KR20240054664A - 살충 및 살균 활성을 갖는 신규한 메타리지움 핑핸스 １５ｒ 균주 및 이의 용도 - Google Patents
살충 및 살균 활성을 갖는 신규한 메타리지움 핑핸스 １５ｒ 균주 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 살충 및 살균 활성을 갖는 신규한 메타리지움 핑핸스 15R 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 식물해충 및 식물병원균에 대한 방제활성을 동시에 갖는 신규한 메타리지움 핑핸스 15R 균주, 메타리지움 핑핸스 15R 균주를 유효성분로 포함하는 해충과 식물병 동시 방제용 조성물 및 메타리지움 핑핸스 15R 균주를 이용한 해충 및 식물병 동시 방제방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 메타리지움 핑핸스 15R 균주는 인축이나 환경 생태계에 안전한 해충 방제원으로서 작물에 유해한 해충과 다양한 식물병원균을 동시에 방제할 수 있어 새로운 생물학적 제제로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 식물 해충 및 식물병 병원균에 대한 살균 활성을 갖는 신규한 곰팡이 메타리지움 핑핸스 15R 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
식물 생육의 가장 큰 장애 요인으로 지적받고 있는 해충과 식물병을 방제하기 위하여 다양한 작물 보호제들이 사용되고 있으며, 더욱 효과적인 보호제의 개발을 위한 연구가 전 세계적으로 활발히 진행되고 있다. 식량 생산 등의 경제적인 목적뿐만 아니라 조경 목적을 위해서도 해충 및 식물병의 방제를 위한 작물 보호제는 매우 필수적으로 요구되고 있고, 그에 따른 경제적 비용도 매우 높은 실정이다. 현재까지 이러한 작물 보호제는 거의 대부분이 화학물질을 이용하여 개발되어 왔으며, 그로 인해 근래에는 이들 화학물질을 바탕으로 한 작물 보호제의 인축에 대한 위해성을 비롯하여 생태계 파괴 등의 다양한 부작용이 발생하고 있다. 이러한 작물보호제의 부작용을 해결하기 위하여 각종 친환경 방제 방법들이 개발되고 있으며, 그 중 주목 받고 있는 한 가지가 곤충병원성 미생물을 이용한 미생물 살충제의 개발과 이용이다.
미생물 살충제의 소재로 이용될 수 있는 미생물은 세균, 바이러스 및 곰팡이 등 다양한 미생물이 있으며, 그 중에서 곤충병원성 곰팡이는 가장 오랜 역사를 지니고 있다. 곤충병원성 곰팡이는 곤충에 병을 일으켜 치사시키는 미생물로서 곤충 기주에 침입하여 증식하는 과정 중에 다양한 세포외 효소나 독소물질 및 2차 대사산물들을 생산하여 기주 곤충의 면역 반응을 극복하거나, 기주를 치사시킬 수 있고 또한 다른 미생물들과의 경쟁에도 이용된다.
한편, 식물에 피해를 주는 해충과 병을 효과적으로 방제하기 위해서는 각각의 개별적 방제를 위한 작물보호제의 사용이 필수적으로 요구되고 있으나, 식물에 유해한 다양한 해충과 함께 식물병원균을 동시에 효과적으로 방제할 수 있는 작물 보호제의 개발이 미흡한 실정이다.
이에 본 발명자들은 복숭아혹진딧물로부터 신규한 곤충병원성 곰팡이 균주인 메타리지움 핑핸스 15R (Metarhizium pinghaense 15R)을 분리 및 동정하였고, 상기 균주의 포자와 대사산물이 복숭아혹진딧물, 목화진딧물, 무테두리진딧물, 점박이응애 및 뿌리혹선충과 같은 식물 해충에 대한 살충효과를 가질 뿐만 아니라 다양한 식물병원균에 대해 높은 항균활성이 있음을 확인함에 따라 이를 해충 및 식물병원균의 동시 방제를 위한 새로운 작물 보호제로 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 신규한 해충 및 식물병원균에 대한 방제활성을 동시에 갖는 메타리지움 핑핸스(Metarhizium pinghaense) 15R 균주(기탁번호: KACC83065BP)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 메타리지움 핑핸스(Metarhizium pinghaense) 15R 균주(기탁번호: KACC83065BP), 이의 포자, 상기 균주 배양물, 상기 균주 배양물에 대한 농축물 또는 상기 균주 배양물의 건조물을 유효성분로 포함하는, 해충 및 식물병 동시 방제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 해충 및 식물병 동시 방제용 조성물을 해충 및 식물병이 번식한 지역에 살포하는 단계를 포함하는, 해충 및 식물병 동시 방제방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 해충 및 식물병원균에 대한 방제활성을 동시에 갖는 메타리지움 핑핸스(Metarhizium pinghaense) 15R 균주(기탁번호: KACC83065BP)를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 해충은 복숭아혹진딧물, 목화진딧물, 무테두리진딧물, 점박이응애 또는 뿌리혹선충일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 식물병원균에 대한 방제활성은 식물병의 원인이 되는 진균 또는 세균에 대한 항진균 또는 항세균 활성일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 진균은 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea T3-4), 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum 15AS32) 또는 콜레토트리쿰 프루티콜라(Colletotrichum fructicola CGF160401)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세균은 클라비박터 미시가넨시스(C. michiganensis subsp. michiganensis)일 수 있다.
또한 본 발명은 메타리지움 핑핸스(Metarhizium pinghaense) 15R 균주(기탁번호: KACC83065BP), 이의 포자, 상기 균주 배양물, 상기 균주 배양물에 대한 농축물 또는 상기 균주 배양물의 건조물을 유효성분로 포함하는, 해충 및 식물병 동시 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 해충은 복숭아혹진딧물, 목화진딧물, 무테두리진딧물, 점박이응애 또는 뿌리혹선충일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 식물병은 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea T3-4), 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum 15AS32), 콜레토트리쿰 프루티콜라(Colletotrichum fructicola CGF160401) 또는 클라비박터 미시가넨시스(C. michiganensis subsp. michiganensis)에 의해 발생하는 것일 수 있다.
나아가 본 발명은 본 발명의 해충 및 식물병 동시 방제용 조성물을 해충 및 식물병이 번식한 지역에 살포하는 단계를 포함하는, 해충 및 식물병 동시 방제방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 지역은 토양 또는 작물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 작물은 가지, 고추, 토마토, 딸기, 배추, 배, 사과, 오이, 장미, 벚, 돈나무, 해당화, 매실, 초피나무, 귤, 감자, 고구마, 담배, 목화, 사철나무, 협죽도, 작살나무, 구기자나무, 참오동나무, 살구나무, 자두나무 또는 고욤나무일 수 있다.
본 발명의 메타리지움 핑핸스 15R 균주(기탁번호: KACC83065BP)는 복숭아혹진딧물, 목화진딧물, 무테두리진딧물, 점박이응애 및 뿌리혹선충에 대하여 우수한 살충 효과를 가지며 동시에 다양한 식물병원균에 대한 살균 활성도 가지고 있는 특징이 있다. 또한 본 발명의 메타리지움 핑핸스 15R 균주는 인축이나 환경 생태계에 안전한 해충 방제원으로서, 작물에 유해한 해충과 다양한 식물병원균을 동시에 방제할 수 있어 새로운 생물학적 제제로 유용하게 사용될 수 있어 농가의 경제성 향상에 크게 기여할 수 있다.
도 1은 메타리지움 핑핸스 15R 균주의 포자, 상기 균주의 출아포자, 균주 배양물에서 균체를 제거한 배양액, 포자와 배양액의 혼합액, 출아포자와 배양액의 혼합액에 대한 복숭아혹진딧물 살충력 평가 결과를 비교한 그래프이다.
도 2는 메타리지움 핑핸스 15R 균주를 액체배양한 배양액의 해충에 대한 살충효과를 확인한 것으로, 복숭아혹진딧물, 목화진딧물 및 무테두리진딧물에 대한 살충력 평가 결과를 비교한 그래프이다.
도 3은 메타리지움 핑핸스 15R 균주를 액체배양한 배양액의 점박이응애에 대한 살충력 평가 결과를 비교한 그래프이다.
도 4는 메타리지움 핑핸스 15R 균주를 액체배양한 배양액의 뿌리혹선충에 대한 살충력 평가 결과를 비교한 그래프이다.
도 5는 메타리지움 핑핸스 15R 균주를 액체배양한 배양액에 의한 보트리티스 시네레아에 대한 항진균 활성 결과를 비교한 그래프이다.
도 6은 메타리지움 핑핸스 15R 균주를 액체배양한 배양액에 의한 콜레토트리쿰 아쿠타툼(A)과 콜레토트리쿰 프루티콜라(B)에 대한 항진균 활성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7는 메타리지움 핑핸스 15R 균주의 액체배양액에 의한 클라비박터 미시가넨시스에 대한 항세균 활성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 메타리지움 핑핸스 15R 균주를 액체배양한 배양액의 해충에 대한 살충효과를 확인한 것으로, 복숭아혹진딧물, 목화진딧물 및 무테두리진딧물에 대한 살충력 평가 결과를 비교한 그래프이다.
도 3은 메타리지움 핑핸스 15R 균주를 액체배양한 배양액의 점박이응애에 대한 살충력 평가 결과를 비교한 그래프이다.
도 4는 메타리지움 핑핸스 15R 균주를 액체배양한 배양액의 뿌리혹선충에 대한 살충력 평가 결과를 비교한 그래프이다.
도 5는 메타리지움 핑핸스 15R 균주를 액체배양한 배양액에 의한 보트리티스 시네레아에 대한 항진균 활성 결과를 비교한 그래프이다.
도 6은 메타리지움 핑핸스 15R 균주를 액체배양한 배양액에 의한 콜레토트리쿰 아쿠타툼(A)과 콜레토트리쿰 프루티콜라(B)에 대한 항진균 활성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7는 메타리지움 핑핸스 15R 균주의 액체배양액에 의한 클라비박터 미시가넨시스에 대한 항세균 활성 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 식물해충 및 식물병원균에 대한 방제 활성을 동시에 갖는 신규한 메타리지움 핑핸스(Metarhizium pinghaense) 15R 균주(기탁번호: KACC83065BP)를 제공함에 특징이 있다.
본 발명에서 용어 “방제"는 농작물 해충 또는 식물병원균의 유의적인 사망률을 증가시키거나 성장률을 저해하는 물질의 능력을 의미한다.
식물을 재배함에 있어서 대표적인 장애 요인으로는 다양한 해충과 식물병이 있고, 이들 문제의 해결을 위해서 살충제와 살균제, 진균제 및 바이러스제제 등이 사용되고 있는데, 이러한 다양한 해충과 식물병들의 방제를 위해서는 각각의 방제제를 이용해야 하는 것이 현실이며 이들을 동시에 방제할 수 있는 효과적인 방제제는 거의 없는 실정이다.
이에 본 발명자들은 보다 효과적인 해충 및 식물병들을 동시에 방제할 수 있는 미생물 제제를 개발하기 위해 연구하던 중, 복숭아혹진딧물의 사육 과정에서 분리된 신균한 메타리지움 핑핸스(Metarhizium pinghaense) 15R 균주가 해충에 대한 우수한 살비력과 함께 다양한 식물병원균들에 대해 높은 항균 활성이 있음을 확인하였다.
그러므로 본 발명자들은 본 발명에서 분리 및 동정한 메타리지움 핑핸스(Metarhizium pinghaense) 15R 균주를 2022년 04월 15일자로 농촌진흥청 국립농업과학원 미생물은행(KACC)에 기탁하여 기탁번호 KACC83065BP를 부여받았다.
나아가 본 발명자들은 본 발명의 메타리지움 핑핸스 15R 균주에 대해 해충에 대한 살비활성을 확인하기 위한 실험을 수행하였는데, 메타리지움 핑핸스 15R 균주, 상기 균주를 배양하여 수득한 출아포자 및 이의 배양액(포자와 균사를 제거한 균주로부터 분비된 대사산물을 포함한 배양액)에 대한 해충의 살충력을 분석하였다.
그 결과, 본 발명의 메타리지움 핑핸스(Metarhizium pinghaense) 15R 균주의 포자, 출아포자, 배양액 모두 복숭아혹진딧물에 대해 높은 살충활성이 있음을 확인할 수 있었으며, 특히 배양액의 살충 효과가 매우 뛰어남을 확인하였다.
나아가 본 발명자들은 본 발명의 메타리지움 핑핸스 15R 균주 배양액에 대한 살충 활성을 포트 시험을 통해 수행하였는데, 그 결과, 상기 균주의 배양액은 복숭아혹진딧물 외에도 목화진딧물과 무테두리진딧물에 대해서 약 80% 이상의 높은 살충 활성을 보였고, 점박이응애의 성충과 약충 모두 처리 후 2일에 약 97% 이상의 높은 살비력을 보였다. 뿌리혹선충에 대해서도 균주 배양액 처리 후 1일에 약 94%, 처리 후 5일에 약 99%의 높은 살충 활성을 확인하였다.
따라서 본 발명자들은 상기 메타리지움 핑핸스(Metarhizium pinghaense) 15R 균주의 포자, 출아포자 및 상기 균주의 배양액 모두가 다양한 해충들을 방제하기 위한 방제제로 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 본 발명자들은 본 발명의 균주에 대한 항진균 또는 항세균 활성을 확인하기 위해, 딸기탄저병원균인 콜레토트리쿰 프루티콜라(Colletotrichum fructicola), 고추탄저병원균 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum), 잿빛곰팡이병원균인 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea), 식물궤양병균인 클라비박터 미시가넨시스(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis)에 대해 항균활성을 분석하였는데, 그 결과, 본 발명의 균주가 상기 식물병원균들에 대해 우수한 방제 활성이 있음을 확인할 수 있었다.
그러므로 본 발명은 해충 및 식물병원균에 대한 방제활성을 동시에 갖는 메타리지움 핑핸스(Metarhizium pinghaense) 15R 균주(기탁번호 KACC83065BP)를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 균주가 방제할 수 있는 해충으로는 이에 제한되지는 않으나, 복숭아혹진딧물, 목화진딧물, 무테두리진딧물, 점박이응애 또는 뿌리혹선충일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 균주는 식물병의 원인이 되는 진균 또는 세균에 대해 항진균 활성 또는 항세균 활성을 모두 갖는 특징이 있다.
본 발명에서 상기 진균의 종류는 이에 제한되지는 않으나, 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea T3-4), 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum 15AS32) 또는 콜레토트리쿰 프루티콜라(Colletotrichum fructicola CGF160401)일 수 있다.
본 발명에서 상기 세균은 클라비박터 미시가넨시스(C. michiganensis subsp. michiganensis)일 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 균주, 이의 포자, 상기 균주 배양물, 상기 균주 배양물에 대한 농축물 또는 상기 균주 배양물의 건조물을 유효성분로 포함하는 해충 및 식물병 동시 방제용 조성물을 제공할 수 있다.
상기 배양물은 통상적인 미생물의 배양방법에 의해 대량으로 배양하여 수득할 수 있으며, 배양배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄을 포함하는 배지를 사용할 수 있으며, 상기 탄소원으로는 전분, 수크로즈, 시트레이트, 말토스, 글루코스, 만니톨, 글리세롤 또는 자일로스를 사용할 수 있다.
또한, 상기 배양물은 본 발명의 균주를 포함하는 배양물 자체의 형태로도 사용할 수 있으며, 또는 균체를 제거하고 배양액만을 사용할 수 있으며, 또는 배양액 중의 배양 배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 또는 여과과정을 거칠 수 있으며, 이러한 단계는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다. 배양액 또는 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동(frozen)하거나 또는 냉동건조(lyophilized)하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.
본 발명의 상기 조성물은 실제 사용하기 적합한 안정적인 제제화를 목적으로 상기 기재한 유효성분(균주, 균주 배양물, 균주 배양액, 균주 배양물의 농축물 또는 균주 배양물의 건조물) 이외에 추가로 물, 담체, 희석제, 계면활성제, 약효증진제, 무기염류, 보조제, 결합제 및 증량제와 같은 물질을 1종 이상 더 포함할 수 있다.
상기 계면활성제는 분자 중에 친수성 분자단과 친유성 분자단을 동시에 갖는 양친매성 물질로서, 세정력, 분산력, 유화력, 가용화력, 습윤력, 살균력, 기포력 및 침투력이 우수하다는 특징을 갖는 것으로 이해되는 물질로서, 본 발명에 따른 모기 살충용 조성물 중의 유효성분(균주 또는 이의 배양물)이 효과적으로 약효를 발현하도록 수화, 현탁, 분산시키는 작용을 하는 것으로 이해될 수 있다.
상기 계면활성제로는 알킬벤젠설포네이트, 알킬나프탈렌설포네이트, 디알킬설포석시네이트, 리그닌설포네이트, 알킬나프탈렌설포네이트포르마린축합물, 폴리옥시알킬렌알킬페닐설포네이트와 같은 설포네이트의 나트륨염 또는 칼슘염, 알킬설페이트, 폴리옥시알킬렌알킬설페이트, 폴리옥시알킬렌알킬페닐설페이트와 같은 설페이트의 나트륨염 또는 칼슘염, 나프탈렌설포석시네이트, 폴리옥시알킬렌석시네이트와 같은 석시네이트의 나트륨염 또는 칼슘염 등의 음이온성 계면활성제, 에톡실화 알킬에테르, 폴리옥시알킬렌알킬페닐폴리머, 다중 알코올과 같은 비이온성 계면활성제가 단독으로 또는 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있으며, 이들은 모두 예시적으로 열거한 것들로서 이들 이외의 계면활성제가 사용될 수 있음은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 용이하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 증량제는 계면활성제와 함께 사용되어 상기 계면활성제를 흡착, 분상화할 수 있는 물질로서, 예를 들면, 전분, 대두박, 밀기울, 입상 섬유질, 유안, 규조토, 제올라이트, 벤토나이트, 탈크, 카올린, 파이로필라이트, 화이트카본 등이 단독 또는 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
상기 결합제는 조성물 내 성분들을 서로 결합시키는 물질로서, 예를 들면, 수용성 전분, 덱스트린, 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리아크릴산나트륨, 폴리비닐알코올, 아라비아검 또는 잔탄검 등이 단독 또는 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 해충 및 식물병 동시 방제용 조성물을 해충 및 식물병이 번식한 지역에 살포하는 단계를 포함하는, 해충 및 식물병 동시 방제방법을 제공한다.
본 발명의 상기 조성물을 살포하는 지역으로는 토양 또는 작물일 수 있으며, 상기 작물의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 작물은 가지, 고추, 배, 사과, 오이, 장미, 벚, 돈나무, 해당화, 매실, 초피나무, 귤, 감자, 담배, 목화, 사철나무, 협죽도, 작살나무, 구기자나무, 참오동나무, 살구나무, 자두나무 또는 고욤나무일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<준비예 및 실험방법>
해충 사육조건
복숭아혹진딧물(Myzus persicae) 및 무테두리진딧물(Lipaphis eryimi)은 봄배추를 공급하였고, 목화진딧물(Aphis gossypii)은 오이잎을 공급하여 온도 25℃, 상대습도 70%, 광조건 12L:12D 조건의 실험실 조건 하에서 사육하면서 미술용 브러쉬로 분리하여 실험에 사용하였다. 점박이 응애(Tetranychus urticae)는 강낭콩을 공급하고 온도 25℃, 상대습도 70%, 광조건 12L:12D 조건으로 실험실 조건 하에서 사육하면서 실험에 이용하였다. 뿌리혹선충(Meloidogyne incognita)은 과습한 환경을 막기 위해 상토와 모래를 1:1 비율로 섞어 재배한 토마토에 2령 약충을 20,000 ~ 50,000마리씩 접종하여 온실에서 상온 조건으로 사육하였다. 실험에 이용할 때는 감염된 기주 뿌리를 세척한 후 가위로 잘라 1% 차아염소산나트륨(NaOCl) 1리터에 섞은 후 믹서기로 잘게 갈아 체로 걸렀으며, 이를 수돗물로 세척하여 24 웰 플레이트에서 선충의 수를 파악하였다.
고체 배양
본 발명에서 분리 및 동정한 곰팡이 메타리지움 핑핸스(Metarhizium pinghaense) 15R의 고체배양은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 균주는 감자한천배지(potato dextrose agar, PDA) 플레이트 상에서 25℃에서 14일 동안 배양한 다음, PDA 플레이트에서 14일된 곰팡이 분생포자를 긁어내고 0.01% 트윈-80(Difco, USA) 용액에 물질을 재현탁시켜 수집하였다. 균사 잔해물을 제거하기 위해 상기 분생포자 현탁액을 격렬하게 교반하고 면거즈를 통해 여과시켰다. 혈구계산기를 사용하여 포자 농도를 측정하였다.
곡물 배지로는 기장을 비닐봉지에 담고 0.15% 시트릭산(citric acid)을 함유한 물을 곡물의 절반 부피로 부어주었다. 95℃에서 15분간 처리한 후, 121℃에서 30분간 고압멸균 처리하여 식혀주고, 액체 배양한 곰팡이를 접종하여 25℃ 조건으로 14일간 배양하였다. 곰팡이가 배양된 곡물을 0.02% 트윈-80 (Tween-80) 용액에 넣어 격렬하게 교반하고 분생포자를 수거한 후 혈구계수기를 이용하여 포자농도를 측정하였다.
액체 배양
고체 배양을 통해 얻어진 포자현탁액은 액체배지에 접종하기 전 SDAY (Saboraud dextrose agar with 1% yeast extract, pH 5.6) 배지에 0.05% 베노밀(benomyl, 95% active ingredient)이 첨가된 SDAY+B 배지에서 포자의 발아 여부를 확인하여, 90% 이상 생존율을 보이는 경우만 사용하였다. 포자현탁액을 PDB (potato dextrose broth, pH 5.6) 배지에 접종하고 25℃, 150 rpm, 암 조건에서 14일간 배양하였다. 14일간 배양된 배양산물을 원심분리하여 균체와 배양액을 분리하였고, 얻어진 배양액은 거름종이(filter paper, ADVANTEC, No. 2)로 1차 여과한 후, 항진균 활성 검정을 위해 배양액을 pH 5.6으로 조정하였다. pH 조절 후 0.45 um 필터를 이용한 2차 여과로 얻어진 순수한 배양액을 실험에 사용하였다. 출아포자(blastospore) 수거는 원심분리 후 분리된 균체를 멸균된 증류수로 2번 세척하여 배양액을 제거하고, 증류수를 본래의 배양액만큼 넣어준 후 균질화하여 현탁액을 제조하였다. 이후 멸균된 거즈로 균체를 제거하고 출아포자만을 수거하여 실험에 이용하였다.
곰팡이 게놈 DNA 추출
곰팡이의 게놈 DNA 추출은 화학적 분해방법을 부분 변형해서 수행하였다. 배지에서 증식된 곰팡이 균체를 액체질소와 막자사발을 이용하여 마쇄하고, 약 1 g의 균체 시료에 400ul의 용해완충액 (0.2 M Tris-HCl(pH 7.5), 0.5M NaCl, 10mM EDTA (pH 8.0), 1% w/v SDS)과 동량의 페놀-클로로포름-이소아밀알콜(phenol-chloroform-isoamylalcohol(25:24:1))을 섞고 5분 동안 강하게 교반하였다. 그 후, 9.800 x g로 8분간 원심 분리하고 상층액을 새로운 튜브로 옮기고, 1ul의 RNase (20 mg/ml, Sigma)를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 다시 동량의 페놀-클로로포름-이소아밀알콜(25:24:1)을 넣고 위와 같은 조건으로 원심분리하여 상층액을 취하였다. 상층액의 2.5배에 해당하는 100% 냉 알코올을 첨가한 후, 4℃에서 16.000x g, 10분간 원심분리하여 DNA 침전물을 얻었다. 얻어진 DNA 침전물은 70% 알코올로 세척하고 건조 후 멸균수 50ul를 넣어 녹였다.
분자생물학적 동정
분자생물학적 동정을 위해서 곰팡이의 게놈 DNA 추출은 PDA에서 2주간 자란 곰팡이 균체 일부를 fungal DNA extraction buffer (0.2 M Tris-Cl (pH 7.5), 0.5 M Nacl, 10 nM EDTA (pH 8.0) and 1% (w/v) SDS)를 처리한 후 phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1)로 원심분리하여 DNA를 정제하였다. 정제된 DNA 용액은 냉에탄올을 이용하여 침전시키고 원심분리 후 멸균 증류수에 녹여 실험에 이용하였다.
분리 균주의 분자생물학적 동정을 위한 PCR primer는 translation elongation factor 1-alpha (EF-1a) 부분의 증폭을 위한 EF1-983F (5' - GCYCCYGGHCAYCGTGAYTTYAT - 3‘) 와 EF1-2218R (5' - ATGACACCRACRGCRACRGTYTG - 3') 프라이머를 사용하였다. PCR 반응은 AccuPower PCR PreMix (Bioneer Co., Korea)를 이용하여 denaturation 94˚C 30초, annealing 55˚C 30초, extensio 72˚C 1분 30 cycles 조건으로 Thermal Cycler (TaKaRa, Japan)를 이용하여 수행하였다.
PCR 반응 후 증폭 산물은 1.0% agarose gel을 이용하여 전기영동 분석하고 Power Gel Extraction Kit (Dyne Bio Inc., Korea)를 이용하여 순수 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 Macrogen (Korea)사에 direct sequencing 의뢰하여 염기서열을 분석하였다. 염기서열은 Multalin (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)를 이용하여 정렬 한 다음 BLAST search tool을 이용하여 기 보고된 다른 곰팡이들 서열과 비교 분석하였다.
식물병원성 곰팡이
항진균 활성 실험에 사용된 식물병원성 곰팡이로는 잿빛곰팡이병균 보트리스 시네레아(Botrytis cinerea T3-4), 고추 탄저병균 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum 15AS32), 딸기 탄저병균 콜레토트리쿰 프루티콜라(Colletotrichum fructicola CGF160401)를 사용하였으며 이들은 충북대학교 식물진균병학 연구실에서 분양받아 사용하였고, 균주들은 PDA배지에 접종하고 보트리스 시네레아는 22℃, 나머지 균주는 25℃ 조건으로 배양하여 실험에 사용하였다.
식물병원성 세균
항세균 활성 실험에 사용된 식물병원성 세균인 토마토 궤양병균 클라비박터 미시가넨시스(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis LMG 7333)는 충북대학교 식물세균병학 연구실에서 분양받아 King's B medium (2% Proteose peptone no.3, 1% glycerol, 0.15% K2HPO4, 0.15% MgSO4·7H2O, pH 7.4)에서 27℃ 조건으로 배양하면서 실험에 사용하였다.
생물학적 검정(Bioassay)
곡물배지에서 형성된 곰팡이 포자와 액체배양을 통해 수득한 출아포자, 그리고 균사와 출아포자가 제거된 배양액을 각각 생물 검정에 사용하였다. 포자는 생존율이 90%를 초과하는 포자 현탁액을 생물 검정에 사용하였으며, 포자의 생존력은 SDAY+B 배지에서 결정되었다.
① 살충력 검정
곡물배지에서 형성된 포자 또는 액체 배양에서 형성된 출아포자를 이용한 복숭아혹진딧물 생물검정은 포자 현탁액을 복숭아혹진딧물 50마리에 스프레이하는 방법으로 접종하고, 7일 동안 매일 관찰하면서 사충을 수거하였다. 사충들은 표피에서 곰팡이의 발생이 육안으로 관찰될 경우에만 곰팡이에 의한 치사로 인정하였다. 생물검정은 3반복 수행하였다.
액체 배지에서 배양된 곰팡이의 출아포자 및 균사가 제거된 배양액을 이용한 복숭아혹진딧물 생물검정은 과습된 탈지면이 포함된 60 mm 페트리디쉬(petri dish)에 지름 25 mm로 잘린 배추잎을 놓고, 그 위에 진딧물 성충 20마리를 올려놓은 후에 0.02% 트윈-80을 함유한 균주의 배양액 5 uL를 피펫으로 충체에 딥핑하는 방법을 이용하였다. 진딧물은 접종 후 배양액을 제거하여 온도 25℃, 광조건 12L:12D, 습도 70% 조건으로 유지하고 24시간 간격으로 매일 관찰하였으며, 대조구로는 0.02% 트윈-80 용액만을 처리하였고 생물검정은 3반복 수행하였다.
뿌리혹선충에 대한 실내 약효 시험은 플레이트 웰당 30마리를 처리하고 배양액을 처리 후 암실에 두고 생충수와 사충수를 조사하였다.
복숭아혹진딧물, 목화진딧물, 무테두리진딧물 및 점박이응애에 대한 포트(pot) 시험은 배추, 오이, 또는 토마토를 정식한 포트에 각 해충을 투입한 후 배양액을 처리하고 생충수를 조사하여 방제가를 결정하였다.
② 곰팡이 배양액의 항진균 활성분석
곰팡이 균주 배양액의 항진균 활성 검정은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 보트리티스 시네레아(B. cinerea)를 PDA배지에서 배양하여 포자형성을 유도하고, 곰팡이 표면을 긁어 수확된 포자를 10% PDB배지를 이용하여 포자현탁액을 만들었다. 수거한 포자현탁액을 멸균된 거즈를 이용하여 보트리티스 시네레아(B. cinerea)의 균사를 제거하였으며, 포자를 혈구계수기(hemocytometer)로 계수하고 2 X PDB배지(pH 5.6)를 이용하여 약 2 × 104 포자/ml이 되도록 조절한 후, 96 웰 플레이트에 100 ul 접종하였다. 접종 후, 100% 곤충병원성 곰팡이 배양액과 멸균수로 희석한 1%, 10% 곤충병원성 곰팡이 배양액을 100 ul씩 접종하고, 22℃, 암조건에서 48시간 배양 후 595 nm에서 흡광도를 측정하여 보트리티스 시네레아(B. cinerea)의 생장을 관찰하였다. 이때 대조구는 배양액 대신 100 ul의 멸균수를 사용하였다. 또한 다른 식물병원성 곰팡이인 고추 탄저병균 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum 15AS32), 딸기 탄저병균 콜레토트리쿰 프루티콜라(Colletotrichum fructicola CGF160401)에 대한 항진균 활성도 동일한 방법으로 수행하였다.
③ 항세균 활성분석
본 발명의 곤충병원성 곰팡이 균주 배양액의 항세균활성 검정은 클라비박터 미시가넨시스(C. michiganensis subsp. michiganensis)를 배양하면서 KB배지(pH 7.4)에서 650 nm로 흡광도(O.D)를 측정하여 균수를 약 1 × 108 CFU/ml이 되도록 배양한 후, 2 X KB배지(pH 7.4)를 이용하여 약 5 × 105 CFU/ml로 조절한 다음, 96 웰 플레이트에 100 ul를 접종하였다. 접종 후, pH 7.4로 조절한 곤충병원성 곰팡이 배양액 100%와 멸균수로 희석한 1%, 10% 배양액을 100 ul씩 각각 접종하고 27℃에서 36시간 배양 후 650 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 대조구는 배양액 대신 100 ul의 멸균수를 사용하였다.
통계분석
살충활성과 항균활성 평가는 3회 반복 수행하였으며, 결과 값은 SPSS 통계프로그램으로 유의수준 0.05 이하로 유의성 검정을 하였다. 자료는 평균 ± 표준오차(SE)로 표시하였다.
<실시예 1>
해충 및 식물병원균에 대한 방제활성을 갖는 병원성 균주의 선발
실내 사육중인 복숭아혹진딧물에서 곰팡이 병이 관찰되어, 그로부터 곰팡이를 분리하였다. 곰팡이 포자로 뒤덮인 복숭아혹진딧물 사충으로부터 곰팡이 포자를 분리하여, 곤충병원성 곰팡이 선택배지인 SDAY+B 배지에 접종하고 25℃, 암조건에서 7일간 배양하였다. 선택배지에서 증식된 곰팡이는 다시 PDA배지 접종하고 25℃, 암조건에서 14일간 배양하였다.
분리된 곰팡이의 분자생물학적 동정을 위해 곰팡이 균체를 수거하고 DNA를 추출하여, EF1-a 영역에 대한 PCR 증폭 후 그 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열을 기 보고된 균주들과 비교 분석한 결과, 메타리지움 핑핸스 (Metarhizium pinghaense) 속 균주로 확인되었다. 이에 본 발명자들은 분리된 균주를 “메타리지움 핑핸스 15R(Metarhizium pinghaense 15R)”로 명명하고, 상기 본 발명의 메타리지움 핑핸스 (Metarhizium pinghaense) 15R 균주를 농촌진흥청 국립농업과학원 미생물은행(KACC)에 2022년 04월 15일자로 기탁하여 기탁번호 KACC83065BP를 부여받았다.
<실시예 2>
본 발명의 메타리지움 핑핸스 15R 균주의 해충에 대한 살충력 평가
본 발명자들은 본 발명에서 분리 및 동정한 메타리지움 핑핸스 15R 균주의 해충에 대한 살충효과를 하기와 같은 해충들을 대상으로 분석하였다.
<2-1> 복숭아혹진딧물에 대한 살충력
복숭아혹진딧물에 대한 살충력은 곡물배지에서 생산된 포자와 액체배양산물인 출아포자, 그리고 배양액(균사와 포자가 제거된 배양액)을 이용하여 평가하였다.
분석 결과, 곡물배지에서 생산된 포자와 배양액을 복숭아혹진딧물에 처리하고 7일 후 살충력을 비교한 결과, 포자는 약 98% 이상의 살충력을 보였고, 배양액은 약 96% 이상의 높은 살충력을 보였다. 또한 처리 후 3일째에는 배양액 처리군에서는 약 72%의 살충력이 확인되었고, 포자를 처리한 군에서는 약 22%의 살충력을 보여 배양액의 살충활성이 포자 보다 더 우수한 것을 알 수 있었다(도 1).
또한 배양액의 효과는 포자와 함께 처리되었을 때 처리 후 2일에서 4일에 뚜렷한 증대 효과를 보였다. 또한, 출아포자의 경우 단독 처리시에는 처리 후 7일에 약 84%의 살충력을 보였으나 배양액과 함께 처리되었을 때에는 거의 100%의 높은 살충력을 보였다. 출아포자와 배양액의 혼합처리 시, 매우 빠르고 높은 살충력이 나타남을 확인하였다.
이상의 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 메타리지움 핑핸스 (Metarhizium pinghaense) 15R 균주의 포자, 출아포자 및 배양액 모두에서 복숭아혹진딧물에 대해 높은 살충활성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다. 특히, 포자나 출아포자 보다 배양액의 살충 활성이 더욱 우수하다는 것을 알 수 있었다.
<2-2> 배양액의 다양한 해충에 대한 살충력 평가
상기 <2-1>의 결과를 통해 본 발명의 메타리지움 핑핸스 15R 균주의 배양액이 복숭아혹진딧물에 대해 우수한 살충력이 있음을 확인함에 따라 상기 배양액의 복숭아혹진딧물, 목화진딧물, 무테두리진딧물에 대한 살충 효과를 포트시험을 통해 분석하였다.
그 결과, 처리 후 3일째에 복숭아혹진딧물, 목화진딧물 및 무테두리진딧물 모두에 대해서 80% 이상의 높은 방제가를 보이는 것으로 나타났다(도 2).
또한, 점박이응애에 대한 살충력 분석도 수행하였는데, 그 결과, 성충과 약충 모두 처리 후 2일만에 약 97% 이상의 높은 살충력을 나타내었고(도 3), 뿌리혹선충에 대한 살충력을 실내 시험을 통해 평가한 결과에서도, 처리 후 1일째에 약 94%의 높은 살충력을 보였으며, 처리 후 5일에는 약 99%의 높은 살충 효과를 나타내었다(도 4).
이상의 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에서 분리 및 동정한 메타리지움 핑핸스 (Metarhizium pinghaense) 15R 균주는 상기 균주의 포자 및 배양액 모두가 다양한 식물 해충에 대해 우수한 살충력이 있다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 3>
본 발명의 메타리지움 핑핸스 15R 균주의 식물 병원균에 대한 항균활성 평가
나아가 본 발명자들은 메타리지움 핑핸스 15R 균주의 배양액을 대상으로, 다양한 식물병원균에 대한 항균 활성을 평가하였다.
<3-1> 식물병원성 곰팡이에 대한 항진균 활성 분석
메타리지움 핑핸스 15R 균주 배양액의 보트리티스 시네레아(B. cinerea)에 대한 항진균 활성을 확인하기 위해, PDB배지(pH 5.6)에서 2주간 액체 배양한 뒤 얻은 메타리지움 핑핸스 15R 균주 배양산물로부터 균체를 제거하고, 배양액을 pH 5.6 ± 0.2로 조절하였다. 얻어진 순수한 배양액을 이용하여 보트리티스 시네레아(B. cinerea)에 대한 항진균 활성을 분석하였다.
그 결과, 메타리지움 핑핸스 15R 균주 배양액을 농도별(100%(v/v), 10%(v/v), 1%(v/v))로 처리한 결과, 100% 및 10% 처리군에서 높은 항진균 활성이 관찰되었다(도 5).
또한, 본 발명자들은 본 발명의 메타리지움 핑핸스(Metarhizium pinghaense) 15R 균주에 대하여, 다른 식물병원성 곰팡이들에 대한 항진균 활성 여부를 확인하기 위해, 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum 15AS32) 및 콜레토트리쿰 프루티콜라(Colletotrichum fructicola CGF160401)에 대하여 상기 방법과 동일한 방법으로 분석하였다.
그 결과, 이들 두 종류의 식물병원성 진균 모두에 대해 본 발명의 메타리지움 핑핸스 15R 균주의 배양액은 항진균 활성이 있는 것으로 나타났으며, 구체적으로 콜레토트리쿰 아쿠타툼에 대해서는 상기 균주 배양액의 10%(v/v) 희석액에서도 항진균 활성이 나타났고, 콜레토트리쿰 프루티콜라에 대해서는 40%(v/v) 희석액에서도 비교적 높은 항진균 활성을 보였다(도 6).
이러한 결과들을 통해 본 발명자들은 본 발명의 메타리지움 핑핸스 (Metarhizium pinghaense) 15R 균주가 보트리티스 시네레아(B. cinerea) 뿐만 아니라 고추 탄저병균인 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum 15AS32) 및 딸기 탄저병균인 콜레토트리쿰 프루티콜라(Colletotrichum fructicola CGF160401)모두에 대해 우수한 항진균 활성이 있음을 확인할 수 있었다.
<3-2> 식물병원성 세균에 대한 항세균 활성분석
나아가 본 발명자들은 메타리지움 핑핸스 15R 균주 배양액의 식물궤양병균인 클라비박터 미시가넨시스(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis)에 대한 항세균 활성을 분석하였다.
그 결과, 처리한 배양액 농도에 따른 항세균 활성이 있는 것으로 나타났다(도 7). 이러한 결과는 본 발명의 메타리지움 핑핸스 (Metarhizium pinghaense) 15R 균주가 식물병원성 세균에도 항균 활성이 있음을 의미한다.
이상의 결과들을 종합해 보면, 본 발명에 따른 메타리지움 핑핸스 (Metarhizium pinghaense) 15R 균주는 균주 및 포자를 비롯한 배양산물들 모두가 복숭아혹진딧물, 목화진딧물, 무테두리진딧물, 점박이응애 및 고구마뿌리혹선충의 식물 해충에 대해 우수한 살충력을 가지고 있음을 알 수 있었고, 특히 상기 균주의 배양액은 식물병원성 곰팡이인 보트리티스 시네레아(B. cinerea), 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum 15AS32)과 콜레토트리쿰 프루티콜라(Colletotrichum fructicola CGF160401)에 대해서도 높은 항진균 활성을 가질 뿐만 아니라 식물병원성 세균인 클라비박터 미시가넨시스(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis)에 대해서도 항세균 활성이 있음을 알 수 있었다.
따라서 본 발명의 메타리지움 핑핸스 (Metarhizium pinghaense) 15R 균주는 해충뿐 아니라 식물병원균을 동시에 효과적으로 방제할 수 있는 유용한 균주임을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시 예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시 예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (11)
- 해충 및 식물병원균에 대한 방제활성을 동시에 갖는 메타리지움 핑핸스(Metarhizium pinghaense) 15R 균주(기탁번호: KACC83065BP).
- 제1항에 있어서,
상기 해충은 복숭아혹진딧물, 목화진딧물, 무테두리진딧물, 점박이응애 또는 뿌리혹선충인 것을 특징으로 하는 메타리지움 핑핸스(Metarhizium pinghaense) 15R 균주(기탁번호: KACC83065BP). - 제1항에 있어서,
상기 식물병원균에 대한 방제활성은 식물병의 원인이 되는 진균 또는 세균에 대한 항진균 또는 항세균 활성인 것을 특징으로 하는, 메타리지움 핑핸스(Metarhizium pinghaense) 15R 균주(기탁번호: KACC83065BP). - 제3항에 있어서,
상기 진균은 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea T3-4), 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum 15AS32) 또는 콜레토트리쿰 프루티콜라(Colletotrichum fructicola CGF160401)인 것을 특징으로 하는, 메타리지움 핑핸스(Metarhizium pinghaense) 15R 균주(기탁번호: KACC83065BP). - 제3항에 있어서,
상기 세균은 클라비박터 미시가넨시스(C. michiganensis subsp. michiganensis)인 것을 특징으로 하는, 메타리지움 핑핸스(Metarhizium pinghaense) 15R 균주(기탁번호: KACC83065BP). - 제1항의 균주, 이의 포자, 상기 균주 배양물, 상기 균주 배양물에 대한 농축물 또는 상기 균주 배양물의 건조물을 유효성분로 포함하는, 해충 및 식물병 동시 방제용 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 해충은 복숭아혹진딧물, 목화진딧물, 무테두리진딧물, 점박이응애 또는 뿌리혹선충인 것을 특징으로 하는 해충 및 식물병 동시 방제용 조성물. - 제6항에 있어서,
상기 식물병은 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea T3-4), 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum 15AS32), 콜레토트리쿰 프루티콜라(Colletotrichum fructicola CGF160401) 또는 클라비박터 미시가넨시스(C. michiganensis subsp. michiganensis)에 의해 발생하는 것을 특징으로 하는, 해충 및 식물병 동시 방제용 조성물. - 제6항의 해충 및 식물병 동시 방제용 조성물을 해충 및 식물병이 번식한 지역에 살포하는 단계를 포함하는, 해충 및 식물병 동시 방제방법.
- 제9항에 있어서,
상기 지역은 토양 또는 작물인 것을 특징으로 하는, 해충 및 식물병 동시 방제방법. - 제10항에 있어서,
상기 작물은 가지, 고추, 토마토, 딸기, 배추, 배, 사과, 오이, 장미, 벚, 돈나무, 해당화, 매실, 초피나무, 귤, 감자, 고구마, 담배, 목화, 사철나무, 협죽도, 작살나무, 구기자나무, 참오동나무, 살구나무, 자두나무 또는 고욤나무인 것을 특징으로 하는 해충 또는 식물병 방제 방법.
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