KR20240058835A

KR20240058835A - 미세입자 조직 스캐폴드 조성물, 장치, 제조 방법 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20240058835A
Application number: KR1020247002139A
Authority: KR
Inventors: 이샤이 아타르; 시닉 케렌; 샤니 코헨
Original assignee: 바이오-체인지 엘티디.
Priority date: 2021-06-21
Filing date: 2022-06-21
Publication date: 2024-05-03
Also published as: IL309563A; WO2022269351A2; EP4358988A2; CA3224921A1; WO2022269351A3; BR112023026974A2; AU2022299473A1; CN118139634A

Abstract

본 개시내용의 실시양태는 신체 윤곽형성, 조직 공학, 재생 의학, 미용 피부과 및 재건 시술 또는 수술을 위한 입자, 조성물, 조직 스캐폴드, 장치, 및 이의 용도 및 방법에 관한 것이다.

Description

미세입자 조직 스캐폴드 조성물, 장치, 제조 방법 및 이의 용도

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 35 U.S.C. §119(e)에 의거하여, 2021년 6월 21일에 출원된 미국 가특허출원 제62/567,919호에 대한 우선권 혜택을 주장하고, 상기 출원의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.

발명의 분야

본 개시내용의 실시양태는 재건 용도를 위한 주사 가능한 미세입자 스캐폴드 조성물에 관한 것이다.

연조직 손상 및 손실의 높은 발생률은 급성 조직 손상, 질환, 또는 유방 종괴절제 또는 종양 제거와 같은 선택적 절차로 인해 환자들 사이에서 발생한다. 이러한 종류의 손상과 치료 시술 및 수술의 결과는 대부분의 경우에 미학적으로 만족스럽지 못하여, 흔히 재건을 위한 순차적인 후속 수술을 필요로 할 수 있는 흉터 및 조직 변형을 야기한다. 추가 단점은 노화 과정의 결과로서 피부 단백질, 유연성 및 부드러움의 손실에 기인할 수 있다.

현재 이용가능한 치료 옵션은, 성공률이 낮은 수술 절차이고 환자의 이환율과 관련되는 분해성 필러 또는 지방 이식에 의존한다. 대부분의 생분해성 진피 필러는 일시적인 효과 또는 부자연스러운 결과로 인한 어려움이 있다. 실리콘 또는 폴리메틸-메타크릴레이트 미세구(PMMA)와 같은 영구 필러는 재발성 혈종, 부종, 비대성 흉터, 결절 형성 및 일부 경우의 암을 포함한 심각한 유해 임상 결과를 야기하는 것으로 알려져 있기 때문에 현재는 거의 사용되지 않으며 안전하지 않은 것으로 간주된다.

따라서, 손실되거나 감소된 연조직 부피의 재건, 재생, 또는 결함 또는 결손된 조직의 대체를 도울 수 있는 적절한 제제가 요구된다.

젤라틴은 조직 공학 및 재생 의학을 위한 매력적인 이식 가능한 생체물질을 제공한다. 가교된 구조를 얻기 위해, 펜던트 메타크릴레이트 기로 변형된 상업적으로 입수 가능한 젤라틴, 예를 들어 젤라틴 메타크릴레이트(GelMA)에 UV 광을 가하면 라디칼 중합을 사용하여 가교된 하이드로겔을 제조한다. 이러한 예에서, 가교는 독성 자유 라디칼을 남기고 최적이 아닌(sub-optimal) 생체적합성을 갖는다.

따라서, 재건 용도, 예를 들어 신체 윤곽형성 및 생체자극을 위한 안전하고 저렴하며 비용 효율적인 이식 가능한 조직 스캐폴드가 요구된다. 더욱이, 조직 스캐폴드는 해로운 면역계 반응(즉, 면역원성의 결여)을 유도하지 않아야 한다. 또한 이는 육아종의 위험이 없도록 짧은 시간 내에 분해 가능해야 한다.

또 다른 요구는 조직에 주사된 세포 요법의 시딩(seeding) 및 생존을 향상시키는 것이다. 이러한 세포는 일반적으로 잘 유지되지 않으며, 처리된 조직에서 부착을 위한 초기 및 중간 베드 역할을 하는 지지성 생체적합성 스캐폴드를 제공함으로써 이러한 세포를 돕는 것이 요구된다.

본 개시내용의 한 가지 목적은 임의로 효소에 의해 가교되고 임의로 체내로 또는 바늘을 갖는 주사기를 통해 주사될 수 있는 개선된 미세입자 다공성 스캐폴드 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 목적은 가교된 단백질을 포함하는 복수의 입자에 관한 것일 수 있고; 여기서, 상기 복수의 미세입자는 적어도 하나의 RGD(Arg-Gly-Asp) 모티프를 포함하고; 상기 복수의 미세입자는 본질적으로 또는 실질적으로 가교제 무함유이며; 상기 복수의 미세입자는 수불용성이다. 복수의 미세입자의 일 양상은 가교된 단백질이 젤라틴, 콜라겐, 카제인, 엘라스틴, 트로포엘라스틴, 알부민, 이들의 조작된 단백질 등, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택될 수 있거나; 또는 다른 양상에서, 가교된 단백질은 비재조합 젤라틴, 재조합 젤라틴, 비재조합 콜라겐, 재조합 콜라겐, 조작된 단백질 또는 이의 합성 단백질, RGD 모티프가 연결된 임의의 조작된 중합체 등, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 일부 양상은 0.1 ㎛ 내지 2000 ㎛(예를 들어, 40 ㎛ 내지 100 ㎛; 60 ㎛ 내지 90 ㎛)로부터 선택된 입자 크기(예를 들어, 건조 또는 습윤 입자); 0.1 ㎛ 내지 2000 ㎛(예를 들어, 40 ㎛ 내지 100 ㎛; 60 ㎛ 내지 90 ㎛)로부터 선택된 적어도 2가지의 상이한 입자 크기; 0.1 ㎛ 내지 2000 ㎛(예를 들어, 30 ㎛ 내지 500 ㎛; 40 ㎛ 내지 100 ㎛; 60 ㎛ 내지 90 ㎛)로부터 선택된 평균 입자 크기, 또는 이들의 조합의 동결건조된 발포체 입자로 구성된 본 개시내용의 복수의 입자를 제공한다.

본 개시내용의 다른 목적에서, 본원에 설명된 복수의 미세입자를 제조하는 방법은 (a) 가교성 단백질 용액과 가교제 용액을 혼합하는 단계로서, 상기 가교성 단백질 용액이 적어도 하나의 RGD(아르기닌-글리신-아스파르테이트(Arg-Gly-Asp)) 모티프를 포함하거나 이에 연결된 가교성 단백질 또는 조작된 중합체를 액체에 용해시키는 것을 포함하고; 상기 가교제 용액이 가교제를 액체에 용해시키는 것을 포함하는 것인 단계; (b) (a)의 혼합된 가교성 단백질 용액과 가교제 용액을 포함하는 가교된 발포체를 형성하는 단계; (c) (b)의 가교된 발포체로부터 가교제를 제거하여 가교제 무함유 발포체를 형성하는 단계; 및 (d) (b)의 형성된 가교된 발포체, (c)의 가교제 무함유 발포체, 또는 (b)의 형성된 가교된 발포체와 (c)의 가교제 무함유 발포체의 조합의 크기를 감소시켜, 크기 감소된 (b)의 가교된 발포체 및/또는 크기 감소된 (c)의 가교제 무함유 발포체를 포함하는 복수의 미세입자를 형성하는 단계를 포함한다. 본 방법의 또 다른 양상은 (a1) 가교성 단백질을 교반하거나 연속적으로 교반하면서 50℃에서 액체(예를 들어, 물, 식염수, PBS)에 첨가하고; 가교성 단백질을 용해시켜 가교성 단백질 용액을 형성함으로써 가교성 단백질 용액을 제조하는 단계; (a2) 가교제를 교반하거나 연속적으로 교반하면서 25℃에서 액체(예를 들어, 물, 식염수, PBS)에 첨가하고; 가교제를 용해시켜 가교제 용액을 형성함으로써 가교제 용액을 제조하는 단계를 갖는 (a)의 혼합을 제공한다. 본원에 개시된 방법의 일부 양상에서, (b)의 가교된 발포체는 효소적으로 가교되며, 여기서 가교제는 트랜스글루타미나제(예를 들어, 미생물 트랜스글루타미나제)이다. 복수의 미세입자를 제조하는 본 개시내용의 방법의 추가 양상에서 (b)의 가교된 발포체의 형성은 통기시키기 위한 휘핑 또는 휘젓기(agitating) 또는 가스 또는 공기(예를 들어, 아르곤, 이산화탄소, 헬륨, 수소, 크립톤, 메탄, 네온, 질소, 산소, 오존, 수증기, 크세논)의 존재 또는 부재 하의 교반을 포함한다. 일부 양상에서, 방법은 가스 또는 공기 없이 (a)의 가교제 용액을 교반하여 발포체가 아닌 융합성(confluent) 가교된 단백질 (b)를 형성하는 것을 포함하며, 이는 (c) 내지 (g)의 발포체에 대해 수행된 것과 동일한 방식으로 추가로 처리되고 크기가 감소될 수 있다. (a)의 가교성 단백질 용액은 37℃에서 (a)의 가교제 용액을 첨가하는 동안 (b)의 가교된 발포체를 형성한다. 휘핑은 가교된 발포체를 형성할 때 통기를 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, (b)의 가교된 발포체의 형성은 가스 또는 공기 없이 교반 또는 혼합함으로써 일어날 수 있다. 본 방법의 또 다른 양상에서, (d)의 감소는 형성된 (b)의 가교된 발포체를 0.2 mm 내지 20 mm(예를 들어, 1 mm 내지 19 mm; 2 mm 내지 18 mm; 3 mm 내지 17 mm; 4 mm 내지 16 mm; 5 mm 내지 15 mm; 6 mm 내지 14 mm; 7 mm 내지 13 mm; 8 mm 내지 12 mm , 9 mm 내지 11 mm); 0.5 mm 이상(예를 들어, 0.6 mm, 0.7 mm, 0.8 mm, 0.9 mm, 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 10 mm, 11 12 mm, 13 mm, 14 mm, 15 mm, 16 mm, 17 mm, 18 mm, 19 mm, 20 mm); 20 mm 이하(예를 들어, 19.5 mm, 18.5 mm, 17.5 mm, 16.5 mm, 15.5 mm, 14.5 mm, 13.5 mm, 12.5 mm, 11.5 mm, 10.5 mm, 9.5 mm, 8.5 mm, 7.5 mm, 6.5 mm, 5.5 4.5 mm, 3.5 mm, 2.5 mm, 1.5 mm)의 크기를 갖는 발포체의 큰 조각으로 절단(예를 들어, 다이싱, 쵸핑, 메싱)하는 것을 포함한다. (c)의 제거에 추가로 관련된 방법의 일부 양상은, 예를 들어, (b)의 가교된 발포체를 세척하여 가교제 또는 가교 효소를 제거하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 (b)의 가교된 발포체는 조각으로 절단(예를 들어, 다이싱, 쵸핑, 메싱)함으로써 크기가 감소되고, 세척은 가교된 발포체 조각을 45℃ 내지 55℃(예를 들어, 50℃)에서 액체 중에서 휘저어서 세척된 발포체 조각을 형성하고; (c1)의 세척된 발포체 조각을 메쉬 체(예를 들어, 하나 이상의 메쉬 체; 35 US 메쉬 # 내지 5000 US 메쉬 #; 2.5 mm 내지 500 mm; 0.5 mm)에서 체질하여 가교제 무함유 발포체 조각(예를 들어, 0.2 mm 내지 20 mm)을 형성함으로써 일어난다.

본 방법의 또 다른 목적은 (e) (c)의 가교제 무함유 발포체 또는 (d)의 복수의 입자를 냉동시키는 단계; (f) (e)의 냉동된 가교제 무함유 발포체를 건조(예를 들어, 동결건조, 냉동건조, 오븐 건조, 실온 건조, 주변 건조)하는 단계; 및 (g) (f)의 동결건조된 가교제 무함유 발포체의 크기를 감소시켜 복수의 가교된 발포체 입자를 형성하는 단계를 추가로 포함하는 것에 관한 것일 수 있다. 본 방법의 복수의 가교된 발포체 입자는 0.1 ㎛ 내지 2000 ㎛(예를 들어, 5 ㎛ 내지 150 ㎛; 40 ㎛ 내지 100 ㎛; 60 ㎛ 내지 90 ㎛)의 입자 크기(예를 들어, 건조 또는 습윤 입자)를 포함한다. 본 방법의 일 양상에서, 가교성 단백질은 젤라틴, 콜라겐, 카제인, 엘라스틴, 트로포엘라스틴, 알부민, 이들의 조작된 단백질 등, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택될 수 있으며, 여기서 가교성 단백질은 추가로 비재조합 젤라틴, 재조합 젤라틴, 비재조합 콜라겐, 재조합 콜라겐 등, 또는 적어도 하나의 RGD 모티프를 포함하거나 이에 연결된 조작된 중합체 등, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 양상은 가교제에 관한 것일 수 있으며, 여기서 상기 가교제는 효소, 예컨대 이에 제한되지 않지만 트랜스글루타미나제 또는 산화 효소이다. 이러한 가교제의 비제한적 예는 천연 트랜스글루타미나제, 변형된 트랜스글루타미나제, 재조합 트랜스글루타미나제, 미생물 트랜스글루타미나제(mTG), 조직 트랜스글루타미나제(tTG), 각질세포 트랜스글루타미나제, 표피 트랜스글루타미나제, 전립선 트랜스글루타미나제, 뉴런 트랜스글루타미나제, 인간 트랜스글루타미나제, 인자 XIII, 천연 산화 효소, 변형된 산화 효소, 리실 옥시다제, 티로시나제, 락카제, 퍼옥시다제 등, 또는 이들의 임의의 조합이다. 더욱이, 본 개시내용의 방법의 또 다른 양상에서, (e)의 냉동은 -18℃ 내지 25℃에서 최소 2시간(예를 들어, 3시간, 4시간, 5 내지 25시간) 동안 일어날 수 있고; (f)의 동결건조는 -50℃ ± 10℃, 0.01 mbar 내지 0.1 mbar(예를 들어, 0.04 mbar 내지 0.05 mbar) 및 24시간 내지 96시간(예를 들어, 48시간)에서 일어날 수 있다.

또 다른 실시양태는 가스 또는 공기 없이 (a)의 단백질 용액을 교반하여 발포체가 아닌 융합성 가교된 단백질(b)을 형성하는 것이며, 이는 (c) (b)의 가교된 발포체 또는 블록으로부터 가교제를 제거하여 가교제 무함유 발포체 또는 블록을 형성하고; (b)의 형성된 가교된 발포체 또는 블록의 크기를 감소시키는 단계; (e) (c)의 가교제 무함유 발포체 또는 블록 또는 (d)의 복수의 입자를 냉동시키는 단계; (f) (e)의 냉동된 가교제 무함유 발포체 또는 블록을 동결건조시키는 단계; (g) (f)의 동결건조된 가교제 무함유 발포체의 크기를 감소시켜 복수의 가교된 발포체 입자를 형성하는 단계의, 발포체에 대해 수행된 것과 동일한 방식으로 추가로 처리되고 크기가 감소될 수 있다.

본 개시내용의 방법의 추가 양상은 (e)의 동결건조된 가교제 무함유 발포체를 분쇄하여 복수의 가교제 무함유 발포체 입자를 형성하고; 복수의 가교제 무함유 발포체 입자를 크기별로 분리하는 단계를 포함하는 (g)의 크기 감소에 관한 것이다. 크기가 감소는 0.1 ㎛ 내지 2000 ㎛의 입자 크기(건조 또는 습윤 입자 크기)를 갖는 복수의 가교제 무함유 발포체 입자를 생성할 수 있다. 본 개시내용의 방법의 또 다른 양상은 복수의 가교제 무함유 발포체 입자를 체질하여 (e)의 분쇄된 동결건조된 가교제 무함유 발포체를 크기별로 분리함으로써 하나 이상 또는 적어도 2가지의 상이한 입자 크기 범위를 갖는 복수의 가교된 발포체를 생성하는 것을 제공한다.

개시내용의 추가 목적은 (a) 본 개시내용의 복수의 미세입자; 및 (b) 담체를 포함하는 조성물에 관한 것일 수 있고, 여기서 가교된 단백질은 젤라틴, 콜라겐, 카제인, 엘라스틴, 트로포엘라스틴, 알부민, 이들의 조작된 단백질 등 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되거나; 가교된 단백질은 비재조합 젤라틴, 재조합 젤라틴, 비재조합 콜라겐, 재조합 콜라겐 등, 또는 적어도 하나의 RGD 모티프를 포함하는 조작된 중합체, 또는 이들의 임의의 조합로부터 선택된다. 추가 양상은 하이드로겔인 조성물의 담체를 제공할 수 있으며, 여기서 상기 담체는 젤라틴; 콜라겐; 알기네이트; 히알루론산; 카르복시메틸 셀룰로오스; 폴리(에틸렌 옥사이드)(PEO); 폴리(비닐 알코올)(PVA); 폴리(프로필렌 푸마레이트)(PPF); 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택될 수 있거나; 담체는 젤라틴(예를 들어, 비가교된, 가교된, 반응계내(in situ) 가교된); 콜라겐(예를 들어, 비가교된, 가교된); 알기네이트(예를 들어, 비가교된, 가교된); 히알루론산(예를 들어, 비가교된, 가교된); PEG; 카르복시메틸 셀룰로오스 등, 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 이들 조성물의 양상은 또한 1 mg/ml 이상(예를 들어, 10 mg/ml; 20 mg/ml; 30 mg/ml; 40 mg/ml; 50 mg/ml; 50 mg/ml; 60 mg/ml; 70 mg/ml; 80 mg/ml; 90 mg/ml; 100 mg/ml; 110 mg/ml; 120 mg/ml; 130 mg/ml; 140 mg/ml; 150 mg/ml ml, 200 mg/ml, 300 mg/ml); 300 mg/ml 이하(예를 들어, 290 mg/ml; 280 mg/ml; 270 mg/ml; 260 mg/ml; 250 mg/ml; 240 mg/ml; 230 mg/ml; 220 mg/ml; 210 mg/ml; 200 mg/ml; 190 mg/ml; 180 mg/ml; 170 mg/ml; 160 mg/ml; 155 mg/ml; 145 mg/ml; 135 mg/ml; 125 mg/ml; 115 mg/ml; 105 mg/ml; 95 mg/ml; 85 mg/ml; 75 mg/ml; 65 mg/ml; 55 mg/ml; 45 mg/ml; 35 mg/ml; 25 mg/ml; 15 mg/ml, 5 mg/ml); 또는 1 mg/ml 내지 300 mg/ml(예를 들어, 2 mg/ml 내지 295 mg/ml; 4 mg/ml 내지 285 mg/ml; 6 mg/ml 내지 275 mg/ml; 8 mg/ml 내지 265 mg /ml; 12 mg/ml 내지 255 mg/ml; 14 mg/ml 내지 245 mg/ml; 16 mg/ml 내지 235 mg/ml; 18 mg/ml 내지 225 mg/ml; 22 mg/ml 내지 215mg /ml, 24 mg/ml 내지 205 mg/ml, 26 mg/ml 내지 195 mg/ml, 28 mg/ml 내지 185 mg/ml, 32 mg/ml 내지 175 mg/ml, 34 mg/ml 내지 165mg /ml, 36 mg/ml 내지 153 mg/ml, 38 mg/ml 내지 143 mg/ml, 42 mg/ml 내지 133 mg/ml, 52 mg/ml 내지 123 mg/ml, 62 mg/ml 내지 113mg /ml, 72 mg/ml 내지 103 mg/ml, 82 mg/ml 내지 93 mg/ml)의 담체 중 복수의 미세입자 농도를 제공한다.

본 개시내용의 또 다른 목적은 본 개시내용의 복수의 미세입자를 포함하고 일부 양상에서 하이드로겔 담체를 추가로 포함하는 조직 스캐폴드를 제공하며, 여기서 상기 하이드로겔 담체는 젤라틴, 콜라겐, 알기네이트, 히알루론산, 카르복시메틸 셀룰로오스 등, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 일부 다른 양상에서, 조직 스캐폴드는 발포체로서 구성되고, 가교된 단백질 미세입자는 적어도 하나의 상이한 입자 크기를 포함하며, 여기서 상기 입자 크기는 0.1 ㎛ 내지 2000 ㎛일 수 있다.

본 개시내용의 또 다른 목적은 복수의 미세입자 및 담체를 포함하는 본 개시내용의 조성물을 포함하는 장치에 관한 것일 수 있으며, 여기서 상기 장치는 일부 양상에서 주사기, 카트리지 또는 바이알이다. 또 다른 양상은 14 게이지 내지 39 게이지(예를 들어, 25 게이지 내지 30 게이지, 27 게이지 내지 30 게이지)로부터 선택된 바늘 또는 캐뉼러를 포함하는 주사기를 제공한다. 장치의 일 양상에서, 장치는 멸균 가능하거나 멸균을 위해 구성된다.

본 개시내용의 또 다른 목적에서, 복수의 미세입자 및 담체, 및/또는 본 개시내용의 복수의 미세입자를 포함하는 조성물의 용도는 대상체(인간 또는 동물)의 신체 윤곽형성을 위한 것일 수 있다. 용도의 일 양상은 연조직 재건, 부피 복원, 유방 확대, 생체자극(세포, 예를 들어 피부의) 등 또는 이들의 조합으로부터 선택된 신체 윤곽형성을 제공한다. 일부 양상에서, 생체자극은 섬유아세포 자극, 콜라겐 생성 자극, 신콜라겐생성, 조직 재성장, 상처 봉합 등, 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 용도의 또 다른 양상은 본 개시내용의 조성물 및/또는 본 개시내용의 복수의 미세입자에 관한 것이며, 여기서 상기 조성물 및/또는 복수의 미세입자는 예를 들어 주사기, 카트리지 또는 바이알일 수 있는 본원에 설명된 장치에서 구성된다.

본 개시내용의 한 가지 목적은 또한 신체 윤곽형성을 필요로 하는 대상체의 부위에 본 개시내용의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 신체 윤곽형성을 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 상기 투여는 일 양상에서 주사에 의한 것이다. 또 다른 양상은 (a) 섬유아세포 자극; (b) 콜라겐 생성 자극; (c) 신콜라겐생성 유도; (d) 조직 재성장 유도; (e) 조직 스캐폴드 제공 등, 또는 (f) 이들의 조합을 초래하는 본 개시내용의 조성물의 투여를 제공한다.

도 1은 다양한 미세입자 배치(batch)에서 가교제 mTG의 평균 활성의 그래프 표현을 도시하고, 여기서 젤라틴 가교를 위해 사용된 mTG의 양은 3 g 내지 10 g이었다. P1: 분석 양성 대조군; mTG(1:100): 양성 대조군; Y축: mTG 평균 활성; X축: 미세입자 배치 및 양성 대조군.
도 2a 내지 도 2d는 주사 후 30일 차에 메이슨 트리크롬(Masson's Trichrome: MT) 염색법을 사용한 본 발명의 조성물이 이식된 피하 부위의 대표적인 조직병리학적 평가를 도시한다. 각각에 대한 스케일은 다음과 같다: 1000 ㎛(도 2a); 200μ(도 2b); 및 50μ(도 2c 내지 도 2d). 검은색 화살표는 본 개시내용의 이식된 조성물을 나타낸다. 회색 화살표는 신콜라겐생성을 나타낸다. 흰색 화살표는 침윤성 섬유아세포와 스캐폴드 사이의 상호작용을 나타낸다.
도 3은 27 게이지(G) 바늘을 갖는 1 ml 주사기를 사용하여 입자 크기와 주사력 사이의 선형 상관관계를 입증한다.
도 4는 0.1 ㎛(즉, 100 nm) 초과(예를 들어, 104 nm; 105 nm; 112 nm; 145 nm; 150 nm; 275 nm)의 입자의 예시적인 주사 전자 현미경(SEM) 이미지를 도시한다.
도 5는 60 ㎛ 내지 100 ㎛(예를 들어, 75.69 ㎛; 88.38 ㎛; 91.56 ㎛; 99.68 ㎛)의 입자 크기 범위를 갖는 미세입자의 예시적인 SEM 이미지를 도시한다.
도 6a는 최대 2000 ㎛ 크기의 입자에 대한 예시적인 광학 현미경 이미지를 도시한다. 입자는 이미지화 전에 수화되었다(스케일 500 ㎛). 도 6b는 558㎛, 862㎛ 및 986㎛(스케일 200 ㎛)의 건조 입자 크기를 도시한다. 도 6c는 1808 ㎛(스케일 500 ㎛)의 입자 크기를 갖는 습윤 입자를 나타낸다.
도 7a는 건조 젤라틴 미세입자(스케일 100 ㎛)를 도시한다. 도 7b는 수화된 또는 습윤 젤라틴 미세입자(스케일 100 ㎛)를 도시한다.
도 8은 건조 및 수화된 미세입자의 크기 분포의 그래프 표현을 도시한다. 건조 미세입자(좌측 열): 입자 크기: 70 ㎛ 내지 170 ㎛. 수화된 미세입자(우측 열): 90 ㎛ 내지 310 ㎛.
도 9는 X축의 주파수 f(Hz)에 대해 Y축에 6℃에서의 0.75%의 젤라틴 담체의 저장 탄성률 G'(Pa)Δ, 손실 탄성률 G''(Pa)_□ 및 복소 점도 η*(Pa.s) O을 나타내는 대표적인 주파수 스윕 그래프를 도시한다.
도 10은 샘플(8 gr mTG)의 예시적인 발포체 미세입자의 대표적인 크기 분포를 도시하며, 여기서 96% 에탄올 샘플(원형)은 80 ㎛ 크기에서 14부피%에서 정점에 도달하였고, DDW 즉석 샘플(다이아몬드형)은 120 ㎛ 크기에서 10부피%에서 정점에 도달하였고; 24시간 샘플(사각형)의 DDW는 140 ㎛ 크기에서 11부피%에서 정점에 도달하였다. 표 6 참조.
도 11은 상이한 식염수 부피(1.5ml; 2ml; 3ml; 4ml)를 갖는 가교된 젤라틴 발포 미세입자의 예시적인 제형의 주사 가능성(injectability)(N)을 도시한다.
도 12는 이식 후 7일, 30일 및 180일차(H&E - 돼지 7일 및 30일, 래트 7일 및 30일, MT-돼지 180일)에 돼지 및 래트 피부에서 H&E(세포 핵을 자주색을 띤 청색으로 염색하고, 세포외 매트릭스 및 세포질을 분홍색으로 염색하는 헤마톡실린 및 에오신) 및 MT, 메이슨 트리크롬(적색 케라틴, 근육 섬유 및 임플란트, 청색 콜라겐 및 뼈, 담적색 또는 분홍색 세포질 및 암갈색 내지 검은색의 세포 핵을 생성함)로 염색된 임플란트의 대표적인 조직학적 사진을 도시하고, 화살표는 본 개시내용의 조성물이 이식된 부위를 나타낸다.
도 13은 청색으로 염색된 새로운 콜라겐 섬유(흰색 화살표)의 이식된 제형(검은색 화살표)을 보여주는, 이식 후 7일, 30일 및 180일차(H&E-돼지 7일 및 메이슨 트리크롬 돼지 30일 및 180일, 래트 7일 및 30일)에 H&E(세포 핵을 자주색을 띤 청색으로 염색하고, 세포외 매트릭스 및 세포질을 분홍색으로 염색하는 헤마톡실린 및 에오신) 및 메이슨 트리크롬(적색 케라틴, 근육 섬유 및 임플란트, 청색 콜라겐 및 뼈, 담적색 또는 분홍색 세포질 및 암갈색 내지 검은색의 세포 핵을 생성함)으로 염색된 임플란트의 대표적인 조직학적 사진을 도시한다.
도 14는 물에서 제조된 1 mg/ml FP의 SDS-PAGE를 도시한다. FP를 분해하기 위해 콜라게나아제를 현탁액에 첨가하였다. 분자량 마커(M); 미생물 트랜스글루타미나제(20 μl 중 7 ㎍ 단백질)(1); 젤라틴(20 μl 중 10 ㎍ 단백질)(2); 콜라게나제(20μl 중 1.7U)(3); 발포체 입자(FP)(콜라게나제로 분해됨, 20 μl 중 10 ㎍ 단백질)(4).
도 15는 아르기닌의 교정 곡선을 나타낸다. 0.999의 R² 값은 높은 선형성을 나타낸다. 아르기닌 농도(㎍/ml)(X축) 대 방출 강도(Y축).
도 16은 유리 아르기닌, 원료 및 가교된 젤라틴 입자의 형광 방출 스펙트럼을 도시한다.
도 17은 원료인 비가교된 젤라틴과 가교된 젤라틴 입자(즉, FP 및 융합성 입자)에서의 RGD 정량화를 도시한다.
도 18은 63 ㎛ 미만: 63 ㎛ 내지 99 ㎛; 99 ㎛ 초과의 상이한 가교된 젤라틴 입자 크기 범위(X축)를 갖는 FP에 대한 RGD 서열 또는 모티프의 양(㎍/mg)(Y축)을 도시한다.
도 19는 젤라틴:mTG, 젤라틴 및 미생물 트랜스글루타미나제(mTG)의 다양한 중량비와 관련된 RGD의 양(㎍/mg)(Y축)을 도시한다.
도 20a 및 도 20b는 심근세포로 분화된, 본 개시내용의 발포체 입자 상에서 성장한 인간 유도 만능 줄기(iPS) 세포의 광학 현미경 이미지를 도시한다. 도 20a는 50 ㎛의 스케일을 갖고, 도 20b는 200 ㎛의 스케일을 갖는다.
도 21a 및 도 21b는 발포체 가교된 젤라틴 섬유로부터 제조된 발포체 입자(FP)의 광학 현미경 이미지를 도시한다. 스케일 100 ㎛.

본 개시내용의 상세한 실시양태가 본원에서 설명된다; 그러나, 개시된 실시양태는 다양한 형태로 구현될 수 있는 본 발명을 단지 예시하는 것임을 이해해야 한다. 또한, 본 발명의 다양한 실시양태와 관련하여 소정의 예시 각각은 예시하기 위함이며 제한하려는 것이 아니다.

다공성 및 생분해성 중합체 스캐폴드는 구조적 지지 매트릭스 또는 세포 접착성 기재로서 이용될 수 있다. 본 개시내용의 목적은 면역 반응을 유도하지 않거나 면역원성이 결여된 안전한, 무독성, 저렴한 또는 저비용의 이식 가능한 조직 스캐폴드를 제공하는 것이다. 하나의 사례에서, 본 개시내용의 이식 가능한 조직 스캐폴드는 합성이고/이거나 비인간 구성요소가 결여되어 있거나 본질적으로 없다. 고유한 세포 결합 요소를 갖는 물질을 사용하는 것은 직접적인 세포 부착 및 국소 리모델링을 허용함으로써 임플란트의 성능을 개선할 수 있다. 트리펩티드 모티프(예를 들어, RGD(아르기닌(Arg)-글리신(Gly)-아스파르테이트(Asp)))는 세포외 매트릭스 단백질, 예컨대 이에 제한되지 않지만 뼈 시알로단백질, 콜라겐, 피브리노겐, 피브로넥틴, 젤라틴, 라미닌, 오스테오폰틴 및 비트로넥틴 내에서 발견되고, 세포 접착, 세포막 결합 및 세포 부착을 용이하게 한다. RGD 모티프는 ECM 단백질 내의 인테그린 결합 도메인이다. 예를 들어, 콜라겐으로부터 유래된 젤라틴은 세포 접착에 유용한 RGD 모티프를 함유한다.

입자

본 개시내용의 다양한 실시양태에서, 미세입자 또는 복수의 미세입자; 이의 제조 방법; 복수의 미세입자를 포함하는 조성물; 본 개시내용의 조성물을 포함하는 주사기 또는 바이알과 같은 장치; 본 개시내용의 복수의 미세입자 또는 조성물을 포함하는 스캐폴드 또는 조직 스캐폴드; 본 개시내용의 개시된 복수의 미세입자 또는 조성물의 용도; 및 본 개시내용의 복수의 미세입자 또는 조성물을 투여하여 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 예를 들어 실험, 진단, 예방 및/또는 치료 목적을 위해 본 개시내용에 따른 조성물이 투여될 수 있는 임의의 유기체를 지칭한다. 전형적인 대상체는 임의의 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 비인간 영장류 및 인간 등과 같은 포유동물)을 포함한다. 이를 필요로 하는 대상체는 전형적으로 본원에 설명된 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 것이 요망되는 대상체이다. 예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체는 특정 질환, 장애 또는 병태에 대해 치료를 원하거나 치료를 필요로 할 수 있거나, 치료가 요망되거나, 치료를 받고 있거나, 향후 치료를 받을 수 있거나, 숙련된 전문가에 의한 관리 하에 있는 인간 또는 동물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 연조직 재건, 부피 복원, 유방 확대, 생체자극(세포, 예를 들어 피부의) 등 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 신체 윤곽형성을 필요로 한다. 일부 실시양태에서, 생체자극은 섬유아세포 자극, 콜라겐 생성 자극, 신콜라겐생성, 조직 재성장, 상처 봉합 등 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다.

본 개시내용의 일 실시양태는 가교된 단백질을 갖는 미세입자 또는 복수의 미세입자에 관한 것이며, 여기서 상기 가교된 단백질의 단백질은 특히 세포 접착 특성을 전달하는 적어도 하나의 RGD(Arg-Gly-Asp) 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수개의 RGD 모티프를 갖지만 적어도 하나의 RGD 모티프를 갖는 가교된 단백질은 입자 크기를 감소시키고 미세입자의 표면적을 증가시킴으로써 충분히 및/또는 더 유리하게 노출될 수 있다. 본원에 설명된 미세입자 또는 복수의 미세입자는 RGD 모티프를 갖는 가교된 단백질을 0.1 ㎍/mg 내지 50 ㎍/mg(예를 들어, 0.2 ㎍/mg 내지 45 ㎍/mg; 0.3 ㎍/mg 내지 40 ㎍/mg; 0.4 ㎍/mg 내지 35 ㎍/mg; 0.5 ㎍/mg 내지 30 ㎍/mg; 0.6 ㎍/mg 내지 25 ㎍/mg; 0.7 ㎍/mg 내지 20 ㎍/mg; 0.8 ㎍/mg 내지 15 ㎍/mg; 0.9 ㎍/mg 내지 10 ㎍/mg; 1 ㎍/mg 내지 5 ㎍/mg); 0.1 ㎍/mg 이상(예를 들어, 2 ㎍; 4 ㎍; 6 ㎍; 8 ㎍; 10 ㎍; 12 ㎍; 14 ㎍; 16 ㎍; 18 ㎍; 20 ㎍; 22 ㎍; 24 ㎍; 26 ㎍; 28 ㎍; 30 ㎍; 32 ㎍; 34 ㎍; 36 ㎍; 38 ㎍; 40 ㎍; 42 ㎍; 44 ㎍; 46 ㎍; 48 ㎍; 50 ㎍); 또는 50 ㎍/mg 이하(예를 들어, 49 ㎍; 47 ㎍; 45 ㎍; 43 ㎍; 41 ㎍; 39 ㎍; 37 ㎍; 35 ㎍; 33 ㎍; 31 ㎍; 29 ㎍; 27 ㎍; 25 ㎍; 23 ㎍; 21 ㎍; 19 ㎍; 17 ㎍; 15 ㎍; 13 ㎍; 11 ㎍; 9 ㎍; 7 ㎍; 5 ㎍; 3 ㎍; 1 ㎍; 0.9 ㎍; 0.7 ㎍; 0.5 ㎍; 0.3 ㎍; 0.1 ㎍)의 양으로 포함한다.

가교된 단백질을 포함하는 미세입자 또는 복수의 미세입자는 가교제 무함유이거나 본질적으로 가교제 무함유이고, 여기서 본원에서 사용된 "가교제 무함유"는 가교제가 없거나 또는 존재할 수 있지만 복수의 미세입자 또는 가교된 단백질의 기능 또는 용도에 영향을 미치지 않는 가교제의 명목상 양을 함유하는 것을 의미한다. 가교된 단백질은, 예를 들어, 발포체, 융합성 하이드로겔 또는 섬유로 안정화될 수 있으며, 여기서 가교는 효소적 가교에 의해 일어난다. 일부 실시양태에서, 효소적 가교는 효소를 사용하여 수행되었지만, 후속적으로 예를 들어 입자로부터 효소를 세척하거나 가교제 또는 가교 효소를 불활성화함으로써 제거되었다. 일 실시양태는 가교된 단백질의 단백질을 가교시키기 위한 트랜스글루타미나제 효소의 사용을 포함하며, 가교가 완료되면, 효소는 가교된 단백질(들)로부터 세척된다. 추가 실시양태에서, 트랜스글루타미나제 효소는 미생물 트랜스글루타미나제 효소이거나 이를 포함한다.

따라서, 최종 미세입자 또는 복수의 미세입자는 가교제 무함유인 가교된 단백질을 포함한다. 일부 양상에서, 최종 미세입자 또는 복수의 미세입자의 가교된 단백질의 단백질은 이전에 가교된 단백질 또는 사전 가교된 단백질을 포함하며, 여기서 상기 가교된 단백질은 임의의 가교제를 제거하기 위해 세척되어, 상기 가교된 단백질을 포함하는 최종 미세입자 또는 복수의 미세입자는 가교제 무함유이거나 본질적으로 또는 실질적으로 가교제 무함유가 된다. 가교된 단백질의 단백질은 젤라틴, 콜라겐, 카제인, 엘라스틴, 트로포엘라스틴, 알부민, 이들의 조작된 단백질 등, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택될 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 실시양태의 다른 양상은 비재조합 젤라틴, 재조합 젤라틴, 비재조합 콜라겐, 재조합 콜라겐, 이들의 조작된 단백질, 적어도 하나의 RGD 모티프를 포함하거나 이에 연결된 조작된 중합체 등, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 가교된 단백질의 단백질에 관한 것일 수 있다. 더욱이, 본 개시내용의 미세입자 또는 복수의 미세입자는 적어도 하나 이상의 가교된 단백질을 포함하며, 여기서 상기 적어도 하나 이상의 가교된 단백질은 적어도 하나의 RGD(Arg-Gly-Asp) 모티프를 포함하고; 상기 미세입자 또는 복수의 미세입자는 가교제 무함유이고(즉, 가교제(들)가 없거나 본질적으로 없음); 미세입자 또는 복수의 미세입자는 수불용성이거나 본질적으로 수불용성이다. 본 개시내용의 일부 실시양태는 사전 가교되고, 수불용성이고, 가교제 무함유이고, 수용성이 아닌 복수의 미세입자에 관한 것이다.

또 다른 실시양태는 본 개시내용의 복수의 미세입자에 관한 것이며, 여기서 미세입자는 발포체의 입자 또는 발포체 유사 특성을 갖는 입자를 포함하고, 복수의 미세입자 또는 발포체 입자는 가교제 무함유인 가교된 단백질을 포함한다. 본 개시내용의 실시양태의 일부 양상에서, 가교된 단백질은 발포체, 융합성 하이드로겔, 또는 섬유(예컨대, 전기방사에서)로 안정화되며, 여기서 가교는 효소적 가교에 의해 일어난다. 본원에서 사용된 바와 같이, "발포체"는 액체, 고체 또는 반고체(예를 들어, 겔)에 가스 기포가 분산된 것을 의미한다. 본원에 개시된 다른 경우에, 발포체는 입자를 포함하거나 입자로서 구성될 수 있다. 이러한 발포체 입자는 발포체의 특성을 유지하거나 발포체로부터 유도되어 "발포체 유사" 특성을 갖는다. 더욱이, 복수의 미세입자 또는 발포체 입자는 가교제 무함유인 가교된 단백질을 포함하는 동결건조된 발포체 입자를 포함한 동결건조된 입자로 구성될 수 있다. 본원에서 사용된 "발포체 입자"(FP)는 이들이 안정한 단백질 발포체로부터 유래하며 분쇄 후 자체 구조에서는 반드시 발포체가 아닐 수 있음을 의미한다. 이는 (c)의 초기 가교제 무함유 발포체 중의 가스 기포의 크기 및 (g)의 동결건조되고 크기가 감소된 입자의 크기에 의해 좌우될 수 있다. 가스 기포가 입자 크기보다 작은 경우, 이들은 발포체의 독립 기포(closed cell)를 함유할 수 있다; 그러나, 입자가 가스 기포보다 작은 경우, 기포 또는 완전 기포가 입자 내에 봉입된 상태로 남아 있을 수 없다. 어느 경우든, 본원에 설명된 실시양태의 성능 및 의도는 방해받지 않으며 발포체 구조로 제한되어서는 안된다.

일 실시양태는 절단(예를 들어, 쵸핑, 다이싱)에 의해; 압축, 덩어리 파쇄기, 분쇄기, 밀(예를 들어, 임팩트 밀, 밀가루 밀, 전체 화면 해머 밀, 메가 해머 밀, 공기 분류 밀, 제트 밀, 볼 밀, 페블 밀, 로드 밀); 그라인더(미세 그라인더, 블레이드 그라인더) 등 또는 이들의 조합을 사용함으로써 크기가 감소되고 미세입자를 포함하는 입자를 포함하거나 입자로서 구성되는 발포체 또는 발포체 입자에 관한 것이다. 크기가 감소됨으로써, 미세입자와 같은 입자를 형성하는 가교된 발포체는 수개의 RGD 모티프를 넓은 표면적에 노출시켜 세포 접착 및 생체자극을 용이하게 할 수 있다. 적어도 2가지의 상이한 입자 크기를 사용하는 실시양태는 또한 향상된 표면적으로부터 이익을 얻는다. 입자 크기는 당업자에 의해 통상적으로 알려져 있고/있거나 사용되는 임의의 기술에 의해 분석되거나 측정될 수 있다. 입자 크기를 측정하기 위한 이러한 방법, 기술 또는 도구의 비제한적인 예로는, 입자 크기 분석기(PSA); 고화질 이미지 처리; 이미지 입자 분석(IPA)(예를 들어, 광학 현미경, 주사 전자 현미경(SEM), 투과 전자 현미경(TEM)); 동적 이미지 분석(DIA); 정적 레이저 광 산란(SLS, 레이저 회절로도 알려져 있음); 동적 광 산란(DLS); 음향 분광법; 체 분석(예를 들어, 건식 체질, 습식 체질) 등, 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다.

일부 실시양태에서, 발포체 가교된 단백질로부터 유도된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는 복수의 미세입자는 0.1 ㎛ 내지 2000 ㎛(예를 들어, 0.2 ㎛ 내지 1499 ㎛; 0.4 ㎛ 내지 1450 ㎛; 0.5 ㎛ 내지 1425 ㎛; 0.6 ㎛ 내지 1400 ㎛; 0.7 ㎛ 내지 1350 ㎛; 0.8 ㎛ 내지 1300 ㎛; 0.9 ㎛ 내지 1250 ㎛; 1 ㎛ 내지 1200 ㎛; 2 ㎛ 내지 1150 ㎛; 3 ㎛ 내지 1100 ㎛; 4 ㎛ 내지 1050 ㎛; 5 ㎛ 내지 1000 ㎛; 6 ㎛ 내지 950 ㎛; 7 ㎛ 내지 900 ㎛; 8 ㎛ 내지 850 ㎛; 9 ㎛ 내지 800 ㎛; 10 ㎛ 내지 750 ㎛; 11 ㎛ 내지 700 ㎛; 12 ㎛ 내지 650 ㎛; 13 ㎛ 내지 600 ㎛; 14 ㎛ 내지 550 ㎛; 15 ㎛ 내지 500 ㎛; 16 ㎛ 내지 450 ㎛; 17 ㎛ 내지 400 ㎛; 18 ㎛ 내지 350 ㎛; 19 ㎛ 내지 300 ㎛; 20 ㎛ 내지 250 ㎛; 25 ㎛ 내지 200 ㎛; 30 ㎛ 내지 150 ㎛; 40 ㎛ 내지 100 ㎛; 60 ㎛ 내지 90 ㎛); 0.1 ㎛ 이상(예를 들어, 0.5 ㎛; 1 ㎛; 5 ㎛; 15 ㎛; 25 ㎛; 35 ㎛; 45 ㎛; 55 ㎛; 65 ㎛; 75 ㎛; 85 ㎛; 95 ㎛; 100 ㎛; 105 ㎛; 115 ㎛; 125 ㎛; 135 ㎛; 145 ㎛; 150 ㎛; 200 ㎛; 250 ㎛; 500 ㎛; 1000 ㎛; 2000 ㎛); 또는 2000 ㎛ 이하(예를 들어, 1250 ㎛; 1000 ㎛; 750 ㎛; 500 ㎛; 250 ㎛; 200 ㎛; 150 ㎛; 140 ㎛; 130 ㎛; 120 ㎛; 110 ㎛; 90 ㎛; 80 ㎛; 70 ㎛; 60 ㎛; 50 ㎛; 40 ㎛; 30 ㎛; 20 ㎛; 10 ㎛; 5 ㎛; 4 ㎛; 3 ㎛; 2 ㎛)의 입자 크기를 포함한다. 이러한 복수의 미세입자에 관한 다른 실시양태는 0.1 ㎛ 내지 2000 ㎛(예를 들어, 0.2 ㎛ 내지 1499 ㎛; 0.4 ㎛ 내지 1450 ㎛; 0.5 ㎛ 내지 1425 ㎛; 0.6 ㎛ 내지 1400 ㎛; 0.7 ㎛ 내지 1350 ㎛; 0.8 ㎛ 내지 1300 ㎛; 0.9 ㎛ 내지 1250 ㎛; 1 ㎛ 내지 1200 ㎛; 2 ㎛ 내지 1150 ㎛; 3 ㎛ 내지 1100 ㎛; 4 ㎛ 내지 1050 ㎛; 5 ㎛ 내지 1000 ㎛; 6 ㎛ 내지 950 ㎛; 7 ㎛ 내지 900 ㎛; 8 ㎛ 내지 850 ㎛; 9 ㎛ 내지 800 ㎛; 10 ㎛ 내지 750 ㎛; 11 ㎛ 내지 700 ㎛; 12 ㎛ 내지 650 ㎛; 13 ㎛ 내지 600 ㎛; 14 ㎛ 내지 550 ㎛; 15 ㎛ 내지 500 ㎛; 16 ㎛ 내지 450 ㎛; 17 ㎛ 내지 400 ㎛; 18 ㎛ 내지 350 ㎛; 19 ㎛ 내지 300 ㎛; 20 ㎛ 내지 250 ㎛; 25 ㎛ 내지 200 ㎛; 30 ㎛ 내지 150 ㎛; 40 ㎛ 내지 100 ㎛; 60 ㎛ 내지 90 ㎛); 0.1 ㎛ 이상(예를 들어, 5 ㎛; 15 ㎛; 25 ㎛; 35 ㎛; 45 ㎛; 55 ㎛; 65 ㎛; 75 ㎛; 85 ㎛; 95 ㎛; 100 ㎛; 105 ㎛; 115 ㎛; 125 ㎛; 135 ㎛; 145 ㎛; 150 ㎛; 200 ㎛; 250 ㎛; 500 ㎛; 1000 ㎛; 2000 ㎛); 또는 2000 ㎛ 이하(예를 들어, 1250 ㎛; 1000 ㎛; 750 ㎛; 500 ㎛; 250 ㎛; 200 ㎛; 150 ㎛; 140 ㎛; 130 ㎛; 120 ㎛; 110 ㎛; 90 ㎛; 80 ㎛; 70 ㎛; 60 ㎛; 50 ㎛; 40 ㎛; 30 ㎛; 20 ㎛; 10 ㎛; 5 ㎛; 4 ㎛; 3 ㎛; 2 ㎛)의 평균 입자 크기를 포함한다. 본 개시내용의 실시양태에서, 본원에서 사용된 "평균 입자 크기"는 복수의 미세입자의 평균 입자 크기를 의미한다. 일부 실시양태에서, "입자 크기"는 건조 입자 크기를 지칭한다. 일부 실시양태에서, "입자 크기"는 습윤 입자 크기를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 습윤 또는 수화된 입자는 동일한 건조 크기의 건조 입자보다 1.4배 내지 2.8배, 평균 1.67배(1.65배 내지 1.67배) 더 큰 입자 크기를 갖는다. 예를 들어, 표 4 참조.

본 개시내용의 추가 실시양태는 본원에 설명된 복수의 미세입자에 관한 것이고, 여기서 상기 복수의 미세입자는 적어도 2가지의 상이한 입자 크기를 포함할 수 있다. 입자 크기는 0.1 ㎛ 내지 2000 ㎛(예를 들어, 0.2 ㎛ 내지 1900 ㎛; 0.3 ㎛ 내지 1800 ㎛; 0.4 ㎛ 내지 1700 ㎛; 0.5 ㎛ 내지 1600 ㎛; 0.6 ㎛ 내지 1500 ㎛; 0.7 ㎛ 내지 1400 ㎛; 0.8 ㎛ 내지 1300 ㎛; 0.9 ㎛ 내지 1250 ㎛; 1 ㎛ 내지 1200 ㎛; 2 ㎛ 내지 1150 ㎛; 3 ㎛ 내지 1100 ㎛; 4 ㎛ 내지 1050 ㎛; 5 ㎛ 내지 1000 ㎛; 6 ㎛ 내지 950 ㎛; 7 ㎛ 내지 900 ㎛; 8 ㎛ 내지 850 ㎛; 9 ㎛ 내지 800 ㎛; 10 ㎛ 내지 750 ㎛; 11 ㎛ 내지 700 ㎛; 12 ㎛ 내지 650 ㎛; 13 ㎛ 내지 600 ㎛; 14 ㎛ 내지 550 ㎛; 15 ㎛ 내지 500 ㎛; 16 ㎛ 내지 450 ㎛; 17 ㎛ 내지 400 ㎛; 18 ㎛ 내지 350 ㎛; 19 ㎛ 내지 300 ㎛; 20 ㎛ 내지 250 ㎛; 25 ㎛ 내지 200 ㎛; 30 ㎛ 내지 150 ㎛; 40 ㎛ 내지 100 ㎛; 60 ㎛ 내지 90 ㎛); 0.1 ㎛ 이상(예를 들어, 0.5 ㎛; 1 ㎛; 5 ㎛; 15 ㎛; 25 ㎛; 35 ㎛; 45 ㎛; 55 ㎛; 65 ㎛; 75 ㎛; 85 ㎛; 95 ㎛; 100 ㎛; 105 ㎛; 115 ㎛; 125 ㎛; 135 ㎛; 145 ㎛; 150 ㎛; 200 ㎛; 250 ㎛; 500 ㎛; 1000 ㎛; 2000 ㎛); 또는 2000 ㎛ 이하(예를 들어, 1250 ㎛; 1000 ㎛; 750 ㎛; 500 ㎛; 250 ㎛; 200 ㎛; 150 ㎛; 140 ㎛; 130 ㎛; 120 ㎛; 110 ㎛; 90 ㎛; 80 ㎛; 70 ㎛; 60 ㎛; 50 ㎛; 40 ㎛; 30 ㎛; 20 ㎛; 10 ㎛; 5 ㎛; 4 ㎛; 3 ㎛; 2 ㎛)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 본원에 개시된 임의의 입자 크기로부터 선택될 수 있다. 적어도 2가지의 상이한 입자 크기를 포함하는 복수의 미세입자에 관한 다른 실시양태는 0.1 ㎛ 내지 2000 ㎛(예를 들어, 0.2 ㎛ 내지 1499 ㎛; 0.4 ㎛ 내지 1450 ㎛; 0.5 ㎛ 내지 1425 ㎛; 0.6 ㎛ 내지 1400 ㎛; 0.7 ㎛ 내지 1350 ㎛; 0.8 ㎛ 내지 1300 ㎛; 0.9 ㎛ 내지 1250 ㎛; 1 ㎛ 내지 1200 ㎛; 2 ㎛ 내지 1150 ㎛; 3 ㎛ 내지 1100 ㎛; 4 ㎛ 내지 1050 ㎛; 5 ㎛ 내지 1000 ㎛; 6 ㎛ 내지 950 ㎛; 7 ㎛ 내지 900 ㎛; 8 ㎛ 내지 850 ㎛; 9 ㎛ 내지 800 ㎛; 10 ㎛ 내지 750 ㎛; 11 ㎛ 내지 700 ㎛; 12 ㎛ 내지 650 ㎛; 13 ㎛ 내지 600 ㎛; 14 ㎛ 내지 550 ㎛; 15 ㎛ 내지 500 ㎛; 16 ㎛ 내지 450 ㎛; 17 ㎛ 내지 400 ㎛; 18 ㎛ 내지 350 ㎛; 19 ㎛ 내지 300 ㎛; 20 ㎛ 내지 250 ㎛; 25 ㎛ 내지 200 ㎛; 30 ㎛ 내지 150 ㎛; 40 ㎛ 내지 100 ㎛; 60 ㎛ 내지 90 ㎛); 0.1 ㎛ 이상 (예를 들어, 0.5 ㎛; 1 ㎛; 5 ㎛; 15 ㎛; 25 ㎛; 35 ㎛; 45 ㎛; 55 ㎛; 65 ㎛; 75 ㎛; 85 ㎛; 95 ㎛; 100 ㎛; 105 ㎛; 115 ㎛; 125 ㎛; 135 ㎛; 145 ㎛; 150 ㎛; 200 ㎛; 250 ㎛; 500 ㎛; 1000 ㎛; 2000 ㎛); 또는 2000 ㎛ 이하(예를 들어, 1250 ㎛; 1000 ㎛; 750 ㎛; 500 ㎛; 250 ㎛; 200 ㎛; 150 ㎛; 140 ㎛; 130 ㎛; 120 ㎛; 110 ㎛; 90 ㎛; 80 ㎛; 70 ㎛; 60 ㎛; 50 ㎛; 40 ㎛; 30 ㎛; 20 ㎛; 10 ㎛; 5 ㎛; 4 ㎛; 3 ㎛; 2 ㎛)로부터 선택되지만 이에 제한되지는 않는 평균 입자 크기를 포함한다.

본 개시내용의 입자의 제조 방법

젤라틴 미세구는, 몇 가지만 열거하면 유중수 에멀젼, 전기분무, 분무 건조 및 미세유체 유화를 포함한 다양한 방법 및 기술을 사용하여 이전에 제조되었다. 이러한 방법을 사용하면, 젤라틴은 여러 유형의 화학적 가교제, 예컨대 1-에틸-3-(3-디메틸 아미노프로필)-카르보디이미드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS), 글리시독시프로일트리메톡시실란(GPTMS), 글루타르알데히드 및 제니핀에 의해 가교된다. 유중수 방법은 통상적으로 사용되는 실험실 기술이지만 산업 규모로의 확장 어려움을 포함한 많은 단점을 가지고 있으며, 오일 및 화학적 가교제의 사용은 잔류 오일과 화학적 가교제의 광범위한 제거를 필요로 하는 독성 문제를 초래한다.

본 개시내용의 일 실시양태는 (a) 가교성 단백질 용액과 가교제 용액을 혼합하는 단계를 포함하는, 본 개시내용의 복수의 미세입자를 제조하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 가교성 단백질 용액은 적어도 하나의 RGD(Arg-Gly-Asp) 모티프를 포함하거나 이에 연결된 가교성 단백질(예를 들어, 젤라틴(예를 들어, 재조합 젤라틴, 비재조합 젤라틴, 반응계내 가교), 콜라겐(예를 들어, 재조합 콜라겐, 비재조합 젤라틴), 카세인, 트로포엘라스틴, 엘라스틴, 알부민, 이들의 조작된 단백질 등 또는 이들의 임의의 조합, 또는 비재조합 젤라틴, 재조합 젤라틴, 비재조합 콜라겐, 재조합 콜라겐, 이에 대한 임의의 조작된 단백질, RGD를 포함하거나 이에 연결된 조작된 중합체 등, 또는 이들의 임의의 조합)을 액체(예를 들어, 물, 식염수, PBS)에 용해시키는 것을 포함하고; 상기 가교제 용액은 가교제 또는 효소 가교제(예를 들어, 트랜스글루타미나제(예를 들어, 천연 트랜스글루타미나제, 변형된 트랜스글루타미나제, 재조합 트랜스글루타미나제, 미생물 트랜스글루타미나제(mTG), 조직 트랜스글루타미나제(tTG), 각질세포 트랜스글루타미나제, 표피 트랜스글루타미나제, 전립선 트랜스글루타미나제, 뉴런 트랜스글루타미나제, 인간 트랜스글루타미나제, 인자 XIII 등, 또는 이들의 임의의 조합), 산화 효소(예를 들어, 천연 산화 효소, 변형된 산화 효소, 리실 옥시다제, 티로시나제, 락카제, 퍼옥시다제 등 또는 이들의 임의의 조합)를 액체(예를 들어, 물, 식염수, PBS)에 용해시키는 것을 포함하고, 상기 가교제는 가교성 단백질을 가교하여 가교된 발포체/블록, 비발포체 가교된 하이드로겔 또는 섬유(예컨대, 전기방사에서)를 형성하기에 충분한 양으로 존재한다. 또 다른 실시양태는 10℃ 내지 40℃의 범위의 온도에서 가교성 단백질을 가용성에서 불용성으로 전환시키기에 충분한 양의 가교제에 관한 것이다. 본 개시내용의 복수의 미세입자의 제조 방법은 (b) (a)의 혼합된 가교성 단백질과 가교제를 포함하는 가교된 발포체/블록, 비발포체 가교된 하이드로겔 또는 섬유(예컨대, 전기방사에서)를 형성하는 단계; (c) (b)의 비발포체 가교된 하이드로겔, 섬유 또는 가교된 발포체를 분쇄하는 단계; (d) (c)의 가교된 제형 또는 생성물로부터 가교제를 제거하여 가교제 무함유 발포체 또는 하이드로겔 또는 섬유(예를 들어, 본질적으로 또는 실질적으로 가교제 무함유)를 형성하는 단계; 및 (e) (d)의 형성된 가교된 생성물, (d)의 가교제 무함유 생성물, 또는 (d)의 형성된 가교된 발포체와 (d)의 가교제 무함유 발포체 또는 하이드로겔의 조합의 크기를 감소시켜 (b)의 크기 감소된 가교된 발포체 또는 하이드로겔 및/또는 (d)의 크기 감소된 가교제 무함유 발포체 또는 하이드로겔을 형성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, (b)의 크기가 감소된 가교된 발포체 또는 하이드로겔 및/또는 (d)의 크기가 감소된 가교제 무함유 발포체 또는 하이드로겔을 포함하는 복수의 입자 및/또는 미세입자는 여과, 오토클레이빙(예를 들어, 110℃ 내지 134℃, 15분 내지 40분, 5 psi 내지 20 psi), 광 조사(예를 들어, 자외선(UV); 감마; 전자빔(e-빔), X선)를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 기능성, 물리화학적 특성, 안정성, 독성 또는 생물학적 효과를 실질적으로 변경하지 않는 임의의 적절한 방법에 의해 멸균될 수 있다. 멸균의 일부 실시양태는 5분 내지 720분(예를 들어, 100분, 150분, 200분, 250분)의 노출 및 10 nm 내지 400 nm(예를 들어, 200 nm 내지 270 nm)의 UV 파장 하의 UV 처리를 포함한다. 추가 실시양태는 10 kGy 내지 50 kGy(예를 들어, 15 kGy, 20 kGy, 25 kGy, 30 kGy, 35 kGy, 40 kGy, 45 kGy)의 감마선 조사를 포함한다. 베테넷(Vettenet) 등은 본원에서 적용될 수 있고 그 전체가 참조로 인용되는 유용한 다양한 멸균 기술 및 매개변수를 개시하고 있다(문헌[Nanomedicine. 10(7):1391-1399, 2014] 참조).

일부 실시양태는, 관리 시점에 혼합되고 주사되어 가교가 반응계내에서 일어나게 되는 다른 제형와 달리, 가교가 생산 제어 단계로서 시험관내에서 일어나는 본원에 설명된 복수의 미세입자를 제조하는 방법에 관한 것이다. 개시된 방법에서 설명된 바와 같이 트랜스글루타미나제 가교제 효소를 제거하기 위해, 가교 반응이 일어난 후, 다수의 반복 및 확장된 세척이 수행된다.

또 다른 실시양태에서, 개시된 복수의 미세입자의 제조 방법은 (i) 가교성 단백질을, 계속 교반하면서, 가교성 단백질을 용해시키기에 충분한 온도, 예컨대 25℃ 이상(예를 들어, 30℃, 37℃, 40℃, 45℃, 50℃)의 온도(여기서, 여기서 가교성 단백질은 적어도 하나의 RGD(Arg-Gly-Asp) 모티프를 포함하는 단백질(예를 들어, 젤라틴(예를 들어, 비재조합 젤라틴, 재조합 젤라틴)), 콜라겐(예를 들어, 비재조합 콜라겐, 재조합 콜라겐), 카제인, 알부민 및 이들의 임의의 조합)으로부터 선택되지만 이에 제한되지 않는다)에서, 가교성 단백질을 액체에 용해시키거나 본질적으로 용해시키거나 완전히 용해시키기에 충분한 온도, 예컨대 이에 제한되지 않지만 40℃ 내지 60℃에서 액체(예를 들어, 물, 식염수, PBS)에 첨가하는 단계; 및 (ii) 가교성 단백질을 액체에 용해시키거나 본질적으로 용해시키거나 완전히 용해시켜 가교성 단백질 용액을 형성하는 단계를 포함하는 가교성 단백질 용액에 관한 것이다.

일부 실시양태는 트랜스글루타미나제 효소(예를 들어, 미생물 트랜스글루타미나제(mTG), 재조합 트랜스글루타미나제, 박테리아 트랜스글루타미나제)와의 가교 반응에 의해 발포 가교된 젤라틴 미세입자(MP)를 제조하는 것에 관한 것이다. 간단히 말하면, 트랜스글루타미나제(예를 들어, mTG) 용액을 휘핑 기계에서 또는 가스 또는 공기(예를 들어, 아르곤, 이산화탄소, 헬륨, 수소, 크립톤, 메탄, 네온, 질소, 산소, 오존, 수증기, 크세논 또는 이들의 임의의 조합)의 존재 또는 부재하의 임의의 다른 수단에 의한 혼합 또는 교반을 위해 액체 상태 젤라틴에 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 (a)의 가교제 용액을 37℃에서 첨가하면서 (a)의 가교성 단백질 용액을 휘핑하여 (b)의 가교된 발포체를 형성함으로써 가교된 발포체를 형성하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태는 (a)의 가교제 용액을 가스 또는 공기 없이 37℃에서 첨가하면서 (a)의 가교성 단백질 용액을 교반하거나 혼합하여 (b)의 비발포 가교된 블록을 형성하는 단계를 포함하는 본 개시내용의 방법에 관한 것이다.

혼합 및 발포하는 동안, 젤라틴을 3차원(3D) 발포체 구조가 안정화될 때까지 가교한다. 그 후, 제형화된 발포체를 45℃에서 인큐베이션한 다음, 크거나 조악한 슬라이스 또는 조각(예를 들어, 0.05 cm 내지 2 cm; 0.5 mm 내지 20 mm)으로 쵸핑한다. 과량의 가교제 또는 트랜스글루타미나제(예를 들어, mTG)의 제거를 위해 쵸핑된 슬라이스를 50℃에서 수회 세척한다. 세척 후, 발포 젤라틴을 동결건조기를 사용하여 냉동건조시킨다. MP의 생성을 위해, 건조 가교된 발포 젤라틴을 여러 크기 범위(예를 들어, 0.1 ㎛ 내지 10 mm)의 미세입자로 밀링하고 체질한다. MP는 방사선을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 미세입자의 구조, 기능 또는 성능에 부정적인 영향을 주지 않는 본원에 설명된 방법을 포함하는 임의의 방법에 의해 멸균할 수 있다.

본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 가교된 젤라틴 미세입자(MP)는 트랜스글루타미나제 효소(예를 들어, 미생물 트랜스글루타미나제(mTG); 재조합 트랜스글루타미나제; 박테리아 트랜스글루타미나제)와의 가교 반응에 의해 제조할 수 있다. 간단히 말하면, 트랜스글루타미나제(예를 들어, mTG) 용액을 액체 상태 젤라틴에 첨가한다. 젤라틴을 안정한 3차원(3D) 구조로 가교될 때까지 (발포 없이) 교반하여 가교된 젤라틴 구조를 형성한다. 그 후, 제형화된 구조를 45℃에서 인큐베이션한 다음, 크거나 조악한 슬라이스 또는 조각(예를 들어, 0.05 cm 내지 2 cm, 0.5 mm 내지 20 mm)으로 쵸핑한다. 과량의 가교제 또는 트랜스글루타미나제(예를 들어, mTG)를 제거하기 위해, 쵸핑된 슬라이스를 50℃에서 수회 세척한다. 세척 후, 가교된 젤라틴을 예를 들어 동결건조기를 사용하여 냉동건조시킨다. MP의 생성을 위해, 무수 가교된 젤라틴을 밀링하고 여러 크기 범위(예를 들어, 0.1 ㎛ 내지 10 mm)의 미세입자로 체질한다. MP는 방사선을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 미세입자의 구조, 기능 또는 성능에 부정적인 영향을 주지 않는 본원에 설명된 방법을 포함하는 임의의 방법에 의해 멸균할 수 있다.

추가 실시양태는 (i) 가교제를, 계속 교반하면서, 가교제를 용해시키거나 본질적으로 용해시키거나 완전히 용해시키기에 충분한 온도, 예컨대 이에 제한되지 않지만 실온, 15℃ 내지 27℃, 예를 들어 25℃에서 액체에 첨가하는 단계; 및 (ii) 가교제를 액체에 용해시키거나 본질적으로 용해시키거나 완전히 용해시켜 가교제 용액을 형성하는 단계를 포함하는, 가교제 용액에 관한 복수의 미세입자를 제조하는 이러한 방법을 제공한다. 다른 실시양태는 가교성 단백질이 본 개시내용의 가교제의 존재 하에 또는 이와 혼합될 때 가교되는, 복수의 미세입자를 제조하는 이러한 방법에 관한 것일 수 있다. 추가 실시양태에서, 가교제는 가교성 단백질과 혼합될 때 효소적으로 가교된 단백질, 효소적으로 가교된 발포체, 또는 효소적으로 가교된 입자, 또는 효소적으로 가교된 섬유를 형성하는 효소(예를 들어, 트랜스글루타미나제, 예컨대 미생물 트랜스글루타미나제)이다. 복수의 미세입자를 제조하는 방법에서 (b)의 가교된 발포체는, (a)의 가교성 단백질 용액을 휘핑, 교반하여 각각 (b)의 가교된 발포체 또는 (b)의 가교된 블록을 형성하기에 충분한 온도에서 첨가하면서, (b1) (a)의 가교성 단백질 용액을 휘핑하거나 (b2) 가스 또는 공기(예를 들어, 아르곤, 이산화탄소, 헬륨, 수소, 크립톤, 메탄, 네온, 질소, 산소, 오존, 수증기, 크세논, 또는 이들의 조합)의 존재 또는 부재 하에 혼합 또는 교반하여 형성될 수 있고, 여기서 휘핑, 혼합 또는 교반은 30℃ 내지 40℃의 온도(예를 들어, 37℃)에서 일어난다.

가교된 단백질, 가교된 발포체, 및/또는 이를 포함하는 미세입자 또는 조성물로부터 가교제를 제거하는 것은, 일 실시양태에서, 안전성 및 규제 측면뿐만 아니라 비용에서 유리하다. 따라서, 일부 실시양태는, (c)의 제거 단계가, (b)의 가교된 발포체 또는 블록을 세척하는 단계로서, (b)의 가교된 발포체 또는 블록이 본원에 설명된 바와 같이 크기가 감소되고 세척이 가교된 발포체로부터 가교제를 제거하거나 본질적으로 제거하기에 충분한 온도(예를 들어, 40℃ 내지 60℃, 45℃ 내지 55℃, 예컨대 50℃) 및 시간(예를 들어, 5분 내지 1시간; 10분 내지 45분; 15분 내지 30분)에서 가교된 발포체의 조각을 액체(예를 들어, 물, 식염수, PBS) 중에서 휘저음으로써 일어나는 것인 단계; 및 세척된 발포체 조각을, 예를 들어 적절한 메쉬 체, 예컨대 이에 제한되지 않지만 35 메쉬 # 내지 5000 메쉬 #(500 ㎛ 내지 2.5 ㎛)를 갖는 체, 예를 들어, 0.5 mm 메쉬 또는 35 메쉬 # 등가의 체를 사용하여 원하는 크기까지 체질하여 크기 감소시켜 원하는 조각을 포함하는 본 설명의 가교제 무함유 발포체 조각을 형성하는 단계를 포함하는 것인 본 개시내용의 이러한 방법에 관한 것일 수 있다.

일 실시양태에서, 이러한 방법은 (b)의 형성된 가교된 발포체 또는 블록, (c)의 가교제 무함유 발포체 또는 블록, 또는 (b)의 가교된 발포체 또는 블록과 (c)의 가교제 무함유 발포체 또는 블록의 조합을 절단(예를 들어, 다이싱, 쵸핑, 메싱)하는 단계를 포함하는 (d)의 크기 감소를 제공할 수 있다. (b)의 가교된 발포체 또는 블록 및/또는 (c)의 가교제 무함유 발포체 또는 블록의 크기를 감소시키기 위한 기술, 방법 또는 도구의 다른 비제한적인 예로는 절단(예를 들어, 다이싱, 쵸핑, 메싱, 체질); 압축, 덩어리 파쇄기, 분쇄기, 밀(예를 들어, 임팩트 밀, 밀가루 밀, 전체 화면 해머 밀, 메가 해머 밀, 공기 분류 밀, 제트 밀, 볼 밀, 페블 밀, 로드 밀); 그라인더(미세 그라인더, 블레이드 그라인더) 등 또는 이들의 조합의 사용이 포함된다. 이러한 방법의 크기 감소는 0.1 ㎛ 내지 10 mm(예를 들어, 0.2 ㎛ 내지 9 mm; 0.3 ㎛ 내지 8 mm; 0.4 ㎛ 내지 7 mm; 0.5 ㎛ 내지 7 mm; 1 ㎛ 내지 6 mm; 5 ㎛ 내지 5 mm; 10 ㎛ 내지 4 mm; 20 ㎛ 내지 1 mm; 40 ㎛ 내지 500 ㎛; 60 ㎛ 내지 200 ㎛; 90 ㎛ 내지 150 ㎛; 95 ㎛ 내지 100 ㎛); 1 ㎛ 초과(예를 들어, 2 ㎛, 4 ㎛, 6 ㎛, 8㎛, 12 ㎛, 15 ㎛, 25 ㎛, 35 ㎛, 45 ㎛, 55 ㎛, 65 ㎛, 75 ㎛, 85 ㎛, 95 ㎛, 105 ㎛, 115 ㎛, 125 ㎛, 135 ㎛, 145 ㎛, 150 ㎛, 200 ㎛, 300 ㎛, 400 ㎛, 500 ㎛, 1 mm, 3 mm, 5 mm, 7 mm, 9 mm); 10 mm 이하(예를 들어, 8 mm, 6 mm, 4 mm, 2 mm, 900 ㎛, 800 ㎛, 700 ㎛, 600 ㎛, 550 ㎛, 450 ㎛, 350 ㎛, 250 ㎛, 175 ㎛, 165 ㎛, 155 ㎛, 140 ㎛, 130 ㎛, 120 ㎛, 100 ㎛, 90 ㎛, 80 ㎛, 70 ㎛, 60 ㎛, 50 ㎛, 40 ㎛, 30 ㎛, 20 ㎛, 10 ㎛, 5 ㎛, 3 ㎛, 1 ㎛)의 복수의 입자를 형성하기 위해 일어날 수 있다. 추가적인 실시양태는 (d)의 감소가 (b)의 형성된 가교된 발포체 또는 0.5 mm 내지 10 mm(예를 들어, 1 mm 내지 8 mm; 2 mm 내지 7 mm; 3 mm 내지 6 mm; 4 mm 내지 5 mm); 0.5 mm 이상(예를 들어, 1.5 mm, 2.5 mm, 3.5 mm, 4.5 mm, 5.5 mm, 6.5 mm, 7.5 mm, 8.5 mm, 9.5 mm); 10 mm 이하(예를 들어, 9 mm, 8 mm, 7 mm, 6 mm, 5 mm, 4 mm, 3 mm, 2 mm, 1 mm)의 크기를 갖는 가교된 발포체 조각을 생성하는 이러한 방법을 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 복수의 미세입자를 제조하는 이러한 방법은 (e) (c)의 가교제 무함유 발포체 또는 블록 또는 (d)의 복수의 입자를 냉동시키는 단계; (e)의 냉동된 가교제 무함유 발포체 또는 블록을 동결건조시키는 단계; 및 (f)의 동결건조된 가교제 무함유 발포체 또는 블록의 크기를 감소시켜 복수의 가교된 발포체 또는 블록 입자를 형성하는 단계를 포함한다. 복수의 미세입자를 제조하는 방법의 다른 실시양태는 (c)의 가교제 무함유 발포체 또는 블록 또는 (d)의 복수의 입자를 건조시키는 단계; 및 (c)의 건조된 가교제 무함유 발포체 또는 블록의 크기를 감소시켜 복수의 건조된 가교된 발포체 또는 블록 입자를 형성하는 단계를 포함한다. 복수의 가교된 발포체 입자는 예를 들어 0.1 ㎛ 내지 2000 ㎛(예를 들어, 0.2 ㎛ 내지 1499 ㎛; 0.4 ㎛ 내지 1450 ㎛; 0.5 ㎛ 내지 1425 ㎛; 0.6 ㎛ 내지 1400 ㎛; 0.7 ㎛ 내지 1350 ㎛; 0.8 ㎛ 내지 1300 ㎛; 0.9 ㎛ 내지 1250 ㎛; 1 ㎛ 내지 1200 ㎛; 2 ㎛ 내지 1150 ㎛; 3 ㎛ 내지 1100 ㎛; 4 ㎛ 내지 1050 ㎛; 5 ㎛ 내지 1000 ㎛; 6 ㎛ 내지 950 ㎛; 7 ㎛ 내지 900 ㎛; 8 ㎛ 내지 850 ㎛; 9 ㎛ 내지 800 ㎛; 10 ㎛ 내지 750 ㎛; 11 ㎛ 내지 700 ㎛; 12 ㎛ 내지 650 ㎛; 13 ㎛ 내지 600 ㎛; 14 ㎛ 내지 550 ㎛; 15 ㎛ 내지 500 ㎛; 16 ㎛ 내지 450 ㎛; 17 ㎛ 내지 400 ㎛; 18 ㎛ 내지 350 ㎛; 19 ㎛ 내지 300 ㎛; 20 ㎛ 내지 250 ㎛; 25 ㎛ 내지 200 ㎛; 30 ㎛ 내지 150 ㎛; 40 ㎛ 내지 100 ㎛; 60 ㎛ 내지 90 ㎛)의 입자 크기를 포함한다. 이러한 방법은 젤라틴, 콜라겐, 카제인, 알부민, 트로포엘라스틴, 엘라스틴 및 이들의 임의의 조합; 또는 비재조합 젤라틴, 재조합 젤라틴, 비재조합 콜라겐, 재조합 콜라겐, 이들의 임의의 조작된 단백질, 적어도 하나의 RGD 모티프를 포함하거나 이에 연결된 조작된 중합체 등, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 가교성 단백질을 포함한다. 이러한 방법의 추가 실시양태는 또한 효소 가교제를 포함하며, 여기서 상기 효소 가교제는 트랜스글루타미나제 또는 산화 효소로부터 선택될 수 있다. 본 개시내용의 다른 실시양태는 천연 트랜스글루타미나제, 변형된 트랜스글루타미나제, 재조합 트랜스글루타미나제, 미생물 트랜스글루타미나제(mTG), 조직 트랜스글루타미나제(tTG), 각질세포 트랜스글루타미나제, 표피 트랜스글루타미나제, 전립선 트랜스글루타미나제, 신경세포 트랜스글루타미나제, 트랜스글루타미나제, 인간 트랜스글루타미나제, 인자 XIII 등, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 효소 가교제를 제공한다. 일부 다른 실시양태는 천연 산화 효소, 변형된 산화 효소, 리실 산화 효소, 티로시나제, 락카제, 퍼옥시다제 등, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소 가교제를 제공할 수 있다.

추가 실시양태는 (e)의 냉동이 동결건조의 준비에 충분한 온도(여기서, 온도는 -18℃ 내지 25℃(예를 들어, -15℃ 내지 23℃; -10℃ 내지 20℃; -5℃ 내지 15℃; 0℃ 내지 10℃; -18℃ 이상(예를 들어, -16℃; -14℃; -12℃; -8℃; -6℃; -4℃; -2℃; 2℃; 4℃; 6℃; 8℃; 10℃; 12℃; 14℃; 16℃; 18℃; 20℃; 22℃; 24℃); 또는 25℃ 이하(예를 들어, 23°; 21℃; 19℃; 17℃; 15℃; 13℃; 11℃; 9℃; 7℃; 5℃; 3℃; 1℃; -1℃; -3℃; -5℃; -7℃; -9℃; -11℃; -13℃; -15℃; -17℃)를 포함한다)에서 동결건조 준비에 충분한 시간(여기서, 상기 시간은 2시간 내지 25시간(예를 들어, 7시간 내지 24시간; 9시간 내지 22시간; 11시간 내지 20시간; 13시간 내지 18시간; 15시간 내지 16시간); 5시간 이상(예를 들어, 6시간; 8시간; 10시간; 12시간; 14시간; 16시간; 18시간; 20시간; 22시간; 24시간); 또는 25시간 이하(예를 들어, 23시간; 21시간; 19시간; 17시간; 15시간; 13시간; 11시간; 9시간; 7시간; 5시간)을 포함함) 동안 일어나는 이러한 방법을 제공한다.

또 다른 실시양태는 (f)의 동결건조가 -50℃ ± 10℃(예를 들어, -60℃ 내지 -40℃; -55℃ 내지 -35℃; -50℃ 내지 -30℃; -45℃ 내지 -25℃; -40℃ 내지 -20℃; -35℃ 내지 -30℃; -60℃ 이상(예를 들어, -58℃; -56℃; -54℃; -52℃; -50℃; -48℃; -46℃; -44℃; -42℃; -40℃); -40℃ 이하(예를 들어, -41℃; -43℃; -45℃; -47℃; -49℃; -51℃; -53℃; -55℃; -57℃; -59℃)로부터 선택된 온도에서, 0.01 mbar 내지 0.1 mbar(예를 들어, 0.02 mbar 내지 0.08 mbar; 0.04 mbar 내지 0.06 mbar); 0.01 mbar 이상(예를 들어, 0.03 mbar; 0.05 mbar; 0.07 mbar; 0.09 mbar); 또는 0.1 mbar 이하; 0.08 mbar; 0.06 mbar; 0.04 mbar; 0.02 mbar; 0.01 mbar)의 기압에서; 24시간 내지 96시간(예를 들어, 48시간 내지 95시간; 50시간 내지 94시간; 52시간 내지 92시간; 54시간 내지 90시간; 56시간 내지 88시간; 58시간 내지 86시간; 60시간 내지 84시간; 62시간 내지 82시간; 64시간 내지 80시간; 66시간 내지 78시간; 68시간 내지 76시간; 70시간 내지 74시간); 48시간 이상(예를 들어, 49시간; 51시간; 53시간; 55시간; 57시간; 59시간; 61시간; 63시간; 65시간; 67시간; 69시간; 71시간; 73시간; 75시간; 77시간; 79시간; 81시간; 83시간; 85시간; 87시간; 89시간); 또는 96시간 이하(예를 들어, 94시간; 92시간; 90시간; 88시간; 86시간; 84시간; 82시간; 80시간; 78시간; 76시간; 74시간; 72시간; 70시간; 68시간; 66시간; 64시간; 62시간; 60시간; 58시간; 56시간; 54시간; 52시간; 50시간; 48시간; 36시간)의 시간 동안 일어나는 이러한 방법에 관한 것일 수 있고, 여기서 상기 시간, 압력 및 온도는 (c)의 동결건조된 가교제 무함유 발포체 또는 (d)의 동결건조된 복수의 입자를 생성하기에 충분하며; 본원에서 사용된 "동결건조된" 생성물, 예컨대 이에 제한되지 않지만 (c)의 동결건조된 가교제가 무함유 발포체 또는 (d)의 동결건조된 복수의 입자는 수분 함량이 4% 이하(예를 들어, 3.8%; 3.6%; 3.4%; 3.2%; 3%; 2.8%; 2.6%; 2.4%; 2.2%; 2%; 1.8%; 1.6%; 1.4%;1.2%; 1%; 0.8%; 0.6%; 0.4%; 0.2%; 0.08%; 0.06%; 0.04%; 0.02%; 0%); 0% 이상(예를 들어, 0.01%; 0.03%; 0.05%; 0.07%; 0.09%; 1.1%; 1.3%; 1.5%; 1.7%; 1.9%; 2.1%; 2.3%; 2.5%; 2.7%; 2.9%; 3.1%; 3.3%; 3.5%; 3.7%; 3.9%); 또는 0% 내지 4%(0.5% 내지 3.5%; 0.7% 내지 3.3%; 0.9% 내지 3.1%; 1.1% 내지 2.9%; 1.3% 내지 2.7%; 1.5% 내지 2.5%)인 생성물을 의미한다. 가교제 무함유 발포체 또는 복수의 입자를 충분히 동결건조시키는 데 필요한 온도, 압력 및 시간은 당업자가 이해하고 있으며, 이들 매개변수를 최적화하기 위해 과도한 실험을 수행하지 않아도 된다.

또 다른 실시양태에서, 이러한 복수의 미세입자를 제조하는 방법은 (e) (c)의 가교제 무함유 발포체 또는 블록 또는 (d)의 복수의 미세입자를 냉동시키는 단계; 및/또는 (f) (c)의 가교제 무함유 발포체 또는 하이드로겔 블록 또는 (d)의 복수의 미세입자를 건조시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태는 동결건조 또는 냉동건조, 오븐 건조 및 실온 또는 주변 온도 건조를 포함하지만 이에 제한되지 않는 건조에 관한 것이다. 복수의 미세입자를 제조하는 방법은 (g) (e) 및/또는 (f)의 건조된 가교제 무함유 발포체 또는 하이드로겔 블록의 크기를 감소시켜 복수의 가교된 발포체 입자 또는 비발포체 가교된 하이드로겔 입자를 형성하는 단계를 추가로 포함한다. 복수의 가교된 미세입자는 예를 들어 0.1 ㎛ 내지 2000 ㎛(예를 들어, 0.2 ㎛ 내지 1499 ㎛; 0.4 ㎛ 내지 1450 ㎛; 0.5 ㎛ 내지 1425 ㎛; 0.6 ㎛ 내지 1400 ㎛; 0.7 ㎛ 내지 1350 ㎛; 0.8 ㎛ 내지 1300 ㎛; 0.9 ㎛ 내지 1250 ㎛; 1 ㎛ 내지 1200 ㎛; 2 ㎛ 내지 1150 ㎛; 3 ㎛ 내지 1100 ㎛; 4 ㎛ 내지 1050 ㎛; 5 ㎛ 내지 1000 ㎛; 6 ㎛ 내지 950 ㎛; 7 ㎛ 내지 900 ㎛; 8 ㎛ 내지 850 ㎛; 9 ㎛ 내지 800 ㎛; 10 ㎛ 내지 750 ㎛; 11 ㎛ 내지 700 ㎛; 12 ㎛ 내지 650 ㎛; 13 ㎛ 내지 600 ㎛; 14 ㎛ 내지 550 ㎛; 15 ㎛ 내지 500 ㎛; 16 ㎛ 내지 450 ㎛; 17 ㎛ 내지 400 ㎛; 18 ㎛ 내지 350 ㎛; 19 ㎛ 내지 300 ㎛; 20 ㎛ 내지 250 ㎛; 25 ㎛ 내지 200 ㎛; 30 ㎛ 내지 150 ㎛; 40 ㎛ 내지 100 ㎛; 60 ㎛ 내지 90 ㎛)의 입자 크기를 포함한다.

또 다른 실시양태는 (g)의 크기 감소가 (e)의 건조된(예를 들어, 동결건조된) 가교제 무함유 발포체 또는 하이드로겔 블록을 분쇄하여 복수 개의 가교제 무함유 발포체 입자를 형성하는 단계; 및 본 개시내용의 복수의 가교제 무함유 발포체 또는 하이드로겔 입자를 크기별로 분리하는 단계를 포함하는 이러한 방법에 관한 것일 수 있다. 복수의 가교제 무함유 발포체 입자 또는 하이드로겔 입자가 예를 들어 0.1 ㎛ 내지 2000 ㎛의 입자 크기를 포함하는 이러한 방법은 복수의 가교제 무함유 발포체 입자를 크기 감소시키거나 크기별로 분리하는 단계를 포함할 수 있으며, 이는 0.1 ㎛ 내지 2000 ㎛의 입자 크기 또는 평균 입자 크기로부터 선택된 상이한 입자 크기 범위를 갖는 복수의 가교된 발포체 입자를 생성하기에 충분한 복수의 가교제 무함유 발포체 입자를 체질함으로써 일어나고, 여기서 상기 상이한 입자 크기 범위는 적어도 2가지의 상이한 입자 크기 범위를 포함한다.

조성물

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 (a) 본원에 설명된 바와 같은 복수의 미세입자를 포함하고; (b) 담체가 있거나 없는 조성물에 관한 것일 수 있다. 본 개시내용의 조성물은 (a) 복수의 미세입자로서, 상기 복수의 미세입자가 가교된 단백질을 포함하고 상기 가교된 단백질이 적어도 하나의 RGD(Arg-Gly-Asp) 모티프를 포함하는 것인 복수의 미세입자를 포함하고; (b) 담체가 있거나 없다. 게다가, 본 개시내용의 조성물은 주사 가능하다. 일부 실시양태는 0.1 ㎛ 내지 2000 ㎛(예를 들어, 5 ㎛ 내지 150 ㎛); 또는 이들의 조합의 범위의 적어도 2가지의 상이한 입자 크기를 포함하는 복수의 미세입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 (a) 본원에 설명된 바와 같은 복수의 미세입자로서, 상기 미세입자 또는 복수의 미세입자가 가교된 단백질을 포함하고 상기 가교된 단백질의 단백질이 적어도 하나의 RGD(Arg-Gly-Asp) 모티프를 포함하고 상기 복수의 미세입자가 본질적으로 또는 실질적으로 가교제 무함유이고 상기 복수의 미세입자가 수불용성인 복수의 미세입자; 및 임의로 (b) 담체를 포함한다. 이러한 조성물은 0.1 ㎛ 내지 2000 ㎛(예를 들어, 0.2 ㎛ 내지 1499 ㎛; 0.4 ㎛ 내지 1450 ㎛; 0.5 ㎛ 내지 1425 ㎛; 0.6 ㎛ 내지 1400 ㎛; 0.7 ㎛ 내지 1350 ㎛; 0.8 ㎛ 내지 1300 ㎛; 0.9 ㎛ 내지 1250 ㎛; 1 ㎛ 내지 1200 ㎛; 2 ㎛ 내지 1150 ㎛; 3 ㎛ 내지 1100 ㎛; 4 ㎛ 내지 1050 ㎛; 5 ㎛ 내지 1000 ㎛; 6 ㎛ 내지 950 ㎛; 7 ㎛ 내지 900 ㎛; 8 ㎛ 내지 850 ㎛; 9 ㎛ 내지 800 ㎛; 10 ㎛ 내지 750 ㎛; 11 ㎛ 내지 700 ㎛; 12 ㎛ 내지 650 ㎛; 13 ㎛ 내지 600 ㎛; 14 ㎛ 내지 550 ㎛; 15 ㎛ 내지 500 ㎛; 16 ㎛ 내지 450 ㎛; 17 ㎛ 내지 400 ㎛; 18 ㎛ 내지 350 ㎛; 19 ㎛ 내지 300 ㎛; 20 ㎛ 내지 250 ㎛; 25 ㎛ 내지 200 ㎛; 30 ㎛ 내지 150 ㎛; 40 ㎛ 내지 100 ㎛; 60 ㎛ 내지 90 ㎛)의 범위의 적어도 2가지의 상이한 입자 크기 또는 0.1 ㎛ 내지 2000 ㎛(예를 들어, 0.2 ㎛ 내지 1499 ㎛; 0.4 ㎛ 내지 1450 ㎛; 0.5 ㎛ 내지 1425 ㎛; 0.6 ㎛ 내지 1400 ㎛; 0.7 ㎛ 내지 1350 ㎛; 0.8 ㎛ 내지 1300 ㎛; 0.9 ㎛ 내지 1250 ㎛; 1 ㎛ 내지 1200 ㎛; 2 ㎛ 내지 1150 ㎛; 3 ㎛ 내지 1100 ㎛; 4 ㎛ 내지 1050 ㎛; 5 ㎛ 내지 1000 ㎛; 6 ㎛ 내지 950 ㎛; 7 ㎛ 내지 900 ㎛; 8 ㎛ 내지 850 ㎛; 9 ㎛ 내지 800 ㎛; 10 ㎛ 내지 750 ㎛; 11 ㎛ 내지 700 ㎛; 12 ㎛ 내지 650 ㎛; 13 ㎛ 내지 600 ㎛; 14 ㎛ 내지 550 ㎛; 15 ㎛ 내지 500 ㎛; 16 ㎛ 내지 450 ㎛; 17 ㎛ 내지 400 ㎛; 18 ㎛ 내지 350 ㎛; 19 ㎛ 내지 300 ㎛; 20 ㎛ 내지 250 ㎛; 25 ㎛ 내지 200 ㎛; 30 ㎛ 내지 150 ㎛; 40 ㎛ 내지 100 ㎛; 60 ㎛ 내지 90 ㎛)의 범위의 평균 입자 크기를 포함하는 2가지의 상이한 입자 크기를 포함하는 본 개시내용의 복수의 미세입자; 및 (b) 담체를 포함한다.

본 개시내용의 또 다른 실시양태는 가교된 단백질이 젤라틴, 콜라겐, 엘라스틴, 트로포엘라스틴, 카제인, 알부민, 이의 임의의 조작된 단백질, 이의 유사 단백질 등, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 본원에 개시된 이러한 조성물을 제공한다. 추가 실시양태에서, 가교된 단백질은 비재조합 젤라틴, 재조합 젤라틴, 비재조합 콜라겐, 재조합 콜라겐, 이들의 조작된 단백질, RGD 모티프를 포함하거나 이에 연결된 임의의 조작된 중합체 등, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택될 수 있다. 다른 실시양태는 복수의 미세입자 및 이러한 복수의 미세입자를 포함하는 본원에 설명된 조성물에 관한 것일 수 있으며, 여기서 가교된 단백질의 단백질은 젤라틴 또는 콜라겐을 포함한다. 추가 실시양태에서, 복수의 미세입자 및 이러한 복수의 미세입자를 포함하는 설명된 조성물은 젤라틴으로 구성된 가교된 단백질의 단백질에 관한 것이다.

일부 조성물 실시양태에서, 담체는 하이드로겔을 포함할 수 있다. 실시양태의 일부 양상은 하이드로겔 담체를 제공하며, 여기서 일 실시양태에서 본원에서 사용된 "하이드로겔"은 적어도 10% H2O의 겔 또는 반고체 친수성 중합체를 의미한다. 담체 및/또는 윤활제는 또한 젤라틴(예를 들어, 가교된(2% w/v); 비가교된 젤라틴(0.25% 내지 2% w/v)); 또는 반응계내 가교된 젤라틴(0.1% w/v 내지 10% w/v); 콜라겐(예를 들어, 가교된; 비가교된); 알기네이트; 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC)(1% 내지 3.5% w/v); 폴리(에틸렌 옥사이드)(PEO); 폴리(비닐 알코올)(PVA); 폴리(프로필렌 푸마레이트)(PPF); 폴리에틸렌 글리콜(PEG); 글리코사미노글리칸 중합체, 예컨대 히알루론산(HA)(예를 들어, 가교된 및 비가교된 HA(0.01% 내지 10% w/v)) 등, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있어지만, 이에 제한되지 않는다. 담체는 단일 담체 또는 2개 이상의 담체의 혼합물(예를 들어, 동일한 또는 상이한 중량 평균 분자량의 제1 담체 및 제2 담체)을 포함할 수 있다. 담체의 비제한적 예로는 글리코사미노글리칸 중합체(예를 들어, 히알루론산, 가교된 히알루론산, 케라탄 설페이트, 콘드로이틴 설페이트 및/또는 헤파린), 세포외 매트릭스 단백질 중합체(예를 들어, 젤라틴, 콜라겐, 엘라스틴 및/또는 피브로넥틴)가 포함된다. 다른 실시양태는 복수의 미세입자 및 담체를 포함하는 본 개시내용의 조성물에 관한 것이며, 여기서 상기 담체는 젤라틴; 콜라겐; 알기네이트; 글리코사미노글리칸(GAG); 폴리에틸렌 글리콜(PEG); 카르복시메틸 셀룰로오스; 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태는 비가교된 콘드로이틴 설페이트 중합체, 비가교된 더마탄 설페이트 중합체, 비가교된 케라탄 설페이트 중합체, 비가교된 헤파란 중합체, 비가교된 헤파란 설페이트 중합체, 비가교된 히알루로난 중합체, 비가교된 글리코사미노글리칸 중합체, 비가교된 엘라스틴 및/또는 피브로넥틴, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 담체를 포함하는 본 개시내용의 조성물을 제공한다.

본원에서 제공되는 추가 실시양태는 가교된 히알루론산 담체 및 복수의 미세입자를 포함하는 주사 가능한 조성물이며, 여기서 상기 가교된 히알루론산은 약 3 mol% 내지 약 40 mol%의 가교 밀도를 갖는다.

적어도 2개의 담체가 있는 일부 실시양태에서, 제1 담체는 약 200 kDa 내지 약 1 MDa의 중량 평균 분자량을 갖는 히알루론산을 포함할 수 있고, 임의로 제2 담체는 약 200 kDa 내지 약 5 MDa의 중량 평균 분자량을 갖는 히알루론산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히알루론산 중합체는 약 0.1% w/v 내지 10% w/v의 농도를 가질 수 있다.

본원에 설명된 조성물을 포함하는 일부 실시양태에서 단백질 미세입자의 평균 입자 크기는 각 적용의 필요성에 적합하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 잔주름 및 주름의 치료를 위해서는 더 작은 평균 입자 크기가 바람직할 수 있는 반면, 성대 확대 또는 심지어 큰 부피 재건(예를 들어, 유방 재건)을 위해서는 더 큰 평균 입자 크기가 더 적합할 수 있다.

다른 실시양태는 본원에 설명된 복수의 미세입자 및 담체를 포함하는 본 개시내용의 조성물에 관한 것이다. 본 개시내용의 실시양태에 유용한 담체의 비제한적 예는 비가교된 젤라틴; 비가교된 콜라겐; 비가교된 알기네이트; 비가교된 히알루론산; 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 반면, 저장된 비활성 가교제가 첨가되고 반응계내에서 비가교된 담체와 반응함으로써 입자가 주사를 위한 적소에서 유지될 수 있다. 또 다른 실시양태는 반응계내에서 가교할 수 있어 비활성 가교제에 비해 반응계내에서 더 오랜 시간 동안 하이드로겔 중에서 입자를 유지시킬 수 있는 활성 가교제 효소 및 비가교된 젤라틴 가교성 단백질을 제공한다.

일 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 가교제 무함유이지만 가교된 단백질을 포함하는 복수의 미세입자 및 담체를 포함하며, 여기서 상기 조성물은 1 mg/ml 이상(예를 들어, 10 mg/ml; 20 mg/ml; 30 mg/ml; 40 mg/ml; 50 mg/ml; 60 mg/ml; 70 mg/ml; 80 mg/ml; 90 mg/ml; 100 mg/ml; 110 mg/ml; 120 mg/ml; 130 mg/ml; 140 mg/ml; 150 mg/ml; 200 mg/ml; 300 mg/ml); 300 mg/ml 이하(예를 들어, 290 mg/ml; 280 mg/ml; 270 mg/ml; 260 mg/ml; 250 mg/ml; 240 mg/ml; 230 mg/ml; 220 mg/ml; 210 mg/ml; 200 mg/ml; 190 mg/ml; 180 mg/ml; 170 mg/ml; 160 mg/ml; 155 mg/ml; 145 mg/ml; 135 mg/ml; 125 mg/ml; 115 mg/ml; 105 mg/ml; 95 mg/ml; 85 mg/ml; 75 mg/ml; 65 mg/ml; 55 mg/ml; 45 mg/ml; 35 mg/ml; 25 mg/ml; 15 mg/ml; 5 mg/ml); 또는 1 mg/ml 내지 300 mg/ml(예를 들어, 2 mg/ml 내지 295 mg/ml; 4 mg/ml 내지 285 mg/ml; 6 mg/ml 내지 275 mg/ml; 8 mg/ml 내지 265 mg/ml; 12 mg/ml 내지 255 mg/ml; 14 mg/ml 내지 245 mg/ml; 16 mg/ml 내지 235 mg/ml; 18 mg/ml 내지 225 mg/ml; 22 mg/ml 내지 215 mg/ml; 24 mg/ml 내지 205 mg/ml; 26 mg/ml 내지 195 mg/ml; 28 mg/ml 내지 185 mg/ml; 32 mg/ml 내지 175 mg/ml; 34 mg/ml 내지 165 mg/ml; 36 mg/ml 내지 153 mg/ml; 38 mg/ml 내지 143 mg/ml; 42 mg/ml 내지 133 mg/ml; 52 mg/ml 내지 123 mg/ml; 62 mg/ml 내지 113 mg/ml; 72 mg/ml 내지 103 mg/ml; 82 mg/ml 내지 93 mg/ml)의 담체 중 복수의 미세입자의 농도를 갖는다

본원에 설명된 발포체 입자와 관련된 일부 실시양태에서, 발포체 입자의 집단은 (0.1Hz 내지 10Hz 주파수 스윕에서 측정 시) 적어도 약 0.5kPa 이상의 탄성률을 가질 수 있다.

일부 실시양태는 미세입자 기공의 적어도 약 40%(예를 들어, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70% 이상)이 약 1.0 내지 약 2.0의 종횡비(aspect ratio)를 갖는 본원에 설명된 미세입자 또는 복수의 미세입자를 제공한다.

본원에 설명된 입자와 관련된 추가 실시양태에서, 입자의 기공은 약 1 내지 약 2.5의 평균 종횡비를 갖는다.

추가 실시양태는 본원에 설명된 미세입자 또는 복수의 미세입자를 제공하며, 여기서 상기 미세입자는 예를 들어 물, 식염수, 완충 용액, 예컨대 포스페이트 완충 용액 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 수용액에서 수화될 수 있다.

조직 스캐폴드

또 다른 실시양태는 본원에 설명된 바와 같은 복수의 미세입자를 포함하는 조직 스캐폴드를 제공하며, 여기서 상기 복수의 미세입자는 예를 들어 젤라틴; 콜라겐; 및 이들의 조합으로부터 선택된 가교된 단백질의 단백질을 포함하고, 상기 복수의 미세입자는 수불용성이고; 상기 복수의 미세입자는 1 ㎛ 내지 2000 ㎛(예를 들어, 5 ㎛ 내지 150 ㎛)의 입자 크기 또는 1 ㎛ 내지 1500 ㎛(예를 들어, 5 ㎛ 내지 150 ㎛)의 평균 입자 크기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조직 스캐폴드는 하이드로겔 담체를 추가로 포함하며, 여기서 하이드로겔 담체는 젤라틴; 콜라겐; 알기네이트; 히알루론산; 카르복시메틸 셀룰로오스; 폴리(에틸렌 옥사이드)(PEO); 폴리(비닐 알코올)(PVA); 폴리(프로필렌 푸마레이트)(PPF); 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되지만, 이에 제한되지 않는다. 다른 실시양태는 하이드로겔 담체 중의 가교된 단백질 미세입자의 분산액, 또는 본원에 설명된 복수의 미세입자의 분산액을 포함하는 이러한 조직 스캐폴드에 관한 것이다. 추가 실시양태는 조직 스캐폴드가 발포체로서 구성되는 이러한 조직 스캐폴드를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 조직 스캐폴드는 가교된 단백질 미세입자의 복수의 미세입자를 포함하며, 여기서 상기 복수의 미세입자는 가교제 무함유이고 수불용성이며, 가교된 단백질 미세입자 또는 복수의 미세입자는 적어도 2가지 상이한 또는 독립적인 입자 크기를 포함한다. 또 다른 실시양태는 조직 스캐폴드가 3차원 형상을 포함하거나 3차원 형상으로 구성되는 본 개시내용의 이러한 조직 스캐폴드를 제공한다. 일 실시양태는 1 ㎛ 내지 2000 ㎛(예를 들어, 5 ㎛ 내지 120 ㎛; 40 ㎛ 내지 100 ㎛; 60 ㎛ 내지 90 ㎛)로부터 선택된 입자 크기를 포함하는 적어도 2가지의 상이한 또는 독립적인 입자 크기를 갖는 조직 스캐폴드에 관한 것이다.

장치

본 개시내용의 추가 실시양태는 본원에 설명된 조성물을 포함하는 장치를 제공한다. 일 실시양태에서, 본 개시내용의 장치는 복수의 미세입자로서, 상기 복수의 미세입자가 가교된 단백질을 포함하고 상기 가교된 단백질의 단백질이 적어도 하나의 RGD(Arg-Gly-Asp) 모티프를 포함하는 것인 복수의 미세입자(여기서, 상기 가교된 단백질을 포함하는 복수의 미세입자 또는 복수의 미세입자를 포함하는 조성물은 가교제 무함유이고 수불용성임); 및 하이드로겔과 같은 담체를 포함하는 이러한 조성물을 포함하며, 여기서 상기 장치는 주사기, 카트리지 또는 바이알이다. 다른 실시양태는 (a) 가교된 젤라틴을 포함하는 복수의 미세입자로서, 상기 복수의 미세입자 본질적으로 또는 실질적으로 가교제 무함유이고 수불용성인 복수의 미세입자; 및 하이드로겔 담체 또는 이를 포함하는 조성물을 포함하는 주사기를 제공하고, 여기서 상기 주사기 및/또는 그 안의 내용물은 멸균되거나 멸균 가능하거나 멸균을 위해 구성된다. 멸균 방법, 기술 또는 이의 도구의 비제한적인 예로는 증기 멸균(예를 들어, 오토클레이브); 화염; 열 멸균(예를 들어, 건열 멸균을 위한 열풍 오븐, 유리 비드 멸균기); 화학적 멸균(예를 들어, 에틸렌옥사이드 가스 멸균, 이산화질소 멸균, 글루타르알데히드 및 포름알데히드 용액을 사용한 멸균, 과산화수소 멸균(예를 들어, 액체 및 기화), 과아세트산 멸균); 방사선 멸균(예를 들어, 자외선(UV) 광 멸균을 사용한 전자기 방사선(예를 들어, UV-C 또는 살균 UV 멸균(예를 들어, 원거리 UVC 멸균), 감마선, X선 또는 전자빔 조사); 광역 스펙트럼 UV(UV-A, UV-B 및 UV-C 파장 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않음); 저온 멸균(예를 들어, 기화된 과산화수소, 과아세트산 침지, 오존) 등, 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다. 본 개시내용의 추가 실시양태는 주사기와 같은 장치를 제공하며, 여기서 상기 주사기는 14 게이지(G) 내지 39 G(예를 들어, 18 게이지 내지 30 게이지; 20 게이지 내지 29 게이지; 22 게이지 내지 27 게이지; 22 게이지 내지 27 게이지; 25 게이지 내지 26 게이지, 27 게이지 내지 30게이지; 17G; 18G; 19G; 20G; 21G; 22G; 23G; 24G; 25G; 26G; 27G; 28G; 29G; 30G)로부터 선택된 바늘을 포함하고, 여기서 게이지가 낮을수록(즉, 바늘이 두꺼워질수록), 본 개시내용의 복수의 미세입자 또는 조성물을 주사하는 것이 더 용이한 반면, 게이지가 높을수록(즉, 바늘이 얇을수록), 조직 스캐폴드, 복수의 미세입자 또는 복수의 미세입자를 포함하는 조성물을 필요로 하는 대상체의 진피에 대한 손상이 덜해진다. 피부과 적용을 위한 일부 실시양태는, 예를 들어, 27 게이지 내지 39게이지 바늘과 같은 여러 상이한 바늘에 부착되거나 부착되도록 구성될 수 있는 주사기 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 2 N 내지 70 N(예를 들어, 3 N 내지 60 N; 4N 내지 50 N; 5 N 내지 40 N; 6 N 내지 30 N; 7 N 내지 20 N); 70 N 또는 70 N 미만(예를 들어, 65 N; 55 N; 45 N; 35 N; 25 N; 15 N; 5 N); 2 N 또는 2 N 초과(예를 들어, 3 N; 4 N; 5 N; 6 N; 7 N; 8 N; 9 N; 10 N; 11 N; 12 N; 13 N; 14 N; 15 N; 16 N; 17 N; 18 N; 19 N; 20 N; 21 N; 22 N; 23 N; 24 N; 25 N; 26 N; 27 N; 28 N; 29 N; 30 N; 40 N; 50 N; 60 N; 70 N)의 주사력 또는 하중을 유지하면서 본 개시내용의 입자 및/또는 조성물의 주사를 허용하는 상기 생체물질이 포함된 27 게이지 바늘을 갖는 주사기가 본 개시내용의 일부 방법에 포함된다. 조직 스캐폴드는 일부 실시양태에서 다공성 젤라틴 조직 스캐폴드일 수 있다. 다른 이러한 실시예는 3차원 조직 스캐폴드를 제공한다. 추가 실시양태는 복수의 미세입자, 본 개시내용의 복수의 미세입자를 포함하는 조성물, 또는 본원에 설명된 조직 스캐폴드를 포함하는 주사기와 같은 장치에 관한 것일 수 있다.

본 개시내용의 추가 실시양태는 본 개시내용의 미세입자를 포함하는 주사기, 카트리지, 바이알 또는 적층 제조 디바이스(예컨대, 생체조직제조(biofabrication)를 위한)와 같은 장치를 제공하며, 여기서 상기 미세입자는 플레이트 또는 지지성 하이드로겔, 조직 내로 또는 대상체의 신체 상으로 또는 내로 배치된다.

본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본원에 설명된 임의의 실시양태의 조성물은 주사기와 같은 장치 또는 전달 장치에 사전 로딩될 수 있는 주사 가능한 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 주사기가 핸들을 통해 튜브에 결합되어 조성물이 튜브를 통해 주사될 수 있다. 이러한 튜브는 시술 동안 내시경 또는 방광경에 추가로 결합될 수 있다. 바늘은 튜브에 부착된 중공 바늘일 수 있다. 튜브는 외부 시스 튜브(sheath tube) 내에 위치할 수 있고 그 내에서 이동 가능하다. 바늘은 조성물의 주사를 제어하기 위해 외부 시스 튜브 내의 후퇴 위치와 바늘 팁이 외부 시스 튜브 외부에 있는 확장 위치 사이에서 이동 가능하다. 일부 실시양태에서, 외부 시스 튜브 내부에 바늘 및 내부 튜브를 갖는 외부 시스 튜브는 내시경의 채널에 삽입된다. 전달 장치는 내부 튜브를 외부 튜브 시스에 대해 원위적으로 이동시키고, 이를 통해 바늘을 바늘 팁이 본원에 설명된 조성물 또는 복수의 미세입자의 관심대상의 조직 또는 영역으로의 주사를 위해 노출되어 있는 연장된 위치를 향해 외부 시스 튜브를 통해 진전시키도록 사용자에 의해 작동될 수 있는 핸들을 포함할 수 있다.

작은 부피의 벌킹(bulking) 적용을 위한 다른 실시양태에서, 조성물 또는 복수의 미세입자는 약 30N 이하의 평균 압출력을 사용하여 14 게이지 내지 39 게이지 바늘로 주사될 수 있다. 작은 부피의 벌킹 적용의 예로는, 피부 조직용 진피 필러(예를 들어, 얼굴 주름, 주름 또는 흉터가 메워지는 얼굴 피부 조직의 치료), 요도 벌킹(예를 들어, 복압성 요실금의 치료), 자궁경부 조직(예를 들어, 자궁경부 무력증의 치료) 및 성대 벌킹(예를 들어, 성대 마비 또는 성대 기능부전의 기타 원인의 교정)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

용도 및 치료 방법

다른 추가의 실시양태는 신체 윤곽형성, 조직 공학, 재생 의학 및 미용 피부과 중 임의의 하나 이상을 위한, 복수의 미세입자, 복수의 미세입자를 포함하는 조성물, 조직 스캐폴드, 복수의 미세입자 및/또는 복수의 미세입자를 포함하는 조성물을 포함하는 장치의 용도를 제공하며, 여기서 일부 실시양태는 연조직 재건, 부피 복원, 유방 확대, 생체자극 등 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 신체 윤곽형성을 추가로 제공한다. 본 개시내용의 또 다른 용도 실시양태는 섬유아세포 자극, 콜라겐 생성 자극, 신콜라겐생성(즉, 새로운 콜라겐을 생성하는 과정), 조직 재성장, 혈관신생 유도 및 조직 스캐폴드 제공 등 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 본원에서 사용되는 생체자극을 포함한다. 본 개시내용의 추가 용도 실시양태는 본원에 설명된 장치에서 구성된 조성물 및/또는 복수의 미세입자에 관한 것이며, 여기서 상기 장치는 예를 들어 주사기, 카트리지 또는 바이알이다.

본 개시내용의 방법은 본원에 설명된 신체 윤곽형성을 필요로 하는 대상체(인간을 포함하는 동물)를 치료하는 방법으로서, 복수의 미세입자와 담체의 조성물을 신체 윤곽형성을 필요로 하는 대상체의 부위에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은, 예를 들어, 복수의 미세입자와 담체의 조성물을 신체 윤곽형성을 필요로 하는 대상체의 부위에 주사함으로써 투여하는 것을 포함한다. 본 개시내용의 또 다른 실시양태는 투여가 섬유아세포 자극; 콜라겐 생성 자극; 신콜라겐생성 유도; 조직 재성장 유도; 혈관신생 유도; 조직 스캐폴드 제공 등 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 신체 윤곽형성을 필요로 하는 대상체를 치료하는 이러한 방법을 제공한다.

본 개시내용의 일부 실시양태에서, 조성물을 형성하기 위해 하이드로겔 담체에 현탁된 복수의 미세입자가 조성물을 함유하는 멸균 주사기를 통해 대상체의 부위에 주사될 수 있으며, 여기서 상기 대상체는 치료적 및 미용적 적용을 필요로 한다. 본원에 설명된 조성물 또는 제형은 필요에 따라 피하층(피하 조직, 피부밑 조직으로도 알려짐), 연조직 및 포유동물 분비선에 주사될 수 있다. 이러한 기술은 주사 위치를 시각하기 위한 다른 기술, 예를 들어 초음파 및 X선과 함께 이용될 수 있다. 또한, 최소 침습적 시술을 사용하여 조직 스캐폴드를 대상체에게 주사하는 것은 체강 노출이 최소화되기 때문에 개복 수술 수행으로 인한 감염 위험, 수술과 관련된 비용, 및/또는 의료 과실 가능성을 최소화한다. 또한, 하이드로겔 담체에 현탁된 복수의 미세입자를 조성물로서 주사하여 본원에 설명된 대상체를 치료하는 방법은 또한 본원에서 사용된 주사기 및/또는 바늘의 크기보다 더 큰 절개부 또는 개구부를 필요로 하는 전형적인 수술과 비교하여 회복 시간 및 통증을 감소시킨다.

일부 실시양태는 본원에 설명된 조성물 또는 제형의 투여 유형에 관한 것이며, 여기서 상기 조성물 또는 제형은 피부의 피하층(피하 조직 또는 피부밑 조직으로도 알려짐)에 투여된다. 피부는 얼굴 피부, 엉덩이 피부 또는 임의의 연조직을 포함할 수 있다. 본원에 설명된 조성물 및 제형은 또한 대상체의 유방 재건 시술을 위한 유선 또는 지방 조직으로의 투여를 포함한다. 전임상 데이터는 래트 모델 및 돼지 모델에서 피부의 피하(SC)층뿐만 아니라 돼지 모델에서 유선에 주사된 비가교된 젤라틴 담체와의 본 개시내용의 젤라틴 미세입자를 입증하였다. 예를 들어 실시예 2 참조.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 복수의 미세입자 또는 스캐폴드로서 복수의 미세입자를 포함하는 조성물은 조직 결함의 즉각적인 물리적 및 기계적 안정화를 제공하거나 임플란트일 수 있는 스캐폴드의 생체역학적 강도를 통해 피부 리프팅/팽창을 제공하는 데 사용될 수 있다. 본 개시내용의 임플란트는 원하는 수술 결과를 얻기 위해 물질의 추가를 필요로 하는 약점 또는 공극이 존재하는 결함을 보강하는 연조직 지지 및 복구를 위한 임시 스캐폴드로서 사용될 수 있다. 이식 후, 임플란트 및/또는 임플란트로 인해 발생한 내성장된 고유 조직은 1개월, 3개월 또는 6개월 후에 0시간 임플란트 부피(즉, 100% 0시간 부피)의 적어도 10부피%를 유지할 수 있다. 임플란트는 예를 들어 신체 윤곽형성, 재건, 유방 확대를 위한 필러 역할을 할 수 있으며, 이는 즉시 분해되지 않고 임플란트에 의해 자극(예를 들어, 섬유아세포 및/또는 콜라겐 생성 자극, 신콜라겐생성 유도; 조직 재성장 유도, 조직 스캐폴드 제공 등 또는 이들의 임의의 조합)된 조직으로 대체된다. 임플란트가 생체자극제 역할을 할 수 있기 때문에, 자극된 세포 또는 조직은 대상체에서 3개월 내지 6개월 동안 초기 임플란트의 10부피% 내지 100부피%(예를 들어, 20% 내지 50%)의 부피로 남아 있다. 새로운 세포 또는 조직이 임플란트에 의해 유도될 수 있으며 미세입자 임플란트를 대체할 수 있다.

또 다른 실시양태는 생체자극제 및 조직 스캐폴드로서 작용하는 본 개시내용의 복수의 미세입자 및/또는 조성물을 제공한다. 예를 들어, 복수의 미세입자 및/또는 조성물이 투여되는 경우, 섬유아세포 및 콜라겐 생성이 자극될 수 있고/있거나, 신콜라겐생성 및/또는 조직 재성장이 유도될 수 있고/있거나, 조직 스캐폴드가 이용될 수 있으며, 이들 모두는 치료, 미용 피부과 및 재건 시술 또는 수술에서 사용하기 위한안전하고 효과적인 저렴한 조직 스캐폴드 및/또는 생체자극제의 범위 내에서 이루어진다.

실시예 16에 예시된 바와 같이, 본 개시내용의 일부 실시양태는 복수의 미세입자 또는 복수의 미세입자를 포함하는 조성물의 용도를 제공하며, 여기서 상기 조성물 또는 복수의 미세입자는 시험관 또는 생체내 적용에서 살아있는 세포에 대한 미세담체로서 기능한다. 예를 들어, 본원에 설명된 발포체 입자(FP)를 포함하는 세포의 시험관내 배양은 단백질 생산, 연구용 생체물질, 약물 개발을 위한 미세기관, 조직 공학용 미세구조와 같은 의학적 목적을 위해 또는 세포 기반 요법의 향상을 위한 제제로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이들 세포는 예를 들어 연속적인 방식으로막대한 수로 증식하고 유지될 수 있다. 그러나, 이는 표준 2차원 세포 배양 방법(즉, 플라스틱 플레이트, 플라스크 등에서의 표면 배양)에서는 달성하기 어려울 수 있으며, 본 개시내용의 미세입자(예를 들어, FP)는, 예를 들어 배양 부피 및 배지를 최적으로 사용하는 3차원 현탁 배양을 허용하고 단일 배치뿐만 아니라 연속 배양 과정을 가능하게 하는 미세담체 역할을 할 수 있다. 또한, 이러한 미세담체는 세포 기반 요법에서 생체내에서 사용되는 세포, 예를 들어 조직에 주사된 세포에 대한 지지를 제공하여, 생체내 세포 생존을 향상시킬 수 있다. 본 개시내용의 미세입자(예를 들어, FP)는 또한 환경 조건, 시딩 농도 및 배지 선택과 같은 원하는 세포주 분화를 위한 최적의 조건에서 줄기 세포 또는 위성 세포를 사용하는 세포 분화에 사용될 수 있다.

또 다른 실시양태는 세포 성장을 지지하고 이식을 위한 또는 약물 스크리닝 또는 단백질 제조에서의 사용을 위한 조직 유사 미세기관의 형성을 촉진하는, 생체외 조직 공학, 예를 들어 3차원(3D) 스캐폴딩을 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물 또는 복수의 미세입자는 시험관내 조직 또는 세포 배양에 사용될 수 있으며, 여기서 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 조성물 또는 복수의 미세입자와 접촉시키면, 세포는 증식하고 이와 같이 특정 단백질을 발현하며, 세포는 더 많은 단백질을 발현하도록 증대될 수 있다. 일부 실시양태는 성장 또는 증대를 위해 RGD가 풍부한 스캐폴드를 필요로 하는 포유동물 세포에 관한 것이다. 세포의 비제한적 예로는 섬유아세포, 상피, 중국 햄스터 난소(CHO), NS0 및 Sp2/0 뮤린 골수종 세포, HEK293 세포, 인간 이배체(HeLa) 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK21) 세포 등이 포함되고, 이들은 각각 콜라겐, 엘라스틴, 젤라틴, 호르몬, 단클론 항체, 효소, FC-융합 단백질, 사이토카인 및 성장 인자, 응고 인자와 같은 구조적 세포외 매트릭스(ECM) 구성요소로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 발현한다. 예를 들어, 본 개시내용의 조성물 또는 복수의 미세입자는 세포 부착, 성장, 증대 또는 이들의 조합을 위한 미세담체 또는 스캐폴드로서 사용될 수 있으며, 여기서 세포는 통상적으로 알려져 있고 사용되는 임의의 포유동물 부착성 세포, 예컨대 이에 제한되지 않지만, 섬유아세포, 상피, 중국 햄스터 난소(CHO), NS0 및 Sp2/0 뮤린 골수종 세포, HEK293 세포, 인간 이배체(HeLa) 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK21) 세포, 심근세포, 유도 만능 줄기 세포 등일 수 있다. 일부 양상에서, 섬유아세포, 심근세포 및 유도 만능 줄기 세포가 소기관에 대한 발현 및 연구에 사용되는 기타 세포 유형을 대표하는 통상적으로 사용되는 세포이다.

추가 실시양태는 시험관내 조직 또는 세포 배양에 의한 단백질 정제를 위한, 본원에 설명된 조성물 또는 복수의 미세입자의 용도에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 단백질 정제는 발현된 단백질을 수집하고, 배양 배지에서 단백질을 여과함으로써 달성될 수 있으며, 여기서 수불용성인 미세입자로부터 수용성인 단백질을 여과하거나 분리하는 것은, 예를 들어, 수집을 위한 여과 또는 원심분리에 의해 일어난다.

일부 실시양태는 복수의 단백질 생산 또는 발현 세포를, 세포를 배양하고 단백질 발현 또는 합성을 유도하기에 충분한 조건 하에, 본원에 설명된 복수의 미세입자 또는 복수의 미세입자를 포함하는 조성물 및 배양 배지를 포함하는 세포 배양물에서 성장시키거나 배양하는 단계를 포함하는 단백질(예를 들어, 무세포(cell-free))의 생산 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포(예를 들어, 섬유아세포, 상피 세포, 중국 햄스터 난소(CHO), NS0 및 Sp2/0 뮤린 골수종 세포, HEK293 세포, 인간 이배체(HeLa) 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK21) 세포이며, 이는, 호르몬: 코리오고나도트로핀 알파(Choriogonadotropin alfa), 폴리트로핀 알파, 폴리트로핀 베타, 황체형성 호르몬, 골형성 단백질-1, 티로트로핀 알파, 응고 인자, 인자 VIII, 인자 IX, 인슐린, 소마트로핀, 콜라겐, _항체: 아달리무맙(Adalimumab), 알렘투주맙(Alemtuzumab), 베바시주맙(Bevacizumab), 브렌툭시맙(Brentuximab), 데노수맙(Denosumab,), 골리무맙(Golimumab), 이브리투모맙 티욱세탄(Ibritumomab tiuxetan), 이필리무맙(Ipilimumab), 오비누투주맙(Obinutuzumab), 오말리주맙(Omalizumab), 페르투주맙(Pertuzumab), 리툭시맙(Rituximab), 실툭시맙(Siltuximab), 토실리주맙(Tocilizumab), 트라스투주맙(Trastuzumab), 베돌리주맙(Vedolizumab), 아도-트라스투주맙탄신(Ado-trastuzumabemtansine), 우스테키누맙(Ustekinumab). 효소: 아갈시다제 베타, 알글루코시다제 알파, 알테플라제, 엘로설파제, GalNAc 4-설파타제, 인간 DNase, 히알루로니다제, 이미글루세라제, 라로니다제, 테넥테플라제, 성장 인자: 및 사이토카인: 다베포에틴 알파, 인터페론 베타-1a, 에포에틴 알파, 에포에틴 베타, 에포에틴 세타 등으로 이루어진, 콜라겐, 엘라스틴, 젤라틴, 호르몬, 단클론 항체, 효소, FC 융합 단백질, 사이토카인 및 성자 인자와 같은 구조적 ECM 구성요소로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 생산하는 데 사용될 수 있다.

본 개시내용의 실시양태는 또한 미세담체 상에서 전술한 임의의 세포(예를 들어, 포유동물, 부착성)를 배양하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 미세담체는 5 ㎛ 내지 2000 ㎛(예를 들어, 99㎛ 내지 700 ㎛)의 건조 입자 크기를 갖는 본원에 설명된 복수의 미세입자이다. 일부 실시양태에서, 세포는 단백질 발현 또는 정제를 위한 시험관내 세포 배양에 유용한 세포 유형을 대표하는 통상적인 부착성 포유동물 세포, 예컨대 인간 섬유아세포, 상피 세포, 중국 햄스터 난소(CHO), NS0 및 Sp2/0 뮤린 골수종 세포, HEK293 세포, 인간 이배체(HeLa) 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK21) 세포, 및 전술한 세포 중 임의의 것이다.

본 개시내용의 일부 실시양태는 본 개시내용의 복수의 미세입자 및 배양 배지를 포함하는 세포 배양물에서 복수의 단백질 생산 세포를 성장시키는 단계를 포함하는, 단백질, 예를 들어 무세포 단백질을 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 성장은 단백질 합성을 유도하는 조건 하에 일어나 무세포 단백질을 생산한다. 단백질 생산 세포의 비제한적인 예로는 콜라겐 생성을 위한 섬유아세포, 상피 세포, 단클론 항체, 예컨대 아달리무맙, 알렘투주맙, 베바시주맙, 브렌툭시맙, 데노수맙, 골리무맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 이필리무맙, 오비누투주맙, 오말리주맙, 페르투주맙, 리툭시맙, 실툭시맙, 토실리주맙, 트라스투주맙, 베돌리주맙, 아도-트라스투주맙탄신, 우스테키누맙의 생산 또는 효소, 예컨대 아갈시다제 베타, 알글루코시다제 알파, 알테플라제, 엘로설파제, GalNAc 4-설파타제, 인간 DNase, 히알루로니다제, 이미글루세라제, 라로니다제, 테넥테플라제의 생산, 또는 호르몬, 예컨대 코리오고나도트로핀 알파, 폴리트로핀 알파, 폴리트로핀 베타, 황체형성 호르몬, 골형성 단백질-1, 티로트로핀 알파, 응고 인자, 인자 VIII, 인자 IX, 인슐린, 소마트로핀의 생산을 위한 중국 햄스터 난소(CHO); 단클론 항체, 예컨대 벨리무맙(Belimumab), 나탈리주맙(Natalizumab), 오파투무맙(Ofatumumab), 팔리비주맙(Palitumab), 라무시루맙(Ramucirumab), 압식시맙(Absiximab), 바실릭시맙(Basiliximab), 카나키누맙(Canakinumab), 세툭시맙(Cetuximab), 인플릭시맙(Infliximab)의 생산을 위한 NS0 및 Sp2/0 뮤린 골수종 세포; 및 응고 인자, 예컨대 인자 VIIa 또는 인자 VIII의 생산을 위한 HEK293 세포, 인간 이배체(HeLa) 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK21) 세포가 포함된다. 일부 실시양태에서, 본원에 설명된 무세포, 또는 본질적으로 무세포 단백질을 생산하는 방법은 콜라겐; 호르몬; 단클론 항체; 효소; 성장 인자; 사이토카인; 및 이들의 조합으로부터 선택된 단백질 또는 무세포 단백질을 생산한다.

일부 실시양태에서, 분화된 세포 또는 분화된 세포들을 생산하는 방법은 유도 만능 줄기 세포, 진피 줄기 세포, 표피 줄기 세포 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 복수의 세포를 성장시키는 단계를 포함한다. 복수의 세포는 복수의 미세입자 또는 본 개시내용의 복수의 미세입자(즉, 적어도 하나의 RGD 모티프를 포함하는 가교된 단백질, 여기서 복수의 미세입자는 가교제로 구성되지 않거나, 실질적으로 구성되지 않거나, 가교제 무함유이거나, 본질적으로 가교제 무함유임)를 포함하는 조성물을 포함하는 세포 배양물 또는 세포 배양 배지에서 성장하며, 여기서 상기 세포는 세포 분화를 유도하여 분화된 세포를 생산하기에 충분한 조건 하에 성장한다. 예를 들어, 전술한 복수의 세포는 기능성 심근세포와 같은 기능성 세포로 분화될 수 있다.

본 개시내용의 추가 실시양태는 미세담체 상에서 세포(예를 들어, 포유동물, 부착성)를 배양하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 미세담체는 5 ㎛ 내지 2000 ㎛의 건조 입자 크기를 갖는 본원에 설명된 복수의 미세입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 유도 만능 줄기 세포(iPS), 배아 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 위성 세포 및 전술한 세포 중 임의의 것과 같은 분화에 적합한 부착성 포유동물 세포이다.

본원에서 사용된 모든 용어는 달리 제공되지 않는 한 당업계에서 통상적인 의미를 갖는 것으로 의도된다. 모든 농도는 달리 정의되지 않는 한 국소 조성물의 전체 중량에 대한 명시된 구성요소의 중량 백분율에 대한 것이다.

본원에 사용된 바와 같이, 단수형은 하나 이상을 의미할 것이다. 단어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우에, 본원에 사용된 단수형 단어는 하나 또는 하나 초과를 의미한다. 본원에 사용된 "또 다른"은 적어도 두번째 이상을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, 모든 수치 값 범위는 종점 및 개시된 값 사이에 개시된 모든 가능한 값을 포함한다. 모든 반정수 수치 값의 정확한 값은 또한 구체적으로 개시된 바와 같이 및 개시된 범위의 모든 하위세트에 대한 한계로서 고려된다. 예를 들어, 0.1% 내지 3%의 범위는 구체적으로 0.1%, 1%, 1.5%, 2.0%, 2.5% 및 3%의 백분율을 개시한다. 추가적으로, 0.1 내지 3%의 범위는 0.5% 내지 2.5%, 1% 내지 3%, 0.1% 내지 2.5% 등을 포함하는 원래 범위의 하위세트를 포함한다. 개별 구성요소의 모든 중량%의 합계는 100%를 초과하지 않을 것으로 이해될 것이다.

"본질적으로 이루어진다"는 것은, 예를 들어 성분이 상업적 물질에 존재하는 통상의 불순물 및 본원에 개시된 실시양태의 작동에 영향을 미치지 않는 수준으로, 예를 들어 5중량% 미만 또는 1중량% 미만 또는 심지어 0.5중량%의 수준으로 존재하는 임의의 다른 첨가제와 함께, 열거된 구성요소만을 포함하는 것을 의미한다.

실시예

하기 실시예는 본 설명의 구체적 양상을 예시한다. 실시예는 단지 실시양태 및 이의 다양한 양상의 구체적 이해 및 실시를 제공하기 때문에, 실시예는 제한적인 것으로 해석되어서는 안된다.

예를 들어, 본원의 실시예는 본질적으로 조직 스캐폴드를 형성하는 효소적으로(mTG) 가교된 젤라틴 발포체 미세입자의 제조를 설명하고, 주사 가능성의 맥락에서 본 개시내용의 조성물의 유변학적 특성을 설명하며, 주사가능한 진피 필러로서 본 개시내용의 미세입자 및 조성물의 안전성 및 유효성을 입증하며, 동물 모델 실험에서 낮은 염증 및 유의한 신콜라겐생성을 보여주었다.

실시예 1: 가교된 젤라틴 발포체 미세입자의 제조.

가교된 젤라틴 발포체의 미세입자를 다음과 같이 제조하였다:

1) 젤라틴 분말을 완전히 용해될 때까지 계속 교반하면서 50℃에서 물에 서서히 첨가하였다.

2) 별도로, 미생물 트랜스글루타미나제(mTG)를 완전히 용해될 때까지 계속 교반하면서 25℃에서 물에 서서히 첨가하였다.

3) 용해된 젤라틴 용액을 통기를 위해 휘핑 기계를 사용하여 약 37℃에서 발포체로 휘핑하거나, 예를 들어 가스 또는 공기(예를 들어, 아르곤, 이산화탄소, 헬륨, 수소, 크립톤, 메탄, 네온, 질소, 산소, 오존, 수증기, 크세논)와 함께 휘젓거나 교반하였다.

4) 용해된 mTG 용액을, 예를 들어 가스 또는 공기 없이 교반하는 동안 젤라틴 용액에 서서히 첨가하고, 이것을 가교된 젤라틴 융합성 하이드로겔 블록이 형성될 때까지 지속하였다.

5) 발포체 또는 하이드로겔 블록을 조각으로 다이싱하거나 절단하였다(예를 들어, 5 mm 내지 20 mm(즉, 2 cm)).

6) 다이싱된 하이드로겔 블록 또는 발포체를 50℃에서 물에서 휘젓고 mTG 효소가 제거 또는 세척되거나 효소의 대부분이 제거되어 가교제 무함유 다이싱된 하이드로겔 또는 발포체를 형성할 때까지 여과하여 2회 세척하였다.

7) 세척되고 다이싱된 가교된 젤라틴 발포체 또는 하이드로겔 블록을 -18℃에서 트레이에서 밤새(예를 들어, 2시간 내지 25시간) 냉동시킨 다음, 0.04 mbar 내지 0.05 mbar에서 48시간 동안 동결건조하였다.

8) 동결건조된 발포체 또는 하이드로겔 블록을 제트밀 또는 블레이드 그라인더를 사용하여 분쇄하고, 분말을 체(예를 들어, 35 US 메쉬 # - 5000 US 메쉬 #, 2.5 ㎛ 내지 500 ㎛)에 통과시켜 입자 크기 그룹으로 분리한다.

젤라틴을 상이한 미생물 트랜스글루타미나제 농축물로 가교시켜 안정한 구조를 생성하였다. 안정한 구조를 제조 과정에서 언급한 바와 같이 쵸핑하고, 밀링하고, 여러 크기 범위로 체질하여 미세입자를 형성하고, 세척하여 트랜스글루타미나제를 제거하였다. 미세입자를 주사 전에 담체 또는 윤활제에 다양한 농도로 희석하였다. 미세입자 및 담체를 공기(주로 질소 및 산소로 구성되고 또한 소량의 이산화탄소, 수소, 헬륨, 아르곤, 네온 등을 포함할 수 있음)의 존재 없이 융합성 균질 겔 유사 유체로서 주사하였다. 원하는 크기 범위(예를 들어, 0.1 ㎛ 내지 2000 ㎛)의 가교된 젤라틴 발포체 미세입자를 선택된 액체 담체(예를 들어, 젤라틴, 히알루론산, 카르복시메틸 셀룰로오스, 물)에 분산시키거나(예를 들어, 표 1 내지 3 참조) 담체/윤활제 구성요소의 건조 분말과 혼합하고 주사기에 충전하고 오토클레이브 또는 방사선으로 멸균한다.

미세입자 내의 mTG 가교제의 양은 mTG 활성 분석 및 SDS PAGE를 사용하여 측정하였다. 테스트된 농도는 양성 대조군의 값보다 낮은 mTG 활성 및 mTG 단백질의 값을 나타냈으며, 이는 본원에서 해당 용어가 사용되는 바와 같이 미세입자가 본질적으로 또는 실질적으로 가교제 무함유였음을 입증한다. 도 1 참조.

실시예 2: 가교된 젤라틴 발포체 미세입자 제형의 조직병리학적 평가.

래트 피부 모델에서 가교된 젤라틴 발포체 미세입자의 피하 주사 제형에 대한 급성 및 아만성 반응을 수행하여 조직 확대 및 피부 리모델링에 대한 안전성, 내용성(tolerability) 및 성능을 평가하였다. 평가된 매개변수는 이식된 가교된 젤라틴 발포체 미세입자 제형에 대한 세포 및 조직 반응뿐만 아니라 외부 피부 반응이었다.

본 실험을 위해, 125 mg의 동결건조된 젤라틴 발포체 미세입자로 구성되고 방사선(10 킬로 그레이)으로 멸균되고 1.2ml 멸균 식염수에 현탁된 본 개시내용의 제형을 테스트하였다. 건조 젤라틴 발포체 미세입자를 주사 3시간 전에 식염수와 혼합하였다. 미세입자의 제조는 실시예 1에 더 상세히 설명되어 있다.

젤라틴 발포체 미세입자 제형을 3마리의 래트의 피하 조직에 주사하여 이식하였다. 각 래트에게 각 부위에 제형 0.3ml씩 1곳 내지 2곳의 부위에 이식하였다. 한 부위에는 경쟁 제품인 Radiesse™(Merz Aesthetics; 수성 겔 담체 중의 칼슘 하이드록시아파타이트 미세구로 구성된 콜라겐 자극제) 0.3ml를 주사하였고, 이는 양성 대조군으로서 사용하였다. 7일차 및 30일차에 헤마톡실린 & 에오신(HE) 및 메이슨 트리크롬(MT) 염색을 통한 조직병리학적 평가를 위해 이식 부위를 수집하였다.

조직병리학적 평가는 반정량적 채점 방법에 기반하였으며 독립적인 병리학자에 의해 "맹검" 방식으로 평가되었다. 임플란트 내용성 및 성능의 평가는 이식 부위의 국소 조직 반응, 괴사의 존재, 공동 형성, 세포 침윤의 유형, 이물질 반응의 존재, 새로운 콜라겐 섬유(신콜라겐생성)의 양 및 물질 흡수로 이루어졌다. 각 매개변수는 0 내지 4의 스케일로 점수를 매겼다(각 스케일의 각 숫자는 다음을 나타낸다: 0-변화 없음, 1-최소, 2-경미, 3-중간 정도, 4-심각함). 도 12-도 13 참조.

조직 확대 및 피부 리모델링을 위한 본 개시내용의 젤라틴 발포체 미세입자 제형의 주사 가능성, 안전성, 내용성 및 성능에 대한 조직병리학적 평가를 수행하였다.

생성물 밀리리터당 다양한 양의 가교된 젤라틴 발포체 미세입자와 다양한 담체 하이드로겔을 사용하여 하기 제형을 제조하였다.

표 1: 생체내에서 테스트된 제형.

표 1의 모든 제형(1번 내지 8번)은 각 주사 부위에 성공적으로 주사되었다: 돼지 배에서 3 cm x 3 cm 정사각형당 1 ml. 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC); 히알루론산(HA);

돼지 피부를 1주일 동안 육안으로 보이는 이상 사례(adverse event)에 대해 조사하였고, 주사 부위에는 어떠한 이상 반응도 없는 것으로 관찰되었다.

결과:

7일차에 2곳의 부위로부터 수집된 개시된 젤라틴 발포체 미세입자 제형 임플란트는 등급 1의 이물질 반응 및 등급 1 내지 2의 신콜라겐생성을 나타냈다. 30일차에 3곳의 부위로부터 임플란트를 수집하였고, 이는 등급 1 내지 2의 이물질 반응과 함께 등급 2의 신콜라겐형성을 나타냈고, 임플란트의 일부 흡수는 뚜렷하였다. 또한, 본원에 설명된 복수의 미세입자를 포함하는 임플란트 또는 조성물과 연결되고 복수의 미세입자를 포함하는 임플란트 또는 조성물을 관통하는 다량의 섬유아세포가 관찰되었다. 어떠한 부위 및 시점에서도 괴사, 공동 형성 또는 부종이 존재하지 않았으며, 이는 우수한 조직 내용성을 입증하였다(도 2a 내지 도 2d).

이와 비교하여, 유사한 양의 양성 대조군인 Radiesse™(Merz Aesthetics)를 피하 이식하고 조직병리학적 평가를 위해 30일차에 수집하였다. 이식된 부위에서, 신콜라겐생성은 등급 0 내지 1이고, 주요 이물질 반응은 등급 3이었다. 반면에, 본 발명의 젤라틴 발포체 미세입자 제형은 신콜라겐생성에 대해 등급 2였고 주요 이물질 반응에 대해 등급 1 내지 2였다. Radiesse™ 임플란트는 입자 주위의 세포 이동은 허용하였지만, 젤라틴 발포체 미세입자에서 볼 수 있는 바와 같이 입자 벌크로의 침윤은 허용하지 않았다.

요약하면, 본 개시내용의 젤라틴 발포체 미세입자 제형은 안전한 것으로 밝혀졌다. 임플란트는 근육, 혈관, 신경 및 표피와 같은 조직에 부정적인 영향을 주지 않으면서 고도로 내용성인 것으로 관찰되었다. 임플란트는 신콜라겐생성을 자극하여 피부 재생을 촉진하는데, 이는 양성 대조군인 경쟁 제품보다 우수하다.

실시예 3: 젤라틴 발포체 미세입자 제형의 주사 가능성 특성규명.

본 개시내용의 젤라틴 발포체 또는 하이드로겔 미세입자 제형을 일 실시양태에서 섬유아세포 자극 및 조직 재성장을 위한 최적의 스캐폴드 지지체를 제공하기 위한 미용 피부과 및 재건 수술용으로 개발하였다. 안전하고 주사 가능한 생체자극제에 대한 중대한 요구를 해결하고 즉각적인 임상 결과를 제공하면서 동시에 진피 필러를 사용하여 유사하게 생성된 피부를 리프팅하고 오래 지속되는 결과를 제공하는 생성물이 요망된다.

주사 가능성은 주사기와 적절한 바늘에 의해 성공적으로 투여되는 생성물의 능력으로 간주된다. 본 개시내용의 젤라틴 발포체 미세입자 제형의 주사 가능성은 Lloyd 압축 시스템(LLOYD Instruments)을 사용하여 평가하였다. 이 방법은 ASTM F2900-11 표준 가이드에 따라 접착성 3D 발포체 구조의 특성규명 및 재생 의학에 사용되는 하이드로겔의 특성규명을 위해 개발하였다. 이 분석 방법은 주사기를 통해 물질을 주사하는 데 필요한 힘의 기계적 데이터를 제공하였다. 바늘 크기와 주사기 브랜드 및 크기가 힘에 영향을 미친다.

본 연구의 목적은 본 개시내용의 젤라틴 발포체 미세입자 제형의 투여를 위한 상이한 최적의 제형을 평가하는 것이었다. 이러한 생성물을 개발하는데 있어 도전과제는 본 개시내용의 젤라틴 발포체 입자를 지지하여 표적 조직에서 3D 구조를 유지하고 3개월 내지 2년과 같은 조기 제거(clearance)를 방지할 수 있는 균일한 응집성 페이스트를 생성하는 것을 포함하였다. 이상적인 제형은 냉장(예를 들어, 4℃) 또는 실온(예를 들어, 20℃ 내지 25℃)에서 적절한 저장 동안 안정할 것이다.

제형은 젤라틴 발포체 미세입자 크기, 입자 대 담체 비, 담체 유형 및 담체 농도의 특정 조합으로 지칭된다.

결과

주사력에 대한 입자 크기의 효과를 테스트하였다. 상이한 크기의 입자를 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC) 담체에 현탁하였다. 구체적으로, 120 mg의 각 입자 크기(예를 들어, 30 ㎛ 내지 100 ㎛)를 1%의 CMC 1 ml에 현탁하였다. 주사력을 1ml 주사기와 27 게이지 바늘을 사용하여 측정하였다. 입자 크기와 측정된 힘(실선) 사이에 선형 상관관계(점선)가 관찰되었다(도 3).

제형

수십 개의 상이한 제형을 초기에 테스트하였다. 준비된 제형 질감이 시각적으로 평활하고 응집력이 있는 것으로 식별되면, 주사기를 준비하고 이의 주사 가능성을 테스트하였다. 따라서, 각 제형의 최적화를 단계별 방식으로 수행하였다. 본원에 제시된 연구 결과는 50 ㎛ 내지 100 ㎛(예를 들어, 60 ㎛ 내지 90 ㎛)의 입자 크기를 사용하였지만, 60 ㎛ 미만(예를 들어, 30 ㎛, 40 ㎛)의 더 작은 입자 크기를 함유하는 추가 제형도 제조하였다.

표 2: 주사된 의료 제품 또는 임플란트로서의 제형.

2℃ 내지 8℃에서 저장 후 안정성을 테스트하였다. 표 2의 제형 1번에 대해 3개의 시점, 즉 1일, 3 내지 4일 및 7일의 시점을 테스트하였다. 힘 테스트 전에, 주사기를 실온으로 평형화하였다. 표 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 냉장 저장 1일, 3 내지 4일 및 7일의 테스트 시점 후에 주사 가능성에는 유의한 변화가 없었다.

표 3: 제형 1번의 냉장 저장 후 주사력

다양한 입자 크기 및 담체 하이드로겔을 갖는 젤라틴 발포체 미세입자 제형을 제조하였다. 입자를 30 ㎛, 40 ㎛, 60 ㎛ 및 90 ㎛의 입자 크기까지 밀링하였다. 주사 가능성은 입자 크기와 필요한 주사력의 선형 상관관계에서 입자 크기에 의해 영향을 받는 것으로 밝혀졌다. 최소 침습 피부과 적용에 적합한 것으로 알려진 2가지 상이한 바늘 크기인 30 G 및 27 G에 대한 데이터를 얻었다(도 3).

실시예 4: 상이한 크기 범위의 젤라틴 발포체 미세입자 제형의 형태학적 형상.

젤라틴 발포체 미세입자(MP)의 형태학적 구조를 고해상도 주사 전자 현미경(HR-SEM) 및 명시야 현미경을 사용하여 평가하였다. MP의 형상, 크기 및 크기 분포 및 MP의 다공도 및 표면 질감과 같은 형태학적 매개변수를 조사하였다.

수송을 위해 소량의 MP 샘플을 1.5ml 마이크로원심분리 플립캡 튜브에 넣었다. 샘플을 고해상도 주사 전자 현미경(HR-SEM)(Technion; "Soft Material Electron Microscopy" 유닛)용으로 준비하였다. 구체적으로, 양면 접착성 카보-테이프 조각을 지정된 금속 금형에 부착시키고, 그 위에 샘플 MP를 확신시키고 균일하게 부착시켰다.

분석: HR-SEM 소프트웨어를 사용하여 이미지에 대해 여러 측정을 수행하였다. 모든 다른 분석은 이미지 및 그래프 표현의 시각적 평가와 같이 주로 정성적이다. 도 4 내지 도 6ac, 도 7a 내지 7b 도 8 참조.

HR-SEM 이미지에서 볼 수 있는 바와 같이, 여러 크기 범위의 입자를 제조하였다. 0.1 ㎛ 초과(또는 그 이하)의 입자 크기를 갖는 입자를 이미지화하였다. 도 4 참조: 104 nm, 105 nm, 112 nm, 145 nm, 150 nm, 275 nm. 60 ㎛ 내지 99 ㎛의 입자 크기를 갖는 MP가 관찰되었다. 도 5 참조; 75.69 ㎛; 88.38 ㎛; 91.56 ㎛; 99.68 ㎛. 크기 범위는 입자의 밀링 및 체질 생산 단계 동안 제어되고 조정되었다.

명시야 현미경을 사용하였을 때 최대 2000 ㎛ 크기의 큰 입자가 관찰되었다. 입자를 이미지화 전에 수화시켰다. 가교된 젤라틴을 99 ㎛ 내지 710 ㎛의 크기 범위까지 밀링하고 체질하였다. 생성된 입자의 팽윤 계수(swelling factor)(습식/건식)는 1.65였다. 일단 습윤화되면, 입자의 팽윤 및 크기는 초기 크기로부터 1.65배 증가하여 최대 약 2000 ㎛까지 증가하였다. 1172 ㎛의 수화된 젤라틴 입자를 도시하는 도 6ac 참조.

실시예 5: 입자 크기 결정.

가교된 젤라틴의 동결건조된 미세입자를 실온(RT)에서 24시간 동안 포스페이트 완충 식염수(PBS)에 분산시켰다. 수화된 미세입자를 광학 현미경으로 시각화하고 건조 입자와 비교하였다. 크기 분포를 ImageJ 소프트웨어에 의해 수동으로 평가하였다. 도 7a, 도 7b, 도 8 참조.

표 4: 예시적인 미세입자 크기 범위 및 평균의 요약.

실시예 6: 젤라틴 발포체 미세입자 제형의 기계적 특성

젤라틴 발포체 미세입자 제형의 기계적 특성을 준비하고, 실온(RT) 및 6℃에서 1시간 동안 혼합하고 저장한 후 테스트하였다.

0.5%, 0.75% 또는 1%의 비가교된 젤라틴 담체 중의 젤라틴 발포체 미세입자(MP)(즉, 60 ㎛ 내지 99㎛, 120 mg/ml)의 습윤 및 건조 제형을 제조하고 1 ml 주사기에 도입하였다. 상기 제형의 기계적 특성을 0.1 Hz 내지 10 Hz 범위의 주파수 스윕 테스트와 함께 AG-R2 레오미터를 사용하여 측정하였다. 도 9 참조. 이러한 상이한 진동 주파수는 샘플에 가해지는 상이한 전단력 수준에 상응한다. 겔 강성 및 이에 따른 압력이 가해질 때 변형에 저항하는 능력의 측정은 제형이 주사 바늘 또는 캐뉼라를 통해 어떻게 압출되는지, 또는 제형이 이후 얼굴 근육 조직 및 그 위에 있는 피부의 움직임에 어떻게 영향을 받는지에 대한 암시를 제공할 수 있다.

건조 입자 제형은 습윤 입자 제형보다 낮은 탄성률을 초래한다. 이는 제형 간의 차이 때문일 수 있다: 건조 입자 제형은 액체와 혼합하기 전에 멸균한 반면, 습윤 입자 제형은 액체와 혼합한 후 멸균하였다. 또한, 비가교된 젤라틴 담체의 백분율은 건조 입자 제형에서 더 낮았다.

표 5: 실온(RT) 및 6℃에서 비가교된 젤라틴 담체 중 젤라틴 미세입자의 기계적 특성.

실시예 7: 발포체 젤라틴 미세입자의 크기 특성규명.

20그램 젤라틴당 상이한 양의 미생물 트랜스글루타미나제(mTG)로 제조된 발포체 입자의 상이한 배치로부터의 샘플을 Mastersizer 3000(ITI Faculty of Biotechnology and Food Engineering, Technion, 일리노이주 하이파)에서 측정하였다. 샘플을 측정 직전에 중수소 감소수(deuterium depleted water: DDW) 또는 96% 에탄올에 분산시키거나 측정 전 24시간 동안 물에 분산시켰다.

표 6: Mastersizer 3000을 사용하여 측정된 발포체 입자의 평균 직경 값.

측정은 5회 반복하여 수행하였다(n=5).

결과:

도 10은 비수화된 발포체 MP(BC 81-9) 및 수화된 발포체 MP의 크기 분포를 보여준다. 발포체 MP를 중수소 감소수(DDW)(즉시(DDW) 또는 24시간 동안(DDW, 24시간)) 및 96% 에탄올에 분산시켰다. 96% 에탄올 중의 입자의 분산은 입자의 비수화 상태였으며, 이는 체질 후 건조 입자 크기를 나타낸다.

입자가 96% 에탄올에 분산되었을 때, 크기 범위가 50 ㎛ 내지 150 ㎛이고 D_x(50)가 약 80 ㎛인 더 좁은 크기 분포가 관찰되었다. 발포체 MP를 60 ㎛ 내지 99㎛의 크기 범위까지 체질한 결과, 80 ㎛의 크기 D_x(50)을 갖는 건조 입자가 예상 체질 범위의 대략 중간에 있었다.

입자가 물(DDW)에 분산되었을 때, 더 넓은 크기 분포가 관찰되었다. 이는 젤라틴 발포체 MP의 수분 흡수로 인해 입자 팽윤이 유발되고 크기 분포 플롯의 이동이 초래되었기 때문이다. 물에 즉시 수화된 입자의 D_x(50)와 수화 24시간 후의 입자의 Dx(50) 사이에 유의한 차이는 발견되지 않았으며, 이는 발포체 MP가 물에 분산된 직후 완전히 수화되었음을 나타낸다.

수화된 입자(DDW-24시간)의 D_x(50) 대 비수화된 입자(96% 에탄올)의 D_x(50)의 생성된 비는 1.67이었다.

실시예 8: 상이한 식염수 희석액 중의 발포체 젤라틴 미세입자의 주사 가능성.

담체로서 사용된 10 mg의 비가교된 젤라틴과 220 mg의 발포체 미세입자를 주사기 대 주사기(STS) 방식으로 30초 동안 2.5ml 주사기 내의 1.5ml, 2ml, 3ml의 식염수와 혼합하였다.

주사 가능성을 혼합 10분 후에 27 게이지(27G) 바늘을 갖춘 Lloyd's 기계식 테스트 기기를 사용하여 측정하였다.

표 7: 상이한 식염수 혼합 부피의 젤라틴 발포체 MP.

표 7 및 도 11에 도시된 바와 같이, 식염수 혼합 부피는 가교된 젤라틴 발포체 MP 제형의 주사 가능성 값에 영향을 미친다. 혼합 부피를 1.5 ml에서 4 ml로 증가시켰을 때, 주사 가능성은 각각 41 N에서 3 N으로 감소하였다. 제형의 주사 가능성을 조정하는 이러한 능력은 조직 저항성에 의존하여 상이한 위치 및 부피로 제형을 주사할 때 이점이 될 수 있다.

실시예 9: 발포체 젤라틴 미세입자 제형의 멸균성

젤라틴 발포체 MP의 멸균성을 12 kGy의 전자빔 방사선(Sor-Van, IL)을 사용한 멸균 후 내독소 및 바이오버든(bioburden) 테스트를 사용하여 평가하였다.

내독소 수준을 평가하기 위해, 20 mg의 발포체 젤라틴 MP를 4U 또는 8U 콜라게나제와 함께 5 ml의 내독소 무함유 물에 분산시키고 발포체 MP가 완전히 분해될 때까지 밤새 150 rpm으로 진탕하면서 37℃에서 배양하였다. 내독소 값을 EndoZyme™ II 분석을 사용하여 정량화하였다.

제조된 제품의 안전성을 목적으로 물, 원료, 또는 완제품 중의 세균 수준 또는 미생물 오염을 평가하고 정량화하기 위해, 바이오버든 테스트를 수행하였다. ISO 11737-1에 따라, 바이오버든 테스트는 밀로다(Miloda) 연구소에서 외부에서 수행되었다(SOP 200.04.01). 샘플(0.1 g)을 완충된 염화나트륨-펩톤(BSCP) + 0.1% Tween 1ml에 넣었다. 60초 동안 손으로 혼합하여 추출을 수행한 다음, 1 ml의 추출액을 트립신 대두 배지(Tryptic Soy Agar: TSA) 플레이트에 플레이팅하고 30℃ 내지 35℃에서 인큐베이션하였다. 72시간 후에 플레이트에서 성장한 미생물의 양을 계수하였다. 그 후, 페트리 접시를 추가로 72시간 동안 25℃로 옮긴 다음, 효모 및 곰팡이의 수를 콜로니 형성 단위(CFU)로서 계산하였다.

표 8: 멸균 후 발포체 겔화 MP의 내독소 및 바이오버든

표 8에 볼 수 있는 바와 같이, 발포체 입자 샘플의 내독소 수준(내독소 단위(EU))은 0.0126 EU/mg 내지 0.0466 EU/mg이었다. 디바이스당 EU(220 mg의 발포체 입자(FP)의)를 계산할 때, EU 값은 최대 10.2였으며, 이는 제형의 멸균성 및 E-빔 방사선을 사용한 멸균 방법의 검증을 입증하는 디바이스당 허용 가능한 EU 값인 20 EU 미만이다. 이는 1보다 작거나 1 미만인 콜로니 형성 단위(CFU)/그램(g)를 이용하는 바이오버든 테스트에서도 입증되었다.

실시예 10: 미세입자(MP)의 수불용성 시험

본 개시내용의 미세입자를 5 ml 식염수를 갖는 웰(6 플레이트 웰)에 플레이팅하고 100 rpm으로 진탕하면서 55℃에서 인큐베이션하였다. MP의 수불용성을 육안 평가를 위해 0시간(인큐베이션 전), 1시간 및 4일에 평가하였다. 시간 경과에 따라 시각적으로 구별이 관찰되지 않았다.

또 다른 연구에서, 본 개시내용의 미세입자를 60℃에서 밤새 사전 건조된 필터에 넣었다. 필터를 50 mg 내지 55 mg 입자로 칭량하고 2 ml 에펜도르프 튜브에 넣었다. 입자가 덮이고 필터 메쉬가 물(약 2.5ml)과 접촉한 것을 보장하기 위해 필터 내부에 물을 첨가하였다. 필터 및 에펜도르프 튜브를 알루미늄 호일로 덮고 테이프로 밀봉하고 60℃에서 인큐베이션을 위해 배치하였다. 1시간 또는 48시간 후, 샘플을 세척하고 건조시켜 중량 손실을 측정하였다. 샘플을 각각 3 ml 내지 4 ml 물로 세척하고(10라운드에 300 ㎕ 내지 400 ㎕) 60℃에서 밤새 건조되도록 배치하였다. FP 샘플을 갖는 필터를 건조 과정 후에 칭량하였다. 연구를 3회 반복하여 수행하였다. 인큐베이션 또는 물에 침지시키기 전 및 물에서 60℃에서 1시간 및 48시간 동안 인큐베이션한 후의 건조 FP의 중량비는 각각 1.006 및 1.005였다. 따라서, 물이 가온되었을 때에도(60℃) 물에서 1시간 또는 48시간 동안 인큐베이션한 경우 물질 건조 질량은 변하지 않은 상태로 유지되었다. 따라서 FP는 가교되었으며 수불용성이 아니다.

실시예 11: 동물 이식 안전성 연구

돼지 이식 안전성 연구에서, 상이한 유형의 제형을 돼지의 피하 조직(피하 조직, 피부밑 조직으로도 알려짐)에 주사하였다. 주사 부위를 주사 후 최대 180일까지 분석하였다(돼지 모델에서의 BC010 연구). 테스트된 미세입자(MP) + 담체 또는 윤활제 제형은 우수한 급성 및 아만성 내용성을 나타냈으며 안전한 것으로 결정되었다. 섬유아세포 동원은 심지어 7일차의 초기 시점에도 나타났으며, 30일차에 나타난 신콜라겐생성의 나중 과정까지 지속되었다. 콜라겐 자극이 입증되었으며, 국소 혈관신생(새로운 모세혈관 형성)의 지지는 새로운 생생한 콜라겐 조직의 생성을 유도하였다.

래트 이식 연구에서, MP 및 담체 또는 윤활제 제형을 래트의 피하 조직(피하 조직, 피부밑 조직으로도 알려짐)에 주사하였다. 본 연구는 주사 후 최대 30일까지 이상 사례, 부종 또는 괴사가 없이 주사 부위당 최대 2ml까지 상이한 용량으로(극단적으로 100배 과다 용량이 투여된 래트 모델에서) 주사된 제형의 높은 안전성 및 내용성을 보여주었다. 콜라겐 자극이 입증되었으며, 국소 혈관신생(새로운 모세혈관 형성)을 지지하여 새로운 콜라겐 조직의 생성을 유도하였다.

래트 이식 연구에서, 담체 건조 입자를 갖는 FP를 상이한 수화 액체: 식염수, 포스페이트 완충 식염수(PBS) 또는 주사용수(WFI)와 혼합하였다. 예를 들어, 110 mg FP와 5 mg 비가교된 젤라틴을 1 ml 식염수 또는 WFI와 혼합하였다. 본 연구는 주사 후 최대 30일까지 이상 사례, 부종 또는 괴사 없이 상이한 액체에서 주사된 제형의 높은 안전성 및 내용성을 보여주었다. 콜라겐 자극이 입증되었으며, 국소 혈관신생(새로운 모세혈관 형성)을 지지하여 새로운 콜라겐 조직의 생성을 유도하였다.

래트 이식 연구에서, FP 건조 입자를 상이한 담체와 혼합하였다: (a) 120 mg FP를 0.5 ml 식염수 및 0.5 ml 가교된 히알루론산(HA; 3000 KD; 10 mg/ml; 0.05 BDDE/1mg HA))과 혼합하였다; (b) 120 mg FP를 5 mg 비가교된 젤라틴의 흡습성 건조 분말(예를 들어, 입자에 관해 미국 특허 제10,596,194호 및 제11,331,412호 참조) 및 1 ml 식염수와 혼합된 12.5 효소 단위의 미생물 트랜스글루타미나제(mTG)의 건조 분말과 혼합하였다. 제형 (a)와 (b) 둘 다는 주사 후 최대 30일까지 이상 사례, 부종 또는 괴사 없이 높은 안전성 및 내용성을 나타냈다. 콜라겐 자극이 관찰되었고(히알루론산 주변이 아닌 FP 주변에서만) 새로운 콜라겐 조직의 생성을 유도하였으며, 이는 가교된 젤라틴 미세입자 FP가 세포 내성장 및 리모델링에 중요하다는 것을 나타낸다.

래트 이식 연구에서, 젤라틴을 상이한 농도의 mTG와 가교시켜 건조 FP를 제작하였다. 다양한 가교 mTG 제형의 120 mg FP를 1ml 식염수와 혼합하였다. 모든 제형은 주사 후 최대 30일까지 이상 사례, 부종, 또는 괴사 없이 높은 안전성 및 내용성을 나타냈다. 콜라겐 자극이 입증되었으며, 국소 혈관신생(새로운 모세혈관의 형성)을 지원하여 새로운 콜라겐 조직의 생성을 유도하였다.

실시예 12: 생체내 이식된 제형의 평가

돼지 이식 연구(BC010)에서, 주사된 MP 및 담체 제형은 7일차에 이식 부위에서 관찰되었으며, 잔여물은 1개월 시점에 나타났다. 180일차에, MP 및 담체 제형은 완전히 분해되어 잔여물이 보이지 않았다. 래트 연구(PCR007)에서, 주사된 MP 및 담체 제형은 주사 후 1개월차에 이식 부위에 존재하였다.

돼지 실험을 위해, 오토클레이브에 의해 멸균된, 1 ml의 최종 부피까지 상이한 담체 중의 30mg 내지 120mg의 동결건조된 젤라틴 발포체 미세입자로 구성된 본 개시내용의 제형을 테스트하였다. 미세입자의 제조는 실시예 1에 더 상세히 설명되어 있다.

래트 실험을 위해, 10 mg의 담체 분자와 혼합된 220 mg의 동결건조된 젤라틴 발포체 미세입자로 구성되고 방사선(10 킬로 그레이)으로 멸균되고 2 ml 멸균 용액에 현탁된 본 개시내용의 제형을 테스트하였다. 건조 젤라틴 발포체 미세입자를 주사 직전에 2 ml 식염수와 혼합하였다. 미세입자의 제조는 실시예 1에 더 상세히 설명되어 있다.

젤라틴 발포체 미세입자 제형을 돼지 2마리와 래트 18마리의 피하 조직에 주사하여 이식하였다. 각 래트에게는 각 부위에 0.3ml 내지 2ml의 제형을 1 내지 4곳의 부위에 이식하였다. 화살표는 본 개시내용의 이식된 조성물을 나타낸다. 래트 모델에서는 7일 및 30일차에 및 돼지 모델에서는 7일, 30일 및 180일차에 헤마톡실린 & 에오신(HE) 및 메이슨 트리크롬(MT) 염색에 의한 조직병리학적 평가를 위해 이식 부위를 수집하였다. 임플란트는 이식 후 7일, 30일 및 180일차(H&E- 돼지 7일 및 30일, 래트 7일 및 30일, MT-돼지 180일)에 돼지 및 래트 피부에서 H&E(세포 핵을 자주색을 띤 청색으로 염색하고, 세포외 매트릭스 및 세포질을 분홍색으로 염색하는 헤마톡실린 및 에오신) 및 MT, 메이슨 트리크롬(적색 케라틴, 근육 섬유 및 임플란트, 청색 콜라겐 및 뼈, 담적색 또는 분홍색 세포질 및 암갈색 내지 검은색의 세포 핵을 생성함)로 염색되었다. 도 12 참조.

본원에 설명된 미세입자 조성물 또는 제형은 생분해성으로 분류될 수 있으며, 이는 위험 완화에서 이점을 갖는다. 칼슘 하이드록시아파타이트(CaHA) 또는 PLA-폴리-L-락트산(PLA)과 같은 상업적으로 이용가능한 기타 제품은 분해 속도가 수많은 이상 사례 및 합병증을 유발할 수 있음을 보여주었다. CaHA로의 처리는 가장 높은 합병증률을 보였으며 주사된 조직에서 결절 및 육아종 형성이 가장 흔한 이상 사례였다. CaHA-CMC(칼슘 하이드록시아파타이트-카르복시메틸셀룰로오스) 임플란트는 입자 주위의 세포 이동은 허용하였지만, 젤라틴 미세입자에서 볼 수 있는 바와 같이 입자 벌크로의 침윤을 허용하지 않았다.

래트 연구에서, 주사된 미세입자 제형은 주사 후 1개월차에 이식 부위에 존재하였다.

실시예 13: 생체자극 과정의 평가

본원에 설명된 돼지 및 래트 이식 연구에 기반하여, 물질의 생체자극 과정은 주사 후 7일 정도로 조기에 관찰되었다. 이는 주사 부위에서 진행 중인 콜라겐 생성과정(등급 2) 및 새로운 콜라겐 섬유의 형성으로 나타났다. 이식 후 7일, 30일 및 180일차(H&E-돼지 7일 및 메이슨 트리크롬 돼지 30일 및 180일, 래트 7일 및 30일)에 H&E(세포 핵을 자주색을 띤 청색으로 염색하고, 세포외 매트릭스 및 세포질을 분홍색으로 염색하는 헤마톡실린 및 에오신) 및 메이슨 트리크롬(적색 케라틴, 근육 섬유 및 임플란트, 청색 콜라겐 및 뼈, 담적색 또는 분홍색 세포질 및 암갈색 내지 검은색의 세포 핵을 생성함)으로 염색된 임플란트의 대표적인 조직학적 사진. 도 13 참조.

실시예 14: SDS-PAGE에 의해 측정된 발포체 입자(FP) 내의 mTG 잔류물:

본 연구는 FP 생성물 내의 미생물 트랜스글루타미나제(mTG) 효소 잔류물의 정성적 측정을 SDS-PAGE로 분석하는 것이었다. FP 현탁액에서 mTG 밴드의 출현은 효소의 존재를 나타냈다. 본 연구는 2회 반복하여 수행하였다. 도 14 참조.

mTG(1), 젤라틴(2) 및 콜라게나제(3)의 테스트 대조군은 예상된 단백질 패턴 및 크기의 결과를 보여주었다. 도 14 참조.

FP 결과(4)는 현탁액에서 mTG 효소의 증거 또는 흔적을 보여주지 않았다. 이는 FP가 mTG를 전혀 포함하지 않거나 매우 적은 양으로 포함하고 있고 mTG 효소가 이 방법으로 측정 시 검출할 수 없음을 시사한다.

실시예 15: RGD 정량화

형광측정 분석을 사용하여 아르기닌의 아미노기를 통해 가교된 젤라틴 미세입자 및 원료의 표면 상의 RGD(아르기닌-글리신-아스파르테이트) 모티프의 양을 정량화하였다. 아르기닌의 아미노기와 9,10-페난트렌퀴논 사이의 반응으로 형광 화합물이 생성되었다. 상기 반응은 전형적으로 높은 pH에서 발생하고 이후 산성화에 의해 형광 화합물 또는 분자가 생산된다.

샘플 및 표준물을 높은 pH 환경에서 9,10-페난트렌퀴논 시약과 개별적으로 혼합하고 60℃, 100rpm에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 혼합물을 HCl과 혼합하고 실온(RT)에서 1시간 동안 인큐베이션하여 형광 분자를 얻었다. 형광 강도를 312 nm의 여기 파장 및 395 nm의 방출로 측정하였다. RGD가 없는 블랭크 대조군은 탈이온수를 사용하여 준비하였다. 샘플을 3회 반복하여 테스트하였다.

결과:

아르기닌의 형광 방출을 상이한 농도에서 측정하고 도 15의 아르기닌 교정 곡선에 도시하였다.

상이한 물질의 형광 방출 스펙트럼을 측정하고 도 16에 도시하였다. 395 nm의 파장에서, 상단에서 하단으로의 곡선은 각각 Arg 80 ㎍/ml; 비가교된 젤라틴; BC-82-8; BC-81-8; BC-82-7; BC-82-5; BC-82-4; BC-82-6; mTG; 블랭크이다.

테스트된 물질의 RGD 모티프를 정량화하고 아르기닌 교정 곡선에 따라 계산하였다(도 15). 교정 곡선에 사용된 유리 아르기닌은 2개의 1차 아미노산기를 갖고 RGD 모티프 서열은 1개의 아미노기를 갖는다. 계산은 395 nm 파장에서의 형광 방출을 포함하였다.

도 17은 비가교된 젤라틴, 미생물 트랜스글루타미나제, 발포체 입자(FP) 및 융합성 입자 내의 RGD의 양(㎍/mg)을 도시한다. 비가교된 젤라틴은 30 ㎍/mg 이상의 RGD 모티프를 가졌으며, (FP) 및 융합성 입자는 각각 약 12 ㎍/mg 및 14 ㎍/mg을 가졌다. 반면, 미생물 트랜스글루타미나제(mTG)는 본질적으로 RGD가 없거나 거의 검출할 수 없는 양의 RGD를 가졌다.

도 18은 상이한 크기 범위의 가교된 발포체 입자(FP)에서 측정된 RGD의 양을 도시한다.

상이한 양의 mTG(X축)와 가교된 FP 상의 RGD 양(Y축)을 또한 측정하고 도 19에 도시하였다. 상이한 젤라틴 대 효소(mTG) 중량 비의 다양한 배치는 젤라틴 또는 mTG 단독과 비교하여 X축에 예시한다(BC-82-7; BC-81-8; BC-82-5; BC-82-4; BC-82- 6; 및 BC-82-8).

결론:

아르기닌 양의 증가는 젤라틴 원료에서도 볼 수 있는 바와 같이 395 nm의 파장에서 방출의 특징적인 증가를 나타냈다. mTG는 395nm의 파장에서 최소의 형광 방출 스펙트럼을 나타냈다. mTG에서의 낮은 신호는 총 효소 중량에 대한 중량 기준아르기닌의 양이 무시할 수 있는 정도이기 때문일 수 있으며, 이는 FP에서 RGD의 정량화가 가교된 젤라틴으로서 지칭되었음을 나타낸다. 이는 형광측정 방법을 사용하여 RGD 서열을 정량화할 수 있음을 입증하였다.

예상대로, 비가교된 젤라틴 중의 RGD 양은 본 연구에서 양성 대조군 역할을 한 가교된 젤라틴 미세입자보다 높았다. 젤라틴은 가용성이었고, 이는 일부 RGD 부위가 포획되어 있거나 노출되지 않은 불용성 가교 입자와 비교하여 크거나 많은 양의 노출된 RGD 부위를 허용하였다. 비가교된 젤라틴이 더 많은 RGD를 나타냈지만, 비가교된 젤라틴의 사용은 제안된 미세입자에 실용적이지 않았는데, 37℃에서 이것이 생물학적 효과 없이 매우 빠르게 용해되거나 분해되기 때문이다.

융합성 입자와 발포체 입자 둘 다의 가교된 젤라틴 미세입자에서도 긍정적인 특징적 방출이 나타났다. 융합성 입자 및 발포체 입자는 제조 방법 및 크기가 상이하지만, 입자 표면 상의 RGD 양은 유사하였다.

상이한 크기 범위의 FP는 유사한 RGD 양을 나타냈다. RGD의 양과 FP를 가교시키는 데 사용된 mTG의 양 사이에 상관관계는 발견되지 않았다. 결과를 통합하면, 가교된 젤라틴 입자 상의 RGD 양은 11 ㎍/mg 내지 36 ㎍/mg의 범위인 것으로 나타났다.

실시예 16: 현탁액 중 미세입자에서의 1차 섬유아세포의 시험관내 배양

1차 소 진피 섬유아세포를 본 개시내용의 미세입자와 함께 인큐베이션하고 비조직 배양 접시에 두었다. 비교를 위해, 세포를 미세입자가 없는 비조직 배양 접시 및 일반적인 조직 배양 접시에 시딩하였다. 생존력을 측정하였다.

세포: 1차 소 진피 섬유아세포(BDF)를 외식편 방법을 사용하여 14개월령 수컷 송아지로부터 단리하였다. 외식편 방법에서, 예를 들어 송아지로부터의 작은 피부 조각을 상당한 양의 세포 증식이 생성될 때까지 조직 배양 접시에 놓았두었다.이 기술은 역사적으로 상처 치유의 모델로서 사용되었다. 약 80% 전면생장(confluence)의 세포 단층을 5분 동안 PBS로 세척한 후, 4분 동안 0.25% 트립신으로 효소적 분산시켜 배양 플레이트에 부착된 세포를 분산시켰다. 이러한 실험을 위해, 계대 5의 세포를 사용하였다.

미세입자: 본 개시내용에 설명된 미세입자는 100 ㎛ 내지 700 ㎛의 건조 입자 크기 범위를 사용하였다. 미세입자를 세포와 함께 인큐베이션하기 전에 수화를 위해 48시간 동안 완전 배양 배지에 현탁하였다.

부착: 약 1x10⁵개의 현탁된 세포를 완전 배양 배지에서 15ml 캡 튜브 내의 최종 부피가 4 ml가 되도록 120 mg의 미세입자 현탁액에 첨가하였다. 세포와 미세입자를 피펫팅하여 혼합하고 세포 배양 인큐베이터(37℃, 5% CO₂) 내에 2시간 동안 배치하여 충분한 세포-미세입자 부착을 허용하였다.

시딩: 세포-미세입자 현탁액을 부드럽게 현탁하고 비조직 배양 96웰 U자형 바닥 플레이트에 시딩하였다. 동일한 세포/배지 부피 비의 BDF를 대조군과 동일한 플레이트의 웰에 시딩하였다. 또 다른 대조군으로서, 동일한 세포/배지 부피 비의 BDF를 일반적인 96웰 조직 배양 플레이트의 웰에 접종하였다.

생존력: 시딩 7일 후에 알라마 블루(Alamar Blue) 생존력/증식/세포독성 분석(Bio-Rad)을 사용하여 세포 생존력을 측정하였다. 각가의 테스트된 웰의 배지 부피 절반을 제거하고, 최종 10% 농도까지 20%(v/v)의 알라마 블루 시약이 보충된 새로운 배지로 교체하였다. 음성 대조군으로서 사용하기 위해, 시약을 배지를 갖지만 세포는 없는 웰에 첨가하였다. 시약과 함께 4시간 동안 인큐베이션한 후, 각각의 테스트 또는 대조 웰로부터 60 μL 배지를 추출하고 PBS에 1:10으로 희석하였다. 흡광도를 570 nm 및 600 nm(Shimadzu UV-1280 분광광도계)에서 측정하였다. 생존력을 식 ((O2 x A1) - (O1 x A2))/((R1 x N2) - (R2 x N1))*100에 따라 계산하고 알마르 블루의 감소 퍼센트로서 표현하였고, 반면 O1 = 570 nm에서 산화된 알라마 블루(파란색)의 몰 흡광 계수(E), O2 = 600 nm에서 산화된 알라마 블루의 E, R1 = 570 nm에서 환원된 알라마 블루(빨간색)의 E, R2 = 환원된 알라마 블루의 E 600 nm에서, A1 = 570 nm에서 테스트 웰의 흡광도, A2 = 600 nm에서 테스트 웰의 흡광도, N1 = 570 nm에서 음성 대조군 웰(세포 없는 배지 + 알라마 블루)의 흡광도, N2 = 600 nm에서 음성 대조군 웰의 흡광도(세포가 없는 배지 + 알라마 블루). 배양물을 최종적으로 건조시켜 고정시키고 SEM으로 표면 형태에 대해 분석하였다.

결과: 본 개시내용의 미세입자에 부착된 세포의 생존력은 평저 96웰 조직 배양 플레이트에 시딩된 동일한 수의 세포의 생존력과 유사하였다. 미세입자가 없는 비조직 배양 96웰 U자형 바닥 플레이트에 시딩된 세포는 존재하더라도 제한된 생존력을 나타냈다. SEM 분석은 세포 주위에 침착된 콜라겐 섬유와 함께 침착되어 늘어난 섬유아세포를 입증하였다.

결론: 본 개시내용의 미세입자는 1차 소 진피 섬유아세포의 세포 부착 및 지지를 위한 표면을 제공하였다. 본원에 설명된 연구는 또한 현탁액에서 미세담체로서 기능한 본 발명의 미세입자의 존재 하의 섬유아세포의 생존력을 입증하였다. 반면, 본 개시내용의 미세입자 없이 인큐베이션된 세포는 생존하지 못하였다. 표 9 참조.

표 9: 소 진피 섬유아세포(BDF)의 생존력

1차 소 진피 섬유아세포를 14개월령 수컷 송아지로부터 단리하였다. 세포 배양은 10% 소 태아 혈청(FCS), L-글루타민, Na-피루베이트, 및 항생제 및/또는 항진균제가 보충된 고 글루코오스 DMEM 배지를 포함하는 성장 배지를 사용하는 표준 조건(예를 들어, 100% 상대 습도(RH), 37℃, 5% CO₂) 하에 발생하였다. 약 100,000개의 세포를 약 2시간인 세포가 미세담체에 부착될 수 있기에 충분한 시간 동안 최종 부피의 성장 배지(4 ml)에서 본 개시내용의 미세담체 또는 복수의 미세입자(120 mg)와 함께 인큐베이션하고 세포 및 본 개시내용의 미세담체를 재현탁하고 비조직 배양 플레이트(예를 들어, 96웰 U자형 바닥 플레이트)에 시딩하여 세포를 배양하였다. 동일한 세포 대 배지 부피 비의 세포를 대조군으로서 동일한 플레이트의 웰에 미세담체 없이 시딩하고, 동일한 세포 대 배지 부피 비의 세포를 또 다른 대조군으로서 일반적인 96웰 조직 배양 플레이트 웰의 웰에 미세담체 없이 시딩하였다.

생존력을, 예를 들어 시딩 3일 후에, 권장된 제조업체 지침에 따라 알라마블루 생존력/증식/세포독성 분석(Bio-Rad)을 사용하여 측정하였다. 미세담체 상에 시딩된 세포의 생존력(3일차)은 조직 배양 플레이트에 시딩된 세포의 생존력과 유사한 반면, 비조직 배양 플레이트에 직접 시딩된 세포는 생존할 수 없었다. 표 9 참조.

예를 들어, 6x10⁶개의 유도 만능 줄기(iPS) 세포를 FP에의 접착을 위해 미코팅된 55 mm 페트리 접시 내의 진탕기(80 RPM)에서 하룻밤 동안 인큐베이터에서 본 개시내용의 FP(입자 크기 범위 500 ㎛ 내지 2000 ㎛)와 함께 인큐베이션하였다. 그 후, 세포 응집체를 증식 및 분화를 위해 8일 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포 응집체는 7일간의 배양 후에 박동하기 시작하였으며, 이는 iPS 세포가 성공적으로 심근세포로 분화되었고 기능성임을 나타낸다.

실시예 17: 세포분화를 위한 유도 만능 줄기 세포의 시험관내 배양

iPS 세포(600만개)를 미코팅 55 mm 페트리 접시 내의 진탕기(80RPM)에서 밤새 인큐베이션하기 위해 인큐베이터에서 100 mg의 FP(입자 크기 범위 25 ㎛ 내지 2000 ㎛)와 부착되도록 인큐베이션하였다. 그 후, 생성된 세포 응집체를 증식 및 분화를 위해 8일 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.

결과: FP가 로딩된 세포를 광학 현미경 하에 관찰하였다(도 20a; 도 20b 참조). FP가 로딩된 세포의 박동은 8일 후에 관찰되었으며, 이는 iPS 세포가 심근세포로 성공적으로 분화되었음을 나타낸다.

실시예 18: 가교된 젤라틴 섬유로부터 제조된 발포체 젤라틴 입자:

가교된 젤라틴을 1 g의 mTG를 사용하여 1 g의 밀링된 젤라틴으로부터 제조하였다. 분말을 혼합하고 10 ml 주사기(주사기 1)에 넣었다. 추가 주사기(주사기 2)에 식염수 8 ml를 충전하고 주사기 1에 연결하였다. 주사기 2의 식염수를 주사기 대 주사기 혼합 방법을 통해 60초 동안 주사기 1의 분말과 혼합하였다. 생성된 발포체를 페트리 접시에 놓인 0.2% w/v 농도를 갖는 차가운(4℃) 미생물 트랜스글루타미나제(mTG) 용액에 다양한 크기의 바늘: 27G, 25G, 21G 바늘을 통해 주사하고 상온(RT)에서 2시간 동안 유지시켰다. 페트리 접시의 절반을 37℃에서 추가로 1시간 동안 저장하였다. 마지막으로, 생성된 섬유를 mTG 용액으로부터 여과하고 실온에서 밤새 건조시키고 모르타르 및 막자에 의해 밀링하고, 이의 형태를 광학 현미경으로 특성규명하였다.

결과: 입자의 광학 현미경 이미지는 22 ㎛ 내지 752 ㎛의 입자 크기 범위를 갖는 발포체 입자(FP)가 발포체 가교된 젤라틴 섬유로부터 성공적으로 제조되었음을 보여주었다. 도 21a; 도 21b 참조.

본 개시내용의 범위 및 사상으로부터 벗어나지 않고서 다양한 변화가 상기 설명된 보호대상에서 이루어질 수 있기 때문에, 상기 설명에 포함되거나 첨부된 청구범위에 정의된 보호대상은 본 개시내용을 설명하고 예시하는 것으로 해석되는 것으로 의도된다. 상기 교시를 고려하면 본 발명의 많은 변형 및 변경이 가능하다. 따라서, 본 설명은 첨부된 청구범위에 속하는 모든 이러한 대안, 변형, 및 변경을 포함하는 것으로 의도된다.

본원에서 인용 또는 참조된 모든 문헌 및 본원에서 인용된 문헌에 인용 또는 참조된 모든 문헌은 본원에서 또는 본원에 참조로 인용된 임의의 문헌에서 언급된 임의의 제품에 대한 제조업체의 지침, 설명, 제품사양 및 제품 설명서와 함께, 본원에 참조로 인용되며 본 개시내용의 실시에 사용될 수 있다.

Claims

가교된 단백질로서, 상기 가교된 단백질이 적어도 하나의 RGD(Arg-Gly-Asp) 모티프를 포함하는 것인 가교된 단백질
을 포함하는 복수의 미세입자로서,
복수의 미세입자는 본질적으로 가교제 무함유이고;
복수의 미세입자는 수불용성인
복수의 미세입자.
제1항에 있어서, 가교된 단백질은 젤라틴, 콜라겐, 엘라스틴, 트로포엘라스틴, 카제인, 알부민, 또는 적어도 하나의 RGD 모티프를 포함하는 임의의 조작된 중합체, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 복수의 미세입자.
제1항에 있어서, 가교된 단백질은 RGD 모티프를 0.1 ㎍/mg 내지 50 ㎍/mg 범위로 포함하는 것인 복수의 미세입자.
제1항에 있어서, 가교된 단백질은 비재조합 젤라틴, 재조합 젤라틴, 비재조합 콜라겐, 재조합 콜라겐, 또는 이들의 임의의 조작된 단백질, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 복수의 미세입자.
제1항에 있어서, 복수의 입자는 건조 발포체 입자를 포함하는 것인 복수의 미세입자.
제1항에 있어서, 복수의 입자는 건조 가교된 젤라틴-블록 입자를 포함하는 것인 복수의 미세입자.
제5항 또는 제6항에 있어서, 건조 입자가 동결건조된 입자를 포함하는 것인 복수의 미세입자.
제1항에 있어서, 복수의 입자는 0.1 ㎛ 내지 2000 ㎛로부터 선택된 입자 크기를 포함하는 것인 복수의 미세입자.
제1항에 있어서, 복수의 입자는 적어도 2가지의 상이한 입자 크기를 포함하는 것인 복수의 미세입자.
제9항에 있어서, 적어도 2가지의 상이한 입자 크기는 0.1 ㎛ 내지 2000 ㎛로부터 선택되는 것인 복수의 미세입자.
제6항에 있어서, 입자 크기는 30 ㎛ 내지 500 ㎛의 평균 입자 크기를 포함하는 것인 복수의 미세입자.
제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 크기는 60 ㎛ 내지 90 ㎛의 평균 입자 크기를 포함하는 것인 복수의 미세입자.
제12항에 있어서, 입자 크기는 60 ㎛의 평균 입자 크기를 포함하는 것인 복수의 미세입자.
제1항의 복수의 미세입자를 제조하는 방법으로서,
(a) 가교성 단백질 용액과 가교제 용액을 혼합하는 단계로서,
가교성 단백질 용액은 적어도 하나의 RGD(Arg-Gly-Asp) 모티프를 포함하는 가교성 단백질을 액체에 용해시키는 것을 포함하고;
가교제 용액은 가교제를 액체에 용해시키는 것을 포함하는 것인 단계;
(b) (a)의 혼합된 가교성 단백질 용액과 가교제 용액을 포함하는 가교된 발포체 또는 하이드로겔 블록을 형성하는 단계;
(c) (b)의 가교된 발포체 또는 하이드로겔 블록으로부터 가교제를 제거하여 가교제 무함유 발포체 또는 하이드로겔 블록을 형성하는 단계; 및
(d) (b)의 형성된 가교된 발포체 또는 하이드로겔 블록, (c)의 가교제 무함유 발포체 또는 하이드로겔 블록, 또는 (b)의 형성된 가교된 발포체 또는 하이드로겔 블록과 (c)의 가교제 무함유 발포체 또는 하이드로겔 블록의 조합의 크기를 감소시켜, 크기 감소된 (b)의 가교된 발포체 및/또는 크기 감소된 (c)의 가교제 무함유 발포체를 포함하는 복수의 미세입자를 형성하는 단계
를 포함하는, 제1항의 복수의 미세입자를 제조하는 방법.
제14항에 있어서, (a)의 혼합 단계는
(a1) 가교성 단백질 용액을 제조하는 단계로서,
(i) 가교성 단백질을 교반하면서 50℃에서 액체에 첨가하는 단계; 및
(ii) 가교성 단백질을 용해시켜 가교성 단백질 용액을 형성하는 단계
를 포함하는 단계; 및
(a2) 가교제 용액을 제조하는 단계로서,
(i) 가교제를 교반하면서 25℃에서 액체에 첨가하는 단계; 및
(ii) 가교제를 용해시켜 가교제 용액을 형성하는 단계
를 포함하는 단계
를 포함하는 것인 방법.
제14항에 있어서, (b)의 가교된 발포체 또는 하이드로겔 블록이 효소적으로 가교되는 것인 방법.
제16항에 있어서, 가교제가 트랜스글루타미나제인 방법.
제17항에 있어서, 가교제가 미생물 트랜스글루타미나제인 방법.
제14항에 있어서, (b)의 가교된 발포체를 형성하는 단계는
(b1) (a)의 가교성 단백질 용액을 37℃에서 첨가하면서 (a)의 가교성 단백질 용액을 휘핑하여 (b)의 가교된 발포체를 형성하는 단계
를 포함하는 것인 방법.
제14항에 있어서, (b)의 가교된 발포체를 형성하는 단계는
(b2) (a)의 가교제 용액을 가스 없이 37℃에서 첨가하면서 (a)의 가교성 단백질 용액을 혼합하여 (b)의 가교된 하이드로겔 블록을 형성하는 단계
를 포함하는 것인 방법.
제14항에 있어서, (d)의 감소 단계는 (b)의 형성된 가교된 발포체를 0.5 mm 내지 20 mm 조각의 크기까지 절단하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제14항에 있어서, (c)의 제거 단계는
(c1) (b)의 가교된 발포체 또는 하이드로겔 블록을 세척하는 단계로서, (b)의 가교된 발포체 또는 블록이 조각으로 절단되어 크기가 감소되고,
여기서 세척은 가교된 발포체 또는 하이드로겔 블록 조각을 액체 중에서 휘저어서 세척된 발포체 또는 하이드로겔 블록 조각을 형성함으로써 일어나는 것인 단계; 및
(c2) (c1)의 세척된 발포체 또는 하이드로겔 블록 조각을 메쉬 체에서 체질하여, 가교제 무함유 발포체 또는 하이드로겔 블록 조각을 형성하는 단계
를 포함하는 것인 방법.
제14항에 있어서,
(e) (c)의 가교제 무함유 발포체 또는 하이드로겔 블록 또는 (d)의 복수의 입자를 냉동시키는 단계;
(f) (e)의 냉동된 가교제 무함유 발포체 또는 하이드로겔 블록을 동결건조시키는 단계; 및
(g) (f)의 동결건조된 가교제 무함유 발포체 또는 하이드로겔 블록의 크기를 감소시켜 복수의 가교된 발포체 또는 하이드로겔 입자를 형성하는 단계
를 추가로 포함하는 방법.
제14항에 있어서,
(e2) (c)의 가교제 무함유 발포체 또는 하이드로겔 블록 또는 (d)의 복수의 입자를 건조시켜 (e2)의 건조된 가교제 무함유 발포체 또는 하이드로겔 블록 또는 (e2)의 건조된 복수의 입자를 형성하는 단계;
(g2) (e2)의 건조된 가교제 무함유 발포체 또는 하이드로겔 블록의 크기를 감소시켜 복수의 가교된 발포체 또는 하이드로겔 입자를 형성하는 단계
를 추가로 포함하는 방법.
제23항 또는 제24항에 있어서, 복수의 가교된 발포체 입자는 0.1 ㎛ 내지 2000 ㎛의 입자 크기를 포함하는 것인 방법.
제14항에 있어서, 가교성 단백질은 젤라틴, 콜라겐, 트로포엘라스틴, 엘라스틴, 카세인, 알부민, 적어도 하나의 RGD 모티프를 포함하거나 이에 연결된 임의의 조작된 중합체, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제14항에 있어서, 가교성 단백질은 비재조합 젤라틴, 재조합 젤라틴, 비재조합 콜라겐, 재조합 콜라겐, 이들의 임의의 조작된 단백질, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제14항에 있어서, 가교제는 트랜스글루타미나제 또는 산화 효소로부터 선택되는 것인 방법.
제28항에 있어서, 가교제는 천연 트랜스글루타미나제, 변형된 트랜스글루타미나제, 재조합 트랜스글루타미나제, 미생물 트랜스글루타미나제(mTG), 조직 트랜스글루타미나제(tTG), 각질세포 트랜스글루타미나제, 표피 트랜스글루타미나제, 전립선 트랜스글루타미나제, 뉴런 트랜스글루타미나제, 인간 트랜스글루타미나제, 인자 XIII 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제28항에 있어서, 가교제는 천연 산화 효소, 변형된 산화 효소, 리실 산화 효소, 티로시나제, 락카제, 퍼옥시다제 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제23항에 있어서, (e)의 냉동은 -18℃ 내지 25℃에서 2시간 내지 48시간 동안 일어나는 것인 방법.
제23항에 있어서, (f)의 동결건조는 -50℃ ± 10℃, 0.01 mbar 내지 0.1 mbar 및 48시간 내지 96시간에서 일어나는 것인 방법.
제24항에 있어서, (e2)의 건조는 45℃ ± 10℃에서 12시간 내지 48시간 동안 일어나는 것인 방법.
제23항 또는 제24항에 있어서, (g) 또는 (g2)의 크기 감소 단계는
(f) 또는 (e2)의 가교제 무함유 발포체 또는 하이드로겔 블록을 분쇄하여 복수의 가교제 무함유 미세입자를 형성하는 단계; 및
복수의 가교제 무함유 미세입자를 크기별로 분리하는 단계
를 포함하는 것인 방법.
제34항에 있어서, (f1)의 복수의 가교제 무함유 발포체 입자가 0.1 ㎛ 내지 2000 ㎛의 입자 크기를 포함하는 것인 방법.
제34항에 있어서, 상기 크기별로 분리하는 단계가, 복수의 가교제 무함유 미세입자를 체질하여 적어도 2가지의 상이한 입자 크기 범위를 갖는 복수의 가교된 미세입자를 생성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
(a) 제1항의 복수의 미세입자
를 포함하는 조성물.
제37항에 있어서, (b) 담체를 추가로 포함하는 조성물.
제37항 또는 제38항에 있어서, 가교된 단백질은 젤라틴, 콜라겐, 트로포엘라스틴, 엘라스틴, 카세인, 알부민, 이들의 조작된 단백질, RGD 모티프를 포함하는 임의의 조작된 중합체, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제39항에 있어서, 가교된 단백질은 비재조합 젤라틴, 재조합 젤라틴, 비재조합 콜라겐, 재조합 콜라겐, 이들의 임의의 조작된 단백질, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제38항에 있어서, 담체는 하이드로겔인 조성물.
제38항에 있어서, 담체는 젤라틴; 콜라겐; 알기네이트; 히알루론산; 카르복시메틸 셀룰로오스; 폴리(에틸렌 옥사이드)(PEO); 폴리(비닐 알코올)(PVA); 폴리(프로필렌 푸마레이트)(PPF); 폴리에틸렌 글리콜(PEG); 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제38항에 있어서, 담체는 비가교된 콘드로이틴 설페이트 중합체, 비가교된 더마탄 설페이트 중합체, 비가교된 케라탄 설페이트 중합체, 비가교된 헤파란 중합체, 비가교된 헤파란 설페이트 중합체, 비가교된 히알루로난 중합체, 비가교된 글리코사미노글리칸 중합체, 비가교된 엘라스틴 및/또는 피브로넥틴, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제38항에 있어서, 담체는 젤라틴; 콜라겐; 알기네이트; 글리코사미노글리칸(GAG); 폴리에틸렌 글리콜(PEG); 카르복시메틸 셀룰로오스; 폴리(에틸렌 옥사이드)(PEO); 폴리(비닐 알코올)(PVA); 폴리(프로필렌 푸마레이트)(PPF) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 담체는 젤라틴(예를 들어, 비가교된, 가교된, 반응계내(in situ) 가교된); 콜라겐(예를 들어, 비가교된, 가교된); 알기네이트(예를 들어, 비가교된, 가교된); 히알루론산(예를 들어, 비가교된, 가교된); PEG; 카르복시메틸 셀룰로오스 등, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제38항에 있어서, 담체는 습윤한 것인 조성물.
제38항에 있어서, 담체는 건조한 것인 조성물.
제37항에 있어서, 조성물은 1 mg/ml 이상의 담체 중 복수의 미세입자의 농도를 포함하는 것인 조성물.
제37항에 있어서, 조성물은 300 mg/ml 이하의 담체 중 복수의 미세입자의 농도를 포함하는 것인 조성물.
제37항에 있어서, 조성물은 1 mg/ml 내지 300 mg/ml의 담체 중 복수의 미세입자의 농도를 포함하는 것인 조성물.
제1항의 복수의 미세입자를 포함하는 조직 스캐폴드.
제50항에 있어서, 하이드로겔 담체를 추가로 포함하고, 하이드로겔 담체는 젤라틴, 콜라겐, 알기네이트, 히알루론산, 카르복시메틸 셀룰로오스, 폴리(에틸렌 옥사이드)(PEO); 폴리(비닐 알코올)(PVA); 폴리(프로필렌 푸마레이트)(PPF) 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조직 스캐폴드.
제50항에 있어서, 조직 스캐폴드는 발포체로서 구성되는 것인 조직 스캐폴드.
제50항에 있어서, 조직 스캐폴드는 가교된 하이드로겔 블록으로서 구성되는 것인 조직 스캐폴드.
제50항에 있어서, 가교된 단백질 미세입자는 적어도 2가지의 상이한 입자 크기를 포함하는 것인 조직 스캐폴드.
제54항에 있어서, 적어도 2가지의 상이한 입자 크기는 0.1 ㎛ 내지 2000 ㎛의 입자 크기를 포함하는 것인 조직 스캐폴드.
제37항 또는 제38항의 조성물을 포함하는 장치.
제56항에 있어서, 장치는 주사기, 카트리지 및 바이알로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 장치.
제57항에 있어서, 주사기는 14 게이지 내지 39 게이지로부터 선택된 바늘을 포함하는 것인 장치.
제57항에 있어서, 주사기는 27 게이지 바늘을 포함하고, 상기 주사기가 2N 내지 70N 범위의 주사력을 발휘하도록 구성되는 것인 장치.
제56항에 있어서, 장치는 멸균을 위해 구성되는 것인 장치.
제37항의 조성물의 용도로서, 용도는 대상체의 신체 윤곽형성을 위한 것인 조성물의 용도.
제61항에 있어서, 신체 윤곽형성은 연조직 재건, 부피 복원, 유방 확대, 생체자극 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
제61항에 있어서, 생체자극은 섬유아세포 자극, 콜라겐 생성 자극, 신콜라겐생성, 혈관신생, 조직 재성장 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
제61항에 있어서, 조성물은 주사기, 카트리지 또는 바이알에 구성되는 것인 용도.
제1항의 조성물의 용도로서, 용도는 시험관내 조직 배양을 위한 것인 조성물의 용도.
제65항에 있어서, 시험관내 조직 배양은 단백질 발현을 위한 것인 조성물의 용도.
제65항에 있어서, 시험관내 조직 배양은 단백질 정제를 위한 것인 조성물의 용도.
제65항에 있어서, 시험관내 조직 배양은 세포 분화를 위한 것인 조성물의 용도.
신체 윤곽형성을 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 제37항 또는 제38항의 조성물을 신체 윤곽형성을 필요로 하는 대상체의 부위에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제69항에 있어서, 투여는 이를 필요로 하는 대상체에게 조성물을 주사하는 것을 포함하는 것인 방법.
제69항에 있어서, 투여 단계는
(a) 섬유아세포 자극;
(b) 콜라겐 생성 자극;
(c) 신콜라겐생성 유도;
(d) 조직 재성장 유도;
(e) 조직 스캐폴드 제공; 또는
(f) 이들의 임의의 조합
을 포함하는 것인 방법.
무세포 단백질을 생산하는 방법으로서,
복수의 단백질 생산 세포를 제1항의 복수의 미세입자 및 배양 배지를 포함하는 세포 배양물에서 성장시키는 단계를 포함하고,
여기서 성장은 단백질 합성을 유도하는 조건 하에 일어나 무세포 단백질을 생산하는 것인, 무세포 단백질을 생산하는 방법.
제72항에 있어서, 단백질은 콜라겐인 방법.
제72항에 있어서, 단백질은 호르몬인 방법.
제72항에 있어서, 단백질은 단클론 항체인 방법.
제72항에 있어서, 단백질은 효소인 방법.
제72항에 있어서, 단백질은 성장 인자인 방법.
제72항에 있어서, 단백질은 사이토카인인 방법.
분화된 세포를 생산하는 방법으로서,
복수의 세포를 제1항의 복수의 미세입자 및 배양 배지를 포함하는 세포 배양물에서 성장시키는 단계를 포함하고,
여기서 성장은 세포 분화를 유도하는 조건 하에 일어나 분화된 세포를 생산하는 것인, 분화된 세포를 생산하는 방법.
제79항에 있어서, 복수의 세포는 유도 만능 줄기 세포를 포함하고, 분화된 세포는 기능성 심근세포를 포함하는 것인 방법.