KR20240045241A - 붕소 중성자 포획 요법에 사용하기 위한 BTS 및 BTS(OMe)를 포함하는 보릴화 아미노산 조성물 및 그의 방법 - Google Patents
붕소 중성자 포획 요법에 사용하기 위한 BTS 및 BTS(OMe)를 포함하는 보릴화 아미노산 조성물 및 그의 방법 Download PDFInfo
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Classifications
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Abstract
티로신 유도체 BTS 및 BTS(OMe)를 포함하는 보릴화 아미노산 조성물, 및 BTS 및 BTS(OMe)를 제조하는 신규 방법이 본원에 개시된다. 결과적으로, BTS 및/또는 BTS(OMe)는 상업용 규모로 확대될 수 있고, 중성자 포획제로서 환자에게 투여될 수 있고, 중성자 포획 요법 양식을 이용함으로써 암, 면역 장애, 및 다른 질환을 치료하는 방법을 제공할 수 있다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 7월 30일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/259,662를 우선권 주장하며, 그의 내용은 전문이 본원에 참조로 포함된다.
연방 정부 지원 연구 하에 이루어진 발명에 대한 권리의 진술
적용가능하지 않음.
발명의 분야
본원에 기재된 발명은 붕소 중성자 포획 요법 (BNCT) 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 인간에서 중성자 포획 요법을 위한 비히클로서 사용될 수 있는, BTS 및 BTS(OMe)를 포함하는 보릴화 아미노산 ("BAA") 또는 ("BAAs") 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 암 및 다른 면역학적 장애 및 질환의 치료에 관한 것이다.
암은 전세계적으로 관상동맥 질환 다음으로 두 번째 주요 사망 원인이다. 매년 수백만 명의 사람들이 암으로 사망하고, 미국에서만 매년 오십만 명이 넘는 사람들이 암으로 사망하며, 2017년에는 1,688,780건의 새로운 암 사례가 진단되었다 (미국 암 학회). 심장 질환으로 인한 사망은 유의하게 감소하고 있지만, 암으로 인한 사망은 일반적으로 증가하고 있다. 다음 세기 초기에, 의학적 발달이 현재 경향을 변화시키지 않는 한 암은 사망의 주요 원인이 될 것으로 예측된다.
여러 암은 높은 사망률을 갖는 것으로 나타난다. 특히, 폐 암종 (모든 암 사망의 18.4%), 유방 암종 (모든 암 사망의 6.6%), 결장직장 암종 (모든 암 사망의 9.2%), 간 암종 (모든 암 사망의 8.2%), 및 위 암종 (모든 암 사망의 8.2%)은 전세계적으로 모든 연령의 두 성별에 대한 암 사망의 주요 원인이다 (글로보칸(GLOBOCAN) 2018). 이들 및 실질적으로 모든 다른 암종은 이들이 원발성 종양으로부터 떨어진 부위로 전이되고, 극소수의 예외로 전이성 질환이 치명적이라는 점에서 공통적인 치사 특색을 공유한다. 더욱이, 초기에 그의 원발성 암에서 생존한 암 환자에 대해서도, 일반적인 경험은 그의 삶이 극적으로 변경된다는 것을 보여주었다. 많은 암 환자는 재발 또는 치료 실패에 대한 잠재력의 인식에 의해 유도된 강한 불안을 경험한다. 많은 암 환자는 또한 치료 후에 신체적 쇠약을 경험한다. 또한, 많은 암 환자는 그의 질환의 재발을 경험한다.
암 요법이 지난 수십년에 걸쳐 개선되었고 생존율이 증가되었지만, 암의 이질성은 여전히 복수의 치료 양식을 이용하는 새로운 치료 전략을 요구한다. 이는 종종 표준 방사선요법 및/또는 화학요법으로 제한되는 해부학적 중요한 부위에서의 고형 종양 (예를 들어, 교모세포종, 두경부의 편평세포 암종 및 폐 선암종)을 치료하는 데 특히 그러하다. 그럼에도 불구하고, 이들 요법의 유해한 효과는 환자의 삶의 질을 감소시키는 심각한 부작용 이외에도, 국소-영역 재발, 원격 전이 및 제2 원발성 종양을 촉진하는 내화학성 및 내방사성이다.
중성자 포획 요법 (NCT)은 방사선 요법의 유망한 형태이다. 이는 정상 세포를 보존하면서 붕소 화합물을 사용하여 종양 세포를 선택적으로 사멸시키는 기술이다. BNCT는 0.5 keV < En < 30 keV의 낮은 에너지 범위에 속하는 고온 열중성자를 흡수하는 비-방사성 10B 동위원소의 성향에 의존한다. 중성자 포획 후, 붕소 원자는 하기와 같이 핵 분열 반응을 겪어 알파-입자 및 반동 리튬 핵 (7Li)을 생성한다:
10B + n→7Li + 4He
알파 입자는 본질적으로 단일 세포 직경으로 제한된 그의 짧은 경로를 따라 150 keV/μm인 고에너지를 축적하고, 이는 이중 가닥 DNA 파괴에 이어 아폽토시스에 의한 암 세포 사멸을 유발한다. 따라서, BNCT는 화학요법, 표적화 요법, 및 전통적인 방사선요법의 육안 해부학적 국재화 둘 다의 개념을 통합한다.
NCT 및 구체적으로 붕소 중성자 포획 요법 (BNCT)의 개념적 기술이 널리 공지되어 있지만, 이러한 유형의 치료와 연관된 기술적 제한은 진전을 늦추었다. 1960년대에 MIT의 연구 반응기를 사용한 초기 조사 동안, 이나트륨 데카히드로데카보레이트를 사용하여 수십 명의 환자를 치료하였으며, 이는 이전에 사용된 단순 붕소 화합물보다 덜 독성이지만 보다 많은 붕소를 세포에 전달할 수 있는 것으로 간주되었다. 불행하게도, BNCT 연구는 BNCT를 받고 있는 환자에서의 중증 뇌 괴사 및 핵 반응기를 사용하는 것의 잠재적 유해로 인해 미국에서 중단되었다.
히로시 하타나카(Hiroshi Hatanaka)는 1968년에 수술에 의해 노출된 두개내 종양으로 빔을 향하게 함으로써 나트륨 보로캅테이트 (BSH)를 사용하여 일본에서 BNCT의 임상 적용을 재조사하였고, 58%의 5년 생존율을 달성하는 것으로 보고하였다. 1987년에 일본의 임상의는 붕소 화합물로서 보로노페닐알라닌 (BPA)을 사용하는 악성 흑색종의 치료를 위해 BNCT를 적용하였다. 따라서, 비록 고온 열중성자 빔을 전달할 수 있는 연구 원자로 시설에의 접근을 갖는 국가에 제한되었지만, BNCT의 느린 부활이 일어났다. 현재, (i) 바람직하게는 종양에 농축되는 포획 화합물의 주입 및 전달, 및 (ii) 시클로트론을 사용한 중성자 빔에 대한 보다 풍부하고 보다 용이한 접근 둘 다에서의 기술적 개선을 고려하면, NCT 치료 방법에 부활이 있었다.
양성자 붕소 융합 반응은 BNCT에 요구되는 10B보다는 자연적으로 풍부한 11B 동위원소에 의존한다. BNCT와는 달리, 양성자 (1H)와 붕소 (11B) 핵 사이의 융합 반응 후에 3개의 알파 입자가 방출된다: p+11B -> 3α. 양성자 빔은 정상 조직 손상을 감소시키는 브래그-피크 특성의 이점을 가지며, 양성자 포획과 조합되는 경우에 양성자 요법 단독의 효능을 개선시킬 수 있다.
붕소의 담체는 1950년대 이후로 진화하였고, 문헌 [NEDUNCHEZHIAN, et al., J. Clin. Diag. Res., vol. 10(12) (Dec. 2016)]에서 검토되었다. 간략하게, 붕산 및 그의 유도체에 의해 나타내어지는 붕소 화합물의 1세대는 독성이거나 또는 낮은 종양 축적/체류를 겪었다. BPA 및 BSH는 둘 다 1960년대에 출현한 2세대 화합물로 간주된다. 이들은 유의하게 더 낮은 독성 및 더 우수한 PK 및 생체분포를 가졌다. BPA-프룩토스 복합체는 1994년 이래로 BNCT를 사용하여 H&N, 교모세포종 및 흑색종을 갖는 환자를 치료하는 데 사용되는 3세대 화합물로 간주된다. 저분자량 및 고분자량 생체분자 둘 다, 예컨대 뉴클레오시드, 포르피린, 리포솜, 나노입자 및 mAb가 전임상 모델에서 종양 표적화에 대해 평가되었지만, BPA-프룩토스 및 BSH가 현재까지 붕소 담체로서 임상에서 사용되는 유일한 화합물이다. BPA-프룩토스의 주요 결함은 종양 흡수에 영향을 미치는 동인 중 하나인 혈액에서의 높은 Cmax를 달성하는 것을 막는 그의 급속한 클리어런스와 조합된 비교적 낮은 용해도이다.
상기 언급된 것으로부터, 새로운 치료 패러다임이 암 및 면역 질환의 치료에 필요하다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이다. 현대 화학적 합성을 사용하고 천연 아미노산을 붕소로 변형시킴으로써, 보다 효과적인 치료, 감소된 부작용 및 보다 낮은 생산 비용이라는 전체 목표와 함께 새로운 질환 치료가 달성될 수 있다.
NCT와 연관된 현재의 결함을 고려하면, 본 발명의 목적은 보릴화 아미노산 및 NCT를 이용하여 암(들), 면역 장애, 및 다른 질환을 치료하는 새롭고 개선된 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 인간 질환, 예컨대 암, 면역 장애, 예컨대 비제한적으로 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 및 다른 세포 질환, 예컨대 비제한적으로 알츠하이머병을 치료하기 위한 전달 양식으로서 사용하기 위한, 화학적 합성을 통해 보릴화된 천연 아미노산을 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 보릴화 아미노산은 자연 발생 아미노산, 예컨대 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 히스티딘, 및 표 I에 제시된 임의의 다른 자연 발생 아미노산으로 구성된다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 BTS를 포함한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 BTS(OMe)를 포함한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 BTS의 합성 방법을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 BTS(OMe)의 합성 방법을 포함한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 (i) 보릴화 아미노산 ("BAA")을 합성하는 단계; (ii) 환자에게 BAA를 투여하는 단계, 및 (iii) 세포에 중성자를 조사하는 단계를 포함하는, 세포에서 붕소를 농축시키는 방법을 포함한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 (i) BTS를 합성하는 단계, (ii) 환자에게 BTS를 투여하는 단계, 및 (iii) 세포에 중성자를 조사하는 단계를 포함하는, 세포에서 붕소를 농축시키는 방법을 포함한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 (i) BTS(OMe)를 합성하는 단계, (ii) 환자에게 BTS(OMe)를 투여하는 단계, 및 (iii) 세포에 중성자를 조사하는 단계를 포함하는, 세포에서 붕소를 농축시키는 방법을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 BAA의 합성 방법을 교시한다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 인간에서 암(들), 면역 장애 및 다른 질환을 치료하는 방법을 교시한다.
도 1. BTS의 화학 구조.
도 2. BTS에 대한 화학적 합성.
도 3. BTS(OMe)의 화학 구조.
도 4. BTS(OMe)에 대한 화학적 합성.
도 5. Tyr에서 N-Boc-Tyr(3-Br, 4-OMe)-OMe로의 화학적 합성.
도 6. Tyr에서 N-Boc-Tyr(3-Br, 4-OMe)-OMe, 이어서 N-Boc-Tyr(3-B(OH)2, 4-OMe)-OMe로의 화학적 합성.
도 7. Pd 커플링 반응의 주요 생성물 및 부산물.
도 8. N-Boc-Tyr(3-B(OH)2, 4-OMe)-OMe로부터의 BTS의 화학적 합성.
도 9. N-Boc-Tyr(3-B(OH)2, 4-OMe)-OMe로부터의 BTS-OMe의 화학적 합성.
도 10. (A). 돼지 간 에스테라제 (PLE)를 사용한 Tyr(3-B(OH)2)-OMe로부터의 BTS의 화학적 합성. (B). LiOH를 사용한 Tyr(3-B(OH)2)-OMe로부터의 BTS의 화학적 합성.
도 11. N-Boc-Tyr(3-B(OH)2, 4-OMe)-OMe에서 Boc-Tyr(3-B(OH)2, 4-OMe)-OH로의 화학적 합성.
도 12. N-Boc-Tyr(3-B(OH)2, 4-OMe)-OH에서 BTS(OMe)로의 화학적 합성.
도 13. BTS 및 BTS(OMe)의 정제용 HPLC 정제.
도 14. 세포주의 패널에서의 LAT1 발현 분석.
도 15. BTS 및 BTS(OMe) 작업 스톡의 순도에 대한 분석.
도 16. 시험관내 FaDu 및 CT26 세포에서의 화합물 흡수.
도 17. 다발성 두경부암 세포주에 걸친 BTS 흡수.
도 18. 래트 신경교종 세포주를 사용한 BTS 흡수.
도 19. 흡수 경쟁 검정.
도 20. 비-종양-보유 마우스에서의 약동학.
도 21. 피하 FaDu 종양을 보유하는 마우스에서의 BTS 및 BTS(OMe) 시간-경과.
도 22. 피하 확립된 FaDu 이종이식편을 사용한 종양 대 혈액 비.
도 23. 피하 FaDu 이종이식편을 사용한 용량 적정 및 생체분포 연구.
도 24. 용량 적정 및 생체분포 연구: 붕소 흡수.
도 25. 확립된 종양 이종이식편의 패널(들)에 걸친 붕소 흡수.
도 26. 확립된 종양 이종이식편에 걸친 IHC에 의한 LAT1 발현.
도 2. BTS에 대한 화학적 합성.
도 3. BTS(OMe)의 화학 구조.
도 4. BTS(OMe)에 대한 화학적 합성.
도 5. Tyr에서 N-Boc-Tyr(3-Br, 4-OMe)-OMe로의 화학적 합성.
도 6. Tyr에서 N-Boc-Tyr(3-Br, 4-OMe)-OMe, 이어서 N-Boc-Tyr(3-B(OH)2, 4-OMe)-OMe로의 화학적 합성.
도 7. Pd 커플링 반응의 주요 생성물 및 부산물.
도 8. N-Boc-Tyr(3-B(OH)2, 4-OMe)-OMe로부터의 BTS의 화학적 합성.
도 9. N-Boc-Tyr(3-B(OH)2, 4-OMe)-OMe로부터의 BTS-OMe의 화학적 합성.
도 10. (A). 돼지 간 에스테라제 (PLE)를 사용한 Tyr(3-B(OH)2)-OMe로부터의 BTS의 화학적 합성. (B). LiOH를 사용한 Tyr(3-B(OH)2)-OMe로부터의 BTS의 화학적 합성.
도 11. N-Boc-Tyr(3-B(OH)2, 4-OMe)-OMe에서 Boc-Tyr(3-B(OH)2, 4-OMe)-OH로의 화학적 합성.
도 12. N-Boc-Tyr(3-B(OH)2, 4-OMe)-OH에서 BTS(OMe)로의 화학적 합성.
도 13. BTS 및 BTS(OMe)의 정제용 HPLC 정제.
도 14. 세포주의 패널에서의 LAT1 발현 분석.
도 15. BTS 및 BTS(OMe) 작업 스톡의 순도에 대한 분석.
도 16. 시험관내 FaDu 및 CT26 세포에서의 화합물 흡수.
도 17. 다발성 두경부암 세포주에 걸친 BTS 흡수.
도 18. 래트 신경교종 세포주를 사용한 BTS 흡수.
도 19. 흡수 경쟁 검정.
도 20. 비-종양-보유 마우스에서의 약동학.
도 21. 피하 FaDu 종양을 보유하는 마우스에서의 BTS 및 BTS(OMe) 시간-경과.
도 22. 피하 확립된 FaDu 이종이식편을 사용한 종양 대 혈액 비.
도 23. 피하 FaDu 이종이식편을 사용한 용량 적정 및 생체분포 연구.
도 24. 용량 적정 및 생체분포 연구: 붕소 흡수.
도 25. 확립된 종양 이종이식편의 패널(들)에 걸친 붕소 흡수.
도 26. 확립된 종양 이종이식편에 걸친 IHC에 의한 LAT1 발현.
섹션의 개요
I.)
정의
II.)
BPA
III.)
BSH
IV.)
붕소
a. 일반적으로 붕소
V.)
자연 발생 아미노산
VI.)
보릴화 아미노산 (BAA)
a. 아미노산 조성물
b. 티로신을 포함하는 BAA (BTS 및 BTS(OMe))
c. BTS 및 BTS(OMe)의 새롭고 개선된 합성
VII.)
BTS 및 BTS(OMe)를 사용한 붕소 중성자 포획 요법
VIII.)
BTS 및 BTS(OMe)를 사용한 양성자 붕소 융합 요법
IX.)
BTS 및 BTS(OMe)를 세포에 전달하는 방법
X.)
키트/제조 물품
I.) 정의:
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어, 표기법 및 다른 과학 용어 또는 용어는 문맥이 달리 명백하게 나타내지 않는 한 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 통상적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성을 위해 및/또는 용이한 참조를 위해 본원에 정의되며, 본원에서의 이러한 정의의 포함은 반드시 관련 기술분야에서 일반적으로 이해되는 것에 비해 실질적인 차이를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
본원에서 상표명이 사용되는 경우, 상표명에 대한 언급은 또한, 문맥상 달리 나타내지 않는 한, 제품 제제, 일반 약물, 및 상표명 제품의 활성 제약 성분(들)을 지칭한다.
용어 "진행성 암", "국부 진행성 암", "진행성 질환" 및 "국부 진행성 질환"은 관련 조직 캡슐을 통해 연장된 암을 의미하고, 미국 비뇨기과 협회 (AUA) 시스템 하의 스테이지 C 질환, 위트모어-주에트 시스템 하의 스테이지 C1-C2 질환 및 TNM (종양, 결절, 전이) 시스템 하의 스테이지 T3-T4 및 N+ 질환을 포함하는 것으로 의도된다. 일반적으로, 국부 진행성 질환을 갖는 환자에게는 수술이 권장되지 않고, 이들 환자는 임상적으로 국부화된 (기관-국한된) 암을 갖는 환자와 비교하여 실질적으로 덜 유리한 결과를 갖는다.
"아미노산"은 카르복실 (-COOH) 및 아미노 (-NH2) 기 둘 다를 함유하는 단순 유기 화합물을 의미한다.
"보릴화"는 지방족 및 방향족 C-H 결합의 관능화를 통해 유기붕소 화합물을 생성하는 반응을 의미한다.
"보릴화 아미노산" (BAA)은 보릴화 반응을 겪은 자연 발생 아미노산, 예컨대 표 I에 제시된 것을 포함하는 화합물을 의미한다. BAA는 사용되는 기저 아미노산에 따라 다중 포맷으로 합성될 수 있다.
"BTS"는 도 1에 제시된 화학 구조를 포함하는 화합물을 의미한다.
"BTS(OMe)"는 도 3에 제시된 화학 구조를 포함하는 화합물을 의미한다.
용어 "화합물"은 화학적 화합물 (예를 들어, BAA) 그 자체 뿐만 아니라, 명백하게 언급되든지 아니든지 간에, 문맥상 하기를 배제하는 것이 명백하지 않는 한, 하기를 지칭하고 포괄한다: 다형체 형태를 포함하는 화합물의 무정형 및 결정질 형태, 여기서 이들 형태는 혼합물의 일부일 수 있거나 또는 단리된 형태일 수 있음; 전형적으로 본 명세서에 제공된 구조에 제시된 형태인 화합물의 유리산 및 유리염기 형태; 광학 이성질체, 및 호변이성질체를 지칭하는 화합물의 이성질체, 여기서 광학 이성질체는 거울상이성질체 및 부분입체이성질체, 키랄 이성질체 및 비-키랄 이성질체를 포함하고, 광학 이성질체는 단리된 광학 이성질체 뿐만 아니라 라세미 및 비-라세미 혼합물을 포함하는 광학 이성질체의 혼합물을 포함함; 여기서 이성질체는 단리된 형태 또는 1종 이상의 다른 이성질체와의 혼합물일 수 있음; 중수소- 및 삼중수소-함유 화합물을 포함하고, 치료적 및 진단적으로 효과적인 방사성 동위원소를 포함한, 방사성 동위원소를 포함하는 화합물의 동위원소; 이량체, 삼량체 등을 포함하는 화합물의 다량체 형태; 바람직하게는 산 부가염 및 염기 부가염을 포함하고, 제약상 허용되는 염, 유기 반대이온 및 무기 반대이온을 갖는 염을 포함하고, 쯔비터이온 형태를 포함하는 화합물의 염, 여기서 여기서 화합물이 2종 이상의 반대이온과 회합되는 경우에 2종 이상의 반대이온은 동일하거나 상이할 수 있음; 및 화합물의 유기 용매화물 및 무기 용매화물을 포함하고, 상기 무기 용매화물은 수화물을 포함하고, 반용매화물, 1용매화물, 2용매화물 등을 포함하는, 화합물의 용매화물, 여기서 화합물이 2종 이상의 용매 분자와 회합되는 경우에 2종 이상의 용매 분자는 동일하거나 상이할 수 있음. 일부 예에서, 본원에서 본 발명의 화합물에 대한 언급은 상기 형태 중 하나 또는 그 형태들의, 예를 들어 염 및/또는 용매화물에 대한 명백한 언급을 포함할 것이지만; 이러한 언급은 단지 강조를 위한 것이고, 상기 확인된 바와 같은 상기 형태 중 다른 것을 배제하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본원에 사용된 용어 "억제하다" 또는 "-의 억제"는 측정가능한 양만큼 감소시키거나, 또는 완전히 방지하는 것을 의미한다.
용어 "포유동물"은 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 소, 말, 및 인간을 포함한, 포유동물로 분류되는 임의의 유기체를 지칭한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 포유동물은 마우스이다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.
용어 "전이성 암" 및 "전이성 질환"은 부위 림프절 또는 원위 부위로 확산된 암을 의미하고, AUA 시스템 하의 스테이지 D 질환 및 TNM 시스템 하의 스테이지 TxNxM+를 포함하는 것으로 의도된다.
"분자 인식"은 숙주 분자가 제2 분자 (즉, 게스트)와 복합체를 형성할 수 있는 화학적 사건을 의미한다. 이 과정은 수소 결합, 소수성 상호작용, 및 이온성 상호작용을 포함하나 이에 제한되지는 않는 비-공유 화학 결합을 통해 발생한다.
"제약상 허용되는"은 비-독성, 불활성이고/거나 인간 또는 다른 포유동물과 생리학상 상용성인 조성물을 지칭한다.
용어 "중성자 포획제"는 중성자에 의해 활성화될 때 알파 입자를 생성하는 안정한 비-반응성 화학적 동위원소를 의미한다.
용어 "중성자 포획 요법"은 중성자로 중성자 포획제를 조사함으로써 국부 침습성 악성 종양, 예컨대 원발성 뇌 종양 및 재발성 두경부암 및 다른 면역학적 장애 및 질환을 치료하기 위한 비침습적 치료 양식을 의미한다.
본원에 사용된 "치료하기 위해" 또는 "치료적" 및 문법적으로 관련된 용어는 질환의 임의의 결과의 임의의 개선, 예컨대 연장된 생존, 보다 적은 이환율, 및/또는 대안적 치료 양식의 부산물인 부작용의 감소를 지칭하며; 관련 기술분야에서 용이하게 인지되는 바와 같이, 질환의 완전한 근절이 바람직하지만 치료 행위에 대한 요건은 아니다.
II.) BPA
참조를 위해 및 선행 기술의 문맥에서, (10B)-BPA, L-BPA, 또는 4-보로노-L-페닐알라닌 (시그마 알드리치(Sigma Aldrich), 미주리주 세인트 루이스)은 화학식 C9H12BNO4를 갖는 합성 화합물이다. 구조는 하기에 제시된다:
BNCT를 통한 암의 치료에 유용한 중요한 보론화 화합물이다. 이는 많은 합성이 개발된 널리 공지된 화합물이다 (US8,765,997, 타이완 바이오테크 컴퍼니, 리미티드(Taiwan Biotech Co, Ltd.), 타이완 타오유안 헤세인, 및 US2017/0015684, 스텔라 파마 코포레이션(Stella Pharma Corp.), 일본 오사카 공립대학, 일본 오사카 참조).
III.) BSH
BPA에 추가로, BSH, 또는 나트륨 보로캅테이트, 또는 BSH 나트륨 보로캅테이트, 또는 나트륨 보로캅테이트 10B, 또는 운데카히드로-클로소-도데카보라테티올은 화학식 Na2B12H11SH를 갖는 공지된 합성 화학 화합물이다. 구조는 하기에 제시된다:
여기서 붕소 원자는 이십면체에 대한 꼭짓점에서 점으로 표시된다. BSH는 BNCT에서 포획제로서 사용된다. 일반적으로 말하면, BSH는 정맥 내로 주사되고, 종양 세포에 농축된다. 이어서, 환자는 중성자로 불리는 원자 입자를 사용한 방사선 치료를 받는다. 중성자는 BSH에서 붕소 핵과 융합되어 종양 세포를 사멸시키는 고에너지 알파 입자를 생성한다.
IV.) 붕소
(a.) 일반적으로 붕소
일반적으로 말하자면, 그리고 본 개시내용의 목적상, 붕소는 기호 B 및 원자 번호 5를 갖는 화학 원소이다. 주로 화학적 화합물에 사용되는 천연 붕소는 2개의 안정한 동위원소로 구성되며, 그 중 하나는 붕소-10이고 다른 하나는 붕소-11이다. 붕소-10 동위원소는 고온 열중성자를 포획하는 데 유용하며, 이는 붕소 중성자 포획 요법을 사용하는 치료 상황에서 이를 유망한 도구로 만든다. 생물학적으로, 본원에 개시된 보릴화 화합물은 인간 및 동물에 비독성이다. 상기에 기초하여, 암 세포 내로 고농도의 붕소를 제공하기 위한 개선된 양식이 유리하다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이다. 본 개시내용의 목적은 이러한 이점을 제공하는 것이다.
V.) 자연 발생 아미노산
일반적으로 말하자면, 그리고 본 개시내용의 목적상, 자연 발생 아미노산은 각 아미노산에 특이적인 측쇄 (R 기)와 함께, 아민 (-NH2) 및 카르복실 (-COOH) 관능기를 함유하는 유기 화합물이다. 아미노산의 핵심 요소는 탄소 (C), 수소 (H), 산소 (O) 및 질소 (N)이지만, 다른 요소가 특정 아미노산의 측쇄에서 발견된다. 약 500개의 자연 발생 아미노산이 공지되어 있고 (20개만이 유전자 코드에서 나타나지만 (표 I)), 많은 방식으로 분류될 수 있다. 이들은 핵심 구조적 관능기의 위치에 따라 알파- (α-), 베타- (β-), 감마- (γ-) 또는 델타- (δ-) 아미노산으로 분류될 수 있고; 다른 카테고리는 극성, pH 수준, 및 측쇄 기 유형 (지방족, 비-시클릭, 방향족, 히드록실 또는 황 함유 등)과 관련된다. 단백질의 형태에서, 아미노산 잔기는 인간 근육 및 다른 조직의 두 번째로 가장 큰 성분 (물이 가장 큼)을 형성한다. 단백질에서의 잔기로서의 그의 역할을 넘어서, 아미노산은 수많은 과정, 예컨대 신경전달물질 수송 및 생합성에 참여한다.
유전자 코드에 의해 직접 코딩된 20개의 아미노산 (표 I 참조)은 그의 특성에 기초하여 여러 군으로 나뉠 수 있다. 주요 인자는 전하, 친수성 또는 소수성, 크기, 및 관능기이다. 이들 특성은 단백질 구조 및 단백질-단백질 상호작용에 중요하다. 수용성 단백질은 단백질의 중간에 매립된 그의 소수성 잔기 (Leu, Ile, Val, Phe, 및 Trp)를 갖는 경향이 있는 반면, 친수성 측쇄는 수성 용매에 노출된다.
내재성 막 단백질은 이들을 지질 이중층에 고정시키는 노출된 소수성 아미노산의 외부 고리를 갖는 경향이 있다. 이들 2개의 극단 사이의 부분-경로의 경우에, 일부 말초 막 단백질은 막 상에 고정되는 그의 표면 상의 소수성 아미노산의 패치를 갖는다. 유사한 방식으로, 양으로 하전된 분자에 결합해야 하는 단백질은 글루타메이트 및 아스파르테이트와 같은 음으로 하전된 아미노산이 풍부한 표면을 갖는 반면, 음으로 하전된 분자에 결합하는 단백질은 리신 및 아르기닌과 같은 양으로 하전된 쇄가 풍부한 표면을 갖는다. 상이한 소수성 규모의 아미노산 잔기가 존재한다.
일부 아미노산은 다른 시스테인 잔기에 공유 디술피드 결합을 형성할 수 있는 시스테인, 폴리펩티드 백본에 사이클을 형성하는 프롤린, 및 다른 아미노산보다 더 가요성인 글리신과 같은 특수한 특성을 갖는다.
VI.) 보릴화 아미노산 (BAA)
간략한 소개로서 및 본 개시내용의 본 발명의 시도에 대한 배경을 보다 잘 이해하기 위해, 큰 중성 아미노산 수송체 1 (LAT-1, SLC7a5)은 필수 아미노산 (예를 들어, 류신, 페닐알라닌)을 세포에 공급하는 나트륨- 및 pH-비의존성 수송체임이 주목된다. 기능적 수송체는 다중-막횡단 서브유닛 SLC7a5 및 단일 막횡단 서브유닛 SLC3a2 (CD98)로 구성된 이종이량체 디술피드-연결된 복합체이다. LAT-1은 태반 또는 혈액-뇌 장벽과 같은 구획을 가로질러 필수 아미노산을 채널링하는 주요 수송체이다. 또한, LAT-1은 또한 갑상선 호르몬 T3 및 T4 (문헌 [FRIESEMA, et al., Endocrinology, 142(10): 4339-4348 (2001)] 참조), 도파민 전구체 L-DOPA, 뿐만 아니라 아미노산-관련 외인성 화합물, 예컨대 약물 멜팔란 및 가바펜틴 (문헌 [UCHINO, et al., Mol. Pharmacol 61:729-737 (2002)] 참조)을 수송한다. 또한, 그의 발현은 대사 및 성장을 위한 아미노산에 대한 강한 요구를 특징으로 하는 여러 유형의 인간 암에서 고도로 상향조절된다 (문헌 [SINGH, et al., Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 1278] 참조). 또한, 아미노산 측쇄의 성질이 다양한 아미노산에 대한 LAT-1의 선택성에 영향을 미치며, 수송률 증가와 관련하여 하기 순서로 영향을 미치는 것으로 보고되었다: Phe > Trp > Leu > Ile > Met > His > Tyr > Val (문헌 [KANAI, et al., J. Biol. Chem., vol. 273, No. 37, pp. 23629-23632 (1998)] 참조). 그러나, 아미노산에 대한 추가의 붕소 변형의 영향은 관련 기술분야에 공지되어 있지 않고, 본 개시내용은 선구적인 돌파구를 나타낸다.
효과적인 암 치료로서의 BNCT의 치료 잠재력은 암 세포 내의 충분한 양의 10B의 선택적 축적에 있다.
상기 내용을 기초로 하여, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 필수 아미노산 수송체 단백질, 예컨대 LAT1이 특정 자연 발생 아미노산의 흡수를 담당함을 보여주었다. 문헌 [SCALISE, et al., Frontiers in Chem., Vol. 6, Art. 243 (June 2018)]을 참조한다. 이러한 원리를 염두에 두고, 본 개시내용은 보릴화 반응을 통한 자연 발생 아미노산의 합성으로 붕소 중성자 포획 요법 ("BNCT") 및/또는 붕소 양성자 포획 요법 (통상적으로 양성자 붕소 융합 요법 ("PBFT")으로 공지됨)에서 중성자 포획제로서 사용하기 위한 종양 추적 및 종양 국재화 특성을 갖는 보릴화 아미노산 ("BAA")을 생성하는 것을 고려한다. 예를 들어, 문헌 [HATTORI, et al., J. Med. Chem., 55, 6980-6984 (2012)]을 참조한다.
(a) 아미노산 조성물(들)
추가 실시양태에서, 하기 화학식을 갖는 BAA가 본 개시내용의 범주 내에 있다 ("티로신 유도체"):
여기서:
E = CO2H, CONHB12H11, B(OH)2이고;
X = H, B(OH)2, Bpin, (-O-CH2CH2)2-O-B12H11 또는 BF3 -이다.
추가 실시양태에서, 하기 화학식을 갖는 티로신 유도체가 본 개시내용의 범주 내에 있다:
여기서:
R = H, CH3, 또는 CF3이고;
X1 = H, B(OH)2, 또는 BF3 -이고;
X2 = H, B(OH)2, 또는 BF3 -이다.
(b) 티로신을 포함하는 BAA (BTS 및 BTS(OMe))
티로신은 하기 화학식을 갖는 필수 아미노산이고:
혈액-뇌 장벽을 용이하게 통과하는 것으로 공지되어 있다. 일단 뇌에서, 이는 신경전달물질의 도파민, 노르에피네프린, 및 아드레날린으로 더 잘 알려진 에피네프린에 대한 전구체이다. 이들 신경전달물질은 신체의 교감 신경계의 중요한 부분이고, 신체 및 뇌에서의 그의 농도는 식이 티로신에 직접적으로 의존한다. 티로신은 빠르게 대사된다. 엽산, 구리, 및 비타민 C는 이들 반응의 보조인자 영양소이다. 티로신은 또한 호르몬, 갑상선, 카테콜 에스트로겐 및 주요 인간 색소인 멜라닌에 대한 전구체이다. 티로신은 많은 단백질, 펩티드 및 심지어 신체의 천연 통증 완화제인 엔케팔린에서 중요한 아미노산이다. 발린 및 다른 분지형 아미노산, 및 가능하게는 트립토판 및 페닐알라닌은 티로신 흡수를 감소시킬 수 있다. 티로신 대사의 수많은 유전적 오류, 예컨대 호킨스 뉴리아(Hawkins Nuria) 및 티로신혈증 I이 발생한다. 가장 흔한 것은 미숙아의 혈액 중 티로신의 증가된 양이며, 이는 감소된 운동 활동, 무기력, 및 불량한 섭식에 의해 나타난다. 감염 및 지적 결핍이 발생할 수 있다. 일부 성인은 또한 그의 혈액에서 상승된 티로신이 발생한다. 이는 보다 많은 비타민 C에 대한 필요를 나타낸다. 일반적으로, 티로신은 스트레스 하에 필요하고, 티로신 보충제는 노르에피네프린의 스트레스-유도된 고갈을 방지하고, 생화학적 우울증을 치유할 수 있다.
추가로, 티로신의 다양한 유도체가 PET를 사용한 전신 영상화를 위한 추적자로서 평가되었고, 일부는 신경내분비 장애 및 암을 포함한 특정 적응증에 대해 승인되었다. 이들은 18F-플루오로-L-DOPA (문헌 [DOI: 10.2967/jnumed.114.145730]), 18F-플루오로-L-알파-메틸티로신, 즉 FAMT (문헌 [INOUE, J Nucl. Med. 1998; 39:663-667] 및 [10.2967/jnumed.112.103069])를 포함한다.
또한, 문헌 [ISHIWATA, et al.]은 O-[18F]플루오로메틸-L-티로신 (예를 들어, 1-8F-FMT)을 기재하였고, 간세포암-보유 래트에서 그의 생체분포를 연구하였다. 문헌 [Nuclear Medicine and Biology 31 (2004) 191-198]을 참조한다. 제시된 바와 같이, 추적자는 췌장에 축적되었고, 60분에 달성된 유의미한 대조가 존재하였으며, 이는 종양의 가시화를 제공하였다. 그러나, 아마도 골수에서의 추적자의 흡수로 인해 어느 정도의 탈플루오린화가 나타났다. 18F-FMT의 탈플루오린화는 고-등급 신경교종에 대한 승인된 영상화 추적자인 18F-플루오로에틸티로신 (즉, 18F-FET)의 탈플루오린화 없음과 대조된다 (문헌 [10.2967/jnumed.114.140608] 및 또한 [NCT04001257] 참조). 신경교종 및 다른 종양에서의 상기 PET 추적자의 상승된 흡수는 두경부, GBM, 및 흑색종 병변 내로의 BPA 흡수를 매개하는 동일한 큰 중성 아미노산 수송체인 LAT-1에 의해 매개된다는 것이 주목된다.
상기에 기초하여, 본 개시내용은 선택된 세포주에서 LAT-1의 발현을 평가하기 위한 보릴화 티로신 유사체의 합성을 개발하기 위해 노력하고, 이들 보릴화 아미노산 유사체가 암 세포주에서 흡수를 나타낸다는 것을 보여준다. 또한, 티로신 유사체가 용량-의존성 방식으로 면역결핍 마우스에서 FaDu 확립된 이종이식편에 의해 흡수된다는 것이 본 개시내용에서 입증된다.
따라서, 특정 암에서 중성자 포획제로서의 보릴화 티로신의 이용이 본 개시내용에 의해 고려된다.
본 개시내용의 한 실시양태에서, 티로신을 포함하는 BAA는 BTS로 표시되고, 도 1에 제시된 하기 화학식을 갖는다.
본 개시내용의 한 실시양태에서, 티로신을 포함하는 BAA는 BTS(OMe)로 표시되고, 도 3에 제시된 하기 화학식을 갖는다.
BTS 및 BTS(OMe)의 합성은 보론산에 대한 직교-위치에서의 티로신의 O-히드록실로 인해 도전과제를 제시한다. 이 히드록실은 전자-공여 기이고, 이는 합성의 피나콜-보란 탈보호 단계를 방해한다. 그 결과, BTS 및 BTS(OMe)의 공지된 합성은 낮은 수율 및 제거하기 어려운 불순물을 생성한다. 따라서, 본 개시내용의 목적은 최대 1 그램 규모에서 높은 수율 및 순도를 생성하는 BTS 및 BTS(OMe)의 신규 합성을 제공하는 것이다.
배경으로서, BTS 및 BTS(OMe)는 물에 매우 가용성이다. 그러나, BNCT에서의 사용에 대해 현재 승인된 유일한 붕소 담체인 BPA와 달리, BTS는 용해도를 보조하기 위해 프룩토스를 필요로 하지 않는다. 추가로, BTS(OMe)는 프룩토스를 필요로 하지만, 용해도의 역치는 BPA에 비해 훨씬 더 높다. 그 결과, BPA에 비해 BTS 또는 BTS(OMe)를 사용하는 것이 L-BPA 프룩토스 (또는 소르비톨) 제제로 현재 실현가능한 것보다 더 높은 농도 및 더 작은 부피의 붕소 화합물의 투여를 허용할 것이다. 종양에서 보다 높은 붕소 농도를 달성할 수 있다는 임상적 유의성은 BNCT 및/또는 PBFT 요법에서의 중성자 조사의 보다 높은 효능 및 궁극적으로 보다 낮은 암 재발률로 해석될 것이다.
따라서, 본 개시내용의 목적은 BTS 및 BTS(OMe)의 새롭고 개선된 합성을 교시하는 것이다.
(c) BTS 및 BTS(OMe)의 새롭고 개선된 합성
BTS (도 2에 나타낸 바와 같음) 및 BTS(OMe) (도 4에 나타낸 바와 같음)의 합성은 실험실 규모에서 효율적인 변환이다. 그러나, L-DOPA 및 Tyr의 형성은 전통적인 미야우라 커플링 (즉, 비스(피나콜레이토)디보란의 Pd 커플링에 이어지는 NaIO4 탈보호) 후에 관찰되었다. 주요 부산물이 생성된다 (도 7 참조). 부산물을 제거하기 위해 크로마토그래피가 요구된다.
또한, BTS (도 2에 나타낸 바와 같음) 및 BTS(OMe) (도 4에 나타낸 바와 같음)의 합성은 과량의 BBr3이 첨가되지 않는 한 N 또는 C 말단이 탈보호되는 경우 진행되지 않는다. 그러나, 이는 합성이 신속한 탈붕소화를 유도한다는 점에서 추가의 문제를 제시한다. 또한, 0℃에서 합성을 개시하는 것이 또한 탈붕소화를 유도한다는 것이 주목된다.
따라서, 본 개시내용의 목적은 Pd 커플링에 의해 생성되는 불순물이 제거되는 BTS 및 BTS(OMe)에 대한 신규 합성 방법을 가능하게 하는 것이다 (도 6 참조).
추가로, 본 개시내용의 목적은 BTS 및 BTS(OMe)의 탈붕소화를 피하기 위해 탈보호 단계를 변형시키는, BTS 및 BTS(OMe)에 대한 신규 합성 방법을 가능하게 하는 것이다. (도 9 내지 12 참조).
생성된 신규 합성을 도 13에 제시된 크로마토그래피 조건을 사용하여 준비하고, 도 7에 제시된 크로마토그래피 조건을 사용하여 분석하고, BTS (도 2에 제시된 바와 같음) 및 BTS(OMe) (도 4에 제시된 바와 같음)를 생성할 것이고, 1 그램까지의 상업용 규모-확대를 허용할 것이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 L-티로신의 목적 물질로의 전환을 포함하는 BTS 및 BTS(OMe)의 합성을 포함한다. L-티로신의 N-Boc-Tyr(3-Br, 4-MeO)-OMe로의 전환은 문헌 [Ghosh, S. et al. ARKIVOC, 2009 (vii), 72-78]에 최초로 제시되어 있다.
N-Boc-Tyr(3-Br, 4-MeO)-OMe의 아릴 보론산 N-Boc-Tyr(3-B(OH)2-4-MeO)-OMe로의 전환은 팔라듐화, 및 이어서 요구되는 보론산으로의 금속 교환으로 이루어진다. 화염 건조된 아르곤 켄칭 플라스크에 메탄올 30 mL 및 디메톡시에탄 12 mL를 채웠다. 용액에 아세트산칼륨 2.8 g, 이어서 Boc-Tyr(3-Br, 4-OMe)-OMe 5 g, 이어서 테트라히드록시디보란 1.3 g을 첨가하였다. 최종적으로, 반응 혼합물에 촉매 Pd, 3 mg의 클로로[(트리-tert-부틸포스핀)-2-(2-아미노비페닐)]팔라듐 (II)을 첨가하였다. 아르곤 분위기 하에, 반응물을 20℃에서 밤새 교반하였다. 반응 완결 시, 물 20 mL를 천천히 첨가하고, 30분 동안 켄칭되도록 하였다. 고체를 여과에 의해 제거하였다. 이어서, 유기 용매를 감압 하에 제거하였다. 이어서, 수성 층을 에틸 아세테이트로 3회 세척하였다. 유기 층을 합하고, 감압 하에 농축시켰다. 조 물질을 헥산 중 25% 에틸 아세테이트에서 실리카 상에서 플래쉬 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 유기 용매의 제거 시, 목적 물질은 백색 고체로서 75% 수율로 단리되었다.
보론산의 도입 후, 합성은 분기되어 화합물 BTS 및 BTS(OMe)를 형성한다. N-Boc-Tyr(3-B(OH)2-4-MeO)-OMe의 N-Boc-Tyr(3-B(OH)2-4-MeO)-OH로의 선택적 비누화는 문헌 [Ghosh, S. et al. ARKIVOC, 2009 (vii), 72-78]에서 강조된다. 이어서, tert-부틸 카르바메이트를 제거하여 BTS(OMe)의 구조를 드러낸다. N-Boc-Tyr(3-B(OH)2, 4-OMe)-OH 1 g이 충전된 플라스크에 디옥산 중 4 M 염산의 용액을 첨가하였다. 1시간 후, Boc 보호된 출발 물질의 존재는 관찰되지 않았다. 휘발성 용매 및 산을 감압 하에 제거하고, 목적 물질을 정제용 LC를 통해 정제하였다.
BTS를 드러내기 위해, N-Boc-Tyr(3-B(OH)2-4-MeO)-OMe로부터의 2-단계 공정이 이어진다. 화염 건조된 아르곤 켄칭 플라스크에 디클로로메탄 25 mL를 채웠다. 용액에 N-Boc-Tyr(3-B(OH)2, 4-OMe)-OMe 1.5 g을 첨가하였다. 온도를 드라이 아이스 조를 사용하여 -78℃로 감소시켰다. 1 당량의 삼브로민화붕소를 첨가하였다. 30분 후, Boc 기는 LCMS에 의해 더 이상 관찰가능하지 않았고, 이 시점에서 제2 당량의 삼브로민화붕소를 첨가하였다. 반응물을 0℃로 가온하였다. 2시간 후, 페놀계 산소를 탈메틸화시켰다. 반응물을 물로 켄칭하고, DCM을 추출을 통해 제거하였다. 수성 층을 LiOH를 사용하여 pH 10 초과로 만들었다. 높은 pH에서 15분 후, 에스테르를 비누화하여 목적 물질을 수득하였다. 수성 층을 감압 하에 농축시키고, 최종 물질을 정제용 액체 크로마토그래피를 통해 단리하였다.
VII.) BTS 및 BTS(OMe)를 사용한 붕소 중성자 포획 요법
본 개시내용의 한 측면은 붕소 중성자 포획 요법 (BNCT) 및/또는 붕소 양성자 포획 요법 ("BPCT")을 위한 양식으로서의 BTS 및 BTS(OMe)의 용도이다. 간략하게, BNCT는 성분 단독이 종양에 치명적이거나 독성이 아닌 2원 치료 양식이다. 두 성분은 (i) 우선적으로 종양에 농축되는 포획 화합물의 주입 또는 전달, 및 (ii) 중성자 또는 양성자에 의한 종양 부위의 조사를 포함한다. BNCT에서, 10B와의 열적 중성자 상호작용의 큰 단면을 고려하면, 결과적으로 붕소 핵의 4He2+ 및 7Li+로의 분열의 높은 확률이 존재한다. He2+ 및 Li+의 이온화 능력이 높고, 이동 거리가 짧다는 것을 고려하면, 바람직하게는 붕소가 풍부한 세포는 사멸되고, 건강한 세포는 고농도의 붕소의 결여로 인해 훨씬 덜 손상된다. 이를 고려하여, BNCT의 이점은 고도로 외상성인 외과적 절차 없이 종양 세포를 파괴하는 것이다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 성공은 종양 세포에서의 10B의 고농도 및 선택적 국재화에 의해 예측된다.
한 실시양태에서, 10B를 BTS 및/또는 BTS(OMe) 상에 농축시킨다. 이어서, 환자에게 BTS 및/또는 BTS(OMe)를 제공하고, BTS 및 BTS(OMe)는 종양 세포 내로 국재화된다. 10B를 함유하는 BTS 및 BTS(OMe)를 종양으로 농축시키고, 종양을 고온 열중성자를 사용하여 조사한다. 종양 세포는 파괴된다.
VIII. BAA를 사용한 양성자 붕소 융합 요법
본 개시내용의 또 다른 측면은 양성자 붕소 융합 요법 (PBFT)을 위한 양식으로서의 BTS 및 BTS(OMe)의 용도이다. 간략하게, 양성자 붕소 융합 반응은 1960년대에 도입되었다. 양성자 (1H)와 붕소 입자 (11B) 사이의 반응 후에 3개의 알파 입자가 방출된다. 이들 3개의 알파 입자는 BNCT에서의 알파 입자의 경우와 같이 종양 세포에 손상을 제공한다. 이론적으로, PBFT의 경우에, 입사 입자당 요법 효능은 BNCT의 것보다 3배 (3x) 더 크다. 또한, 양성자 빔이 브래그-피크 특징의 이점을 갖기 때문에, 정상 조직 손상이 감소될 수 있다. 일반적으로 말해서, 알파 입자를 사용한 종양 치료에 대한 많은 연구가 수행되었다. 용량 전달을 위해 알파 입자를 이용하기 위해, 2가지 핵심이 고려되어야 한다. 첫째, 붕소 흡수가 표적 세포에 정확하게 표지되어야 한다. 상기 언급된 바와 같이, 알파 입자는 보로네이트 화합물이 축적되는 곳에서 생성된다. 이것이 종양 영역 근처의 정상 조직에서 발생하는 경우에, 알파 입자는 종양 세포 뿐만 아니라 정상 조직을 손상시킬 것이다. 둘째, 생성된 알파 입자의 수 또한 효과적인 요법을 위한 중요한 인자이다. PBFT를 사용함으로써, BNCT 또는 통상적인 양성자 요법 단독과 비교하여 보다 효과적인 요법이 실현될 수 있다.
한 실시양태에서, 10B 및/또는 11B를 BTS 및 BTS(OMe) 상에서 농축시킨다. 이어서, 환자에게 BTS 및 BTS(OMe)를 제공하고, BTS 및 BTS(OMe)는 종양 세포 내로 국재화된다. 10B 및/또는 11B를 함유하는 BTS 및 BTS(OMe)를 종양으로 농축시키고, 종양을 고온 열중성자를 사용하여 조사한다. 종양 세포는 파괴된다.
IX. BTS 및 BTS(OMe)를 세포에 전달하는 방법
관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인지되는 바와 같이, 고농도의 붕소를 세포에 효율적으로 전달하는 능력은 본 발명의 이점이다.
본 개시내용의 BTS 및 BTS(OMe)는 보다 많은 양의 붕소가 포유동물에서 세포에 안전하게 투여되는 것을 가능하게 하는 것으로 나타났다. 간략하게, 본 개시내용의 BTS 및 BTS(OMe)는 본 개시내용에 제시된 바와 같이 제조된다. 생성된 BTS 및 BTS(OMe)는 상향조절된 LAT-1 수송체 단백질에 의해 종양 세포에 의해 흡수된다.
X.) 키트/제조 물품
본원에 기재된 실험실, 예후, 예방, 진단, 및 치료 용도에 사용하기 위한 키트는 본 발명의 범주 내에 있다. 이러한 키트는 하나 이상의 용기, 예컨대 바이알, 튜브 등을 수용하도록 구획화된 담체, 패키지, 또는 용기를 포함할 수 있으며, 각각의 용기(들)는 방법에 사용되는 개별 요소 중 하나를 사용, 예컨대 본원에 기재된 사용에 대한 지침서를 포함하는 라벨 또는 삽입물과 함께 포함한다. 예를 들어, 용기(들)는 본 개시내용의 BTS 및 BTS(OMe) 또는 여러 BTS(들) 및 BTS(OMe)(들)를 포함할 수 있다. 키트는 약물 단위를 포함하는 용기를 포함할 수 있다. 키트는 BTS(들) 및 BTS(OMe)(들)의 전부 또는 부분 및/또는 암 및/또는 다른 면역학적 장애를 검출하기 위한 진단 검정을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 전형적으로 상기 기재된 용기 및 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 시린지; 담체, 패키지, 용기, 바이알 및/또는 내용물 및/또는 사용 지침서를 열거한 튜브 라벨, 및 사용 지침서를 갖는 패키지 삽입물을 포함한, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 물질을 포함하는 그와 연관된 1개 이상의 다른 용기를 포함할 것이다.
라벨은 조성물이 특정 요법 또는 비-치료적 적용, 예컨대 예후, 예방, 진단, 또는 실험실 적용을 위해 사용됨을 나타내기 위해 용기 상에 또는 용기와 함께 존재할 수 있고, 또한 본원에 기재된 것과 같은 생체내 또는 시험관내 사용을 위한 지침을 나타낼 수 있다. 지시 및/또는 다른 정보는 또한 키트와 함께 또는 키트 상에 포함되는 삽입물(들) 또는 라벨(들) 상에 포함될 수 있다. 라벨은 용기 상에 있거나 용기와 회합될 수 있다. 라벨을 형성하는 문자, 숫자 또는 다른 기호가 용기 그 자체로 성형 또는 에칭될 때 라벨은 용기 상에 있을 수 있고; 라벨이 용기를 또한 보유하는 리셉터클 또는 담체 내에, 예를 들어 패키지 삽입물로서 존재할 때 라벨은 용기와 회합될 수 있다. 라벨은 조성물이 병태, 예컨대 암 또는 다른 면역학적 장애를 진단, 치료, 예방, 또는 예후하는 데 사용된다는 것을 나타낼 수 있다.
용어 "키트" 및 "제조 물품"은 동의어로서 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 조성물, 예컨대 본 개시내용의 BTS(들) 및 BTS(OMe)(들)을 함유하는 제조 물품(들)이 있다. 제조 물품은 전형적으로 적어도 하나의 용기 및 적어도 하나의 라벨을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이알, 시린지, 및 시험 튜브를 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리, 금속, 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 하나 또는 여러 개의 BTS(들) 및 BTS(OMe)(들) 및/또는 하나 이상의 치료 용량의 BTS(들) 및 BTS(OMe)(들)를 보유할 수 있다.
대안적으로, 용기는 병태를 치료, 진단, 예후 또는 예방하는 데 효과적인 조성물을 보유할 수 있고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 내의 활성제는 본 개시내용의 BTS 및 BTS(OMe)일 수 있다.
제조 물품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 포스페이트-완충 염수, 링거액 및/또는 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질, 예컨대 다른 완충제, 희석제, 필터, 교반기, 바늘, 시린지, 및/또는 사용 지침서 및/또는 적응증을 갖는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다.
예시적인 실시양태
1)
하기 화학 구조를 포함하는 조성물:
여기서 E = CO2H, CONHB12H11, B(OH)2이고;
X = H, B(OH)2, Bpin, (-O-CH2CH2)2-O-B12H11, 또는 BF3 -이다.
2)
하기 화학 구조를 포함하는 조성물:
여기서:
R = H, CH3, 또는 CF3이고;
X1 = H, B(OH)2, 또는 BF3 -이고;
X2 = H, B(OH)2, 또는 BF3 -이다.
3)
제2항에 있어서, 하기를 포함하는 조성물:
4)
제2항에 있어서, 하기를 포함하는 조성물:
5)
하기 단계를 포함하는, L-티로신의 목적 물질로의 전환 방법에 의해 생성된 조성물:
(i) 하기를 포함하는, 팔라듐화, 및 이어서 요구되는 보론산으로의 금속 교환을 포함하는 N-Boc-Tyr(3-Br, 4-MeO)-OMe (4)의 아릴 보론산 N-Boc-Tyr(3-B(OH)2-4-MeO)-OMe (5)로의 전환 단계:
a. 메탄올 및 디메톡시에탄을 포함하는 용매 혼합물;
b. 아세트산칼륨을 포함하는 리간드 치환기;
c. N-Boc-Tyr(3-Br, 4-MeO)-OMe (4)를 포함하는 아릴 브로마이드 유형의 시약;
d. 테트라히드록시보란을 포함하는 보론화제;
e. 클로로((트리-tert-부틸포스핀)-2-(2-아미노비페닐))팔라듐 (II)을 포함하는 팔라듐 촉매; 및
f. (i) 물로의 켄칭, (ii) 에틸 아세테이트를 포함하는 용매 교환, 및 (iii) 헥산 중 대략 25% 에틸 아세테이트를 사용한 실리카 상의 플래쉬 크로마토그래피를 포함하는 정제.
(ii) 보론산의 도입 후, 화합물 BTS (7) 및 BTS(OMe) (9)를 형성하기 위해 합성이 분기되는 단계.
(iii) 하기를 포함하는, BTS(OMe) (9)의 구조를 드러내기 위한 N-Boc-Tyr(3-B(OH)2-4-MeO)-OH (8)의 전환 단계:
a. 디옥산 중 4 M 염산을 포함하는 용액;
b. N-Boc-Tyr(3-B(OH)2, 4-OMe)-OH를 포함하는 tert부틸카르바메이트 유형의 시약; 및
c. 물 중 0% 내지 20% 범위의 아세토니트릴을 사용한 역상 크로마토그래피를 포함하는 정제.
(iv) 하기를 포함하는, 동시적인 메틸 에테르 절단 및 카르바메이트 제거, 후속적으로 이어서 비누화를 포함하는 N-Boc-Tyr(3-B(OH)2, 4-MeO)-OMe (5)의 BTS (7)로의 전환 단계:
a. 디클로로메탄을 포함하는 용액;
b. N-Boc-Tyr(3-B(OH)2, 4-MeO)-OMe (5)를 포함하는 첨가된 시약;
c. 삼브로민화붕소를 포함하는 반응물;
d. 디클로로메탄으로부터 물로의 용매 교환;
e. LiOH를 포함하는 반응물; 및
f. 물 중 0% 내지 20% 범위의 아세토니트릴을 사용한 역상 크로마토그래피를 포함하는 정제.
6) 제5항에 있어서, 조성물이 BTS인 방법.
7) 제5항에 있어서, 조성물이 BTS(OMe)인 방법.
8) 도 2에 실질적으로 나타낸 합성을 포함하는, BTS의 제조 방법.
9) 도 4에 실질적으로 나타낸 합성을 포함하는, BTS(OMe)의 제조 방법.
10) 도 8에 나타낸 단계를 포함하는, 도 6에 나타낸 화합물의 정제 방법.
11) 제10항에 있어서, 정제 변형이 하기 단계를 포함하는 것인 방법:
(i) 반응에서 에틸렌 글리콜을 디메톡시에탄 (DME)으로 대체하는 단계;
(ii) 감압을 통해 유기 용매를 제거한 다음, 목적 물질을 수성으로부터 에틸 아세테이트로 추출하는 단계;
(iii) 헥산 중 30% EtOAc에서 등용매 플래쉬 크로마토그래피로 정제하는 단계.
12) 도 11의 합성을 포함하는 탈보호 방법.
13) 제12항에 있어서, 탈보호 단계가 목적 물질 중의 불순물을 감소시키는 것인 방법.
14) 제13항에 있어서, 목적 물질이 BTS인 방법.
15) 제13항에 있어서, 목적 물질이 BTS(OMe)인 방법.
16) 도 12에 제시된 바와 같은 BBr3을 사용한 탈메틸화를 위한 절차를 포함하는 추가의 합성 변형을 포함하는, 도 9에 제시된 바와 같은 N-Boc-Tyr(3-B(OH)2), (4-OMe)-OH의 BTS로의 합성을 포함하는 방법.
17) 제16항에 있어서, BBr3을 사용한 탈메틸화가 목적 물질의 탈붕소화를 완화시키는 것인 방법.
18) 제17항에 있어서, 목적 물질이 BTS인 방법.
19) 제17항에 있어서, 목적 물질이 BTS(OMe)인 방법.
20) 제1항의 조성물을 포함하는 키트.
21) 제2항의 조성물을 포함하는 키트.
22) 제3항의 조성물을 포함하는 키트.
23) 제4항의 조성물을 포함하는 키트.
24) 제1항의 조성물을 포함하는 투여 단위 형태.
25) 제2항의 조성물을 포함하는 투여 단위 형태.
26) 제3항의 조성물을 포함하는 투여 단위 형태.
27) 제4항의 조성물을 포함하는 투여 단위 형태.
28) 제24항에 있어서, 붕소 중성자 포획 요법 (BNCT)에 사용되는 인간 단위 형태.
29) 제25항에 있어서, 붕소 중성자 포획 요법 (BNCT)에 사용되는 인간 단위 형태.
30) 제26항에 있어서, 붕소 중성자 포획 요법 (BNCT)에 사용되는 인간 단위 형태.
31) 제27항에 있어서, 붕소 중성자 포획 요법 (BNCT)에 사용되는 인간 단위 형태.
32) 제5항의 방법에 의해 생성된 BTS 화합물.
33) 제5항의 방법에 의해 생성된 BTS(OMe) 화합물.
34) 제32항의 BTS 화합물을 사용하여 암을 치료하는 방법으로서, 여기서 상기 BTS는 BNCT에서 중성자 포획제로서 사용되는 것인 방법.
35) 제33항의 BTS(OMe) 화합물을 사용하여 암을 치료하는 방법으로서, 여기서 상기 BTS(OMe)는 BNCT에서 중성자 포획제로서 사용되는 것인 방법.
실시예:
본 발명의 다양한 측면은 하기 여러 실시예로서 추가로 기재되고 예시되며, 이들 중 어느 것도 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1: Boc-Tyr(3-Br, 4-OMe)-OMe 전구체의 합성.
N-Boc-Tyr(3-Br, 4-OMe)-OMe 전구체의 합성을 도 5에 나타냈고, 표준 방법을 사용하여 수행하였다. 문헌 [GHOSH, et al., Arkivoc (2009) (vii) pp. 72-78]을 참조한다.
실시예 2: Tyr에서 Boc-Tyr(3-Br, 4-OMe)-OMe, 이어서 Boc-Tyr(3-B(OH)2, 4-OMe)-OMe로의 합성
N-Boc-Tyr(3-Br, 4-OMe)-OMe 전구체의 합성 (상기 실시예 1 참조)에 이어서, N-Boc-Tyr(3-B(OH)2, 4-OMe)-OMe로의 추가의 합성을 하기 방법을 사용하여 수행하였다. 문헌 [GURUNG, et al., Org. Process Res. Dev. (2017), 21, pp. 65-74]을 참조한다.
간략하게, 화염 건조된 아르곤 켄칭 플라스크에 메탄올 30 mL 및 디메톡시에탄 12 mL를 채웠다. 이어서, 용액에 아세트산칼륨 2.8 g, 이어서 N-Boc-Tyr(3-Br, 4OMe)-OMe 5 g, 이어서 테트라히드록시디보란 1.3 g을 첨가하였다. 최종적으로, 반응 혼합물에 촉매 Pd, 3 mg의 클로로[(트리-tert-부틸포스핀)-2-(2-아미노비페닐)]팔라듐 (II)을 첨가하였다. 아르곤 분위기 하에, 반응물을 20℃에서 밤새 교반하였다. 반응 완결 시, 물 20 mL를 천천히 첨가하고, 30분 동안 켄칭되도록 하였다. 고체를 여과에 의해 제거하였다. 이어서, 유기 용매를 감압 하에 제거하였다. 이어서, 수성 층을 에틸 아세테이트로 3회 세척하였다. 이어서, 유기 층을 합하고, 감압 하에 농축시켰다. 조 물질을 헥산 중 25% 에틸 아세테이트에서 실리카 상에서 플래쉬 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 유기 용매의 제거시, 목적 물질은 백색 고체로서 75% 수율로 단리되었다.
목적 물질은 본원에 언급된 합성에서 침전되지 않지만, 여과 후에 모액에 잔류하는 것으로 관찰되었다. 따라서, 본 개시내용은 하기와 같이 정제를 추가로 변형시킨다:
- (i) 반응에서 에틸렌 글리콜을 디메톡시에탄 (DME)으로 대체한다.
반응은 킬레이트화를 유지하지만, 관련 기술분야에 이전에 공지되었던 보다 낮은 비점을 갖는 것이 주목되고 이해된다.
- (ii) 초기 여과 후, 감압을 통해 유기 용매를 제거한 다음, 수성으로부터 에틸 아세테이트로 목적 물질을 추출한다.
이러한 추가의 단계는 관련 기술분야에서 이전에 보고되지 않았던 친수성 불순물을 제거하는 유기 상으로의 역추출의 이점을 제공한다는 것이 주목된다.
- (iii) 디페닐-보론산이 주요 불순물 / 부산물이고, 반응의 증가된 희석은 이 물질에서 약간의 감소를 나타낸다.
증가된 희석은 보다 높은 당량의 BBA를 이용하고, 아릴-팔라듐 복합체와 특유의 커플링 파트너인 N-Boc-Tyr(3-B(OH)2, 4-OMe)-OMe 사이의 상호작용의 확률을 감소시킴으로써 아릴-아릴 팔라듐 커플링에 비해 보릴화에 유리함이 주목된다.
- (iv) 최종적으로, 추가의 정제를 위해, 헥산 중 30% EtOAc에서 등용매 플래쉬 크로마토그래피를 수행한다.
헥산 중 25% EtOAc에서의 정제는 비아릴 부산물로부터 밀접하게 용리된 N-Boc-Tyr(3-B(OH)2, 4-OMe)-OMe를 분리하는 이점을 제공한다는 것이 주목된다.
도 6에 제시된 생성된 변형된 절차를 수행하여 도 6에 제시된 생성된 화합물 (화학 구조 번호 5)을 수득하였다.
실시예 3: QDA 질량 검출을 사용한 Pd 커플링의 분석
상기 실시예 2에 제시된 합성에서 PD 커플링으로부터 생성된 불순물을 제시하기 위해, 하기 실험을 QDA 질량 검출을 사용하여 수행하였다. 간략하게, QDA 질량 검출기 검정을 제조업체의 표준 프로토콜에 따라 사용하였다. 칼럼은 가드 칼럼(Guard Column) (워터스 코포레이션(Waters Corp), 매사추세츠주 밀포드)을 갖는 액퀴티 BEH C18(Acquity BEH C18) 칼럼 (2.1 x 50 mm)이었다. 칼럼 온도는 40℃였다. 이동상 A는 0.1% 포름산을 포함하였고, 이동상 B는 0.1% 포름산 및 90% 아세토니트릴을 포함하였다. 구배는 하기 표에 기재되어 있다:
QDA 질량 검출기 상의 양이온 모드는 Boc 기를 나타내지 않고, 이들은 보다 간단한 방식으로 질량 등가성을 나타내기 위해 구조에서 의도적으로 생략된다는 것이 주목되어야 한다.
도 7(A)에 제시된 결과는 반응물 (상기 실시예 2 참조)의 총 이온 전류 (TIC)를 나타낸다. TIC 크로마토그램은 분석에서 모든 지점에서 검출되는 질량의 전체 범위에 걸쳐 합산된 강도를 나타냄을 주목한다. 도 7(B)는 285 nm에서의 UV 트레이스를 나타낸다. 마지막으로, 도 7(C)는 도 6에 제시된 합성 변형 전의 생성물 및 반응과 관련된 주요 불순물의 질량 ID를 나타낸다. 결과는 2.0분에서 목적 물질이 용리되는 반면, 불순물은 2.7분에서 나타난다는 것을 보여준다. 불순물의 고유한 특색은, 특색이 N 및 C 말단의 탈보호에서 생존하지 못하더라도, 불순물이 1개의 보론산 모티프를 유지한다는 것이 관찰된다.
실시예 4: Boc-Tyr(3-B(OH)2, 4-OMe)-OMe 탈보호를 위한 화학적 합성
상기 실시예 2에 제시된 신규 정제 절차에 따라, 목적 물질에서 발견되는 불순물을 감소시키기 위해, 합성에서 추가의 탈보호 단계를 수행하였다. 이 탈보호 단계는 BTS 및 BTS(OMe)의 합성에 대한 추가의 신규 변형이고, 하기 방식으로 수행된다.
간략하게, 화염 건조된 아르곤 켄칭 플라스크에 디클로로메탄 25 mL를 채웠다. 용액에 N-Boc-Tyr(3-B(OH)2, 4-OMe)-OMe 1.5 g을 첨가하였다. 온도를 드라이 아이스 조를 사용하여 -78℃로 감소시켰다. 1 당량의 삼브로민화붕소를 첨가하였다. 이어서, 30분 후, Boc 기는 LCMS에 의해 더 이상 관찰가능하지 않았다. 따라서, 이 단계에서, 제2 당량의 삼브로민화붕소를 첨가하였다. 반응물을 0℃로 가온하였다. 2시간 후, 페놀계 산소를 탈메틸화시켰다. 이어서, 반응물을 물로 켄칭하고, DCM을 추출을 통해 제거하였다. 수성 층을 LiOH를 사용하여 pH 10 초과로 만들었다. pH > 10 < 12에서 15분 후, 에스테르를 비누화하여 목적 물질을 제공하였다. 수성 층을 감압 하에 농축시키고, 최종 물질을 정제용 액체 크로마토그래피를 통해 단리하였다.
과량의 BBr3이 첨가되는 경우를 제외하고는, N 또는 C 말단이 탈보호될 때 반응이 진행되는 것으로 보이지 않음이 관찰된다. 그러나, 이는 신속한 탈붕소화를 초래한다. 기질이 양성자화를 통해 티로신 스캐폴드로 복귀되거나 또는 3,4-디히드록시 티로신, L-DOPA로 산화되기 때문에 반응의 탈붕소화는 문제가 된다. 이들 둘 다는 더 이상 BNCT에 필요한 붕소를 운반하지 않는다.
따라서, 본 개시내용의 한 측면 내에서, 반응은, 1 당량의 BBr3을 첨가하고, Boc 기가 제거될 때까지 (대략 30분) 반응을 모니터링하고, 이어서 제2 당량의 BBr3을 첨가한 후에 상업용 규모 확대에 효율적이고 유리한 것으로 관찰되었다. 제2 당량의 BBr3의 첨가 후, 반응물을 0℃로 가온하여 반응을 가속화하였다 (대략 2시간). 대안적 실시양태에서, 본원에 제시된 바와 같이, 2 당량 첨가를 이용하는 것보다 반응 과정에 걸쳐 BBr3의 정상 첨가를 수행하는 것이 본 개시내용의 측면 내에 있다.
마지막으로, 목적 물질이 수용성이기 때문에, 본원에 기재된 바와 같이 반응이 물로 켄칭되면, 이는 DCM으로부터 물로의 추출 및 물질의 최종 비누화 반응으로의 직접적인 단축을 가능하게 함이 주목된다. 혼합물이 너무 오랫동안 물에 방치되는 경우, HBr이 형성되고 바람직하지 않은 부반응인 양성자탈붕소화를 개시한다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이다.
본원에 제시된 합성의 결과는 도 8에 제시된다.
도 8에 나타낸 계내 완전한 탈보호보다는, 탈보호는 단계적 방식으로 수행될 수 있다. 간략하게, 화염 건조된 아르곤 켄칭 플라스크에 디클로로메탄 25 mL를 채웠다. 용액에 N-Boc-Tyr(3-B(OH)2, 4-OMe)-OMe 1.5 g을 첨가하였다. 온도를 드라이 아이스 조를 사용하여 0℃로 감소시켰다. 1 당량의 삼브로민화붕소를 첨가하였다. 이어서, 30분 후에 Boc 기는 LCMS에 의해 더 이상 관찰가능하지 않았다. 따라서, 이 단계에서, 제2 당량의 삼브로민화붕소를 첨가하였다. 반응물을 0℃에서 유지하였다. 2시간 후, 페놀계 산소를 탈메틸화시켰다. 이어서, 반응물을 메탄올로 켄칭하고, 유기 용매를 감압 하에 제거하여 황색 분말을 남겼다. 이 분말에 아세토니트릴을 첨가하여 목적 물질을 백색 분말로서 침전시켰다.
본원에 제시된 합성의 결과는 도 9에 제시된다.
비누화 단계는 극도로 민감한 것으로 밝혀졌고, 대부분의 조건은 티로신으로의 프로토-탈붕소화 또는 L-DOPA로 이어지는 산화성 탈붕소화를 초래한다. 2가지 성공적인 경로가 발견되었다.
제1 예시에서 Tyr(3-B(OH)2-OMe를 물 중 10 부피의 0.1 M KCl 중에 용해시키고, 0.1 M NaOH를 사용하여 pH를 7로 조정하였다. 이 용액에 돼지 간 에스테라제를 첨가하고, 반응을 37℃가 되게 하였다. 2일 후, 목적 물질인 Tyr(3-B(OH)2를 정제용 LCMS를 통해 단리하였다. 제2 방법은 Tyr(3-B(OH)2-OMe를 60 부피의 물에 용해시킴으로써 수행되었다. 이 용액에 2.2 당량의 LiOH를 첨가하였다. 15분 이내에, 비누화된 물질을 정제용 LCMS를 통해 정제할 준비가 되었다.
본원에 제시된 합성의 결과는 각각 도 10(A) 및 10(B)에 제시되어 있다.
실시예 5: Boc-Tyr(3-B(OH)2, 4-OMe)-OMe에서 Boc-Tyr(3-B(OH)2, 4-OMe)-OH로의 화학적 합성
N-Boc-Tyr(3-B(OH)2, 4-OMe)-OMe에서 N-Boc-Tyr(3-B(OH)2, 4-OMe)-OH로의 합성을 도 11에 나타냈고, 표준 방법을 이용하여 수행하였다. 문헌 [GHOSH, et al., Arkivoc (2009) (vii) pp. 72-78]을 참조한다.
실시예 6: Boc-Tyr(3-B(OH)2, 4-OMe)-OH에서 BTS(OMe)로의 화학적 합성
N-Boc-Tyr(3-B(OH)2, 4-OMe)-OH의 BTS(OMe)로의 합성을 도 12에 나타냈고, 이는 본 개시내용의 범주 내에 있는 추가의 합성 변형을 이용한다. 변형은 BBr3을 사용한 탈메틸화를 위한 절차를 이용하지 않고, 도 8 및 도 9에 나타나 있으며, 메틸 에테르를 유지한다.
간략하게, N-Boc-Tyr(3-B(OH)2, 4-OMe)-OH 1.0 g이 충전된 플라스크에 디옥산 중 4 M 염산의 용액을 첨가하였다. 1시간 후, Boc 보호된 출발 물질의 존재는 관찰되지 않았다. 휘발성 용매 및 산을 감압 하에 제거하고, 목적 물질을 프로토콜을 사용하여 정제용 LC에 의해 정제하였다. 간략하게, 30 mm x 100 mm의 치수를 갖는 C18 정제용 칼럼을 사용하였다. 유량을 50 mL/분으로 설정하였다. 사용된 구배를 하기 표에 제시하였다:
크로마토그래피 분석의 결과는 도 13에 제시된다. 생성된 BTS(OMe)는 도 3에 제시된 구조를 갖는다.
실시예 7: 웨스턴 블롯을 통한 LAT1 발현 분석.
간략한 배경기술로서, LAT-1 (SLC7A5)은 Leu, Phe, Tyr, His 및 Trp를 포함한 대형 중성 아미노산의 흡수를 매개하는 아미노산 수송체이다. 이는 또한 L-DOPA 및 갑상선 호르몬의 흡수를 담당한다. 구조적으로, 이는 CD98과 이종이량체를 형성하는 11-TM 단백질이다. 그의 발현은 두경부암 및 신경교종을 포함한 특정 암 적응증에서 상향조절된다.
LAT-1 발현을 웨스턴 블롯팅을 사용하여 세포주에 걸쳐 정성적으로 추정하였다. 간략하게, 세포 용해물 (총 단백질 10 μg)을 SDS-PAGE 상에서 러닝시키고, PVDF 막으로 옮겼다. 항-SLC7A5 폴리클로날 (인비트로젠(Invitrogen) #PA5-50485)을 LAT-1의 검출에 사용하였다. 마우스 항-b-액틴 MAb (인비트로젠 #AM4302)를 로딩 대조군으로서 사용하였다. 2차 (검출 항체)는 각각 알렉사 플루오르 플러스(Alexa Fluor Plus) 염소 항-토끼 및 알렉사 플루오르 790 당나귀 항-마우스였다.
결과는 세포주 FaDu, HeLa, 및 A431이 가장 높은 수준의 LAT-1 발현을 나타냈다는 것을 보여준다. (도 14).
따라서, FaDu 세포주 (인두 편평세포 암종)가 붕소 중성자 포획 요법 (BNCT) 치료와 가장 관련된 적응증을 나타내기 때문에 보론화 아미노산의 후속 평가를 위해 선택되었다.
실시예 8: BTS, BTS(OMe) 용액의 불순물 프로파일.
용액 중 BTS 및 BTS(OMe)의 용해도 및 불순물 프로파일을 결정하기 위해, 하기 프로토콜을 사용하여 하기 실험을 수행하였다. 간략하게, BTS 시험 물품 제제(들)을 물에 용해시키고 NaOH에 의해 pH를 7-7.5로 조정함으로써 제조하였다.
BTS(OMe) 시험 물품 제제(들)을 물 중에 용해시키고, 모든 결정이 가용화될 때까지 NaOH를 첨가하여 pH를 서서히 상승시킴으로써 제조하였다. 그 시점에서의 pH는 대략 9.5-10이다. 이어서, 프룩토스를 1.1 mol/mol BTS(OMe)의 비로 첨가하였다. 진한 HCl을 사용하여 pH를 7-7.5로 조정하였다.
두 용액을 100 mg/mL로 조정하고, 0.2 μm 여과하였다. 실제 농도를 ICP OES에 의해 확인하였다.
BTS 및 BTS(OMe) 용액의 분석을 LCMS를 통해 수행하였다. 간략하게, LS/MS 순도 확인을 40℃에서 유지되고 수성 포름산-2% 아세토니트릴로 평형화된 액퀴티 BEH C18 칼럼 (50 x 2.1 mm, 1.7 μm, (워터스))이 장착된 액퀴티 H-부류 시스템 (워터스)을 사용하여 LCMS에 의해 수행하였다. 화합물 및 불순물을 아세토니트릴-포름산의 구배를 사용하여 6분에 걸쳐 2에서 20%로 용리시켰다. 피크 할당은 인-라인 ESI LCMS를 사용하여 양성 모드로 수행하였다. 결과는 두 화합물 모두 95% 초과의 불순물이 없었다는 것을 나타낸다. (도 15).
실시예 9: 시험관내 FaDu 및 CT26 세포에서의 붕소 흡수.
하인두 편평세포 암종-유래 세포주 FaDu가 높은 LAT-1 발현을 갖는다는 것이 널리 입증되었다. 그 결과, 이는 붕소 화합물을 상당한 수준으로 축적한다. 추가로, FaDu는 또한 SCID 마우스에서 확립된 이종이식편 모델로서 잘 성장한다. 본 개시내용은 마우스-유래 암 세포주인 CT-26이 BNCT 실험에 적합한지 여부를 결정하기 위해 노력하였다. 배경기술로서, CT26은 동계 모델이고, 야생형 BalbC 마우스에 이식되고 확립될 수 있으며, 편리하고 저비용인 모델을 제공한다.
간략하게, CT26 세포를 수거하고, PBS로 2회 세척하고, 카운트를 HBSS 배지 중에서 2백만/ml로 조정하였다. 이어서, 붕소 화합물을 HBSS 중 2.5 mM의 최종 농도로 세포에 첨가하고, 세포를 가습 5% CO2 분위기 하에 37℃에서 2.0시간 동안 진탕시키면서 인큐베이션하였다. 2시간 인큐베이션 후, 세포를 수거하고, 빙냉 PBS로 2회 세척하였다. 세포를 1 ml 빙냉 PBS 중에 현탁시키고, 일부 (50 μl)를 RIPA 완충제 중에 용해시키고, 단백질 함량을 BCA 검정에 의해 결정하였다.
나머지 부분 (950 μl)을 질산 용해 (80℃에서 66.7% 산)에 적용하고, 붕소 측정을 ICP-OES를 사용하여 수행하였다.
도 16의 결과는 세포를 3종의 화합물 각각에 대해 등몰 농도를 함유하는 배지에서 인큐베이션한 경우에, 세포내 붕소 농도가 BPA-프룩토스에 비해 BTS로 처리된 세포에 대해 60% 더 높았음을 보여준다 (1700 ± 133 대 1097 ± 59 μg/g). BTS(OMe)-프룩토스의 세포내 농도는 BPA-프룩토스의 것과 유사하였다 (1005 ± 113 μg/g). BTS가 FaDu 세포에 대한 바람직한 기질이라는 사실을 설명하기 위한 몇몇 가능성이 존재한다. 먼저, LAT-1 이외의 다른 수송체 (즉, SLC7A5)가 수반되어, 증대된 순 세포내 붕소를 생성할 수 있다. 대안적으로, BTS는 아미노산 수송체가 양 방향으로 작용하기 때문에 세포 내부에서 보다 잘 보유될 수 있다. 본 발명자들은 이전에 범-LAT-1 억제제 BCH (2-아미노비시클로-(2,2,1)-헵탄-2-카르복실산) 뿐만 아니라 LAT-1 특이적 억제제 JPH203이 농도-의존성 방식으로 붕소 축적을 감소시켰음을 제시하였으며, 이는 LAT-1이 보릴화 티로신 유사체에 대한 단독 수송체일 가능성이 있다는 것을 시사한다 (비공개). 본 발명자들은 또한 세포 체류, 즉 붕소 공급원이 배지로부터 제거될 경우 세포내 붕소 농도 감소에 있어서 BPA와 BTS 사이에 차이가 있다는 것을 보여주었다. BPA가 제거되고 신선한 배지로 대체 시 BPA-프룩토스로 처리된 세포에 대해 세포내 붕소의 양이 급격히 감소한다.
CT26 세포주에서 내재화된 각각의 화합물의 양은 FaDu에서보다 대략 40% 더 적은 반면, BTS의 내재화의 감소는 보다 현저하였다. 웨스턴 블롯에 의해 추정된 CT26에서의 LAT-1의 낮은 발현은 전반적으로 감소된 붕소 흡수와 일치한다. 각각의 막대는 상이한 날에 수행된 3회의 독립적인 실험 (FaDu)을 나타내거나 또는 단일 실험 (CT-26)을 나타낸다. 오차 막대는 1 표준 편차를 나타낸다. 보로노페닐알라닌 (프룩토스 용액으로서)을 대조군으로서 사용하였다. (도 14 참조).
실시예 10: 다발성 두경부암 세포주에 걸친 BTS 흡수
다발성 두경부암 세포주 및 흑색종 세포주에서 BTS의 흡수를 평가하기 위해, 다음 프로토콜을 사용하여 다음 실험을 수행하였다.
간략하게, 모두 BNCT 처리와 관련된 암 적응증을 나타내는 5종의 인간-유래 세포주 (FaDu, A375, SCC-25, A253, 및 Detroit 562)를 배양하고, BPA-프룩토스 (표준 관리) 또는 BTS로 2시간 동안 처리하였다. 이어서, 세포를 세척하여 화합물을 제거하고, 수거하고, 상기 기재된 프로토콜에 따라 처리하였다. 붕소 흡수는 ICP OES 및 BCA 검정에 의해 각각 결정된 바와 같이 세포 단백질 mg당 붕소 μg으로서 보고되었다.
결과는 BTS가 시험된 각각의 세포주에 걸쳐 BPA-프룩토스와 비교하여 우수한 흡수를 갖는다는 것을 보여준다. 도 17을 참조한다.
실시예 11: 래트 신경교종 세포주를 사용한 BTS 흡수
래트 신경교종 세포주는 혁신적인 붕소 담체, 또는 보로노포르피린의 대류 증진 전달 (문헌 [Yang, et al., doi:10.1016/j.apradiso.2014.01.002]) 또는 L-DOPA로의 종양의 사전-치료 (문헌 [Barth, et al., J Neurooncol. 2009; 94:299-312])를 포함한 BPA의 흡수를 증진시키는 무수한 방식을 사용하여 반응기 기반 BNCT 연구를 수행하기 위한 동소 암 모델로서 광범위하게 사용되었다.
이 실험에서, 배양된 세포주를 사용하여 BTS가 F98 및 C6 래트 신경교종 세포주 둘 다로의 효율적인 붕소 전달에 사용될 수 있다는 것을 확인하였다. 실제로, 2시간에 달성된 붕소 농도는 BPA-프룩토스와 비교하여 BTS가 > 2-배 더 높았으며, 이는 BTS가 심지어 다중 종에 걸쳐 다중 암 적응증에 대한 바람직한 LAT-1 기질임을 입증한다 (도 18 참조). 이 화합물은 BBB를 통과할 것으로 예상되고, 뇌 종양의 BNCT와 관련될 것이다.
실시예 12: LAT1에 대한 BTS와 Phe 사이의 경쟁.
BTS 및 BTS(OMe)가 LAT-1을 매개하는 능력을 결정하기 위해, 하기 프로토콜을 사용하여 하기 실험을 수행하였다. 간략하게, FaDu 세포 (2백만 개)를 HBSS 배지에서 2시간 동안 37℃에서 0.5 mM의 (i) BTS, (ii) BTS(OMe), 또는 (iii) BPA-프룩토스와 함께, 증가하는 농도의 LAT-1 특이적 억제제 JPH203-디클로라이드 (19A) 또는 페닐알라닌, 경쟁자 (19B)의 존재 또는 부재 (19A) 하에 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 수거하고, 차가운 PBS로 세척하였다. 세포에 의해 흡수된 각각의 화합물의 양을 ICP OES에 의해 결정하였다. IC50 결정은 프리즘(Prism) (그래프패드(GraphPad)) 소프트웨어를 사용하여 3 파라미터 억제제 비-선형 회귀 피트에 의해 이루어졌다.
결과는 BPA, BTS, 및 BTS(OMe) 수송이 JHP203에 의해 대략 0.3 mM의 IC50으로 동등하게 억제된다는 것을 보여준다. 이는 LAT-1 매개된 흡수를 나타낸다.
경쟁 검정에서, 0.01 내지 20 mM 범위의 증가된 농도의 Phe를 사용하였다. BTS는 BTS(OMe) 또는 BPA에 비해 더 높은 IC50을 갖는 것으로 나타났고, 이는 전자를 능가하기 위해 더 높은 페닐알라닌 농도가 요구됨을 나타낸다. 이는 BTS가 LAT-1에 대한 친화도가 더 높다는 것을 시사한다 (도 19).
실시예 12: 비-종양 보유 Balb-C 마우스에서의 BTS 대 BPA의 약동학
혈액 중 BTS 대 BPA (BPA-프룩토스)의 약동학을 결정하기 위해, 하기 프로토콜을 사용하여 표 II에 제시된 파라미터 하에 하기 실험을 수행하였다. 간략하게, 200 mg/mL의 각각의 화합물 (BTA 및 BPA-프룩토스)을 Balb/C 비-종양 보유 수컷 마우스 (군당 5마리의 마우스)의 꼬리 정맥에 주사하였다. 혈액을 하기 시점에 EDTA-코팅된 튜브로 채취하였다: 2, 5, 16, 30, 60, 120 및 240분. 붕소 농도를 진한 질산 중에서 1시간 동안 분해 후 ICP OES를 사용하여 측정하였다. 붕소 농도를 1 mL의 혈액에 대해 정규화하고, 그래프패드 프리즘을 사용하여 플롯팅하였다. PK 파라미터 (20(B) 참조)는 구획 분석을 사용하여 PK 솔버(PK Solver) 버전 2.0을 사용하여 수득하였다. BPA-프룩토스를 참조 물질로서 사용하였다.
결과는 BTS (염수 제제로서)가 보다 짧은 t1/2 베타 (예를 들어, 제거 상) 및 보다 빠른 클리어런스 (CL)를 갖는 2상 약동학을 나타냄을 보여준다. BTS 및 BPA에 대한 t1/2가 보고되었지만, 알파 상 동안 급속한 감소가 관찰되었다. 정상 상태에서의 분포 부피 (Vss)는 BPA보다 BTS에 대해 더 낮다. 이는 BTS가 보다 높은 혈액 단백질 결합을 가지며, 기관을 제거하는 데 용이하게 접근가능할 가능성이 있다는 것을 시사한다. (도 20)
실시예 13: BTS 및 BTS(OMe) 생체분포 연구 및 생체내 종양 대 혈액 비(들).
BTS 및 BTS(OMe)의 생체분포 및 종양 대 혈액 비를 결정하기 위해, 하기 프로토콜을 사용하여 하기 실험을 수행하였다. 간략하게, BPA를 제외한 시험된 모든 화합물을 100 mg/mL 원액으로서 제조하였다. BPA를 25 mg/ml의 프룩토스 용액으로서 제조하였다. 연구 전에 ICP OES에 의해 농도를 확인하였다. 혈액 및 조직 (종양, 신장 및 췌장)을 지시된 시간에 수거하고, 칭량하고, 테플론(Teflon) 용기 내부에 넣고, CEM 마이크로웨이브 오븐을 사용하여 소화시켰다. 소화된 조직을 ICP OES에 의해 분석하여 붕소 농도를 결정하였다.
모든 동물 연구는 문헌 ["Guide for the care and use the laboratory animals," Eighth Edition and Animal Welfare Act (USDA)]에 따라 수행하였다. 간략하게, 인간 하인두 편평 세포 암종 FaDu 세포를 L-글루타민 및 10% FBS로 보충된 DMEM 중에 유지하였다. 암컷 CB17 SCID 마우스의 우측 측복부에 매트리겔 (Matrigel) (코닝 라이프 사이언시스(Corning Life Sciences))과 1:1 희석으로 혼합된 2.5 x 106개 암 세포를 주사하여 피하 (s.c.) 종양을 생성하였다. 종양 크기를 캘리퍼 측정에 의해 결정하고, 종양 부피를 폭2 x 길이/2로서 계산하였으며, 여기서 폭은 최소 치수이고, 길이는 최대 치수이다. 종양이 대략 300 mm3 부피에 도달할 때까지 종양을 비치료 상태로 성장시켰다. 그 시점에서, 동물을 무작위화하고, 치료 개시 시점에서의 종양 부피에 기초하여 각각의 치료군에 할당하여 각각의 군에서의 유사한 평균 종양 크기 및 변동을 보장하였다.
각각의 군에게 단일 용량의 200 mg/mg의 BPA 또는 400 mg/kg 또는 800 mg/mg의 시험 물품을 정맥내 꼬리 정맥 주사를 통해 제공하였다. 주사 부피는 수의학 지침에 따라 마우스당 200 μL를 초과하지 않았다. 투여 후 2시간에, 각각의 마우스로부터의 혈액을 하악하 정맥으로부터 K2 EDTA 코팅된 튜브 내로 수집하였다. 붕소 분석을 위해 종양 및 기관을 수집하였다.
FaDu-종양 보유 마우스에서 BTS 및 BTS(OMe)의 생체분포를 결정하고 후속 용량-증량 연구 동안 관심 종양 및 기관을 수거하기 위한 가장 적절한 시간을 결정하기 위해, 두 분자 모두의 400 mg/kg 용량을 볼루스 i.v. 주사로서 투여하였다. BPA-프룩토스를 그의 용해도 제약 및 허용된 최대 i.v. 부피에 대한 요건으로 인해 200 mg/mL의 용량으로 투여하였다. 혈액/기관에서의 붕소 화합물 축적을 ICP OES에 의해 결정하고, 조직 그램당 붕소 μg으로서 표현하였다.
결과는 60분에 최대로 종양에 상당한 축적이 있었으며, 이후 시점에 점차적으로 점점 감소하였음을 나타낸다 (도 21(A)). 혈액 및 신장에서, 5분의 초기 시점으로부터 관찰된 급속한 감소가 존재하였다. 특히, 감소는 신장에서 BTS에 대해 상당히 더 느렸다 (도 21(B) 및 도 21(D)). 이는 사구체에서의 높은 신장 체류 또는 가능하게는 네프론에서의 일부 재흡수 메카니즘으로 인한 것이다. 또한, BTS는 LAT-1의 존재로 인해 뮤린 췌장에서 극히 높은 흡수를 나타냈다 (도 21(C)). 뮤린 췌장에서의 티로신-기재 PET 추적자의 높은 흡수가 밝혀졌다 (문헌 [ABE, et al. 2009, https://doi.org/10.1080/02841850600979055] 참조).
추가로, BTS(OMe)는 그의 생체분포에서 BPA와 현저하게 유사하였다. BTS에 대한 종양 대 혈액 비는 30분과 60분 사이에 2배 초과로 증가하였고, 60분과 120분 사이에 30% 미만으로 증가하였다 (도 22). 따라서, 후속 연구에서 후속 기관 수거를 위해 120분 시점을 선택하였다.
실시예 14: 생체내 FaDu 세포를 사용한 BTS 및 BTS(OMe)의 생체분포 연구 및 붕소 흡수.
생체 내에서 BTS 및 BTS(OMe)의 생체분포 및 붕소 흡수를 결정하기 위해, 하기 프로토콜을 사용하여 하기 실험을 수행하였다. 간략하게, 볼루스 i.v. 주사를 사용하여 종양에서의 붕소의 축적에 대한 증가된 용량 수준의 효과를 평가하기 위해, 피하 FaDu를 보유하는 SCID 마우스에게 BTS 및 BTS(OMe)를 400 내지 1000 mg/kg 범위의 수준으로 투여하였다.
종양 및 선택된 기관을 주사 후 2시간에 수거하고, ICP OES를 위해 처리하였다.
생체분포의 결과를 그래프화하고 (도 23), 붕소 흡수에 대해서는 종양만을 나타냈다 (도 24). 결과는 화합물 BTS 및 BTS(OMe) 둘 다가 200 mg/kg 수준으로만 투여된 BPA 군과 비교하여 상당히 더 높은 수준으로 종양에 축적되었다는 결론을 내렸다. 낮은 수준의 BPA 투여는 그의 용해도 한계의 결과이다. BTS 군은 BPA를 사용하여 달성가능한 수준을 상당히 초과하는 종양에서의 붕소의 수준을 달성하였다 (66 ± 20 대 25 ± 3 μg/mg). BTS(OMe)에 의해 부여된 종양내 붕소 농도, 44 ± 8 μg/mg은 BTS보다 낮았지만, 여전히 BPA로 달성된 수준의 거의 2배만큼 높았다. BTS 및 BTS(OMe) 수준 둘 다는 800에서 1000 mg/kg 용량-수준으로 단지 미미하게 증가하였으며, 이는 LAT-1 시스템이 대략 800 mg/kg에서 포화에 도달한다는 것을 시사한다.
결과는 BTS(OMe)가 신장 또는 췌장에 축적되지 않고, 그 측면에서 BPA와 유사함을 추가로 확인하였다. 연구는 또한 어느 화합물도 뇌에 축적되지 않음을 밝혀냈다. 이전의 약동학 연구 (실시예 12 참조)와 일치하게, 모든 화합물은 2시간에 낮은 수준일지라도 혈액에서 검출가능하였다. 이는 정상 뇌에서의 붕소 수준이 천연 붕소 흡수일 가능성이 있고 이들 화합물의 전신 존재에 의해 혼동되지 않을 것임을 시사한다. 따라서, 생체분포를 나타내기 위해 주사 후 2시간이 정확하게 선택되었다.
실시예 15: BNCT에 관련된 적응증으로부터 선택된 확립된 이종이식편을 사용한 종양으로의 붕소 전달
추가의 실험에서, BTS 및 BTS(OMe)가 보다 높은 붕소 농도를 생성하는 암 다중 세포주에 걸쳐 비교적 더 높은 정도로 흡수되는지 여부를 확인하기 위해, 하기 프로토콜을 사용하였다. 간략하게, BNCT를 사용한 치료에 대해 고려되는 다중 적응증으로부터 유래된 5종의 인간 암 세포주의 패널을 사용하였다. 구체적으로, 패널은 두경부 암종 (FaDu 및 Detroit 562), 흑색종 (MeWo), 비소암 폐 암종 (A549) 및 유방 암종 (HCC-1954)으로 이루어졌다.
표준 방법을 사용하여, 피하 이식된 확립된 마우스 이종이식편을 SCID CB-17 마우스에서 성장시켰다. 종양이 하기와 같이 150-200 mm3에 도달했을 때 치료를 시작하였다: BTS 또는 BTS(OMe) 부문은 800 mg/kg을 받았고, 대조군 BPA 아암은 200 mg/kg을 받았다. 주사 2시간 후에 동물을 안락사시켰다. 종양을 수거하고, 칭량하고, 표준 방법을 사용하여 소화시켰다. 붕소의 농도를 ICP OES에 의해 측정하고, 조직 그램당 마이크로그램으로서 플롯팅하였다. 도 25에 도시된 바와 같이, BTS 및 BTS(OMe) 부문에서 붕소의 양이 가장 높았고, 이전의 결과와 일치하였다. 그러나, 절대 흡수는 세포주 사이에서 다양하였고, 전체 최저 흡수는 Detroit 562 종양에서 관찰되었다.
추가로, 본 발명자들은 관찰된 차이가 LAT-1 발현 수준과 관련이 있는지 여부를 평가하였다. 수거된 종양을 IHC에 의해 LAT-1에 대해 염색하였다.
도 26에 제시된 바와 같이, FaDu 및 MeWo 종양 둘 다는 > 99% LAT-1 염색을 갖는 반면 (26(A) 및 26(B) 참조), Detroit 562는 45% 염색을 가졌고, 종양의 일부 영역은 LAT-1 발현이 결여되었다 (26(E) 참조). 기질 세포는 또한 후자의 시편에 존재하였다. HCC-1954와 A549 둘 다는 가장 높은 염색 정도와 가장 낮은 염색 정도 사이의 중간에 있었다 (도 26(C) 및 26(D) 참조). 상기에 기초하여, LAT-1 발현 분석이 붕소 흡수와 상관관계가 있는 것으로 나타났으며, 이는 상승된 LAT-1 발현이 BNCT 치료의 우수한 결과에 중요함을 확증한다.
실시예 16: BTS 및 BTS(OMe)의 사용을 통한 인간 암종의 치료를 위한 인간 임상 시험.
BTS 및/또는 BTS(OMe)는 본 발명에 따라 합성되며 종양 세포에 특이적으로 축적되고 특정 종양 및 다른 면역학적 장애 및/또는 다른 질환의 치료에 사용된다. 각각의 이들 적응증과 관련하여, 2가지 임상 접근법이 성공적으로 추구된다.
I.) 보조 요법: 보조 요법에서, 환자를 화학요법제 또는 제약 또는 생물제약 작용제 또는 그의 조합과 조합하여 BTS 및/또는 BTS(OMe)로 치료한다. 원발성 암 표적을 BTS 및/또는 BTS(OMe)의 첨가에 의해 표준 프로토콜 하에 치료한 다음, 조사하였다. 프로토콜 설계는 원발성 또는 전이성 병변의 종양 질량의 감소, 무진행 생존의 증가, 전체 생존, 환자의 건강의 개선, 질환 안정화, 뿐만 아니라 표준 화학요법 및 다른 생물학적 작용제의 통상적인 용량을 감소시키는 능력을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 하기 실시예에 의해 평가된 바와 같은 유효성을 다룬다. 이들 투여량 감소는 화학요법제 또는 생물학적 작용제의 용량-관련 독성을 감소시킴으로써 추가의 및/또는 연장된 요법을 가능하게 한다.
II.) 단독요법: 종양의 단독요법에서 BTS 및/또는 BTS(OMe)의 사용과 관련하여, BTS 및/또는 BTS(OMe)는 화학요법제 또는 제약 또는 생물학적 작용제 없이 환자에게 투여된다. 한 실시양태에서, 단독요법은 광범위한 전이성 질환을 갖는 말기 암 환자에서 임상적으로 수행된다. 프로토콜 설계는 원발성 또는 전이성 병변의 종양 질량의 감소, 무진행 생존의 증가, 전체 생존, 환자의 건강의 개선, 질환 안정화, 뿐만 아니라 표준 화학요법 및 다른 생물학적 작용제의 통상적인 용량을 감소시키는 능력을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 하기 실시예에 의해 평가된 바와 같은 유효성을 다룬다.
투여량
투여 요법은 최적의 원하는 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 BTS 및/또는 BTS(OMe) 주사가 투여될 수 있거나, 여러 분할 용량이 시간에 걸쳐 투여될 수 있거나, 또는 용량은 치료 상황의 위급성에 의해 지시되는 바와 같이 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 본원에 사용된 "투여 단위 형태"는 치료될 포유동물 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적 이산 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 요구되는 제약 담체와 함께 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 상세사항은 (a) BTS 및/또는 BTS(OMe)의 고유한 특징, 조사 메카니즘 (반응기)의 개별 역학 및 달성하고자 하는 특정한 치료 또는 예방 효과, 및 (b) 개체에서의 감수성의 치료를 위해 이러한 화합물을 배합하는 기술 분야에 내재된 제한사항에 의해 지시되고, 이에 직접적으로 의존한다.
임상 개발 계획 (CDP)
CDP는 본 개시내용의 BTS 및/또는 BTS(OMe)를 사용한 암(들) 및/또는 면역 장애의 치료를 따르고, 이를 이어서 보조 요법 또는 단독요법과 관련하여 중성자 포획 요법을 사용하여 방사선조사한다. 시험은 초기에 안전성을 입증하고, 그 후에 반복 용량에서의 효능을 확인한다. 시험은 표준 화학요법을 표준 요법 + BTS 및/또는 BTS(OMe), 이어서 붕소 중성자 포획 요법을 사용한 방사선조사와 비교하는 개방 표지이다. 인지될 바와 같이, 환자의 등록과 관련하여 이용될 수 있는 하나의 비제한적 기준은 관련 기술분야에 공지된 표준 검출 방법에 의해 결정된 바와 같은 종양에서의 BTS 및/또는 BTS(OMe)의 농도이다.
본 발명은 본 발명의 개별 측면의 단일 예시로서 의도되는 본원에 개시된 실시양태에 의해 범주가 제한되지 않으며, 기능적으로 등가인 임의의 것은 본 발명의 범주 내에 있다. 본원에 기재된 것들에 추가로, 본 발명의 모델, 방법, 및 생활 주기 방법론에 대한 다양한 변형이 상기 설명 및 교시내용으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명해질 것이고, 유사하게 본 발명의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다. 이러한 변형 또는 다른 실시양태는 본 발명의 진정한 범주 및 취지로부터 벗어나지 않으면서 실시될 수 있다.
표 I. 자연 발생 아미노산.
표 II. 약동학적 파라미터.
Claims (21)
- 하기 화학 구조를 포함하는 조성물:
여기서:
R = H, CH3, 또는 CF3이고;
X1 = H, B(OH)2, 또는 BF3 -이고;
X2 = H, B(OH)2, 또는 BF3 -이다. - 제1항에 있어서, 하기를 포함하는 조성물:
- 제1항에 있어서, 하기를 포함하는 조성물:
- 하기 단계를 포함하는, L-티로신의 목적 물질로의 전환 방법에 의해 생성된 조성물:
(i) 하기를 포함하는, 팔라듐화, 및 이어서 요구되는 보론산으로의 금속 교환을 포함하는 N-Boc-Tyr(3-Br, 4-MeO)-OMe (4)의 아릴 보론산 N-Boc-Tyr(3-B(OH)2-4-MeO)-OMe (5)로의 전환 단계:
a. 메탄올 및 디메톡시에탄을 포함하는 용매 혼합물;
b. 아세트산칼륨을 포함하는 리간드 치환기;
c. N-Boc-Tyr(3-Br, 4-MeO)-OMe (4)를 포함하는 아릴 브로마이드 유형의 시약;
d. 테트라히드록시보란을 포함하는 보론화제;
e. 클로로((트리-tert-부틸포스핀)-2-(2-아미노비페닐))팔라듐 (II)을 포함하는 팔라듐 촉매; 및
f. (i) 물로의 켄칭, (ii) 에틸 아세테이트를 포함하는 용매 교환, 및 (iii) 헥산 중 대략 25% 에틸 아세테이트를 사용한 실리카 상의 플래쉬 크로마토그래피를 포함하는 정제.
(ii) 보론산의 도입 후, 화합물 BTS (7) 및 BTS(OMe) (9)를 형성하기 위해 합성이 분기되는 단계:
(iii) 하기를 포함하는, BTS(OMe) (9)의 구조를 드러내기 위한 N-Boc-Tyr(3-B(OH)2-4-MeO)-OH (8)의 전환 단계:
a. 디옥산 중 4 M 염산을 포함하는 용액;
b. N-Boc-Tyr(3-B(OH)2, 4-OMe)-OH를 포함하는 tert부틸카르바메이트 유형의 시약; 및
c. 물 중 0% 내지 20% 범위의 아세토니트릴을 사용한 역상 크로마토그래피를 포함하는 정제.
(iv) 하기를 포함하는, 동시적인 메틸 에테르 절단 및 카르바메이트 제거, 후속적으로 이어서 비누화를 포함하는 N-Boc-Tyr(3-B(OH)2, 4-MeO)-OMe (5)의 BTS (7)로의 전환 단계:
a. 디클로로메탄을 포함하는 용액;
b. N-Boc-Tyr(3-B(OH)2, 4-MeO)-OMe (5)를 포함하는 첨가된 시약;
c. 삼브로민화붕소를 포함하는 반응물;
d. 디클로로메탄으로부터 물로의 용매 교환;
e. LiOH를 포함하는 반응물; 및
f. 물 중 0% 내지 20% 범위의 아세토니트릴을 사용한 역상 크로마토그래피를 포함하는 정제. - 제4항에 있어서, 조성물이 BTS인 방법.
- 제4항에 있어서, 조성물이 BTS(OMe)인 방법.
- 도 8에 나타낸 단계를 포함하는, 도 6에 나타낸 화합물의 정제 방법.
- 제7항에 있어서, 정제 변형이 하기 단계를 포함하는 것인 방법:
(i) 반응에서 에틸렌 글리콜을 디메톡시에탄 (DME)으로 대체하는 단계;
(ii) 감압을 통해 유기 용매를 제거한 다음, 목적 물질을 수성으로부터 에틸 아세테이트로 추출하는 단계; 및
(iii) 헥산 중 30% EtOAc에서 등용매 플래쉬 크로마토그래피로 정제하는 단계. - 도 12에 제시된 바와 같은 BBr3을 사용한 탈메틸화를 위한 절차를 포함하는 추가의 합성 변형을 포함하는, 도 9에 제시된 바와 같은 N-Boc-Tyr(3-B(OH)2), (4-OMe)-OH에서 BTS로의 합성을 포함하는 방법.
- 제9항에 있어서, BBr3을 사용한 탈메틸화가 목적 물질의 탈붕소화를 완화시키는 것인 방법.
- 제10항에 있어서, 목적 물질이 BTS인 방법.
- 제10항에 있어서, 목적 물질이 BTS(OMe)인 방법.
- 제1항의 조성물을 포함하는 키트.
- 제2항의 조성물을 포함하는 키트.
- 제3항의 조성물을 포함하는 키트.
- 제1항의 조성물을 포함하는 투여 단위 형태.
- 제2항의 조성물을 포함하는 투여 단위 형태.
- 제3항의 조성물을 포함하는 투여 단위 형태.
- 제16항에 있어서, 붕소 중성자 포획 요법 (BNCT)에 사용되는 인간 단위 형태.
- 제17항에 있어서, 붕소 중성자 포획 요법 (BNCT)에 사용되는 인간 단위 형태.
- 제18항에 있어서, 붕소 중성자 포획 요법 (BNCT)에 사용되는 인간 단위 형태.
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