KR20240055629A - Tlr5 활성능을 가진 플라젤린 면역증강제 유도체의 진핵세포 발현시스템을 이용한 제조 및 응용 - Google Patents
Tlr5 활성능을 가진 플라젤린 면역증강제 유도체의 진핵세포 발현시스템을 이용한 제조 및 응용 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 TLR5 활성능을 가진 플라젤린 면역증강제 유도체의 진핵세포 발현시스템을 이용한 제조 및 응용에 관한 것으로, 본 발명에 따른 플라젤린 변형체는 높은 면역 증강효과를 가지는 것으로, 다양한 백신 및 면역치료제 조성물에 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 TLR5 활성능을 가진 플라젤린 면역증강제 유도체의 진핵세포 발현시스템을 이용한 제조 및 응용에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 진핵세포에서 발현될 수 있으며 기존의 원핵생물 유래의 플라젤린 단백질과 동등하거나 그 이상의 면역증강 효과를 가진 플라젤린 단백질에 대한 것이다.
세균 편모의 필라멘트를 구성하는 구성 단위 단백질을 플라젤린 (flagellin)이라 하며, 플라젤린이 규칙적으로 조합되어 필라멘트를 형성하여 박테리아가 움직일 수 있도록 기능한다.
TLR5는 대식세포 및 수지상 세포를 포함한 다양한 면역 세포의 표면에서 발현되는 패턴 인식 수용체로, TLR5가 플라젤린을 인식하면 NF-kB의 활성화와 염증성 사이토카인 생성을 유도한다. NF-kB는 면역 및 염증 반응에 관여하는 유전자의 발현을 조절하는 전사 인자로, IkB (NF-kB 억제제)라는 억제 단백질을 포함하여 세포질에 단백질 복합체로 존재한다. TLR5가 자극을 받아 활성화되면 IkB를 분해하고 NF-kB의 활성화를 유발하며, NF-kB의 활성화는 TNF- α (Tumor Necrosis Factor-α) 및 IL-1β (Interleukin-1β)와 같은 전염증성 사이토카인의 생성을 유도한다.
또한 플라젤린은 세포질 내에 존재하는 NLRC4-인플라마좀 (NLRC4-inflammasome) 신호 전달계를 자극할 수 있는 병원체 관련 분자 패턴 (pathogen-associated molecular pattern) 인자이다. 따라서 플라젤린은 세포 표면에 존재하는 TLR5와 세포질에 존재하는 NLRC4-인플라마좀을 모두 활성화시킬 수 있는 면역조절 물질이다.
이러한 특징을 활용하여 다양한 백신 및 면역치료제에 응용할 수 있는 면역증강제 개발의 대상으로 연구되어 왔다. 다양한 항원을 플라젤린과 함께 투여하거나 플라젤린과 재조합 융합 단백질 형태로 투여할 경우 항원-특이 면역반응을 강화시켜 주는 기능을 하며, 독감백신, 폐렴백신, 세균성 치주질환, 항암 치료백신, 노로바이러스백신, 신경퇴행성 질환, 각종 면역질환에서 면역증강제 효능이 입증되었다. 또한 플라젤린에 의한 TLR5 활성화는 조혈 세포와 방사선으로 인한 위장 조직을 보호하고 암 세포의 생존과 성장에 영향을 미치는 것으로 보고된 바 있다.
다만, 지금까지 플라젤린 면역증강제 효과는 원핵세포인 대장균에서 발현한 재조합 단백질을 사용하여 진행되어 왔다. 그런데, 플라젤린 면역증강제의 적용 범위를 핵산-기반 백신 (예, DNA 백신 혹은 mRNA 백신 등)이나 번역 후 수정 (post-translational modification)이 필수적인 항원에 응용하기 위해서는 진핵세포 발현 시스템에서 발현한 플라젤린 제작이 필요하다. 그런데 진핵세포 시스템에서 제조한 플라젤린은 원핵세포-발현 플라젤린에 비해 TLR5-신호전달능이 현저히 저하된다. 이러한 현상은 진핵세포에서 플라젤린을 발현할 경우 번역후 수정 과정을 통한 입체 장애 때문에 효율적으로 TLR5-신호전달을 유도하지 못한 것에 기인한 것으로 추측된다.
이에, 강력한 면역조절능을 보유하고 있으며 효과적인 백신 면역증강제 기능이 있는, 진핵세포에서 제조될 수 있는 플라젤린 단백질에 대한 연구가 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 진핵세포에서 플라젤린 단백질을 제조하였으며, 이의 면역증강능 및 안전성이 월등히 우수한 것을 확인하였다.
구체적으로, 본 발명자들은 진핵세포 시스템에서 제조한 플라젤린은 원핵세포에서 발현한 플라젤린에 비해 TLR5자극 활성이 매우 약한 것을 확인하였다. 이러한 현상은 진핵세포에서 플라젤린을 발현할 경우 번역후 수정 과정에 의해 당화된 플라젤린 (glycosylated-eFlaB)이 생산되고, 당화된 플라젤린은 당분자에 의한 입체 장애 때문에 효율적으로 TLR5-신호전달을 유도하지 못한 것에 기인한 것으로 추측하였다. 본 가설을 증명하기 위하여 생물정보학분석을 진행하였으며, 진핵세포에서 발현한 플라젤린은 5개의 N-당화 부위가 있음을 확인하였다. 이에 위치-지정 돌연변이 (site-directed mutagenesis)법을 도입하여 N-glycosylation 부위로 추정되는 아스파라진을 알라닌으로 치환한 플라젤린 변형체를 제작하여 인비트로 (in vitro) 및 인비보 (in vivo) 조건에서 해당 플라젤린 변형체의 활성을 검증하였다. 이를 통해 pFlaB와 동일한 TLR5 자극활성과 면역증강제 효능을 나타내는 진핵세포-발현 플라젤린 면역증강제 변형체 (eukFlaB variants)를 도출하였다. 흥미롭게도, 해당 변형체 (eukFlaB variant)는 탈면역 특성을 나타내었다. 종합적으로 면역정보학적 분석과 단백질 변형 전략을 사용하여 N-당화를 유도하지 않는 진핵세포 발현 플라젤린 (deglycosylated eukaryotic expressed flagellin)을 확립함으로써 보다 안전하고 다양한 임상-적용이 가능한 플라젤린 면역증강제를 도출하였다.
이에, 본 발명의 목적은 진핵세포에서 발현 가능한 플라젤린 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 진핵세포에서 발현 가능한 플라젤린 단백질을 포함하는 백신용 면역보조제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 진핵세포에서 발현 가능한 플라젤린 단백질을 포함하는 면역기능 증강용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 진핵세포에서 발현 가능한 플라젤린 단백질을 포함하는 미생물 감염 또는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 진핵세포에서 발현 가능한 플라젤린 단백질의, 면역보조 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 진핵세포에서 발현 가능한 플라젤린 단백질의, 면역기능 증강 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 진핵세포에서 발현 가능한 플라젤린 단백질의, 자가면역 질환, 염증성 질환, 미생물 감염 또는 암의 예방 또는 치료 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 TLR5 활성능을 가진 플라젤린 면역증강제 유도체의 진핵세포 발현시스템을 이용한 제조 및 응용에 관한 것으로, 본 발명에 따른 플라젤린 단백질은 높은 면역 증강효과를 나타낸다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는, 서열번호 13의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아스파라긴 (Asparagine, N)이 알라닌 (Alanine)으로 치환된, 진핵세포에서 발현 가능한 폴리펩타이드에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호 13의 아미노산 서열에서 83, 101, 139, 273 및 330 번째 위치로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치의 아스파라긴이 알라닌으로 치환된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 폴리펩타이드는, 서열번호 13의 아미노산 서열에서 83번째 위치; 및 101, 139, 273 및 330 번째 위치로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치;의 아스파라긴이 알라닌으로 치환된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 폴리펩타이드는, 서열번호 13의 아미노산 서열에서 83 및 101 번째 위치; 및 139, 273 및 330 번째 위치로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치; 의 아스파라긴이 알라닌으로 치환된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 폴리펩타이드는, 서열번호 13의 아미노산 서열에서 83, 101 및 139 번째 위치; 및 273 및 330 번째 위치로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치; 의 아스파라긴이 알라닌으로 치환된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 폴리펩타이드는, 서열번호 14 내지 23의 아미노산 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드는 TLR-5 활성능이 우수하여 높은 면역 증강효과를 나타내므로, 백신용 면역보조제 조성물, 면역기능 증강용 조성물, 또는 자가면역 질환, 염증성 질환, 미생물 감염 또는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드는 독감 백신과 함께 투여시 독감 항원에 특이적인 항체의 생성을 유도하는 효과가 우수하므로, 독감 백신용 면역보조제 조성물 또는 독감 치료용 면역보조제 조성물로 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태는, 서열번호 13의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아스파라긴 (Asparagine, N)이 알라닌 (Alanine)으로 치환된 폴리펩타이드를 포함하는, 백신용 면역보조제 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호 13의 아미노산 서열에서 83, 101, 139, 273 및 330 번째 위치로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치의 아스파라긴이 알라닌으로 치환된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 폴리펩타이드는, 서열번호 13의 아미노산 서열에서 83번째 위치; 및 101, 139, 273 및 330 번째 위치로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치;의 아스파라긴이 알라닌으로 치환된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 폴리펩타이드는, 서열번호 13의 아미노산 서열에서 83 및 101 번째 위치; 및 139, 273 및 330 번째 위치로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치; 의 아스파라긴이 알라닌으로 치환된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 폴리펩타이드는, 서열번호 13의 아미노산 서열에서 83, 101 및 139 번째 위치; 및 273 및 330 번째 위치로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치; 의 아스파라긴이 알라닌으로 치환된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 폴리펩타이드는, 서열번호 14 내지 23의 아미노산 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 백신용 면역보조제 조성물은 1종 이상의 통상적으로 사용되는 약제학적 및/또는 수의학적으로 허용되는 담체, 희석제, 항생제, 보조제 등을 더 포함할 수 있다.
담체는 목적동물 (숙주동물)에게 투여하는 것에 대해 제약상 허용되는 임의의 용매 (용액), 분산 매질, 코팅제, 완충제, 등장성 작용제, 현탁액, 콜로이드, 안정화제, 방부제, 항생제 (항균제, 항진균제 등), 흡착 지연제, 보조제 (아쥬반트, Adjuvant), 삽입물 등을 포함할 수 있다. 일반적으로는 화학 화합물, 특히 면역원에 대한 1종 이상의 전달 비히클 (Vehicle)의 사용은 제약 업계의 당업자에게 주지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 성분과 상용성이지 않는 한, 진단, 예방 및 치료용 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 1종 이상의 보충 활성 성분(들)이 또한 개시된 면역원성 조성물 및 백신 제제 중 1종 이상 이내로 혼입될 수 있거나 또는 이와 함께 투여될 수 있다.
희석제로는 물, 식염수, 덱스트로스, 에탄올, 글라이세롤 등이 포함될 수 있고, 상기 등장성 작용제로는 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 솔비톨, 락토스 등이 포함될 수 있으며, 상기 안정화제로는 알부민이 포함될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
보조제 (아쥬반트)로는 광물성 겔, 예를 들어 알루미늄 하이드록사이드 겔; 표면 활성 물질, 예를 들어 라이소레시틴; 글리코사이드, 예를 들어 사포닌 유도체, 예를 들어, 퀼 A(Quil A) 또는 GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., 알라바마주 버밍햄); 플루론 폴리올; 다가음이온 (다중음이온); 비-이온성 블록 중합체, 예를 들어 플루론 F-127 (B.A.S.F., 미국); 펩타이드; 광유, 예를 들어 몬타나이드 (Montanide) ISA-206 (셉픽(Seppic), 프랑스), 몬타나이드 ISA-50 (셉픽, 프랑스), 카보폴 (Cabopol), 암피겐, 암피겐 마크 II (하이드로닉스(Hydronic), 미국), 알하이드로겔, 오일 에멀젼 (예컨대, 베이올F(BayolF)/아르라셀 A(Arlacel A)와 같은 광유와 물의 유화액), 또는 식물성 오일, 물 및 레시틴과 같은 유화제의 유화액; 명반(alum); 콜레스테롤; 프로인트 (Freund) 완전 및 불완전 보조제; 블록 공중합체 (CytRx, 죠지아주 아틀란타); SAF-M (카이론(Chiron), 캘리포니아주 에머리빌); 암피겐 (AMPHIGEN, 등록상표) 보조제; 모노포스포릴 지질 A, 애브리딘(Avridine) 지질-아민 보조제; 대장균 (E. coli) 유래 열-불안정성 장 독소 (재조합 등); 콜레라 독소; 뮤라밀 다이펩타이드; IMS1313 (셉픽(Seppic사), 프랑스); ISA206; 몬타나이드 01 겔 (Montanide 01 gel)(셉픽, 프랑스); 및 이들 보조제의 혼합물이 포함되나, 이에 한정되지 아니하고, 바람직하게는 IMS1313, 카보폴 및 몬타나이드 01 겔로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 아쥬반트이다. 상기 아쥬반트는 면역반응의 향상 및/또는 접종 후 흡수 속도를 촉진하는 화합물 또는 혼합물을 칭하는 것으로 임의의 흡수-촉진제를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는, 서열번호 13의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아스파라긴 (Asparagine, N)이 알라닌 (Alanine)으로 치환된 폴리펩타이드를 포함하는, 면역기능 증강용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호 13의 아미노산 서열에서 83, 101, 139, 273 및 330 번째 위치로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치의 아스파라긴이 알라닌으로 치환된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 폴리펩타이드는, 서열번호 13의 아미노산 서열에서 83번째 위치; 및 101, 139, 273 및 330 번째 위치로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치;의 아스파라긴이 알라닌으로 치환된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 폴리펩타이드는, 서열번호 13의 아미노산 서열에서 83 및 101 번째 위치; 및 139, 273 및 330 번째 위치로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치; 의 아스파라긴이 알라닌으로 치환된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 폴리펩타이드는, 서열번호 13의 아미노산 서열에서 83, 101 및 139 번째 위치; 및 273 및 330 번째 위치로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치; 의 아스파라긴이 알라닌으로 치환된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 폴리펩타이드는, 서열번호 14 내지 23의 아미노산 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는, 서열번호 13의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아스파라긴 (Asparagine, N)이 알라닌 (Alanine)으로 치환된 폴리펩타이드를 포함하는, 자가면역 질환, 염증성 질환, 미생물 감염 또는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에서, 자가면역 질환은 혈구탐식성 림프조직구증 (Hemophagocytic lymphohistiocytosis), 전신 홍반 루푸스 (systemic lupus erythematosus), 기쿠치 (Kikuchi) 병, 혈관염 (vasculitis), 성인 스틸 병 (Adult onset Still's disease), 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis), 염증성 근육염 (Inflammatory Myositis), 베체트 병 (Behcet disease), IgG4-연관성 질환, 쇼그렌 증후군 (Sjogren syndrome), 거대세포 동맥 염 (Giant cell arteritis), 측두 동맥염 (Temporal arteritis), 제1형 당뇨병, 아토피 피부염, 크론병 (Crohn's disease), 전신성 경화증 (systemic sclerosis), 건선, 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 및 그레이브스 갑상선 항진증 (Graves hyperthyroidism)으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 염증성 질환은 패혈증, 위염, 장염, 신장염, 간염, 만성 폐쇄성 폐질환 (Chronic Obstructive Pulmonary Disease: COPD), 폐섬유증, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두통, 두통, 허리 통증, 섬유근육통, 근막 질환, 바이러스 감염, 세균 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 프로스타글란딘 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 및 습진으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 미생물은 인플루엔자 바이러스 (Influenza virus), 코로나 바이러스 (Corona virus), 간염 바이러스 (Hepatitis virus), 지카 바이러스 (Zika virus), 뎅기 바이러스 (Dengue virus, DENV), 한타바이러스 (Hanta virus), 거대세포바이러스 (Cytomegalovirus, CMV), 엡스타인-바바이러스 (Epstein Barr virus, EBV), 사람면역결핍바이러스 (human immunodeficiency virus, HIV), 단순포진바이러스 (Herpes simplex virus, HSV), 치쿤군야 바이러스 (Chikungunya virus), 엔테로바이러스 (Enterovirus), 마버그열바이러스 (Marburg hemorrhagic fever virus), 파르보바이러스 (parvovirus), 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 (Sever Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus, SFTSV), 로타바이러스 (Rotavirus), 노로 바이러스 (Norovirus), 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis), A 군 용혈성연쇄구균 (Group A Streptococcus, GAS), B 군 연쇄구균 (Group B Streptococcus, GBS), 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus), 시겔라 (Shigella), 병원성 대장균 (pathogenic E. coli), 살모넬라 (Salmonella), 클라미디아 (Chlamydia), 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa), 비피막형 헤모필루스 인플루엔자균 (Non-typeable Haemophilus influenzae), 폐렴간균(Klebsiella pneumoniae), 클로스트리듐디피실레 (Clostridium difficile), 말라리아원충 (Plasmodium), 라슈마니아 (Leishmania), 주혈흡충 (Schistosoma), 트리파노소마 (Trypanosoma), 브루셀라균 (Brucella), 와포자충 (Cryptosporidium) 및 엔트아메마 (Entamoeba)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 암은 유방암, 폐암, 결장암, 신장암, 간암, 난소암, 전립선암, 고환암, 비뇨 생식관암, 림프계암, 직장암, 췌장암, 식도암, 위암, 자궁 경부암, 갑상선암 및 피부암으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호 13의 아미노산 서열에서 83, 101, 139, 273 및 330 번째 위치로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치의 아스파라긴이 알라닌으로 치환된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 폴리펩타이드는, 서열번호 13의 아미노산 서열에서 83번째 위치; 및 101, 139, 273 및 330 번째 위치로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치;의 아스파라긴이 알라닌으로 치환된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 폴리펩타이드는, 서열번호 13의 아미노산 서열에서 83 및 101 번째 위치; 및 139, 273 및 330 번째 위치로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치; 의 아스파라긴이 알라닌으로 치환된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 폴리펩타이드는, 서열번호 13의 아미노산 서열에서 83, 101 및 139 번째 위치; 및 273 및 330 번째 위치로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치; 의 아스파라긴이 알라닌으로 치환된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 폴리펩타이드는, 서열번호 14 내지 23의 아미노산 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적 유효량으로 투여될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "약학적 유효량"은 상술한 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 인간을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 예컨대, 경구, 피부, 정맥, 근육, 피하 등의 경로로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 경구로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는, 서열번호 13의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아스파라긴 (Asparagine, N)이 알라닌 (Alanine)으로 치환된 폴리펩타이드의, 백신 면역보조 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는, 서열번호 13의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아스파라긴 (Asparagine, N)이 알라닌 (Alanine)으로 치환된 폴리펩타이드의, 면역기능 증강 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는, 서열번호 13의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아스파라긴 (Asparagine, N)이 알라닌 (Alanine)으로 치환된 폴리펩타이드의, 자가면역 질환, 염증성 질환, 미생물 감염 또는 암의 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.
본 발명은 TLR5 활성능을 가진 플라젤린 면역증강제 유도체의 진핵세포 발현시스템을 이용한 제조 및 응용에 관한 것으로, 본 발명에 따른 플라젤린 변형체는 높은 면역 증강효과를 가지는 것으로, 다양한 백신 및 면역치료제 조성물에 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 원핵세포인 대장균에서 발현한 패혈증 비브리오균 유래 야생형 플라젤린 (prokFlaB)과 진핵세포인 Expi293TM 세포에서 발현한 야생형 플라젤린 (eukFlaB)을 웨스톤 블롯을 통해 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 원핵세포인 대장균에서 발현한 패혈증 비브리오균 유래 야생형 플라젤린 (prokFlaB)과 진핵세포인 Expi293TM 세포에서 발현한 야생형 플라젤린 (eukFlaB)의 TLR5-자극 활성을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따라 진핵세포인 Expi293TM 세포에서 발현한 야생형 플라젤린 (eukFlaB)을 탈당화 효소인 Peptide N-glycosidase F (PNGase)로 처리한 전후의 단백질 상태를 웨스톤 블롯을 통해 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따라 진핵세포인 Expi293TM 세포에서 발현한 야생형 플라젤린 (eukFlaB)을 탈당화 효소인 Peptide N-glycosidase F (PNGase)로 처리한 전후의 TLR5-자극 활성을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 플라젤린 (FlaB)의 당화 아미노산 서열을 예측한 결과를 나타낸다.
도 5는 부위-특이적-돌연변이 (site-directed mutagenesis)를 유도한 플라젤린 변형체 제작 구성을 나타내는 도면이다.
도 6 내지 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 진핵세포인 Expi293TM 세포에서 발현한 플라젤린 변형체의 특징과 TLR5-자극 활성을 검증한 결과이다.
도 8은 Co-IP (Co-immunoprecipitation) 방법을 통하여 플라젤린 변형체와 TLR5의 결합을 측정한 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 원핵세포인 대장균에서 발현한 패혈증 비브리오균 유래 야생형 플라젤린 (prokFlaB)과 진핵세포인 Expi293TM 세포에서 발현한 야생형 플라젤린 (eukFlaB) 및 다양한 플라젤린 변형체의 면역증강제 효능을 독감 백신 모델에서 비교한 결과를 나타낸다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 원핵세포인 대장균에서 발현한 패혈증 비브리오균 유래 야생형 플라젤린 (prokFlaB)과 진핵세포인 Expi293TM 세포에서 발현한 야생형 플라젤린 (eukFlaB), eukFlaBN83/101/139A, eukFlaBN83/101/139/273A 및 eukFlaBN83/101/139/273/330A를 독감 백신 모델에서 면역증강제로 사용할 경우 prokFlaB- 혹은 eukFlaB-선택적인 항체 생성 여부를 비교한 결과를 나타낸다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 원핵세포인 대장균에서 발현한 패혈증 비브리오균 유래 야생형 플라젤린 (prokFlaB)과 진핵세포인 Expi293TM 세포에서 발현한 야생형 플라젤린 (eukFlaB) 및 다양한 플라젤린 변형체의 안정성을 비교한 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 원핵세포인 대장균에서 발현한 패혈증 비브리오균 유래 야생형 플라젤린 (prokFlaB)과 진핵세포인 Expi293TM 세포에서 발현한 야생형 플라젤린 (eukFlaB)의 TLR5-자극 활성을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따라 진핵세포인 Expi293TM 세포에서 발현한 야생형 플라젤린 (eukFlaB)을 탈당화 효소인 Peptide N-glycosidase F (PNGase)로 처리한 전후의 단백질 상태를 웨스톤 블롯을 통해 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따라 진핵세포인 Expi293TM 세포에서 발현한 야생형 플라젤린 (eukFlaB)을 탈당화 효소인 Peptide N-glycosidase F (PNGase)로 처리한 전후의 TLR5-자극 활성을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 플라젤린 (FlaB)의 당화 아미노산 서열을 예측한 결과를 나타낸다.
도 5는 부위-특이적-돌연변이 (site-directed mutagenesis)를 유도한 플라젤린 변형체 제작 구성을 나타내는 도면이다.
도 6 내지 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 진핵세포인 Expi293TM 세포에서 발현한 플라젤린 변형체의 특징과 TLR5-자극 활성을 검증한 결과이다.
도 8은 Co-IP (Co-immunoprecipitation) 방법을 통하여 플라젤린 변형체와 TLR5의 결합을 측정한 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 원핵세포인 대장균에서 발현한 패혈증 비브리오균 유래 야생형 플라젤린 (prokFlaB)과 진핵세포인 Expi293TM 세포에서 발현한 야생형 플라젤린 (eukFlaB) 및 다양한 플라젤린 변형체의 면역증강제 효능을 독감 백신 모델에서 비교한 결과를 나타낸다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 원핵세포인 대장균에서 발현한 패혈증 비브리오균 유래 야생형 플라젤린 (prokFlaB)과 진핵세포인 Expi293TM 세포에서 발현한 야생형 플라젤린 (eukFlaB), eukFlaBN83/101/139A, eukFlaBN83/101/139/273A 및 eukFlaBN83/101/139/273/330A를 독감 백신 모델에서 면역증강제로 사용할 경우 prokFlaB- 혹은 eukFlaB-선택적인 항체 생성 여부를 비교한 결과를 나타낸다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 원핵세포인 대장균에서 발현한 패혈증 비브리오균 유래 야생형 플라젤린 (prokFlaB)과 진핵세포인 Expi293TM 세포에서 발현한 야생형 플라젤린 (eukFlaB) 및 다양한 플라젤린 변형체의 안정성을 비교한 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.
실시예 1: 진핵세포-발현 야생형 플라젤린 생산용 플라스미드 제작
원핵세포에서 발현하는 패혈증 비브리오균(Vibrio vunificus)-유래 FlaB (prokFlaB)는 Lee SE, et al. A bacterial flagellin, Vibrio vulnificus FlaB, has a strong mucosal adjuvant activity to induce protective immunity. Infect Immun. 2006;74(1):694-702에 개시된 방법에 따라 생산되었다.
상기 FlaB를 진핵세포에서 발현하기 위해, HindIII (AAGCTT) 절단 부위를 포함하는, 하기 표 1의 정방향 프라이머 eukFlaB-F 와 NotI 절단 부위를 포함한 역방향 프라이머 eukFlaB-R을 사용하여 PCR 반응을 통해 증폭하였다. 이때, 포유류 세포 발현 코돈 사용 (빈도)에 따라 최적화 한 FlaB를 합성한 후, pBHA 플라스미드에 클로닝한 pBHA::eukFlaB (바이오니아, 대한민국)를 PCR반응 주형(template)으로 사용하였다.
| 서열번호 | 명칭 | 서열 (5'->3') |
| 1 | eukFlaB-F | CCCAAGCTTGCCGTCAACGTGAACACCAA |
| 2 | eukFlaB-R | ATAGTTTAGCGGCCGCGCCCAGCAGGGAGAGGGCGC |
eukFlaB DNA 증폭 산물과 진핵세포 발현 벡터 pSectag2B (Invitrogen, V900-20)는 각각 한 쌍의 제한 효소(RE) HindIII 및 NotI을 37℃에서 하룻밤 처리하였다. 제한 효소를 처리한 PCR 산물과 진핵세포 발현 벡터인 pSectag2B를 실온에서 2시간 동안 T4 DNA 연결효소 (Enzynomics)에 의해 결합시켰다. 새로운 구조인 pSectag2B::eukFlaB 플라스미드는 대장균 컴피턴트 세포인 TOP10 (Invitrogen)으로 형질 전환 하고 앰피실린이 함유된 LB 플레이트를 사용하여 배양하였다. 발현 벡터의 DNA 염기 서열은 Macrogen Online Sequencing Order System (http://dna. macrogen.com/kor/)을 통해 디데옥시-사슬 종결 염기서열법 (dideoxy-chain termination sequencing)으로 확인하였다.
실시예 2: 진핵세포 발현시스템을 활용한 재조합 단백질 생산
진핵세포 발현계 세포주인 Expi293TM 세포는 Thermofish Scientific (Thermofish Scientific, Cat#. A14635)로부터 구입하여 본 발명에 사용하였다. 형질주입 절차는 제조업체 프로토콜을 따랐다. Expi293TM 세포는 37℃, 8% CO2 및 125 rpm의 속도로 교반되는 인큐베이터에서 배양하였다. 0일째 (형질주입 전날) Expi293TM 세포는 배양 플라스크 (corning)에 3x106/ml로 접종하였다. 1일 차 (형질주입 당일), Expi293TM 세포 수를 측정하여 3x106/ml로 접종하고 0.22 μm 필터(Millexmil-GV, SLGVR13)를 통해 여과하여 멸균한 pSectag2B::eukFlaB 플라스미드를 세포 배양계에 첨가하였다. 둘째 날, ExpiFectamineTM 293 Transfection Enhancer 1 and enhancer 2를 첨가하여 넷째 날까지 계속 배양하였다. 이 때 재조합 단백질은 IgK 사슬 서열을 포함하는 pSectag2B로 인해 배양 배지로 분비되었다.
넷째 날, 단백질이 분비되어진 배양 배지는 4℃에 20분 동안 17,000 rpm으로 원심 분리한 후 제조업체의 지침에 따라 무세포 상층액을 Ni-NTA agarose beads (Qiagen, Hilden, Germany)가 포함된 컬럼에 로딩하였다. 원하는 단백질을 제외한 나머지 단백질을 제거하기 위해 세척버퍼 I (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazole, pH=8)와 세척버퍼 II (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, and 20 mM Imidazole, pH=8)를 이용하여 세척하였다. 대상 단백질은 15분 동안 상온에서 용출버퍼 (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl and 250 mM Imidazole, pH=8)를 이용하여 녹여서 분리하였다. 그렇게 용출된 단백질은 투석법에 의해 완충액을 인산염 완충 식염수 (PBS)로 교체하였다.
재조합 펩타이드는 SDS-PAGE 및 BALB/c 마우스에서 생성된 항-FlaB 항체를 사용한 웨스턴 블롯을 통해 확인하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
실시예 3: 진핵세포 발현 시스템을 활용하여 제작한 야생형 플라젤린의 TLR5-자극 활성 검증
진핵세포 발현 시스템을 활용하여 제작한 야생형 플라젤린의 TLR5 자극 활성을 검증하기 위하여, 다양한 단백질 농도에서 NF-κB 활성을 측정하였다. 구체적으로, 제조업체의 프로토콜에 따라 HEK-BlueTM 검출 (InvivoGen, hb-det2) 분석 시스템과 함께 HEK-BlueTM hTLR5 세포 (InvivoGen, hκb-htlr-5)를 사용하였다. 각 단백질 농도에 대해 3중 OD 620 nm 값을 사용하여 EC50을 계산하였다. 탈당화된 eukFlaB의 생물학적 활성을 확인하기 위해 Thermofish Scientific로부터 구입한 HEK293T 세포를 사용하여 시험관 내 NF-κB 루시퍼라제 리포터 분석을 수행하였다. HEK293T 세포는 10% FBS및 100 units/ml의 항생제 (GibcoTM, cat.15140122)를 포함하는 DMEM 배지 (GibcoTM, cat.11995-065)에서 37℃, 5% CO2로 유지하였다. NF-κB 리포터 분석을 위해 최소 3회 세포 계대를 사용했다. HEK293T 세포는 24-웰 플레이트 (SPL Life Sciences Co., Ltd., Korea)에 2x105/well로 접종하여 24시간 동안 배양하였다. 세포에 형질주입(transfection) 하기 위해 리포터 플라스미드 pNF-κB-luc (100 ng/well), p3xFlag-hTLR5 (100 ng/well), pCMV-β-Gal (50 ng/well), 및 Effectene (5 ㎕/well) (Qiagen, 301427)을 넣고 하룻밤 배양하였다. 형질 주입된 세포에 prokFlaB, eukFlaB 또는 돌연변이 eukFlaB 변형체를 처리하고 24시간 동안 배양한 후, 배양액을 제거하고 세포 용해 완충액 (Promega, Madison, WI USA, E153A)으로 세포를 용해시킨 후, 세포 용해물로부터 형광효소 활성화를 광도계 (Berthold, Lumat-Plus LB96V)로 측정하였다.
실험 결과, 도 2에 나타난 것과 같이, eukFlaB는 prokFlaB에 비해 현저히 낮은 TLR5 자극을 유도하는 것을 확인하였다.
실시예 4: 탈당화 효소 (Peptide N-glycosidase F)를 사용한 진핵세포발현-플라젤린 탈당화 (N-deglycoslyation) 반응 및 탈당화된 진핵세포-발현 플라젤린의 TLR5-자극 활성 검증
진핵세포 발현 eukFlaB의 탈당화 반응은 제조자 프로토콜에 따라 PNGase F 효소 (Promega, cat.V483A)를 이용하여 수행하였다. PNGase F 효소 (10 U/μl)와 euFlaB (15 μg)을 혼합한 후 37℃에서 배양하였다. 2시간 후, 탈당화 정도는 SDS-PAGE 및 BALB/c 마우스에서 생성된 항-FlaB 항체를 사용한 웨스턴 블롯을 통해 확인하였고, 그 결과를 도 3a에 나타내었다. 탈당화된 eukFlaB의 TLR5-자극 활성은 실시예 3과 동일한 방법으로 측정하여, 그 결과를 도 3b에 나타내었다.
실험결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이, 탈당화된 eukFlaB는 TLR5 자극활성을 회복하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 부위 특이적 돌연변이 (site-directed mutagenesis) 유도를 통한 다양한 탈당화 플라젤린 유도체 제작 및 다양한 탈당화된 진핵세포-발현 플라젤린 유도체의 TLR5-자극 활성 검증
NetNGlyc-1.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0), N-당화 공통염기배열 Asn-Xaa-Ser/Thr을 결정하는 생물정보 도구를 사용하여 FlaB 아미노산 서열의 N-당화 부위를 예측하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이, eukFlaB는 N83, N101, N139, N273 및 N330에서 5개의 당화 잔기가 예측되었고, 3개의 잔기 (N83, N101, N139)가 TLR5 결합 도메인 근처에 위치하는 것이 확인되었다.
이에, 도 5에 나타낸 바와 같이, 부위 특이적 돌연변이 (site-directed mutagenesis)법을 도입하여 다양한 탈당화 플라젤린 단백질 [eukFlaBN83A, eukFlaBN101A, eukFlaBN139A, eukFlaBN273A, eukFlaBN330A, eukFlaBN83A,N101A (eukFlaBN83/101A), eukFlaBN83A,N101A,N139A (eukFlaBN83/101/139A), eukFlaBN83A,N101A,N139A,N273A (eukFlaBN83/101/139/273A), eukFlaBN83A,N101A,N139A,N273A,N330A (eukFlaBN83/101/139/273/330A), 및 eukFlaBN139A,N273A,N330A (eukFlaBN139/273/330A)를 제작하였다.
eukFlaB의 부위-특이적 돌연변이 (site-directed mutation) 생성은 제조업체 프로토콜에 따라 수행하였다 (EZchangeTM Site-directed Mutation, Cat. # EZ004S). 간단히 말해서, pSectag2B::eukFlaB 플라스미드는 PCR 반응을 위한 템플릿으로 사용되었으며, 이때 사용한 표 2의 프라이머는 특정 코돈인 “AAC” 또는 “AAT”에 해당하는 아미노산 아스파라긴(N)을 또 다른 특정 코돈인 “GCT” 또는 “GCC”에 해당하는 아미노산 알라닌(A)으로 변화하여 위치 유도 돌연변이 생성을 위해 설계되었다. EZ-MIX 효소를 사용하여 PCR 산물에서 모체 플라스미드를 분리한 후 플라스미드는 대장균 컴피턴트 세포 (수용성 세포)인 TOP10으로 형질 전환하고 앰피실린 (100 μg/ml)이 함유된 LB 플레이트에 얇게 펴서 발랐다. eukFlaB의 양성 돌연변이 서열은 마크로젠 온라인 시퀀스 (http://dna.macrogen.com/kor/)을 통해 확인하였다.
| 서열번호 | 명칭 | 서열 (5'->3') |
| 3 | N83A-F | CTGAAGGCGCCATGGCCGAAACCACCAACATC |
| 4 | N83A-R | GATGTTGGTGGTTTCGGCCATGGCGCCTTCAG |
| 5 | N101A-F | CTCTGCAGTCTGCCGCCGGCAGCAACAGCAAG |
| 6 | N101A-R | CTTGCTGTTGCTGCCGGCGGCAGACTGCAGAG |
| 7 | N139A-F | CAACAAGCTGCTGGCTGGCACCTACGGCAC |
| 8 | N139A-R | GTGCCGTAGGTGCCAGCCAGCAGCTTGTTG |
| 9 | N273A-F | GGGCGAGGGCAAGGCCGTGACCGTGGATAC |
| 10 | N273A-R | GTATCCACGGTCACGGCCTTGCCCTCGCCC |
| 11 | N330A-F | CAACGAGAACGTCGCTGCCTCTAAGTCCAGG |
| 12 | N330A-R | CCTGGACTTAGAGGCAGCGACGTTCTCGTTG |
재조합 펩타이드는 SDS-PAGE 및 BALB/c 마우스에서 생성된 항-FlaB 항체를 사용한 웨스턴 블롯을 통해 확인하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
상기 방법을 통해 제조된 eukFlaB, eukFlaBN83A, eukFlaBN101A, eukFlaBN139A, eukFlaBN273A, eukFlaBN330A, eukFlaBN83/101A, eukFlaBN83/101/139A, eukFlaBN83/101/139/273A, eukFlaBN83/101/139/273/330A 및 eukFlaBN139/273/330A의 펩타이드 서열은 하기 표 3에 나타내었다.
| 서열번호 | 명칭 | 서열 (5'->3') |
| 13 | eukFlaB | MAVNVNTNVAAMTAQRYLNNANSAQQTSMERLSSGFKINSAKDDAAGLQISNRLNVQSRGLDVAVRNANDGISIAQTAEGAMNETTNILQRMRDLSLQSANGSNSKSERVAIQEEVTALNDELNRIAETTSFGGNKLLNGTYGTKAMQIGADNGEAVMLSLKDMRSDNVMMGGVSYQAEEGKDKNWNVAAGDNDLTIALTDSFGNEQEIEINAKAGDDIEELATYINGQTDLVKASVGEGGKLQIFAGNNKVQGEIAFSGSLAGELGLGEGKNVTVDTIDVTTVQGAQESVAIVDAALKYVDSHRAELGAFQNRFNHAISNLDNINENVNASKSRIKDTDFAKETTQLTKTQILSQASSSILAQAKQAPNSALSLLG |
| 14 | eukFlaBN83A | MAVNVNTNVAAMTAQRYLNNANSAQQTSMERLSSGFKINSAKDDAAGLQISNRLNVQSRGLDVAVRNANDGISIAQTAEGAMAETTNILQRMRDLSLQSANGSNSKSERVAIQEEVTALNDELNRIAETTSFGGNKLLNGTYGTKAMQIGADNGEAVMLSLKDMRSDNVMMGGVSYQAEEGKDKNWNVAAGDNDLTIALTDSFGNEQEIEINAKAGDDIEELATYINGQTDLVKASVGEGGKLQIFAGNNKVQGEIAFSGSLAGELGLGEGKNVTVDTIDVTTVQGAQESVAIVDAALKYVDSHRAELGAFQNRFNHAISNLDNINENVNASKSRIKDTDFAKETTQLTKTQILSQASSSILAQAKQAPNSALSLLG |
| 15 | eukFlaBN101A | MAVNVNTNVAAMTAQRYLNNANSAQQTSMERLSSGFKINSAKDDAAGLQISNRLNVQSRGLDVAVRNANDGISIAQTAEGAMNETTNILQRMRDLSLQSAAGSNSKSERVAIQEEVTALNDELNRIAETTSFGGNKLLNGTYGTKAMQIGADNGEAVMLSLKDMRSDNVMMGGVSYQAEEGKDKNWNVAAGDNDLTIALTDSFGNEQEIEINAKAGDDIEELATYINGQTDLVKASVGEGGKLQIFAGNNKVQGEIAFSGSLAGELGLGEGKNVTVDTIDVTTVQGAQESVAIVDAALKYVDSHRAELGAFQNRFNHAISNLDNINENVNASKSRIKDTDFAKETTQLTKTQILSQASSSILAQAKQAPNSALSLLG |
| 16 | eukFlaBN139A | MAVNVNTNVAAMTAQRYLNNANSAQQTSMERLSSGFKINSAKDDAAGLQISNRLNVQSRGLDVAVRNANDGISIAQTAEGAMNETTNILQRMRDLSLQSANGSNSKSERVAIQEEVTALNDELNRIAETTSFGGNKLLAGTYGTKAMQIGADNGEAVMLSLKDMRSDNVMMGGVSYQAEEGKDKNWNVAAGDNDLTIALTDSFGNEQEIEINAKAGDDIEELATYINGQTDLVKASVGEGGKLQIFAGNNKVQGEIAFSGSLAGELGLGEGKNVTVDTIDVTTVQGAQESVAIVDAALKYVDSHRAELGAFQNRFNHAISNLDNINENVNASKSRIKDTDFAKETTQLTKTQILSQASSSILAQAKQAPNSALSLLG |
| 17 | eukFlaBN273A | MAVNVNTNVAAMTAQRYLNNANSAQQTSMERLSSGFKINSAKDDAAGLQISNRLNVQSRGLDVAVRNANDGISIAQTAEGAMNETTNILQRMRDLSLQSANGSNSKSERVAIQEEVTALNDELNRIAETTSFGGNKLLNGTYGTKAMQIGADNGEAVMLSLKDMRSDNVMMGGVSYQAEEGKDKNWNVAAGDNDLTIALTDSFGNEQEIEINAKAGDDIEELATYINGQTDLVKASVGEGGKLQIFAGNNKVQGEIAFSGSLAGELGLGEGKAVTVDTIDVTTVQGAQESVAIVDAALKYVDSHRAELGAFQNRFNHAISNLDNINENVNASKSRIKDTDFAKETTQLTKTQILSQASSSILAQAKQAPNSALSLLG |
| 18 | eukFlaBN330A | MAVNVNTNVAAMTAQRYLNNANSAQQTSMERLSSGFKINSAKDDAAGLQISNRLNVQSRGLDVAVRNANDGISIAQTAEGAMNETTNILQRMRDLSLQSANGSNSKSERVAIQEEVTALNDELNRIAETTSFGGNKLLNGTYGTKAMQIGADNGEAVMLSLKDMRSDNVMMGGVSYQAEEGKDKNWNVAAGDNDLTIALTDSFGNEQEIEINAKAGDDIEELATYINGQTDLVKASVGEGGKLQIFAGNNKVQGEIAFSGSLAGELGLGEGKNVTVDTIDVTTVQGAQESVAIVDAALKYVDSHRAELGAFQNRFNHAISNLDNINENVAASKSRIKDTDFAKETTQLTKTQILSQASSSILAQAKQAPNSALSLLG |
| 19 | eukFlaBN83/101A | MAVNVNTNVAAMTAQRYLNNANSAQQTSMERLSSGFKINSAKDDAAGLQISNRLNVQSRGLDVAVRNANDGISIAQTAEGAMAETTNILQRMRDLSLQSAAGSNSKSERVAIQEEVTALNDELNRIAETTSFGGNKLLNGTYGTKAMQIGADNGEAVMLSLKDMRSDNVMMGGVSYQAEEGKDKNWNVAAGDNDLTIALTDSFGNEQEIEINAKAGDDIEELATYINGQTDLVKASVGEGGKLQIFAGNNKVQGEIAFSGSLAGELGLGEGKNVTVDTIDVTTVQGAQESVAIVDAALKYVDSHRAELGAFQNRFNHAISNLDNINENVNASKSRIKDTDFAKETTQLTKTQILSQASSSILAQAKQAPNSALSLLG |
| 20 | eukFlaBN83/101/139A | MAVNVNTNVAAMTAQRYLNNANSAQQTSMERLSSGFKINSAKDDAAGLQISNRLNVQSRGLDVAVRNANDGISIAQTAEGAMAETTNILQRMRDLSLQSAAGSNSKSERVAIQEEVTALNDELNRIAETTSFGGNKLLAGTYGTKAMQIGADNGEAVMLSLKDMRSDNVMMGGVSYQAEEGKDKNWNVAAGDNDLTIALTDSFGNEQEIEINAKAGDDIEELATYINGQTDLVKASVGEGGKLQIFAGNNKVQGEIAFSGSLAGELGLGEGKNVTVDTIDVTTVQGAQESVAIVDAALKYVDSHRAELGAFQNRFNHAISNLDNINENVNASKSRIKDTDFAKETTQLTKTQILSQASSSILAQAKQAPNSALSLLG |
| 21 | eukFlaBN83/101/139/273A | MAVNVNTNVAAMTAQRYLNNANSAQQTSMERLSSGFKINSAKDDAAGLQISNRLNVQSRGLDVAVRNANDGISIAQTAEGAMAETTNILQRMRDLSLQSAAGSNSKSERVAIQEEVTALNDELNRIAETTSFGGNKLLAGTYGTKAMQIGADNGEAVMLSLKDMRSDNVMMGGVSYQAEEGKDKNWNVAAGDNDLTIALTDSFGNEQEIEINAKAGDDIEELATYINGQTDLVKASVGEGGKLQIFAGNNKVQGEIAFSGSLAGELGLGEGKAVTVDTIDVTTVQGAQESVAIVDAALKYVDSHRAELGAFQNRFNHAISNLDNINENVNASKSRIKDTDFAKETTQLTKTQILSQASSSILAQAKQAPNSALSLLG |
| 22 | eukFlaBN83/101/139/273/330A | MAVNVNTNVAAMTAQRYLNNANSAQQTSMERLSSGFKINSAKDDAAGLQISNRLNVQSRGLDVAVRNANDGISIAQTAEGAMAETTNILQRMRDLSLQSAAGSNSKSERVAIQEEVTALNDELNRIAETTSFGGNKLLAGTYGTKAMQIGADNGEAVMLSLKDMRSDNVMMGGVSYQAEEGKDKNWNVAAGDNDLTIALTDSFGNEQEIEINAKAGDDIEELATYINGQTDLVKASVGEGGKLQIFAGNNKVQGEIAFSGSLAGELGLGEGKAVTVDTIDVTTVQGAQESVAIVDAALKYVDSHRAELGAFQNRFNHAISNLDNINENVAASKSRIKDTDFAKETTQLTKTQILSQASSSILAQAKQAPNSALSLLG |
| 23 | eukFlaBN139/273/330A | MAVNVNTNVAAMTAQRYLNNANSAQQTSMERLSSGFKINSAKDDAAGLQISNRLNVQSRGLDVAVRNANDGISIAQTAEGAMNETTNILQRMRDLSLQSANGSNSKSERVAIQEEVTALNDELNRIAETTSFGGNKLLAGTYGTKAMQIGADNGEAVMLSLKDMRSDNVMMGGVSYQAEEGKDKNWNVAAGDNDLTIALTDSFGNEQEIEINAKAGDDIEELATYINGQTDLVKASVGEGGKLQIFAGNNKVQGEIAFSGSLAGELGLGEGKAVTVDTIDVTTVQGAQESVAIVDAALKYVDSHRAELGAFQNRFNHAISNLDNINENVAASKSRIKDTDFAKETTQLTKTQILSQASSSILAQAKQAPNSALSLLG |
다양한 플라젤린의 생물학적 활성을 결정하기 위해 리포터 어세이를 통해 Toll-like receptor5-신호 매개에 의한 NF-κB 활성을 측정하였다. HEK293T 세포는 10% FBS (GibcoTM, cat.16000044)와 100 units/ml의 페니실린과 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신 항생제 (GibcoTM, cat.15140122)를 포함하는 DMEM (GibcoTM, cat.11995-065)배지에서 유지하였다. HEK293T 세포는 24-웰 플레이트 (Corning costar, cat.3526)에 2x105/well로 접종하여, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 세포에 형질주입(transfection) 하기 위해 리포터 플라스미드 pNF-κB-luc (100 ng/well), p3xFlag-hTLR5 (100 ng/well), pCMV-β-Gal (50 ng/well), Effectene (5 ㎕/well) (Qiagen, 301427)을 넣고 하룻밤 배양하였다. 형질 주입된 세포에 prokFlaB, eukFlaB 또는 돌연변이 eukFlaB 변형체를 처리하고 24시간 동안 배양한 후, 배양액을 제거하고 세포 용해 완충액으로 세포를 용해시킨 후, 세포 용해물로부터 형광효소 활성화를 광도계 (Berthold, Lumat-Plus LB96V)로 측정하여 TLR5-신호전달 활성을 검증하였다.
실험결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, eukFlaB, eukFlaBN101A, eukFlaBN139A, eukFlaBN273A, eukFlaBN330A, eukFlaBN139/273/330A는 TLR5 활성화를 유도하지 않으나 eukFlaBN83A, eukFlaBN83/101A, eukFlaBN83/101/139A, eukFlaBN83/101/139/273A, eukFlaBN83/101/139/273/330A는 TLR5 활성화를 유도함을 확인하였다. 특히 eukFlaBN83/101/139A, eukFlaBN83/101/139/273A, eukFlaBN83/101/139/273/330A는 원핵세포 유래 플라젤린(prokFlaB)과 동일한 수준의 TLR5 자극 활성을 가짐을 확인하였다.
실시예 6: 공동면역침강법 (Co-IP; Co-Immunoprecipitation)을 이용한 플라젤린 변형체와 TLR5 결합 측정
다음과 같이, 공동면역침강법 (Co-IP)을 이용하여 플라젤린 변형체와 TLR5의 결합을 측정하였다. 구체적으로, HEK293T 세포를 p3XFlag-hTLR5 플라스미드로 24시간 동안 형질주입시켰다. 프로테아제 억제제가 포함된 RIPA 완충액을 사용하여 세포를 용해한 후 초음파 처리한 다음 원심분리하여 상층액을 수집했다. 단백질 prokFlaB, eukFlaB, eukFlaBN83/101/139A 및 eukFlaBN83/101/139/273/330A를 상청액과 혼합하고 4℃에서 밤새 회전시켰다 (Complex I). 동시에 Protein A/G plus-agarose (Santa Cruz Biotechnology, sc-2003)와 항-Flag 태그 항체 (Abcam, ab1162)를 혼합하고 4℃에서 밤새 회전시켰다 (Complex II). 그 다음 IP 버퍼 (1% TritonX-100, 25mM Tris pH 7.5, 10% Glycerol, 150mM NaCl, 1mM DTT, 1mM EDTA 및 protease inhibitor)로 Complex II를 5회 세척하였다. Complex I과 II를 4℃에서 6시간 동안 혼합 후, IP 버퍼로 5회 세척하여 비특이적 결합 단백질을 제거하였다. 1x SDS loading buffer 50μl를 넣고 10분간 가열한 후, SDS-PAGE 및 추가 웨스턴 블롯을 분석하였다. 항-FlaB eukFlaB 변형체가 항-Myc에 의해 잘 검출되는 Myc-태그와 함께 발현되므로 eukFlaB 상의 당화로 인해 검출된 eukFlaB 단백질이 낮기 때문에, 각각 pFlaB 및 eukFlaB 변형체를 검출하기 위한 웨스턴 블롯 분석에 마우스 항-FlaB 및 항-Myc-HRP (Novex®, 46-0709)의 두 가지 다른 항체를 사용하였다.
실험 결과, 도 8에 나타난 것과 같이, prokFlaB는 TLR5와 높은 친화도로 결합하였으나 eukFlaBsms TLR5와 결합하지 않음을 관찰할 수 있었다. 또한 eukFlaBN83/101/139A 및 eukFlaBN83/101/139/273/330A 변형체는 TLR5 결합이 회복되는 것이 확인되었다. 이로부터 당화가 FlaB-TLR5 결합을 방해하고 탈당화가 더 높은 친화성의 FlaB-TLR5 결합을 초래한다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7: 마우스를 활용한 독감 백신 실험 모델 시스템에서 상기에서 제작한 진핵세포-발현 플라젤린 변형체의 면역증강제 효능 검증
생후 7주 된 암컷 BALB/C 생쥐 (n=10)는 오리엔트 (성남시, 경기도, 대한민국)에서 구입하여 실험진행 하기 전 1주일 동안 시설환경에서 적응시켰다. 쥐는 졸레틸®50 (Virbac corporation, Carros, France)과 럼푼TM (Bayer AG, Leverkusen, Germany)을 혼합한 마취제를 복강투여 하여 마취시킨 뒤, 면역을 시작했다. 그룹으로는 1) sH1N1 항원군(sH1N1, 0.2 ug/mouse), 2) sH1N1(0.2 ug/mouse) 과 prokFlaB(4 ug/mouse), 3) 혹은 eukFlaB (4 ug/mouse) 혼합물 (sH1N1+prokFlaB, sH1N1+eukFlaB, sH1N1+eukFlaBN83A, sH1N1+eukFlaBN83/101A, sH1N1+eukFlaBN83/101/139A, sH1N1+eukFlaBN83/101/139/273A., and sH1N1+eukFlaBN83/101/139/273/330A)을 사용하여 비강 내 면역을 시작하였다. 백신 항원은 PBS로 희석하여 마우스 한쪽 비강당 10 ㎕씩 총 20 ㎕ 사용하였다. 마우스는 2주 간격으로 3회 면역 접종을 받았고, 마지막 면역 접종 2주 후 항체반응을 결정하기 위해 혈청을 채취했다.
독감 항원-특이 항체 면역 반응은 효소 결합 면역 흡착 분석법 (ELISA)에 의해 측정되었으며, 마우스 혈청은 세 번째 면역 2주 후에 채취하였다. ELISA 플레이트 (Corning Laboratories, 3690)은 각각 sH1N1 (4 ㎍/ml)을 넣어 코팅 시킨 뒤 4℃에서 하룻밤 동안 정치시켰다. 다음 날, 플레이트는 세척 완충제인 PBS-T [PBS containing 0.05% of Tween20 (Thermo fisher scientific, cat. J20605-AP)]를 이용하여 3회 세척하고 blocking buffer [1 mM of EDTA (JUNSEI, cat. 17385S0401) 및 0.5% of BSA (Sigma, cat. A2153-50G) in PBS-T]를 넣어 상온에서 1시간 동안 블락킹 하여 항원, 항체의 비특이적 결합을 차단하였다. 마우스에서 채취한 혈청은 blocking buffer를 이용하여 계열 희석 (2-fold dilution)하고 well 당 40 ul 넣고 상온에서 2시간 반응시켜주었다. 상기 플레이트는 PBS-T를 이용하여 5번 세척하고, horseradish-peroxidase(HRP) conjugated anti-mouse IgG 항체를 넣고 상온에서 1시간 반응시키고 PBS-T로 플레이트를 세척하였다. 그 뒤 substrate인 TMB (BD OptEIA, cat.555214)를 넣고 발색이 되면 STOP 버퍼 (1N H2SO4)를 넣어 반응을 멈추게 하였다. 마이크로플레이트 판독기 (Molecular Devices Corporation, Menlo Park, CA)를 이용하여 450nm에서의 흡광도를 측정하였다. 항체 역가는 아무것도 넣지 않은 well보다 2배 높은 흡광도 값을 산출하여, 혈청 희석액의 reciprocal Log2값을 계산하였다.
실험결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, eukFlaBN83A, eukFlaBN83/101A, eukFlaBN83/101/139A, eukFlaBN83/101/139/273A, 및 eukFlaBN83/101/139/273/330A는 원핵세포에서 발현한 플라젤린 (prokFlaB)와 동일한 수준의 독감 항원-특이 항체의 생성을 유도하여 면역증강제 효능을 가짐을 확인하였다.
실시예 8: 원핵세포-발현 플라젤린과 진핵세포-발현 플라젤린에 대한 항체 생성능 비교 검증
실시예 7의 독감 백신 모델에서, 효소 결합 면역 흡착 분석법 (ELISA)을 통하여 플라젤린-특이 항체 면역 반응을 측정하였다. 구체적으로, 마우스 혈청은 세 번째 면역 2주 후에 채취하였다. ELISA 플레이트 (Corning Laboratories, 3690)은 각각 prokFlaB (1 ㎍/ml) 혹은 야생형 eukFlaB (1 ㎍/ml)을 넣어 코팅 시킨 뒤 4℃에서 하룻밤 동안 정치시켰다. 효소 결합 면역 흡착 분석법 (ELISA)은 실시예 7과 동일한 방법으로 실시하였다.
실험결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 원핵세포에서 발현한 플라젤린(prokFlaB)은 prokFlaB- 및 eukFlaB-특이 항체의 생성을 유도하지만 eukFlaB, eukFlaBN83/101/139A, eukFlaBN83/101/139/273A 및 eukFlaBN83/101/139/273/330A는 prokFlaB- 및 eukFlaB-특이 항체의 생성을 유도하지 않음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 eukFlaB 변형체는 생체 내에 반복적으로 투여하여 생물학적 제제인 플라젤린 자체에 대한 면역반응을 유도하지 않음으로써 보다 안전한 플라젤린 면역증강제를 제공할 수 있음을 확인하였다.
실시예 9: 탈당화된 진핵세포-발현 플라젤린 유도체의 안정성 검증
prokFlaB, eukFlaB 및 N-당화 돌연변이체 eukFlaB를 정제하고 -80 ℃, 4 ℃ 및 실온과 같은 상이한 온도에서 2주 동안 보관하였다. 단백질의 구조적 안정성과 기능성은 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 및 NF -κB 리포터 분석으로 각각 시험하였다.
실험 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 원핵세포에서 제작한 플라젤린(prokFlaB)에 비해 진핵세포에서 제작한 플라젤린은 보다 우수한 안정성이 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 eukFlaB 변형체는 생물학적 제제 생산, 유통 및 생체 내 투여 시 약동학적으로 보다 우수한 플라젤린 면역증강제를 제공할 수 있을 것으로 예상된다.
Claims (24)
- 서열번호 13의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아스파라긴 (Asparagine, N)이 알라닌 (Alanine)으로 치환된, 진핵세포에서 발현 가능한 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 13의 아미노산 서열에서 83, 101, 139, 273 및 330 번째 위치로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치의 아스파라긴이 알라닌으로 치환된 것인, 진핵세포에서 발현 가능한 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 14 내지 23의 아미노산 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 진핵세포에서 발현 가능한 폴리펩타이드.
- 제2항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는,
서열번호 13의 아미노산 서열에서 83번째 위치; 및
101, 139, 273 및 330 번째 위치로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치;
의 아스파라긴이 알라닌으로 치환된 것인, 진핵세포에서 발현 가능한 폴리펩타이드. - 제2항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는,
서열번호 13의 아미노산 서열에서 83 및 101 번째 위치; 및
139, 273 및 330 번째 위치로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치;
의 아스파라긴이 알라닌으로 치환된 것인, 진핵세포에서 발현 가능한 폴리펩타이드. - 제2항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는,
서열번호 13의 아미노산 서열에서 83, 101 및 139 번째 위치; 및
273 및 330 번째 위치로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치;
의 아스파라긴이 알라닌으로 치환된 것인, 진핵세포에서 발현 가능한 폴리펩타이드. - 서열번호 13의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아스파라긴 (Asparagine, N)이 알라닌 (Alanine)으로 치환된 폴리펩타이드를 포함하는, 백신용 면역보조제 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 13의 아미노산 서열에서 83, 101, 139, 273 및 330 번째 위치로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치의 아스파라긴이 알라닌으로 치환된 것인, 백신용 면역보조제 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 14 내지 23의 아미노산 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 백신용 면역보조제 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는,
서열번호 13의 아미노산 서열에서 83번째 위치; 및
101, 139, 273 및 330 번째 위치로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치;
의 아스파라긴이 알라닌으로 치환된 것인, 백신용 면역보조제 조성물. - 제8항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는,
서열번호 13의 아미노산 서열에서 83 및 101 번째 위치; 및
139, 273 및 330 번째 위치로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치;
의 아스파라긴이 알라닌으로 치환된 것인, 백신용 면역보조제 조성물. - 제8항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는,
서열번호 13의 아미노산 서열에서 83, 101 및 139 번째 위치; 및
273 및 330 번째 위치로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치;
의 아스파라긴이 알라닌으로 치환된 것인, 백신용 면역보조제 조성물. - 서열번호 13의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아스파라긴 (Asparagine, N)이 알라닌 (Alanine)으로 치환된 폴리펩타이드를 포함하는, 면역기능 증강용 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 13의 아미노산 서열에서 83, 101, 139, 273 및 330 번째 위치로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치의 아스파라긴이 알라닌으로 치환된 것인, 면역기능 증강용 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 14 내지 23의 아미노산 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 면역기능 증강용 조성물.
- 제14항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는,
서열번호 13의 아미노산 서열에서 83번째 위치; 및
101, 139, 273 및 330 번째 위치로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치;
의 아스파라긴이 알라닌으로 치환된 것인, 면역기능 증강용 조성물. - 제14항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는,
서열번호 13의 아미노산 서열에서 83 및 101 번째 위치; 및
139, 273 및 330 번째 위치로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치;
의 아스파라긴이 알라닌으로 치환된 것인, 면역기능 증강용 조성물. - 제14항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는,
서열번호 13의 아미노산 서열에서 83, 101 및 139 번째 위치; 및
273 및 330 번째 위치로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치;
의 아스파라긴이 알라닌으로 치환된 것인, 면역기능 증강용 조성물. - 서열번호 13의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아스파라긴 (Asparagine, N)이 알라닌 (Alanine)으로 치환된 폴리펩타이드를 포함하는, 자가면역 질환, 염증성 질환, 미생물 감염 또는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제19항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 13의 아미노산 서열에서 83, 101, 139, 273 및 330 번째 위치로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치의 아스파라긴이 알라닌으로 치환된 것인, 자가면역 질환, 염증성 질환, 미생물 감염 또는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제19항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 14 내지 23의 아미노산 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 자가면역 질환, 염증성 질환, 미생물 감염 또는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제20항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는,
서열번호 13의 아미노산 서열에서 83번째 위치; 및
101, 139, 273 및 330 번째 위치로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치;
의 아스파라긴이 알라닌으로 치환된 것인, 자가면역 질환, 염증성 질환, 미생물 감염 또는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 제20항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는,
서열번호 13의 아미노산 서열에서 83 및 101 번째 위치; 및
139, 273 및 330 번째 위치로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치;
의 아스파라긴이 알라닌으로 치환된 것인, 자가면역 질환, 염증성 질환, 미생물 감염 또는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 제20항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는,
서열번호 13의 아미노산 서열에서 83, 101 및 139 번째 위치; 및
273 및 330 번째 위치로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치;
의 아스파라긴이 알라닌으로 치환된 것인, 자가면역 질환, 염증성 질환, 미생물 감염 또는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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