KR20240040823A - 비타민 b12를 생성하는 리모시락토바실러스 퍼멘텀 pl9261과 이를 유효성분으로 함유하는 비타민 b12 결핍증 예방 및 개선용 조성물 - Google Patents
비타민 b12를 생성하는 리모시락토바실러스 퍼멘텀 pl9261과 이를 유효성분으로 함유하는 비타민 b12 결핍증 예방 및 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 또는 상기 균주의 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 비타민 B12 부족으로 인한 질병 - 혈액학적 신경학적 장애 (hematological and neurological disorders), 악성빈혈 (pernicious anemia), 말초신경염(peripheral neuritis), 빈혈(anemia), 관상동맥질환(coronary disease), 고호모시스테인혈증(hyperhomocysteinemia)과 심근경색증(myocardial infaction), 위축성 위염(atrophic gastritis), 췌장의 만성 염증(chronic inflammation of the pancreas), 위 및 /또는 소장의 부분을 제거하는 수술적 처치, 체중 감소(비만) 수술, 크론 병(Crohn's disease), 궤양성 대장염 (ulcerative colitis) 등의 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease), 셀리악병(celiac disease), 비만, 높은 체질량 지수, 또는 임신 중 태아 신경 발달 이상, 당뇨병 전 상태, 인슐린 저항성, 또는 메트포르민 복용으로 인한 비타민 B12 부족 현상의 예방 또는 개선에 효과적으로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261 (Limosilactobacillus fermentum PL9261)과 이의 새로운 용도에 관한 것으로, 상기 리모실락토바실러스 퍼멘텀 PL9261의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 또는 이들의 추출물을 포함하는 비타민 B12 결핍증의 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.
미국 국립과학원/미국의학원(National Academy of Sciences/Institute of Medicine)에 따르면, 50세 이상의 모든 사람들은 B12 (코발라민, cobalamin) 보충제를 섭취하거나 또는 B12 강화된 음식을 사용하여야 된다고 하였고, 이를 위해 메틸코발라민 (메틸화된 B12)으로 섭취하라고 권고하고 있다. 메틸코발라민 생산에는 약 30가지 효소가 관여하며 특정 세균 (Klebsiella와 Pseudomonas 속 세균과 일부 유산균)과 고균 (archaea)만이 이 비타민을 생산하며 동물 조직에 축적된다.
비타민 B12 은 미네랄을 포함하는 유일한 수용성 비타민으로 DNA와 적혈구를 만들도록 해준다. 사람은 비타민 B12가 결핍되면 혈액학적 신경학적 장애 (hematological and neurological disorders, Rannelli et al., 2014, Journal of Medical Case Reports, 8, 277), 빈혈 (anemia)및 악성빈혈 (pernicious anemia, Socha et al., 2020, Cleveland Clinic Journal of Medicine , 87, 153-164), 말초신경기능장애(peripheral neuropathy, Cuddapah et al., 2020, Practical Neurology, 64-67), 관상동맥질환(coronary artery disease, Kumar et al., 2009, Clin Chem Lab Med 47, 334-338), 고호모시스테인혈증(hyperhomocysteinemia, Lee et al., 2017, J Korean Neurol Assoc 35, 261-263) 과 심근경색증(myocardial infarction, Umarje et al., 2016, Asian J Pharm Clin Res, 9, 2-4) 이 일어날 수 있다.
비타민 B12는 사람의 체내에서 합성하지 못하지만 필수적인 영양성분이며, 간에 5년간 저장되지만 지속적으로 섭취하지 않게 되면 고갈되게 된다. 특히 위염 (Dholakia et al., 2005, World J Gastroenterol., 11, 7078-7083), 악성빈혈 (Kim et al., 2011, Infect Chemother, 43, 266-269), 크론병 (Battat et al., 2014, Inflammatory Bowel Diseases, 20, 1120-1128.), 셀리악병 (Shyama and Kumar N, 2018, Gen Med (Los Angeles), an open access journal Volume 6 Issue 2 317), 기생충 등으로 소장의 상태가 안 좋을 때 (Cordingley and Crawford, 1986, Aust N Z J Med. 16, 78-79.), 알코올 중독으로 영양분 섭취가 안될 때 (Fragasso et al., 2010, Eur J Intern Med. 21, 97-100.), 그레이브스 병 (Rodriguez et al., 2020, AACE Clin Case Rep. 6, e282-e285.), 루푸스 같은 면역 질환 (Segal et al., 2004, Rheumatol Int. 24, 14-19), 위산제거제 복용 (Jung et al., 2015, Intern Med J. 45, 409-416), 당뇨약인 메트포르민 복용시 (Kim et al., 2019, Medicine 98:46(e17918).) 비타민 B12가 결핍되게 된다.
인도에서는 채식주의나 고기 부족 때문에 비타민 B12의 결핍이 자주 발생한다. 따라서 동물 관련 음식을 적게 섭취하는 극채식주의자들과 위장장애를 가진 노인들에게 비타민 B12의 결핍은 대단히 위험하며 반드시 육류식품과 보충제를 주기적으로 섭취해야 한다. (Watanabe et al., 2014, Nutrients 6, 1861-1873). 최근에는 비타민 B12 강화식품과 건강보조식품이 이런 결핍을 막기 위한 좋은 대안으로 생각되고 있다. 그러나 대부분의 보충제는 화학합성으로 생산되고 예상치 못한 부작용 (side effects)을 일으킬 수가 있다 (Advait Vasavada; Devang Sanghavi, 2022, In: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2022 Jan.2022 Mar 19).
자연에 존재하는 인체에 가장 효과적인 활성 형태는 메틸코발라민 (methylcobalamin)이다. 현재 상업용으로 가장 많이 사용되는 비타민 B12는 합성물질인 시아노코발라민 (cyanocobalamin)으로, 미생물 발효로 생산된 메틸코발라민 (methylcobalamin), 하이드로소 코발라민 (hydroxocobalamin)과 아데노실코발라민 (adenosylcobalamin)에 아질산나트륨 (sodium nitrite)과 열을 가하면서 칼륨시아나이드를 추가하여 만든다.
많은 회사들이 시아노코발라민을 가장 많이 사용하는 이유는 가격이 메틸코발라민에 비해 매우 저렴하기 때문이다. 하지만 시아노코발라민의 가벼운 부작용으로는 설사와 가려움증이 있고, 심각할 경우 과민증, 저칼륨증, 심정지도 올 수 있다 (2017: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28816120). 또한 신장 기능 저하를 가속화시키고 신장 기능이 손상된 환자의 심혈관계 위험을 증가시킬 수 있다 (2017: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28816120).
따라서 비타민 B12를 생산하는 미생물을 복용하는 것이 경제적이며 부작용을 일으키지 않는 확실하고 안전한 방법이다. 나아가서 비타민 B12 생산하는 프로바이오틱을 섭취하게 되면 몸 안에 일정하게 비타민 B12 농도를 유지하게 될 것이다.
비타민은 유기화학합성을 통해 생산되어 왔으나, 이는 고가의 장비와 환경에 유해한 용매를 이용한 화학 반응이 요구된다. 이런 문제점을 극복하기 위해 최근 생물학적 공정으로 비타민을 생산하는 방법이 개발되고 있다. 특히 미생물의 빠른 성장, 기후에 영향을 받지 않고, 생산 시설 확충의 용이성 등으로 인해 미생물을 이용한 비타민의 생산이 주목받고 있다.
미생물을 이용한 비타민 생산방법에 관한 선행기술로는, 한국공개특허 제10-2018-0113535호 "비타민B12 결핍을 예방 및/또는 치료를 위한 조성물 및 방법"에 슈두비타민 B12 생산 세균(인테스티니모나스 뷰티릭시프로두센스(Intestinimonas butyriciproducens) 및/또는 유박테리움 할리(Eubacterium hallii))의 비타민 B12 결핍 치료 및 예방 용도가 개시되어 있고, 한국공개특허 제10-2022-0059972호 "비타민K2를 함유하는 유산균 발효물, 및 이를 포함하는 염증 예방 또는 치료용 조성물"에 유산균주인 락토바실러스 플란터룸 (Lactobacillus plantarum), 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactics) 및 류코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides)의 비타민 K 생산 용도가 개시되어 있다.
본 발명자들은 경제적이며 부작용을 일으키지 않는 비타민 B12 섭취 방법을 개발하기 위하여, 비타민 B12를 생산하는 미생물을 탐색하였고, 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261 (기탁번호 KCTC15035BP)이 장 부착력이 뛰어나고, 내산 내담즙성이 우수하여 장내에서 안정적이며, 항생제 내성이 없고, 유해 효소나 유해 생산물이 없고, 용혈 현상이 없어 프로바이오틱으로 적합함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 비타민 B12를 생산하는 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261 (기탁번호 KCTC 15035BP) 균주 및 이를 포함하는 비타민 B12 결핍에 의한 각종 질병의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 수탁번호 KCTC15035BP의 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261(Limosilactobacillus fermentum PL9261) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물, 또는 이들의 추출물을 유효성분으로 함유하는 비타민 B12 부족으로 발생하는 질병의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물, 또는 이들의 추출물을 유효성분으로 함유하는 비타민 B12 부족으로 발생하는 질병의 예방 또는 개선용 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261 (기탁번호 KCTC 15035BP)는 장 부착력이 뛰어나고, 내산 내담즙성이 우수하여 장내에서 안정적이며, 항생제 내성이 없고, 유해 효소나 유해 생산물이 없고, 용혈 현상이 없어 프로바이오틱으로 적합하며, 비타민 B12 (코발라민) 생산 능력이 뛰어나 비타민 B12 결핍증의 예방, 개선을 위한 프로바이오틱 및 포스트바이오틱 소재로 유용하게 활용될 수 있다. 또한 상기 균주의 배양물에는 다량의 비타민 B12 (코발라민) 자체를 함유하여 비타민 B12 (코발라민) 결핍 예방 및 개선에 활용될 수 있다.
도 1은 Cup assay를 이용한 비타민 B12 정성적 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 HPLC를 이용한 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261의 비타민B12 생산능을 나타낸 도이다.
도 3은 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261의 용혈 검사 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261의 식중독균 억제능을 나타낸 도인다.
도 5는 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261의 Bile acid deconjugation 활성 여부를 나타낸 도이다.
도 6은 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261의 장 부착능을 나타낸 도이다.
도 7은 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261 (기탁번호 KCTC15035BP)의 16S rRNA 염기서열을 나타낸 도이다.
도 2는 HPLC를 이용한 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261의 비타민B12 생산능을 나타낸 도이다.
도 3은 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261의 용혈 검사 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261의 식중독균 억제능을 나타낸 도인다.
도 5는 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261의 Bile acid deconjugation 활성 여부를 나타낸 도이다.
도 6은 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261의 장 부착능을 나타낸 도이다.
도 7은 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261 (기탁번호 KCTC15035BP)의 16S rRNA 염기서열을 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 수탁번호 KCTC15035BP의 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261(Limosilactobacillus fermentum PL9261)균주를 제공한다.
상기 균주는 서열번호 1로 기재되는 16S rRNA 염기서열을 갖는다.
본 발명은 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물, 또는 이들의 추출물을 유효성분으로 함유하는 비타민 B12 부족으로 발생하는 질병의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261은 비타민 B12을 생산하는 유산균이다.
유산균은 건강한 사람의 장내 미생물 생태계에 존재하며, 장내 상피내포에 정착하여 정상적인 장관 내 미생물 균총 유지, 유당불내증의 완화, 혈중 콜레스테롤의 감소, 항암작용, 면역조절작용 및 식품의 영양학적 가치 증진 등의 유익한 효과를 나타내는 것으로 알려져 있으며, 이러한 유익한 기능을 하는 살아 있는 유산균을 프로바이오틱스(probiotics)라 분류하고 있다.
프로바이오틱스(probiotics)란 건강에 이로운 작용을 하는 균을 말하며, 유산균(Lactobacillus), 비피더스균(Bifidobacterium), 엔테로코쿠스(Enterococcus) 등이 대표적인 균주로 장 건강과 면역체계 강화 등에 효능을 보이는 균이다. 흔히 먹는 요구르트, 치즈 등 발효유 제품과 김치, 된장 등 발효식품에 들어있으며 최근에는 캡슐이나 분말 형태의 건강기능식품으로도 많이 섭취하고 있다.
포스트바이오틱스(postbiotics)란 프로바이오틱스 사균체 혹은 이의 대사 물질 등을 포함하는 의미의 용어이다. 대표적으로는 유산균이 만드는 유기산, 박테리오신, 부티레이트, 효소, 아미노산, 펩타이드 등이 있다. 포스트바이오틱스도 유해균을 직접 사멸하고 장 점막 면역을 활성화하며, 장 점막에 부착해 유해균으로부터 장을 보호하는 역할을 할 수 있다고 알려져 있다.
본 발명의 조성물은 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261 균주 1 x 106 내지 1 x 1012 CFU를 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261은 항생제 내성을 나타내지 않는다.
유산균은 항생제 내성의 유전자의 저장고로 작용하여 인체의 마이크로바이옴에 내성유전자가 전달되게 되고, 이런 인체 세균에 의한 질병 발발 시 항생제치료가 불가능해지기 때문에 (Chon et al., 2020, Korean Society of Dairy Science and Biotechnology, 38, 70-88) 항생제 내성이 없는 유산균을 사용하는 것이 필수적이다. 따라서 식약처의 프로바이오틱 가이드라인 (건강기능식품 기능성 원료 프로바이오틱스 안전성 평가 가이드(민원인 안내서, 안내서-1124-01), 2021. 7)에도 반드시 항생제내성 검사를 수행하여 감수성인 것만 프로바이오틱으로 사용허가를 하도록 되어 있다.
유럽식품안전청(EFSA)의 지침은 미생물의 항생제 내성 평가를 위해 우선적으로 10종의 항생제(ampicillin, vancomycin, gentamycin, kanamycin, streptomycin, erythromycin, clindamycin, tylosin, tetracycline, chloramphenicol) 에 대해 항생제 최소 억제농도 검사법(minimum inhibitory concentration test, MIC test)을 실시하도록 규정 하고 있다.
본 발명의 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261은 내산 내담즙성이 우수한 유산균이다.
유산균이 프로바이오틱스로서 유용한 기능을 나타내기 위해서는 섭취한 많은 수의 균이 인체 내 소화기환을 통하여 장내에 점착하여야 하므로 유산균은 사람 장관의 위산과 담즙산에 대한 안정성을 기본적으로 보유해야 한다. 이러한 이유로 유용한 프로바이오틱스 유산균주를 선발하기 위해서는 내산성 및 내담즙성에 대한 확인이 반드시 필요하다.
본 발명의 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261은 용혈 현상이 없는 유산균이다.
용혈성은 적혈구가 파괴되며 발생하는 정상적인 작용과 유전적 결함, 화학물질, 미생물에 의해 생성되는 독성 물질에 의해 형성되는 비정상적 작용으로 나뉘며, 생체 내 용혈현상은 주로 비장, 간장, 골세포 등에서 발생하며 비정상적 용혈 현상이 발생할 경우 적혈구의 산소운반 기능 장애로 인해 생체 내에 치명적인 결과를 가져온다.
본 발명의 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261은 D- lactate를 생성하지 않는 유산균이다.
Lactate는 L형과 D형의 두 광학이성질체가 존재한다. 인체에는 L형에 대해 특이적인 L- lactate dehydrogenase(LDH) 만이 존재하기 때문에 인간의 대사물은 L- lactate이다. 주로 세균들에 존재하는 D- LDH나 D, L- racemase에 의해 분해 생성되는 D- lactate는 하등동물의 대사물로서 인체 내에서는 거의 측정할 수 없거나 극히 소량만이 존재한다. 혈액 내 D- lactate의 상승은 장관의 해부학적 또는 기능적인 이상, 장내 D- lactate 생성 세균의 증식 및 주 대사 장기인 간과 신장의 기능 장애와 관련되어 나타난다.
본 발명의 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261은 장에 부착하여 지속적으로 비타민 B12를 생성할 수 있다.
장세포 부착능은 위산과 담즙을 통과하여 최종 목적 부위인 장에 부착하여 효능을 발휘하기 위해 갖추어야 할 프로바이오틱스의 중요한 요소 중 하나이다. 따라서 우수한 세포 부착율을 갖고 있는 프로바이오틱스는 장내 환경 개선 효과가 더 우수하다.
본 발명의 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261은 식중독 균을 억제할 수 있다.
상기 식중독 균은 엔테로코커스 피칼리스 (Enterococcus faecalis) CCARM 0011, 대장균 (Escherichia coli) O157:H7 ATCC 43894, 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) CCARM 0045, 살모넬라 티피미리움 (Salmonella typhimurium) CCARM 8001, CCARM 8100 를 포함할 수 있다.
본 발명의 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261은 담즙산(bile acid) deconjugation 활성을 나타내지 않는다.
담즙산은 소장에서 taurine 또는 glycine과 결합되어 포합담즙산(conjugated bile acid)으로 존재하는데 지질 용해도가 높아 소장에서 콜레스테롤의 흡수를 용이하게 한다. 그러나 유산균의 담즙산 분해효소에 의해 담즙산의 탈포합이 진행되면 담즙산은 유실되고, 새로운 담즙산을 합성하기 위한 전구물질로 콜레스테롤을 소모시켜 혈중 콜레스테롤을 낮추게 된다.
상기와 같이, 본 발명의 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261은 비타민 B12를 생성하는 안전한 프로바이오틱이다.
비타민 B12는 적혈구와 DNA 합성에 필요한 수용성 비타민이며, 뇌와 신경 세포 작용과 발달에 관여하는 주요인자이다. 비타민 B12가 결핍되면 거대적혈구모 빈혈 (megaloblastic anemia), 악성 빈혈, 피로, 신경 손상으로 손과 다리가 간지러우며 무감각해짐, 기억력감소, 혼돈, 치매, 우울증, 발작 등이 나타난다. 이런 증상들은 음식물로부터 비타민 B12 섭취가 적거나 위궤양 등으로 비타민 B12 흡수가 낮아질 때 발생한다.
상기 비타민 B12 부족으로 발생하는 질병은 혈액학적 신경학적 장애 (hematological and neurological disorders), 악성빈혈 (pernicious anemia), 말초신경염(peripheral neuritis), 빈혈(anemia), 관상동맥질환(coronary disease), 고호모시스테인혈증(hyperhomocysteinemia)과 심근경색증(myocardial infaction), 위축성 위염(atrophic gastritis), 췌장의 만성 염증(chronic inflammation of the pancreas), 위 및 /또는 소장의 부분을 제거하는 수술적 처치, 체중 감소(비만) 수술, 크론 병(Crohn's disease), 궤양성 대장염 (ulcerative colitis) 등의 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease), 셀리악병(celiac disease), 비만, 높은 체질량 지수, 임신 중 태아 신경 발달 이상, 당뇨병 전 상태, 인슐린 저항성, 또는 메트포르민 복용으로 인한 비타민 B12 부족 현상으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
비타민 B12의 체내농도를 높이기 위해서는 보충제를 먹는 것이 가장 좋은 방법이다. 특히 비타민 B12의 체내 농도를 일정하게 유지하기 위해서는 제일 좋은 방법은 비타민 B12를 생성하는 프로바이오틱을 섭취하는 것이다.
본 발명의 균주의 배양물 또는 배양액은 본 발명의 신규 균주를 공지의 액체 배지에서 배양시켜 수득한 사물을 의미하며, 본 발명에서는 신규한 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261 균주를 포함하는 개념이다.
본 발명의 균주의 파쇄물은 균주 자체를 화학적 또는 물리적 힘에 의해 파쇄하여 얻은 산물일 수 있다.
본 발명의 균주의 배양물의 추출물은 균주 자체, 균주의 파쇄물, 균주의 배양물 또는 이들의 혼합물을 추출 방법, 추출 용매, 추출된 성분 또는 추출물의 형태를 불문하고 추출하여 얻어진 산물을 의미할 수 있으며, 추출 후 분획, 농축 등의 다른 방법으로 가공 또는 처리하여 얻어질 수 있는 물질을 모두 포함하는 광범위한 개념이다.
본 발명의 용어 "유효성분으로 함유하는"은 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261 균주의 균체, 배양물, 파쇄물 또는 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 조성물은 투여를 위하여 조성물 총 중량에 대하여 본 발명의 추출물을 0.1 내지 99.9 중량%를 유효성분으로 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "건강기능식품" 이란, 일상 식사에서 결핍되기 쉬운 영양소나 또는 인체에 유용한 기능을 가진 원료나 성분 (기능성 원료)을 사용하여 제조하는 것으로, 인체의 정상적인 기능을 유지하거나 생리 기능 활성화를 통하여 건강을 유지하고 개선하는 식품을 의미하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 건강기능식품은 당업계에 공지된 다양한 제조방법에 따라 적절한 유효 농도 범위에서 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물, 또는 상기 균주의 추출물을 첨가하여 제조 가능하다.
본 발명의 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 비타민 B12 부족으로 발생하는 질병의 예방 또는 개선 효능을 가지므로비타민 B12 부족으로 발생하는 질병의 예방 또는 개선을 목적으로 하는 개체에게 꾸준히 섭취하게 함으로써 상기 비타민 B12 부족으로 발생하는 질병을 예방할 수 있고, 이미 발생한 비타민 B12 부족으로 발생하는 질병을 개선시킬 수 있다.
상기 건강기능식품은 비타민 B12 부족으로 발생하는 질병의 예방 또는 개선을 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 개체에도 적용 가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비 인간동물, 조류, 또는 어류 등 어떠한 개체에도 적용 가능하다.
본 발명은 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물, 또는 이들의 추출물을 유효성분으로 함유하는 비타민 B12 부족으로 발생하는 질병의 예방 또는 개선용 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 용어 "사료 첨가제"란 영양소 보충 및 체중감소 예방, 사료내 섬유소의 소화 이용성 증진, 유질 개선, 번식장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 목적으로 사료에 첨가하는 물질을 의미한다.
본 발명의 사료첨가제는 비타민 B12 부족으로 발생하는 질병의 예방 또는 개선 효능을 가지므로 가금류, 가축 등에게 꾸준히 섭취하게 함으로써 상기 비타민 B12 부족으로 발생하는 질병을 예방할 수 있고, 이미 발생한 비타민 B12 부족으로 발생하는 질병을 개선시킬 수 있다.
상기 사료 첨가제를 공급하는 경우, 가금류 및 가축 등에 대하여 단독으로 공급하거나 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.
또한, 본 발명의 사료 첨가제는 당업계에 공지된 다양한 사료 제조방법에 따라 적절한 유효 농도 범위에서 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물, 또는 상기 균주의 추출물을 첨가하여 제조 가능하다.
상기 첨가제는 비타민 B12 부족으로 발생하는 질병의 예방 또는 개선을 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 개체에도 적용 가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비 인간동물, 조류, 또는 어류 등 어떠한 개체에도 적용 가능하다.
본 발명은 수탁번호 KCTC15035BP의 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261(Limosilactobacillus fermentum PL9261) 균주를 이용한 비타민 B12의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 비타민 B12의 제조방법은
1) 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261(Limosilactobacillus fermentum PL9261) 균주를 Modified MRS broth 배지에 접종하고 배양하여 배양액을 얻는 단계;
2) 상기 단계 1)의 배양액을 원심분리하여 침전물을 얻는 단계;
3) 상기 단계 2)의 침전물에 추출용액을 첨가하고 4°C에서 12 내지 24 시간 방치한 후 원심분리하여 상등액을 취하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 상등액으로부터 크로마토그래피(Chromatography)를 이용하여 비타민 B12를 분리하는 단계; 를 포함한다.
상기 단계 1)의 유산균은 비타민 B12 free assay broth에 3회 계대 배양 한 것일 수 있다.
상기 단계 1)의 Modified MRS broth 배지는 MRS, 3 g CaCO3, 100 mg CoCl26H2O, 100mg DMB(α-(5,6-dimethylbenzimidazoly)-cobamidcyanide), 5 g glycerol/L을 포함하는 것일 수 있다.
상기 단계 1)의 Modified MRS broth 배지는 pH 6 내지 7일 수 있고, 바람직하게는 pH 6.5일 수 있다.
상기 단계 1)에서 상기 Modified MRS broth 배지 1.8L에 상기 유산균을 0.1 내지 3% (v/v) 접종할 수 있고, 0.5 내지 2% (v/v) 접종할 수 있고, 바람직하게는 1% (v/v) 접종할 수 있다.
상기 단계 1)에서 배지에 유산균을 접종한 후 12 내지 36시간 정치배양할 수 있고, 18 내지 30 시간 정치배양할 수 있으며, 바람직하게는 24시간 정치배양할 수 있다.
상기 단계 2)에서 상기 배양액을 원심분리기를 이용하여 8,000 rpm에서 15분간 원심분리할 수 있다.
상기 단계 2)에서 침전물을 얻은 후, 상기 침전물을 인산완충용액으로 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 단계 3)의 추출용액은 비타민 B12를 추출하기 위한 용액으로, 0.1 M Na2HPO4, pH 4.5 with 0.005% KCN을 포함할 수 있다.
상기 단계 3)에서 침전물에 추출용액을 첨가하고 4°C에서 12 내지 24 시간 방치 후, 121℃에서 15분 동안 고압살균하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 단계 3)의 원심분리는 8,000 rpm에서 15분간 원심분리할 수 있다.
상기 단계 3)에서 원심분리 후 0.2 mm 필터를 이용하여 여과하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 단계 4)에서 크로마토그래피(Chromatography)는 칼럼 크로마토그래피(Column chromatography) 일 수 있다.
본 발명의 용어 "크로마토그래피(Column chromatography)"는 혼합물을 분리하는 실험적인 기법 중 하나로, 혼합물을 구성하고 있는 매우 유사한 성분들을 분리할 수 있는 분리법이다. 시료는 이동상에 의해 이동하는데, 이런 이동상은 관 속에 또는 고체 판 위에 고정되어 있는 용해되지 않는 정지상을 통해 지나간다. 두 상은 시료성분들이 이동상과 정지상 사이에서 분배 정도가 달라지도록 선택한다. 시료 성분 중에 정지상에 세게 붙잡히는 성분은 이동상의 흐름에 따라 천천히 움직이는 한편 정지상에 약하게 붙잡히는 성분은 빠르게 운반된다. 이동 속도의 이러한 차이 때문에 시료성분들은 정성적으로, 정량적으로 분석할 수 있는 불연속적인 띠로 분리된다.
상기 칼럼 크로마토그래피는 이동상의 종류에 따라 가스크로마토그래피(Gas chromatography, GC)와 액체크로마토그래피(Liquid chromatography, LC)로 나뉜다.
본 발명의 칼럼 크로마토그래피는 고속액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
HPLC는 액체크로마토그래피 중 가장 많이 쓰이는 분석장비로, 모세관크로마토그래피를 고성능 장치화한 것이다. HPLC 칼럼을 이용하면 해상도가 높아지고 분석 시간이 짧아지며 재현성이 좋아지는 장점이 있고, 아미노산(Amino acids), 비타민(vitamin), 핵산(nucleic acid) 구성요소 등이 측정 가능하다.
구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 비타민 B12 생산 유산균을 선발하기 위하여, 비타민 B12 생산량을 측정하고 (도 1), HPLC를 이용하여 비타민 B12 생산을 확인함으로써 (도 2) 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261을 비타민 B12 생산 유산균로 선발하였다. 또한, 항생제 내성 테스트를 통해 상기 균주가 항생제 내성이 없음을 확인하였고, 산성에서 24시간 처리에도 생존성을 보여 내산성이 강하고, 정상인의 소장의 담즙 농도인 0.06%보다 농도가 훨씬 높은 0.250%의 담즙에서도 생존성을 보여 내담즙성이 매우 강한 특성이 있음을 확인하였다. 또한, 용혈 현상이 없고 (도 3), D-lactate 를 생성하지 않음을 확인함으로써 안전성을 입증하였다. 아울러 여러가지 장 유해균의 억제 능력이 우수하며 (도 4), bile salt deconjugation이 없고 (도 5), 장 부착 능력이 매우 우수한 특성이 있으며 (도 6), 젤라틴 분해효소가 없으며 암모니아 및 인돌을 생성하지 않아 유해 물질을 생산하지 않음을 확인함으로써, 본 발명의 균주를 비타민 B12를 생성하는 안전한 프로바이오틱으로 이용할 수 있음을 확인하였다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 비타민 B12 생산 유산균주의 선발
1) 감수성 유산균의 선발
확보된 유산균 중 아가 희석법 CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute. 2018. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; M07, Eleventh ed. CLSI, Wayne, PA.) 방법으로 MIC (Minimal Inhibitory Concentration) 를 측정하고, EFSA(European Food Safety Authority, EFSA. 2018 EFSA Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP). Guidance on the characterization of microorganisms used as feed additives or as production organisms. EFSA Journal 16: 1-24)의 cut-off value 이하인 경우 감수성으로 판단하여 선발하였다.
아가 희석법으로 측정된 MIC 값을 재확인하기 위하여 ISO (International Organization for Standardization )의 액체희석법 (ISO 19032. 2010. Milk and milk products-determination of the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobials applicable to bifidobacteria and non-enterococcal lactic acid bacteria (LAB))를 이용하여 9가지 항생제에 대한 최소억제농도 (MIC) 측정을 실시하였다. 내성여부는 37℃, 혐기 조건에서 48시간 배양 후 EFSA의 cut-off 값에 따라 결정하였다. 이때 락티카제이바실러스 파라카제이 ATCC 334 (Lacticaseibacillus paracasei ATCC 334) 를 QC(quality control)균주로 사용하였다.
9가지 항생제에 대한 검사를 액체희석법를 사용하여 검사한 결과 내재 내성 (intrinsic resistance)인 밴코마이신을 제외한 모든 항생제에 대한 내성이 없음을 확인하였다.
리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261 항생제 내성 검사 결과는 표 1에 나타내었다.
| GEN | KAN | STR | TET | ERY | CLI | CHL | AMP | VAN | |
| L. fermentum PL9261 | 2 | 64 | 32 | 8 | 0.5 | ≤0.032 | 4 | 0.5 | >128 |
| EFSA cut-off value | 16 | 64 | 64 | 8 | 1 | 4 | 4 | 2 | n.r. |
(GEN, gentamicin; KAN, kanamycin; STR, streptomycin; TET, tetracycline; ERY, erythromycin; CLI, clindamycin, CHL, chloramphenicol; AMP, ampicillin; VAN, vancomycin)
2) 미생물검사법을 이용한 비타민 B12 생산 유산균주의 선발
감수성 유산균 균주 중에서 비타민 B12를 생산하는 유산균을 선발하기 위해 positive control인 Limosilactobacillus reuteri KCTC 3594를 포함하여 BPB-MRS 고체배지에서 37℃, anaerobic 상태에서 48시간 배양하였다. 이를 MRS 액체배지에 접종하여 37℃에서 24시간 정치 배양하였다. 11,000 x g, 4℃에서 10분 간 원심 분리한 침전물을 멸균 인산완충용액으로 2회 세척하고 인산완충용액에 다시 현탁하여 600 nm에서 흡광도가 1이 되도록 하였다. 비타민 B12 free 배지에 위의 유산균을 1% (v/v) 접종하였다. 흡광도 값이 높은 균주를 이차검색 대상으로 선발하였다. Negative control로는 L. plantarum ATCC 8014를 사용하였다.
3) 배양액 준비와 세포 추출물 준비
상기에서 선발된 균주를 BPB(0.002%)-MRS 고체배지에 접종하고 37℃, 혐기조건에서 48시간 배양하였다. 이를 비타민 B12 free assay broth에 3회 계대 배양 한 유산균을 Modified MRS broth (MRS + 3 g CaCO3, 100 mg CoCl2·6H2O, 100mg DMB(α-(5,6-dimethylbenzimidazoly)-cobamidcyanide), 5 g glycerol/L, pH 6.5) 1.8 L에 유산균을 1% (v/v)접종하고 24시간 정치 배양하였다. 배양액을 8,000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 침전을 얻고 인산완충용액으로 2회 세척하였다. 각각의 유산균 침전물의 무게 (wet weight)를 동일하게 맞추고, 10 ml의 추출용액 (0.1 M Na2HPO4, pH 4.5 with 0.005% KCN)으로 현탁액을 만들어 냉장에서 하룻밤 방치하였다. 121℃, 15분 동안 고압 멸균 후 8,000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 상등액을 취하였다. 이를 0.2 mm filter로 여과하여 다음 실험 전까지 빛을 차단하기 위해 알루미늄 호일로 싸서 냉동 보관하였다.
<실험예 1> 미생물을 이용한 비타민 B12 생산 확인 및 정량 (microbiological assay)
B12 생성 측정에 사용하는 테스트 유산균은 B12를 생성하지 못하여 B12를 외부에서 첨가해야 자랄 수 있는 세균으로 Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis. (B12 auxotroph, ATCC 7830)을 Lactobacilli MRS Broth (Difco)에 접종하여 37℃에서 24간 배양하였다. 이를 원심분리하여 세균을 침전시키고 멸균 생리식염수로 3회 세척하였다. 세균 침전물을 O.D. (600 nm) 를 1이 되도록 테스트 유산균을 현탁하여 준비하였다. 1에서 준비한 유산균 추출물과 멸균 증류수를 혼합하여 시험관에 4 ml, VB12 free broth 4ml을 넣고 뚜껑을 닫고 121℃에서 15분간 멸균한다. 멸균 후 배지를 식히고, 모든 시험관에 위에서 준비한 테스트 균액을 20 ul를 접종하였다. 이때 standard로는 0~200 pg/ml cyanocobalamin (Sigma)을 사용하였다. 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261 (L. fermentum PL9261) 균주는 144.5 pg/ml의 VB12를 생산함을 확인하였다.
B12 auxotroph의 성장으로 확인한 비타민 B12 생산 결과는 표 2에 기재하였다.
| absorbance at 600nm | pg/ml | |
| L. plantarum ATCC 8014 (negative control) | 0.332 | 18.4 |
| L. fermentum PL9261 | 2.312 | 144.5 |
<실험예 2> Cup assay를 이용한 비타민 B12 생산 확인
B12 영양요구형 (Auxotroph) 균주인 L. delbrueckii subsp. lactis. (B12 auxotroph, ATCC 7830)를 Lactobacilli MRS Broth (Difco)에 3회 계대 배양하여 사용하였다. 비타민 B12 free assay 배지에 1.5% agar를 첨가하여 pH 6.0을 맞추고 멸균하여 배지온도를 50℃로 식힌 후에 테스트유산균 (O.D. at 600=1.4) 를 100 ml당 1 ml을 넣고 잘 섞어주면서 배양접시에 부었다. 배지가 굳으면 멸균된 일회용 팁으로 well을 만들었다. Well에 준비된 sample과 비타민 B12 standard를 100 ul씩 첨가하여 gas pack을 넣은 배양용기에 넣어 37℃에서 배양하였다. 48시간 후 테스트유산균의 성장환의 사이즈와 탁도를 확인하여 비타민 B12의 생산을 확인할 수 있었다 (도 1). 이때 positive control로 Limosilactobacillus reuteri(KCTC 3594)을 사용하였다.
<실험예 3> HPLC를 이용한 비타민 B12 detection 생산 확인
실험예 1 및 2에서 선발된 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261과 positive 균주인 Limosilactobacillus reuteri KCTC 3594를 각각 MRS에 배양하여 위와 같은 방법으로 세균 추출물을 준비하였다. Vacuum manifold에 장착된 IAC (Immune Affinity Column, Eurofin IAC Vitamin B12, Eurofin Technologies, Hungary) 컬럼의 완충액을 제거한 후 HPLC water로 컬럼을 활성화시켰다. 추출물에 인산완충용액 (pH 7.4)을 첨가하여 20 ml로 희석하여 컬럼에 주입하여 optimal flow rate (3 ml/min)으로 통과시키고 컬럼을 5 ml 인산완충용액으로 세척하였다. 다음 HPLC grade methanol로 비타민 B12를 용출하였다. 메탄올추출액을 질소농축기를 이용하여 60도에서 전량 휘발시켰다. HPLC분석은 한국 SGS에 의뢰하여 진행하였다. 전량 휘발된 건조물에 5 mM KH2PO4 용액 2 ml을 첨가하여 분석하였고 이때 비타민 B12 HPLC-UV switching기법을 사용하였다.
HPLC를 이용한 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261가 생산한 비타민B12 확인 결과는 도 2에 나타내었다.
<실험예 4> 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261의
내산 내담즙 확인
리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261의 내산성 및 내담즙성을 다음과 같이 측정하였다. 내산성 실험은 소화관 조건과 유사한 환경에서 측정하기 위하여 pH 3.0 배지에 1,000 U/㎖의 펩신을 첨가한 인공 위액에서 실시하였다. 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261을 MRS 액체 배지에서 24시간 배양한 후 원심분리하여 세포를 회수하고 멸균 생리 식염수로 3회 세척하였다. 10 ml의 인공 위액을 첨가하여 유산균 배양 조건과 같은 조건에서 90 분 동안 반응시킨 후 연속 희석하여 MRS 고체배지에 도말하고 배양하여 생균수를 계수하여 내산성 정도를 측정하였다. 또한, 내담즙성 실험은 인공 위액 조건에서 90 분 동안 처리된 각 유산균 배양액을 사용하여 pH 7.0 배지에 0.3% 담즙 (돼지 담즙 추출액, Sigma) 및 1,000 U/㎖ 트립신이 첨가된 인공담즙액에서 실시하였다. 인공 위액 처리된 배양액을 원심분리 후 상등액과 동일한 양의 인공 담즙액을 첨가하여 90 분간 더 반응시킨 후 연속 희석하여 MRS 고체배지에 도말하고 생균수 (CFU)를 계수하여 내담즙성 정도를 측정하였다.
내산성 및 내담즙성을 분석한 결과, 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261은 산과 담즙에 내성이 있다는 것을 확인하였다.
리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261의 내산 내담즙 검사결과는 표 3에 나타내었다.
| MRS | Gastric juice | Bile acid | |||
| 0 min | 90 min | 180 min | 90 min | 90 min | |
| L. fermentum PL9261 | 1.28 x 109 | 5.40 x 108 | 9.60 x 109 | 4.80 x 108 | 1.20 x 109 |
<실험예 5> 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261의 용혈 현상 여부 확인
미생물에 의해 적혈구가 파괴되어 나타나는 용혈 현상을 확인하기 위한 실험을 실시하였다. Sheep blood agar 배지에 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261을 도말하여, 37℃에서 48시간 동안 배양한 후 용혈현상을 관찰하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 PL9261 용혈현상을 나타내지 않는 안전한 균주임을 확인하였다.
<실험예 6> 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261의 D-lactate 생성 여부 실험
프로바이오틱스 안전성 평가 항목 중 하나인 D-lactate production은 ABcam사의 키트를 (ab83429) 사용하여 실험하였다. 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261을 BPB-MRS 고체배지에서 37℃, anaerobic 상태에서 48시간 배양하였다. Cell pellet을 3회 세척하고 600 nm에서 OD 1로 맞추고 100 ul를 10 ml의 MRS broth에 접종하여 37℃에서 24시간 정치 배양하였다. 13,000rpm, 4℃에서 10분 간 원심 분리하여 상등액을 취하여 매뉴얼에 따라 실험을 진행하여 D-lactate 양을 계산하였다.
혈장에서의 D-lactate 정상 상한치는 5 mmol/L (450.4 mg/L)이며, 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261 배양액의 D- lactate의 양은 61.1 mg/L 으로, 상기 결과는 인체에는 영향이 없음을 의미한다.
<실험예 7> 식중독균 억제 검사
리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261의 식중독균 억제능을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261를 MRS 액체배지에서 하루밤 배양 후 원심 분리하여 상등액을 준비하였다. 식중독균으로는 엔테로코커스 피칼리스 (Enterococcus faecalis) CCARM 0011, 대장균 (Escherichia coli) O157:H7 ATCC 43894, 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) CCARM 0045, 살모넬라 티피미리움 (Salmonella typhimurium) CCARM 8001, CCARM 8100을 사용하였다. 하룻밤 자란 식중독균을 McFaland standard 0.5로 탁도를 맞춘 뒤 멸균 면봉으로 고체 배지에 접종하고 구멍을 만들어 유산균 배양 상등액 200 ul를 떨어뜨려 하룻밤 배양 후 억제환의 유무와 크기를 확인하였다. 이때 negative control로 MRS broth를 사용하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261는 엔테로코커스 피칼리스 균주를 제외한 나머지 네 균주에 억제력을 보였다.
<실험예 8> 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261의 bile acid deconjugation 활성 평가
리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261을 0.5%의 taurodeoxycholic acid (TDCA, Sigma)가 첨가된 MRS 고체배지에 접종하여 혐기 조건에서 37℃에서 2일간 배양하였다. BSH activity가 있는 균주의 경우 (양성의 경우) 불투명한 하얀색 콜로니가 생기거나 콜로니 주변의 배지가 탁해진다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261은 음성으로 판명되었다.
<실험예 9> 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261의 장세포 부착능
리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261의 장세포 부착능을 확인하기 위해 HT-29 세포 (human cololectal adenocarcinoma cell line with epithelial morphology)에 첨가하여 하룻밤 배양 후 부착되지 않은 유산균은 제거하고 그람 염색 후 현미경으로 관찰하였다.
그 결과 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261이 장 세포 부착 능력이 우수함을 확인하였다 (도 6).
<실험예 10> 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL 2610의 16S rRNA 염기서열
리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL 9261는 16S rRNA의 염기서열을 분석하여 리모시락토바실러스 퍼멘텀으로 동정되었다. 구체적으로, 16S rRNA 유전자를 증폭하기 위하여 16S rRNA 프라이머 (27F, 5'-AGA GTT TCM TGG CTC AG-3’; 1088R, 5'-GCTG TACTA AG-3’)를 사용하여 PCR을 수행하였다. ABI 3730XL DNA 분석기((Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 Bionix (Seoul, Korea)에서 PCR로 얻은 16S rRNA 유전자 절편을 sequencing PCR을 수행하여 DNA 시퀀스를 얻고 이 정보를 국립생물공학정보센터 웹 서버(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 BLAST 알고리즘을 사용하여 분석하였을 때 791개의 DNA 염기는 Limosilactobacillus fermentum 과 100% 일치하는 결과를 확인할 수 있었다. 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261 (기탁번호 KCTC15035BP)의 16S rRNA 염기서열은 도 7에 나타내었다.
Claims (9)
- 수탁번호 KCTC15035BP의 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261(Limosilactobacillus fermentum PL9261) 균주.
- 제1항에 있어서,
상기 균주는 서열번호 1로 기재되는 16S rRNA 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 균주.
- 제1항의 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물, 또는 이들의 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 비타민 B12 부족으로 발생하는 질병의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제 3항에 있어서,
상기 조성물은 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261 균주 1 x 106 내지 1 x 1012 CFU 를 포함하는 것을 특징으로 하는 비타민 B12 부족으로 발생하는 질병의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제 3항에 있어서,
상기 비타민 B12 부족으로 발생하는 질병은 혈액학적 신경학적 장애 (hematological and neurological disorders), 악성빈혈 (pernicious anemia), 말초신경염(peripheral neuritis), 빈혈(anemia), 관상동맥질환(coronary disease), 고호모시스테인혈증(hyperhomocysteinemia)과 심근경색증(myocardial infaction), 위축성 위염(atrophic gastritis), 췌장의 만성 염증(chronic inflammation of the pancreas), 위 또는 소장의 부분을 제거하는 수술적 처치, 체중 감소(비만) 수술, 크론 병(Crohn's disease), 궤양성 대장염 (ulcerative colitis) 등의 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease), 셀리악병(celiac disease), 비만, 높은 체질량 지수, 또는 임신 중 태아 신경 발달 이상, 당뇨병 전 상태, 인슐린 저항성, 또는 메트포르민 복용으로 인한 비타민 B12 부족 현상으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 비타민 B12 부족으로 발생하는 질병의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 비타민 B12 부족은 메트포르민을 복용하는 당뇨환자에서 발생하는 것을 특징으로 하는 비타민 B12 부족으로 발생하는 질병의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제 3항에 있어서,
상기 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261은 식중독균을 억제하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
- 제 3항에 있어서,
상기 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261은 항생제 내성이 없는 것을 특징으로 하는 비타민 B12 부족으로 발생하는 질병의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 리모시락토바실러스 퍼멘텀 PL9261 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물, 또는 이들의 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 비타민 B12 부족으로 발생하는 질병의 예방 또는 개선용 사료 첨가제.
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