KR20240038834A - Primer composition for recombinase-polymerase amplification reaction for rapid diagnosis of Rice stripe virus - Google Patents
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Abstract
벼줄무늬잎마름바이러스 신속 진단을 위한 재조합효소-중합효소 증폭 반응용 프라이머 조성물에 관한 것으로서, 본 발명은 벼줄무늬잎마름바이러스(Rice stripe virus, RSV)에 감염된 벼로부터, RSA의 RNA를 추출하여, 서열정보를 확인하였으며, 이를 기존의 RSA와 비교하여, 유전체 상동성을 확인하였다. 또한, 수득된 RSA의 서열정보로부터, RPA를 위한 프라이머 쌍을 제작하였으며, 제작된 프라이머 중 RPA 반응성이 우수한 프라이머를 선별하였다. 또한, 선별된 프라이머 쌍의 최적 온도, 시간, 프라이머 첨가량 및 MgOAc 첨가량을 확인하여, RPA를 이용한 RSA의 신속한 검출 및 진단 효과를 확인하여, 현장에서 빠른 시간 내에 RSV를 검출할 수 있고 경제적인 손실을 줄일 수 있어, 관련 산업에 유용하게 이용할 수 있다.The present invention relates to a primer composition for a recombinase-polymerase amplification reaction for rapid diagnosis of rice stripe virus (Rice stripe virus (RSV)). The present invention extracts RNA of RSA from rice infected with rice stripe virus (RSV), Sequence information was confirmed and compared with existing RSA to confirm genomic homology. In addition, a primer pair for RPA was prepared from the obtained sequence information of RSA, and among the prepared primers, primers with excellent RPA reactivity were selected. In addition, by confirming the optimal temperature, time, primer addition amount, and MgOAc addition amount of the selected primer pair, the rapid detection and diagnostic effect of RSA using RPA was confirmed, allowing rapid detection of RSV in the field and reducing economic loss. Because it can be reduced, it can be usefully used in related industries.
Description
본 발명은, 벼줄무늬잎마름바이러스 신속 진단을 위한 재조합효소-중합효소 증폭 반응용 프라이머 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a primer composition for recombinase-polymerase amplification reaction for rapid diagnosis of rice leaf blight virus.
벼줄무늬잎마름병은 동아시아권 국가에 벼 생산에 영향을 미치는 바이러스병으로써 감염되었을 때 벼이삭이 아예 나오지 않거나 잎이 말라죽는 병징이 나타나며 작물의 상품성과 품질이 저하되는 특징이 있다. 기존에 진단방법으로는 유전물질을 추출한 다음 중합효소 연쇄 반응(Polymerase chain reaction, PCR)으로 진단에 필요한 유전자 일부분을 증폭해 확인하는 방법이 일반적으로 알려진 진단법이나, PCR을 이용한 진단은, 진단 시 핵산의 추출에서부터 증폭 산물의 확인까지 최소 190분 이상의 시간이 소요되며, 유전물질의 추출과 PCR 진행 시 각 과정마다 특수한 장비가 요구되기 때문에, 신속한 검출과 진단에 어려움이 있다.Rice striped leaf blight is a viral disease that affects rice production in East Asian countries. When infected, symptoms include no rice ears growing or drying of leaves, which reduces the marketability and quality of the crop. The existing diagnostic method is a generally known method of extracting genetic material and then amplifying and confirming part of the gene required for diagnosis through polymerase chain reaction (PCR). However, diagnosis using PCR is performed using nucleic acid It takes at least 190 minutes from extraction to confirmation of the amplification product, and since special equipment is required for each process when extracting genetic material and performing PCR, rapid detection and diagnosis are difficult.
한편, 재조합효소-중합효소 증폭법(Recombinase Polymerase Amplification; RPA)은 등온에서 특이 DNA를 빠르게 증폭시키는 방법으로서, 특이 병원체가 보유한 특이 염기서열의 증폭을 이용하여, 다양한 병원체들을 검출하는데 응용되고 있다. Meanwhile, Recombinase Polymerase Amplification (RPA) is a method of rapidly amplifying specific DNA at isothermal, and is applied to detect various pathogens by using amplification of specific base sequences possessed by specific pathogens.
이에, 본 발명자들은, RSV에 감염된 식물체로부터, RSV의 유전체를 수득하였으며, RPA를 이용한 RSV 검출용 프라이머 쌍 및 최적 반응 조건을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors obtained the genome of RSV from plants infected with RSV, confirmed primer pairs and optimal reaction conditions for RSV detection using RPA, and completed the present invention.
본 발명의 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 쌍; 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 쌍;으로 이루어진 군에서 선택된 프라이머 쌍을 포함하는 벼줄무늬잎마름바이러스(Rice stripe virus, RSV) 검출용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.The object of the present invention is a primer pair of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; Primer pair of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4; Primer pair of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6; Primer pair of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8; and a primer pair of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10. It provides a primer set for detecting rice stripe virus (RSV) comprising a primer pair selected from the group consisting of.
본 발명의 다른 목적은 상기의 프라이머 세트를 포함하는 벼줄무늬잎마름바이러스(Rice stripe virus, RSV) 검출용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for detecting rice stripe virus (RSV) containing the above primer set.
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 조성물을 포함하는 벼줄무늬잎마름바이러스(Rice stripe virus, RSV) 검출용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit for detecting rice stripe virus (RSV) containing the above composition.
본 발명의 또 다른 목적은 검체로부터 RNA를 추출하는 단계;Another object of the present invention is to extract RNA from a specimen;
상기 추출된 RNA를 상기의 키트를 이용하여 증폭하는 단계; 및Amplifying the extracted RNA using the kit; and
상기 증폭된 산물을 확인하는 단계;를 포함하는 벼줄무늬잎마름바이러스(Rice stripe virus, RSV)의 검출 방법을 제공하는 것이다.To provide a method for detecting rice stripe virus (RSV), including the step of confirming the amplified product.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 쌍; 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 쌍;으로 이루어진 군에서 선택된 프라이머 쌍을 포함하는 벼줄무늬잎마름바이러스(Rice stripe virus, RSV) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a primer pair of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; Primer pair of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4; Primer pair of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6; Primer pair of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8; and a primer pair of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10. It provides a primer set for detecting rice stripe virus (RSV) comprising a primer pair selected from the group consisting of.
또한, 본 발명은 상기의 프라이머 세트를 포함하는 벼줄무늬잎마름바이러스(Rice stripe virus, RSV) 검출용 조성물을 제공한다.Additionally, the present invention provides a composition for detecting rice stripe virus (RSV) comprising the above primer set.
또한, 본 발명은 상기의 조성물을 포함하는 벼줄무늬잎마름바이러스(Rice stripe virus, RSV) 검출용 키트를 제공한다.Additionally, the present invention provides a kit for detecting rice stripe virus (RSV) containing the above composition.
또한, 본 발명은 검체로부터 RNA를 추출하는 단계;In addition, the present invention includes the steps of extracting RNA from a specimen;
상기 추출된 RNA를 상기의 키트를 이용하여 증폭하는 단계; 및Amplifying the extracted RNA using the kit; and
상기 증폭된 산물을 확인하는 단계;를 포함하는 벼줄무늬잎마름바이러스(Rice stripe virus, RSV)의 검출 방법을 제공한다.It provides a method for detecting rice stripe virus (RSV), including the step of confirming the amplified product.
본 발명은 벼줄무늬잎마름바이러스(Rice stripe virus, RSV)에 감염된 벼로부터, RSA의 RNA를 추출하여, 서열정보를 확인하였으며, 이를 기존의 RSA와 비교하여, 유전체 상동성을 확인하였다. 또한, 수득된 RSA의 서열정보로부터, RPA를 위한 프라이머 쌍을 제작하였으며, 제작된 프라이머 중 RPA 반응성이 우수한 프라이머를 선별하였다. 또한, 선별된 프라이머 쌍의 최적 온도, 시간, 프라이머 첨가량 및 MgOAc 첨가량을 확인하여, RPA를 이용한 RSA의 신속한 검출 및 진단 효과를 확인하여, 현장에서 빠른 시간 내에 RSV를 검출할 수 있고 경제적인 손실을 줄일 수 있어, 관련 산업에 유용하게 이용할 수 있다.In the present invention, RNA of RSA was extracted from rice infected with rice stripe virus (RSV), sequence information was confirmed, and this was compared with existing RSA to confirm genomic homology. In addition, a primer pair for RPA was prepared from the obtained sequence information of RSA, and among the prepared primers, primers with excellent RPA reactivity were selected. In addition, by confirming the optimal temperature, time, primer addition amount, and MgOAc addition amount of the selected primer pair, the rapid detection and diagnostic effect of RSA using RPA was confirmed, allowing rapid detection of RSV in the field and reducing economic loss. Because it can be reduced, it can be usefully used in related industries.
도 1은 벼 시료에서 벼줄무늬잎마름바이러스(Rice stripe virus, RSV)의 cDNA를 RT-PCR로 확인한 도이다.
도 2는 벼 시료에서 검출된 벼줄무늬잎마름바이러스(Rice stripe virus, RSV)의 RNA를 기존의 RSV와 서열 상동성을 확인한 도이다.
도 3는 본 발명의 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification, RPA)을 위하여 제작된 프라이머 쌍의 정보를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 5쌍의 프라이머 쌍으로 벼줄무늬잎마름바이러스(Rice stripe virus, RSV) RNA를 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification, RPA)으로 검출한 것을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 프라이머 쌍 4의 최적 증폭 온도를 확인한 도이다.
도 6 본 발명의 프라이머 쌍 4의 증폭반응에서, 겔 전기영동을 통해 육안으로 확인 가능한 시간을 확인한 도이다.
도 7는 본 발명의 프라이머 쌍 4의 증폭반응에서, 최적의 프라이머 농도를 확인한 도이다.
도 8는 본 발명의 프라이머 쌍 4의 증폭반응에서, 최적의 MgOAc의 농도를 확인한 도이다. Figure 1 is a diagram showing cDNA of rice stripe virus (RSV) confirmed in a rice sample by RT-PCR.
Figure 2 is a diagram confirming the sequence homology of RNA of rice stripe virus (RSV) detected in rice samples with existing RSV.
Figure 3 is a diagram showing information on primer pairs prepared for the recombinase polymerase amplification (RPA) method of the present invention.
Figure 4 is a diagram showing the detection of rice stripe virus (RSV) RNA by recombinase polymerase amplification (RPA) using five primer pairs of the present invention.
Figure 5 is a diagram confirming the optimal amplification temperature of primer pair 4 of the present invention.
Figure 6 is a diagram confirming the time that can be visually confirmed through gel electrophoresis in the amplification reaction of primer pair 4 of the present invention.
Figure 7 is a diagram confirming the optimal primer concentration in the amplification reaction of primer pair 4 of the present invention.
Figure 8 is a diagram confirming the optimal MgOAc concentration in the amplification reaction of primer pair 4 of the present invention.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명한다. 이하의 설명에 있어, 당업자에게 주지 저명한 기술에 대해서는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다.Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the attached drawings. In the following description, detailed descriptions of techniques well known to those skilled in the art may be omitted. Additionally, when describing the present invention, if it is determined that a detailed description of a related known function or configuration may unnecessarily obscure the gist of the present invention, the detailed description may be omitted. In addition, the terminology used in this specification is a term used to appropriately express preferred embodiments of the present invention, and may vary depending on the intention of the user or operator or the customs of the field to which the present invention belongs.
따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.Therefore, definitions of these terms should be made based on the content throughout this specification. Throughout the specification, when a part is said to “include” a certain element, this means that it may further include other elements rather than excluding other elements, unless specifically stated to the contrary.
본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 쌍; 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 쌍;으로 이루어진 군에서 선택된 프라이머 쌍을 포함하는 벼줄무늬잎마름바이러스(Rice stripe virus, RSV) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.The present invention provides a primer pair of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; Primer pair of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4; Primer pair of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6; Primer pair of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8; and a primer pair of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10. It provides a primer set for detecting rice stripe virus (RSV) comprising a primer pair selected from the group consisting of.
본 발명의 “벼줄무늬잎마름바이러스(Rice stripe virus, RSV)”는 벼(rice)에 가장 큰 피해를 입히는 병원 바이러스로서, Laodelphax striatellus Fallen를 포함하는 3종의 애멸구로 매개되는 증식형 바이러스이다. 조기감염에서는 잎이 말려서 유령병이라고도 불리며, 잎에 황백색조반을 유발하는 바이러스이다.“Rice stripe virus (RSV)” of the present invention is a pathogenic virus that causes the most damage to rice, and is a proliferative virus transmitted by three types of planthoppers, including Laodelphax striatellus Fallen. In early infection, the leaves curl, so it is also called ghost disease. It is a virus that causes yellowish-white spots on the leaves.
본 발명에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.In the present invention, the term "primer" is a nucleic acid sequence having a short free 3' hydroxyl group, which can form a base pair with a template of a complementary nucleic acid and copies the strand of the nucleic acid template. refers to a short nucleic acid sequence that serves as a starting point for Primers can initiate DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and reagents for polymerization (i.e., DNA polymerase or reverse transcriptase) in an appropriate buffer and temperature.
상기 프라이머 설계 시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기 서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg2+의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.When designing the primers, there are various restrictions, such as the A, G, C, and T content ratio of the primers, prevention of primer complex (dimer) formation, and prohibition of repeating the same base sequence more than three times. In addition, in the single PCR reaction conditions, the template (template) Conditions such as the amount of DNA, concentration of primers, concentration of dNTP, concentration of Mg 2+ , reaction temperature, and reaction time must be appropriate.
상기의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.The above primers may incorporate additional features without changing the basic properties. That is, the nucleic acid sequence can be modified using many means known in the art. Examples of such modifications include methylation, capping, substitution of a nucleotide with one or more homologs, and uncharged linkages such as phosphonates, phosphotriesters, phosphoroamidates, or carbamates, or phosphorothioates or phosphorodithioates. Modification of nucleotides into charged linkages such as In addition, nucleic acids may contain one or more nucleases, toxins, antibodies, signal peptides, proteins such as poly L lysine, intercalating agents such as acridine or psoralen, chelating agents such as metals, radioactive metals, iron oxidizing metals, and alkylating agents. May have additional covalently linked residues.
또한 본 발명의 프라이머 서열은 검출 가능한 시그널을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출 될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA 에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용 가능한 단백질을 포함한다.Additionally, the primer sequence of the present invention can be modified using a label that can directly or indirectly provide a detectable signal. The primer may contain a label that can be detected using spectroscopy, photochemistry, biochemistry, immunochemistry or chemical means. Useful labels include 32 P, fluorescent dyes, electron dense reagents, enzymes (commonly used in ELISA), biotin or haptens, and proteins for which antisera or monoclonal antibodies are available.
본 발명의 프라이머는 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제 4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.The primers of the present invention are prepared by cloning of appropriate sequences, restriction enzyme digestion, phosphotriester method by Narang et al. (1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), and diethylphosphoramidase method by Beaucage et al. Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862 (1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), and any other well-known method, including direct chemical synthesis methods such as the solid support method of U.S. Pat. No. 4,458,066.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 프라이머 쌍은 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification, RPA)에 이용하는 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the primer pair may be used in recombinase polymerase amplification (RPA).
본 발명의 “재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification, RPA)”은 PCR 기술 기반의 DNA 및 RNA 증폭을 확인할 수 있는 기술이다. 기존 PCR 방법과는 다르게 RPA 방법은 DNA 결합 단백질(binding protein)과 재조합효소(recombinase)를 이용하여 빠르고 정확하게 타겟 시퀀스(target sequence)를 증폭시킬 수 있고, 등온의 중합효소(mesophilic polymerase)를 이용하여 등온조건에서도 증폭이 가능하므로 특별한 장비 없이 등온장치만 있으면 빠른 시간 안에 바이러스를 검출 및 진단할 수 있다는 장점이 있다. 그러나, RPA 방법에는 비특이적 반응이 종종 발생하므로 이를 방지하기 위하여 적합한 프라이머의 제작이 중요하다.“Recombinase polymerase amplification (RPA)” of the present invention is a technology that can confirm DNA and RNA amplification based on PCR technology. Unlike the existing PCR method, the RPA method can quickly and accurately amplify the target sequence using DNA binding protein and recombinase, and can use isothermal polymerase (mesophilic polymerase) to quickly and accurately amplify the target sequence. Since amplification is possible even under isothermal conditions, it has the advantage of being able to detect and diagnose viruses in a short time using an isothermal device without any special equipment. However, since non-specific reactions often occur in the RPA method, it is important to prepare appropriate primers to prevent this.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 벼줄무늬잎마름바이러스(Rice stripe virus, RSV)는 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the rice stripe virus (RSV) may include the base sequence of SEQ ID NO: 11.
또한, 본 발명은 상기의 프라이머 세트를 포함하는 벼줄무늬잎마름바이러스(Rice stripe virus, RSV) 검출용 조성물을 제공한다.Additionally, the present invention provides a composition for detecting rice stripe virus (RSV) comprising the above primer set.
본 발명의 바이러스를 검출용 조성물은 RSV에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있으며, 상기 조성물은 반응 증폭 혼합물을 더 포함할 수 있다. 반응 증폭 혼합물은 증폭 반응을 수행하기에 필요한 시약, 열 안정성 DNA 중합 효소, 데옥시뉴클레오티드, 뉴클레아제가 없는 멸균수 및 2가 금속 양이온을 함유하는 용액 등을 지칭하며, 바람직하게는 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드, DNA 중합효소를 포함할 수 있다. 상기 프로브의 말단에는 형광 물질 등의 리포터를 표지(labeling)할 수 있다.The composition for detecting a virus of the present invention may include a primer or probe that specifically binds to RSV, and the composition may further include a reaction amplification mixture. The reaction amplification mixture refers to a solution containing reagents necessary to perform the amplification reaction, thermostable DNA polymerase, deoxynucleotides, nuclease-free sterile water, and divalent metal cations, and is preferably a reaction buffer, a deoxynucleotide, etc. May contain oxynucleotides and DNA polymerase. The end of the probe may be labeled with a reporter such as a fluorescent substance.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 쌍; 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 쌍;으로 이루어진 군에서 선택된 프라이머 쌍;으로 이루어진 군에서 선택된 프라이머 쌍을 0.5 내지 3.5 μl 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 1.0 내지 3.0 μl, 더욱 바람직하게는 1.5 내지 2.5 μl 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.According to one embodiment of the present invention, the primer pair of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; Primer pair of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4; Primer pair of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6; Primer pair of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8; and a primer pair of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10; a primer pair selected from the group consisting of; and may contain 0.5 to 3.5 μl of a primer pair selected from the group consisting of, preferably 1.0 to 3.0 μl, more preferably It may contain 1.5 to 2.5 μl, but is not limited thereto.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 조성물은, MgOAc를 0.5 내지 4.0 μl 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 1.0 내지 3.5 μl, 더욱 바람직하게는 1.5 내지 3.0 μl일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.According to one embodiment of the present invention, the composition may contain 0.5 to 4.0 μl of MgOAc, preferably 1.0 to 3.5 μl, more preferably 1.5 to 3.0 μl, but is not limited thereto. .
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 재조합-중합효소 증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 반응버퍼 및 증류수를 더 포함하는 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the composition may further include DNA polymerase for recombinant-polymerase amplification reaction, dNTPs, reaction buffer, and distilled water.
또한, 본 발명은 상기의 조성물을 포함하는 벼줄무늬잎마름바이러스(Rice stripe virus, RSV) 검출용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for detecting rice stripe virus (RSV) containing the above composition.
또한, 본 발명은 검체로부터 RNA를 추출하는 단계;In addition, the present invention includes the steps of extracting RNA from a specimen;
상기 추출된 RNA를 상기의 키트를 이용하여 증폭하는 단계; 및Amplifying the extracted RNA using the kit; and
상기 증폭된 산물을 확인하는 단계;를 포함하는 벼줄무늬잎마름바이러스(Rice stripe virus, RSV)의 검출 방법을 제공한다.It provides a method for detecting rice stripe virus (RSV), including the step of confirming the amplified product.
본 발명의 RSV 검출 방법은 검체 내 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 RSV 감염 여부를 진단하는 방법을 말한다. 더욱 구체적으로 본 발명의 RSV를 진단하기 위한 프라이머를 이용한 증폭 반응을 수행하여 RSV의 RNA를 특이적으로 검출할 수 있는 방법일 수 있다.The RSV detection method of the present invention refers to a method of diagnosing RSV infection including the base sequence of SEQ ID NO: 11 in a sample. More specifically, it may be a method of specifically detecting RSV RNA by performing an amplification reaction using primers for diagnosing RSV of the present invention.
상기 “증폭 반응”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미하며, 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification, RPA), 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로, 역전사-중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭 (transcription-mediatedamplification; TMA) (WO88/10315), 자가유지염기서열복제(self sustained sequence replication) (WO90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR), 핵산염기서열 기반 증폭 (nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭 (strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭 (loop-mediated isothermal amplification; LAMP) 등의 증폭 방법일 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.The “amplification reaction” refers to a reaction that amplifies a nucleic acid molecule, including recombinase polymerase amplification (RPA), polymerase chain reaction (PCR), and reverse transcription-polymerase chain reaction ( reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), ligase chain reaction (LCR), Gap-LCR (WO 90/01069), repair chain reaction (EP 439,182), transcription-mediated amplification ( transcription-mediated amplification (TMA) (WO88/10315), self sustained sequence replication (WO90/06995), selective amplification of target polynucleotide sequences, consensus sequence priming polymerization Consensus sequence primed polymerase chain reaction (CP-PCR), arbitrarily primed polymerase chain reaction (AP-PCR), nucleic acid sequence based amplification (NASBA), strand Amplification methods may include strand displacement amplification and loop-mediated isothermal amplification (LAMP), but are not limited thereto.
본 발명의 일실시에에 따르면, 상기 검체는 벼(rice) 또는 매개충(insect vector)인 것일 수 있고, 바람직하게는 벼(rice)이다.According to one embodiment of the present invention, the sample may be rice or an insect vector, and is preferably rice.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 증폭은 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification, RPA)으로 증폭하는 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the amplification may be amplification using recombinase polymerase amplification (RPA).
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 재조합-중합효소 증폭법은 20 내지 50℃의 온도 조건으로 수행되는 것일 수 있고, 바람직하게는 25 내지 40℃일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.According to one embodiment of the present invention, the recombinant-polymerase amplification method may be performed under temperature conditions of 20 to 50°C, preferably 25 to 40°C, but is not limited thereto.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 재조합-중합효소 증폭법은 5 내지 25 분간 수행되는 것일 수 있고, 바람직하게는 10 내지 20분 일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.According to one embodiment of the present invention, the recombinant-polymerase amplification method may be performed for 5 to 25 minutes, preferably 10 to 20 minutes, but is not limited thereto.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 증폭 산물의 확인은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방산선 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어진 군에서 선택된 방법으로 확인하는 것일 수 있고, 바람직하게는 겔 전기영동 방법이나, 이에 제한되지는 않는다. 겔 전기 영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the amplification product may be confirmed by a method selected from the group consisting of DNA chip, gel electrophoresis, radiation measurement, fluorescence measurement, and phosphorescence measurement, preferably gel electrophoresis. The method is not limited thereto. Gel electrophoresis may use agarose gel electrophoresis or acrylamide gel electrophoresis depending on the size of the amplification product.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited to these examples.
<실시예 1> 벼 시료에서의 viral RNA 추출 및 확인<Example 1> Extraction and confirmation of viral RNA from rice samples
<1-1> viral RNA 추출<1-1> Extraction of viral RNA
벼줄무늬잎마름병 바이러스(Rice stripe virus, RSV)의 vireal RNA를 추출하기 위하여, RdRp 부분을 타겟으로 한 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 구체적으로, 경북대학교 위생곤충실험실에서 시료를 제공받았으며, 제공받은 시료는 비즈를 이용해 곱게 갈아주었다. 그 후 Viral DNA / RNA Extraction(Intronbio)를 사용해 Viral RNA를 추출한 후 SuPrimeScript RT-PCR Premix(2X)(GENETBIO)를 사용해 RT-PCR을 수행하였다. 그 후, RT-PCR 산물을 전기영동을 이용하여 확인하였다. RT-PCR 분석에 이용된 프라이머 쌍은 하기 표 1에 나타내었다.To extract vireal RNA of rice stripe virus (RSV), RT-PCR was performed using primers targeting the RdRp region. Specifically, samples were provided by the Hygienic Insect Laboratory of Kyungpook National University, and the samples were finely ground using beads. Afterwards, viral RNA was extracted using Viral DNA / RNA Extraction (Intronbio), and RT-PCR was performed using SuPrimeScript RT-PCR Premix (2X) (GENETBIO). Afterwards, the RT-PCR product was confirmed using electrophoresis. Primer pairs used for RT-PCR analysis are shown in Table 1 below.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 목적하는 크기의 전기영동 산물이 확인되었다.As a result, as shown in Figure 1, an electrophoresis product of the desired size was confirmed.
<1-2> viral RNA 분석<1-2> Viral RNA analysis
상기 실시예 1-1에서 수득된 PCR 산물의 염기서열을 분석하였다. 구체적으로, 수득된 PCR 산물의 염기서열을 분석한 후 CLC Sequencing Viewer 8을 사용하여 NCBI에 등록된 기존 RSV의 서열(GQ229095, GQ229094, GQ229093, GQ229092, GQ229091, GQ229090, GQ229089)과 비교하여, 서열이 일치하는지 확인하였다. 검출된 RSV RNA 서열 정보는 하기 표 2와 같다.The base sequence of the PCR product obtained in Example 1-1 was analyzed. Specifically, the base sequence of the obtained PCR product was analyzed and compared with the existing RSV sequences registered in NCBI (GQ229095, GQ229094, GQ229093, GQ229092, GQ229091, GQ229090, GQ229089) using CLC Sequencing Viewer 8. Checked if they match. The detected RSV RNA sequence information is shown in Table 2 below.
(서열번호 11)R.S.V.
(SEQ ID NO: 11)
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 분리된 viral RNA가 기존의 RSV와 일치하는 것을 확인하였다.As a result, as shown in Figure 2, it was confirmed that the isolated viral RNA matched existing RSV.
<실시예 2> RSV 검출을 위한 프라이머 제작 및 재조합효소-중합효소 증폭법 최적화<Example 2> Preparation of primers for RSV detection and optimization of recombinase-polymerase amplification method
<2-1> RSV 검출을 위한 프라이머 제작<2-1> Preparation of primers for RSV detection
본 발명의 재조합효소-중합효소 증폭법(Recombinase Polymerase Amplification; RPA)을 이용하여 RSV를 검출하기 위한 프라이머를 제작하였다. 구체적으로 상기 실시예 1에서 분석된 RSV 염기서열을 바탕으로 Primer BLAST를 시행하여, 5쌍의 프라이머 쌍을 제작하였다. 그 후 제작된 프라이머쌍에서 RSV의 RPA 진단에 적합한 프라이머 쌍을 확인하고, RPA 분석을 시행하여 적합한 프라이머 쌍을 선별하였다. 제작된 5쌍의 프라이머 정보는 하기 표 3 및 도 3에 나타내었다.Primers for detecting RSV were prepared using the Recombinase Polymerase Amplification (RPA) method of the present invention. Specifically, Primer BLAST was performed based on the RSV base sequence analyzed in Example 1, and five primer pairs were created. Afterwards, primer pairs suitable for RPA diagnosis of RSV were identified from the prepared primer pairs, and RPA analysis was performed to select suitable primer pairs. Information on the five pairs of primers produced is shown in Table 3 and Figure 3 below.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 상기의 프라이머 쌍 중 프라이머 쌍 4(primer pair 4)가 RPA 분석에 적합한 프라이머 쌍인 것을 확인하였으며, 실제로 RPA 분석 결과 프라이머 쌍 4에서 증폭 산물의 밴드(band)가 가장 뚜렷한 것을 확인하였으며, 이 후 실험에서는 프라이머 쌍 4를 이용하여, 최적 조건을 확인하였다.As a result, as shown in Figure 4, it was confirmed that among the above primer pairs, primer pair 4 was a suitable primer pair for RPA analysis. In fact, as a result of RPA analysis, the band of the amplification product in primer pair 4 was The most obvious one was confirmed, and in subsequent experiments, primer pair 4 was used to confirm the optimal conditions.
<2-2> RPA 최적 온도조건 확립<2-2> Establishment of optimal temperature conditions for RPA
본 발명의 RSV 검출을 위한 프라이머의 최적 온도를 확인하였다. 구체적으로, 33.4 내지 43.4 ℃의 온도 조건에서, 상기 실시예 2-1의 프라이머 쌍 4를 이용하여, RSV를 검출하였다.The optimal temperature of the primers for RSV detection of the present invention was confirmed. Specifically, RSV was detected using primer pair 4 of Example 2-1 above under temperature conditions of 33.4 to 43.4°C.
그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이, 프라이머 쌍 4는 37℃에서 밴드의 발현이 강하게 나타난 것을 확인하여, 37℃가 최적 온도인 것을 확인하였다.As a result, as shown in Figure 5, it was confirmed that primer pair 4 showed strong band expression at 37°C, confirming that 37°C was the optimal temperature.
<2-3> RPA 최적 반응 시간조건 확립<2-3> Establishment of RPA optimal reaction time conditions
본 발명의 RSV 검출을 위한 프라이머의 최적 반응 시간을 확인하였다. 구체적으로, 프라이머 쌍 4를 이용하여, 37℃에서 0 내지 20분간 RPA를 이용하여 RSV를 검출하였다.The optimal reaction time of the primers for RSV detection of the present invention was confirmed. Specifically, using primer pair 4, RSV was detected using RPA at 37°C for 0 to 20 minutes.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 37℃에서는 반응 10분 이후 증폭 산물이 확인되었으며, 반응 20분에 밴드가 선명하게 발현되는 것을 확인하여, 프라이머 쌍 4의 최적 반응 시간을 확인하였다.As a result, as shown in Figure 6, the amplification product was confirmed after 10 minutes of reaction at 37°C, and the band was clearly expressed at 20 minutes of reaction, confirming the optimal reaction time for primer pair 4.
<2-4> RPA 최적 프라이머 첨가량 확인<2-4> Check the optimal primer addition amount for RPA
본 발명의 RSV 검출을 위한 프라이머 쌍 4의 반응 시 최적 첨가량을 확인하였다. 구체적으로, 프라이머 쌍 4를 2.1 μl을 기준(1x)으로, 0 내지 2배(0x 내지 2x)의 농도로 첨가하여, RPA로 RSV를 검출하였다.The optimal addition amount was confirmed during the reaction of primer pair 4 for RSV detection of the present invention. Specifically, primer pair 4 was added at a concentration of 0 to 2 times (0x to 2x) using 2.1 μl as a standard (1x), and RSV was detected with RPA.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 프라이머 쌍 4의 첨가량이 증가할수록, 밴드의 발현이 선명해지는 것을 확인하였으며, 프라이머의 농도가 2x (4.2 μl)일 때, 밴드가 가장 선명한 것을 확인하였다.As a result, as shown in Figure 7, it was confirmed that as the amount of primer pair 4 added increased, the expression of the band became clearer. It was confirmed that the band was clearest when the primer concentration was 2x (4.2 μl).
<2-5> RPA 최적 MgOAc 첨가량 확인<2-5> Confirmation of optimal MgOAc addition amount for RPA
RPA 분석에 첨가되는 화합물 중, RPA 반응에 영향을 중요한 화합물인 MgOAc의 첨가량에 따른, 최적 농도를 확인하였다. 구체적으로, MgOAc 2.5 μl (1x)를 기준으로 0 내지 2배 (0x 내지 2x)로 MgOAc를 첨가하여, 프라이머 쌍 4를 이용한 RPA로 RSA를 검출하였다.Among the compounds added for RPA analysis, the optimal concentration was confirmed according to the amount of MgOAc, which is an important compound that affects the RPA reaction. Specifically, MgOAc was added 0 to 2 times (0x to 2x) based on 2.5 μl (1x) of MgOAc, and RSA was detected by RPA using primer pair 4.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, MgOAc가 첨가되지 않았을 때(0x)에는, 밴드의 발현이 확인되지 않았으나, MgOAc가 첨가되면, 밴드의 발현이 확인되었으며, MgOAc의 첨가량에 따른 밴드의 선명도에는 차이가 없었다.As a result, as shown in Figure 8, when MgOAc was not added (0x), the expression of the band was not confirmed, but when MgOAc was added, the expression of the band was confirmed, and the clarity of the band depending on the amount of MgOAc added was There was no difference.
따라서, 본 발명은 벼줄무늬잎마름바이러스(Rice stripe virus, RSV)에 감염된 벼로부터, RSA의 RNA를 추출하여, 서열정보를 확인하였으며, 이를 기존의 RSA와 비교하여, 유전체 상동성을 확인하였다. 또한, 수득된 RSA의 서열정보로부터, RPA를 위한 프라이머 쌍을 제작하였으며, 제작된 프라이머 중 RPA 반응성이 우수한 프라이머를 선별하였다. 또한, 선별된 프라이머 쌍의 최적 온도, 시간, 프라이머 첨가량 및 MgOAc 첨가량을 확인하여, RPA를 이용한 RSA의 신속한 검출 및 진단 효과를 확인하여, 현장에서 빠른 시간내에 RSV 검출가능하고, 경제적인 손실을 줄일 수 있어, 관련 산업에 유용하게 이용할 수 있다.Therefore, the present invention extracted RNA of RSA from rice infected with rice stripe virus (RSV), confirmed sequence information, and compared it with existing RSA to confirm genomic homology. In addition, a primer pair for RPA was prepared from the obtained sequence information of RSA, and among the prepared primers, primers with excellent RPA reactivity were selected. In addition, by confirming the optimal temperature, time, primer addition amount, and MgOAc addition amount of the selected primer pair, the rapid detection and diagnostic effect of RSA using RPA was confirmed, enabling rapid detection of RSV in the field and reducing economic losses. It can be usefully used in related industries.
Claims (14)
상기 프라이머 쌍은 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification, RPA)에 이용하는 것인, 프라이머 세트.According to clause 1,
The primer pair is a primer set used in recombinase polymerase amplification (RPA).
상기 벼줄무늬잎마름바이러스(Rice stripe virus, RSV)는 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 것인, 프라이머 세트.According to clause 1,
The rice stripe virus (RSV) is a primer set containing the base sequence of SEQ ID NO: 11.
상기 조성물은, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 쌍; 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 쌍;으로 이루어진 군에서 선택된 프라이머 쌍을 0.5 내지 3.5 μl 포함하는 것인, 조성물.According to clause 4,
The composition includes a primer pair of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; Primer pair of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4; Primer pair of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6; Primer pair of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8; And a primer pair of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10; a composition comprising 0.5 to 3.5 μl of a primer pair selected from the group consisting of.
상기 조성물은, MgOAc를 0.5 내지 4.0 μl 포함하는 것인, 조성물.According to clause 4,
The composition includes 0.5 to 4.0 μl of MgOAc.
상기 조성물은 재조합-중합효소 증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 반응버퍼 및 증류수를 더 포함하는 것인, 조성물.According to clause 4,
The composition further includes DNA polymerase for recombinant-polymerase amplification reaction, dNTPs, reaction buffer, and distilled water.
상기 추출된 RNA를 제 8항의 키트를 이용하여 증폭하는 단계; 및
상기 증폭된 산물을 확인하는 단계;를 포함하는 벼줄무늬잎마름바이러스(Rice stripe virus, RSV)의 검출 방법.Extracting RNA from a sample;
Amplifying the extracted RNA using the kit of claim 8; and
A method for detecting rice stripe virus (RSV), comprising the step of confirming the amplified product.
상기 검체는 벼(rice) 또는 매개충(insect vector)인 것인, 방법.According to clause 9,
The method wherein the sample is rice or insect vector.
상기 증폭은 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification, RPA)으로 증폭하는 것인, 방법.According to clause 9,
The amplification method is amplification using recombinase polymerase amplification (RPA).
상기 재조합-중합효소 증폭법은 20 내지 50℃의 온도 조건으로 수행되는 것인, 방법.According to clause 11,
The method wherein the recombinant-polymerase amplification method is performed under temperature conditions of 20 to 50°C.
상기 재조합-중합효소 증폭법은 5 내지 25 분간 수행되는 것인, 방법.According to clause 13,
The method wherein the recombinant-polymerase amplification method is performed for 5 to 25 minutes.
상기 증폭 산물의 확인은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방산선 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어진 군에서 선택된 방법으로 확인하는 것인, 방법.According to clause 9,
The method of confirming the amplification product by a method selected from the group consisting of DNA chip, gel electrophoresis, radiation measurement, fluorescence measurement, and phosphorescence measurement.
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