KR20240046081A - 락토바실러스 퍼멘텀 hem1036 균주를 유효성분으로 포함하는 암 치료 부작용 개선용 조성물 - Google Patents

락토바실러스 퍼멘텀 hem1036 균주를 유효성분으로 포함하는 암 치료 부작용 개선용 조성물 Download PDF

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강혜지
김보배
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Abstract

본원의 일 구현예에 따른 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermemtum) HEM1036 균주(KCTC13978BP를 유효성분으로 포함하는 암 치료 부작용 개선용 조성물은 단쇄지방산 조절 및 장내 미생물 균총 변화를 통해, 암 치료 부작용 또는 항암제 복용에 따른 부작용을 예방 또는 치료할 수 있으며, 상기 조성물은 식품 조성물, 건강기능식품 조성물, 약학 조성물 등에 응용될 수 있다.

Description

락토바실러스 퍼멘텀 HEM1036 균주를 유효성분으로 포함하는 암 치료 부작용 개선용 조성물{A COMPOSITION FOR IMPROVING SIDE EFFECTS OF CANCER TREATMENT COMPRISING LACTOBACILLUS FERMENTUM HEM1036 STRAIN AS AN ACTIVE INGREDIENT}
본원은 락토바실러스 퍼멘텀 HEM1036 균주를 유효성분으로 포함하는 암 치료 부작용 개선용 조성물에 관한 것이다. 특히 본원은 LARS, 설사 및 체중감소를 개선하는 조성물에 관한 것이다.
최근 발표된 국가암통계자료를 보면 대장암 발생률은 2019년 기준 인구 10만 명 당 56.5명으로 갑상선암(59.8), 폐암(58.4), 위암(57.4)에 이어 4번째로 높았다(조발생률). 2019년 한해에만 2만9030명이 대장암으로 새롭게 진단받았다. 붉은 고기나 술과 같은 대장암 위험요인에 의해 대장점막에 용종이 생기고, 그 일부가 대장암이 된다. 또 연령에 비례해 발생하는 경향이 있는데, 주로 50세 이상에서 발생한다.
대장암 중 직장암을 수술할 때에는 종양을 중심으로 상방으로 최소한 10㎝, 하방으로 대략 2㎝ 길이의 여유를 두고 절제하므로 종양의 위치에 따라 직장과 S결장의 일부를 절제하게 되고, 남는 S결장 혹은 하행결장을 끌어내려 남는 직장 혹은 항문에 연결하게 된다. 이와 같이 항문으로 배변이 가능하게 하는 수술방법을 ‘저위전방절제술’이라고 하며, 이후에 발생하는 배변곤란 증상들을 통칭해 ‘저위전방절제 증후군(LARS 증후군, Low anterior resection syndrome)’이라고 한다. 저위전방절제 증후군의 증상은 수술 직후에 가장 심하며 1~2년에 걸쳐 점차 개선되지만, 완전히 정상화될 수는 없기 때문에, 직장암 수술 후 발생하는 배변기능의 저하는 영구적인 후유증으로 봐야한다.
저위전방절제 증후군의 원인은 아직 명확히 밝혀지지는 않았지만, 여러 요인이 복합적으로 작용할 것으로 보고 있다. 첫째, 직장의 길이가 짧아짐으로 인하여 대변저장능력이 떨어지는 것이다. 정상인의 경우, 직장에 대변이 충분량 모였을 때 한 번에 배출시킨다고 한다면, 직장암 수술환자의 경우 잔존직장의 길이가 짧아 대변을 모아두는 저장능력이 떨어지므로 조금씩 여러 번에 걸쳐서 대변을 배출하게 되는 것이다. 둘째, 직장암 수술 시에는 직장, S결장, 하행결장의 움직임에 관여하는 신경이 일부 절단될 수밖에 없는데 이로 인하여 잔존직장 및 이에 문합한 S결장, 하행결장의 정상적인 운동기능이 저하된다는 것이다. 셋째, 일부의 직장암 환자는 수술 후 항문괄약근의 기능이 떨어져 항문을 조이는 힘이 약화하는데 이 또한 대변실금 등 배변곤란 증상을 유발하는 원인으로 작용한다고 보고 있다.
한편, 설사는 약물요법을 받는 많은 암 환자에게 흔히 경험할 수 있는 부작용 중 하나다. 물과 같은 변을 하루에 3-4회 이상 보며, 복부의 통증, 회음부의 불편감, 변실금 등을 포함하여, 전해질 불균형 및 탈수와 신장기능 부전을 유발하여 생명에 심각한 영향을 미칠 수도 있다. 일반적으로 화학 요법 약물은 암세포의 성장을 늦추거나 멈추는 방식으로 작용하는데, 이는 암세포 특이적이지 않아 다른 세포에도 영향을 미치면서 부작용을 초래한다. 표적 항암제 또한 비슷한 부작용을 가진다. 표적치료제는 크게 두가지로 세포 증식 및 이동을 비롯한 다양한 생물학적 활성을 갖는 중요한 세포 신호 전달 단백질을 차단하는 티로신 키나아제 저해제(Tyrosine Kinase Inhibitor, TKI)와 세포 표면에서 수용체와 결합을 차단시키는 단클론항체가 있다. 하지만 표적치료제의 초기 개발 당시 대표적인 슬로건이었던 ‘암을 선택적으로 공격한다’는 장점으로 낮은 독성이 기대되었으나 이러한 약제가 상용화되면서 적지 않은 독성 및 일부 환자에서는 치명적인 부작용이 보고되고 있다.
장 점막 세포들의 항암제에 의한 DNA 손상으로 세포 사멸이 유발되고, ROS(Reactive Oxygen Species)와 염증 유발 요소들이 조직에 많아 지면서 조직의 손상, 염증, 궤양 등이 유도되고 장벽의 손상으로 장내의 박테리아가 침투하기 쉬운 환경이 되면서 더욱 염증이 유발되면서 점막염과 함께 설사가 나타난다.
LARS, 설사 외에도 많은 암 치료 또는 항암제 복용에 따른 부작용이 존재하는데, 특히 다수의 암 환자가 심각한 체중감소를 겪고 있다.
이에 대해 대한민국 등록번호 제10-2215592호는 락토바실러스 퍼멘텀 HEM1036을 이용하여 장내 환경을 개선하는 방법을 제안한 바 있으나, 해당 선행문헌은 LARS, 설사 및 체중감소에 대한 효과를 구체적으로 다루고 있지 않다.
대한민국 등록번호 제10-2215592호
본원이 해결하고자 하는 과제는 암 치료 부작용 개선용 조성물을 제공하는 것을 포함한다. 특히 본원에 따른 조성물을 통해 LARS, 설사 및 체중감소를 개선하고자 한다.
본원의 제1측면은, 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermemtum) HEM1036 균주(기탁번호 KCTC13978BP)를 유효성분으로 포함하는 암 치료 부작용 개선용 조성물을 제공한다.
본원의 다른 측면은, 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermemtum) HEM1036 균주(기탁번호 KCTC13978BP)를 유효성분으로 포함하는 암 치료 부작용 개선용 식품 조성물, 건강식품 조성물, 약학 조성물을 제공한다.
각 측면에 있어서 암 치료 부작용이란 저위전방절제증후군(LARS), 설사 및 체중감소를 의미한다.
본원의 일 구현예에 따른 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermemtum) HEM1036 균주(KCTC13978BP)를 유효성분으로 포함하는 암 치료 부작용 개선용 조성물은 단쇄지방산 조절 및 장내 미생물 균총 변화를 통해, 암 치료 부작용 또는 항암제 복용에 따른 부작용을 예방 또는 치료할 수 있으며, 상기 조성물은 식품 조성물, 건강기능식품 조성물, 약학 조성물 등에 응용될 수 있다.
도 1a는 HEM1036 복용 전후의 분변 내 단쇄지방산 변화를 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 1b는 HEM1036 복용 전후의 분변 내 단쇄지방산과 LARS 점수의 상관관계를 나타낸 도면이다.
도 2는 HEM1036 복용 전 일반인과 LARS(Low anterior resection syndrome, 저위전방절제 증후군) 환자군의 분변 내 단쇄지방산을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 HEM1036 복용 후 일반인과 LARS(Low anterior resection syndrome, 저위전방절제 증후군) 환자군의 단쇄지방산 생성능을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4a는 저위전방절제 증후군 점수 측정을 위한 설문지를 나타낸 도면이다.
도 4b는 HEM1036 복용 전후의 LARS(Low anterior resection syndrome, 저위전방절제 증후군) 질병점수를 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 HEM1036 복용 전후의 암환자 삶의 질 점수를 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 HEM1036 복용 전후의 장내 미생물 풍부도 변화를 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7a는 락토바실러스 퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum) HEM1036 균주 처리에 따른 항암제 유도 체중 감소 개선능 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 7b는 락토바실러스 퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum) HEM1036 균주 처리에 따른 항암제 유도 설사 개선능 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 7c는 락토바실러스 퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum) HEM1036 균주 처리에 따른 항암제에 의한 장 길이 감소 억제능 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 7d는 락토바실러스 퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum) HEM1036 균주 처리에 따른 항암제 유도 설사 개선 결과를 나타낸 도면이다.
도 7e는 락토바실러스 퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum) HEM1036 균주 처리에 따른 항암제 유도 염증 조직 관찰 결과를 나타낸 도면이다.
도 8a는 항암제 유도 설사 모델에서 대장의 밀착연결 단백질(Occludin)의 발현량을 정량적 실시간 중합효소연쇄반응(qRT-PCR) 을 통하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8b는 항암제 유도 설사 모델에서 대장의 밀착연결 단백질(ZO-1)의 발현량을 정량적 실시간 중합효소연쇄반응(qRT-PCR) 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8c는 항암제 유도 설사 모델에서 대장의 밀착연결 단백질(Occludin)의 발현량을 면역조직화학염색(immunohistochemistry)을 통하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8d는 항암제 유도 설사 모델에서 대장의 염증성 사이토카인(TNFα)의 발현량을 qRT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8e는 항암제 유도 설사 모델에서 염증성 사이토카인(IL-1β)의 발현량을 qRT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9a는 항암제 유도 설사 모델에서 소장의 융모 길이 회복능을 확인한 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 9b는 항암제 유도 설사 모델에서 소장의 융모 길이(Villi/Crypt) 회복능을 확인한 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 9c는 항암제 유도 설사 모델에서 소장의 융모 조직 구조 회복을 확인한 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 10a는 항암제 유도 설사 모델에서 대장의 전해질 균형 관련 유전자(Clca1)의 발현량을 qRT-PCR을 통하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10b는 항암제 유도 설사 모델에서 대장의 전해질 균형 관련 유전자(CFTR)의 발현량을 qRT-PCR을 통하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10c는 항암제 유도 설사 모델에서 대장의 전해질 균형 관련 유전자(ANO1)의 발현량을 qRT-PCR을 통하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10d는 항암제 유도 설사 모델에서 대장의 전해질 균형 관련 유전자(NKCC1)의 발현량을 qRT-PCR을 통하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10e는 항암제 유도 설사 모델에서 대장의 전해질 균형 관련 유전자(NHE3)의 발현량을 qRT-PCR을 통하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10f는 항암제 유도 설사 모델에서 대장의 전해질 균형 관련 유전자(SGLT1)의 발현량을 qRT-PCR을 통하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10g는 항암제 유도 설사 모델에서 대장의 전해질 균형 관련 유전자(DRA)의 발현량을 qRT-PCR을 통하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11a는 암 화학요법 모델에서 항암제(5FU)와 L. fermentum HEM1036 균주 처리에 따른 종양(cancer burden) 감소 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11b는 암 화학요법 모델에서 L. fermentum HEM1036 균주 처리에 따른 항암제 유도 체중 감소의 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11c는 암 화학요법 모델에서 L. fermentum HEM1036 균주 처리에 따른 항암제 유도 체중 감소의 개선 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11d는 암 화학요법 모델에서 L. fermentum HEM1036 균주 처리에 따른 항암제 유도 종양 외 체중 감소의 개선 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11e는 암 화학요법 모델에서 L. fermentum HEM1036 균주 처리에 따른 종양 무게 변화를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우 뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서 사용하는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용하는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~ 를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합(들)"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B"의 기재는 "A 또는 B, 또는 A 및 B"를 의미한다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되지 않을 수 있다.
본원발명은, 대한민국 등록번호 제10-2215592호에 따른 HEM1036 균주의 암 치료 부작용, 특히 저위전방절제증후군(LARS), 설사 및 체중감소에 대한 개선 용도에 관한 것이다. 상기 특허에 의하면 HEM1036 균주는 장내 환경을 개선하는 용도로 사용되며, 유익한 단쇄지방산으로서 뷰티르산의 증가, 프로피온산의 증가, 및 유해한 단쇄지방산으로서 아이소뷰티르산의 감소 효과가 있다.
그러나 상기 특허는 일반인의 장내 환경 개선 효과에 집중한 것으로, 해당 균주를 통해 장내환경을 개선할 수 있으나, 구체적으로 어떻게 대장암환자의 LARS 증후군 또는 설사를 개선하는지에 대해 개시하고 있지 않다. 또한 체중감소 개선효과에 대해서는 언급하고 있지 않다.
본 출원인이 실제 LARS 환자군의 분변 내 단쇄지방산을 분석한 결과, 정상군에 비해 단쇄지방산이 유의적으로 많은 것을 확인하였다(실시예 2). 이에 대해 본 출원인은 대장암환자, 특히 실제로 전위전방절제술을 받은 환자군에 대해서 HEM1036 균주 섭취 실험을 진행했으며, 상기 특허의 개시내용과 달리 HEM1036 균주가 단순히 유익한 단쇄지방산은 증가, 유해한 단쇄지방산은 감소시키는 것이 아니라 총 단쇄 지방산(totalSCFA) 및 아세트산의 양을 정상수준으로 감소시키는 것을 확인하였다(실시예 3).
이외에도 LARS, 설사, 체중감소 개선과 관련이 있는 장 투과성 염증, 소장 융모 길이 감소 등에 대해서도 본원에 따른 조성물을 투여하여 증상 개선 효과를 볼 수 있음을 확인하였다.
본원의 제 1 측면은, 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermemtum) HEM1036 균주(KCTC13978BP)를 유효성분으로 포함하는 암 치료 부작용 개선용 약학 조성물을 제공한다.
본원의 다른 측면은, 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermemtum) HEM1036 균주(기탁번호 KCTC13978BP)를 유효성분으로 포함하는 암 치료 부작용 개선용 식품 조성물, 건강식품 조성물, 약학 조성물을 제공한다. 제1측면과 공통되는 내용은 다른 측면의 조성물들에도 공히 적용된다.
각 측면에 있어서 암 치료 부작용이란 저위전방절제증후군(LARS), 설사 및 체중감소를 의미한다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 총 단쇄 지방산(totalSCFA) 및 아세트산의 양을 감소시키는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 TNFα 또는 IL-1β 발현량을 감소시키는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 Clca1, CFTR, ANO1, NKCC1, NHE3, SGLT1, DRA로 이루어진 단백질 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "치료"는 본원의 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermemtum) HEM1036 균주(KCTC13978BP)를 포함하는 암 치료 부작용 개선용 약학 조성물을, 암을 치료 받거나 항생제를 복용한 개체에 투여하여 치료나 복용에 따른 부작용이 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "LARS(Low anterior resection syndrome, 저위전방절제 증후군)"는 구불결장 및 직장암에 대한 수술인 전방절제술(anterior resection), 저위전방절제술(low anterior resection) 또는 초저위전방절제(ultra-low anterior resection) 수술을 받고 나서 발생하는 배변습관의 변화 혹은 배변곤란 증상을 말한다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제제화하여 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학 조성물을 제제화할 경우, 일반적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 또는 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있으나", 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 또는 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 균주의 사균체에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose), 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 예를 들어, 단순한 부형제 이외에도 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 비경구 투여를 위한 제제로는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 비수성용제 또는 현탁제로는, 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 좌제로는, 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따른 약학 조성물은 의약품 조성물 또는 의약외품 조성물일 수 있다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함된다.
본원의 상기 의약외품 조성물은 바디 클렌저, 소독 청결제, 세정제, 주방용 세정제, 청소용 세정제, 치약, 가글제, 물티슈, 세제, 비누, 핸드 워시, 헤어세정제, 헤어 유연제, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 및 필터 충진제로 이루어진 군에서 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본원의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본원의 약학 조성물은 단독으로 투여하거나 공지된 암 치료 부작용에 대한 치료 효과를 나타내는 것으로 알려진 성분과 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 성인 1인당 약 0.1ng 내지 약 1,000 mg/kg, 바람직하게는 1 ng 내지 약 100 mg/kg로 투여할 수 있고, 본원의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량 또는 투여횟수는 어떠한 면으로든 본원의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 락토바실러스 퍼멘텀 HEM1036 균주, 이의 생균체, 이의 사균체, 이의 배양물, 이의 파쇄물 및/또는 이의 추출물을 포함하는 것일 수 있다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "사균체"는 생균의 반대되는 개념으로서 발효를 통해 얻어진 생균과 대사산물들을 열처리 등에 의해 균의 성장이 일어나지 못하도록 한 형태를 의미한다. 사균체는 세포질(cytoplasm), 세포벽(cell wall), 박테리오신(bacteriocin) 등의 항균활성 물질, 다당류(polysaccharide), 유기산 등을 포함할 수 있다. 상기 사균체를 이용한 제품은 생균 제품과 비교하여 높은 안정성을 가지고 있으며, 특히 내열성이 우수하며, 외부 환경에 대한 안정성이 높아 기존 생균 제품보다 보관이 용이하고 유통기간을 늘릴 수 있다는 장점을 가지고 있다. 또한, 항생제 사용에 대한 규제가 강화되고 있기 때문에 대체제로서의 활용성과 아직 사균체 제품 생산에 본격적으로 뛰어든 업체가 손에 꼽을 정도이기 때문에 시장성과 성장가능성이 매우 크다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "배양물"은 본원의 균주를 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 배양시켜 수득한 사물을 의미하며, "배양액"과 혼용하여 사용될 수 있다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강 기능 식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다.
본원의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고 휴대성이 뛰어나므로, 본 발명의 식품은 장내 환경 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
상기 건강 식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강 보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강 식품, 건강 보조 식품의 용어는 혼용될 수 있다. 구체적으로, 상기 건강 기능 식품은 본원의 락토바실러스 퍼멘텀 HEM1036 균주를 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.
본원의 식품 조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 우울증 개선에 대하여 높은 효과를 기대할 수 있으므로, 매우 유용하게 사용될 수 있다.
상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신 (niacin), 비오틴 (biotin), 폴레이트 (folate), 판토텐산 (panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
본원의 락토바실러스 퍼멘텀 HEM1036 균주는 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 식품 조성물은 식품 또는 음료에 대하여 50 중량부 이하, 구체적으로 20 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본원의 식품 조성물의 일 예로 건강음료 조성물로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강음료 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 ∼ 0.04 g, 구체적으로 약 0.02 ∼ 0.03 g이 될 수 있다.
상기 외에 건강음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강음료 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본원의 식품 조성물은 장내 환경 개선 효과를 나타낼 수 있다면 본원의 락토바실러스 퍼멘텀 HEM1036 균주를 다양한 중량%로 포함할 수 있으며, 구체적으로 본원의 락토바실러스 퍼멘텀 HEM1036 균주를 식품 조성물의 총 중량 대비 0.00001 내지 100 중량% 또는 0.01 내지 80 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본원의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 본원의 이해를 돕기 위하여 예시하는 것 일뿐, 본원의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 연구대상자 군, 균주 섭취 전-후 단쇄지방산의 양 변화 비교
(1) 단쇄지방산 분석
연구대상자 군(대장암 환자 중 전위전방절제술 시행 및 항암 완료 환자군)에 대해 본원에 따른 조성물 섭취 전과 후의 분변 내 총단쇄지방산(totalSCFA)과 세부적으로 아세트산(Acetate), 프로피온산(Propionate), 뷰티르산(Butyrate)의 양을 비교했다.
분변시료(총 26명의 연구대상자의 섭취 전과 후의 분변시료) 0.2 g 전자저울로 칭량하여 1 mL의 증류수를 첨가한 후 충분히 교반하여 균질화했다. 13000rpm, 4도에서 10분간 원심분리 후 150 ㎕을 GC용 바이알에 넣고, 150 ㎕의 GC 버퍼 용액을 분주한 뒤 GC-FID로 분석했다(도 1a).
GC(gas chromatography) 용 바이알에 대사체 분석을 위한 GC 버퍼용액 100 ㎕ [GC 버퍼용액 조성: 증류수 10 mL, (NH4)2SO4 8.82g, monosodium phosphate 2.38g, phosphoric acid 50 ㎕, 2-ethyl butyric acid 0.5 ㎕]. 증류수 50 ㎕, 상등액 50 ㎕씩 분주하였으며, GC-FID(flame ionization detector) 분석법을 활용하여 미생물 생산 대사체인 6 종의 단쇄지방산(아세트산, 프로피온산, 뷰티르산, 이소뷰티르산, 발레르산, 이소발레르산)을 분석했다.
총 단쇄지방산(totalSCFA)의 양은 아세트산, 프로피온산, 뷰티르산의 정량값을 더하여 산출하였으며, 26명의 연구대상자별로 섭취전과 후의 단쇄지방산양을 비모수적 대응비교 분석 (Wilcoxon signed-rank test)하여 비교했다.
26명의 연구대상자의 점수를 대응표본 비모수 검정(Wilcoxon signed-rank test)하여 전후 차이의 유의성을 평가했다. 그 결과 본원에 따른 조성물은 6종의 단쇄지방산 중에서 총 단쇄 지방산(totalSCFA) 및 아세트산의 양을 유의하게 감소시킴으로써 장운동성을 개선하고 이를 통하여 설사 및 잦은 배변과 같은 이상(abnormal) 배변습관을 완화시키는 것을 확인했다.
(2) 분변 내 단쇄지방산과 LARS 점수의 상관관계 확인
26명의 연구대상자의 섭취 전후의 단쇄지방산양과 LARS점수의 상관관계를 확인했다. 연구대상자의 본원에 따른 조성물섭취 전후 분변 내 각 단쇄지방산 양(totalSCFA, AmM, PmM, BmM)과 LARS점수의 상관관계를 산점도로 나타냈으며, 피어슨 상관계수로 계산하여 표현했다(도 1b) 도면에서 빗금으로 표시되거나 검은색으로 채워진 그래프는 섭취 전(V1)을, 다수의 점으로 표시된 그래프는 섭취 후(V2)를 의미한다.
총 단쇄지방산은 LARS점수와 유의적인 양의 상관관계를 보였으며 (실선 상자, 피어슨R = 0.445), 세가지 주요 단쇄지방산 중 특별히 아세트산이 LARS점수와 유의적인 양의 상관관계(피어슨 상관관계 R = 0.478)를 보였다 (각 단쇄지방산과 LARS점수의 상관관계 및 산점도; 점선 상자).
실시예 2. 정상군-LARS 환자군, 균주 미섭취 시 단쇄지방산의 양 비교
정상군과 LARS환자의 분변시료(각 그룹별 24명의 분변시료) 0.2 g을 전자저울로 칭량하여 1 mL의 증류수를 첨가한 후 충분히 교반하여 균질화했다. 이후 13000rpm, 4도에서 10분간 원심분리 후 150 ㎕을 GC용 바이알에 넣고, 150 ㎕의 GC 버퍼 용액을 분주한 뒤 GC-FID로 분석했다.
GC(gas chromatography)용 바이알에 대사체 분석을 위한 GC 버퍼용액 100 ㎕ [GC 버퍼용액 조성: 증류수 10 mL, (NH4)2SO4 8.82g, monosodium phosphate 2.38g, phosphoric acid 50 ㎕, 2-ethyl butyric acid 0.5 ㎕], 증류수 50 ㎕, 상등액 50 ㎕씩 분주하였으며, GC-FID(flame ionization detector) 분석법을 활용하여 미생물 생산 대사체인 6 종의 단쇄지방산(아세트산, 프로피온산, 뷰티르산, 이소뷰티르산, 발레르산, 이소발레르산)을 분석했다.
총 단쇄지방산(totalSCFA)의 양은 아세트산, 프로피온산, 뷰티르산의 정량값을 더하여 산출하였으며, 정상군과 LARS환자의 그룹별 분변내 총단쇄지방산, 아세트산, 뷰티르산을 독립표본 T검정을 실시하여 평균(도 2 그래프 내 검은색 점)비교했다.
그 결과, 기본적으로 LARS환자의 분변에서 전체적인 분변 내 단쇄지방산이 건강한 사람에 비해 유의적으로 많은 것을 확인할 수 있었다(도 2).
실시예 3. 정상군-LARS 환자군, 균주 섭취 시 분변 내 단쇄지방산의 양 비교
(1) PMAS(Personalized Pharmaceutical Meta-Analysis Screening) 기법을 이용한 HEM1036 균주 배양
본원의 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) HEM1036 균주에 의한 단쇄지방산 생성량을 확인하기 위해, 하기와 같이 주식회사 에이치이엠파마(본 출원인)의 PMAS 기법(등록특허 제10-2227382호, 제10-2124474호 참조)을 이용해 LARS 환자의 분변 시료를 이용하여 체외 (in vitro) 조건에서 스크리닝 배양을 수행했다.
장 환경 유사배지는 NaCl, NaHCO3, KCl, 헤민 (Hemin), mucin, L-cysteine, resazurin등 조성물을 포함한다.(이하, PMAS 배지)
먼저, 상기 조성의 PMAS 배지를 준비한 후, 혐기챔버(whitly A95 anaerobic workstation)에서 24시간 동안 혐기 치환하여 배지를 혐기 상태로 준비 했다.
혐기챔버 내에서 정상군 또는 LARS 환자의 분변을 PMAS 배지에 균질화 한 후, 거름망을 이용하여 변의 잔여물을 걸러내었다.
96-웰 플레이트에 균을 처리하지 않은 대조군(NC, negative control) 웰에는 상기 균질화된 시료를 분주하고, 실험군 웰에는 상기 균질화된 시료와 Lactobacillus fermentum HEM1036 을 분주했다.
다음으로, 상기 실험군 및 대조군이 분주된 96-웰플레이트를 24시간 동안 혐기챔버에서 교반기를 이용하여 배양했다.
(2) 단쇄지방산 생성량 비교
상기에서 수행한 PMAS 스크리닝의 배양 후 96-웰 플레이트를 이용하여, 3800rpm으로 상온에서 10분간 원심분리한 후 각 웰의 상등액을 96-웰 세포배양 플레이트로 옮겼다. 다음으로 GC(gas chromatography)용 바이알에 대사체 분석을 위한 GC 버퍼용액 100 ㎕ [GC 버퍼용액 조성: 증류수 10 mL, (NH4)2SO4 8.82g, monosodium phosphate 2.38g, phosphoric acid 50 ㎕, 2-ethyl butyric acid 0.5㎕], 증류수 50㎕, 상등액 50㎕씩 분주하였으며, GC-FID(flame ionization detector) 분석법을 활용하여 미생물 생산 대사체인 6 종의 단쇄지방산(아세트산, 프로피온산, 뷰티르산, 이소뷰티르산, 발레르산, 이소발레르산)을 분석했다(도 3).
이를 실시예 2의 결과와 비교하여 균주 처리에 따른 단쇄지방산 비율 변화를 확인했다(도 2, 도 3). 이외에도 배양하지 않은 분변시료도 GC-FID로 분석하여 배양 유무에 따른 단쇄지방산 변화를 확인했다.
배양하지 않은 분변 시료는 0.2 g 전자저울로 칭량하여 1 mL의 증류수를 첨가한 후 충분히 교반하여 균질화했다. 13000rpm, 4도에서 10분간 원심분리 후 150㎕을 GC용 바이알에 넣고, 150㎕의 GC 버퍼 용액을 분주한 뒤 GC-FID로 분석했다.
HEM1036을 처리한 웰과 대조군(균주처리 없이 PMAS배양한 well)의 단쇄지방산 차이를 통하여 단쇄지방산 변화량을 계산하였으며, LARS환자 분변에서의 단쇄지방산 변화량과 건강한 사람 분변에서의 단쇄지방산 변화량의 평균을 독립표본 T검정으로 비교한 후 P-value를 표시했다. 점선 (y=0) 보다 아래로 내려간 경우, PMAS에서 HEM1036처리시에 대조군보다 단쇄지방산이 감소하였음을 의미한다.
분석 결과 6종의 단쇄지방산 중 총 단쇄 지방산(totalSCFA) 및 아세트산의 양이 유의적으로 감소한 것을 확인했다.
실시예 4. LARS 환자군, 균주 섭취 전-후 LARS 질병 점수 비교(균주 섭취 전-후)
LARS 환자를 대상으로 HEM 1036 섭취 전과 후의 LARS 문진 응답 점수를 비교하였으며, 26명의 연구대상자의 점수를 대응표본 비모수 검정(Wilcoxon signed-rank test)하여 전후 차이의 유의성을 평가했다(도 4a). 그 결과, HEM 1036균주 섭취를 통하여 유의적으로 LARS질병 점수가 호전됨을 확인할 수 있었다.
또한 Kim et al (2021) 논문에 따르면 LARS문항은 변실금 증상 관련 문항(Q1 - Q2)과 잦은 배변 증상 관련 문항(Q3 - Q5)으로 분류할 수 있는데, HEM 1036균주를 섭취하면 특별히 잦은 배변 증상이 유의적으로 개선됨을 알 수 있었다(도 4b).
실시예 5. 암환자 군, 균주 섭취 전-후 문진 응답 점수 비교
대장암환자 군을 대상으로 본원에 따른 조성물 섭취 전과 후의 암환자 삶의 질 문진 응답 점수를 비교하였으며, 26명의 연구대상자의 점수를 대응표본 비모수 검정(Wilcoxon signed-rank test)하여 전후 차이의 유의성을 평가했다. 삶의 질(Global health status/QoL)과 기능척도에 해당하는 모든 지표들과 오심과 구토, 호습곤란, 경제적 어려움(Nausea and vomiting, Dyspnoea, Financial difficulties)를 제외한 증상척도 관련 지표들의 전후 비교 결과를 도면으로 표현했다.
그 결과, HEM1036균주 섭취를 통하여 전반적으로 삶의 질 및 기능척도가 증가하고 증상척도가 개선되는 것을 확인할 수 있었다(도 5). 특히 증상척도 중 설사(Diarrhea) 항목이 HEM1036 균주 섭취를 통해 유의적으로 개선되는 것을 확인했다.
실시예 6. 연구대상자군, 장내 미생물 풍부도 변화 확인
(1) 장내 미생물 풍부도 분석 방법
분변시료(총 26명의 연구대상자의 섭취 전과 후의 분변시료)에서의 장내 마이크로바이옴 분석은 분변 시료 내 유전체를 전부 추출한 후, 박테리아 특이적 프라이머를 사용한 NGS(Next generation sequencing) 방식으로 유전체 기반의 16S rRNA V3-V4 region NGS 분석을 일루미나 Miseq System으로 수행했다. 시퀀싱 결과는 Qiime2*에서 dada2 denoising방법을 활용하여 데이터 전처리했다.
통계분석은 R (ver.4.1.1)의 phyloseq 패키지를 활용하여 각 분변 샘플 시퀀싱 결과에서 알파다양성을 계산하였으며, 26명의 연구대상자별로 섭취전과 후의 분변 내 미생물 알파다양성을 비모수적 대응비교 분석 (Wilcoxon signed-rank test)하여 비교했다.
(2) 분석 결과
HEM1036 균주 섭취 전과 후의 분변 내 장내미생물(마이크로바이옴) 알파다양성을 비교하였으며, 26명의 연구대상자의 점수를 대응표본 비모수 검정(Wilcoxon signed-rank test)하여 전후 차이의 유의성을 평가했다. 장내미생물의 풍부도(richness)를 평가하는 Observed, Chao1, ACE, Fisher 척도의 경우 HEM1036 섭취 후 유의적으로 증가하였으며, 장내미생물의 풍부도(richness)와 다양성(homogeneity)을 함께 평가하는 Shannon, Simpson등의 척도 또한 통계적으로 유의적이지는 않지만 섭취 후 증가하는 경향을 보였다.(도 6)
실시예 7. 마우스 모델에서 HEM1036 투여에 의하여 나타나는 설사 및 체중감소 개선 효과 확인
본원의 락토바실러스 퍼멘텀 HEM1036 (Lactobacillus fermentum)의 화학요법에 의한 설사 개선 기능성을 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행했다.
(1) 동물 사육
6주령 수컷 balb/c 마우스를 각각 대조군(Ctrl), 항암제 투여 설사 유도군(5-FU), 항암제 투여 설사 유도 및 HEM1036(1036) 투여군으로 구분하여 실험을 진행했다.
4주령 수컷 Balb/c 마우스를 구입하여 2주간 사육 시설 적응기간을 거친 후 총 3주간 L. fermentum HEM1036을 투여하였고, 이후 5일간 매일 5-FU를 복강주사한 후 2일간 세척기(wash out)를 가진 후 동물을 희생했다.
No. 그룹명 동물 수 CID 유도 처치
(복강주사) 		물질 투여(경구) 비고
1 Ctrl 7 1X PBS 1X PBS 200 ㎕/day 정상 대조군
2 5-FU 8 5FU 30 mpk 1X PBS 200 ㎕/day 항암제 투여 설사 유도군
3 1036 8 5FU 30 mpk HEM1036 1X109 CFU/200 ㎕/day HEM1036 투여군
(2) 조직 분석
동물 희생 시, 마우스의 혈액, 대장, 맹장, 소장, 분변을 적출하여 정량적 실시간 중합효소연쇄반응(qRT-PCR), 일반조직염색 및 면역조직화학염색으로 설사 및 염증 관련 지표 발현량과 단백질량을 확인했다. 통계적 유의성 분석은 one-way ANOVA (Dunnett's comparison)을 사용했다.
(3) 락토바실러스 퍼멘텀 HEM1036의 항암제 유도 설사 및 체중 개선능 확인
항암제 투여에 의한 부작용 중 체중 감소와 설사에 대해, 본원 조성물 투여에 의한 개선 정도를 확인하기 위하여, 3주간 PBS 또는 HEM1036을 경구 투여한 마우스에서 5FU에 의한 체중 감소 정도 및 설사 점수(diarrhea score)를 비교했다.
항암제 투여 전 체중을 측정하여 기준무게로 설정하고, 이후 5FU를 매일 1회 30mpk로 복강주사하고 체중 및 분변의 설사 정도를 확인하고 점수를 부여했다. 또한 동물 희생 후 대장의 길이를 측정하고 대장 내 분변의 덩어리짐 정도를 확인하여 설사 점수의 적합성을 재확인했다. 마지막으로 대장에서 H&E 조직 염색을 실시하여 조직의 모양 및 염증 상태를 비교했다.
그 결과 질환 유도 대조군에 비하여 L. fermentum HEM1036을 투여한 그룹에서 유의미하게 체중 감소가 억제되었으며(도 7a), 설사 점수 및 대장 길이가 유의적으로 개선되었고(도 7b, 도 7c, 도 7d), 조직의 염증 정도가 낮아짐을 확인했다(도 7e).
상기 결과를 토대로, 본원의 L. fermentum HEM1036 균주는 항암제 투여시 부작용으로 나타나는 체중 감소 및 설사의 개선에 효과가 있음을 알 수 있다.
실시예 8. LARS, 설사, 체중감소 개선에 영향을 줄 수 있는 인자 확인
LARS, 설사, 체중감소의 개선에 영향을 줄 수 있는 인자로서 장 투과성, 소장 융모 길이, 전해질 균형 지표 변화를 확인했다.
(1) 장 투과성 및 염증 지표 개선능 확인
마우스 모델 및 분석 정보는 실시예 7의 (1), (2)와 동일하다.
항암제 투여 시 나타나는 대장의 장 투과성 및 염증의 증가가 본원의 L. fermentum HEM1036 균주 투여에 의하여 개선되는지 확인하기 위하여, 동물 희생 시 적출한 대장(colon)에서 관련 지표들의 변화를 확인했다. 장 투과성과 밀접한 연관을 보이는 밀착연접단백질(tight junction protein)인 Occludin과 ZO-1의 발현량을 정량적 실시간 중합효소연쇄반응(qRT-PCR)을 통하여 확인하였을 때, L. fermentum HEM1036 균주 투여에 의하여 유의적으로 개선됨을 확인하였고(도 8a, 도 8b), 대장조직에서 Occludin에 대한 면역조직화학염색을 실시하여 단백질의 증가를 확인했다(도 8c). 또한 염증성 사이토카인으로 알려져있는 TNFα과 IL-1β의 발현량을 qRT-PCR로 확인하였을 때 질환 대조군 대비 유의적으로 감소함을 확인했다(도 8d, 도 8e).
(2) 소장 융모 길이 개선 확인
마우스 모델 및 분석 정보는 실시예 7의 (1), (2)와 동일하다.
설사 모델에서 나타나는 소장 융모 길이의 감소가 본원의 L. fermentum HEM1036 균주 투여에 의하여 개선되는지 확인하기 위하여, 동물 희생 시 적출한 소장(small intestine) 중 공장(jejunum)에서 H&E 조직염색을 실시하고 융모(villi)와 선와(crypt)의 길이를 Image J 소프트웨어로 측정하여 비교했다.
실험 결과, L. fermentum HEM1036 투여 그룹에서 질환 유도 대조군에 비하여 융모 길이(villi length) 및 융모/선와 (villi/crypt) 비율이 유의적으로 개선됨을 확인했다(도 9a, 도 9b, 도 9c).
(3) 전해질 균형 지표의 변화 확인
마우스 모델 및 분석 정보는 실시예 7의 (1), (2)와 동일하다.
설사 모델에서 나타나는 전해질 균형 지표의 불균형이 본원의 L. fermentum HEM1036 균주 투여에 의하여 개선되는지 확인하기 위하여, 항암제 투여 모델에서 적출한 대장에서 전해질 수송 관련 단백질의 변화를 정량적 실시간 중합효소연쇄반응(qRT-PCR)으로 확인했다. 실험 결과, 질환 유도 대조군에서 전해질 수송 단백질인 Clca1, CFTR, ANO1, NKCC1, NHE3, SGLT1, DRA의 발현이 저하되고, 이것이 L. fermentum HEM1036 균주 투여에 의하여 유의적으로 증가하는 것을 확인했다(도 10a - 도 10g).
실시예 9. 대장암 마우스 모델 HEM1036 투여에 의한 체중 감소 억제 효과 확인
(1) 동물 사육
6주령 수컷 balb/c 마우스를 각각 정상대조군(NC), 암유발대조군(DC), 항암제 투여 대조군(5-fluorouracil, 5FU) 및 HEM1036 투여군(Low, High)으로 구분하여 실험을 진행했다.
No. 그룹명 동물 수 항암제 처치
(복강주사) 		물질 투여
(경구) 		비고
1 NC 8 1X PBS 1X PBS 200 ㎕/day 정상 대조군
2 DC 8 1X PBS 1X PBS 200 ㎕/day 암유발 대조군
3 5FU 8 5FU 30 mpk/every other day 1X PBS 200 ㎕/day 항암제 투여 대조군
4 Low 8 5FU 30 mpk/every other day HEM1036 1X108 CFU/200 ㎕/day HEM1036 저용량 투여군
5 High 8 5FU 30 mpk/every other day HEM1036 1X109 CFU/200 ㎕/day HEM1036 고용량 투여군
4주령 수컷 Balb/c 마우스를 구입하여 2주간 사육 시설 적응기간을 거친 후 CT26 마우스 대장암세포(murine colorectal carcinoma)를 5X105 cells/mouse로 1회 경피주사한 후 다음날부터 HEM1036은 매일 경구투여, 5FU는 2일 간격으로 복강주사하면서 체중 및 암 크기를 측정했다. 총 3주간 사육 후 동물을 희생했다. 동물 희생시 체중 및 암 무게를 측정했다.
(2) 암 화학요법 모델에서 락토바실러스 퍼멘텀 HEM1036의 체중 감소 억제능 확인
Balb/c 마우스 유래 대장암세포주인 CT26을 주사하여 암을 발생시키고 화학요법 약제인 5FU를 처리하여 암 화학요법을 모델링한 마우스에서 항암제 부작용으로 나타나는 체중 감소가 본원의 L. fermentum HEM1036 균주 투여에 의하여 억제되는지 확인하기 위하여, L. fermentum HEM1036 균주를 저용량(1X108 CFU/mouse/day)과 고용량(1X109 CFU/mouse/day)으로 투여하고 체중 및 암의 크기 변화를 측정했다.
확인 결과, 항암제 투여 대조군과 비교하였을 때 L. fermentum HEM1036 투여에 의하여 암 크기 및 무게의 변화는 발생하지 않은 반면, 암제외체중(cancer free body weight) 및 체중 감소 정도가 유의적으로 억제됨을 확인했다(도 11a - 도 11e).
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국생명공학연구원 KCTC13978BP 20191008

Claims (7)

  1. 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermemtum) HEM1036 균주(기탁번호 KCTC13978BP)를 유효성분으로 포함하는 암 치료 부작용 개선용 조성물에 있어서,
    상기 암 치료 부작용은 저위전방절제증후군(LARS), 설사 및 체중감소인 것인, 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 총 단쇄 지방산(totalSCFA) 및 아세트산의 양을 감소시키는 것인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 TNFα 또는 IL-1β 발현량을 감소시키는 것인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 Clca1, CFTR, ANO1, NKCC1, NHE3, SGLT1 및 DRA으로 이루어진 단백질 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 발현을 증가시키는 것인, 조성물.
  5. 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermemtum) HEM1036 균주(기탁번호 KCTC13978BP)를 유효성분으로 포함하는 암 치료 부작용 개선용 식품 조성물에 있어서,
    상기 암 치료 부작용은 저위전방절제증후군(LARS), 설사 및 체중감소인 것인, 조성물.
  6. 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermemtum) HEM1036 균주(기탁번호 KCTC13978BP)를 유효성분으로 포함하는 암 치료 부작용 개선용 건강기능식품 조성물에 있어서,
    상기 암 치료 부작용은 저위전방절제증후군(LARS), 설사 및 체중감소인 것인, 조성물.
  7. 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermemtum) HEM1036 균주(기탁번호 KCTC13978BP)를 유효성분으로 포함하는 암 치료 부작용 개선용 약학 조성물에 있어서,
    상기 암 치료 부작용은 저위전방절제증후군(LARS), 설사 및 체중감소인 것인, 조성물.
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