 갖는 엔테로코커스 라티(Enterococcus ratti) BM-05 균주를 제공한다.
다른 실시예에서, 본 발명은 기탁번호 KCTC 14668BP로 기탁되고, 질염 원인균에 대하여 항균 활성을 갖는 스트렙토코커스 히요인테스티날리스(Streptococcus hyointestinalis) BM-08 균주를 제공한다.
다른 실시예에서, 본 발명은 기탁번호 KCTC 14662BP로 기탁되고, 질염 원인균에 대하여 항균 활성을 갖는 박테로이데스 수이스(Bacteroides suis) BM-01 균주를 제공한다.
상기 질염 원인균은 칸디다 알비칸즈(Candida albicans)이다.
본 발명의 다른 실시예에서, 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물, 상기 배양물의 추출물 및 상기 균주의 사균체로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 질염 완화 또는 치료용 약학적 조성물, 식품 조성물 및 건강기능식품 조성물을 제공한다.
따라서, 상기와 같은 효과를 가지는 본 발명의 균주는 질염의 원인이 되는 칸디다 알비칸즈의 증식 및 활성을 저해하여 질염 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 클로스트리듐 부틸리쿰(Clostridium butyricum) BM-02 균주(KCTC 14663BP)의 칸디다 알비칸즈(Candida albicans) 증식 저해율을 나타내는 그래프이다.
도 2는 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) LCM001 균주(KCTC 14669BP)의 칸디다 알비칸즈(Candida albicans) 증식 저해율을 나타내는 그래프이다.
도 3은 엔테로코커스 라티(Enterococcus ratti) BM-05 균주(KCTC 14665BP)의 칸디다 알비칸즈(Candida albicans) 증식 저해율을 나타내는 그래프이다.
도 4는 스트렙토코커스 히요인테스티날리스(Streptococcus hyointestinalis) BM-08 균주(KCTC 14668BP)의 칸디다 알비칸즈(Candida albicans) 증식 저해율을 나타내는 그래프이다.
도 5는 박테로이데스 수이스(Bacteroides suis) BM-01 균주(KCTC 14662BP)의 칸디다 알비칸즈(Candida albicans) 증식 저해율을 나타내는 그래프이다.
도 2는 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) LCM001 균주(KCTC 14669BP)의 칸디다 알비칸즈(Candida albicans) 증식 저해율을 나타내는 그래프이다.
도 3은 엔테로코커스 라티(Enterococcus ratti) BM-05 균주(KCTC 14665BP)의 칸디다 알비칸즈(Candida albicans) 증식 저해율을 나타내는 그래프이다.
도 4는 스트렙토코커스 히요인테스티날리스(Streptococcus hyointestinalis) BM-08 균주(KCTC 14668BP)의 칸디다 알비칸즈(Candida albicans) 증식 저해율을 나타내는 그래프이다.
도 5는 박테로이데스 수이스(Bacteroides suis) BM-01 균주(KCTC 14662BP)의 칸디다 알비칸즈(Candida albicans) 증식 저해율을 나타내는 그래프이다.
본 명세서 또는 출원에 개시되어 있는 본 발명의 실시 예들에 대해서 특정한 구조적 내지 기능적 설명들은 단지 본 발명에 따른 실시 예를 설명하기 위한 목적으로 예시된 것으로, 본 발명에 따른 실시 예들은 다양한 형태로 실시될 수 있으며 본 명세서 또는 출원에 설명된 실시 예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
본 발명에 따른 실시 예는 다양한 변경을 가할 수 있고 여러가지 형태를 가질 수 있으므로 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 본 명세서 또는 출원에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명의 개념에 따른 실시 예를 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미이다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미인 것으로 해석되어야 하며, 본 명세서에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 발명은 칸디다 질염 원인균에 대하여 항균 활성을 갖는 클로스트리듐 부틸리쿰(Clostridium butyricum) BM-02 균주(KCTC 14663BP), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) LCM001 균주(KCTC 14669BP), 엔테로코커스 라티(Enterococcus ratti) BM-05 균주(KCTC 14665BP), 스트렙토코커스 히요인테스티날리스(Streptococcus hyointestinalis) BM-08 균주(KCTC 14668BP) 또는 박테로이데스 수이스(Bacteroides suis) BM-01 균주(KCTC 14662BP)를 제공한다.
본 발명자들은 질염에 대하여 완화 효과를 가지는 미생물을 동정하여 규명하였으며, 클로스트리듐 부틸리쿰(Clostridium butyricum) BM-02 균주(KCTC 14663BP), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) LCM001 균주(KCTC 14669BP), 엔테로코커스 라티(Enterococcus ratti) BM-05 균주(KCTC 14665BP), 스트렙토코커스 히요인테스티날리스(Streptococcus hyointestinalis) BM-08 균주(KCTC 14668BP) 또는 박테로이데스 수이스(Bacteroides suis) BM-01 균주(KCTC 14662BP) , 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물, 상기 배양물의 추출물 및 상기 균주의 사균체는 질염의 예방, 개선 또는 치료 효과가 있음을 발견하였다.
상기 질염 원인균은 칸디다 알비칸즈(Candida albicans)이고, 상기 균주들은 칸디다 알비칸즈(Candida albicans)의 증식을 억제하는 효과, 즉 항균 효과를 나타낸다.
이에 본 발명자들은 상기 신규한 균주의 16s rRNA 염기서열을 분석하고, 유전학적 계통수를 분석하여, 상기 균주들을 생물자원센터(KCTC)에 하였다.
클로스트리듐 부틸리쿰(Clostridium butyricum) BM-02 균주는 2021년 8월 23일에 기탁번호 KCTC 14663BP로 기탁되었다.
엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) LCM001 균주는 2021년 8월 23일에 기탁번호 KCTC 14669BP로 기탁되었다.
엔테로코커스 라티(Enterococcus ratti) BM-05 균주는 2021년 8월 23일에 기탁번호 KCTC 14665BP로 기탁되었다.
스트렙토코커스 히요인테스티날리스(Streptococcus hyointestinalis) BM-08 균주는 2021년 8월 23일에 기탁번호 KCTC 14668BP로 기탁되었다.
박테로이데스 수이스(Bacteroides suis) BM-01 균주는 2021년 8월 23일에 기탁번호 KCTC 14662BP로 기탁되었다.
본 발명의 용어 "배양물"은 상기 균주가 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 균주를 일정기간 배양하여 얻는 상기 균주, 균추출물, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미하나, 균주 배양 후 균주를 제거한 배양액도 포함하는 의미이다.
상기 배양액은 일정시간 가만히 두어 하층에 가라앉은 부분을 제외한 상층의 액체만을 취하거나, 여과를 통해 균체를 제거하거나, 배양액을 원심분리하여 하부의 침전을 제거하고 상부의 액체만을 의미할 수도 있다. 이러한 배양액은 통상의 방법으로 농축하여 농축액으로 이용할 수도 있다.
상기 배양액 또는 배양액의 농축물은 통상의 방법으로 건조하여 건조물로 제공될 수 있다.
본 명세서에서 언급하는 "배양물"은 특별한 언급이 없는 한, 전술한 균체의 배양액, 배양액의 농축물, 상기 배양액 또는 농축물의 건조물을 포함하는 의미이다. 상기 배양물에는 경우에 따라 균체가 포함될 수도 있고, 포함되지 않을 수도 있으며, 특별히 균체의 포함여부는 문제되지 않는다.
상기 배양물은 멸균된 MRS broth 배지에 상기 균주를 접종하고, 12시간 이상 배양하여 수득하는 것이 바람직하다.
상기 사균체는 1) 상기 균주를 배양하는 단계; 2) 상기 배양액을 가압멸균하는 단계; 3) 막여과 농축기로 농축 및 건조하여 분말화하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조되는 것을 특징으로 한다.
상기 배양 단계는 멸균된 MRS broth 배지에 상기 균주를 접종하고, 12시간 이상 배양하는 것이 바람직하다.
상기 배양액은 100 ~ 121℃에서 30 ~ 60분간 가압멸균하는 것이 바람직하다.
상기 막여과 농축기는 여과막 사이즈가 0.1 ~ 1㎛일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 사균체 분말은 4.0 X 1012 ~ 6.0 X 1012 cell/g의 농도일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 실시예에서, 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물, 상기 배양물의 추출물 및 상기 균주의 사균체로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 질염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에서, 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물, 상기 배양물의 추출물 및 상기 균주의 사균체로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 질염 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에서, 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물, 상기 배양물의 추출물 및 상기 균주의 사균체로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 질염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 질염은 칸디다 알비칸즈(Candida albicans)에 의하여 유발되는 것을 특징으로 한다.
상기 질염 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 주성분인 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물, 상기 배양물의 추출물 및 상기 균주의 사균체로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 유효성분 유효량에 1종 또는 2종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 통상적인 담체 또는 1종 또는 2종 이상의 첨가제를 선택하여 통상적인 제형의 조성물로 제조할 수 있다.
담체는 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제, 방부제 중에서 1종 또는 2종 이상을 선택하여 사용할 수 있으며, 첨가제로는 향료, 비타민류, 항산화제 중에서 1종 또는 2종 이상을 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 담체 및 첨가제는 약제학적으로 허용 가능한 것은 모두 사용이 가능하며, 구체적으로는 희석제로는 유당(lactose monohydrate), 트레할로스(Trehalose), 옥수수 전분(cornstarch), 콩기름(soybean oil), 미결정 셀룰로오스(microcrystalline cellulose) 또는 만니톨(D-mannitol)이 좋고, 활택제로는 스테아린산 마그네슘(magnesium stearate) 또는 탈크(talc)가 바람직하며, 결합제로는 폴리비닐 피롤리돈(PVP:polyvinyl pyrolidone) 또는 하이드록시프로필셀룰로오스(HPC: hydroxypropylcellulose) 중에서 선택함이 바람직하다. 또한, 붕해제로는 카르복시메칠셀룰로오스칼슘(Ca-CMC: carboxymethylcellulose calcium), 전분글리콜산나트륨(sodium starchglycolate), 폴라크릴린칼륨(polacrylin potassium) 또는 크로스포비돈(cross-linkedpolyvinylpyrrolidone)중에서 선택함이 바람직하고, 감미제로는 백당, 과당, 소르비톨(sorbitol) 또는 아스파탐(aspartame) 중에서 선택되고, 안정제로는 카르복시메칠셀룰로오스나트륨(Na-CMC: carboxymethylcellulosesodium), 베타-싸이크로덱스트린(β-cyclodextrin), 백납(white bee's wax) 또는 잔탄검(xanthan gum) 중에서 선택되며, 방부제로는 파라옥시안식향산메칠(methyl p-hydroxy benzoate, methylparaben), 파라옥시안식향산프로필(propylp-hydroxybenzoate, propylparaben), 또는 소르빈산칼륨(potassium sorbate) 중에서 선택하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기에서 '약학적으로 유효한 양' 이란 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며 바람직하게는 염증성 질환의 예방 또는 치료하기에 충분한 양을 말한다. 또한, 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등과 같은 여러 인자에 따라 적절히 변화될 수 있다.
본 발명의 조성물은 상기 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는" 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 본 발명의 조성물은 상기 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다. 투여 경로로는 이에 한정되지는 않으나 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물, 상기 배양물의 추출물 및 상기 균주의 사균체로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 질염 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물, 상기 배양물의 추출물 및 상기 균주의 사균체로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 질염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물 또는 건강기능식품은 상기 식품 조성물을 포함한 음료(차 또는 알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품 (예: 햄, 소시지, 콘드비프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등일 수 있다.
또한, 본 발명의 식품 조성물 또는 건강기능식품은 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제, 액제 제형 등으로 제형화된 것일 수도 있다. 이들은 담체, 희석제, 부형제 및 첨가제 중 하나 이상을 더 포함하여 제형화될 수 있다.
상기 담체, 부형제, 희석제 및 첨가제의 구체적인 예로는 이에 한정하는 것은 아니나, 락토즈, 덱스트로즈, 슈크로즈, 솔비톨, 만니톨, 에리스리톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 미세결정성 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸셀룰로즈, 물, 설탕시럽, 메틸셀룰로즈, 메틸 하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 활석, 스테아트산 마그네슘 및 미네랄 오일로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상이 사용되는 것이 바람직하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예. 칸디다 알비칸즈(Candida albicans)에 대한 항균력 시험
1. 시약 및 재료
칸디다 알비칸즈(Candida albicans, ATCC® 11006TM)는 한국미생물보존센터(KCCM, Korea)에서 구입하였으며, LB Broth Low Salt(MB cell, Korea), Agar, bacteriological(DEAJUNG, Korea)를 이용하여 배양하였다.
2.
칸디다 알비칸즈(
Candida albicans
)에 대하여 항균력을 갖는 균주 스크리닝
칸디다 알비칸즈의 항균력 시험은 디스크 확산 검사법(Disk diffusion method)를 이용하여 측정하였다.
(1) 미생물 배양
LB Broth Low Salt media 10ml을 121℃, 15min 고압증기멸균하여 사용하였고, LB Agar plate에 배양된 미생물의 single colony를 접종하여 37℃ 배양기에서 48시간 150rpm으로 배양하였다.
(2) 샘플 및 제조
선정된 미생물은 LB Broth Low Salt media 10ml을 121℃, 15min 고압증기멸균하여 사용하였고, LB Agar plate에 배양된 미생물의 single colony를 접종하여 37℃ 배양기에서 48시간 150rpm으로 배양하였다. 배양이 완료된 미생물 및 배양액을 3000rpm에서 원심 분리하여, 미생물과 무세포 상등액으로 분리한 후, 무세포 상등액을 pore size 0.22um PVDF filter를 사용하여 filtration하였다.
(3) 디스크 확산 검사법
YM agar(1.5%)를 제조하여 121℃에서 15min 고압증기멸균 한 후, 멸균이 완료 된 YM agar media를 100 petri dish 에 분주하여 평편한 곳에 놓아 굳을 때 까지 기다린다. 이후에 YM broth를 121℃에서 15min 고압증기멸균을 수행하여 칸디다 알비칸즈 single colony를 접종한 후, 25℃배양기에서 150rpm 24시간 배양한다.
배양이 완료되면, media를 제외한 0.7% agar를 121℃에서 15min동안 고압증기멸균을 한 후 배양이 완료된 칸디다 알비칸즈를 1%를 접종하여 0.7% agar와 잘 섞어 준 후, 굳은 YM agar(1.5%)위에 3ml 분주하여 얇게 깔아준다. 칸디다 알비칸즈가 포함된 0.7% agar가 어느정도 굳으면 멸균된 pater dish에 filtration된 배양액을 30ul를 분주한 후 25℃배양기에 72시간 정치배양 하였다.
(4) 결과
상기 디스크 확산 검사법에 의하여 칸디다 알비칸즈(Candida albicans)에 대하여 항균 활성을 갖는 5종의 균주를 선별하였다; 클로스트리듐 부틸리쿰(Clostridium butyricum) BM-02 균주(KCTC 14663BP), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) LCM001 균주(KCTC 14669BP), 엔테로코커스 라티(Enterococcus ratti) BM-05 균주(KCTC 14665BP), 스트렙토코커스 히요인테스티날리스(Streptococcus hyointestinalis) BM-08 균주(KCTC 14668BP) 또는 박테로이데스 수이스(Bacteroides suis) BM-01 균주(KCTC 14662BP).
3. 칸디다 알비칸즈 증식 저해율 분석
상기 선별된 5 종 균주의 칸디다 알비칸즈의 증식 저해율을 분석하기 위하여, 칸디다의 증식 저해율을 multi-reader(TECAN, switzerland))를 이용하여 600nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였다.
(1) 미생물 배양
LB Broth Low Salt media 10ml을 121℃, 15min 고압증기멸균하여 사용하였고, LB Agar plate에 배양된 미생물의 single colony를 접종하여 37℃ 배양기에서 48시간 배양하였다.
(2) 샘플 및 제조
선정된 미생물은 LB Broth Low Salt media 10ml을 121℃, 15min 고압증기멸균하여 사용하였고, LB Agar plate에 배양된 미생물의 single colony를 접종하여 37℃ 배양기에서 48시간 150rpm으로 배양하였다. 배양이 완료된 미생물 및 배양액을 동결건조(-80℃, 진공)하여 분말로 제조하였다.
(3) 흡광도 측정
배양 진행중인 칸디다 알비칸즈를 동일하게 100uL씩 분주하고, 각각 분주된 칸디다 알비칸즈의 배양액에 동결건조가 완료된 미생물 배양액을 농도별 (0.1, 0.25. 0.5, 1. 2 mg/ml)로 처리하여 48시간동인 배양기에서 배양하여 칸디다 알비칸즈의 증식 및 저해를 확인한다. 48시간 배양이 완료되면 이를 즉시 600nm 흡광도로 측정하였다.
(4) 결과
도 1 ~ 5를 참고하면, 상기 선별된 5종의 균주 모두 농도가 증가할수록 칸디다 알비칸즈(Candida albicans)의 증식을 억제하는 것을 확인하였으며, 상기 5종의 균주들은 질염의 원인이 되는 칸디다 알비칸즈의 증식 및 활성을 저해하여 질염 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물로 유용하게 활용될 수 있다는 것을 확인하였다.
본 명세서에서는 본 발명을 한정된 실시 예를 중심으로 설명하였으나, 본 발 명의 사상적 범위 내에서 다양한 실시 예가 가능하다. 또한 설명되지는 않았으나, 균등한 수단도 또한 본 발명에 그대로 결합되는 것이라 할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 보호범위는 하기 특허청구범위에 의하여 정해져야 할 것이다.
Claims (8)
- 질염 원인균에 대하여 항균 활성을 갖는 클로스트리듐 부틸리쿰(Clostridium butyricum) BM-02 균주(KCTC 14663BP).
- 제1항에 있어서,
상기 질염 원인균은 칸디다 알비칸즈(Candida albicans)인 것을 특징으로 하는 균주.
- 제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 따른 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물, 상기 배양물의 추출물 및 상기 균주의 사균체로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 질염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 질염은 칸디다 알비칸즈(Candida albicans)에 의하여 유발되는 것을 특징으로 하는 질염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 따른 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물, 상기 배양물의 추출물 및 상기 균주의 사균체로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 질염 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 질염은 칸디다 알비칸즈(Candida albicans)에 의하여 유발되는 것을 특징으로 하는 질염 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 따른 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물, 상기 배양물의 추출물 및 상기 균주의 사균체로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 질염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 질염은 칸디다 알비칸즈(Candida albicans)에 의하여 유발되는 것을 특징으로 하는 질염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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| KR102053744B1 (ko) | 2018-11-27 | 2019-12-09 | 한국생명공학연구원 | 질염 원인균에 대한 항균 활성 및 질내 부착능이 우수한 락토바실러스 속 균주 및 이의 용도 |
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