KR20240078980A - 대황, 유백피, 황련 및 당귀를 포함하는 약재의 피마자유 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 항산화, 항균, 항염 또는 여드름 피부 개선용 화장료 조성물 - Google Patents
대황, 유백피, 황련 및 당귀를 포함하는 약재의 피마자유 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 항산화, 항균, 항염 또는 여드름 피부 개선용 화장료 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 대황, 유백피, 황련, 당귀 및 피마자유를 함유하는 복합 추출물, 이의 제조 방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 항산화, 항균, 항염 또는 여드름 피부 개선용 화장료 조성물을 개시한다. 본 발명에 따른 방법으로 제조된 복합 추출물은 프로피오니박테리움 아크네균(Propionibacterium acnes), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococus aureus) 및 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococus epidermidis)의 생장 억제, NO 생성 억제, DPPH 라디컬 소거 및 ABTS 라디컬 소거 활성을 가지고 있으므로, 항산화, 항균, 항염 또는 여드름 피부 개선용 화장료 조성물로 적용될 수 있다.
Description
본 발명은 천연 약재 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 대황, 유백피, 황련 및 당귀를 포함하는 약재의 피마자유 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 항산화, 항균, 항염 또는 여드름 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
여드름은 모낭에 붙어 있는 피지선에 발생하는 만성 염증성 질환이다. 여드름은 사춘기 내지 성인이 되어서도 나타날 수 있고, 유분이 많은 피부 부위인 얼굴, 목, 가슴 등에서 나타난다.
여드름이 생기는 원인으로는 호르몬의 변화, 세균 감염, 유전성 요인 등이 있고, 치료 방법으로는 경구제 또는 외용제 형태의 약제를 사용하는데, 구체적으로는 피지 생성을 억제하기 위한 항안드로겐제, 항염제로 작용하는 비스테로이드 소염제, 살리실산, 벤조일퍼옥사이드와 같은 항균제, 테트라사이클린, 에리스로마이신과 같은 항생물질 등이 사용된다.
그러나 이러한 호르몬제, 항생물질 등의 사용은 호르몬 불균형, 표피 생장 억제, 내성균의 출현, 광과민작용 등의 부작용이 있을 수 있으므로, 부작용이 없는, 여드름 치료용 천연 생약 성분에 대한 관심이 높아지고 있다.
한편, 한국 등록특허 제10-1039532호(2011.06.01.)는 천연항균복합체를 함유하는 여드름 개선용 화장료 조성물을 개시하고 있으나, 여드름의 원인균을 억제하는 효능만 구현하고 있을 뿐, 다른 원인에 의한 여드름의 증상 완화에는 효과가 미미한 문제점이 있다.
본 발명은 천연 약재 추출물 및 이를 유효성분으로 함유한 화장료 조성물로서 여드름 원인균의 억제뿐만 아니라 항산화, 항균 및 항염증 효과를 가지는 천연 약재 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, (a) 대황, 유백피, 황련 및 당귀의 혼합물에 피마자유를 3 내지 5 중량배수 첨가하여 70 내지 80℃에서 1 내지 8일 간 우려내고, 상기 혼합물을 여과하여 피마자유 추출액을 제조하는 단계; (b) 상기 피마자유 추출액에 70 내지 90% 메탄올을 5 내지 20 중량배수 첨가하여 80 내지 100℃에서 1 내지 3 시간 진탕하고 분액 깔대기로 옮겨 1 내지 5 시간 방치하여 층을 분리하는 단계; 및 (c) 상기 분리된 메탄올 층을 감압농축 및 동결건조하여 복합 추출물을 수득하는 단계;를 포함하는 항산화, 항균, 항염증 또는 여드름 피부 개선용 복합 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.
또한 상기 혼합물의 조성은 대황 3.5 내지 5.77 중량%, 유백피 3.5 내지 5.77 중량%, 황련 3.5 내지 5.77 중량% 및 당귀 3.5 내지 5.77 중량%인 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
또한 상기 복합 추출물은 프로피오니박테리움 아크네균(Propionibacterium acnes), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococus aureus) 및 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococus epidermidis)의 생장 억제, NO 생성 억제, DPPH 라디컬 소거 및 ABTS 라디컬 소거 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
상기 다른 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 상기 방법으로 제조된 복합 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항균, 항염증 또는 여드름 피부 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 복합 추출물을 제조하는 방법은 대황, 유백피, 황련 및 당귀의 혼합물을 피마자유로 우려내고, 피마자유 추출액을 메탄올로 추출함으로써 항산화, 항균, 항염증 및 여드름 피부 개선 효과를 구현하는 복합 추출물을 제조할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실험예에서 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실험예에서 시료 농도별 DPPH 자유라디칼 소거능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실험예에서 시료 농도별 ABTS 자유라디칼 소거능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실험예에서 시료 농도별 RAW264.7세포의 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실험예에서 대조군 대비 시료 농도별 NO 생성량(%)을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실험예에서 시료 농도별 DPPH 자유라디칼 소거능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실험예에서 시료 농도별 ABTS 자유라디칼 소거능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실험예에서 시료 농도별 RAW264.7세포의 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실험예에서 대조군 대비 시료 농도별 NO 생성량(%)을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하 바람직한 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예의 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한, 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.
본 발명은 (a) 대황, 유백피, 황련 및 당귀의 혼합물에 피마자유를 3 내지 5 중량배수 첨가하여 70 내지 80℃에서 1 내지 8일 간 우려내고, 상기 혼합물을 여과하여 피마자유 추출액을 제조하는 단계; (b) 상기 피마자유 추출액에 70 내지 90% 메탄올을 5 내지 20 중량배수 첨가하여 80 내지 100℃에서 1 내지 3 시간 진탕하고 분액 깔대기로 옮겨 1 내지 5 시간 방치하여 층을 분리하는 단계; 및 (c) 상기 분리된 메탄올 층을 감압농축 및 동결건조하여 복합 추출물을 수득하는 단계; 를 포함하는 항산화, 항균, 항염증 또는 여드름 피부 개선용 복합 추출물을 제조하는 방법을 개시한다.
본 발명에서 상기 대황은 여귀과에 속하는 여러해살이 초본식물인 장엽대황(Rheum palmatum L.) 및 당고특대황(Rheum tanguticum Maximowicz)의 뿌리로, 체내에 과다하게 축적되어 있는 열을 내리므로 피부반진, 변비 및 혈압 상승을 치료하는 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
또한 상기 유백피는 느릅나무과 식물인 비술나무(Ulmus pumila L.)의 근피로, 소변 출혈, 요도 통증 및 종기를 치료하는 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
또한 상기 황련(Coptis chinensis Franch)은 미나리아재비과에 속하는 여러해살이 초본식물로, 그 뿌리는 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 등에 대한 항균 효과 및 해열 효과가 있고, 임상실험에서 세균성이질, 폐결핵, 성홍열, 디프테리아, 궤양성결장염, 고혈압 등의 치료 효력을 나타내는 것으로 알려져 있다.
또한 상기 당귀는 산형과에 속하는 참당귀의 뿌리를 건조시킨 약재로, 혈액순환을 촉진시키고 진통 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.
또한 상기 피마자유는 쌍떡잎식물 쥐손이풀목 대극과의 한해살이풀인 피마자의 종자를 압착하여 수득한 오일로, 리시닌, 리시놀산 등의 성분을 포함하고, 항염증, 보습, 흉터 치유 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서의 상기 (a) 단계는 상기 피마자유 내의 유효 성분과 상기 대황, 유백피, 황련 및 당귀의 혼합물 내의 유효 성분을 반응시키고, 상기 유효 성분들이 용해된 피마자유만을 선택적으로 추출하기 위한 단계이다.
이러한 관점에서 상기 피마자유는 상기 혼합물의 3 내지 5 중량배수가 첨가될 수 있고, 70 내지 80℃에서 1 내지 8일 간 우려낼 수 있으며, 바람직하게는 상기 피마자유는 상기 혼합물의 3 중량배수가 첨가될 수 있고, 70 내지 80℃까지 가온이 되면 가온을 멈춰 그 상태로 1일을 우려내고, 2일 차에 다시 가온 후 70 내지 80℃에 도달하면 가온을 멈춰 그 상태로 7일을 추가로 우려낼 수 있다.
또한 상기 혼합물의 여과는 당 업계에 공지된 여과 방법을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 100 또는 140 mesh 여과망을 사용할 수 있다.
상기 혼합물의 조성은 대황 3.5 내지 5.77 중량%, 유백피 3.5 내지 5.77 중량%, 황련 3.5 내지 5.77 중량% 및 당귀 3.5 내지 5.77 중량%일 수 있고, 바람직하게는 5.77 중량%일 수 있다.
본 발명에서의 상기 (b) 단계는 상기 피마자유 추출액을 용매 추출하기 위한 단계로, 상기 용매 추출에는 당 업계에 공지된 통상의 용매 추출 방법이 적절히 선택되어 사용될 수 있고, 구체적으로 상기 용매는 물, 탄소 수가 1 내지 4인 저급 알코올(예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올) 또는 이들의 혼합물인 함수 저급 알코올, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 디클로로메탄, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 이중 메탄올, 물 또는 이들의 혼합물에서 선택되는 것이 바람직하다.
여기서, 상기 피마자유 추출액에 대한 추출 용매로 메탄올을 이용하는 경우, 예를 들어, 70 내지 90 %(v/v) 메탄올을 상기 피마자유 추출액의 5 내지 20 중량배수 첨가하고, 80 내지 100℃에서 1 내지 3 시간 진탕하고 분액 깔대기로 옮겨 1 내지 5 시간 방치하여 층을 분리하는 방식으로 추출할 수 있고, 바람직하게는 75 내지 85 %(v/v) 메탄올을 상기 피마자유 추출액의 5 내지 10 중량배수 첨가하고 80℃ 또는 100℃에서 1 내지 2 시간 진탕하고 분액 깔대기로 옮겨 1 내지 3 시간 방치하여 층을 분리하는 방식으로 추출할 수 있다.
또한 상기 (b) 단계는 1 내지 5회 반복하여 수행되는 것이 추출 효율을 향상시키기 위하여 바람직하고, 더욱 바람직하게는 2 내지 4회 반복될 수 있다.
본 발명에서 상기 (c) 단계는 상기 (b) 단계에서 분리된 메탄올 층에 함유된 유효성분의 구조를 안정화시키고, 고체의 복합 추출물을 수득하기 위한 단계이다.
상기 감압농축 및 동결건조는 당 업계에 공지된 통상의 기기 및 장비를 이용하여 수행될 수 있다. 구체적으로는, 상기 감압농축은 30 내지 60℃에서 상기 메탄올 용매를 완전히 제거할 때까지 수행될 수 있고, 상기 동결건조는 먼저 -90 내지 -60℃에서 48시간 동결시킨 후에 동결건조 추출분말 조건에서 수행될 수 있다.
본 발명은 상기 방법으로 복합 추출물을 제조할 수 있고, 상기 복합 추출물은 항산화, 항균, 항염증 또는 여드름 피부 개선 효과가 매우 우수한 것으로 확인되었고, 구체적으로는 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 아크네균(Propionibacterium acnes)의 생장 억제, 피부상재균인 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococus aureus) 및 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococus epidermidis)의 생장 억제, 염증 인자인 NO의 생성 억제, 항산화 관련 인자인 DPPH 라디컬 소거 및 ABTS 라디컬 소거 효과가 매우 우수한 것으로 확인되었다.
본 발명은 다른 앙태로서, 상기 방법으로 제조된 복합 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.
상기 화장료 조성물은 상기 복합 추출물을 10 내지 20 중량%로 함유할 수 있고, 바람직하게는 10 중량%로 함유할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 젤 타입, 스킨 타입, 크림 타입, 연고 타입 등으로 적용될 수 있지만, 이들만으로 한정되는 것은 아니다. 상기의 조성물은 그것의 타입에 따라 적절한 통상의 연화제, 유화제, 증점제 또는 당업계에 공지되어 있는 기타 물질들을 첨가하여, 공지의 방법에 의해 적절하게 제조될 수 있다.
상기 젤 타입 조성물은 트리메틸올프로판, 폴리에틸렌 글리콜 또는 글리세린 등의 연화제, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 이소세틱알콜 등의 용매, 정제수 등을 첨가하여 제조할 수 있다.
상기 스킨 타입 조성물은 스테아릴 알콜, 미리스틸 알콜, 베헤닐 알콜, 아라키딜 알콜, 이소스테아릴 알콜, 이소세틸 알콜 등의 지방 알콜, 부틸렌 글라이콜, 글리세린, 알란토인, 메틸 파라벤, 이디티에이-2-소디움, 잔탄검, 디메티콘, 폴리 에틸렌 글라이콜-60 하이드로제네이트 카스톨 오일, 폴리 소르베이트 60 및 정제수 등을 첨가하여 제조할 수 있다.
상기 크림 타입 조성물은 스테아릴 알콜, 미리스틸 알콜, 베헤닐 알콜, 아라키딜 알콜, 이소스테아릴 알콜, 이소세틸 알콜 등의 지방 알콜, 레시틴, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 소프파티질세린, 소프파티딜이노시톨 등의 리피드, 이들의 유도체, 글리세릴 스테아레이트, 소르비탄 팔미테이트, 소리비탄 스테아레이트 등의 유화제, 아보카도 오일, 살구 오일, 바바수 오일, 유리지치 오일, 동백 오일 등의 천연 지방 또는 오일, 프로필렌글리콜 등의 용매 및 정제수 등을 첨가하여 제조할 수 있다.
상기 연고 타입 조성물은 연화제, 유화제 및 마이크로크리스탈린납, 파라핀, 세레신, 밀납, 경납, 바세린 등의 왁스를 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 항염 성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다. 항염 성분으로는 마치현 추출물, 병풍추출물, 디포타슘글리시리제이트(Dipotassium Glycyrrhizate), 암모늄글리시리제이트(Ammonium glycyrrhizate) 항염 기능성 펩타이드로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습제, 방향제, 방향제 담체, 단백질, 용해화제, 당유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 등을 포함하는 부형제를 추가로 함유할 수 있다.
본 발명에서 상기 화장료 조성물은 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 아이크림, 세럼, 영양크림, 맛사지크림, 클렌징크림, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 파우더, 엣센스, 팩, 헤어토닉, 헤어트리트먼트, 샴푸 또는 린스로 제형화 될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 통상의 방법에 의해 제형화될 수 있다. 피부 외용제의 제형화에 있어서 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있고, 화장료 조성물의 제형화에 있어서 International cosmetic ingredient dictionary, 6th ed(The cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, Inc, Washington, 1995)에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있다.
구체적으로, 상기 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형으로 제조할 수 있다. 예컨대, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등의 화장수; 훼이셜 로션, 바디로션 등의 유액; 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림 등의 크림; 에센스; 화장연고; 스프레이; 젤; 팩; 선 스크린; 메이크업 베이스; 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션; 파우더; 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일 등의 메이크업 제거제; 또는 클렌징 폼, 비누, 바디워시 등의 세정제로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 피부 외용제는, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 화장료 조성물은 각각의 제형에 있어서 상기 필수성분 외에 제형의 종류 또는 사용 목적 등에 따라 본 발명에 따른 목적을 저해하지 않는 범위 내에서 다른 성분들이 적절히 배합될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 통상적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있으며, 예컨대 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 허용 가능한 담체는 제형에 따라 달리할 수 있다. 예컨대, 연고, 페이스트, 크림 또는 젤로 제형화될 때담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 파우더 또는 스프레이로 제형화될 때, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있고, 스프레이의 경우 클로 로플루오로히드로카본, 프로판, 부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 더 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 용액 또는 유탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 용매, 용해화제, 또는 유탁화제가 사용될 수 있고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-브틸글리콜 오일이 사용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 사용될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 현탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리 옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 사용될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 최종 제품의 품질이나 기능에 따라 업계에서 통상적으로 사용되는 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉 쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 추가적으로 함유할 수 있다. 다만, 상기 보조제 및 그 혼합 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 영향을 미치지 않도록 적절히 선택할 수 있다.
이하, 구체적인 실험예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
복합 추출물 및 시료 제조
대황, 유백피, 황련 및 당귀의 혼합물에 피마자유를 3 중량배수 첨가하고 70 내지 80℃까지 가온이 되면 작동을 멈춰 그 상태로 1일을 우려내고, 2일차에 다시 동일한 온도로 가온 후 해당 온도에 도달하면 작동을 멈춰 그 상태로 7일을 추가로 우려낸 후 상기 혼합물을 100 또는 140 mesh 여과망으로 여과하여 피마자유 추출액을 제조하였고, 상기 혼합물 및 상기 피마자유의 조성은 하기 표 1과 같다.
상기 피마자유 추출액 100 g을 삼각플라스크에 분취한 후, 80 %(v/v) 메탄올 500 mL를 넣고 1 시간 동안 진탕한 후, 분액 깔대기로 옮겨 2시간 방치한 후, 분리된 층을 각각 삼각 플라스크에 옮겼다.
같은 방법으로 3회 반복 추출하여 수집한 80 %(v/v) 메탄올 층을 40℃에서 감압농축기(Rotary evaporator N-1000, EYELA)를 사용하여 용매를 완전히 제거한 후, -75℃의 급속동결기에서 48시간 동결시킨 후 동결건조기(Freeze dryer, FD, TD-5075R, Korea)를 이용하여 복합 추출물을 제조하였고, 상기 복합추출물을 증류수에 용해하여 후속 실험에서 요구되는 농도에 맞게 시료를 제조하였다.
| 성분 명 | 중량% |
| 대황 | 5.77 |
| 유백피 | 5.77 |
| 황련 | 5.77 |
| 당귀 | 5.77 |
| 피마자유 | 76.92 |
실험방법
(1) 항산화 기능성분 분석
1) 총 페놀 함량 분석
총 폴리페놀 함량은 Folin Ciocalteu's의 방법을 이용하여 함량(mg gallic acid equivalents(GAE)/g)을 측정하였다(Rama P, Vignesh A, Lakshmanan G, Murugesan K. In vitro antioxidant activity of Achyranthes aspera Linn. Int J Med Pharmceut Sci. 2013. 3(2):67-78.). 10% Folin-Ciocalteu’s phenol reagent 500 μL, 시료 100 μL 및 7.5% sodium carbonate 400 μL를 혼합하여 실온의 암소에서 30분 동안 반응시킨 후 Microplate reader(765 nm)로 흡광도를 측정하였고, 표준물질인 Gallic acid를 이용하여 표준 검량선을 구했으며, 총 폴리페놀 함량을 산출한 결과를 도 1에 나타내었다.
2) 총 플라보노이드 함량 분석
총 플라보노이드는 aluminum chloride를 사용한 비색법을 사용하여 함량(mg quercetin equivalents(QE)/g)을 구하였다(Rama P, Vignesh A, Lakshmanan G, Murugesan K. In vitro antioxidant activity of Achyranthes aspera Linn. Int J Med Pharmceut Sci. 2013. 3(2):67-78.). 증류수 560 μL, 1 M 포타슘 아세테이트 용액(potassium acetate solution) 20 μL, 시료 100 μL, 10 %(v/v) aluminium chloride solution 20 μL 및 메탄올 300 μL를 혼합하여 실온의 암소에서 30분 반응시켰다. 그 다음 Microplate reader(415 nm)로 흡광도를 측정하였으며, 표준물질인 Quercetin을 이용하여 표준 검량선을 구했으며, 총 플라보노이드 함량을 산출한 결과를 도 1에 나타내었다.
(2) 항산화능 평가
1) DPPH 자유라디칼 소거능 평가
항산화능 분석을 위해 DPPH 자유 라디칼 소거법을 활용하였다 (BLOIS, M. Antioxidant Determinations by the Use of a Stable Free Radical. Nature 181, 1199-1200 (1958).). 50 ppm 농도의 시료 100 μL와 60 μM DPPH 용액 100 μL를 각각 plate에 분주하여 혼합시킨 후 실온의 암실에 30분간 반응시켰으며 Microplate reader(540 nm)로 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
2) ABTS 자유라디칼 소거능 평가
항산화능 분석을 위해 ABTS 라디칼 소거법을 활용하였다 (Re R, Pellegrini N, Proteggente A, Pannala A, Yang M, Rice-Evans C. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radic Biol Med. 1999 May;26(9-10):1231-7.). potassium persulfate 및 7 mM ABTS를 혼합하여 약 16시간 동안 실온의 암실에서 ABTS+를 형성시켜주었다. 이를 흡광도 415 nm에서 측정하여 0.70±0.02의 값이 되도록 에탄올을 사용하여 희석하였다. 농도별(1000, 2000 및 5000 ppm) 각 시료 5 μL와 희석한 ABTS 용액 95 μL를 혼합한 후 15분간 반응시킨 다음 Microplate reader(415 nm)로 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
(3) 항균효능 평가
1) 실험 균주
항균활성측정에 사용된 균주는 여드름균 2종 Propionibacterium acnes 3314 및 Propionibacterium acnes 3320과 Staphylococus aureus, Staphylococus epidermidis를 국내 생명공학연구원 KCTC 및 생물자원센터 KCCM으로부터 구입하여 각 균의 생육 조건에 따라 24시간 종균 배양하여 활성화시켰다.
상기 균주는 CO2 incubator에서 28℃로 3일간 배양되어 성장여부가 관찰되었다. 실험에 사용된 배지의 조성은 하기 표 2에 나타내었다.
| 균주 | 배지 조성 |
| Propionibacterium acnes 3314 및 Propionibacterium acnes 3320 | Soluble starch, Distilled water, Beef extract, Yeast extract Cysteine hydrochloride, Sodium acetate, Tryptose, Dextrose, Agar 및 Sodium chloride |
| Staphylococus aureus 및 Staphylococus epidermidis | Peptone, Beef extract, Distilled water 및 Agar |
2) 여드름 원인균 및 피부상재균에 대한 항균 활성 평가(최소저해농도 평가)
최소저해농도(Minimum inhibitory concentration, MIC)의 측정은 Clinical and Laboratory Standards Institute guidelines에 따라 실시하였다. 시료를 농도별(6.2 ppm, 12.5 ppm, 25 ppm, 50 ppm, 100 ppm, 200 ppm 및 500 ppm)로 상기 배지에 첨가하고, 여기에 탁도를 1.0 × 108 CFU/mL로 맞춘 균 10 μL 접종해 최종적으로 1.0 × 106 CFU/mL이 되게 하였다. 다음으로 37℃ Incubator에서 18시간 배양한 후에 MTT 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide, 5 mg/mL] 사용하여 색이 변하지 않는 가장 낮은 농도를 측정하였다.
(4) 항염증 평가
1) 세포 독성 측정
시료의 독성을 알아보기 위해 RAW264.7세포에 처리한 후 cell viability assay를 진행하였다. 실험에서는 Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Japan)을 이용하여 측정하였다. RAW264.7 cell을 1 × 104 cells/well로 96well plate에 분주 한 후 24시간 동안 배양한 다음, 시료를 DMSO에 녹인 후 농도 별(0.005, 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.25, 및 0.5 %(v/v))(확인부탁드립니다)로 희석하여 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 각 well당 CCK-8 용액을 10 μL 첨가하고 37℃, 5% CO2 조건에서 2시간 동안 반응시킨 다음 microplate Reader(Bio-Tek, Winoski, VT, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였고 그 결과를 도 4에 나타내었다.
2) NO 생성량 측정
염증에 의한 NO 생성량을 측정하기 위해 Griess방법에 따라 실험을 진행하여 정량 하였다. 96-well plate에 RAW264.7 세포를 1 × 105 cells/well이 되도록 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 시료를 농도별 (0.01, 0.025, 0.05 및 0.1 ppm)로 처리하고 1시간 후 lipopolysaccharide (LPS, Sigma)를 0.1 ppm으로 24시간 동안 반응시켰다. 반응을 마친 상등액과 Griess reagent를 1:1의 부피비로 섞어 30 min간 실온에서 반응시켜 540 nm에서 microplate Reader (BioTek, Winoski, VT, USA)를 이용하여 흡광도를 측정하였고 표준곡선에 흡광도를 대입하여 NO 생성량을 산출하였으며, 시료 및 LPS를 처리하지 않은 대조군도 같은 방법으로 측정 및 산출하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.
(5) 통계분석
상기 실험의 결과는 SAS package(release 8.01)를 이용하여 평균±표준편차로 표시하였고, 평균값의 통계적 유의성은 p < 0.05 수준에서 Student t-test에 의해 검정되었다.
실험결과
(1) 총 페놀 및 총 플라보노이드 함량
도 1을 참조하면, 상기 시료에 함유된 총 페놀 함량은 4.46±0.25 중량%이었고, 총 플라보노이드 함량은 2.44±0.19 중량%으로 나타났다.
(2) DPPH 라디컬 소거능 평가
도 2를 참조하면, 상기 시료의 DPPH 라디컬 소거능을 평가한 결과, 1,000 ppm에서 35.8±2.6%, 2,000 ppm에서 42.0±1.7%, 5,000 ppm에서 55±3.2%의 소거능이 나타났다.
(3) ABTS 라디컬 소거능 평가
도 3을 참조하면, 상기 시료의 ABTS 라디컬 소거능을 평가한 결과, 1,000 ppm에서 20.0±1.4%, 2,000 ppm에서 29.3±2.9%, 5,000 ppm에서 40.4±1.9%의 소거능이 나타났다.
(4) 여드름균 및 피부상재균 최소억제농도
하기 표 3을 참조하면. Propionibacterium acnes 최소억제농도는 200 ppm로 나타났고, Staphylococus aureus와 Staphylococus epidermidis는 100 ppm 농도에서 동일하게 최소억제농도로 나타났다.
| 균주 | MIC (ppm) |
| Propionibacterium acnes | 200 |
| Staphylococus aureus | 100 |
| Staphylococus epidermidis | 100 |
(5) 세포독성
도 4를 참조하면, 시료의 농도별로 세포독성을 평가한 결과, 0.1 %(v/v) 농도 이상에서 세포독성이 나타난 것을 확인할 수 있다.
이를 통해 본 발명에 따른 복합체 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 상기 복합체 추출물을 0.1 %(v/v) 이하로 포함될 경우 세포독성이 없을 것으로 예상된다.
(6) NO 생성량
도 5를 참조하면, 대조군의 NO 생성량 대비 LPS 단독 처리 세포군의 NO 생성량은 302.6±16.1%로 유의성있게 증가되었다 (***p < 0.001). 반면에 시료를 0.01 ppm 농도로 처리한 실험군의 NO 생성량은 대조군 대비 302.9±16.6%이고, 시료를 0.025 ppm 농도로 처리한 실험군의 NO 생성량은 대조군 대비 303.5±28.6%이고, 시료를 0.05 ppm 농도로 처리한 실험군의 NO 생성량은 대조군 대비 271.9±23.3%로 나타났으나, LPS 단독 처리 세포군과의 통계적 유의성은 보이지 않았다.
상기 시료를 0.1 ppm 농도로 처리한 실험군의 NO 생성량은 244.0±22.5%로 LPS 단독 처리 세포군 대비 약 19% 감소되어, LPS 단독 처리 세포군의 NO 생성량 대비 유의성 있게 감소된 것을 확인할 수 있다(#p<0.05).
이상에서 설명한 본 발명의 바람직한 실시예들은 기술적 과제를 해결하기 위해 개시된 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 사상 및 범위 안에서 다양한 수정, 변경, 부가 등이 가능할 것이며, 이러한 수정 변경 등은 이하의 특허청구범위에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.
Claims (4)
- (a) 대황, 유백피, 황련 및 당귀의 혼합물에 피마자유를 3 내지 5 중량배수 첨가하여 70 내지 80℃에서 1 내지 8일 간 우려내고, 상기 혼합물을 여과하여 피마자유 추출액을 제조하는 단계;
(b) 상기 피마자유 추출액에 70 내지 90% 메탄올을 5 내지 20 중량배수 첨가하여 80 내지 100℃에서 1 내지 3 시간 진탕하고 분액 깔대기로 옮겨 1 내지 5 시간 방치하여 층을 분리하는 단계; 및
(c) 상기 분리된 메탄올 층을 감압농축 및 동결건조하여 복합 추출물을 수득하는 단계;
를 포함하는 항산화, 항균, 항염증 또는 여드름 피부 개선용 복합 추출물을 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 혼합물의 조성은 대황 3.5 내지 5.77 중량%, 유백피 3.5 내지 5.77 중량%, 황련 3.5 내지 5.77 중량% 및 당귀 3.5 내지 5.77 중량%인 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 복합 추출물은 프로피오니박테리움 아크네균(Propionibacterium acnes), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococus aureus) 및 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococus epidermidis)의 생장 억제, NO 생성 억제, DPPH 라디컬 소거 및 ABTS 라디컬 소거 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 복합 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항균, 항염증 또는 여드름 피부 개선용 화장료 조성물.
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| KR1020220161776A KR20240078980A (ko) | 2022-11-28 | 2022-11-28 | 대황, 유백피, 황련 및 당귀를 포함하는 약재의 피마자유 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 항산화, 항균, 항염 또는 여드름 피부 개선용 화장료 조성물 |
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