KR20240067606A - 동맥경화반의 심혈관질환 예측 마커 및 이를 이용한 심혈관질환 발생 예측 방법 - Google Patents
동맥경화반의 심혈관질환 예측 마커 및 이를 이용한 심혈관질환 발생 예측 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 동맥경화반의 심혈관질환 예측 마커 및 이를 이용한 심혈관질환 발생 예측 방법에 관한 것으로, 말초혈관질환의 조직인 동맥경화반으로부터 MPO 및 PD-L1 발현 수준을 분석하여 수술 후 대상 환자의 심혈관질환의 발생 여부를 예측할 수 있으므로 말초혈관질환 환자의 혈액이 아닌 조직으로부터 신규한 염증인자의 조합으로 이루어진 신규한 심혈관질환 발생 예측 마커로 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 동맥경화반의 심혈관질환 예측 마커 및 이를 이용한 심혈관질환 발생 예측 방법에 관한 것이다.
말초동맥질환 (peripheral artery disease)은 하지 동맥의 협착과 폐색에 의해 하지의 혈류 공급이 저하된 상태를 일컫는 질환으로, 국내의 말초동맥질환 유병율은 4.6%이고 점차 증가 추세를 보이며, 나이가 증가하거나 고혈압, 심혈관질환이 있는 환자에서 증가하는 경향을 나타낸다. 초기에는 보행 시 다리 통증인 파행으로 나타나고, 적절한 시점에 치료를 받지 않으면 악화되어 휴식 시 통증 및 발의 궤양이 발생하는 중증 하지 허혈로 진행한다. 중증 하지 허혈의 경우 1년 이내 사지 절단율이 30% 이상, 2년 사망률은 40%로 보고되어 있을 정도로 예후가 나쁜 질병 중 하나이다.
말초동맥질환은 보통 동맥경화증 (atherosclerosis)에 의해 발생하는 것으로 알려져 있다. 이 때, 동맥경화증의 위험인자는 고혈압, 당뇨, 흡연, 고지혈증 등으로 알려져 있고, 상기 원인은 말초동맥질환 이외의 급성심근경색, 뇌졸중 등 다른 혈관 질환의 위험인자로도 작용하므로, 말초동맥질환 환자는 일반적으로 다른 혈관 질환에 대한 발병률도 높은 경향이 있다. 이에 대하여 말초동맥질환 환자의 30% 이상이 심뇌혈관질환을 동반한다는 보고가 있으며, 말초동맥질환으로 치료받은 환자의 약 20%가 치료 1년 이내 심근경색, 뇌졸중 등으로 인한 입원과 사망이 발생하는 것으로 보고된 바 있다.
한편 말초동맥질환의 원인이 되는 동맥경화증은 지질이상과 염증 반응이 복합되어 발생한다. 동맥경화반 (atheroma, athromatous plaque)은 저밀도 지질단백질이 혈관 내막에 축적되어 형성되는 것으로, 내피세포 기능장애와 투과성 증가, 산화 작용, 염증 세포 침윤 등의 과정을 거쳐 취약한 동맥경화반이 형성된다. 취약한 동맥경화반의 섬유성막이 파열되면 괴사성핵이 노출되어 혈전으로 발전하게 된다.
동맥경화반의 병인에서 콜레스테롤의 역할이 강조되었으나, 점차 염증 반응의 중요성이 높아지고 있으며, 말초 혈액에서 C-반응성 단백질 증가, 호중구-림프구 비율 증가 등이 말초동맥질환의 진행 정도나 다른 혈관 영역의 병변인 심뇌혈관 질환 발생 위험성과 관련되어 있음이 보고되어 있다.
기존의 대부분의 연구들이 말초 혈액에서 염증 표지자를 분석한 것이고, 동맥경화반 조직을 직접 분석한 연구는 제한적이다. 뿐만 아니라, 동맥경화반이나 혈전 조직을 직접적으로 분석한 연구는 대부분 경동맥이나 관상동맥 질환에서 이루어졌고, 말초동맥의 검체를 분석한 연구는 매우 제한적이며, 말초동맥질환 환자의 동맥경화반 조직으로부터 심혈관질환 발생 예측에적용될 수 있는 염증 인자 관련 마커에 대해서는 전혀 보고된 바가 없다.
본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위하여 말초동맥질환 환자의 수술 후 심혈관질환 발생 예측을 위한 정보를 제공하는 방법 및 심혈관질환 발생예측용 키트를 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 하기의 단계를 포함하는 말초동맥질환 환자의 심혈관질환 발생 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다:
대상 환자로부터 분리된 동맥경화반 샘플에서 MPO (myeloperoxidase) 및 PD-L1 (programmed Death-Ligand 1)의 발현 수준을 측정하는 단계;
상기 수준에 근거하여 MPO 및 PD-L1 발현 수준 점수를 도출하는 단계; 및
심혈관질환 발생 가능성을 예측하는 단계.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법이 기재된 설명서 및 면역조직화학 염색 재료를 포함하는 말초동맥질환 환자의 심혈관질환 발생 예측용 키트를 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 하기의 단계를 포함하는 말초동맥질환 환자의 심혈관질환 발생 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다:
대상 환자로부터 분리된 동맥경화반 샘플에서 MPO (myeloperoxidase) 및 PD-L1 (programmed Death-Ligand 1)의 발현 수준을 측정하는 단계;
상기 수준에 근거하여 MPO 및 PD-L1 발현 수준 점수를 도출하는 단계; 및
심혈관질환 발생 가능성을 예측하는 단계.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 발현 수준은 면역조직화학 염색 방법에 의해 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 측정은 MPO에 대하여 염색된 세포 개수 계수 방법을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 세포 개수 계수 방법은 저배율에서 조직의 세포 밀도가 가장 높은 구역을 3 군데 선택한 후, 해당 부위를 고배율에서 관찰하여 염색된 세포의 수를 측정하고 3 군데의 평균값을 산출할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 저배율은 x100 배율이고, 상기 고배율은 x400 배율일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 측정은 PD-L1에 대한 염색 강도분석을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 MPO 및 PD-L1의 발현 점수는 하기 표에 따라 도출될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 MPO 및 PD-L1 발현 수준 점수는 MPO의 발현 수준 점수, 및 PD-L1의 발현 수준 점수를 각각 합산한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 예측은 MPO 발현 세포수가 많거나, PD-L1 염색 강도가 낮을수록 말초동맥질환 환자의 심혈관질환 발생 가능성이 높은 것으로 평가할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 심혈관질환이란 심근경색, 허혈성 뇌경색, 및 심뇌혈관질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 상기 방법이 기재된 설명서 및 면역조직화학 염색 재료를 포함하는 말초동맥질환 환자의 심혈관질환 발생 예측용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 개체에서 분리된 동맥경화반의 MPO, 및 PD-L1 발현 수준을 확인하는 단계를 포함하는 심혈관질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 심혈관질환 진단용 키트를 제조하기 위한 개체에서 분리된 동맥경화반의 MPO, 및 PD-L1 또는 MPO, 및 PD-L1 발현 수준 측정 제제의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 S1) 개체에서 분리된 동맥경화반의 MPO, 및 PD-L1 발현 수준을 확인하는 단계;, S2) 본 발명의 점수 체계를 통해 발현 점수를 도출하여 심혈관질환으로 판단하는 단계;, 및 S3) 심혈관질환으로 판단된 개체를 치료하는 단계를 포함하는 치료 방법을 제공한다.
동맥경화반의 심혈관질환 예측 마커 및 이를 이용한 심혈관질환 발생 예측 방법은 말초혈관질환의 조직인 동맥경화반으로부터 MPO 및 PD-L1 발현 수준을 분석하여 수술 후 대상 환자의 심혈관질환의 발생 여부를 예측할 수 있으므로 말초혈관질환 환자의 혈액이 아닌 조직으로부터 신규한 염증인자의 조합으로 이루어진 신규한 심혈관질환 발생 예측 마커로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 대상 환자의 동맥경화반의 MPO 및 PD-L1 발현 정도를 반영한 심혈관질환 예측 모델의 점수 체계를 나타낸 표이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 심혈관질환 예측 모델에 적용되는 MPO 세포 개수 계수 방법과 관련하여 각각 0점 내지 2점에 해당하는 염색된 세포 개수 별 대퇴동맥경화반 조직의 MPO 면역화학염색 결과를 나타내는 사진이다. A는 MPO에 대하여 염색된 세포가 없는 경우, B는 MPO에 대하여 0 내지 99개, C는 MPO에 대하녀 100 내지 299개, 및 D는 300개 이상의 세포가 염색된 경우의 면역화학염색 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 심혈관질환 예측 모델에 적용되는 PD-L1 염색 강도와 관련하여 각각 0점 내지 3점에 해당하는 염색 강도를 나타내는 대퇴동맥경화반 조직 PD-L1 면역화학염색 결과이다 (x100 배율 및 x400 배율). A 및 B는 염색 강도가 intense인 경우, C 및 D는 염색 강도가 moderate인 경우, E 및 F는 염색 강도가 mile인 경우, G 및 H는 염색 강도가 no reaction인 경우의 면역화학염색 결과를 나타내는 x100 배율 및 x400 배율 사진이다.
도 4는 비모수분석 검정 (Mann-Whitney test) 분석 결과, 혈관질환이 발생한 군과 그렇지 않은 군에서의 MPO와 PD-L1 발현 점수 체계 비교 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 심혈관질환을 예측할 수 있는 인자에 대한 cox regression analysis 의 단변량 (univariate) 및 다변량 (multivariate) 결과를 나타낸 도표이다.
도 6은 MPO와 PD-L1 발현 점수 체계의 심혈관질환에 대한 예측가능성을 평가하고, 점수 체계에 따라 두 군으로 나누어 분석할 때 분류 기준이 되는 점수를 찾기 위한 Receiver operating characteristic analysis을 실시한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 Kaplan-Meier 분석 결과, MPO와 PD-L1 발현 점수 체계에 따라 분류된 두 군의 심혈관질환 발생 위험도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 심혈관질환 예측 모델에 적용되는 MPO 세포 개수 계수 방법과 관련하여 각각 0점 내지 2점에 해당하는 염색된 세포 개수 별 대퇴동맥경화반 조직의 MPO 면역화학염색 결과를 나타내는 사진이다. A는 MPO에 대하여 염색된 세포가 없는 경우, B는 MPO에 대하여 0 내지 99개, C는 MPO에 대하녀 100 내지 299개, 및 D는 300개 이상의 세포가 염색된 경우의 면역화학염색 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 심혈관질환 예측 모델에 적용되는 PD-L1 염색 강도와 관련하여 각각 0점 내지 3점에 해당하는 염색 강도를 나타내는 대퇴동맥경화반 조직 PD-L1 면역화학염색 결과이다 (x100 배율 및 x400 배율). A 및 B는 염색 강도가 intense인 경우, C 및 D는 염색 강도가 moderate인 경우, E 및 F는 염색 강도가 mile인 경우, G 및 H는 염색 강도가 no reaction인 경우의 면역화학염색 결과를 나타내는 x100 배율 및 x400 배율 사진이다.
도 4는 비모수분석 검정 (Mann-Whitney test) 분석 결과, 혈관질환이 발생한 군과 그렇지 않은 군에서의 MPO와 PD-L1 발현 점수 체계 비교 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 심혈관질환을 예측할 수 있는 인자에 대한 cox regression analysis 의 단변량 (univariate) 및 다변량 (multivariate) 결과를 나타낸 도표이다.
도 6은 MPO와 PD-L1 발현 점수 체계의 심혈관질환에 대한 예측가능성을 평가하고, 점수 체계에 따라 두 군으로 나누어 분석할 때 분류 기준이 되는 점수를 찾기 위한 Receiver operating characteristic analysis을 실시한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 Kaplan-Meier 분석 결과, MPO와 PD-L1 발현 점수 체계에 따라 분류된 두 군의 심혈관질환 발생 위험도를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 하기의 단계를 포함하는 말초동맥질환 환자의 심혈관질환 발생 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다:
대상 환자로부터 분리된 동맥경화반 샘플에서 MPO (myeloperoxidase) 및 PD-L1 (programmed Death-Ligand 1)의 발현 수준을 측정하는 단계;
상기 수준에 근거하여 MPO 및 PD-L1 발현 수준 점수를 도출하는 단계; 및
심혈관질환 발생 가능성을 예측하는 단계.
본 발명은 상기 단계를 포함하는 말초동맥질환 환자의 심혈관질환 발생 예측 모델을 설계하였고, 이에 따라 말초동맥질환 환자의 수술 후 심혈관질환 발생 여부 예측할 수 있다.
본 발명에서, 상기 수술은 말초동맥질환 환자가 예방 또는 치료를 위해 받을 수 있는 화학적, 물리적인 방법에 따른 시술, 수술 등을 모두 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 샘플은 동맥경화반 세포 또는 조직이거나, 상기 동맥경화반을 포함하는 세포 또는 조직일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 면역조직화학 분석에 의해 동백경화반을 통해 본 발명에 따른 심혈관질환 발생 예측 마커인 MPO 및 PD-L1의 발현 수준을 확인할 수 있는 임의의 샘플을 모두 포함할 수 있다.
본 발명에서, 발현 수준은 MPO 발현 세포수 수준, 및 PD-L1 염색 강도 수준을 각각 의미할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 발현 수준은 면역조직화학 염색 방법에 의해 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 MPO 발현 세포수, 및 PD-L1 염색 강도는 예를 들어, 말초질환 환자로부터 채취 및 분리된 동맥경화반 조직을 면역조직화학 염색 결과 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 면역조직화학 염색 방법은 면역조직화학 분석 방법 중 하나로, 말초동맥질환 환자의 대퇴 동맥경화반으로부터 채취 및 분리된 조직을 면역조직화학 염색하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 면역조직화학 염색 방법은 동맥경화반 샘플을 염색하기 위한 일반적인 면역조직화학 염색 방법을 의미할 수 있고, 이에 사용되는 임의의 실험 조건이 적용될 수 있다. 예를 들어, 일반적인 면역조직화학 염색 방법이란 샘플을 염색하기 위하여 당업계에서 일반적으로 수행되는 실험 온도, 염색 기간 등의 조건, 염색 재료, 염색 단계 등 임의의 조건이 모두 적용될 수 있다. 이에 더하여, 면역조직화학 염색 방법 중에서도 특히 동맥경화반 샘플을 염색하기 위하여 당업자가 적용할 수 있는 일반적인 조건, 방법, 재료에 대한 것이라면 무엇이든지 포함할 수 있으며, 동맥경화반 샘플 염색에 필요한 최적의 조건, 방법, 재료 등이 추가적으로 더 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 동맥경화반 샘플을 염색하기 위하여 부가적으로 필요한 염색 전 또는 염색 후 과정, 예를 들어, 불순물 제거, 혹은 후처리 방법 등이 염색 방법의 각 단계 전후에 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 측정은 MPO에 대하여 염색된 세포 개수 계수 방법을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 MPO 발현 세포수가 0 내지 99개, 100개 내지 299개, 및 300개 이상인 경우 각각 0점, 1점, 및 2점으로 평가될 수 있다. 이 때, 점수가 클수록 심혈관질환 발생 가능성이 높은 것으로 예측될 수 있다.
세포의 계수는 개체마다 그리고 한 개체 내에서도 관찰하는 조직의 위치에 따라 세포의 밀도, 개수의 차이가 있을 수 있으며, 이에 따라 본 발명의 일 실시예에서 제시하는 심혈관질환 발생 예측 모델에 사용되는 점수가 상이하게 도출되므로 정량적으로 기준이 확립된 세포 계수 방법이 필수적이다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 세포 개수 계수 방법은 저배율에서 조직의 세포 밀도가 가장 높은 구역을 3 군데 선택한 후, 해당 부위를 고배율에서 관찰하여 염색된 세포의 수를 측정하고 3 군데의 평균값을 산출할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 저배율은 x100 배율이고, 상기 고배율은 x400 배율일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 세포 개수 계수 방법은, 예를 들어, The Prognostic Value of Sex-Determining Region Y-Box 2 and CD8+ Tumor-Infiltrating Lymphocytes in Limited-Stage Small-Cell Lung Cancer (Clinical Translational Research, Oncology 2021;99:528-538, 530p, Jinsoo Lee 외 7명)에 기재된 바와 같이 면역조직화학 방법이 적용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이와 같이 고배율로 3-5개의 filed를 확인 후 평균을 내는 단계를 포함하는 분석 방법은 면역화학염색 결과를 분석하기 위하여 당업계에서 일반적으로 활용되는 방법이므로, 통상의 기술자는 본 발명에 따른 면역화학염색된 세포의 계수 방법이 구체적이고 명확히 기재된 것으로 인식할 수 있을 뿐만 아니라, 이에 따라 계수된 세포의 개수 역시 구체적이고 명확한 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 측정은 PD-L1에 대한 염색 강도 분석을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 PD-L1 염색 강도는 no reaction, mild reaction, moderate reaction, 및 intense reaction으로 구분되어 각각 3점, 2점, 1점, 및 0점으로 평가될 수 있다. 이 때, 염색 강도가 높을수록 점수가 낮으므로, 염색 강도가 낮을수록 심혈관질환 발생 가능성이 높은 것으로 예측될 수 있다.
PD-L1의 수준을 확인하기 위한 PD-L1 염색 강도 분석은 기준에 따라 결과 값이 상이하게 도출될 수 있는 문제점이 있으므로 이에 대한 정량적인 기준 확립이 필수적이다.
본 발명의 일 실시예에서 사용되는 상기 no reaction, mild reaction, moderate reaction, 및 intense reaction의 구분에는 도 3이 적용될 수 있다. 도 3은 각각의 경우에 대한 x100 배율 및 x400 배율에서의 염색 결과를 나타내고 있으므로 채취된 동맥경화반 샘플을 면역조직화학 염색 결과와 비교하여 도 3을 기준으로 네 가지 경우 중 어느 하나에 해당하는지 여부를 판단하고, 이에 따라 본 발명의 심혈관질환 예측 모델에 따라 PD-L1 점수가 도출될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, Analysis of PD-L1 expression in trophoblastic tissues and tumors (Human Pathology (2019) 84, 202-212, 205-6p, Bingjian Lu MD 외 8명)에 기재된 바와 같이 면역조직화학 방법이 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이에 따르면, 염색 강도 평가는 기존 PD-L1에 대한 면역조직화학 염색을 시행한 연구를 참고문헌으로 하여, normal trophoblastic tissue를 양성 대조군으로 하여 평가할 수 있다. 예를 들어, 상기 양성대조군보다 발현보다 강하면 Intense reaction, 이와 유사하면 moderate reaction, 이보다 약하면 mild reaction 으로 정하고 평가할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 면역조직화학 분석 결과 평가하는 방법은 염색 강도 및 염색된 세포의 비율로 등급에 의할 수 있다. 이 때, 염색 강도는 없음 (no reaction), 약함 (mild reaction), 보통 (moderate reaction), 및 강함 (intense reaction)을 각각 02ja, 1점, 2점, 및 3점으로 평가하고, 실험군 염색 결과를 상기 염색 강도의 없음, 약함, 보통, 및 강함의 평가는 각 염색 강도를 나타내는 표준적인 슬라이드를 기준으로 분류하는 방법이 적용될 수 있다.
면역조직화학 염색 분석은 기본적으로 intensity 항목을 각각 연구에서 염색하려는 마커의 양성대조군을 정하여 이를 기준으로 intensity의 정도의 판단을 근거로 하는 것이 일반적이다. 따라서, 각 염색 강도를 나타내는 슬라이드가 구체적으로 제시되는 경우 당업계의 통상의 기술자는 면역조직화학 분석 결과를 정량적으로 분석할 수 있는 것이고, 본 발명의 염색 강도 분석에 필요한 기준이 되는 염색의 정도, 및 이를 나타내는 슬라이드가 명확하다는 점에서 발명의 기재가 구체적이며, 따라서 발명의 구성이 명확하게 확정된 것으로 평가될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 MPO 및 PD-L1의 발현 점수는 하기 표에 따라 도출될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 MPO 및 PD-L1 발현 수준 점수는 MPO의 발현 수준 점수, 및 PD-L1의 발현 수준 점수를 각각 합산한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 MPO 및 PD-L1 발현 수준 점수는 본 발명에 따른 심혈관질환 예측 모델에 의해 계산되는 점수를 의미하며, 이 때, 계산되는 점수란 MPO 및 PD-L1 각각 발현 수준에 따라 평가되는 점수의 합산을 의미할 수 있다. 또한, 본 발명의 심혈관질환 예측 모델은 상기 MPO 발현 수준 점수 및 상기 PD-L1 발현 수준 점수를 합산한 점수에 근거할 수 있고, 이에 제한되지 않을 수 있다.
또한, 두 명 이상의 환자로 이루어진 군의 심혈관질환 발생을 예측하는 경우, 각 환자의 발현 수준 점수의 평균으로 예측 여부를 판정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 예측은 MPO 발현 세포수가 많거나, PD-L1 염색 강도가 낮을수록 말초동맥질환 환자의 심혈관질환 발생 가능성이 높은 것으로 평가할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 심혈관질환이란 심근경색, 허혈성 뇌경색, 및 심뇌혈관질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 대퇴 동맥의 내막절제술 후 심근 경색, 허혈성 뇌경색 발생이나 심뇌혈관질환의 발생은 상기 질환으로 인한 예후 악화뿐만 아니라 이로 인한 사망을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 “예후 악화”가 기존의 심근 경색, 허혈성 뇌경색의 질병 진행, 증상 등의 악화를 의미하는 것이면 해당이 되지 않을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 수술 후 추적 관찰 중 새로운 혈관 사건 발생 (심근 경색, 허혈성 뇌경색 발생이나 심뇌혈관 문제로 인한 사망)만이 포함될 수 있고, 이와 같은 기준은 기존 많은 문헌에서 “major adverse cardiovascular events (MACE)”로 지칭하는 것으로 많이 사용되는 결과 변수에 해당하여 적용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 상기 방법이 기재된 설명서 및 면역조직화학 염색 재료를 포함하는 말초동맥질환 환자의 심혈관질환 발생 예측용 키트를 제공한다.
본 발명에서, 상기 키트는 말초동맥질환 환자의 수술 후 심혈관질환 발생을 예측할 수 있도록 하는 도구를 의미할 수 있고, 컨테이너 등을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 컨테이너는 상기 물질을 포장하는 역할을 할 수 있고, 보관 및 고정하는 역할을 할 수도 있다. 상기 컨테이너의 재질은 예컨대, 플라스틱, 유리병 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 키트에는 말초동맥질환 환자로부터 채취 및 분리된 동맥경화반 샘플을 염색할 수 있는 제제, 및 이 외에도 이들의 염색 방법에 통상적으로 필요한 다른 구성 성분, 조성물, 용액, 장치 등이 포함될 수 있으며, 상기의 물질을 적용하는 선후에는 제한이 없고, 각 물질의 적용은 동시에 진행될 수도 있으며, 미시에 진행될 수도 있다.
또한, 본 발명의 키트는 필요한 경우 말초동맥질환 환자로부터 동맥경화반을 채취 및 분리할 수 있는 도구, 재료, 예를 들어, 가위, 핀셋, 붕대, 소독약 등이 더 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, “검출”은 대상의 농도 등을 정량하는 것을 포함할 수 있고, 특정 물질의 유무를 확인하는 정성적인 의미(정성분석)를 포함하므로, 목적하는 물질의 존재(발현) 여부를 측정 및 확인하는 것, 또는 목적하는 물질의 존재 수준(발현 수준)의 변화를 측정 및 확인하는 것을 모두 포함하는 의미이다.
본 발명에서, “수준”은 바람직하게 “측정”에 의해 판단될 수 있고, 상기 정성분석은 목적하는 물질의 존재 여부를 측정 및 확인하는 것을 의미하는 것일 수 있으며, 상기 정량분석은 목적하는 물질의 존재 수준 (발현 수준) 또는 양의 변화를 측정 및 확인하는 것을 의미하는 것일 수 있다. 본 발명에서 수준 분석은 정성적인 방법과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한없이 수행될 수 있으며, 정량적인 측정이 수행되는 것일 수 있다.
본 발명에서, “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 대상 (subject)의 감수성 (susceptibility)을 판정하는 것, 대상이 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상의 예후 (prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스 (therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 “포함” 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로” 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.
본 발명의 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 “이들의 조합”의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 동맥경화반의 MPO 및 PD-L1을 이용한 심혈관질환 예측 모델의 설계
총 37명의 말초동맥질환 환자에서 대퇴동맥 내막절제술을 시행하여 동맥경화반 조직을 제거하였다. 제거된 동맥경화반 조직을 파라핀 블록으로 보관하였고 4-마이크로미터 두께의 슬라이드를 제작한 후, MPO (myeloperoxidase) 및 PD-L1에 대한 면역조직화학 염색을 시행하였다.
MPO 발현 수준은 염색된 세포의 수를 계수하여 표 1의 기준에 따라 해당하는 점수로 평가하였고, PD-L1의 발현 수준은 염색 강도를 분석하여 표 2의 기준에 따라 해당하는 점수로 평가하였다. 그 후, 두 가지 요소인 MPO 및 PD-L1의 발현 수준을 통합하기 위하여 각각의 발현 수준 점수를 합산하여 5점 척도의 점수 체계로 분석되는 심혈관질환 예측 모델을 설계하였다 (도 1).
MPO 발현 수준은 염색된 세포의 수 계수와 관련하여, 개체마다 그리고 한 개체 내에서도 관찰하는 조직의 위치에 따라 세포의 밀도, 개수의 차이가 있을 수 있으므로, 저배율인 x100 배율에서 조직의 세포 개수 (밀도)가 가장 높은 구역을 3 군데 선택한 후, 해당 부위를 고배율인 x400 배율에서 관찰하여 염색된 세포의 수를 측정하고 3 군데의 평균값을 산출하는 방법을 적용하였다.
상기 방법에 따라 표 1에 표기된 점수 0 내지 2점에 해당하는 염색 결과를 도 2에 나타내었다. MPO에 대한 면역화학염색 결과, 도 2의 A는 염색된 세포 없음, B는 염색된 세포 수 0-99개, C는 염색된 세포 수 100-299개, 및 D는 염색된 세포 수 300개 이상을 나타내므로 (x400 배율), 상기 방법에 따라 MPO 발현 수준을 정량적으로 구분하여 점수로 도출하였다.
| MPO 발현 정도 구분 | |
| 점수 | 염색된 세포의 수 (positive cells) |
| 0 | 0-99 |
| 1 | 99-299 |
| 2 | 300 이상 |
또한, PD-L1의 발현 수준을 확인하기 위한 염색 강도의 구분을 위하여 다음과 같은 기준을 적용하였다. 염색이 되지 않은 슬라이드는 no reaction으로 정의하였고, 이외의 슬라이드는 염색의 정도에 따라 3 개의 단계로 구분하고 각각 표준적인 슬라이드를 선정하여 이를 기준으로 분류하였다.
상기 방법에 따라 표 2에 표기된 점수 0 내지 3점에 해당하는 염색 결과를 도 3에 나타내었다. 이에 따르면, no reaction, mild reaction, moderate reaction, 및 intense reaction 각각의 경우에 대한 x100 배율 및 x400 배율에서의 기준이 확인된다. 구체적으로, 도 3의 A 및 B는 no reaction (negative; no color reaction)에 해당하는 x100 배율 및 x400 배율에서의 사진을 나타내고, C 및 D는 mild reaction(positive; mild reaction)에 해당하는 x100 배율 및 x400 배율 사진이며, E 및 F는 moderate reaction (positive; moderate reaction)를 나타내는 x100 배율 및 x400 배율 사진이고, G 및 H는 intense reaction (positive; intense reaction)을 나타내는 x100 배율 및 x400 배율 사진이다.
| PD-L1 발현 정도 구분 | |
| 점수 | 염색 강도 |
| 0 | intense reaction |
| 1 | moderate reaction |
| 2 | mild reaction |
| 3 | no reaction |
본 모델에 따르면, 실험 대상자의 동맥경화반에서 관찰되는 MPO 발현 세포 수가 많을수록, PD-L1 염색 강도가 낮을수록 점수가 높은 것으로 정의된다.
실시예 2. 심혈관질환 발생 추적 확인을 통한 심혈관질환 발생 예측 모델의 검증
실시예 1에서 설계된 심혈관질환 예측 모델을 검증하기 위하여 심혈관질환 환자군을 추적 관찰하여 심혈관질환 발생 여부를 확인하였다. 구체적으로, 대퇴 동맥 내막절제술로 동맥경화반을 제거한 환자를 대상으로 수술을 받은 말초동맥질환 환자들을 평균 수술 후 2년까지 추적 관찰하여 심혈관질환 발생 여부를 확인하였다. 본 실시예에서 심혈관질환 발생은 심근경색, 허혈성 뇌경색, 및 심뇌혈관 문제로 인한 사망으로 정의하였다.
대상 환자들은 심혈관질환이 발생한 군 (positive군)과 심혈관질환이 발생하지 않은 군 (negative군)으로 분류하였고, 실시예 1에 따른 모델에 따라 MPO 및 PD-L1 발현 정도에 따라 점수를 도출하여 각 군을 비교하였다. 이를 비모수분석 방법을 통하여 통계적 차이를 확인하였고, P값이 0.05 미만인 경우에 통계적으로 의미 있는 차이가 있는 것으로 정의하였다.
그 결과, positive군 (n=10)에서는 평균 3.22점 (표준편차 1.64, 중간값 3, 범위 1-5)으로 평가되었고, negative군 (n=16)에서는 평균 1.33점 (표준편차 1.49, 중간값 1, 범위 0-5)으로 평가되었다는 점에서, positive군에서 통계적으로 유의하게 높은 점수가 나타나는 것으로 확인되었다 (P = 0.006).
따라서, 실시예 1에 따른 심혈관질환 예측 모델은 말초질환 환자들의 수술 후 심혈관질환 발생 예측에 우수한 효과를 나타내는 것으로 확인되고, 말초질환 환자의 동맥경화반 내 MPO 및 PD-L1는 심혈관질환 발생 예측에 대한 바이오마커인 것으로 확인되었다.
실시예 3. 통계 분석을 통한 심혈관질환 예측 모델의 검증
실시예 1에서 설계된 심혈관질환 예측 모델을 검증하기 위하여 단변량 분석, 다변량 분석, 콕스-회귀 분석, 및 카플러-마이어 분석을 시행하였다. 구체적으로, 나이, 기저질환, 동반질환 (고혈압, 당뇨, 관상동맥질환, 뇌경색, 심방세동), 흡연력, 수술 전 발목상완지수 수치, 말초 혈액의 C-반응성 단백질, 및 MPO와 PD-L1 발현 점수 체계를 분석에 변수로 포함하여 단변량 분석을 실행하였다.
그 중, 통계적으로 유의한 것으로 확인된 뇌경색, MPO, 및 PD-L1 발현 점수를 포함하여 다변량 분석을 시행하였다. 심혈관사건은 발생은 시간이 포함되는 변수여서 Cox-regression analysis로 분석하였으며, 이 때 P값이 0.05 미만인 경우 통계적으로 의미 있는 차이가 있는 것으로 정의하였다.
그 결과, 혈관질환이 발생한 군과 그렇지 않은 군에서 MPO와 PD-L1 발현 점수 체계는 통계적으로 유의한 차이를 나타내는 것으로 확인되었고 (p= 0.006) (도 4), 다변량 분석에서는 통계적인 경향성이 확인되었다 (P = 0.097) (도 5).
또한, 심혈관사건 발생 분석에는 COX-regression analysis가 적합하다고 판단하여 통계 분석을 수행하였고, 추가적으로 MPO와 PD-L1의 발현 점수 체계를 ROC curve를 그려 cut-off 값을 구하고, 이를 기준으로 두 군 (lower risk vs. higher risk)으로 나누어 Kaplan-Meier 분석 방법으로 심혈관질환 발생 위험도를 분석하였다 (도 6 및 도 7).
이와 같은 결과에 따르면, 대퇴동맥 포함 말초동맥 조직의 MPO 및 PD-L1 발현 정도에 따라 수술 후 심혈관질환 발생 위험도가 예측될 수 있으므로, MPO, 및 PD-L1 조합은 심혈관질환 발생 예측 방법에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
Claims (11)
- 하기의 단계를 포함하는 말초동맥질환 환자의 심혈관질환 발생 예측을 위한 정보를 제공하는 방법:
대상 환자로부터 분리된 동맥경화반 샘플에서 MPO (myeloperoxidase) 및 PD-L1 (programmed Death-Ligand 1)의 발현 수준을 측정하는 단계;
상기 수준에 근거하여 MPO 및 PD-L1 발현 수준 점수를 도출하는 단계; 및
심혈관질환 발생 가능성을 예측하는 단계.
- 제1항에 있어서,
상기 발현 수준은 면역조직화학 염색 방법에 의해 측정되는 것인, 심혈관질환 발생 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 측정은 MPO에 대하여 염색된 세포 개수 계수 방법을 포함하는 것인, 심혈관질환 발생 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
- 제3항에 있어서,
상기 세포 개수 계수 방법은 저배율에서 조직의 세포 밀도가 가장 높은 구역을 3 군데 선택한 후, 해당 부위를 고배율에서 관찰하여 염색된 세포의 수를 측정하고 3 군데의 평균값을 산출하는 것인, 심혈관질환 발생 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
- 제4항에 있어서,
상기 저배율은 x100 배율이고, 상기 고배율은 x400 배율인 것인, 심혈관질환 발생 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 측정은 PD-L1에 대한 염색 강도 분석을 포함하는 것인, 심혈관질환 발생 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 MPO 및 PD-L1의 발현 점수는 하기 표에 따라 도출되는 것인, 심혈관질환 발생 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 MPO 및 PD-L1 발현 수준 점수는 MPO의 발현 수준 점수, 및 PD-L1의 발현 수준 점수를 각각 합산한 것인, 심혈관질환 발생 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 예측은 MPO 발현 세포수가 많거나, PD-L1 염색 강도가 낮을수록 말초동맥질환 환자의 심혈관질환 발생 가능성이 높은 것으로 평가하는 것인, 심혈관질환 발생 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 심혈관질환이란 심근경색, 허혈성 뇌경색, 및 심뇌혈관질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 심혈관질환 발생 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
- 제1항의 방법이 기재된 설명서 및 면역조직화학 염색 재료를 포함하는 말초동맥질환 환자의 심혈관질환 발생 예측용 키트.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20220124941A (ko) | 2021-03-04 | 2022-09-14 | 계명대학교 산학협력단 | 당뇨 전단계 진단 또는 당뇨 합병증 발병 예측용 바이오마커 및 이의 용도 |
-
2022
- 2022-11-09 KR KR1020220148812A patent/KR20240067606A/ko unknown
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