KR20240063883A

KR20240063883A - 반려동물에서의 바이오마커 검출의 방법

Info

Publication number: KR20240063883A
Application number: KR1020247007120A
Authority: KR
Inventors: 유샨 왕
Original assignee: 유니 파르마 컴퍼니, 리미티드
Priority date: 2021-09-28
Filing date: 2022-09-15
Publication date: 2024-05-10
Also published as: TW202313954A; US20230096313A1; JP2024535100A; CN117980496A; EP4409019A1; WO2023055577A1

Abstract

혈액 샘플 내의 피브린/피브리노겐 분해 산물(fibrin/fibrinogen degradation products, "FDP")을 정량화하는 두 가지 방법이 개시된다. 첫번째 방법은 사람이 아닌 동물로부터 혈액 샘플을 수득하는 단계, 혈액 샘플을 원심분리하여 제1 상청액을 수득하는 단계, 제1 상청액을 수집하는 단계, 제1 상청액을 원심분리하여 제2 상청액을 수득하는 단계, 제2 상청액을 수집하는 단계, 제2 상청액을 희석하는 단계, 희석된 제2 상청액을 FDP에 특이적으로 결합하는 항체를 함유하는 시약과 접촉시키는 단계, FDP에 특이적으로 결합된 항체의 양을 검출함으로써 혈액 샘플 내의 FDP를 정량화하는 단계를 특징으로 한다. 두번째 방법은 희석된 제2 상청액을 FDP를 특이적으로 검출하는 정량 면역분석법을 수행하여 비인간 혈액 샘플 내의 FDP의 양을 정량화하는 단계가 필요하다.

Description

반려동물에서의 바이오마커 검출의 방법

사람과 마찬가지로 반려동물도 의학의 발전과 예방 관리 및 영양 개선으로 인해 수명이 길어지고 있다. 반려동물의 수명이 길어질수록 노화 특히 암과 같은 질병에 걸릴 확률이 높아진다. 매년 약 600만 마리의 개와 약 600만 마리의 고양이가 암으로 진단되고 있다.

동물의 암 종류는 거의 100가지가 넘는다. 반려동물에게 발생하는 암은 피부, 뼈, 유방, 머리 및 목, 림프계, 복부, 및 고환에서 발견될 수 있다. 백혈병은 고양이에게 가장 흔한 암이며, 림프종과 유선암(mammary gland cancer)은 개에게 가장 흔한 암이다.

개는 다른 반려동물들에 비해 더 많은 형태의 암에 걸린다. 미국 수의암학회(Veterinary Cancer Society)에 따르면, 암은 개의 47%, 특히 10세 이상 개의 주요 사망 원인이 된다.

암배아항원(carcinoembryonic antigen) 및 피브린/피브리노겐 분해 산물과 같이 인간 혈청에 존재하는 많은 바이오마커들은 암과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 특정 바이오마커들은 인간 암의 진행을 예측할 수 있는 것으로 확인되었지만, 인간이 아닌 동물의 암에 대한 연구는 아직 산발적으로 이루어지고 있는 실정이다.

동물 암과 관련된 바이오마커들을 검출하는 방법을 개발하여 암의 초기 단계에서 적절한 치료를 시행함으로써, 생존율을 높일 수 있는 방법을 개발할 필요가 있다.

개요

이러한 필요를 충족하기 위해, 혈액 샘플에서 피브린/피브리노겐 분해 산물("FDP")을 정량하는 방법을 제공한다. 이 방법은 사람이 아닌 동물로부터 혈액샘플을 수득하는 단계, 혈액 샘플을 원심분리하여 제1 상청액을 수득하는 단계와 제1 상청액을 수집하는 단계, 제1 상청액을 원심분리하여 제2 상청액을 수득하는 단계와 제2 상청액을 수집하는 단계, 제2 상청액을 희석하는 단계, 희석된 제2 상청액을 FDP에 특이적으로 결합하는 항체를 함유하는 시약과 접촉시키는 단계, FDP에 결합하지 않은 항체를 제거하는 단계, 및 FDP에 특이적으로 결합한 항체의 양을 검출함으로써 혈액 샘플에서 FDP를 정량화하는 단계를 통해 수행된다.

또한, 혈액 샘플 내의 FDP 양을 정량화하는 두번째 방법을 제공한다. 이 방법은 사람이 아닌 동물의 혈액 샘플을 수득하는 단계, 혈액 샘플을 원심분리하여 제1 상청액을 수득하는 단계와 제1 상청액을 수집하는 단계, 제1 상청액을 원심분리하여 제2 상청액을 수득하는 단계와 제2 상청액을 수집하는 단계, 제2 상청액을 희석하는 단계, 희석된 제2 상청액을 FDP를 특이적으로 검출하는 정량 면역분석법(quantitative immunoassay)을 수행함으로써 혈액 샘플 내의 FDP 양을 정량화하는 단계를 통해 달성된다.

본 발명의 여러 실시예에 대한 자세한 내용은 아래의 설명에 제시되어 있다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 장점은 발명의 설명과 도면, 그리고 첨부된 청구범위를 통해 명백해질 것이다.

아래의 설명은 첨부 도면을 참조한다.
도 1a는 대조군 개와 종양을 보유한 개의 DR-70 항원 발현 수준의 도시를 나타낸 것이다.
도 1b는 도 1a에 제시된 데이터로부터 계산되고, 다양한 컷오프 값을 통해 구성된 수용자 반응 특성(receiver operator characteristic) 곡선을 나타낸 것이다.

앞서 요약한 바와 같이, 혈액 샘플 내의 FDP를 정량화하기 위한 첫번째 방법이 개시된다. 이 방법은 비인간 혈액 샘플을 원심분리하여 제1 상청액을 얻는 단계를 특징으로 한다.

바람직하게는, 비인간 혈액 샘플은 포유류, 예를 들어 개, 고양이, 토끼, 기니피그, 페럿(ferret), 또는 돼지의 혈액 샘플이다. 혈액은 당업자에 알려진 임의의 방법으로 얻을 수 있다.

특정 첫번째 방법에서, 항응고 처리된 혈액이 사용될 수 있다. 예를 들어, 신선혈(fresh blood)은 응고를 방지하기 위해, 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid) 또는 구연산 나트륨(sodium citrate)으로 처리될 수 있다. 비인간 혈액 샘플의 항응고 처리는 본 발명을 수행하기 위해 필수가 아니며, 응고된 전혈도 사용될 수 있다.

비인간 혈액 샘플은 원심분리를 통해 혈구(blood cells)를 제거하여 제1 상청액을 수득한다. 원심분리는 10 x g 내지 2,000 x g (예를 들어, 10 x g, 50 x g, 100 x g, 250 x g, 500 x g, 1000 x g, 1250 x g, 1500 x g, 및 2000 x g)로 30초 내지 30분(예를 들어, 30초, 1분, 5분, 10분, 15분, 20분, 25분, 및 30분) 동안 수행될 수 있다.

예를 들어, 혈구 펠릿 상단으로부터 제1 상청액을 피펫팅함으로써 제1 상청액을 수집한 후, 제1 상청액은 다시 원심분리하여 제2 상청액을 수득한다. 이 두번째 원심분리 단계는 1,000 x g 내지 50,000 x g (예를 들어, 1,000 x g, 2,500 x g, 5,000 x g, 10,000 x g, 11,000 x g, 12,000 x g, 13,000 x g, 14,000 x g, 15,000 x g, 16,000 x g, 17,000 x g, 18,000 x g, 19,000 x g, 20,000 x g, 25,000 x g, 30,000 x g, 35,000 x g, 40,000 x g, 45,000 x g, 및 50,000 x g)에서 30초 내지 30분 (예를 들어, 30초, 1분, 5분, 10분, 15분, 20분, 25분, 및 30분) 동안 수행된다.

제2 상청액을 수집한 후, 제2 상청액을 적절한 희석제로 희석하여 면역 검출을 위해 준비한다. 예를 들어, 인산염 완충 식염수("PBS")가 제2 상청액을 희석하기 위해 사용될 수 있다.

제2 상청액은 1:5 내지 1:10,000, 바람직하게는 1:50 내지 1:5,000, 더 바람직하게는 1:100 내지 1:1,000의 비율로 희석될 수 있다. 허용 가능한 희석 비율은 예를 들면, 1:5, 1: 25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:300, 1:400, 1:500, 1:750, 1:1,000, 1:1,500, 1:2,000, 1:2,500, 1:3,000, 1:3,500, 1:4,000, 1:4,500, 1:5,000, 1:7,500, 및 1:10,000이 될 수 있다.

그런 다음 희석된 제2 상청액을 FDP에 특이적으로 결합하는 항체가 포함된 시약과 접촉시킨다.

FDP에 특이적으로 결합하는 항체를 개발하는 것은 통상의 기술자의 기술 범위 내에 있다. 예를 들어, 개와 같은 목적 동물로부터 분리한 FDP를 토끼에 접종하여 FDP에 특이적으로 결합하는 항체를 함유하는 다클론 혈청을 얻을 수 있다. 마우스에 FDP 및 양성 반응 동물로부터 분리한 비장세포(splenocyte)를 접종하여 FDP에 대한 단일 클론 항체를 얻을 수 있다. 특정 예시로, 인간 FDP에 결합하는 특정 항체는 다른 종의 FDP와 교차 반응한다. 따라서, 항-인간 FDP 다클론 항체 또는 단일 클론 항체는 시약으로 사용될 수 있다.

상기의 방법은 희석된 제2 상청액을 시약과 접촉시키는 단계를 필요로 한다. 이 단계는 예를 들어, 희석된 제2 상청액을 플레이트 표면에 흡착시키고, 플레이트 표면을 항-FDP 항체를 함유하는 시약에 노출시킴으로써, 달성할 수 있다. 다른 일 예로는, 희석된 제2 상청액을 튜브 내에서 시약과 혼합하는 방법이 있다.

시약 내의 항-FDP 항체가 희석된 제2 상청액 내의 FDP에 결합할 수 있도록 충분한 시간을 허용한 후, 미결합 항체는 제거한다. 예를 들어, 희석된 제2 상청액을 플레이트에 흡착시킨 경우에, PBS/폴리소르베이트-20과 같은 적절한 세정제 용액으로 세척함으로써 미결합 항-FDP 항체를 제거할 수 있다. 또한, 희석된 제2 상청액을 시약과 튜브 내에 혼합하는 경우에, 미결합 항체는 FDP에 또한 결합하는 제2 항체를 첨가하고 제2 항체를 포획함으로써 결합된 항체로부터 분리하고 제거할 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 방법은 접촉 단계 이후에 FDP에 특이적으로 결합된 항체의 양을 검출하는 단계를 포함한다. 시약 내의 항-FDP 항체는 형광 또는 효소로 표지될 수 있고, FDP에 결합된 항-FDP 항체의 양은 예를 들어, 형광 표지 항체를 사용하는 경우에는, 형광의 강도에 의해, 또는 효소 표지 항체를 사용하는 경우에는, 비색 방법에 의해서 측정될 수 있다. 특이적으로 결합된 항-FDP 항체를 검출하기 위한 방법은 당업자에게 알려진 임의의 방법이 사용될 수 있다.

제2 상청액 내의 FDP의 양은 여러가지 방법으로 정량화 할 수 있다. 특정 일 예로, 상이한 희석 비율에서 정제된 FDP 표준물질(standard)에 결합된 항-FDP 항체의 양을 제2 상청액에서 검출된 양과 비교한다.

상기 방법은 비교 목적으로 동일한 종의 여러 동물들의 혈액 샘플에 대해 수행할 수 있다. 예를 들어, 이 방법은 암에 걸리지 않은 개의 혈액 샘플에서 FDP 수치를 측정하여 기준값을 설정하는 데에 사용할 수 있다. 동일한 방법으로 암에 걸린 개의 혈액 샘플에서 FDP 수치를 측정하여 이 수치가 암이 없는 다른 동물의 수치와 다른 지 알아볼 수 있다.

개요 부분에서 혈액 샘플 내의 FDP를 정량화하는 두번째 방법에 대해 언급하였다. 두번째 방법은 앞서 자세히 서술한 첫번째 방법과 특정 단계들을 공유한다. 두번째 방법은, 첫번째 방법과 마찬가지로, (i) 사람이 아닌 동물로부터 혈액 샘플을 수득하는 단계, (ii) 혈액 샘플을 원심분리하여 제1 상청액을 수득하는 단계, (iii) 제1 상청액을 수집하는 단계, (iv) 제1 상청액을 원심분리하여 제2 상청액을 수득하는 단계, (v) 제2 상청액을 수집하는 단계, 및 (vi) 제2 상청액을 희석하는 단계를 필요로 한다. 두번째 방법은 희석된 제2 상청액을 FDP를 특이적으로 검출하는 정량 면역분석법(quantitative immunoassay)을 수행하여 혈액 샘플 내의 FDP 양을 정량화하는 단계를 특징으로 한다.

두번째 방법은, 앞서 서술한 첫번째 방법과 마찬가지로, 비인간 혈액 샘플의 항응고 처리가 필수가 아니다. 응고된 전혈도 사용될 수 있다.

두번째 방법에서 원심분리 단계 및 희석은 첫번째 방법과 동일한 방법으로 수행된다. 이를 다시 설명하면, 비인간 혈액 샘플을 30초 내지 30분 동안 10 x g 내지 2,000 x g로 원심분리하여 제1 상청액을 수득하고, 제1 상청액을 30초 내지 30분 동안 1,000 x g 내지 50,000 x g로 원심분리하여 제2 상청액을 수득하며, 제2 상청액은 1:5 내지 1:10,000의 비율로 희석하여 정량 면역분석법에 사용한다.

정량 면역분석법은, 다음으로 제한되지는 않으나, 효소결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, "ELISA"), 효소 증식 면역 분석 기술(enzyme multiplied immunoassay technique), 정량적 면역조직화학분석법(quantitative immunohistochemistry assay), 방사면역분석법(radioimmunoassay), 면역형광 분석법(immunofluorescence assay), 유세포 분석법(flow cytometry assay), 단백질 마이크로어레이 분석법(protein microarray assay), 전기화학발광 분석법(electrochemiluminescence assay), 마이크로비드 분석법(microbead assay), 미세유체 면역분석법(microfluidic immunoassay), 또는 표면 플라즈몬 공명 면역분석법(surface plasmon resonance immunoassay)일 수 있다.

특정 예로, 정량적 면역분석법은 FDP에 특이적으로 결합하는 항체를 함유하는 다클론 토끼 혈청을 사용하는 ELISA이다. 또 다른 예로, 정량적 면역분석법은 FDP에 특이적으로 결합하는 단일 클론 항체를 사용하는 ELISA이다. ELISA는 민감도를 높이기 위해 제2 항-FDP 항체를 사용하는 샌드위치 ELISA일 수 있다.

마지막으로, 두번째 방법에서는, 개, 고양이, 토끼, 기니피그, 페럿, 또는 돼지와 같은 포유동물로부터 비인간 혈액 샘플을 채취한다.

더 이상의 상세한 설명이 없이도 통상의 기술자는 본원에 개시된 내용에 기초하여 본 개시 내용을 최대한 활용할 수 있다. 따라서, 후술할 구체적인 실시예들은 단지 설명을 위한 것으로 해석되어야 하며, 본 명세서에 개시된 나머지 부분을 어떠한 방식으로든 제한하지 않는다.

실시예

실시예 1: 혈액 샘플 준비

세포학 및/또는 조직 병리학에 의해 확인된 암을 갖는 262 마리의 개로부터 혈액 샘플을 채취하였다. 또한, 건강한 동물 54마리로부터도 혈액 샘플을 채취하였다. 모든 경우에, 반려동물의 소유자로부터 연구 목적의 임상 데이터 사용에 대한 사전동의를 얻었다.

전혈을 항응고제(에틸렌디아민 테트라아세트산) 처리된 튜브에 수집하였다. 수집 직후 튜브를 10분간 1500 RPM으로 원심분리하고, 이어서 상청액을 제거하고 10분간 16,000 x g로 원심분리하였다. 그 결과 생성된 상청액을 PBS에 1:200의 비율로 희석하여 면역검출 분석법에 사용하였다.

실시예 2: 효소결합 면역흡착 분석법("ELISA")

토끼 다클론 혈청을 피브린과 FDP를 조합한 항원인 DR-70 항원에 대해 배양하였다. 혈액 샘플 내의 FDP는 후술하는 바와 같이 샌드위치 ELISA 분석에서 항-DR-70 항원의 항체를 사용하여 정량적으로 측정하였다.

친화성(affinity) 정제된 항-DR-70 토끼 혈청을 96-웰 플레이트의 웰에 코팅한 다음, 희석된 혈액 샘플 100 μL와 함께 실온에서 30분간 배양하였다. 웰을 세척한 후, 홀스래디쉬 과산화효소(horseradish peroxidase, "HRP")-접합 항-DR70 항체를 각 웰에 첨가하고 30분 동안 배양한 후 세척하였다. 결합된 HRP-접합 항-DR70 항체의 검출을 테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine) 기질을 첨가하고, 충분히 색이 발현된 다음 0.1 N HCl로 반응을 중단시킴으로써 달성하였다. 색상 강도는 450 nm 파장에서 마이크로플레이트 리더기로 측정하였다. DR-70의 농도는 정제된 DR-70에서 얻은 표준 곡선과 비교하여 계산하였다. 결과는 도 1a에 표시하였다.

건강한 동물의 혈액 샘플 내 DR-70 농도의 중간값은 1.163 μg/mL (0.1010-1.775 μg/ml; n=54)였다. 암으로 고통받는 개의 혈액 샘플 내 DR-70 농도의 중간값은 2.132 μg/mL (0.3495-4.355 μg/ml; n=262)로, 건강한 동물의 농도보다 유의미하게 높은 값이었다(p<0.0001; Kruskal-Wallis test).

실시예 3: 진단 유용성

개의 암 진단에 DR-70 수치를 사용한 것의 유용성을 수용자 반응 특성(Receiver Operator Characteristics)을 만들고, 곡선 아래 면적(area under the curve, "AUC")을 계산하여 시험하였다. 결과는 도 1b에 표시하였다. DR-70의 AUC는 0.9185 (95% 신뢰구간 0.8876 내지 0.9494; p<0.0001)로서, DR-70 수치를 이용하여 암에 걸린 개와 건강한 동물을 쉽게 구별할 수 있음을 나타내었다.

DR-70 혈중 농도에 대한 최적의 컷오프 값은 상이한 컷오프 값에서 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)를 계산하여 결정하였다. 데이터는 아래의 표 1에 나타내었다.

선택된 컷오프 값에서 DR-70의 민감도 및 특이도

DR-70 (μg/mL)	민감도 (%)	95% CI	특이도 (%)	95% CI
> 1.492	85.50	80.72% 내지 89.25%	79.63	67.10% 내지 88.23%
> 1.494	85.11	80.30% 내지 88.92%	79.63	67.10% 내지 88.23%
> 1.497	84.73	79.88% 내지 88.58%	79.63	67.10% 내지 88.23%
> 1.503	84.73	79.88% 내지 88.58%	81.48	69.16% 내지 89.62%
> 1.508	84.35	79.46% 내지 88.25%	81.48	69.16% 내지 89.62%
> 1.513	84.35	79.46% 내지 88.25%	83.33	71.26% 내지 90.98%
> 1.518	83.97	79.04% 내지 87.92%	83.33	71.26% 내지 90.98%
> 1.523	83.59	78.62% 내지 87.58%	83.33	71.26% 내지 90.98%
> 1.528	83.21	78.21% 내지 87.25%	83.33	71.26% 내지 90.98%
> 1.532	82.82	77.79% 내지 86.91%	83.33	71.26% 내지 90.98%
> 1.536	82.44	77.38% 내지 86.57%	83.33	71.26% 내지 90.98%

DR-70의 최적의 컷오프 농도는 1.513 μg/mL였으며, 민감도는 84.35% (95% CI: 79.46- 88.25%), 특이도는 83.33% (95% CI: 71.26- 90.98%)였다.

본 명세서에 개시된 모든 특징들은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각 특징들은 동일하거나 동등하거나 유사한 목적을 제공하는 대체 특징들로 대체될 수 있다. 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 개시된 각 특징들은 동등하거나 유사한 특징들의 일반적인 일련의 예일뿐이다.

이상의 설명으로부터 통상의 기술자는 본 발명의 본질적인 특성을 쉽게 확인할 수 있으며, 본 발명의 사상과 범위를 벗어나지 않고, 본 발명을 다양한 용도와 조건에 맞게 다양하게 변경 및 수정할 수 있다. 따라서, 다른 실시예들도 다음의 청구범위의 범위 내에 있다.

Claims

다음의 단계들을 포함하는, 혈액 샘플에서 피브린/피브리노겐 분해 산물(fibrin/fibrinogen degradation products, FDP)을 정량화(quantifying)하기 위한 방법:
사람이 아닌 동물로부터 혈액 샘플을 수득하는 단계;
혈액 샘플을 10 x g 내지 2,000 x g로 원심분리하여 제1 상청액(supernatant)을 수득하는 단계;
제1 상청액을 수집하는 단계;
제1 상청액을 1,000 x g 내지 50,000 x g로 원심분리하여 제2 상청액을 수득하는 단계;
제2 상청액을 수집하는 단계;
제2 상청액을 1:5 내지 1:10,000 비율로 희석하는 단계;
희석된 제2 상청액을 FDP에 특이적으로 결합하는 항체를 함유하는 시약과 접촉시키는 단계;
FDP에 결합하지 않은 항체를 제거하는 단계; 및
FDP에 특이적으로 결합된 항체의 양을 검출함으로서 혈액 샘플에서 FDP를 정량화하는 단계.
제1항에 있어서,
혈액 샘플은 항응고 처리되는, 방법.
제1항에 있어서,
사람이 아닌 동물은 개, 고양이, 토끼, 기니 피그(guinea pig), 페럿(ferret), 또는 돼지인, 방법.
제1항에 있어서,
항응고 처리된 혈액 샘플은 30초 내지 30분 동안 원심분리되는, 방법.
제4항에 있어서,
제2 상청액은 30초 내지 30분 동안 원심분리되는, 방법.
제5항에 있어서,
제2 상청액은 접촉 단계 전에 1:50 내지 1:5,000의 비율로 희석되는, 방법.
제6항에 있어서,
제2 상청액은 접촉 단계 전에 1:100 내지 1:1,000의 비율로 희석되는, 방법.
다음의 단계들을 포함하는, 혈액 샘플에서 피브린/피브리노겐 분해 산물(FDP)을 정량화하기 위한 방법:
사람이 아닌 동물로부터 혈액 샘플을 수득하는 단계;
혈액 샘플을 10 x g 내지 2,000 x g로 원심분리하여 제1 상청액을 수득하는 단계;
제1 상청액을 수집하는 단계;
제1 상청액을 1,000 x g 내지 50,000 x g로 원심분리하여 제2 상청액을 수득하는 단계;
제2 상청액을 수집하는 단계;
제2 상청액을 1:5 내지 1:10,000 비율로 희석하는 단계;
희석된 제2 상청액을 FDP를 특이적으로 검출하는 정량 면역분석법(quantitative immunoassay)을 수행함으로써 혈액 샘플 내의 FDP 양을 정량화하는 단계.
제8항에 있어서,
혈액 샘플은 항응고 처리되는, 방법.
제8항에 있어서,
정량 면역분석법은 효소결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 면역조직화학법(immunohistochemistry), 면역형광분석법(immunofluorescence assay), 유세포 분석법(flow cytometry assay), 또는 미세유체 면역분석법(microfluidic immunoassay)인, 방법.
제10항에 있어서,
정량 면역분석법은 FDP에 특이적으로 결합하는 항체를 함유하는 다클론 토끼 혈청(polyclonal rabbit serum)을 사용하는 ELISA인, 방법.
제10항에 있어서,
정량 면역분석법은 FDP에 특이적으로 결합하는 단일 클론 항체를 사용하는 ELISA인, 방법.
제9항에 있어서,
사람이 아닌 동물은 개, 고양이, 토끼, 기니 피그, 페럿, 또는 돼지인, 방법.
제9항에 있어서,
항응고 처리된 혈액 샘플은 30초 내지 30분 동안 원심분리되는, 방법.
제14항에 있어서,
제2 상청액은 30초 내지 30분 동안 원심분리되는, 방법.
제15항에 있어서,
제2 상청액은 수행 단계 전에 1:50 내지 1:5000 비율로 희석되는, 방법.
제16항에 있어서,
제2 상청액은 수행 단계 전에 1:100 내지 1: 1000의 비율로 희석되는, 방법.