KR20240051965A

KR20240051965A - Th-302를 이용한 parp 억제제에 내성이 있는 환자의 치료

Info

Publication number: KR20240051965A
Application number: KR1020247008354A
Authority: KR
Inventors: 티엔양 치; 씽 리우; 찌엔씬 뚜안; 판잉 멍; 안룽 리
Original assignee: 아센타위츠 파마슈티컬즈 리미티드
Priority date: 2021-08-27
Filing date: 2022-08-26
Publication date: 2024-04-22
Also published as: JP2024531492A; CN118076359A; EP4393493A1; WO2023025312A1

Abstract

본 발명은 TH-302를 단독으로 사용하거나 병용하여 PARP 억제제에 내성이 있는 환자를 치료하기 위한 치료 방법, 약물 및 이의 약제학적 용도를 제공한다.

Description

TH-302를 이용한 PARP 억제제에 내성이 있는 환자의 치료

본 발명은 암 치료 방법에 관한 것으로, 특히 PARP 억제제(PARPi)에 내성이 있는 암 환자의 치료 방법에 관한 것이다.

PARPi 약물 올라파립(Olaparib)의 첫 번째 인체 임상 시험에서는 PARPi가 BRCA1/2 돌연변이를 갖는 종양 세포의 성장을 억제할 수 있다는 것을 처음으로 입증하였고, 이는 주로 합성치사 이론(Ashworth, A., & Lord, C. J. (2018). Synthetic lethal therapies for cancer: what's next after PARP inhibitors?. Nature reviews. Clinical oncology, 15(9), 564-576. https://doi.org/10.1038/s41571-018-0055-6)에 기반하는데, PARP 억제제는 PARP의 DNA 단일 가닥 손상 복구 기능을 억제할 수 있어 세포에서 대량의 단일 가닥 DNA 손상이 적시에 복구될 수 없게 된다. 복구되지 않은 단일 가닥 DNA 손상은 복제 분기점 붕괴를 유발하여 이중 가닥 DNA 손상을 일으킬 수 있고, 세포 독성이 비교적 강한 이중 가닥 DNA 손상은 정상 세포에서 BRCA1 및 BRCA2와 같은 단백질의 공동 참여에 의해 매개되는 상동 재조합 복구(HR) 경로를 통해 복구될 수 있지만, BRCA1/2 결핍 종양 세포에서 이중 가닥 DNA 손상은 복구될 수 없어 종양 세포의 최종 사멸을 일으킨다. PARPi는 초기에 방사선 치료 및 화학요법 감작을 위해 개발되었고, BRCA1/2 유전자 결핍 암을 치료하기 위한 단일 약물로서 PARPi의 개발을 뒷받침하는 전임상 연구도 있었다. 이로써 PARPi-BRCA 가설을 검증하기 위한 초기 표적 모집단으로 BRCA1/2 생식세포 돌연변이(gBRCA1/2) 보인자가 선택되었다. 난소암에 대한 PARPi의 초기 연구에는 이전에 백금 기반 화학요법을 받은 모집단이 등록되었고, 이 연구에서는 백금 민감도가 PARPi 반응과 직접적인 관련이 있다는 것을 발견하였다(백금 기반 화학요법 약물은 DNA 손상제로, DNA 교차결합을 일으키고, 일부는 HR 경로에 의해 복구될 수 있으며; 따라서, DNA 복구 결핍 종양은 백금 기반 화학요법에 민감할 것으로 예상됨). 다른 두 가지 PARPi: 니라파립(niraparib) 및 루카파립(rucaparib)은 난소암에 대해 승인되었는 바, BRCA1/2 상태에 관계없이 니라파립의 유지요법이 FDA 및 EMA에 의해 승인되었고; 루카파립도 이전에 2차 화학요법을 받은 BRCA1/2 돌연변이 관련 난소암 환자를 위한 선택 가능한 요법으로 FDA 및 EMA에 의해 등록되었으며; 탈라조파립 또한 BRCA 돌연변이/HER-2 음성 전이성 유방암 치료용으로 FDA에 의해 승인되었다(Mateo, J., Lord, C. J., Serra, V., Tutt, A., Balmaρa, J., Castroviejo-Bermejo, M., Cruz, C., Oaknin, A., Kaye, S. B., & de Bono, J. S. (2019). A decade of clinical development of PARP inhibitors in perspective. Annals of oncology: official journal of the European Society for Medical Oncology, 30(9), 1437-1447. https://doi.org/10.1093/annonc/mdz192).

PARPi의 임상 응용으로 인해 PARPi 내성은 곧 임상 응용에서 피할 수 없는 문제가 될 것이며, BRCAm(BRCA 돌연변이) 난소암 환자의 40% 이상이 PARPi의 혜택을 받지 못하고 있다. 기존 연구에서는 상동 재조합 복구(Homologous recombination repair restoration, HRR), DNA 복제 분기점 보호, PARPi 약동학 변화 등이 PARPi 내성의 주요 원인인 것으로 나타났다. PARPi 내성을 극복하고 PARPi 약물 민감도를 높이기 위해 다양한 조합 치료 수단이 개발되고 있으며, 그 중 다수의 조합 치료 수단이 임상 단계에 진입하였다. 주로 PARPi-DNA 알킬화제 조합; PARPi-종양 용해 단순 포진 바이러스(oHSVs) 조합; PARPi-이온화 방사선 조합; PARPi-면역요법 조합; PARPi-HSP90 억제제 조합; PARPi-WEE1/ATR 억제제 조합; PARPi-DNMTi 억제제 조합; PARPi-CDK 억제제 조합 등을 포함한다(He Li,Zhao-Yi Liu,Nayiyuan Wu,Yong-Chang Chen,Quan Cheng and Jing Wang.PARP inhibitor resistance: the underlying mechanisms and clinical implications.Mol Cancer,2020 Jun 20;19(1):107.2020. https://doi.org/10.1186/s12943-020-01227-0; Rose, M., Burgess, J. T., O'Byrne, K., Richard, D. J., & Bolderson, E. (2020). PARP Inhibitors: Clinical Relevance, Mechanisms of Action and Tumor Resistance. Frontiers in cell and developmental biology, 8, 564601. https://doi.org/10.3389/fcell.2020.564601).

TH-302(Evofosfamide, 에보포스파미드, cas 번호 918633-87-1)는 미국 스레숄드(Threshold)사에서 개발된 2-니트로이미다졸 유발 저산소 활성화 전구약물(HAP) 브로모이포스파미드이다. 저산소 조건에서 비활성 TH-302 전구약물은 독성이 높은 Br-IPM을 방출할 수 있다. TH-302는 광범위한 생체내 및 생체외 생물학적 활성 및 특이적인 저산소 선택적 활성화 활성을 가지고 H2AX 인산화 및 DNA 교차결합 활성을 유도하여 세포 주기 정지를 일으키므로, 그 화합물은 많은 제약회사와 과학연구소에서 항암제 개발을 위해 사용된다.

Meng F Y(Meng Fanying) 등이 발표한 연구 논문에서는 TH-302가 다양한 종양에 대해 광범위한 활성을 가지고 우수한 저산소 선택적 활성 강화 효과가 있음을 지적하였다. 연구에 따르면 저산소 조건 하에 32개의 인간 암 세포주에 대한 TH-302의 생체외 세포 독성이 모두 정상 산소 조건 하의 것보다 훨씬 강하고, 이는 그 화합물이 저산소 환경에서 암 세포에 대해 선택적 세포 독성을 가짐을 나타낸다. 단일 전자 환원 효소(POR)가 과발현된 인간 세포를 사용하여 저산소 조건에서 TH-302의 단일 전자 환원 효소 의존적 활성 강화 원리를 입증하였고, 하기 반응식 1과 같다.

반응식 1

시토크롬 P450 산화 환원 효소가 전구약물인 TH-302를 환원시켜 중간체인 라디칼 음이온을 얻은 후, 라디칼 음이온이 불안정하여 세포 독성을 갖는 세포 독소 Br-IPM으로 분해됨으로써 작용을 발휘한다. 그 단계의 핵심 단계는 단일 전자 환원 과정인데, 연구에서는 산소가 있으면 단일 전자 환원 과정이 역전된다는 것을 입증하였고, 즉, 산소가 있으면 단일 전자 환원 과정을 방해하므로, 저산소 환경에서만 TH-302가 환원되어 더 강한 세포 독성이 구비될 수 있다. 추가로 염기 절제, 뉴클레오티드 절제, 비상동 말단 연결 복구 또는 상동 말단 연결 복구가 결핍한 세포주(그 세포주는 상동 의존적 복구 결핍 세포주임)를 비롯한 차이니즈 햄스터 난소 세포 기반의 DNA 복구 돌연변이 세포주를 사용하여 TH-302의 생체외 세포 독성을 검출하였다. 연구에서는 상동 말단 연결 복구 단독 결손 또는 뉴클레오티드 절제와 함께 복구 결손된 세포주가 TH-302 저산소 민감도를 크게 증가시키지만, 염기 절제, 뉴클레오티드 절제 또는 비상동 말단 연결 복구 단독 결손된 세포주는 TH-302 민감도에 영향을 미치지 않는다는 것을 발견하였다. 그 발견과 일치하게, BRCA1, BRCA2 및 FANCA 결핍 세포의 생체외 실험에서도 TH-302에 대한 민감도 향상이 관찰되었고; 임상 시험에서도 TH-302가 BRCA 유전자 돌연변이가 있는 환자에 대해 더 나은 치료 효과를 갖는 것이 관찰되었다(Meng F, Evans J W, Bhupathi D, et al. Molecular and cellular pharmacology of the hypoxia-activated prodrug TH-302.[J]. Molecular Cancer Therapeutics, 2012, 11(3):740; Conroy, M., Borad, M. J., & Bryce, A. H. (2017). Hypoxia-Activated Alkylating Agents in BRCA1-Mutant Ovarian Serous Carcinoma. Cureus, 9(7), e1517. https://doi.org/10.7759/cureus.1517; WO2015013448A1, Treatment of pancreatic cancer with a combination of a hypoxia-acti vated prodrug and a taxane; WO2020007106A1, 에보포스파미드의 항암 의약 용도).

TH-302의 작용 메커니즘에 관한 이러한 연구에서, 특히 개시된 TH-302가 BRCA 돌연변이에 특히 민감하다는 사실은 TH-302 약물이 병용을 통해 PARPi 내성 결함을 극복할 수 있다는 것을 시사한다.

그러나 PCT/US2012/031677 출원(공개번호 WO2012135757A2, Methods for treating cancer, 출원인 미국 스레숄드사)에서 스레숄드사의 연구자는 TH-302와 PARPi 후보 약물 ABT-888(즉 Veliparib, CAS: 912444-00-9)을 사용하여 생체외 병용 연구를 수행하였고;

상이한 암 세포를 정상 산소 조건에서 ABT-888로 1시간 동안 전처리한 다음, 정상 산소 또는 저산소 조건에서 TH-302와 함께 2시간 동안 더 배양하였다. ABT-888의 존재 하에 3일 동안 배양한 후, Alamar Blue를 사용하여 세포 생존력을 결정하였다. 결과는 하기 표와 같다.

H460 세포주(인간 대세포폐암 세포) 결과:

HCT116 세포주(인간 결장암 세포) 결과:

A375 세포주(인간 악성 흑색종 세포) 결과:

상기 결과에 따르면, 생체외 세포 실험에서 TH-302와 ABT-888의 병용은 상가 효과가 없고, 즉 TH-302 활성은 실질적으로 ABT-888의 존재에 의해 영향을 받지 않는다.

그러나 PCT/US2019/065065 출원(공개번호 WO2020118251A2, 발명의 명칭 Hypoxia targeting compositions and combinations thereof with a parp inhibitor and methods of use thereof)에서는 저산소 활성화 약물 또는 이의 전구약물(예를 들어 아파지큐온(apaziquone), AQ4N, 에타니다졸(etanidazole), 에보포스파미드(evofosfamide(TH-302)), 니모라졸(nimorazole), 피모니다졸(pimonidazole), 포르피로마이신(porfiromycin), PR-104, 탈록소티닙(tarloxotinib), 티라파자민(tirapazamine))과 PARPi를 병용하면 상가 효과가 있다는 것을 지적하였고, 특히 티라파자민과 올라파립의 동물 체내 병용 투여 시험도 공개하였으며, 결과에 따르면 티라파자민 또는 PARPi의 단일 투여 방안에 비해 저산소 활성화 항암 전구약물인 티라파자민과 PARPi인 올라파립의 병용 투여 방안이 PDX 동물 모델의 종양 성장 속도를 유의하게 지연시킬 수 있고, 즉 저산소 활성화 항암 약물과 PARPi의 병용은 상가 효과가 있다.

즉, 상이한 연구의 시험에서 저산소 활성화 항암 전구약물과 PARPi의 병용이 상가 효과가 있는지 여부에 대해서는 여전히 의견이 많으며, 이는 상가 효과의 복잡성을 보여준다.

출원인의 연구진은 약효 시험에서 TH-302와 PARPi의 병용이 일부 동물 체내 종양 증식 억제 시험에서 상가 효과를 나타낸다는 것을 발견하였고, 이는 지난 2012년 스레숄드사에서 실시한 생체외 세포 실험 결과와 완전히 다르며, 따라서 출원인은 추가 연구를 진행하여 예기치 못한 추가 결과를 얻었는 바, TH-302 단일 제제는 PARPi에 내성이 있는 암 모델에 대해 우수한 치료 효과를 가질 수 있다는 것이다!

실험 결과에 기반하여, 본 발명은 하기와 같은 암 치료 방법을 제공한다.

치료 방법은, 식 (I)의 저산소 활성화 화합물을 함유하는 약물을 단독으로 사용하거나 병용하여 PARPi에 내성이 있는 암 또는 종양 환자를 치료하고:

식 (I),

상기 식 (I)에서, R은 각각 독립적으로 H, -CH₃, -CH₂CH₃으로부터 선택되며, X는 각각 독립적으로 Cl, Br, MsO, TsO와 같은 이탈 관능기로부터 선택된다.

치료 방법은, 식 (I)의 저산소 활성화 화합물을 함유하는 약물을 PARP 억제제와 병용하여 PARP 억제제에 내성이 있는 암 또는 종양 환자를 치료하고:

식 (I),

본 명세서에 따른 약물은 의약품 또는 제제를 의미하고, 제조된 의약품은 특정 용량 범위의 유효 성분인 식 (I)의 저산소 활성화 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물을 포함하고, 및/또는 제조된 약물은 특정 제형이고 특정 투여 방식으로 투여된다.

제조된 의약품, 약물, 제제는 약학적으로 허용 가능한 보조제 또는 부형제를 더 포함할 수 있다. 상기 약물은 임상적으로 투여되는 임의의 제형일 수 있고, 예를 들어 정제, 좌제, 분산정, 장용정, 츄어블정, 구강붕해정, 캡슐, 당의제, 과립제, 건조분말제, 경구액제, 소형 주사제, 동결건조분말 주사제 또는 대용량 주입제이다. 구체적인 제형 및 투여 방식에 따라, 상기 약물의 약학적으로 허용 가능한 보조제 또는 부형제는 희석제, 가용화제, 붕해제, 현탁화제, 윤활제, 결합제, 충전제, 향미제, 감미제, 항산화제, 계면활성제, 방부제, 코팅제 및 색소 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

TH-302 또는 이의 유사한 화합물 과 관련된 제제는 경구 제제, 동결건조 제제 및 농축 주사액을 포함하고, 관련 처방, 제조 방법 및 임상 적합성, 투여 방법은 스레숄드사의 관련 특허: WO2010048330A1, WO2012142520A2, WO2008083101A1에 상세히 기재되고 공개되어 있으며, 여기서 본 발명은 상기 출원서류의 전문을 인용한다.

TH-302 또는 이의 유사한 화합물 은 DNA 알킬화제 항암제로, 광범위한 암 치료 잠재력을 가지고, 이와 관련된 암 적응증 실험, 임상 시험은 스레숄드사 및 다른 제약회사의 관련 특허 출원서류(예를 들어 WO2016011195A2, WO2004087075A1, WO2007002931A1, WO2008151253A2, WO2009018163A1, WO2009033165A2, WO2010048330A2, WO2012142520A1, WO2008083101A2, WO2020007106A1, WO2020118251A1, WO2014169035A1, WO2013116385A1, WO2019173799A2, WO2016081547A1, WO2014062856A1, WO2015069489A1, WO2012006032A2, WO2018026606A2, WO2010048330A2, WO2015171647A1, WO2013096687A1, WO2013126539A2, WO2013096684A2, WO2012009288A2, WO2012145684A2, WO2016014390A2, WO2019055786A2, WO2012135757A2, WO2015013448A2, WO2016011328A2, WO2013177633A2, WO2016011195A2, WO2015051921A2) 및 FDA 등록 임상 시험(NCT02402062, NCT02020226, NCT02076230, NCT01381822, NCT02093962, NCT01440088, NCT02255110, NCT02342379, NCT01864538, NCT01149915, NCT02433639, NCT00743379, NCT01485042, NCT01721941, NCT02047500, NCT00742963, NCT01497444, NCT00495144, NCT01746979, NCT01144455, NCT01403610, NCT01522872, NCT01833546, NCT02598687, NCT03098160, NCT02496832, NCT02712567)에 공개되어 있으며, 여기서 본 발명은 상기 관련 출원서류 및 임상 시험 정보를 모두 인용한다.

"암"은 침습을 통해 국소적으로 확장되고 전이를 통해 전신적으로 확장될 수 있는 무제한 성장 가능성이 있는 백혈병, 림프종, 암 및 다른 악성 종양(고형 종양 포함)을 의미한다.

TH-302 또는 이의 유사한 화합물 에 의해 치료될 수 있는 암의 구현예는 부신암, 골암, 뇌암, 유방암, 기관지암, 결장암 및/또는 직장암, 담낭암, 두경부암, 신장암, 후두암, 간암, 폐암, 신경조직암, 췌장암, 전립선암, 부갑상선암, 피부암, 위암, 갑상선암을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 암의 다른 일부 구현예는 급성 및 만성 림프구성 및 과립구성 종양, 선암, 선종, 기저세포암, 자궁경부이형성증 및 상피내암, 유잉육종, 표피양암종, 거대세포종, 다형성 교모세포종, 털세포 종양, 장신경절세포종, 증식성 각막 신경 종양, 섬세포암종, 카포시육종, 평활근종, 백혈병, 림프종, 악성 유암종, 악성 흑색종, 악성 고칼슘혈증, 마르파노이드 종양, 수질상피암종, 전이성 피부암, 점막신경종, 골수종, 균상식육종, 신경아세포종, 골육종, 골원성 및 다른 육종, 난소 종양, 갈색세포종, 진성 적혈구증가증, 원발성 뇌종양, 소세포폐암, 궤양성 및 유두상 편평세포암종, 증생, 정상피종, 연부조직육종, 망막모세포종, 횡문근육종, 신세포암종, 국소 피부 병변, 세망세포육종 및 윌름스 종양을 포함한다.

PARP는 효소 중 하나로, 정식 명칭은 폴리 ADP-리보스 중합효소(Poly ADP-ribose Polymerase, PARP)이다. PARP는 DNA 복구 효소로, DNA 복구 경로에서 핵심 작용을 한다. PARP는 DNA가 손상 및 파손될 때 활성화되고, DNA 손상의 분자 센서로서 DNA 파손 위치를 식별하고 결합하여 수용체 단백질의 폴리 ADP 리보실화 작용을 활성화하고 촉매하며 DNA 복구 과정에 참여한다.

PARP 억제제는 PARP 효소의 작용을 억제하여 "수리공"에 해당하는 이러한 PARP 효소를 정상적으로 작동할 수 없도록 하고, DNA 손상이 복구되지 않으면 세포는 사멸하게 된다.

세포에는 PARP라는 "수리공"이 한 명만 있는 것이 아니기 때문에, PARP에 문제가 생겨 세포의 DNA 손상이 다음 공정으로 넘어가더라도 DNA를 복구할 수 있는 또 다른 "수리공"이 기다리고 있다. BRCA 유전자에 의해 생성된 단백질은 이 다른 "수리공"의 중요한 구성원이다. 정상 세포에는 이중 보험 메커니즘이 있는데, PARP 억제제가 보험 메커니즘 중 하나를 파괴하더라도 다른 하나는 여전히 작동할 수 있으므로 세포는 사멸하지 않는다.

그러나 BRCA 유전자 돌연변이가 있는 난소암이나 유방암 세포에서는 BRCA라는 "수리공"이 더 이상 정상적으로 작동할 수 없게 된다. 물론 PARP팀이 아직 작동 중이기 때문에 암 세포는 사멸하지 않는다.

PARP 억제제를 사용하여 암 세포에 특이적으로 침투하면, PARP 효소 활성이 억제되어 정상적으로 작동할 수 없고, 암 세포의 DNA를 복구할 수 없다. 이로써, PARP 억제제는 정상 세포가 아닌 암 세포만 사멸하는 효과를 구현한다.

PARP 억제제+BRCA 유전자 돌연변이가 동시에 발생하면, 소위 "합성치사(Synthetic Lethality)"가 발생하는데, 합성치사란 두 가지 서로 다른 유전자(BRCA)나 단백질(PRAP)이 동시에 변하여 세포 사멸을 일으키는 것으로, 두 가지 유전자/단백질 중 하나만 비정상인 경우에는 세포 사멸을 일으키지 않는다.

PARP 억제제는 PARP 효소에 대해 억제 작용이 있는 화합물이며, 즉 PARP 효소 활성을 억제할 수 있는 모든 물질이 PARP 억제제이다.

이미 시판 중인 5개의 약물 올라파립(Olaparib), 루카파립(Rucaparib), 니라파립(Niraparib), 탈라조파립(Talazoparib), 플루조파립(Fluzoparib) 및 임상 3상에 진입한 약물 파미파립(Pamiparib)에서 선택되며, 분명히 여기서 말하는 PARP 억제제는 실질적으로 PARP 억제제 활성 성분을 함유하는 약물을 의미하는 것이다.

탈라조파립(Talazoparib)은 유해하거나 유해한 것으로 의심되는 생식세포 BRCA 돌연변이(gBRCAm) HER2 음성 국소 진행성 또는 전이성 유방암이 있는 성인에게 적용된다. 시판 중인 0.25mg/1mg의 탈라조파립 토실레이트 캡슐을 1일 1회, 1회 1mg 경구 투여하고, 이상반응이 나타날 경우 치료 중단 또는 용량 저감을 고려해야 한다.

처음으로 이상반응이 나타날 경우, 경구 용량을 1일 1회, 1회 0.75mg(0.25mg 캡슐 3개)으로 저감하고;

두 번째로 이상반응이 나타날 경우, 경구 용량을 1일 1회, 1회 0.5mg(0.25mg 캡슐 2개)으로 저감하며;

세 번째로 이상반응이 나타날 경우, 경구 용량을 1일 1회, 1회 0.25mg(0.25mg 캡슐 1개)으로 저감한다.

니라파립(Niraparib)은 백금 민감성 재발성 상피성 난소암, 나팔관암 또는 원발성 복막암 성인 환자가 백금 함유 화학요법에 의해 완전히 완화되거나 부분적으로 완화된 후의 유지요법에 사용된다. 시판 중인 100mg의 니라파립 토실레이트 캡슐을 질환이 진행되거나 견딜 수 없는 이상반응이 나타날 때까지 1일 1회, 1회 300mg 경구 투여하고, 이상반응이 나타날 경우 치료 중단 또는 용량 저감을 고려해야 한다.

용량 저감은 먼저 1일 3캡슐(300mg)에서 1일 2캡슐(200mg)로 저감하고;

용량 추가 저감이 필요한 경우, 1일 2캡슐(200mg)에서 1일 1캡슐(100mg)로 두 번째로 용량을 저감할 수 있으며;

투여 중단 및 용량 저감 시 이상반응이 조절되지 않는 경우에는 투여 중단을 권장한다.

루카파립(Rucaparib)은 종양에 특정 유전자 돌연변이(유해한 BRCA)가 있고 두 가지 이상의 화학요법 약물로 치료를 받은 진행성 난소암 여성에게 사용된다. 시판 중인 정제는 200mg, 250mg, 300mg의 세 가지 규격이 있다. 권장 용량은 식사 후 또는 식사 없이 1일 2회, 1회 600mg 경구 투여한다. 질환이 진행되거나 허용할 수 없는 독성이 나타날 때까지 치료를 계속한다. 이상반응이 나타날 경우 치료 중단 또는 용량 저감을 고려해야 한다.

올라파립(Olaparib)은 생식세포 또는 체세포 BRCA 돌연변이(gBRCAm 또는 sBRCAm)가 있는 진행성 상피성 난소암, 나팔관암 또는 원발성 복막암 초기 치료 성인 환자가 백금 함유 화학요법에 의해 완전히 완화되거나 부분적으로 완화된 후의 유지요법; 백금 민감성 재발성 상피성 난소암, 나팔관암 또는 원발성 복막암 성인 환자가 백금 함유 화학요법에 의해 완전히 완화되거나 부분적으로 완화된 후의 유지요법에 사용된다. 시판 중인 정제는 150mg 및 100mg의 두 가지 규격이 있다. 권장 용량은 1일 2회, 1회 300mg(150mg 정제 2개)이고, 상응하게 1일 총 용량이 600mg이다. 100mg 정제는 용량 저감 시 사용된다.

메스꺼움, 구토, 설사, 빈혈과 같은 이상반응을 처리하기 위해 치료 중단 또는 용량 저감을 고려할 수 있고;

용량 저감이 필요한 경우, 권장 용량을 1회 250mg(150mg 정제 1개, 100mg 정제 1개), 1일 2회 복용(상응하게, 1일 총 용량 500mg)으로 저감하며;

용량 추가 저감이 필요한 경우, 권장 용량을 1회 200mg(100mg 정제 2개), 1일 2회 복용(상응하게, 1일 총 용량 400mg)으로 저감한다.

플루조파립(Fluzoparib)은 2차 이상 화학요법을 받은 생식세포 BRCA 돌연변이(gBRCAm)가 있는 백금 민감성 재발성 난소암, 나팔관암 또는 원발성 복막암 환자의 치료에 사용된다. 시판 중인 캡슐제의 규격은 50mg이다.

임상에 진입한 기타 개발 중인 PARPi 후보 약물에 대해서는 웹링크 https://www.selleckchem.com/PARP.html 및 관련 학술 논문을 참조바란다.

암 치료를 위한 TH-302 또는 이의 유사한 화합물 의 권장 용량에 대해서는 스레숄드사 및 다른 제약회사의 특허 출원서류(예를 들어 WO2016011195A2, WO2004087075A1, WO2007002931A1, WO2008151253A2, WO2009018163A1, WO2009033165A2, WO2010048330A2, WO2012142520A1, WO2008083101A2, WO2020007106A1, WO2020118251A1, WO2014169035A1, WO2013116385A1, WO2019173799A2, WO2016081547A1, WO2014062856A1, WO2015069489A1, WO2012006032A2, WO2018026606A2, WO2010048330A2, WO2015171647A1, WO2013096687A1, WO2013126539A2, WO2013096684A2, WO2012009288A2, WO2012145684A2, WO2016014390A2, WO2019055786A2, WO2012135757A2, WO2015013448A2, WO2016011328A2, WO2013177633A2, WO2016011195A2, WO2015051921A2) 및 FDA 등록 임상 시험(NCT02402062, NCT02020226, NCT02076230, NCT01381822, NCT02093962, NCT01440088, NCT02255110, NCT02342379, NCT01864538, NCT01149915, NCT02433639, NCT00743379, NCT01485042, NCT01721941, NCT02047500, NCT00742963, NCT01497444, NCT00495144, NCT01746979, NCT01144455, NCT01403610, NCT01522872, NCT01833546, NCT02598687, NCT03098160, NCT02496832, NCT02712567) 중의 용량을 참조할 수 있고,

120mg/m² 내지 460mg/m²의 1일 용량으로 정맥 주사를 통해 투여되며;

480mg/m² 내지 약 670mg/m² 또는 예를 들어 575mg/m²의 1주 용량으로 정맥 주사를 통해 투여된다.

임상 시험에 사용된 TH-302(투여용 농축액)는 TH-302의 멸균 액체 제제이다. TH-302는 70% 무수 에탄올, 25% 디메틸아세트아미드 및 5% 폴리소르베이트 80으로 제조되었다. 이는 제조자에 의해 고무 마개와 플립오프씰(flip-off seal)을 갖춘 10mL 유리 바이알로 제공된다. TH-302 의약품은 눈에 보이는 입자가 기본적으로 포함되지 않은 투명한 무색 내지 담황색 용액이다. 공칭 총량이 650mg인 TH-302의 경우, 각각의 1회용 바이알에는 공칭 충전 부피가 6.5mL인 TH-302 의약품(100mg/mL에 해당)이 함유되고, 제조 번호(batch number), 투여 경로, 필수 보관 조건, 제조자 이름 및 관련 규정에서 요구하는 적절한 조기 경보 표시가 명시되어 있는 라벨이 명확하게 붙어 있다. 투여 전에 약국 매뉴얼에 따라 희석해야 한다.

원하는 최종 농도를 얻기 위해 투여 전에 시판되는 5% 포도당 수용액으로 총 부피 500mL(총 용량 ≥1000mg의 경우 1000mL)로 희석한다. 디(2-에틸헥실)프탈레이트(DEHP 없음)가 없는 5% 포도당 수용액으로 각각의 TH-302를 제조하고, DEHP가 없는 정맥 주입 투여 장치를 사용하여 정맥내에 점적주입한다.

물론 스레숄드사에서 개발된 동결건조 제제를 사용할 수도 있고,

TH-302(100mg) 및 수크로스(1g)의 용액(20mL)을 동결건조 바이알에 첨가하고 동결건조하여 TH-302의 동결건조 단위 제형을 생산하고, 약물 로딩은 5mg/cm³ 미만이다. 인간에게 투여하는 경우, 단위 제형을 5% 포도당 주사액에 용해시키고 그 용액의 적당량을 환자에게 투여하며;

후속적으로 인간 환자를 대상으로 한 TH-302의 1상 임상 시험 투여 방안은 동결건조 제제를 사용하고, 100mL의 유리 바이알에 주사용 TH-302 동결건조 제제를 준비하며, 약물 로딩은 100mg/100ml이고, 2℃ 내지 8℃의 통제된 조건에서 보관하며, 사용 시 동결건조 제제병에 250mL의 5% 포도당 주사액을 주입하고, 주입 펌프를 통해 30분 이내에 정맥내에 점적주입한다.

단독으로의 사용은, 즉 단일요법이다. 병용은, 즉 병용요법이다. 단일요법이란 한 치료 과정에서 하나의 항암제만을 사용하는 것을 말한다. 병용요법이란 한 치료 과정에서 두 가지 이상의 항암제를 동시에 또는 순차적으로 사용하는 것을 말한다.

일반적으로, 병용요법은 질환의 특성과 병용 약물의 종류에 따라 다양한 투여량과 투여 주기를 탐색해야 하고, 위와 같은 조건을 토대로 탐색된 병용요법 방안만이 단일요법 방안보다 더 나은 치료 효과를 얻을 수 있다.

단일요법 및 병용요법 방안의 약물 투여량과 투여 주기는 상기 TH-302 및 이의 유사한 화합물과 PARPi의 용량, 투여 방안을 참조하여 임상 시험을 통해 탐색되어야 한다.

추가적으로, 상기 환자는 DNA 복구 효소가 손상되었다.

관련 연구 문헌에 따르면, DNA 복구 효소 손상은,

상동 재조합 DNA 복구 효소(homologous recombination repair) 손상,

뉴클레오티드 절제 복구 효소(nucleotide excision repair) 손상,

비상동 말단 연결 효소 손상(nonhomologous end joining),

염기 절제 복구 효소(base excision repair) 손상,

미스매치 복구 효소(mismatch repair) 손상, 및

판코니 빈혈(Fanconi's anemia) 경로 복구 효소 손상 중 하나 이상으로부터 선택된다.

바람직하게는 상동 재조합 DNA 복구 효소 손상, 뉴클레오티드 절제 복구 효소 손상, 염기 절제 복구 효소 손상 중 하나 이상이고, 보다 바람직하게는 단독 상동 재조합 DNA 복구 효소 손상이거나 상동 재조합 DNA 복구 효소 손상과 뉴클레오티드 절제 복구 효소 손상을 동시에 갖는다.

추가적으로, 상기 환자의 종양 또는 암 조직에서 BRCA1, BRCA2에 대응되는 유전자 중 임의의 1개의 유전자 돌연변이 또는 2개의 유전자 돌연변이가 있는 것으로 검출되거나; 또는 상기 환자는 BRCA1, BRCA2에 대응되는 유전자 중 임의의 1개의 유전자 돌연변이 또는 2개의 유전자 돌연변이가 있는 것으로 확인된다.

BRCA1, BRCA2에 대응되는 유전자 중 임의의 1개의 유전자 돌연변이 또는 2개의 유전자 돌연변이는 시판되는 (동반) 진단 키트를 통해 검출될 수 있고,

올라파립(Olaparib) 파트너 검출 키트 BRACAnalysisCDx는, 그 유전자 검출을 통해 난소암 환자의 혈액 샘플에서 BRCA 유전자 돌연변이를 발견하는 데 사용되며;

BRCA1/2 유전자 돌연변이 검출 키트(조합 프로브-앵커 합성 시퀀싱 방법)는 임상적으로 난소암 및 유방암으로 진단된 환자에서 BRCA1/2 유전자의 엑손 영역 및 인접 인트론 영역의 생식계열 돌연변이를 정성적으로 검출하는 데 사용되고;

인간 BRCA1 유전자 및 BRCA2 유전자 돌연변이 검출 키트(가역적 말단 종결 시퀀싱 방법)는 PARP 억제제 올라파립 정제의 관련 약물 사용 지침에 사용될 수 있다.

BRCA1, BRCA2 돌연변이는 생식세포 돌연변이(gBRCAm) 및 체세포 돌연변이(sBRCAm)의 BRCA1, BRCA2 돌연변이를 포함한다.

식 (I)의 저산소 활성화 화합물은,

(TH-302), 및 의 구조의 화합물로부터 선택되는 것이고, 특히, TH-302가 바람직하다.

추가적으로, 상기 암 또는 종양은 난소암, 유방암, 췌장암, 나팔관암, 원발성 복막암, 위암, 전립선암, 폐암, 간암, 결장암, 직장암, 방광암 등으로부터 선택되고, 상기 폐암은 바람직하게는 비소세포폐암, 소세포폐암이다.

치료 방법은, 하기 식의 저산소 활성화 화합물을 함유하는 약물을 단독으로 사용하여 올라파립(Olaparib)에 내성이 있는 난소암, 유방암, 췌장암, 나팔관암, 원발성 복막암, 위암, 전립선암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 간암, 결장암, 직장암, 또는 방광암 환자를 치료하고:

상기 환자의 종양 또는 암 조직에서 BRCA1, BRCA2에 대응되는 유전자 중 임의의 1개의 유전자 돌연변이 또는 2개의 유전자 돌연변이가 있는 것으로 검출되거나; 또는 상기 환자는 BRCA1, BRCA2에 대응되는 유전자 중 임의의 1개의 유전자 돌연변이 또는 2개의 유전자 돌연변이가 있는 것으로 확인된다.

치료 방법은, 하기 식의 저산소 활성화 화합물을 함유하는 약물을 올라파립(Olaparib)과 병용하여 올라파립(Olaparib)에 내성이 있는 난소암, 유방암, 췌장암, 나팔관암, 원발성 복막암, 위암, 전립선암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 간암, 결장암, 직장암, 또는 방광암 환자를 치료하고:

치료 방법은,

PARP 억제제에 내성이 있는 암 또는 종양 환자의 BRCA1, BRCA2유전자 돌연변이 상황을 검출하는 단계; 및

상기 환자에게 BRCA1, BRCA2 유전자 돌연변이가 있는 경우, 식 (I)의 저산소 활성화 화합물을 함유하는 약물을 단독으로 사용하거나 PARP 억제제와 병용하여 치료하는 단계를 포함하고:

식 (I),

바람직하게는, 상기 유전자 돌연변이의 TMB(종양 돌연변이 부담) 수준은 중간이다.

단독으로 사용하거나 PARP 억제제와 병용하여 환자의 암을 치료하기 위한 약물의 제조를 위한 식 (I)의 저산소 활성화 화합물의 용도가 제공된다:

식 (I),

상기 환자는 PARP 억제제에 내성이 있는 환자이고;

상기 약제학적 용도에서, 상기 환자는 DNA 복구 효소가 손상되었거나; 또는

상기 환자의 종양 또는 암 조직에서 BRCA1, BRCA2에 대응되는 유전자 중 임의의 1개의 유전자 돌연변이 또는 2개의 유전자 돌연변이가 있는 것으로 검출되거나; 또는

상기 환자는 BRCA1, BRCA2에 대응되는 유전자 중 임의의 1개의 유전자 돌연변이 또는 2개의 유전자 돌연변이가 있는 것으로 확인된다.

상기 약제학적 용도에서, 상기 식 (I)의 저산소 활성화 화합물은,

의 구조의 화합물로부터 선택되는 것이거나; 또는

상기 PARP 억제제는 올라파립(Olaparib), 루카파립(Rucaparib), 니라파립(Niraparib), 탈라조파립(Talazoparib), 플루조파립(Fluzoparib), 파미파립(Pamiparib)으로부터 선택되거나; 또는

상기 암 또는 종양은 난소암, 유방암, 췌장암, 나팔관암, 원발성 복막암, 위암, 전립선암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 간암, 결장암, 직장암, 방광암으로부터 선택되거나; 또는

상기 유전자 돌연변이의 TMB(종양 돌연변이 부담) 수준은 중간이다.

종양 유형에 따라 TMB(Tumor mutation load(burden), 즉 종양 돌연변이 부담) 수준이 다르기 때문에, 일반적으로 TMB가 20개 돌연변이/Mb(Mb는 백만 염기를 나타냄)를 초과하면 높은 수준이고; TMB가 10개 돌연변이/Mb 미만이면 낮은 수준이며, 그 중간이면 중간 수준인 것으로 간주된다. 2017년 세계폐암학회에서 브리스톨마이어스스퀴브(BMS)가 CheckMate-032라는 임상 시험 결과를 발표하였다. 이는 1차 치료에 실패한 진행성 폐암 환자 401명을 대상으로 한 2상 임상 시험으로, PD-1 억제제를 단일 투여받거나 이필리무맙과 병용 투여받았다. TMB 수준에 따라 고 TMB, 중 TMB, 저 TMB 환자로 구분하였고, 병용요법을 받은 모집단에서 세 그룹의 유효율은 각각 62%, 20%, 23%로, 고 TMB 환자의 유효율은 3배 높았으며; 세 그룹의 전체 생존율 중앙값은 각각 22.0개월, 3.6개월, 3.4개월이었고, 22.0개월과 3.4개월은 6배 차이난다! 그 시험은 상이한 암 치료 약물 및 상이한 TMB 수준이 약물의 효능에 매우 큰 영향을 미친다는 것을 보여주었다.

본 발명은 또한 PARP 억제제에 내성이 있는 암 또는 종양 환자를 치료하기 위한 약물을 제공하며, 상기 약물은 식 (I)의 저산소 활성화 화합물을 함유하고, 그 약물을 단독으로 사용하거나 병용하여 PARP 억제제에 내성이 있는 암 또는 종양 환자를 치료할 수 있다:

식 (I),

상기 식 (I)에서, R은 각각 독립적으로 H, -CH₃, -CH₂CH₃으로부터 선택되고, X는 각각 독립적으로 Cl, Br, MsO, TsO와 같은 이탈 관능기로부터 선택된다.

바람직하게는, 상기 환자는 DNA 복구 효소가 손상되었거나; 또는

바람직하게는, BRCA1, BRCA2 돌연변이는 생식세포 돌연변이(gBRCAm) 및 체세포 돌연변이(sBRCAm)의 BRCA1, BRCA2 돌연변이를 포함한다.

특히, 상기 약물에서, 상기 식 (I)의 저산소 활성화 화합물은,

의 구조로부터 선택되는 화합물이거나; 또는

상기 약물은 식 (I)의 저산소 활성화 화합물을 함유하는 것 외에도 의약품, 약물, 제제의 특성에 따라 약학적으로 허용 가능한 보조제 또는 부형제를 첨가해야 한다. 상기 약물은 임상적으로 투여되는 임의의 제형일 수 있고, 예를 들어 정제, 좌제, 분산정, 장용정, 츄어블정, 구강붕해정, 캡슐, 당의제, 과립제, 건조분말제, 경구액제, 소형 주사제, 동결건조분말 주사제 또는 대용량 주입제이다. 구체적인 제형 및 투여 방식에 따라, 상기 약물의 약학적으로 허용 가능한 보조제 또는 부형제는 희석제, 가용화제, 붕해제, 현탁화제, 윤활제, 결합제, 충전제, 향미제, 감미제, 항산화제, 계면활성제, 방부제, 코팅제 및 색소 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

상기 약물을 사용하는 경우, 상기 약물을 단독으로 사용하거나 PARPi 약물과 병용하여 치료할 수 있다.

도 1은 정상 산소 및 저산소 조건에서 Capan-1 세포주에 대한 화합물 TH-302 및 티라파자민(tirapazamine)의 억제율 곡선을 보여주며, 여기서 "conc.Log(nM)"는 nmol/L 단위의 농도값을 10진법으로 나타낸 로그값을 나타내고, "inhibition"은 억제율을 나타낸다.
도 2는 정상 산소 및 저산소 조건에서 BxPc-3 세포주에 대한 화합물 TH-302 및 티라파자민(tirapazamine)의 억제율 곡선을 보여주며, 여기서 "conc.Log(nM)"는 nmol/L 단위의 농도값을 10진법으로 나타낸 로그값을 나타내고, "inhibition"은 억제율을 나타낸다.
도 3은 인간 췌장암 Capan-1 피하 모델에서 그룹별 마우스의 종양 부피 성장 그래프를 보여준다.
도 4는 인간 췌장암 Capan-1 피하 모델에서 그룹별 마우스의 상대 종양 억제율 그래프를 보여준다.
도 5는 인간 췌장암 Capan-1 피하 모델에서 그룹별 마우스의 체중 그래프를 보여준다.
도 6은 인간 췌장암 Capan-1 피하 모델에서 그룹별 마우스의 체중 변화율 그래프를 보여준다.
도 7은 췌장암 Capan-1CDX 모델에서 그룹별 마우스의 종양 부피 성장 그래프를 보여준다.
도 8은 췌장암 Capan-1CDX 모델에서 치료군별 시간에 따른 체중 변화 그래프를 보여준다.
도 9는 폐암 LU6429 PDX 모델에서 그룹별 마우스의 종양 부피 성장 그래프를 보여준다.
도 10은 폐암 LU6429 PDX 모델에서 치료군별 시간에 따른 체중 변화 그래프를 보여준다.
도 11은 방광암 BL3325 PDX 모델에서 그룹별 마우스의 종양 부피 성장 그래프를 보여준다.
도 12는 방광암 BL3325 PDX 모델에서 치료군별 시간에 따른 체중 변화 그래프를 보여준다.

이하, 구체적인 실시예를 참조하여 본 발명을 설명한다. 통상의 기술자는 이러한 실시예가 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 임의의 방식으로 한정하는 것이 아님을 이해할 수 있다.

달리 설명하지 않는 한, 하기 실시예의 실험 방법은 모두 일반적인 방법이다. 달리 설명하지 않는 한, 사용된 약재 원료, 시약 재료 등은 모두 시중에서 구매할 수 있는 제품이다.

용어 "환자" 및 "개체"는 서로 교환하여 사용될 수 있고, 암 치료를 위한 포유동물을 의미한다. 통상적으로, 환자는 인간이다. 통상적으로, 환자는 암을 앓고 있는 인간이다. 일부 실시예에서, "환자" 또는 "개체"는 약물 및 요법을 스크리닝, 특성화 및 평가하기 위한 비인간 포유동물, 예를 들어 비인간 영장류, 개, 고양이, 토끼, 돼지, 마우스 또는 래트를 의미할 수 있다.

"전구약물"은 투여 또는 사용 후 신진대사 또는 다른 방식을 통해 적어도 하나의 특성과 관련된 생물학적 활성 또는 더 높은 활성을 갖는 화합물(또는 약물)로 전환되는 화합물을 의미한다. 약물에 비해, 전구약물은 약물보다 활성이 낮거나 활성이 없는 방식으로 화학적 변형되지만, 화학적 변형으로 인해 전구약물이 투여된 후 대사 또는 다른 생물학적 과정을 통해 상응한 약물이 생성된다. 전구약물은 활성 약물에 비해 변경된 대사안정성 또는 전달 특성, 비교적 작은 부작용 또는 독성 또는 개선된 향미를 가질 수 있다. 전구약물은 상응한 약물 이외의 반응물을 사용하여 합성할 수 있다.

"치료" 또는 "치료 환자"는 환자에게 본 발명과 관련된 치료적 유효량의 약물을 투여, 사용 또는 적용하는 것을 의미한다.

환자에게 약물을 "투여" 또는 "사용" 또는 "적용"하는 것은 직접 투여 또는 사용(전문의가 환자에게 투여하거나 사용할 수 있고, 또는 자가 투여하거나 사용할 수 있음) 및/또는 간접 투여 또는 사용을 의미하며, 이는 약물을 처방하는 행위일 수 있다. 예를 들어, 환자에게 약물을 자가 투여 또는 사용하도록 지시하고 및/또는 환자에게 약물 처방을 제공하는 의사는 환자에게 약물을 투여 또는 사용한다.

약물의 "치료적 유효량"은 암 환자에게 투여, 사용 또는 적용될 때 원하는 치료 효과(예를 들어, 환자의 암에 대한 하나 이상의 임상 증상 완화, 개선, 경감 또는 제거)를 갖게 되는 약물의 양을 의미한다. 치료 효과는 반드시 1회 용량을 투여하거나 사용함으로써 나타나는 것은 아니며, 일련의 용량을 투여하거나 사용한 후에만 나타날 수도 있다. 따라서, 치료적 유효량은 1회 이상 투여되거나 사용될 수 있다.

병증 또는 환자의 "치료"는 유익하거나 원하는 결과(임상 결과 포함)를 얻기 위한 조치를 취하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해, 유익하거나 원하는 임상 결과에는 하나 이상의 암 증상 완화 또는 개선; 질환 중증도의 감소; 질환 진행의 지연 또는 둔화; 질환 상태의 개선, 완화 또는 안정화; 또는 다른 유익한 효과가 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 일부 경우에는 암 치료로 인해 질환이 부분적으로 반응하거나 안정화될 수 있다.

"종양 세포"는 임의의 적절한 종(예를 들어 포유동물, 예를 들어 쥐, 개, 고양이, 말 또는 인간)의 종양 세포를 의미한다.

이상, 본 발명의 구체적인 실시형태에 대한 설명은 본 발명을 한정하지 않고, 본 발명의 사상을 벗어나지 않는 한 통상의 기술자가 본 발명에 따라 이룬 다양한 변경 또는 변형은 모두 본 발명에 첨부된 청구범위에 속해야 한다.

이하, 본 발명의 구체적인 실험을 제공한다.

본 발명에 개시된 시험 과정 중 동물 실험의 시험 방안, 모든 수정, 동물 복지 및 사용은 모두 CRO(임상시험수탁기관)의 IACUC 위원회에 의해 검토되고 승인되었다. 시험 과정에서 동물 복지 및 실험 조작은 모두 AAALAC의 요구사항을 준수하였다.

1. BRCA 녹아웃 및 야생형 종양 세포에서 화합물 TH-302의 생체외 세포 독성 비교

TH-302는 저산소 조건에서 활성화됨으로써 세포 독소를 방출하여 종양 세포와 종양 조직을 사멸할 수 있는 소분자 전구약물이다. 생체외 세포 수준에서 TH-302와 BRCA 병원성 돌연변이 사이의 상관관계를 평가하기 위해, 우리는 인간 결장암 세포주 DLD1과 BRCA2 단백질 녹아웃 DLD1-BRCA2-/- 종양 세포주를 선택하여 저산소 조건에서 BRCA2 단백질 발현 유무에 관계없이 위의 두 종양 세포주에 대한 TH-302의 살상 능력에 차이가 있는지 여부를 검출하였다.

그 콜로니 형성 실험은 IC₉₀(90% 억제 농도) 값을 사용하여 화합물 TH-302의 세포 사멸 능력을 평가하였다. 구체적인 실험 방법은 하기와 같다.

(1) 세포 배양

a) DLD1 및 DLD1-BRCA2-/- 세포를 RPMI 배지에 배양하고, 10% FBS 및 1% 이중항체를 첨가한 후, 37℃, 5% CO₂의 조건에서 배양하였다.

(2) 세포 플레이팅

a) 세포 포화도가 80% 내지 90%가 될 때까지 세포를 일상적으로 배양하고, 필요한 개수에 도달하면 세포를 수집하였다.

b) 상응한 배지에 재현탁하고 계수하여, 적합한 밀도의 세포 현탁액을 조제하였다.

c) 세포 현탁액을 10cm 유리 접시에 넣었고, DLD1-BRCA2^-/- 세포의 밀도는 3.0×10⁵/접시였으며, DLD1 세포의 밀도는 300/접시였다.

d) 세포를 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 2일 동안 배양하였다.

(3) 화합물의 준비

화합물을 실험 요구사항에 따라 준비하였다.

(4) 화합물의 세포 처리

a) 세포를 산소 함량<0.01%(저산소)의 조건에서 3시간 동안 화합물로 처리하였다.

b) 세포를 1×PBS로 1회 세척하고 트립신으로 소화한 다음 세포를 계수하였다.

c) 3mL의 배지에서 세포를 재현탁하고, 6웰 배양 플레이트에 접종하였으며, 여기서 DLD1-BRCA2-/- 세포의 밀도는 2000/웰이었고, DLD1 세포의 밀도는 300/웰이었다.

d) 세포 플레이트를 인큐베이터에 10일 동안 정치하였다.

e) 배지를 버리고 세포를 고정한 후 크리스탈 바이올렛으로 40분 동안 염색하였다.

f) Colony Counter(VWR)를 사용하여 세포 콜로니 계수를 수행하고, CalcuSyn 소프트웨어(http://www.biosoft.com/w/calcusyn.htm)에 따라 IC₉₀ 값을 계산하였다.

상기 실험 방법에 의해 측정된 두 가지 세포에서 시험할 화합물 TH-302의 IC₉₀ 값은 하기 표 1에 나타내었다.

표 1: 저산소 조건에서 2개의 종양 세포에 대한 화합물 TH-302의 억제 작용에 관한 IC₉₀ 데이터

실험 결론: 화합물 TH-302는 저산소 조건에서 활성화된 후 DLD1야생형 및 BRCA2 결실 DLD1-BRCA2-/- 세포의 생체외 세포 독성에 유의한 차이가 있는 것으로 나타났다. DLD1-BRCA2-/- 세포에 비해, 야생형 DLD1의 생체외 IC₉₀ 값은 70배 증가하였다. 상기 결과는 저산소 조건에서 BRCA2 단백질의 결실이 TH-302에 대한 DLD1 세포의 민감도를 크게 증가시킨다는 것을 나타낸다.

2. Capan-1/BxPc-3 생체외 세포 증식에 대한 화합물 TH-302/티라파자민(tirapazamine)의 영향 실험

출원인은 정상 산소 및 저산소 조건 하에 Capan-1 및 BxPc-3 세포주에서 각각 저산소 활성화 항암 전구약물 TH-302 및 티라파자민의 생체외 세포 증식 억제 실험을 연구하였다. Capan-1 세포주는 BRCA 돌연변이형 세포주이고, BxPc-3 세포주는 BRCA 야생형, 즉 non-BRCA 돌연변이형 세포주이다. 이 실험을 통해 저산소 활성화 항암 전구약물인 TH-302와 티라파자민의 BRCA 돌연변이에 대한 민감도 차이를 검증하였다.

실험 방법, 실험 데이터 및 결론은 하기와 같다.

실험 방법

1) Capan-1/BxPc-3 세포 현탁액을 두 부류의 24웰 플레이트에 웰당 495μL씩 첨가하였고, 세포 밀도는 6×10⁴/웰이었다. 저산소 실험에는 유리 삽입판(glass inserts)이 있는 24웰 플레이트를 사용하고, 정상 산소 실험에는 일반 플라스틱 24웰 플레이트를 사용하였다.

2) 세포를 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 밤새 배양하였다.

3) 화합물 처리

저산소 조건:

저산소 워크스테이션을 저산소 환경(O₂<0.01%)으로 조정하고, 산소 표시자를 이용하여 워크스테이션의 저산소 상황을 확인하였다.

24시간의 세포 플레이팅 후, 유리 삽입판(glass inserts)이 있는 24웰 플레이트를 저산소 워크스테이션으로 옮겼다.

24웰 플레이트를 나선형 진탕기에 놓고, 웰 플레이트 덮개를 열고 흔들어준 후, 5분 동안 가스 교환을 수행하였다.

단일 제제군에서는 각 웰에 100배 시험 농도의 화합물 용액을 직접 첨가하였다.

정상 산소 조건:

24시간의 세포 플레이팅 후, 각 웰에 100배 시험 농도의 화합물 용액을 5μL 첨가하고, 각각의 실험 그룹에 3개의 중복 웰을 설정하였다.

4) 3시간의 화합물 처리 후, 모든 24웰 플레이트를 웰당 500μL의 완전 배지로 2회 세척하였다.

5) Capan-1 세포 배양 플레이트의 각 웰에 1000μL의 완전 배지를 첨가하고, BxPc-3 세포 배양 플레이트의 각 웰에 500μL의 완전 배지를 첨가하였다.

6) 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 72시간 동안 정치하였다.

7) Capan-1 세포의 경우 각 웰에서 800μL의 배지를 버리고, BxPc-3 세포의 경우 각 웰에서 300μL의 배지를 버리며, 50μL의 CTG를 첨가하고 2분 동안 흔들어 섞은 후 실온의 암실에서 15분 동안 정치하였다.

8) 24웰 플레이트에서 웰당 100 μL의 배지를 96웰 흰색 플레이트로 옮겼다.

9) 다기능 마이크로플레이트 리더를 사용하여 화학 발광 신호값을 판독하였고, 판독 시간은 1000ms이다.

10) GraphPad Prism 5 software로 IC₅₀을 계산하여 화합물의 IC₅₀ 값(반수 억제 농도)을 얻었다.

실험 데이터

정상 산소 및 저산소 조건 하에 BRCA 돌연변이형 Capan-1 세포주에서 TH-302 및 티라파자민의 세포 증식 억제 실험 데이터는 표 2 및 표 3에 나타낸 바와 같고, IC₅₀ 곡선은 도 1에 도시된 바와 같다.

표 2: BRCA 돌연변이형 Capan-1 세포주에서 TH-302의 세포 증식 억제 실험 데이터

표 3: BRCA 돌연변이형 Capan-1 세포주에서 티라파자민의 세포 증식 억제 실험 데이터

정상 산소 및 저산소 조건 하에 BRCA 야생형 BxPc-3 세포주에서 TH-302 및 티라파자민의 세포 증식 억제 실험 데이터는 표 4 및 표 5에 나타낸 바와 같고, IC₅₀ 곡선은 도 2에 도시된 바와 같다.

표 4: BRCA 야생형 BxPc-3 세포주에서 TH-302의 세포 증식 억제 실험 데이터

표 5: BRCA 야생형 BxPc-3 세포주에서 티라파자민의 세포 증식 억제 실험 데이터

실험 결론

상기 실험 데이터에서, TH-302는 저산소 조건 하에 BRCA 돌연변이 Capan-1 세포주에서의 IC₅₀이 0.82μM이고, BRCA 야생형 BxPc-3 세포주에서의 IC₅₀이 3.07μM로, 양자는 3.7배 차이가 났는데, 이는 BRCA 돌연변이가 종양 세포주에 대한 TH-302의 증식 억제 활성을 더 증강시킴을 나타낸다. 즉 BRCA 돌연변이는 TH-302 약물에 대한 종양 세포의 민감도를 향상시킨다.

저산소 활성화 항암 전구약물이기도 한 티라파자민은 저산소 조건 하에 BRCA 돌연변이 Capan-1 세포주에서의 IC₅₀이 29.06μM이고, BRCA 야생형 BxPc-3 세포주에서의 IC₅₀이 33.23μM로, 그 차이는 1.1배로 뚜렷한 차이가 없는데, 이는 티라파자민이 BRCA 돌연변이와 상관관계가 없음을 나타낸다. 즉 BRCA 돌연변이는 종양 세포주에 대한 티라파자민의 증식 억제 활성에 유의한 영향을 미치지 않고, 즉 BRCA 돌연변이는 티라파자민 약물에 대한 종양 세포의 민감도를 향상시키지 않는다.

3. 올라파립(Olaparib) 내성 동물 CDX 및 PDX 모델에서 TH-302의 약효 및 안전성 실험

3.1 올라파립 내성 췌장암 Capan-1 CDX 모델에서 TH-302의 약효 및 안전성 평가

Capan-1 CDX 모델은 BRCA2 병원성 돌연변이가 있는 올라파립 내성 모델이다.

각각의 BALB/c 암컷 누드 마우스의 등 오른쪽 아래에 1:1의 PBS 및 Matrigel(0.1ml/마리)에 재현탁한 5×10⁵ Capan-1 세포를 피하 접종하여 총 64마리의 암컷 마우스에게 접종하였다. 접종일은 2021년 6월 23일이고, 평균 종양 부피가 140mm³에 도달하면 종양 크기에 따라 무작위로 그룹화하였다. 시험은 시험 약물 올라파립 100mg/kg 단일 제제군(그룹 2), TH-302 75mg/kg과 올라파립 100mg/kg의 조합 투여군(그룹 5), TH-302 75mg/kg 단일 제제군(그룹 7), 및 10% 무수 에탄올+10% 폴리옥시에틸렌(35)피마자유+80% 포도당 주사액 D5W(pH7.4) 비히클 대조군, 총 7개의 그룹, 그룹당 6마리의 마우스로 나누었다. 비히클 대조군, TH-302 단일 제제군 및 조합 투여군은 모두 꼬리 정맥을 통해 주 1회, 총 3주 동안 투여하고; 시험 약물 올라파립군은 경구를 통해 1일 1회, 총 30일 동안 위내 투여하였다. 상대 종양 억제율 TGI(%)에 따라 효능 평가를 수행하고, 동물 체중 변화 및 사망 상황에 따라 안전성 평가를 수행하였다.

시험 약물 올라파립 100mg/kg(그룹 2) 치료군은 종양 세포 접종 후 35일차에 종양 억제 작용이 없었고, 상대 종양 억제율 TGI(%)는 -7.1%였으며, 대조군에 비해 통계학적으로 유의한 차이가 없었다(p>0.05). 올라파립 100mg/kg과 TH-302 75mg/kg의 조합 투여군(그룹 5)은 종양 세포 접종 후 35일차에 유의한 종양 억제 작용이 있었고, 대조군에 비해 통계학적으로 유의한 차이가 있었으며(p<0.001), 상대 종양 억제율 TGI(%)는 84.47%였다. TH-302 75mg/kg 단일 제제군(그룹 7)은 종양 세포 접종 후 35일차(Day 35)에 유의한 종양 억제 작용을 나타냈고, 대조군에 비해 통계학적으로 유의한 차이가 있었으며(p<0.001), 상대 종양 억제율 TGI(%)는 87.66%였다. TH-302 단일 제제군과 올라파립 및 TH-302의 조합 투여군을 비교했을 때, 종양 억제 효과는 유의한 차이가 없었다(p>0.05). 시험 약물 올라파립 100mg/kg, TH-302 75mg/kg 단일 제제군, 올라파립 100mg/kg과 TH-302 75mg/kg의 조합 투여군 마우스에서는 유의한 체중 감소가 없었고, 내성이 우수하였다.

구체적인 그룹별 투여 방안은 하기 표 6에 나타낸 바와 같다.

표 6: 인간 췌장암 Capan-1 피하 동물 치료 모델 실험에서 그룹별 약물 투여 방안

그룹별 마우스의 종양 부피를 상이한 일수에 측정하여 평균값을 구하였고, 그 결과는 하기 표 7에 나타낸 바와 같다.

표 7: 인간 췌장암 Capan-1 모델에서 그룹별 마우스의 치료 시간에 따른 종양 부피 변화(단위mm³)

각각의 치료군과 대조군의 종양 성장 상황은 표 7 및 도 3에 나타낸 바와 같다. 약효 평가는 표 8을 참조바란다.

표 8: 인간 췌장암 Capan-1 피하 모델에서 그룹별 약효 분석표

표 8: 상대 종양 증식률, T/C%, 즉 특정 시점에서 치료군과 대조군 간의 상대 종양 부피 또는 종양 무게의 백분율값이다. 계산 공식은 하기와 같다.T/C%=T_RTV/C_RTV×100%(T_RTV: 치료군 평균 RTV; C_RTV: 비히클 대조군 평균 RTV; RTV=V_t/V₀, V₀은 그룹화 시 그 동물의 종양 부피이고, V_t는 치료 후 그 동물의 종양 부피임);

상대 종양 억제율, TGI(%), 계산 공식은 다음과 같다. TGI%=(1-T/C)×100%. (T 및 C는 각각 특정 시점에서 치료군과 대조군의 평균 상대 종양 부피(RTV)임).

표 9: 인간 췌장암 Capan-1 피하 모델에서 그룹별 종양의 상대 종양 억제율

위의 표를 그래프로 작성하여 도 4를 얻을 수 있다.

그룹별 마우스의 체중을 상이한 일수에 측정하여 평균값을 구하였고, 그 결과는 하기 표 10에 나타낸 바와 같다.

표 10: 인간 췌장암 Capan-1 피하 동물 치료 모델 실험에서 상이한 약물 접종 일수의 마우스 체중

위의 표를 그래프로 작성하여 도 5를 얻을 수 있고, 즉 인간 췌장암 Capan-1 피하 모델에서 그룹별 마우스의 체중 곡선이다.

마찬가지로 표 10의 데이터를 처리하여 하기 표 11을 얻을 수 있다.

표 11: 인간 췌장암 Capan-1 피하 동물 치료 모델 실험에서 상이한 약물 접종 일수의 마우스 체중 변화율(그룹 평균 변화%=평균((T-T0)/T0)×100, T는 현재 값을 나타내고, T0은 초기 값을 나타냄)

위의 표를 그래프로 작성하여 도 6을 얻을 수 있다.

실험 데이터 분석에 따르면, 효능 측면에서:

1. Capan-1 CDX 모델은 실제로 올라파립 내성 모델이고, 올라파립은 그 모델에서 종양 성장에 대한 억제 작용이 없으며, 즉 올라파립에 내성이 있고;

2. TH-302 단일 제제는 올라파립 내성 췌장암에 우수한 치료 효과(TGI 82.67%)를 보이며;

3. TH-302와 올라파립의 병용은 올라파립 내성 췌장암에 우수한 치료 효과(TGI 87.43%)를 보이고;

4. 올라파립과 TH-302의 조합 투여군에 비해 TH-302 단일 제제군은 종양 억제 효과가 약간 우수하나 유의한 차이는 없으며(p>0.05);

실험 데이터 분석에 따르면, 시험 약물 올라파립 100mg/kg, TH-302 75mg/kg 단일 제제군, 올라파립 100mg/kg과 TH-302 75mg/kg의 조합 투여군 마우스에서는 유의한 체중 감소가 없었고, 내성이 우수하였다.

발명자는 올라파립(Olaparib) 내성 췌장암 Capan-1 CDX 모델에서 TH-302에 대한 심층적인 연구를 추가로 수행한 결과, ① TH-302 단일 제제군에서는 약물의 용량 의존적 종양 억제 작용을 나타냈고; ② 올라파립과 TH-302를 병용한 특정 용량 조합에서는 종양 억제 효과의 시너지 작용을 나타낼 수 있었다.

발명자는 올라파립(Olaparib) 내성 폐암 LU6429 PDX 모델, 방광암 BL3325 PDX 모델에서 TH-302의 약효 및 안전성을 동시에 연구하였다.

추가 연구 방안 및 실험 데이터는 하기와 같다.

3.2 올라파립(Olaparib) 내성 췌장암 Capan-1 CDX 모델에서 TH-302의 약효 및 안전성에 대한 추가 연구

방안: BALB/c 누드 마우스에 인간 췌장암 Capan-1 세포를 피하 접종하여, 인간 췌장암 피하이식 모델을 구축하였다. 시험은 시험 약물 올라파립 100mg/kg 단일 제제군(그룹 2), TH-302 50mg/kg 단일 제제군(그룹 3, QD), TH-302 100mg/kg 단일 제제군(그룹 4), TH-302 50mg/kg 단일 제제군(그룹 5, QW), TH-302 25mg/kg 단일 제제군(그룹 6), TH-302 25mg/kg과 올라파립 100mg/kg의 조합 투여군(그룹 7), 및 10% 무수 에탄올+10% 폴리옥시에틸렌(35)피마자유+80% 포도당 주사액 D5W(pH7.4) 비히클 대조군(그룹 1), 총 7개의 그룹, 그룹당 6마리의 마우스로 나누었다. 비히클 대조군, TH-302 각각의 시험 약물은 모두 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다. 여기서 TH-302 50mg/kg 단일 제제군(그룹 3, QD)은 1일 1회, 3일 동안 연속 투여하고, 4일 동안 휴식한 뒤 2주 동안 휴식하며; 그런다음 3일 동안 연속 투여하였다. TH-302 100mg/kg(그룹 4, QW), 50mg/kg(그룹 5, QW), 25mg/kg(그룹 6, QW) 단일 제제군 및 TH-302 25mg/kg과 올라파립 100mg/kg의 조합 투여군(그룹 7)의 TH-302는 주 1회, 총 3주 동안 투여하였다. 그룹별 시험 약물 올라파립은 경구를 통해 1일 1회, 총 30일 동안 위내 투여하였다. 구체적인 인간 췌장암 Capan-1 동물 모델의 투여 경로, 용량 및 방안은 표 12에 나타낸 바와 같다.

표 12: 인간 췌장암 Capan-1 동물 모델의 투여 경로, 용량 및 방안

참고: 투여 부피 10μL/g.

시험에서 상이한 일수에 각각의 치료군과 대조군의 종양 성장 상황을 기록하였고, 표 13에 나타낸 바와 같으며, 상응하게 그룹별 마우스의 종양 부피 성장 곡선은 도 7에 도시된 바와 같다. 상대 종양 증식률 및 상대 종양 억제율에 따라 효능을 평가하고, 그룹별 약효 분석은 표 14에 나타낸 바와 같다. 치료군과 대조군의 투여 후 체중 변화를 기록하고, 인간 췌장암 Capan-1 피하 모델에서 그룹별 안전성을 연구하였으며, 43일차 마우스 체중 변화율 결과는 표 15에 나타낸 바와 같고, 치료군별 시간에 따른 체중 변화 그래프는 도 8에 도시된 바와 같다.

상대 종양 증식률, T/C%, 즉 특정 시점에서 치료군과 대조군 간의 상대 종양 부피 또는 종양 무게의 백분율값이다. 계산 공식은 하기와 같다.

T/C%=T_RTV/C_RTV×100%(T_RTV: 치료군 평균 RTV; C_RTV: 비히클 대조군 평균 RTV; RTV=V_t/V₀, V₀은 그룹화 시 그 동물의 종양 부피이고, V_t는 치료 후 그 동물의 종양 부피임);

또는 T/C%=TTW/CTW×100%(T_TW: 실험 종료 시 치료군의 평균 종양 무게; C_TW: 실험 종료 시 비히클 대조군의 평균 종양 무게).

상대 종양 억제율, TGI(%), 계산 공식은 다음과 같다. TGI%=(1-T/C)×100%. (T 및 C는 각각 특정 시점에서 치료군과 대조군의 상대 종양 부피(RTV) 또는 종양 무게(TW)임).

표 13: 인간 췌장암 Capan-1 모델에서 그룹별 마우스의 치료 시간에 따른 종양 부피 변화(mm ³ )

표 14: 인간 췌장암 Capan-1 피하 모델에서 그룹별 약효 분석표

참고: 1. 데이터는 "평균값±표준오차"로 나타내고; 2. T/C%=T_RTV/C_RTV×100%; 3. CR: 종양 완전 완화, 종양 0으로 퇴축.

표 15: 인간 췌장암 Capan-1 피하 모델에서 그룹별 체중 변화 상황

상기 데이터에 따르면:비히클 대조군 마우스는 종양 세포 접종 후 43일차(Day 43)에 평균 종양 부피가 1301.38mm³이다. 시험 약물 올라파립 100mg/kg(그룹 2) 치료군은 종양 세포 접종 후 43일차(Day 43)에 평균 종양 부피가 846.86mm³이고, 상대 종양 억제율 TGI(%)는 37.43%이며, 대조군에 비해 통계학적으로 유의한 차이가 없다(p>0.05).

시험 약물 TH-302 50mg/kg 치료군(그룹 3, QD)은 종양 세포 접종 후 43일차(Day 43)에 평균 종양 부피가 146.99mm³이고, 대조군에 비해 통계학적으로 유의한 차이가 있으며(p<0.001), 상대 종양 억제율 TGI(%)는 89.17%이다. 시험 약물 TH-302 100mg/kg 치료군(그룹 4)은 종양 세포 접종 후 43일차(Day 43)에 평균 종양 부피가 124.68mm³이고, 대조군에 비해 통계학적으로 유의한 차이가 있으며(p<0.001), 상대 종양 억제율 TGI(%)는 90.89%이다. 시험 약물 TH-302 50mg/kg 치료군(그룹 5, QW)은 종양 세포 접종 후 43일차(Day 43)에 평균 종양 부피가 263.45mm³이고, 대조군에 비해 통계학적으로 유의한 차이가 있으며(p<0.001), 상대 종양 억제율 TGI(%)는 80.18%이고, 종양 완전 억제율은 33.3%이다. 시험 약물 TH-302 25mg/kg 치료군(그룹 6)은 종양 세포 접종 후 43일차(Day 43)에 평균 종양 부피가 1521.33mm³이고, 대조군에 비해 통계학적으로 유의한 차이가 없으며(p>0.05), 상대 종양 억제율 TGI(%)는 -21.59%이다. 올라파립 100mg/kg과 TH-302 25mg/kg의 조합 투여군(그룹 7)은 종양 세포 접종 후 43일차(Day 43)에 평균 종양 부피가 378.56mm³이고, 대조군에 비해 통계학적으로 유의한 차이가 있으며(p<0.001), 상대 종양 억제율 TGI(%)는 74.36%이다.

TH-302 100mg/kg(그룹 4), 50mg/kg(그룹 5, QW) 및 25mg/kg(그룹 6) 단일 제제군에서는 약물의 용량 의존적 종양 억제 작용을 나타낸다. TH-302 100mg/kg(그룹 4, QW), 50mg/kg(그룹 5, QW) 단일 제제군은 TH-302 25mg/kg 단일 제제군(그룹 6, QW)에 비해 모두 통계학적으로 유의한 차이가 있다(p<0.001).

올라파립 100mg/kg과 TH-302 25mg/kg의 조합 투여군(그룹 7)은 항종양 작용이 올라파립 100mg/kg(그룹 2), TH-302 25mg/kg 단일 제제군(그룹 6)보다 우수하고, 통계학적으로 유의한 차이가 있으며(p<0.05 및 p<0.001), 올라파립과 TH-302를 병용한 특정 용량 조합에서는 종양 억제 효과의 시너지 작용을 나타낼 수 있다.

시험 약물 올라파립 100mg/kg(그룹 2), TH-302 25mg/kg(그룹 6), TH-302 50mg/kg(그룹 3, QD), TH-302 50mg/kg(그룹 5, QW), TH-302 100mg/kg(그룹 4), 올라파립 100mg/kg과 TH-302 25mg/kg의 조합 투여군(그룹 7), 비히클 대조군(그룹 1) 마우스에서는 유의한 체중 감소가 없고, 내성이 우수하다.

3.3 올라파립(Olaparib) 내성 폐암 LU6429 PDX 모델에서 TH-302의 약효 및 안전성 평가

LU6429 PDX 모델은 BRCA2 병원성 돌연변이가 있는 올라파립 내성 모델이다.

방안: Balb/c 누드 암컷 마우스에 HuPrime 폐암 LU6429 종양 덩어리를 피하 접종하여, 인간 폐암 피하이식 종양 모델을 구축하였다. 시험은 시험 약물 올라파립 50mg/kg 단일 제제군(그룹 02), TH-302 80mg/kg 단일 제제군(그룹 03), TH-302 40mg/kg 단일 제제군(그룹 04), TH-302 20mg/kg 단일 제제군(그룹 05), TH-302 40mg/kg과 올라파립 50mg/kg의 조합 투여군(그룹 06), 및 포도당 주사액 비히클 대조군(그룹 01), 총 6개의 그룹, 그룹당 6마리의 마우스로 나누었다. 여기서 비히클 대조군 및 TH-302는 모두 꼬리 정맥을 통해 주 1회, 총 3주 동안 투여하고; 올라파립은 1일 1회, 총 28일 동안 위내 투여하였다. 구체적인 HuPrime® 폐암 LU6429 동물 모델의 투여 경로, 용량 및 방안은 표 16에 나타낸 바와 같다.

표 16: HuPrime® 폐암 LU6429 동물 모델의 투여 경로, 용량 및 방안

참고: 1. 투여 부피 10μL/g; 2. QD×28: 1일 1회, 28일 동안 연속 투여; 3. QW×3: 주 1회, 3주 동안 연속 투여.

시험에서 상이한 일수에 각각의 치료군과 대조군의 종양 성장 상황을 기록하였고, 표 17에 나타낸 바와 같으며, 상응하게 그룹별 마우스의 종양 부피 성장 곡선은 도 9에 도시된 바와 같다. 상대 종양 증식률 및 상대 종양 억제율에 따라 효능을 평가하고, 그룹별 약효 분석은 표 18에 나타낸 바와 같다. 치료군과 대조군의 투여 후 체중 변화를 기록하고, HuPrime® 폐암 LU6429 피하 모델에서 그룹별 안전성을 연구하였으며, 25일차 마우스 체중 변화율 결과는 표 19에 나타낸 바와 같고, 치료군별 시간에 따른 체중 변화 그래프는 도 10에 도시된 바와 같다.

표 17: HuPrime® 폐암 LU6429 모델에서 그룹별 마우스의 치료 시간에 따른 종양 부피 변화(mm ³ )

표 18: HuPrime® 폐암 LU6429 피하 모델에서 그룹별 약효 분석표

참고: 데이터는 "평균값±표준오차"로 나타낸다.

표 19: HuPrime® 폐암 LU6429 피하 모델에서 그룹별 체중 변화 상황

상기 데이터에 따르면:올라파립 단일 제제군은 종양 억제 작용이 나타나지 않았고, 이는 폐암 LU6429 PDX 모델이 올라파립에 내성이 있음을 나타낸다. 본 연구에서, 80mg/kg, 40mg/kg, 20mg/kg 용량의 시험 약물 TH-302 단일 제제군, 및 TH-302 40mg/kg과 올라파립 50mg/kg의 조합 투여군은 HuPrime® 폐암 LU6429 피하 모델에 모두 유의한 항종양 증식 작용이 있다. 여기서 TH-302 80mg/kg(그룹 03) 용량 치료군에서 1마리의 마우스만 종양이 완전히 제거되고, 제거율은 16.7%이다. 시험 약물 TH-302 80mg/kg, 40mg/kg 및 20mg/kg 치료군 사이에는 통계학적으로 유의한 차이가 있고(p<0.05), 용량 의존성을 나타낸다. TH-302 40mg/kg과 올라파립 50mg/kg의 조합 투여군은 치료 효과가 올라파립 50mg/kg 단일 제제군보다 현저히 우수하지만, TH-302 40mg/kg 단일 제제군에 비해 약간 우수하나 차이가 유의하지 않다.

각각의 시험 약물 치료군 마우스는 치료 기간 동안 체중이 감소하지 않았고, 내성이 우수하다.

3.4 올라파립(Olaparib) 내성 방광암 BL3325 PDX 모델에서 TH-302의 약효 및 안전성 평가

BL3325 PDX 모델은 BRCA2 병원성 돌연변이가 있는 올라파립 내성 모델이다.

방안: Balb/c 누드 암컷 마우스에 HuPrime® 방광암 BL3325 종양 덩어리를 피하 접종하여, 인간 방광암 피하이식 종양 모델을 구축하였다. 시험은 시험 약물 올라파립 50mg/kg 단일 제제군(그룹 02), TH-302 80mg/kg 단일 제제군(그룹 03), TH-302 40mg/kg 단일 제제군(그룹 04), TH-302 20mg/kg 단일 제제군(그룹 05), TH-302 40mg/kg과 올라파립 50mg/kg의 조합 투여군(그룹 06), 및 포도당 주사액 비히클 대조군(그룹 01), 총 6개의 그룹, 그룹당 6마리의 마우스로 나누었다. 여기서 비히클 대조군 및 TH-302는 모두 꼬리 정맥을 통해 주 1회, 총 3주 동안 투여하고; 올라파립은 1일 1회, 총 30일 동안 위내 투여하였다. 구체적인 HuPrime® 방광암BL3325 동물 모델의 투여 경로, 용량 및 방안은 표 20에 나타낸 바와 같다.

표 20: HuPrime® 방광암 BL3325 동물 모델의 투여 경로, 용량 및 방안

참고: 1. 투여 부피 10μL/g; 2. QD×30: 1일 1회, 30일 동안 연속 투여; 3. QW×3: 주 1회, 3주 동안 연속 투여; 4. i.v.: 꼬리 정맥 투여, p.o.: 위내 투여.

시험에서 상이한 일수에 각각의 치료군과 대조군의 종양 성장 상황을 기록하였고, 표 21에 나타낸 바와 같으며, 상응하게 그룹별 마우스의 종양 부피 성장 곡선은 도 11에 도시된 바와 같다. 상대 종양 증식률 및 상대 종양 억제율에 따라 효능을 평가하고, 그룹별 약효 분석은 표 22에 나타낸 바와 같다. 치료군과 대조군의 투여 후 체중 변화를 기록하고, HuPrime® 방광암 BL3325 피하 모델에서 그룹별 안전성을 연구하였으며, 35일차 마우스 체중 변화 결과는 표 23에 나타낸 바와 같고, 치료군별 시간에 따른 체중 변화 그래프는 도 12에 도시된 바와 같다.

표 21: HuPrime® 방광암 BL3325 모델에서 그룹별 마우스의 치료 시간에 따른 종양 부피 변화(mm ³ )

표 22: HuPrime® 방광암 BL3325 피하 모델에서 그룹별 약효 분석표

참고: 1. 데이터는 "평균값±표준오차"로 나타내고; 2. T/C%=T_RTV/C_RTV*100%.

표 23: HuPrime® 방광암 BL3325 피하 모델에서 그룹별 체중 변화 상황

참고: 1. 데이터는 "평균값±표준오차"로 나타낸다.

상기 데이터에 따르면:

80mg/kg, 40mg/kg, 20mg/kg 용량의 시험 약물 TH-302 단일 제제군, 및 TH-302 40mg/kg과 올라파립 50mg/kg의 조합 투여군은 HuPrime® 방광암 BL3325 피하 모델에 모두 유의한 항종양 증식 작용이 있고, 올라파립 50mg/kg 단일 제제군은 유의한 종양 억제 작용이 없다. TH-302 80mg/kg 용량군은 20mg/kg 용량군에 비해 종양 억제 작용에 통계적 차이가 존재하고, 이는 TH-302가 용량 의존적으로 BL3325 종양 성장을 억제함을 나타낸다. 여기서 TH-302 80mg/kg 치료군(그룹 03)에서 1마리의 마우스만 종양이 완전히 제거되고, 제거율은 16.7%이다. TH-302 40mg/kg과 올라파립 50mg/kg의 조합 투여군은 치료 효과가 올라파립 50mg/kg 단일 제제군보다 현저히 우수하며, TH-302 40mg/kg 단일 제제군보다 더 우수하고 차이가 유의하다.

본 발명의 실시예에 사용된 PARP 억제제는 올라파립(Olaparib)이지만, 루카파립(Rucaparib), 니라파립(Niraparib), 탈라조파립(Talazoparib), 플루조파립(Fluzoparib), 파미파립(Pamiparib)도 PARP 억제제에 속하며, 작용 메커니즘은 올라파립(Olaparib)과 유사하고, 모두 손상된 DNA 복구에 참여하는 효소를 차단하며, 따라서 루카파립(Rucaparib), 니라파립(Niraparib), 탈라조파립(Talazoparib), 플루조파립(Fluzoparib), 파미파립(Pamiparib)과 같은 PARPi가 상기 실험 중의 올라파립(Olaparib)과 유사한 종양 억제 효능을 가지고 있음을 유추할 수 있다.

TH-302는 저산소 활성화 DNA 알킬화제이고, 청구항 1의 일반식 화합물:

식 (I)

은 관련 특허출원에서 TH-302과 유사한 메커니즘을 가지고 있다는 것이 입증되었기 때문에, 이러한 화합물이 TH-302와 유사한 효과를 가진다는 것을 충분히 예측할 수 있다.

Claims

식 (I)의 저산소 활성화 화합물을 함유하는 약물을 단독으로 사용하거나 병용하여 PARP 억제제에 내성이 있는 암 또는 종양 환자를 치료하는 치료 방법:
식 (I),
상기 식 (I)에서, R은 각각 독립적으로 H, -CH₃, -CH₂CH₃으로부터 선택되며, X는 각각 독립적으로 Cl, Br, MsO, TsO와 같은 이탈 관능기로부터 선택된다.
제1항에 있어서,
상기 식 (I)의 저산소 활성화 화합물을 함유하는 약물을 PARP 억제제와 병용하여 PARP 억제제에 내성이 있는 암 또는 종양 환자를 치료하는, 치료 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 환자는 DNA 복구 효소가 손상되었거나; 또는
상기 환자의 종양 또는 암 조직에서 BRCA1, BRCA2에 대응되는 유전자 중 임의의 1개의 유전자 돌연변이 또는 2개의 유전자 돌연변이가 있는 것으로 검출되거나; 또는
상기 환자는 BRCA1, BRCA2에 대응되는 유전자 중 임의의 1개의 유전자 돌연변이 또는 2개의 유전자 돌연변이가 있는 것으로 확인되는, 치료 방법.
제3항에 있어서,
BRCA1, BRCA2 돌연변이는 생식세포 돌연변이(gBRCAm) 및 체세포 돌연변이(sBRCAm)의 BRCA1, BRCA2 돌연변이를 포함하는, 치료 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 PARP 억제제는 올라파립(Olaparib), 루카파립(Rucaparib), 니라파립(Niraparib), 탈라조파립(Talazoparib), 플루조파립(Fluzoparib), 파미파립(Pamiparib)으로부터 선택되고;
상기 암 또는 종양은 난소암, 유방암, 췌장암, 나팔관암, 원발성 복막암, 위암, 전립선암, 간암, 결장암, 직장암, 폐암, 방광암으로부터 선택되며, 상기 폐암은 바람직하게는 비소세포폐암, 소세포폐암인, 치료 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 식 (I)의 저산소 활성화 화합물은 하기 구조의 화합물로부터 선택되는 것인, 치료 방법:
.
하기 식의 저산소 활성화 화합물을 함유하는 약물을 단독으로 사용하여 올라파립(Olaparib)에 내성이 있는 난소암, 유방암, 췌장암, 나팔관암, 원발성 복막암, 위암, 전립선암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 간암, 결장암, 직장암, 또는 방광암 환자를 치료하는 치료 방법으로서:
,
상기 환자의 종양 또는 암 조직에서 BRCA1, BRCA2에 대응되는 유전자 중 임의의 1개의 유전자 돌연변이 또는 2개의 유전자 돌연변이가 있는 것으로 검출되거나; 또는 상기 환자는 BRCA1, BRCA2에 대응되는 유전자 중 임의의 1개의 유전자 돌연변이 또는 2개의 유전자 돌연변이가 있는 것으로 확인되는, 치료 방법.
하기 식의 저산소 활성화 화합물을 함유하는 약물을 올라파립(Olaparib)과 병용하여 올라파립(Olaparib)에 내성이 있는 난소암, 유방암, 췌장암, 나팔관암, 원발성 복막암, 위암, 전립선암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 간암, 결장암, 직장암, 또는 방광암 환자를 치료하는 치료 방법으로서:
,
상기 환자의 종양 또는 암 조직에서 BRCA1, BRCA2에 대응되는 유전자 중 임의의 1개의 유전자 돌연변이 또는 2개의 유전자 돌연변이가 있는 것으로 검출되거나; 또는 상기 환자는 BRCA1, BRCA2에 대응되는 유전자 중 임의의 1개의 유전자 돌연변이 또는 2개의 유전자 돌연변이가 있는 것으로 확인되는, 치료 방법.
PARP 억제제에 내성이 있는 암 또는 종양 환자의 BRCA1, BRCA2 유전자 돌연변이 상황을 검출하는 단계; 및
상기 환자에게 BRCA1, BRCA2 유전자 돌연변이가 있는 경우, 식 (I)의 저산소 활성화 화합물을 함유하는 약물을 단독으로 사용하거나 PARP 억제제와 병용하여 치료하는 단계를 포함하는 치료 방법:
식 (I),
상기 식 (I)에서, R은 각각 독립적으로 H, -CH₃, -CH₂CH₃으로부터 선택되며, X는 각각 독립적으로 Cl, Br, MsO, TsO와 같은 이탈 관능기로부터 선택된다.
제3항, 제4항, 제7항, 제8항 또는 제9항에 있어서,
상기 유전자 돌연변이의 TMB(종양 돌연변이 부담) 수준은 중간인, 치료 방법.
단독으로 사용하거나 PARP 억제제와 병용하여 환자의 암을 치료하기 위한 약물의 제조를 위한 식 (I)의 저산소 활성화 화합물의 용도:
식 (I),
상기 환자는 PARP 억제제에 내성이 있는 환자이고;
상기 식 (I)에서, R은 각각 독립적으로 H, -CH₃, -CH₂CH₃으로부터 선택되며, X는 각각 독립적으로 Cl, Br, MsO, TsO와 같은 이탈 관능기로부터 선택된다.
제11항에 있어서,
상기 환자는 DNA 복구 효소가 손상되었거나; 또는
상기 환자의종양 또는 암 조직에서 BRCA1, BRCA2에 대응되는 유전자 중 임의의 1개의 유전자 돌연변이 또는 2개의 유전자 돌연변이가 있는 것으로 검출되거나; 또는
상기 환자는 BRCA1, BRCA2에 대응되는 유전자 중 임의의 1개의 유전자 돌연변이 또는 2개의 유전자 돌연변이가 있는 것으로 확인되는, 용도.
제12항에 있어서,
상기 BRCA1, BRCA2 돌연변이는 생식세포 돌연변이(gBRCAm) 및 체세포 돌연변이(sBRCAm)의 BRCA1, BRCA2 돌연변이를 포함하고;
상기 유전자 돌연변이의 TMB(종양 돌연변이 부담) 수준은 중간인, 용도.
제11항에 있어서,
식 (I)의 저산소 활성화 화합물은 하기 구조의 화합물로부터 선택되는 것이거나:
; 또는
상기 PARP 억제제는 올라파립(Olaparib), 루카파립(Rucaparib), 니라파립(Niraparib), 탈라조파립(Talazoparib), 플루조파립(Fluzoparib), 파미파립(Pamiparib)으로부터 선택되거나; 또는
상기 암 또는 종양은 난소암, 유방암, 췌장암, 나팔관암, 원발성 복막암, 위암, 전립선암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 간암, 결장암, 직장암, 방광암으로부터 선택되는, 용도.
식 (I)의 저산소 활성화 화합물을 함유하는, PARP 억제제에 내성이 있는 암 또는 종양 환자를 치료하기 위한 약물:
식 (I),
상기 식 (I)에서, R은 각각 독립적으로 H, -CH₃, -CH₂CH₃으로부터 선택되며, X는 각각 독립적으로 Cl, Br, MsO, TsO와 같은 이탈 관능기로부터 선택된다.
제15항에 있어서,
상기 환자는 DNA 복구 효소가 손상되었거나; 또는
상기 환자의 종양 또는 암 조직에서 BRCA1, BRCA2에 대응되는 유전자 중 임의의 1개의 유전자 돌연변이 또는 2개의 유전자 돌연변이가 있는 것으로 검출되거나; 또는
상기 환자는 BRCA1, BRCA2에 대응되는 유전자 중 임의의 1개의 유전자 돌연변이 또는 2개의 유전자 돌연변이가 있는 것으로 확인되고, 바람직하게는, BRCA1, BRCA2 돌연변이는 생식세포 돌연변이(gBRCAm) 및 체세포 돌연변이(sBRCAm)의 BRCA1, BRCA2 돌연변이를 포함하는, 약물.