KR20240036496A

KR20240036496A - 유전자 전달에서 비바이러스 벡터로서의 수지상 구조

Info

Publication number: KR20240036496A
Application number: KR1020237037828A
Authority: KR
Inventors: 폴라미 탈루크데르; 칼 루핑
Original assignee: 티바 바이오테크 엘엘씨
Priority date: 2021-04-02
Filing date: 2022-04-01
Publication date: 2024-03-20
Also published as: IL307411A; JP2024512770A; WO2022212838A1; CN117915958A; AU2022252396A1; CA3214023A1; EP4313170A1

Abstract

본원에는, 시험관내 및 생체내 둘 다에서 핵산의 세포내 전달을 용이하게 하기 위해, 핵산을 갖는 나노입자를 형성하도록 다른 지질 성분과의 조합으로 사용될 수 있는 신규한 수지상 구조가 개시된다. 또한, 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위한 그 화합물을 포함하는 나노입자 조성물 및 이의 이용 방법이 제공된다.

Description

유전자 전달에서 비바이러스 벡터로서의 수지상 구조

관련 출원에 대한 상호참조

본 출원은 발명의 명칭이 "핵산 전달을 위한 수지상 구조"인 2021년 4월 2일자로 제출된 미국 가출원 제63/170,119호의 이익을 특허청구한 것이며, 상기 가출원은 마치 전부가 제시되어 있는 것처럼 본원에 참고로 포함되어 있다.

기술분야

본 개시내용은 질환 및/또는 장애를 치료 또는 예방하기 위해 대상체에게 핵산을 효율적으로 전달하기 위한 비바이러스 벡터 또는 운반체로서의 수지상 구조, 및 운반체 및 핵산을 포함하는 나노입자 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 개시내용은 나노입자 조성물을 제제화하는 방법 및 이러한 나노입자 조성물을 사용하여 대상체에서 질환 및/또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.

핵산 백신 및 치료제는 여러 질환 또는 병태를 예방하고 치료하기 위한 유망한 접근법으로서 부각되고 있다. 특정 핵산은 세포 또는 혈장 내에서 제한된 지속시간 동안만 안정적이며, 그의 고도로 하전된 성질은 세포막을 가로지르는 전달을 더욱 복잡하게 만든다. 그러므로, 이러한 제제를 안정화하고 세포 내로 전달할 수 있는 조성물이 매우 중요하다(Mendes et al., 2017, Molecules 22(9), 1401; Jones et al., 2013, Mol. Pharmaceutics 10, 4082-4098; 및 Nishikawa and Huang, 2001 Hum. Gene Ther. 12, 861-870). 핵산 전달 벡터는 이상적으로 최소한의 독성으로 엔도뉴클레아제에 의한 핵산 분해, 세포 내재화, 엔도솜 탈출, 벡터로부터 페이로드(payload) 방출 및 원하는 표적에 대한 접근과 같은 상이한 세포외 및 세포내 장벽을 극복해야 한다(Jones et al., 2013, Mol. Pharmaceutics 10, 4082-4098; Nishikawa and Huang, 2001 Hum. Gene Ther. 12, 861-870; Gomes et al., 2014 MRS Bull. 39, 60-70; 및 Dufes et al., 2005, Adv. Drug Delivery Rev. 57, 2177-2202).

지질 나노입자(LNP) 시스템은 이의 높은 핵산 캡슐화 효율 및 강력한 형질감염 등으로 인해 유전자 약물을 위한 가장 진보된 전달 시스템에 해당하지만, 약간 정도 내지 중간 정도의 국소 및 전신 부작용이 관찰되었다(Mol Ther Nucleic Acids. 2019 Apr 15; 15: 1-11; Ther Deliv. 2016;7(5):319-334. doi:10.4155/tde-2016-0006).

생체적합성이거나 생체내에서 천연 대사산물로 분해가능한 것으로 알려진 빌딩 블록을 갖는 일명 폴리에스테르 덴드론(polyester dendron)이 보고되어 있다(Carnahan and Grinstaff, 2001, J. Am. Chem. Soc. 123, 2905; Carnahan and Grinstaff, 2001, Macromolecules 34, 7648; 및 Carnahan and Grinstaff, 2006, Macromolecules 39, 609).

발명의 개요

일 양태에서, 본 발명은 하기 화학식 Ia, Ib, Ic, Id, Ie 또는 If의 덴드론 또는 덴드리머를 포함하는 핵산 운반체에 관한 것이다:

화학식 Ia,

화학식 Ib,

화학식 Ic,

화학식 Id,

화학식 Ie, 또는

화학식 If

식 중, PE는 코어, 및 하나 이상의 세대를 형성하는 복수의 단량체 폴리에스테르 단위를 포함하는 폴리에스테르(PE) 덴드론이고, A는 아민이며, B는 소수성 단위이고, z는 표면 기의 수이다.

일 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 핵산 운반체 중 어느 하나, 그 내에 봉입된 치료적 또는 면역원성 핵산 제제, 및 접합된 지질(conjugated lipid)을 포함하는 나노입자 조성물에 관한 것이다. 일 양태에서, 본 발명은 세포내 전달뿐만 아니라 생체내 나노입자 안정성을 개선하기 위해 본원에 개시된 핵산 운반체 중 어느 하나, 그 내에 봉입된 치료적 또는 면역원성 핵산 제제, 본원에 개시된 하나의 접합된 지질(예컨대, PEG-지질), 및 인지질과 콜레스테롤 또는 이의 유도체의 혼합물을 포함하는 나노입자 조성물에 관한 것이다.

일 양태에서, 본 발명은 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 본원에 개시된 나노입자 조성물 중 어느 하나를 제공하는 단계 및 치료적 유효량의 그 나노입자 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시양태의 하기 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 이해할 때 더 잘 이해될 수 있을 것이다. 본 발명을 예시할 목적으로, 특정 실시양태가 도면에 도시되어 있다. 그러나, 본 발명은 도시된 정확한 배열 및 수단에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 나노입자 조성물(pH 5.0에서 제제화된, 핵산 운반체로서 PE-G2-헥사데실-프로필피롤리딘)의 크기 분포 프로파일을 나타내는 동적 광 산란(DLS) 분석을 예시한 것이다.

도 2는 나노입자 조성물(pH 6.0에서 제제화된, 핵산 운반체로서 PE-G2-헥사데실-프로필피롤리딘)의 크기 분포 프로파일을 나타내는 동적 광 산란(DLS) 분석을 예시한 것이다.

도 3은 PE-G2-헥사데실-프로필피롤리딘과 RNA의 결합을 나타내는 아가로스 겔의 사진을 예시한 것이다. 겔은 에티듐 브로마이드(EB)에 의해 염색되고 겔 이미지는 Syngene G Box 이미징 시스템(Syngene, USA) 상에서 촬영된다.

도 4는 PE-G2-헥사데실-프로필피롤리딘 나노입자로 제제화되고 투여한지 1일, 4일 및 6일 후에 마우스로부터 수집된 SEAP 레플리콘 RNA에 대한 생체내 분비된 알칼리성 포스파타제(SEAP) 발현을 예시한 것이다.

도 5는 나노입자 조성물(pH 5.0에서 제제화된, 핵산 운반체로서 PE-G2-A1-리시놀레익.PE-G2-리놀레익)의 크기 분포 프로파일을 나타내는 동적 광 산란(DLS) 분석을 예시한 것이다.

도 6은 PE-G2-A1-리시놀레익.PE-G2-리놀레익과 RNA의 결합을 나타내는 아가로스 겔의 사진을 예시한 것이다. 겔은 에티듐 브로마이드(EB)에 의해 염색되고 겔 이미지는 Syngene G Box 이미징 시스템(Syngene, USA) 상에서 촬영된다.

도 7은 SEAP 레플리콘 RNA 및 PE-G2-A1-리시놀레익.PE-G2-리놀레익을 함유하는 나노입자에 대한 퀀티블루 분석(quantiblue assay)을 통한 시험관내 SEAP 발현을 도시한 것이다.

도 8a 및 8b는 핵산 운반체로서 PE-G1-A1-리시놀레익.PE-G1-A1-리시놀레익 또는 PE-G2-A1-리시놀레익.PE-G1-A1-리시놀레익 및 SEAP 레플리콘 RNA를 함유하는 나노입자 조성물의 크기 분포 프로파일을 나타내는 동적 광 산란(DLS) 분석을 예시한 것이다.

도 9a는 SEAP 레플리콘 RNA 및 PE-G1-A1-리시놀레익.PE-G1-A1-리시놀레익 또는 PE-G2-A1-리시놀레익.PE-G1-A1-리시놀레익을 함유하는 나노입자에 대한 퀀티블루 분석을 통한 시험관내 SEAP 발현을 보여준다.

도 9b는 SEAP 레플리콘 RNA 및 PE-G1-A1-리시놀레익.PE-G1-A1-리시놀레익 또는 PE-G2-A1-리시놀레익.PE-G1-A1-리시놀레익을 함유하고 투여한지 3일 후에 마우스로부터 수집된 나노입자에 대한 생체내 SEAP 발현을 예시한 것이다.

도 10은 PE-G1-A1-리시놀레익.PE-G1-A1-리시놀레익 또는 PE-G2-A1-리시놀레익.PE-G1-A1-리시놀레익 전달 물질을 사용하여 제제화된 SARS-CoV-2 스파이크 레플리콘 RNA로 백신 접종 후 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적인 마우스 혈청 IgG에 대한 종점 희석 역가를 예시한 것이다.

특정 용어가 단지 편의상으로만 하기 설명에서 사용되며, 이에 한정하지 않는다.

용어 "치환하다"는, 모 구조에서 모든 원자의 원자가(valency)가 유지되는 한, 하나의 작용기 또는 그 내에 포함된 모이어티를 분자 상의 또 다른 작용기로 변경하는 능력을 지칭한다. 그 치환된 기는 본원에서 "치환" 또는 "치환기"로서 상호교환적으로 지칭된다. 임의의 주어진 구조에서 하나 초과의의 위치가 특정된 기로부터 선택된 하나 초과의 치환기에 의해 치환되는 경우, 그 치환기는 모든 위치에서 동일하거나 상이할 수 있다.

용어 "아민"은 하나 이상의 수소 원자가 알킬기와 같은 치환기에 의해 치환되어 있는 형식상 암모니아의 유도체이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "표면 기"는 수지상 분자의 표면 상의 말단 기를 의미한다. 핵산 운반체의 표면은 자기 조립 특성을 돕고 핵산을 축합하기 위해 소수성 테일부(본원에서 성분 "B"로서 기재됨) 또는 아민(본원에서 성분 "A"로서 기재됨)에 의해 변형된다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "알킬"은 1개 내지 28개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소를 의미한다. 알킬 사슬 길이는 핵산 운반체의 소수성 및 자기 조립 특성을 제어하는 데 유용할 수 있다. 알킬의 대표적인 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, sec-부틸, iso-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, n-헥실, 3-메틸헥실, 2,2-디메틸펜틸, 2,3-디메틸펜틸, n-헵틸, n-옥틸, n-노닐, 및 n-데실을 포함하지만, 이에 국한되는 것이 아니다.

청구범위 및 상응하는 명세서의 부분에서 사용된 바와 같이, 단어 "a" 및 "하나"는, 특별히 달리 명시되어 있지 않는 한, 언급된 항목 중 하나 이상을 포함하는 것으로서 정의된다. 이 용어는 구체적으로 언급된 상기 단어, 이의 파생어, 및 유사한 의미의 단어를 포함한다. 문구 "적어도 하나" 뒤에 "A, B, 또는 C"와 같은 2 이상의 항목의 목록은 A, B 또는 C의 임의의 개별적인 것뿐만 아니라 이들의 임의의 조합을 의미한다.

비바이러스 벡터는 발암, 면역원성, 및 광범위한 친화성(tropism)을 포함하는, 바이러스 벡터와 관련된 다수의 한계를 해결할 수 있는 가능성을 갖는다. "나노입자 조성물"은 핵산 운반체 및 핵산 페이로드를 포함하는 조성물을 지칭한다. 핵산 페이로드는 핵산 운반체에 의해 "운반"되며, 핵산 운반체에 의해 봉입될 수 있다.

일 실시양태는 핵산을 축합하기 위해서 그리고 핵산을 분해로부터 보호하는 나노입자 조성물로 자가 조립하기 위해서 아민 및 소수성 테일부를 사용하여 변형된 바와 같이 빌딩 블록으로서 폴리에스테르 덴드론(이의 비제한적인 예는 2,2-비스메틸올프로피온산(bis-MPA) 단량체 기반 덴드론임)을 포함한다. 일 실시양태에서, 덴드론은 핵산을 세포로 운송할 수 있다.

일 실시양태는 하기 화학식 Ia, Ib, Ic, Id, Ie 또는 If를 갖는 핵산 운반체를 포함한다:

화학식 Ia,

화학식 Ib,

화학식 Ic,

화학식 Id,

화학식 Ie, 또는

화학식 If

식 중, PE는 코어, 및 나무 유사 구조를 형성하기 위해 코어 주위에 층을 이룬 단량체 폴리에스테르 단위를 포함하는 폴리에스테르 덴드론이며, 여기서 각 층은 세대(G)로 불리고, A는 아민이며, B는 소수성 단위이고, z는 표면 기의 수이다.

PE는 하기 화학식 II를 가질 수 있다:

화학식 II

식 중, G는 덴드론의 층 또는 세대이고, n은 값이 1 내지 10 범위인 세대 수이며, 단량체 폴리에스테르 단위는 2,2-비스(하이드록시메틸) 프로피온산 또는 2,2-비스(하이드록시메틸)부티르산일 수 있지만, 이에 국한되는 것이 아니다. Z는 하기 화학식 III을 갖는다:

z = bⁿ 화학식 III

식 중, b는 분기점 다중도 또는 각 분기점에서의 분기의 수이고, n은 세대 수이다.

단량체 폴리에스테르 단위로서 2,2-비스(하이드록시메틸)프로피온산 또는 2,2-비스(하이드록시메틸)부티르산을 포함하는 핵산 운반체에서, 분기점 다중도 또는 각 분기점에서의 분기의 수, b는 2이다.

코어의 구조는 아민 및/또는 결과로 생성되는 핵산 운반체의 전하 밀도, 직경 및 가요성에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 속성은 핵산 운반체의 물리화학적 특성, 핵산과 그의 상호작용, 및 유전자 전달 활성에 영향을 미칠 수 있다.

일 실시양태에서, 코어는 하기 스캐폴드로부터 선택될 수 있다:

식 중, A는 아민이고, B는 소수성 단위이다.

아민 A는 고립전자쌍(lone pair)을 갖는 하나 이상의 질소 원자를 함유함으로써 핵산 운반체 분자에 양성자 수용 작용가를 부여하는 모이어티이다. 따라서, 아민은 산성 조건 하에서 자유 양성자(H⁺)를 수용할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 질소 원자(들)은 이차 또는 삼차 아민의 형태로 존재한다. 아민은 하기와 같이 다음의 모이어티: 1-(2-아미노에틸)피페라진, 1-피페리딘에탄아민, 1-디메틸아미노-2-프로필아민, 1-(3-아미노프로필)피롤리딘, 1-(2-아미노에틸)피롤리딘, 1-(2-아미노에틸)피페리딘, 2-(1-피페라지닐)에틸아민, 2-(4-메틸피페라진-1-일)-에틸아민, 3-(디메틸아미노)-1-프로필아민, 3-(디에틸아미노)프로필아민, (4-아미노부틸)디메틸아민, 4-(1-피롤리디닐)-1-부틸아민, 4-모르폴린에탄아민, 4-모르폴린프로판아민, 4-메틸-1-피페라진에탄아민, 4-(디에틸아미노)부틸아민, N,N-디메틸에틸렌디아민, N,N-디메틸디프로필렌트리아민, N,N'-디메틸-N,N'-비스(3-메틸아미노프로필)트리메틸렌디아민, N1-(2-아미노에틸)-N1-메틸프로판-1,3-디아민, N1-(3-아미노프로필)-N1-메틸부탄-1,4-디아민, N1-(4-아미노부틸)-N1-메틸부탄-1,4-디아민, N1-(3-아미노프로필)프로판-1,3-디아민, N1-(3-아미노프로필)-N1-메틸프로판-1,3-디아민, 3-((3-아미노프로필)(메틸)아미노)프로판-1-올, 1-디메틸아미노-2-프로판올, 1-[비스[3-(디메틸아미노)프로필]아미노]-2-프로판올, 2-디메틸아미노에탄올, 2-(디에틸아미노)에탄올, 2-[2-(디메틸아미노)에톡시]에탄올, 2-(2-아미노에톡시)에탄올, 2-{[2-(디메틸아미노)에틸]메틸아미노}에탄올, 3-디메틸아미노-1-프로판올, 3-디에틸아미노-1-프로판올, 4-(디메틸아미노)-1-부탄올, 4-디에틸아미노-2-부틴-1-올, N-메틸디에탄올아민, 4-(디에틸아미노)부탄-1-올, 3-(아제티딘-1-일)프로판-1-올, 3-(피롤리딘-1-일)프로판-1-올, 3-(피페리딘-1-일)프로판-1-올, 4-(아제티딘-1-일)부탄-1-올, 4-(피롤리딘-1-일)부탄-1-올, 4-(피페리딘-1-일)부탄-1-올, 3-모르폴리노프로판-1-올, 4-모르폴리노부탄-1-올, 3-(4-메틸피페라진-1-일)프로판-1-올, 4-(4-메틸피페라진-1-일)부탄-1-올로부터 선택될 수 있다.

화학식 I의 소수성 단위 B는 PE 덴드론을 작용성 시약, 예컨대 지방산 또는 그의 유도체와 접촉시킴으로써 도입될 수 있다. 지방산은 C₄-C₂₈ 사슬을 갖는 포화 또는 불포화 지방산일 수 있다. 지방산은 아라키돈산, 올레산, 에이코사펜타노산, 라우르산, 카프릴산, 카프르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 또는 리놀렌산일 수 있지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 지방산 유도체는 12-하이드록시-9-시스-옥타데세노산, 12-메틸테트라데카노산, 12-메틸트리데카노산, 14-메틸헥사데카노산, 14-메틸헥사데카노산, 18-메틸노나데카노산, 19-메틸아라키드산, 이소팔미트산, 이소스테아르산, 피탄산, (±)-2-하이드록시옥타노산, (±)-3-하이드록시데카노산, (±)-3-하이드록시옥타노산, 10-하이드록시데카노산, 12-하이드록시옥타데카노산, 15-하이드록시펜타데카노산, 16-하이드록시헥사데카노산, 2-하이드록시헥사데카노산, 2-하이드록시테트라데카노산, 2-하이드록시도데카노산, DL-α-하이드록시스테아르산, DL-β-하이드록시라우르산, DL-β-하이드록시미리스트산, 또는 DL-β-하이드록시팔미트산일 수 있지만, 이에 국한되는 것이 아니다.

일 실시양태에서, 핵산 운반체는 시험관내 및 생체내에서 전달 물질을 추적하기에 적합한 작용기를 포함할 수 있다. 핵산 운반체는 탄소(C) 또는 수소(H)의 안정한 동위원소, 예컨대 ¹³C 또는 ²H(또한 본원에서 중수소, D 또는 d로서도 지칭됨)를 함유하는 지방산을 가질 수 있다. 핵산 운반체가 레플리콘 RNA와 같은 핵산을 갖는 나노입자로 제제화되는 경우, 나노입자는 질량 분석 또는 핵 자기 공명 영상과 같은 기법에 의해 투여 후 시험관내 및 생체내에서 추적될 수 있다. 안정한 동위원소의 함유는 전달 분자의 확인에 유익할 수 있는데, 그러한 동위원소가 조직에 농후한 ¹²C 및 ¹H 동위원소와 상이하기 때문이다. 추적은 투여 후 나노입자의 생체분포, 물질 클리어란스 및 분자 안정성, 및 관련 문제를 확인하는 데 유용할 수 있다. 동위원소로 표지화된 지방산은 옥타노산-1-¹³C, 옥타노산-8-¹³C, 옥타노산-8,8,8-²H3, 옥타노익-²H15 산, 데카노산-1-¹³C, 데카노산-10-¹³C, 데카노익-10,10,10-²H3 산, 데카노익-²H19 산, 운데카노산-1-¹³C, 라우르산-12,12,12-²H3, 라우릭-²H23 산, 라우르산-1-¹³C, 라우르산-1,12-¹³C2, 트리데카노익-2,2-²H2 산, 미리스트산-14-¹³C, 미리스트산-1-¹³C, 미리스트산-14,14,14-²H3, 미리스틱-d27 산, 팔미트산-1-¹³C, 팔미트산-16-¹³C, 팔미트산-16-¹³C,16,16,16-²H3, 팔미트산-²H31, 스테아르산-1-¹³C, 스테아르산-18-¹³C, 스테아르산-18,18,18-²H3, 스테아릭-²H35 산, 올레산-1-¹³C, 올레산-²H34, 리놀렌산-1-¹³C, 리놀레산-²H32, 아라키도닉-5,6,8,9,11,12,14,15-²H8 산, 또는 에이코사노익-²H39 산일 수 있지만, 이에 국한되는 것이 아니다.

일 실시양태에서, 본원에 기재된 핵산 운반체 중 어느 하나를 포함하는 나노입자 조성물이 제공된다. 본원의 나노입자 조성물은 세포 내로 제제를 도입하는 데 유용할 수 있다. 그 제제는 핵산일 수 있다. 본원에서 나노입자 조성물은 백신으로서 유용할 수 있다. 본원에서 나노입자 조성물은 치료적 제제로서 유용할 수 있다. 본원에서 나노입자 조성물은 형질감염제로서 유용할 수 있다. 본원에서 나노입자 조성물은 질환을 치료하거나 예방하는 방법에 유용할 수 있다.

일 실시양태에서, 나노입자 조성물은 핵산 운반체의 혼합물을 포함할 수 있다. 혼합물 내의 핵산 운반체 중 하나 이상은 혼합물 내의 다른 핵산 운반체와 비교하여 상이한 아민(들), 상이한 아민 밀도(들), 또는 상이한 측쇄(들) 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 이들 핵산 운반체는 혼합물에서 고정된 비율로 존재할 수 있다. 3개의 수지상 분자를 갖는 혼합물의 예의 경우, 제1 핵산 운반체 대 제2 핵산 운반체 및 제3 핵산 운반체의 비율은 i:j:k일 수 있으며, 여기서 i, j 및 k는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20, 또는 전술한 것 중 어느 2개 사이의 값으로부터 선택된다.

일 실시양태에서, 나노입자 조성물은 하나 이상의 치료적 또는 면역원성 핵산 제제를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산"은 임의의 천연 또는 합성 DNA 또는 RNA 분자, 또는 이의 하이브리드를 지칭한다. 핵산은 천연 및/또는 합성 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 핵산 분자는 항체, 호르몬, 또는 수용체와 같은 치료적 이익을 갖는 단백질을 코딩할 수 있다. 핵산 분자는 바이러스 또는 박테리아 병원체와 같은 질환으로부터, 또는 암 세포로부터 유래된 단백질 면역원을 코딩할 수 있다. 핵산 분자는, 단백질을 코딩하지 않고 그 대신에, 예를 들어 siRNA의 형태로, 세포 신호전달 또는 단백질 발현의 조절을 통해 생물학적 효과를 발휘할 수 있다.

일 실시양태에서, 치료적 또는 면역원성 핵산 제제는 RNA 또는 DNA 분자일 수 있다. 핵산 제제는 또한 하나 이상의 상이한 RNA 분자, DNA 분자, 또는 이 둘의 조합의 혼합물일 수 있다. 용어 "DNA" 또는 "DNA 분자" 또는 "데옥시리보핵산 분자"는 데옥시리보뉴클레오타이드의 중합체를 지칭한다. DNA 분자는 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, DNA, 또는 cDNA일 수 있다. DNA 분자는 야생형 또는 조작된 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 예컨대 항원을 코딩할 수 있다. 용어 "RNA" 또는 "RNA 분자" 또는 "리보핵산 분자"는 리보뉴클레오타이드의 중합체(예컨대, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30개 이상의 리보뉴클레오타이드)를 지칭한다. RNA 분자는 레플리콘 RNA(repRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), miRNA, 단일 가닥 가이드 RNA(sgRNA), 메신저 RNA(mRNA), 또는 트랜스퍼 RNA(tRNA)일 수 있다. 레플리콘 RNA(repRNA)는 감염성 자손 비리온을 생산할 수 없는 복제 적격, 자손 결함 RNA 바이러스 게놈을 지칭한다. repRNA로서 사용하기 위해 전형적으로 변형되는 바이러스 게놈은 "양성 가닥" RNA 바이러스를 포함한다. 그 변형된 바이러스 게놈은 mRNA 및 복제를 위한 주형으로서 둘 다 기능한다. 작은 간섭 RNA(siRNA)는 RNA 간섭을 지시하거나 매개할 수 있는 약 10-50개의 뉴클레오타이드(또는 뉴클레오타이드 유사체)를 포함하는 RNA(또는 RNA 유사체)를 지칭한다. 마이크로RNA(miRNA)는 코딩 mRNA의 안정성 및 번역 중 하나 또는 둘 다에 영향을 미침으로써 진핵생물에서 유전자 발현의 전사 후 조절에 관여하는 작은(20-24 nt) 조절 비코딩 RNA를 지칭한다. 메신저 RNA(mRNA)는 일반적으로 단일 가닥 RNA이며 하나 이상의 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열을 한정한다. 이 정보는 리보솜이 mRNA에 결합할 때 단백질 합성 동안 번역된다. DNA 또는 RNA 분자는 핵산 백본, 리보스 당 모이어티 및 핵염기 자체에서 화학적으로 변형될 수 있다.

RNA 분자는 모노시스트로닉 또는 폴리시스트로닉 mRNA일 수 있다. 모노시스트로닉 mRNA는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 코딩하는 하나의 서열만을 포함하는 mRNA를 지칭한다. 폴리시스트로닉 mRNA는 전형적으로 2 이상의 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 코딩하는 2 이상의 서열을 지칭한다. mRNA는 항원으로서 작용하는 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드를 코딩할 수 있다.

일 실시양태에서, DNA 분자는 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, DNA, 또는 cDNA일 수 있다. RNA 분자는 레플리콘 RNA(repRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), miRNA, 단일 가닥 가이드 RNA(sgRNA), 메신저 RNA(mRNA), 또는 트랜스퍼 RNA(tRNA)일 수 있다. 치료적 또는 면역원성 핵산 제제는 핵산 운반체에 비공유 결합되거나 공유 결합될 수 있다. 치료적 또는 면역원성 핵산 제제는 이온 결합을 통해 그 하전된 핵산 운반체에 정전기적으로 결합될 수 있다.

일 실시양태에서, 본원에 기재된 나노입자 조성물은 항원을 코딩하는 면역원성 또는 치료적 핵산 제제를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "캡슐화된"은 핵산(예컨대, 메신저 RNA)과 같은 활성제 또는 치료제를 전부 캡슐화, 일부 캡슐화, 또는 둘 다로 제공하는 나노입자를 지칭할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 핵산은 나노입자 내에 전부 캡슐화된다. 핵산 치료제의 문맥에서, 전부 캡슐화는 Ribogreen® 분석에 의해 결정될 수 있다. RiboGreen®은 용액 중의 올리고뉴클레오타이드 및 단일 가닥 DNA 또는 RNA를 정량하기 위한 초민감성 형광 핵산 염색제이다(미국 소재 Thermo Fisher Scientific으로부터 이용가능함).

본원에 사용된 바와 같이, "항원"은 면역 반응을 촉발하는 분자로서 정의된다. 면역 반응은 항체 생산, 또는 특정 면역 활성 세포의 활성화, 또는 둘 다를 수반할 수 있다. 항원은 단백질, 펩타이드, 또는 폴리펩타이드와 같은 거대분자를 포함하여, 면역 반응을 자극할 수 있는 임의의 분자를 지칭할 수 있다. 항원은 병원체의 구조적 성분, 또는 암세포일 수 있다. 항원은 합성될 수 있거나, 숙주에서 재조합 생산될 수 있거나, 또는 조직 샘플, 세포, 또는 생물학적 유체(이에 국한되는 것이 아님)를 포함하는 생물학적 샘플로부터 유도될 수 있다.

항원은 백신 항원, 기생충 항원, 박테리아 항원, 종양 항원, 환경 항원, 치료 항원 또는 알레르겐일 수 있지만, 이에 국한되는 것이 아니다. 본원에 사용된 바와 같이, 뉴클레오타이드 백신은 항원(들)을 전달함으로써 대상체의 체내에서 적응성 면역 반응을 자극할 수 있는 DNA 또는 RNA 기반 예방 또는 치료 조성물이다. 백신 접종에 의해 유도된 면역 반응은 전형적으로 면역학적 기억의 발달, 및 차후 항원 또는 감염원과의 접촉에 신속하게 대응하는 유기체의 능력을 결과적으로 얻게 한다.

핵산의 운반체로서 본원에서 "핵산 운반체"를 사용하는 것이 바람직하며, 이러한 이유로 "핵산 운반체"라는 명칭이 적용된다. 그러나, 실시양태들은 또한 본원의 핵산 운반체와 음전하 또는 부분 음전하를 함유하는 제제와의 조합을 포함한다. 제제는 약물일 수 있다.

일 실시양태에서, 나노입자 조성물은 음전하 또는 부분 음전하를 함유하는 약물을 포함하도록 제제화될 수 있다. 나노입자는 핵산 운반체에서 음전하와 양성자화 아민기의 양전하와의 정전기적 결합을 통해 제제화될 수 있다. 음전하를 띠는 약물은 이온성 약물일 수 있다. 용어 "이온성 약물"은 증류수의 용액에서 수용성이고 이온화가능한 전기적 비대칭성 분자를 지칭한다. 이온성 약물은 포스페이트, 포스포네이트, 또는 포스피네이트 작용기를 함유할 수 있다. 포스페이트기를 포함하는 약물은 포스페이트 함유 뉴클레오타이드 유사체, 예를 들어 암 치료 및 바이러스 화학요법에 사용되는 약물일 수 있다. 포스페이트 함유 약물은 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오사이드 유사체, 아라비노실시토신(ara-C), 아라-C 모노포스페이트(ara-CMP), 아지도티미딘(AZT), AZT 모노포스페이트(AZTMP), 2'3'-디데옥시시티딘(ddCD), 사이클릭 아데노사이드 모노포스페이트(cAMP), 테노포비르, 또는 아데포비르일 수 있지만, 이에 국한되는 것이 아니다.

일 실시양태에서, 본원에 기재된 나노입자 조성물은 하나 이상의 "지질 접합체(lipid conjugate)"를 포함할 수 있다. 지질 접합체는 입자의 응집을 방지하는 데 유용할 수 있다. 고려되는 지질 접합체는 PEG-지질 접합체를 포함하지만, 이에 국한되는 것이 아니다, PEG-지질 접합체는 지질에 커플링된 PEG(예컨대, DMG-PEG 2000 또는 ALC 0159), 인지질에 커플링된 PEG(예컨대, 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)), 콜레스테롤 또는 이의 유도체에 접합된 PEG, 및 이들의 혼합물일 수 있지만, 이에 국한되는 것이 아니다. 특정한 경우, PEG는 선택적으로 알킬, 알콕시, 아실, 또는 아릴 기에 의해 치환될 수 있다.

다양한 사슬 길이 및 포화도의 다양한 아실 사슬기를 갖는 포스파티딜에탄올아민은 PEG에 접합되어 지질 접합체를 형성할 수 있다. 포스파티딜에탄올아민은 상업적으로 이용가능하거나, 또는 종래 기법을 이용하여 단리 또는 합성될 수 있다. 포스파티딜에탄올아민은 C₁₀ 내지 C₂₀ 범위의 탄소 사슬 길이를 갖는 포화 또는 불포화 지방산을 포함할 수 있다. 포스파티딜에탄올아민은 단일- 또는 다중-불포화 지방산, 및 포화 지방산과 불포화 지방산의 혼합물을 포함할 수 있다. 고려되는 포스파티딜에탄올아민은 디미리스토일포스파티딜에탄올아민(DMPE), 디팔미토일-포스파티딜에탄올아민(DPPE), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 및 디스테아로일-포스파티딜에탄올아민(DSPE)을 포함하지만, 이에 국한되는 것이 아니다.

PEG 지질은 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체에 접합된 PEG를 포함할 수 있다. 콜레스테롤 유도체의 예는 콜레스타놀, 콜레스타논, 콜레스테논, 코프로스타놀, 콜레스테릴-2'-하이드록시에틸 에테르, 콜레스테릴-4'-하이드록시부틸 에테르, 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이에 국한되는 것이 아니다.

PEG는 2개의 말단 하이드록실기를 갖는 에틸렌 PEG 반복 단위의 선형 수용성 중합체이다. PEG는 이의 분자량에 의해 분류되며, 예를 들어 PEG 2000은 약 2,000 달톤의 평균 분자량을 갖고, PEG 5000은 약 5,000 달톤의 평균 분자량을 갖는다. PEG는 Avanti Polar Lipids로부터 상업적으로 이용가능하다. 본원에 기재된 PEG-지질 접합체 중 PEG 모이어티는 약 550 달톤 내지 약 10,000 달톤 범위의 평균 분자량을 포함할 수 있다.

나노입자 조성물에 포함된 PEG-지질의 크기, 상대적 양 및 분포는 나노입자 조성물의 물리적 특성에 영향을 미칠 수 있다. 제어될 수 있는 물리적 특성은 나노입자의 직경, 나노입자의 응집 성향, 각 나노입자 내부의 핵산 분자의 수, 또는 나노입자 조성물 내의 나노입자의 농도, 치료적 및 면역원성 핵산 제제의 세포내 전달의 효능, 및/또는 세포에 의한 나노입자의 흡수의 효능일 수 있지만, 이에 국한되는 것이 아니다. 마치 전부가 제시되어 있는 것처럼 본원에 참고로 포함되어 있는 문헌: a) PCT/US19/67402(Poulami Talukder, Jasdave S. Chahal, Justine S. McPartlan, Omar Khan, Karl Ruping. Nanoparticle Compositions for Efficient Nucleic Acid Delivery and Methods of Making and Using the Same; b) Mui, Barbara L et al. "Influence of Polyethylene Glycol Lipid Desorption Rates on Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of siRNA Lipid Nanoparticles." Molecular therapy. Nucleic acids vol. 2,12 e139. 17 Dec. 2013, doi:10.1038/mtna.2013.66)을 참조할 수 있다.

나노입자 조성물은 나노입자 조성물당 10 몰% 이하의 PEG-지질을 포함할 수 있다. 나노입자 조성물은 나노입자 조성물당 약 10 몰%, 약 9 몰%, 약 8 몰%, 약 7 몰%, 약 6 몰%, 약 5 몰%, 약 4 몰%, 약 3 몰%, 약 2 몰%, 또는 약 1 몰%, 또는 전술한 정수 중 어느 2개 사이의 임의의 양의 PEG-지질을 포함할 수 있다. PEG-지질을 포함하는 나노입자 조성물은 PEG-지질 결여된 조성물의 나노입자보다 더 작은 직경을 갖는 나노입자를 포함할 수 있다. 나노입자 조성물은 또한 PEG-지질 결여된 조성물의 나노입자보다 더 높은 나노입자의 응집 성향을 갖는 나노입자를 포함할 수 있다.

나노입자 조성물은 "양친매성 지질"을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "양친매성 지질"은 비극성 소수성 "테일부" 및 극성 "헤드부"를 갖는 임의의 물질을 지칭한다. 극성기는 포스페이트, 카르복실, 설파토, 아미노, 설프하이드릴, 니트로, 하이드록실, 또는 기타 유사기를 포함할 수 있다. 비극성기는 장쇄 포화 및 불포화 지방족 탄화수소기, 및 하나 이상의 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 또는 헤테로사이클기(들)에 의해 치환된 그러한 기를 포함할 수 있지만, 이에 국한되는 것이 아니다. 양친매성 지질의 예는 인지질, 아미노지질, 및 스핑고지질을 포함하지만, 이에 국한되는 것이 아니다. 인지질의 대표적인 예는 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티드산, 팔미토일올레로일 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜 콜린, 디올레오일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 및 디리노올레일포스파티딜콜린을 포함하지만, 이에 국한되는 것이 아니다.

나노입자 조성물은 나노입자 조성물당 양친매성 지질 10 몰% 내지 15 몰% 범위의 양으로 양친매성 지질을 포함할 수 있다.

일 실시양태에서, 나노입자 조성물은 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체를 포함할 수 있다. 콜레스테롤 유도체의 예는 콜레스테롤, 5,6-에폭시 콜레스테롤, 콜레스타논, 콜레스테논, 코프로스타놀, 콜레스테릴-2'-하이드록시에틸 에테르, 콜레스테릴-4'-하이드록시부틸 에테르, 24-에틸 콜레스테롤, 24-메틸 콜레스테롤, 콜렌산, 3-하이드록시-5-콜레스테노산, 콜레스테릴 팔미테이트, 콜레스테릴 아라키도네이트, 콜레스테릴 아라키데이트, 콜레스테릴 미리스테이트, 콜레스테릴 팔미톨레에이트, 콜레스테릴 리그노세레이트, 콜레스테릴 올레에이트, 콜레스테릴 스테아레이트, 콜레스테릴 에루케이트, 콜레스테롤 α-리놀레네이트, 콜레스테릴 리놀레에이트, 콜레스테릴 호모-γ-리놀레네이트, 4-하이드록시 콜레스테롤, 6-하이드록시 콜레스테롤, 7-하이드록시 콜레스테롤, 19-하이드록시 콜레스테롤, 20-하이드록시 콜레스테롤, 22-하이드록시 콜레스테롤, 24-하이드록시 콜레스테롤, 25-하이드록시 콜레스테롤, 27-하이드록시 콜레스테롤, 27-알킨 콜레스테롤, 7-케토 콜레스테롤, 7-데하이드로 콜레스테롤, 8-데하이드로 콜레스테롤, 24-데하이드로 콜레스테롤, 5α-하이드록시-6-케토 콜레스테롤, 20,22-디하이드록시 콜레스테롤, 7,25-디하이드록시 콜레스테롤, 7,27-디하이드록시 콜레스테롤, 7-케토-25-하이드록시 콜레스테롤, 푸코스테롤, 피토스테롤, 콜레스테릴 11,14-에이코사디에노에이트, 디메틸 하이드록시에틸 아미노프로판 카바모일 콜레스테롤 아이오다이드 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이에 국한되는 것이 아니다. 콜레스테롤 유도체는 만노스, 갈락토스와 같은 당 모이어티를 포함할 수 있다. 콜레스테롤 유도체는 당 모이어티 및/또는 아미노산, 예컨대 세린, 트레오닌, 리신, 히스티딘, 아르기닌 또는 이들의 유도체를 포함할 수 있다. 나노입자 조성물은 나노입자 조성물당 콜레스테롤 또는 이의 유도체 50 몰% 내지 75 몰% 범위의 양으로 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체를 포함할 수 있다.

일 실시양태에서, 나노입자 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 주제 화합물을 하나의 기관, 또는 신체의 부분으로부터 또 다른 기관, 또는 신체의 부분으로 운반하거나 수송하는 데 관여하는, 약제학적으로 허용가능한 물질, 조성물 또는 비히클, 예를 들어 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 제조 보조제(예컨대, 활택제, 탈크, 마그네슘, 칼슘 또는 아연 스테아레이트, 또는 스테아르산), 또는 용매 캡슐화 물질을 의미한다. 각각의 약제학적으로 허용가능한 담체는 제제의 다른 성분과 상용성이 있고 환자에게 해롭지 않다는 의미에서 "허용가능"하다. 약제학적으로 허용가능한 담체로서의 역할을 할 수 있는 물질의 일부 예는 (1) 당류, 예를 들어 락토스, 글루코스, 만노스 및/또는 수크로스; (2) 전분, 예를 들어 옥수수 전분 및/또는 감자 전분; (3) 셀룰로스, 및 그의 유도체, 예를 들어 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 미결정 셀룰로스 및/또는 셀룰로스 아세테이트; (4) 분말 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 활택제, 예를 들어 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 라우릴 설페이트 및/또는 탈크; (8) 부형제, 예를 들어 코코아 버터 및/또는 좌약 왁스; (9) 오일, 예를 들어 땅콩 오일, 목화씨 오일, 홍화 오일, 참기름, 올리브 오일, 옥수수 오일 및/또는 대두 오일; (10) 글리콜, 예를 들어 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예를 들어 글리세린, 소르비톨, 및/또는 만니톨; (12) 에스테르, 예를 들어 글리세라이드, 에틸 올레에이트 및/또는 에틸 라우레이트; (13) 한천; (14) 완충제, 예를 들어 수산화마그네슘 및/또는 수산화알루미늄; (15) 알긴산; (16) 무발열원 수; (17) 희석제, 예를 들어 등장성 식염수, 및/또는 PEG400, (18) 링거액; (19) C2-C12 알콜, 예를 들어 에탄올; (20) 지방산; (21) pH 완충 용액; (22) 증량제, 예를 들어 폴리펩타이드 및/또는 아미노산; (23) 혈청 성분, 예를 들어 혈청 알부민, HDL 및 LDL; (24) 계면활성제, 예를 들어 폴리소르베이트(Tween 80) 및/또는 폴록사머; 및/또는 (25) 약제학적 제제에 사용되는 다른 비독성의 상용성 물질: 예를 들어, 충전제, 결합제, 습윤제, 착색제, 이형제, 코팅제, 감미제, 착향제, 항료 제제, 보존제 및/또는 항산화제를 포함한다. 용어 "부형제", "담체", "약제학적으로 허용가능한 담체" 등은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.

일 실시양태는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위한 방법을 포함한다. 방법은 본원에 기재된 나노입자 조성물 중 어느 하나를 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 치료적 유효량의 나노입자 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료적 유효량"은 원하는 치료 효과를 생성하는 데 효과적인 나노입자 조성물의 양을 지칭한다. 치료 효과는 동물에서 세포의 적어도 하위집단에서 나타날 수 있다. 치료 효과는 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 이익/위험 비율로 달성될 수 있다. "치료적 유효량"은 혈청에서 항원 특이적 항체의 출현을 발생시키기에 충분한 양을 지칭할 수 있다. "치료적 유효량"은 질환 증상의 감소를 유도하기에 충분한 양을 지칭할 수 있다. "치료적 유효량"은 질환 증상의 소멸을 유도하기에 충분한 양을 지칭할 수 있다. 바이러스 감염을 치료할 때, 질환 증상의 감소는 대변, 체액, 또는 분비물에서 바이러스의 감소에 의해 평가될 수 있다. 나노입자 조성물은 면역 반응을 발생시키기에 효과적인 양을 사용하고 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 나노입자 조성물은 면역 반응을 조절하는 데 효과적인 양을 사용하고 및 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 나노입자 조성물은 면역 관용을 유도하기 위해, 즉 코딩된 항원에 대한 대상체의 면역 반응을 감소시키기 위해 투여될 수 있다. 예를 들어, 일 실시양태는 면역 관용을 유도하기 위해 나노입자 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있는 알레르기성 또는 자가면역 질환을 치료하는 방법을 포함한다.

치료 효능은 원하는 결과를 달성하는 데 필요한 활성제의 유효량 및 투여 시간에 따라 달라질 수 있다. 나노입자 조성물의 투여는 예방 수단일 수 있다. 나노입자 조성물의 투여는 특히 약한 면역 체계를 갖는 환자, 노인 또는 영유아에서 면역의 느린 발달과 관련된 합병증을 최소화하기 위해, 감염원에 대한 면역성을 촉진하는 치료 수단일 수 있다.

정확한 투여량은 다양한 인자에 기초하여 그리고 개별 환자에 비추어 임상의에 의해 선택될 수 있다. 투여량 및 투여는 충분한 수준의 활성제(들)을 제공하거나 원하는 효과를 유지하기 위해 조정될 수 있다. 예를 들어, 고려될 수 있는 인자는 질환의 유형 및 중증도; 환자의 연령 및 성별; 약물 조합; 및 요법에 대한 개별 반응을 포함할 수 있다.

나노입자 조성물에서 활성제의 치료 효능 및 독성은 표준 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있으며, 예를 들어 시험관내에서 배양된 세포 또는 실험 동물에서 집단의 50%에서의 치료적 유효 용량(ED50) 및 집단의 50%에 대한 치사 용량(LD50)을 결정함으로써 결정될 수 있다. 나노입자 조성물은 치료 지수라고 칭하는 독성 효과 대 치료 효과의 용량 비율(LD50/ED50)에 기초하여 평가될 수 있으며, 큰 값은 평가에 사용될 수 있다. 세포 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 인간 사용을 위한 투여량을 제제화하는 데 사용될 수 있다.

치료적 유효 용량은 세포 배양 분석으로부터 초기에 추정될 수 있다. 치료적 유효 용량은 세포 배양에서 결정된 바와 같이 IC50(즉, 증상의 절반 최대 억제를 달성하는 치료제의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위해 동물 모델에서 제제화될 수 있다. 혈장 내 농도는, 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다. 임의의 특정 투여량의 효과는 적합한 생물분석에 의해 모니터링될 수 있다.

투여되는 나노입자 제제의 양은 사용되는 특정 치료제(예컨대, 핵산), 치료 중인 질환 또는 장애, 환자의 연령, 체중, 및 상태, 및 임상의의 판단에 따라 달라질 것이다. 치료적 유효 용량은 대상체의 체중의 킬로그램당 치료적 또는 면역원성 핵산 0.001 ng 내지 50 mg일 수 있다. 치료적 유효 용량은 대상체의 체중의 킬로그램당 치료적 또는 면역원성 핵산 0.001 ng, 0.002 ng, 0.003 ng, 0.004 ng, 0.005 ng, 0.006 ng, 0.007 ng, 0.008 ng, 0.009 ng, 0.01 ng, 0.02 ng, 0.03 ng, 0.04 ng, 0.05 ng, 0.06 ng, 0.07 ng, 0.08 ng, 0.09 ng, 0.1 ng, 0.2 ng, 0.3 ng, 0.4 ng, 0.5 ng, 0.6 ng, 0.7 ng, 0.8 ng, 0.9 ng, 0.001 μg, 0.002 μg, 0.003 μg, 0.004 μg, 0.005 μg, 0.006 μg, 0.007 μg, 0.008 μg, 0.009 μg, 0.01 μg, 0.02 μg, 0.03 μg, 0.04 μg, 0.05 μg, 0.06 μg, 0.07 μg, 0.08 μg, 0.09 μg, 0.1 μg, 0.2 μg, 0.3 μg, 0.4 μg, 0.5 μg, 0.6 μg, 0.7 μg, 0.8 μg, 0.9 μg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg, 13 mg, 14 mg, 15 mg, 16 mg, 17 mg, 18 mg, 19 mg, 20 mg, 21 mg, 22 mg, 23 mg, 24 mg, 25 mg, 26 mg, 27 mg, 28 mg, 29 mg, 30 mg, 31 mg, 32 mg, 33 mg, 34 mg, 35 mg, 36 mg, 37 mg, 38 mg, 39 mg, 40 mg, 41 mg, 42 mg, 43 mg, 44 mg, 45 mg, 46 mg, 47 mg, 48 mg, 49 mg, 또는 50 mg, 또는 전술한 것 중 어느 2개 사이의 범위 내의 값일 수 있다. 치료적 및 면역원성 핵산은 치료 용량당 사용되는 상이한 핵산의 조합일 수 있다. 용어 "대상체" 및 "개체"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 인간 또는 동물을 의미한다. 바람직하게는, 동물은 척추동물, 예컨대 영장류, 설치류, 가축 또는 게임 동물이다. 영장류는 침팬지, 시노몰구스 원숭이, 거미 원숭이, 및 마카크, 예컨대 레서스(Rhesus)를 포함한다. 설치류는 마우스, 래트, 기니피그, 우드척, 페럿, 토끼 및 햄스터로부터 선택될 수 있다. 가축 또는 게임 동물은 소, 말, 돼지, 사슴, 들소, 버팔로, 고양이 종, 예컨대 집 고양이, 개 종, 예컨대 개, 여우, 늑대, 조류 종, 예컨대 닭, 에뮤(emu), 타조, 및 어류, 예컨대 송어, 메기 및 연어를 포함한다. 환자 또는 대상체는 전술한 것 또는 전술한 것의 하위집합으로부터 선택될 수 있다. 환자 또는 대상체는 상기 모두로부터 선택될 수 있지만, 인간, 영장류 또는 설치류와 같은 하나 이상의 군 또는 종을 제외할 수 있다. 일 실시양태에서, 환자 또는 대상체는 포유류, 예컨대 영장류, 예컨대 인간일 수 있다. 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.

바람직하게는, 대상체는 포유동물이다. 포유동물은 인간, 비인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 돼지, 말, 또는 소일 수 있지만, 이러한 예에 제한되지 않는다. 인간 이외의 포유동물은 질환 또는 장애의 동물 모델을 대표하는 대상체일 수 있다. 또한, 본원에 기재된 방법은 가축 및/또는 애완동물을 치료하는 것에 관한 것일 수 있다. 대상체는 수컷 또는 암컷일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "투여하다", "투여하는", "투여" 등은 조성물을 대상체 내로 배치하는 것을 지칭한다. 투여는 원하는 효과가 생성되도록 원하는 부위에 조성물의 적어도 부분적인 국소화를 결과로 유도하는 방법 또는 경로에 의해 이루어질 수 있다. 본원에 기재된 나노입자 조성물은 정맥내, 근육내, 피하, 경피, 기도(에어로졸), 폐, 비강, 직장, 또는 국소(협측 및 설하 포함) 투여를 포함하는, 경구 또는 비경구 경로(이에 국한되는 것이 아님)를 포함하는 당업자에게 공지된 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다.

예시적인 투여 방식은 주사, 주입, 점적, 흡입, 또는 섭취를 포함하지만, 이에 국한되는 것이 아니다. "주사"는 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 심실내, 피막내, 안구내, 심장내, 피내, 복강내, 기관경, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척추내, 뇌척수강내, 및 뇌간내 주사 및 주입을 포함하지만, 이에 국한되는 것이 아니다. 일 실시양태에서, 조성물은 정맥 주입 또는 주사에 의해 투여될 수 있다.

나노입자 조성물은 유전자 발현을 조절하는 치료적 DNA 또는 RNA의 전달에 사용될 수 있다. 치료적 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AON) 또는 이중 가닥 작은 간섭 RNA(siRNA)일 수 있다. 전형적으로, siRNA는 21 내지 23개의 뉴클레오타이드 길이이다. siRNA는 숙주 세포 내에서 발현될 때 표적 유전자의 mRNA 전사체에 함유된 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 모르폴리노 안티센스 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표적 유전자의 mRNA 전사체에 함유된 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 치료적 또는 면역원성 핵산은 특정 표적 유기체 내의 특정 표적 유전자에 대한 간섭 RNA(iRNA)일 수 있다. iRNA는 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현 또는 번역의 서열 특이적 침묵을 유도하여, 유전자 발현을 하향조절하거나 방지할 수 있다. iRNA는 표적 유전자의 발현을 완전 억제할 수 있다. iRNA는 처리되지 않은 대조군과 비교하여 표적 유전자의 발현 수준을 감소시킬 수 있다. 치료적 또는 면역원성 핵산은 마이크로 RNA(miRNA)일 수 있다. miRNA는 짧은 RNA, 예컨대 헤어핀 RNA(hpRNA)일 수 있다. miRNA는 내인성 세포 효소의 활성에 의해 표적 세포 내에서 생물학적으로 활성인 dsRNA로 절단될 수 있다. RNA는 이중 가닥 RNA(dsRNA)일 수 있다. ds RNA는 적어도 25개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. dsRNA는 표적 유전자 또는 유전자들의 서열에 상보적인 서열을 함유할 수 있다.

일 실시양태에서, 치료적 또는 면역원성 핵산은 표적 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자의 활성 또는 합성을 전부 또는 일부 감소, 억제, 간섭 또는 조절하는 제제일 수 있거나 이를 코딩할 수 있다. 표적 유전자는 숙주 유기체의 게놈에 포함된 임의의 유전자일 수 있다. 치료적 또는 면역원성 핵산의 서열은 표적 유전자의 핵산 서열에 100% 상보적이거나 동일하지 않을 수 있다.

일 실시양태에서, 나노입자 조성물은 대상체에서 유전 정보의 표적화된 특이적 변경에 사용될 수 있다. 일 실시양태는 본원의 나노입자 조성물의 투여를 포함하는, 대상체에서 치료적 또는 면역원성 영향을 미치기에 충분한 유전 정보의 표적화된 특이적 변경을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변경"은 대상체의 세포 내의 게놈에서의 임의의 변화를 지칭한다. 변경은 표적 유전자의 서열에서의 뉴클레오타이드의 삽입 또는 결실일 수 있다. "삽입"은 표적 유전자의 서열에 하나 이상의 뉴클레오타이드를 추가하는 것을 지칭한다. 용어 "결실"은 표적 유전자의 서열에서의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 손실 또는 제거를 지칭한다. 변경은 표적 유전자의 서열의 수정일 수 있다. "수정"은, 예컨대 삽입, 결실 또는 치환에 의한 표적 유전자의 서열에서의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 변경을 지칭하며, 이는 숙주 유기체의 유전자형 및/또는 표현형의 개선에 의해 나타난 유전자의 더 유리한 발현을 결과로 유도할 수 있다.

유전 정보의 변경은 게놈 편집 기법을 통해 달성될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "게놈 편집"은 게놈에서의 뉴클레오타이드 서열을 정밀하거나 제어된 방식으로 변형하는 과정을 지칭한다.

예시적인 게놈 편집 시스템은, 예를 들어, 2018년 8월 30일에 공개되고 마치 전부가 제시되어 있는 것처럼 본원에 참고로 포함되어 있는 WO 2018/154387에 기재된 바와 같이 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)이다. 일반적으로 "CRISPR 시스템"은 Cas 유전자를 코딩하는 서열, tracr(트랜스 활성화 CRISPR) 서열, tracr-mate 서열, 가이드 서열, 또는 CRISPR 유전자좌로부터의 다른 서열 및 전사체를 포함하는 CRISPR 관련(Cas) 유전자의 발현에 관여하는 전사체 및 기타 요소를 지칭한다. 하나 이상의 tracr mate 서열은 가공 전의 가이드 서열 또는 뉴클레아제에 의한 처리 후 crRNA에 작동가능하게 연결될 수 있다. tracrRNA 및 crRNA는 연결될 수 있고, 키메라 crRNA-tracrRNA 하이브리드를 형성할 수 있으며, 여기서 성숙한 crRNA는 합성 줄기 루프를 통해 부분적인 tracrRNA에 융합되어, 마치 전부가 제시되어 있는 것처럼 본원에 참조로 포함되어 있는 문헌[Cong et al., Science, 15:339(6121):819-823 (2013) 및 Jinek et al., Science, 337(6096):816-21 (2012)]에 기재된 바와 같이 천연 crRNA:tracrRNA 이합체를 모방하게 된다. 단일 융합된 crRNA-tracrRNA 작제물은 또한 본원에서 가이드 RNA 또는 gRNA, 또는 단일 가이드 RNA(sgRNA)로서도 지칭된다. sgRNA 내에서, crRNA 부분은 "표적 서열"로서 식별되며, tracrRNA는 자주 "스캐폴드"로서 지칭된다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 나노입자 조성물은 sgRNA를 전달하는 데 사용될 수 있다.

일 실시양태에서, 나노입자 조성물은 메가 뉴클레아제, 호밍 엔도뉴클레아제, TALEN 기반 시스템, 또는 아연 핑거 뉴클레아제를 포함하는 다른 예시적인 게놈 편집 시스템을 적용하는 데 사용될 수 있다. 나노입자 조성물은 이들 유전자 편집 도구에 대한 서열을 코딩하는 핵산(RNA 및/또는 DNA), 및 실제 유전자 산물, 단백질, 또는 기타 분자를 전달하는 데 사용될 수 있다.

일 실시양태에서, 나노입자 조성물은, 예컨대 대상체로부터 세포를 단리하고, 유전자를 편집하고, 편집된 세포를 대상체 내로 다시 이식함으로써, 생체내 또는 생체외에서 대상체에서 유전자 표적화를 위해 사용될 수 있다. 일 실시양태는 대상체로부터 단리된 세포에 본원의 나노입자 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 방법은 유전자 표적화를 포함할 수 있다. 방법은 편집된 세포를 대상체 내로 다시 이식하는 단계를 포함할 수 있다.

일 실시양태는 세포 내로 제제를 도입하기 위한 방법을 포함한다. 방법은 세포를 본원의 나노입자 조성물에 노출시키는 단계를 포함할 수 있다. 제제는 핵산일 수 있다. 방법은 제제가 핵산인 경우 형질감염의 방법일 수 있다.

실시양태 목록 - 하기 목록은 실시양태의 비제한적인 목록이며, 본원에 달리 설명되거나 예시된 실시양태를 제한하지 않는다. 이 목록 내의 실시양태는 본원의 임의의 다른 실시양태 또는 실시예로부터의 하나 이상의 요소로 보충될 수 있다. 이 목록 내의 일 실시양태에서의 요소는 본원의 임의의 다른 실시양태 또는 실시예로부터의 하나 이상의 요소에 의해 대체될 수 있다.

1. 하기 화학식 Ia, Ib, Ic, Id, Ie 또는 If의 덴드론 또는 덴드리머를 포함하는 핵산 운반체:

화학식 Ia,

화학식 Ib,

화학식 Ic,

화학식 Id,

화학식 Ie, 또는

화학식 If

식 중, PE는 코어, 및 하나 이상의 세대를 형성하는 복수의 단량체 폴리에스테르 단위를 포함하는 폴리에스테르 덴드론이고, A는 아민이며, B는 소수성 단위이고, z는 표면 기의 수이다.

2. 실시양태 1에 있어서, PE는 하기 화학식 II를 갖는 것인 핵산 운반체:

화학식 II

식 중, G는 덴드론의 층 또는 세대이고, n은 세대 수이며 1 내지 10의 범위이다.

3. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 복수의 단량체 폴리에스테르 단위는 2,2-비스(하이드록시메틸)프로피온산 또는 2,2-비스(하이드록시메틸)부티르산을 포함하며, 바람직하게는, 복수의 단량체 폴리에스테르 단위 모두는 2,2-비스(하이드록시메틸)프로피온산 또는 2,2-비스(하이드록시메틸)부티르산인 핵산 운반체.

4. 실시양태 1 내지 3 중 어느 한 실시양태에 있어서, z는 하기 화학식 III을 갖는 것인 핵산 운반체:

z = bⁿ 화학식 III

식 중, b는 분기점 다중도 또는 각 분기점에서의 분기의 수이고, n은 세대 수이며 1 내지 10의 범위이다.

5. 실시양태 1 내지 4 중 어느 한 실시양태에 있어서, A는 1-(2-아미노에틸)피페라진, 1-피페리딘에탄아민, 1-디메틸아미노-2-프로필아민, 1-(3-아미노프로필)피롤리딘, 1-(2-아미노에틸)피롤리딘, 1-(2-아미노에틸)피페리딘, 2-(1-피페라지닐)에틸아민, 2-(4-메틸피페라진-1-일)-에틸아민, 3-(디메틸아미노)-1-프로필아민, 3-(디에틸아미노)프로필아민, (4-아미노부틸)디메틸아민, 4-(1-피롤리디닐)-1-부틸아민, 4-모르폴린에탄아민, 4-모르폴린프로판아민, 4-메틸-1-피페라진에탄아민, 4-(디에틸아미노)부틸아민, N,N-디메틸에틸렌디아민, N,N-디메틸디프로필렌트리아민, N,N'-디메틸-N,N'-비스(3-메틸아미노프로필)트리메틸렌디아민, N1-(3-아미노프로필)프로판-1,3-디아민, N1-(3-아미노프로필)-N1-메틸프로판-1,3-디아민, 3-((3-아미노프로필)(메틸)아미노)프로판-1-올, 1-디메틸아미노-2-프로판올, 1-[비스[3-(디메틸아미노)프로필]아미노]-2-프로판올, 2-디메틸아미노에탄올, 2-(디에틸아미노)에탄올, 2-[2-(디메틸아미노)에톡시]에탄올, 2-(2-아미노에톡시)에탄올, 2-{[2-(디메틸아미노)에틸]메틸아미노}에탄올, 3-디메틸아미노-1-프로판올, 3-디에틸아미노-1-프로판올, 4-(디메틸아미노)-1-부탄올, 4-디에틸아미노-2-부틴-1-올, N-메틸디에탄올아민, 4-(디에틸아미노)부탄-1-올, 3-(아제티딘-1-일)프로판-1-올, 3-(피롤리딘-1-일)프로판-1-올, 3-(피페리딘-1-일)프로판-1-올, 4-(아제티딘-1-일)부탄-1-올, 4-(피롤리딘-1-일)부탄-1-올, 4-(피페리딘-1-일)부탄-1-올, 3-모르폴리노프로판-1-올, 4-모르폴리노부탄-1-올, 3-(4-메틸피페라진-1-일)프로판-1-올, 또는 4-(4-메틸피페라진-1-일)부탄-1-올인 핵산 운반체.

6. 실시양태 1 내지 5 중 어느 한 실시양태에 있어서, B는 지방산(C4-C28) 또는 이의 유도체로부터 유래되는 것인 핵산 운반체.

7. 실시양태 6에 있어서, 지방산은 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 아라키돈산, 및 에이코사펜타노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 핵산 운반체.

8. 실시양태 6에 있어서, 지방산 유도체는 12-하이드록시-9-cis-옥타데세노산, 12-메틸테트라데카노산, 12-메틸트리데카노산, 14-메틸헥사데카노산, 14-메틸헥사데카노산, 18-메틸노나데카노산, 19-메틸아라키드산, 이소팔미트산, 이소스테아르산, 피탄산, (±)-2-하이드록시옥타노산, (±)-3-하이드록시데카노산, (±)-3-하이드록시옥타노산, 10-하이드록시데카노산, 12-하이드록시옥타데카노산, 15-하이드록시펜타데카노산, 16-하이드록시헥사데카노산, 2-하이드록시헥사데카노산, 2-하이드록시테트라데카노산, 2-하이드록시도데카노산, DL-α-하이드록시스테아르산, DL-β-하이드록시라우르산, DL-β-하이드록시미리스트산, 및 DL-β-하이드록시팔미트산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 핵산 운반체.

9. 실시양태 6 내지 8 중 어느 한 실시양태에 있어서, 지방산 또는 유도체는 하나 이상의 안정한 동위원소를 포함하는 것인 핵산 운반체.

10. 실시양태 9에 있어서, 안정한 동위원소는 탄소 또는 수소의 안정한 동위원소인 핵산 운반체.

11. 실시양태 10에 있어서, 탄소의 안정한 동위원소는 ¹³C인 핵산 운반체.

12. 실시양태 10에 있어서, 수소의 안정한 동위원소는 ²H인 핵산 운반체.

13. 실시양태 10에 있어서, 안정한 동위원소를 포함하는 지방산은 옥타노산-1-13C, 옥타노산-8-13C, 옥타노산-8,8,8-d3, 옥타노익-2H15 산, 데카노산-1-13C, 데카노산-10-13C, 데카노익-10,10,10-d3 산, 데카노익-d19 산, 운데카노산-1-13C, 라우르산-12,12,12-2H3, 라우릭-2H23 산, 라우르산-1-13C, 라우르산-1,12-13C2, 트리데카노익-2,2-2H2 산, 미리스트산-14-13C, 미리스트산-1-13C, 미리스트산-14,14,14-2H3, 미리스틱-2H27 산, 팔미트산-1-13C, 팔미트산-16-13C, 팔미트산-16-13C,16,16,16-2H3, 팔미트산-2H31, 스테아르산-1-13C, 스테아르산-18-13C, 스테아르산-18,18,18-2H3, 스테아릭-2H35 산, 올레산-1-13C, 올레산-2H34, 리놀렌산-1-13C, 리놀레산-2H32, 아라키도닉-5,6,8,9,11,12,14,15-2H8 산, 및 에이코사노익-2H39 산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 핵산 운반체.

14. 실시양태 1 내지 13 중 어느 한 실시양태의 핵산 운반체, 및 그 내에 전부 또는 일부 캡슐화된 치료적 또는 면역원성 핵산 제제를 포함하는 나노입자 조성물.

15. 실시양태 14에 있어서, 치료적 또는 면역원성 핵산 제제는 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, DNA, cDNA, RNA, repRNA, siRNA, miRNA, sgRNA, 및 mRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 나노입자 조성물.

16. 실시양태 14에 있어서, 치료적 또는 면역원성 핵산 제제는 감염성 질환, 병원체, 암, 자가면역 질환 및 알레르기성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항원을 코딩하는 것인 나노입자 조성물.

17. 실시양태 14에 있어서, 치료적 또는 면역원성 핵산 제제는 유전자의 활성을 침묵, 억제 또는 변형시킬 수 있는 RNA 또는 DNA를 포함하는 것인 나노입자 조성물.

18. 실시양태 14 내지 17 중 어느 한 실시양태에 있어서, PEG-지질을 추가로 포함하는 나노입자 조성물.

19. 실시양태 18에 있어서, PEG-지질은 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] 또는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000인 나노입자 조성물.

20. 실시양태 18 또는 19에 있어서, 나노입자 조성물은 나노입자 조성물당 PEG-지질 1 몰% 내지 10 몰% 범위로 PEG-지질을 포함하는 것인 나노입자 조성물.

21. 실시양태 18 내지 20 중 어느 한 실시양태에 있어서, 인지질 및 콜레스테롤 또는 이의 유도체를 추가로 포함하는 나노입자 조성물.

22. 제21항에 있어서, 인지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE) 또는 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC)인 나노입자 조성물.

23. 실시양태 21 또는 22에 있어서, 나노입자 조성물은 나노입자 조성물당 인지질 10 몰% 내지 15 몰%의 범위로 인지질을 포함하는 것인 나노입자 조성물.

24. 실시양태 21 내지 23 중 어느 한 실시양태에 있어서, 나노입자 조성물은 나노입자 조성물당 콜레스테롤 또는 이의 유도체 50 몰% 내지 75 몰%의 범위로 콜레스테롤 또는 이의 유도체를 포함하는 것인 나노입자 조성물.

25. 대상체에서 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 실시양태 1 내지 24 중 어느 한 실시양태의 나노입자 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.

26. 실시양태 25에 있어서, 나노입자 조성물의 치료적 유효량은 대상체의 kg 체중당 핵산 0.01 mg 내지 핵산 10 mg의 범위로 치료적 또는 면역원성 핵산 제제를 포함하는 것인 방법.

27. 실시양태 25 또는 26에 있어서, 대상체는 포유동물인 방법.

28. 실시양태 25 내지 27 중 어느 한 실시양태에 있어서, 포유동물은 설치류, 개, 영장류, 말, 고가 농업용 동물, 및 인간으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.

실시예

하기의 비제한적인 실시예는 특정 실시양태를 예시하기 위해 제공된다. 전체 실시양태는 하기 하나 이상의 실시예로부터의 하나 이상의 상세내용으로 보충될 수 있고/있거나 실시양태로부터의 하나 이상의 요소는 하기 하나 이상의 실시예로부터의 하나 이상의 상세내용으로 대체될 수 있다.

이상적인 핵산 운반체는 생체축적 및 후속적인 세포독성을 방지하기 위해 생분해성일 수 있다. 높은 세대는 더 높은 패키징을 가지므로 생분해하기 어렵다. 생분해성을 유지하고 세포독성을 피하면서 핵산과 복합체화하고 세포막을 가로질러 이동할 수 있는 낮은 세대 덴드론이 필요하다.

실시예 1. 화학식 [I]a의 핵산 운반체

일 실시양태에서, 단량체 단위 상에 존재하는 화학 결합은 에스테르 결합이며, 낮은 세대 폴리에스테르 덴드론의 말단 층은 아미드 결합을 통해 아민으로 치환되었다. 이는 중심점에 아민 표면 기 및 친유성 단위를 갖는 계면활성제 유사 덴드론이 어떻게 자기 조립되고 이후 높은 친화력으로 핵산에 결합할 수 있는지에 대한 구조-활성 관계의 이해를 발전시킨다.

도식 1은 2세대 변형돤 폴리에스테르 덴드론 및 변형에 사용될 수 있는 아민(A)의 개략도이다. 이 도식에서, 알킬 사슬 B는 C₁₀ - C₂₈ 중 어느 하나로부터 선택될 수 있다. PE-덴드론-G2-헥사데실-프로필피롤리딘의 합성의 예는 다음과 같다.

합성 도식 1:

화합물 1: 헥사데실 아지드(MW: 267.2, 106 mg, 0.39 mmol)를 1 ml THF에 용해시키고, 50 ml 둥근 바닥 플라스크(RBF)에 취한 다음, THF(0.5 mL)에 용해된 알킨, PE-G2-아세틸렌-OH(80 mg, 0.2 mol)를 CuSO₄.5H₂O(7.8 mg, 0.031 mmol, 10 몰%) 및 아스코르브산 나트륨(12.3 mg, 0.062 mmol, 20 몰%), 및 탈기된 THF:H₂O(2 mL, 1:1)와 함께 첨가하였다. 반응 혼합물을 23℃에서 16시간 교반하였다. 다음날, 용매를 진공에서 제거하고, 40분 동안 100% CH₂Cl₂(이동상 a)부터 75:22:3 CH₂Cl₂/MeOH/NH₄OHaq(부피 기준, 이동상 b)까지의 구배 용출로 실리카 컬럼(24 g) 상에서 플래시 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 원하는 생성물이 65% 이동상 b에서 용출되어(1:1 이동상 a/이동상 b에서 Rf = 0.6) 수율 120 mg(90%)으로 황색 오일로서 원하는 생성물을 얻었다.

화합물 2: 화합물 1(120 mg, 0.18 mmol)을 건조 DCM 또는 CH₂Cl₂(3 mL)에 용해시키고, 피리딘(0.3 ml, 1.44 mmol)을 첨가한 후, 건조 DCM(5 mL)에 용해된 p-니트로페닐 클로로포르메이트(580 mg, 2.88 mmol, MW 201.6, 16 eq)를 첨가하였다. 다음날, 반응 혼합물을 1.33 M NaHSO₄로 희석하고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 염수로 세척하고, Rotavap에서 농축한 후, DCM/EtOAc를 사용한 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 화합물이 8.5% EtOAc/DCM에서 용출되었다(9:1 DCM/EtOAc에서 Rf = 0.7). 반응 수율 175 mg(74%). ¹H NMR (301 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 0.83 - 0.89 (m, 3 H), 1.20 - 1.35 (m, 40 H), 1.79 - 1.90 (m, 2 H), 2.02 - 2.04 (m, 3 H), 4.06 - 4.15 (m, 2 H), 4.26 - 4.45 (m, 13 H), 4.45 - 4.49 (m, 1 H), 5.25 - 5.30 (m, 2 H), 7.33 - 7.41 (m, 8 H), 7.57 - 7.61 (m, 1 H), 8.18 - 8.30 (m, 8 H).

¹³C NMR (76 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 14.09 (s, 1 C), 14.17 (s, 1 C), 17.58 (s, 1 C), 17.62 (s, 1 C), 21.03 (s, 1 C), 22.65 (s, 1 C), 26.45 (s, 1 C), 28.95 (s, 1 C), 29.31 (s, 1 C), 29.36 (s, 1 C), 29.49 (s, 1 C), 29.56 (s, 1 C), 29.61 (s, 1 C), 29.64 (s, 1 C), 30.22 (s, 1 C), 31.88 (s, 1 C), 46.53 (s, 1 C), 46.67 (s, 1 C), 50.44 (s, 1 C), 58.42 (s, 1 C), 60.37 (s, 1 C), 65.70 (s, 1 C), 69.08 (s, 1 C), 77.20 (s, 1 C), 121.75 (s, 1 C), 123.91 (s, 1 C), 125.26 (s, 1 C), 125.28 (s, 1 C), 125.30 (s, 1 C), 141.61 (s, 1 C), 145.54 (s, 1 C), 152.07 (s, 1 C), 155.17 (s, 1 C), 170.97 (s, 1 C), 172.01 (s, 1 C).

화합물 3: 건조 DCM(0.9 mL)에 용해된 화합물 2(90 mg, 0.07 mmol)의 용액을 건조 DCM(1 mL)에 용해된 과량의 아민, 1-(3-아미노프로필)피롤리딘(72 mg, 0.56 mmol)에 첨가하였다. 건조 DCM(1 mL) 중의 DMAP(17 mg, 0.28 mmol) 및 DIPEA(0.05 mmol, 0.56 mmol)의 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 아르곤 분위기 하에서 23℃에서 16시간 교반하였다. 다음날, 용매를 진공에서 제거하고, 40분 동안 100% CH₂Cl₂(이동상 a)부터 75:22:3 CH₂Cl₂/MeOH/NH₄OHaq(부피 기준, 이동상 b)까지의 구배 용출로 실리카 컬럼(24 g) 상에서 플래시 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 원하는 생성물이 80% 이동상 b에서 용출되어(Rf = 0.2(75:22:3 CH₂Cl₂/MeOH/NH₄OHaq)) 황색 오일(30 mg, 35%)로서 원하는 화합물을 얻었다. C₆₆H₁₁₆N₁₀O₁₅에 대한 MS (ESI): [M + H]⁺ m/z 1289.7(계산치), 1289.7(실험치).

실시예 2. 화학식 [I]b의 핵산 운반체

본 출원에서, 단량체 단위 상에 존재하는 화학 결합은 에스테르 결합이고, 중심점에 아민을 갖는 낮은 세대 폴리에스테르 덴드론의 말단층은 에스테르 결합을 통해 소수성 테일부에 의해 치환되었는데, 이는 전체 구조를 가수분해되기 쉽고 따라서 생분해성이 되도록 한다. 알킬 사슬을 갖는 이러한 낮은 세대 덴드론은 핵산과 비공유 결합하여 그의 동적 평형 성질을 통해 나노입자를 형성할 수 있다. 이는 중심점에 소수성 단위 표면 기(B) 및 아민(A)을 갖는 계면활성제 유사 덴드론이 어떻게 자기 조립되고 이후 높은 친화력으로 핵산에 결합할 수 있는지에 대한 구조-활성 관계의 이해를 발전시킨다. 본 실시예의 대표적인 구조가 하기 식으로 표시된다.

실시예 3. 화학식 [I]c의 핵산 운반체:

구조는 상이한 세대일 수 있는 2개의 공유 부착된 수지상 세그먼트를 포함하며, 선형 사슬은 수지상 세그먼트 중 하나에 부착되어 있다. 합성 전략은 구리 촉매화된 아지드-알킨 고리첨가(CuAAC) 반응의 화학선택성을 활용하였다. 중심점에 아지드 및 일차 아세틸렌을 갖는 2개의 개별 덴드론이 THF에서 효율적으로 커플링되었고, 여기서 하나의 덴드론은 주변부에 아민을 갖고, 다른 덴드론은 주변부에 소수성 테일부를 갖는다. 본 실시예의 대표적인 구조가 하기 식으로 표시된다.

또는

합성 도식 2:

화합물 4: 출발 물질인 PE 덴드론 G2 아세틸렌-OH(300 mg, 0.62 mmol)를 건조 DCM(6 mL)에 용해시키고, 피리딘(0.9 ml, 4.96 mmol)을 첨가한 후, 건조 DCM(15 mL)에 용해된 p-니트로페닐 클로로포르메이트(2.1 g, 10 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃ 내지 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 다음날, TLC는 생성물 형성을 보여준다. 반응 혼합물을 1.33 M NaHSO₄로 희석하고, EtOAc로 추출하였다. 유기층을 염수로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시키고, Rotavap에서 증발시켰다. 그 다음, 조 물질을 DCM/EtOAc를 이용한 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 화합물이 45% EtOAc에서 용출되기 시작하여(1:9 EtOAc/DCM에서 Rf = 0.9) 담황색 오일(553 mg, 70%)로서 원하는 생성물을 얻었다.

화합물 5: 건조 DCM(3 mL)에 용해된 화합물 4(150 mg, 0.14 mmol)의 용액을 건조 DCM(1 mL)에 용해된 과량의 NMe₂EDA(0.08 ml, 0.7 mmol)에 첨가하였다. 건조 DCM(1 mL) 중의 DMAP(34 mg, 0.28 mmol) 및 DIPEA(0.1 ml, 0.56 mmol)의 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 질소 분위기 하에서 23℃에서 16시간 교반하였다. 그 다음, 용매를 진공에서 제거하고, 24 g 컬럼 상에 로딩하고, 60% ultra/DCM에서 용출시켰다(75:22:3 CH₂Cl₂/MeOH/NH₄OHaq에서 실리카겔 TLC Rf = 0.25; 수율 120 mg(90%)). C₃₈H₆₈N₈O₁₄에 대한 MS (ESI): [M]+ m/z 861.00(계산치), 861.4(실험치).

화합물 6: PE-G2-아지드-OH(MW: 491.54, 54 mg, 114 μmol)를 50 ml RBF에 취한 다음, THF(0.6 mL)에 용해된 알킨(MW: 860, 98 mg, 114 μmol)을 CuSO₄.5H₂O(3 mg, 11.4 μmol, 10 몰%, MW 249.69) 및 아스코르브산 나트륨(4.5 mg, 22.8 μmol, 20 몰%, MW 198.11), 및 탈기된 THF:H₂O(2 mL, 1:1)와 함께 첨가하였다. 반응 혼합물을 23℃에서 16시간 교반하였다. 다음날, 용매를 진공에서 제거하고, 40분 동안 100% CH₂Cl₂(이동상 a)부터 75:22:3 CH₂Cl₂/MeOH/NH₄OHaq(부피 기준, 이동상 b)까지의 구배 용출로 실리카 컬럼(24 g) 상에서 플래시 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 원하는 생성물이 70% 이동상 b에서 용출되었다(이동상 b에서 실리카겔 TLC Rf = 0.2, 수율 120 mg(90%)). C₅₉H₁₀₅N₁₁O₂₄에 대한 MS (ESI): [M+H]⁺ m/z 1352.73(계산치), 1352.6(실험치).

화합물 7: 화합물 6(30 mg, 0.022 mmol)을 피리딘(2 ml)에 용해시켰다. 얼음 배쓰에서 아르곤으로 10분간 플러싱 후, 리놀레오일 클로라이드(0.04 ml, 0.11 mmol, 5.5 eq, MW 298, SD 0.93)를 적가하고, 0℃ 내지 23℃에서 16시간 동안 교반하였다. 다음날, 용매를 진공에서 제거하고, 40분 동안 100% CH₂Cl₂(이동상 a)부터 75:22:3 CH₂Cl₂/MeOH/NH₄OHaq(부피 기준, 이동상 b)까지의 구배 용출로 실리카 컬럼(24 g) 상에서 플래시 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 원하는 생성물이 90% 이동상 b에서 용출되었다(이동상 b에서 실리카겔 TLC Rf = 0.45); 수율 20 mg(36%). ¹H NMR (301 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 0.82 - 0.90 (m, 12 H), 1.12 - 1.16 (m, 6 H), 1.19 - 1.39 (m, 79 H), 1.50 - 1.67 (m, 9 H), 1.97 - 2.07 (m, 16 H), 2.16 - 2.24 (m, 24 H), 2.24 - 2.31 (m, 9 H), 2.37 - 2.45 (m, 6 H), 2.71 - 2.79 (m, 7 H), 3.18 - 3.28 (m, 6 H), 4.01 - 4.29 (m, 24 H), 4.32 - 4.39 (m, 1 H), 5.24 - 5.40 (m, 16 H), 5.59 - 5.70 (m, 2 H), 7.71 - 7.76 (m, 1 H). C₁₃₁H₂₂₅N₁₁O₂₈에 대한 MS (ESI): [M+2H]²⁺ m/z 1201.3(계산치), 1201.8(실험치).

합성 도식 3:

화합물 8: PE-G2-아지드-OH(250 mg, 0.51 mmol)를 건조 DCM(6 mL)에 용해시키고, 피리딘(0.9 ml, 11.2 mmol)을 첨가한 후, 건조 DCM(16 mL)에 용해된 p-니트로페닐 클로로포르메이트(1.6 g, 8.16 mmol, MW 201.6, 16 eq)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃ 내지 23℃에서 16시간 동안 교반하였다. 다음날, TLC는 생성물 형성을 보여준다. 반응 혼합물을 1.33M NaHSO₄로 희석하고, EtOAc로 추출하였다. 유기층을 염수로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시키고, Rotavap에서 증발시켰다. 그 다음, 조 물질을 DCM/EtOAc를 이용한 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 화합물이 4% EtOAc/DCM에서 용출되었다(Rf = 0.8(19:1 DCM/EtOAc)). 수율 135 mg(23%).

화합물 9: 건조 DCM(1 mL)에 용해된 화합물 8(135 mg, 0.117 mmol)의 용액을 건조 DCM(1 mL)에 용해된 과량의 NMe2EDA(0.077 ml, 0.7 mmol)에 첨가하였다. 건조 DCM(1 mL) 중의 DMAP(29 mg, 0.23 mmol) 및 DIPEA(0.08 ml, 0.46 mmol)의 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 아르곤 분위기 하에서 23℃에서 16시간 교반하였다. 다음날, 용매를 진공에서 제거하고, 40분 동안 100% CH₂Cl₂(이동상 a)부터 75:22:3 CH₂Cl₂/MeOH/NH₄OHaq(부피 기준, 이동상 b)까지의 구배 용출로 실리카 컬럼(24 g) 상에서 플래시 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 원하는 생성물이 60% 이동상 b에서 용출되었다(이동상 b에서 실리카겔 TLC Rf = 0.35). 수율 70 mg(63%).

화합물 10: 화합물 9(70 mg, 0.074 mmol)를 50 ml RBF에서 취하고, 1 ml THF에 용해된 알킨(29.9 mg, 0.074 mmol)을 아지드에 첨가하고, CuSO₄.5H₂O(2 mg, 0.0074 mmol, 10 몰%)를 아스코르브산 나트륨(3 mg, 0.015 mmol, 20 몰%), 및 탈기된 THF:H₂O(2 mL, 1:1)와 함께 첨가하였다. 반응 혼합물을 23℃에서 16시간 교반하였다. 다음날, 용매를 진공에서 제거하고, 40분 동안 100% CH₂Cl₂(이동상 a)부터 75:22:3 CH₂Cl₂/MeOH/NH₄OHaq(부피 기준, 이동상 b)까지의 구배 용출로 실리카 컬럼(24 g) 상에서 플래시 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 원하는 생성물이 70% 이동상 b에서 용출되었다(이동상 b에서 실리카겔 TLC Rf = 0.25). 수율 50 mg(50%). C₅₉H₁₀₅N₁₁O₂₄에 대한 MS (ESI): [M+H]⁺ m/z 1352.73(계산치), 1352.6(실험치).

화합물 11: 화합물 10(50 mg, 0.036 mmol)을 피리딘(2 ml)에 용해시켰다. 얼음 배쓰에서 아르곤으로 10분간 플러싱 후, 리놀레오일 클로라이드(0.065 ml, 0.203 mmol, 5.5 eq, MW 298, SD 0.93)을 적가하고, 0℃ 내지 23℃에서 16시간 동안 교반하였다. 다음날, 용매를 진공에서 제거하고, 40분 동안 100% CH₂Cl₂(이동상 a)부터 75:22:3 CH₂Cl₂/MeOH/NH₄OHaq(부피 기준, 이동상 b)까지의 구배 용출로 실리카 컬럼(40 g) 상에서 플래시 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 원하는 생성물이 70% 이동상 b에서 용출되었다(이동상 b에서 실리카겔 TLC Rf = 0.85); 수율 30 mg(34%).¹H NMR (301 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 0.82 - 0.91 (m, 12 H), 1.14 - 1.41 (m, 84 H), 1.50 - 1.68 (m, 10 H), 1.96 - 2.07 (m, 15 H), 2.17 - 2.25 (m, 26 H), 2.26 - 2.31 (m, 6 H), 2.36 - 2.45 (m, 7 H), 2.70 - 2.79 (m, 7 H), 3.17 - 3.27 (m, 6 H), 4.07 - 4.24 (m, 22 H), 4.27 - 4.38 (m, 3 H), 5.22 - 5.41 (m, 16 H), 5.57 - 5.66 (m, 2 H), 7.65 - 7.69 (m, 1 H). C₁₃₁H₂₂₅N₁₁O₂₈에 대한 MS (ESI): [M+2H]²⁺ m/z 1201.3(계산치), 1201.8(실험치).

실시예 4. 화학식 [I]d의 핵산 운반체:

구조는 상이한 세대일 수 있는 2개의 공유 부착된 수지상 세그먼트를 포함하며, 선형 사슬은 수지상 세그먼트 중 하나에 부착되어 있다. 합성 전략은 또한 CuAAC 반응의 화학선택성을 활용하였다. 중심점에 아지드 및 일차 아세틸렌을 갖는 2개의 개별 덴드론이 THF에서 효율적으로 커플링되었다. 본원의 실시양태는 동일한 구조 내에 상이한 유형의 테일부의 도입을 허용한다. 본 실시예의 대표적인 구조가 하기 식으로 표시된다.

합성 도식 4:

화합물 12: 건조 DCM(6 mL)에 용해된 화합물 4(438 mg)의 용액을 건조 DCM(6 mL)에 용해된 과량의 모노-Boc-DAPMA(0.45 ML)에 첨가하였다. 건조 DCM(1 mL) 중의 DMAP(100 mg) 및 DIPEA(0.29 ml)의 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 아르곤 분위기 하에서 23℃에서 16시간 교반하였다. TLC는 반응이 완료되었음을 확인시켜 주었다. 조 생성물을 Rotavap에서 감압 하에 농축하고, 40분 동안 100% CH₂Cl₂(이동상 a)부터 75:22:3 CH₂Cl₂/MeOH/NH₄OHaq(부피 기준, 이동상 b)까지의 구배 용출로 실리카 컬럼 상에서 플래시 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 원하는 생성물이 45% 이동상 b에서 용출되어(1:1 이동상 a/이동상 b에서 Rf = 0.4), 담황색 오일(404 mg, 66%)로서 원하는 생성물을 얻었다.

화합물 13: PE-G2-아지드-OH(MW:491.54, 58 mg, 114 μmol)를 50 ml RBF에 취한 다음, THF(1 mL)에 용해된 화합물 12(MW:1475.82, 173 mg, 114 μmol)를 CuSO₄.5H₂O(3 mg, 0.011 mmol, 10 몰%, MW 249.69) 및 아스코르브산 나트륨(4.6 mg, 0.023 mmol, 20 몰%, MW 198.11), 및 탈기된 THF:H₂O(2 mL, 1:1)와 함께 첨가하였다. 반응 혼합물을 23℃에서 16시간 교반하였다. 다음날, TLC는 반응이 완료되었음을 확인시켜 주었다. 반응 혼합물을 40분 동안 100% CH₂Cl₂(이동상 a)부터 75:22:3 CH₂Cl₂/MeOH/NH₄OHaq(부피 기준, 이동상 b)까지의 구배 용출로 실리카 컬럼 상에서 플래시 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 원하는 생성물이 56% 이동상 b에서 용출되어(Rf = 0.4(75:22:3 CH₂Cl₂/MeOH/NH₄OHaq)), 황색 오일(140 mg, 60%)로서 원하는 생성물을 얻었다. C₉₁H₁₆₅N₁₅O₃₂에 대한 MS (ESI): [M+4H]⁴⁺ m/z 795.5(계산치), 794.9(실험치); [M+3H]³⁺ m/z 1059.96(계산치), 1060.2(실험치).

화합물 14: 화합물 13(137 mg, 0.069 mmol)을 피리딘(2 ml)에 용해시켰다. 얼음 배쓰에서 아르곤으로 10분간 플러싱 후, 리놀레오일 클로라이드(0.13 ml, 0.41 mmol, 6 eq, MW 298, SD 0.93)를 적가하고, 0℃ 내지 23℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 23℃에서 16시간 교반하였다. 다음날, TLC는 반응이 완료되었음을 확인시켜 주었다. 반응 혼합물을 Rotavap에서 증발시키고, 40분 동안 100% CH₂Cl₂(이동상 a)부터 75:22:3 CH₂Cl₂/MeOH/NH₄OHaq(부피 기준, 이동상 b)까지의 구배 용출로 실리카 컬럼 상에서 플래시 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 원하는 생성물이 50% 이동상 b에서 용출되어(Rf = 0.6(75:22:3 CH₂Cl₂/MeOH/NH₄OHaq), 황색 오일(100 mg, 48%)로서 원하는 생성물을 얻었다. C₁₆₃H₂₈₅N₁₅O₃₆에 대한 MS (ESI): [M + 2H]²⁺m/z 1515.5(계산치), 1516.1(실험치); [M + 3H]³⁺ m/z 1010.3(계산치), 1011.0(실험치); ¹H NMR (301 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 0.84 - 0.90 (m, 12 H), 1.11 - 1.36 (m, 91 H), 1.40 - 1.43 (m, 40 H), 1.52 - 1.70 (m, 26 H), 1.98 - 2.07 (m, 15 H), 2.16 - 2.29 (m, 20 H), 2.34 - 2.45 (m, 15 H), 2.70 - 2.78 (m, 6 H), 3.07 - 3.25 (m, 17 H), 4.01 - 4.25 (m, 26 H), 4.32 - 4.40 (m, 1 H), 5.27 - 5.43 (m, 19 H), 5.93 - 6.20 (m, 1 H), 7.71 - 7.77 (m, 1 H).

화합물 15(PE 덴드론-A1-리시놀레익.PE 덴드론-리놀레익): 화합물 14(0.033 mmol) 100 mg을 3 ml MeOH에 용해시킨 후 20 eq의 AcCl(0.047 ml, 0.66 mmol)으로 처리하고, 반응을 0℃ 내지 23℃에서 4시간 동안 교반하고, 건조 때까지 증발시키고, 조 생성물의 절반을 2 ml DMF에 용해시키고, 0.045 ml Et₃N(0.33 mmol)을 첨가한 후, 1 ml DMF에 용해된 리시놀레익-NHS(39 mg, 0.099 mmol)를 첨가하였다. 다음날, 반응 혼합물을 농축하고, 40분 동안 100% CH₂Cl₂(이동상 a)부터 75:22:3 CH₂Cl₂/MeOH/NH₄OHaq(부피 기준, 이동상 b)까지의 구배 용출로 실리카 컬럼 상에서 플래시 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 원하는 생성물이 45% 이동상 b에서 용출되어(Rf = 0.85(75:22:3 CH₂Cl₂/MeOH/NH₄OHaq)), 황색 오일(50 mg, 41%)로서 원하는 생성물을 얻었다. ¹H NMR (301 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 0.84 - 0.89 (m, 22 H), 1.06 - 1.17 (m, 14 H), 1.20 - 1.33 (m, 133 H), 1.41 - 1.46 (m, 13 H), 1.53 - 1.70 (m, 37 H), 1.98 - 2.07 (m, 22 H), 2.11 - 2.21 (m, 34 H), 2.23 - 2.32 (m, 7 H), 2.35 - 2.44 (m, 18 H), 2.71 - 2.78 (m, 4 H), 3.13 - 3.30 (m, 19 H), 3.55 - 3.63 (m, 5 H), 3.66 - 3.78 (m, 1 H), 4.02 - 4.39 (m, 27 H), 5.18 - 5.57 (m, 20 H), 6.17 - 6.28 (m, 2 H), 6.82 - 6.91 (m, 2 H), 7.70 - 7.80 (m, 1 H).

실시예 5. 화학식 [I]e의 핵산 운반체:

구조는 상이한 세대일 수 있는 2개의 공유 부착된 수지상 세그먼트를 포함하며, 선형 사슬은 수지상 세그먼트 중 하나에 부착되어 있다. 중심점에 아지드 및 일차 아세틸렌을 갖는 2개의 개별 덴드론이 커플링되어 이종작용성 수상 돌기 구조를 형성할 것이며, 하나의 세그먼트는 표면 상에 아민을 포함하도록 변형되는 반면, 다른 세그먼트는 아민 및 꼬리부 둘 다를 포함하도록 변형될 것이다. 본 발명은 동일한 구조 내에 상이한 유형의 아민의 도입을 허용하며, 여기서 하나의 아민은 핵산을 축합시킬 수 있는 반면, 다른 아민은 엔도솜 내부에 강력한 완충 능력 및 이에 따른 염산 및 물의 추가 유입을 가질 수 있으며, 이는 결국 페이로드의 엔도솜 파열을 유도한다. 본 실시예의 대표적인 구조가 하기 식으로 표시된다.

합성 도식 5:

화합물 16: 건조 DCM(0.5 mL)에 용해된 화합물 8(90 mg, MW 1151.95, 0.078 mmol)의 용액을 건조 DCM(1 mL)에 용해된 과량의 4-(2- 아미노에틸)모르폴린(80 mg, 0.992 g/ml, MW 130.19, 0.63 mmol, 8 eq)에 첨가하였다. 건조 DCM(1 mL) 중의 DMAP(19 mg, MW 122.17, 0.156 mmol, 2 eq) 및 DIPEA(0.312 mmol, MW 129.24, d 0.742 g/ml, 4 eq)의 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 23℃에서 아르곤 분위기 하에서 16시간 교반하였다. TLC는 반응이 완료되었음을 확인시켜 주었다. 조 생성물을 Rotavap에서 감압 농축하고, 40분 동안 100% CH₂Cl₂(이동상 a)부터 75:22:3 CH₂Cl₂/MeOH/NH₄OHaq(부피 기준, 이동상 b)까지의 구배 용출로 24 g 실리카 컬럼 상에서 플래시 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 원하는 생성물이 24% 이동상 b에서 용출되어(1:1 이동상 a/이동상 b에서 Rf = 0.7), 담황색 오일(79 mg, 91%)로서 원하는 생성물을 얻었다.

화합물 17: 화합물 16(MW:1116, 79 mg, 80 μmol)을 50 ml RBF에 취한 다음, THF(0.6 mL)에 용해된 알킨, PE-G2-아세틸렌-BocAmine1 또는 화합물 12(MW:1489, 105 mg, 70 μmol)를 CuSO₄.5H₂O(2 mg, 0.07 μmol, 10 몰%, MW 249.69) 및 아스코르브산 나트륨(3 mg, 14.8 μmol, 20 몰%, MW 198.11), 및 탈기된 THF:H₂O(2mL, 1:1)와 함께 첨가하였다. 반응 혼합물을 23℃에서 16시간 교반하였다. 다음날, TLC는 반응이 완료되었음을 확인시켜 주었다. 반응 혼합물을 40분 동안 100% CH₂Cl₂(이동상 a)부터 75:22:3 CH₂Cl₂/MeOH/NH₄OHaq(부피 기준, 이동상 b)까지의 구배 용출로 24 g 실리카 컬럼 상에서 플래시 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 원하는 생성물이 65% 이동상 b에서 용출되어(Rf = 0.2(2:1 이동상 b/이동상 a), 황색 오일(75 mg, 41%)로서 원하는 생성물을 얻었다. C₁₁₉H₂₁₃N₂₃O₄₀에 대한 MS (ESI): [M+3H]³⁺ m/z 869.4(계산치), 869.18(실험치).

화합물 18: 화합물 17(0.019 mmol) 50 mg을 3 ml MeOH에 용해시킨 후 20 eq의 (0.024 ml, 0.38 mmol)로 처리하고, 반응을 0℃ 내지 23℃에서 4시간 동안 교반하고, 건조 때까지 증발시키고, 조 생성물을 2 ml DMF에 용해시키고, Et₃N(0.053 ml, 0.38 mmol, MW 101.19, d 0.726)을 첨가한 후, 1 ml DMF에 용해된 리시놀레익-NHS(46 mg, 0.115 mmol, MW 395.27)를 첨가하였다. 다음날, 반응 혼합물을 농축하고, 40분 동안 100% CH₂Cl₂(이동상 a)부터 75:22:3 CH₂Cl₂/MeOH/NH₄OHaq(부피 기준, 이동상 b)까지의 구배 용출로 실리카 컬럼 상에서 플래시 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 원하는 생성물이 75% 이동상 b에서 용출되어(Rf = 0.55(75:22:3 CH₂Cl₂/MeOH/NH₄OHaq)), 황색 오일(50 mg, 41%)로서 원하는 생성물을 얻었다. C₁₇₁H₃₀₉N₂₃O₄₀에 대한 MS (ESI): [M+2H]²⁺ m/z 1664.6(계산치), 1664.4(실험치).

실시예 6. 화학식 [I]f의 핵산 운반체:

구조는 상이한 세대일 수 있는 2개의 공유 부착된 수지상 세그먼트를 포함하며, 선형 사슬은 수지상 세그먼트 중 하나에 부착되어 있다. 중심점에 각각 아지드 및 일차 아세틸렌을 갖는 2개의 개별 수상 돌기는 커플링되어 동종작용성 수상 돌기 구조를 형성할 것이다. 본 실시예의 대표적인 구조가 하기 식으로 표시된다.

또는

합성 도식 6:

화합물 19: PE-G1-아지드-OH(250 mg, 0.96 mmol, MW 259.3)를 건조 DCM(3 mL)에 용해시키고, 피리딘(0.6 ml, 7.68 mmol, 8 eq)을 첨가한 후, 건조 DCM(8 ml)에 용해된 p-니트로페닐 클로로포르메이트(525 mg, mmol, MW 201.6, 2.7 eq)를 첨가하고, 반응 혼합물을 0℃ 내지 23℃에서 16시간 동안 교반하였다. 다음날, TLC는 생성물 형성을 보여준다. 반응 혼합물을 1.33M NaHSO₄로 희석하고, EtOAc로 추출하였다. 유기층을 염수로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시키고, Rotavap에서 증발시켰다. 그 다음, 조 물질을 DCM/EtOAc를 이용한 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 화합물이 2% EtOAc/DCM에서 용출되었다(Rf = 0.8(19:1 DCM/EtOAc)). 수율 190 mg(33%).

화합물 20: 건조 DCM(0.5 mL)에 용해된 화합물 19(190 mg, 0.32 mmol, 589.51)의 용액을 건조 DCM(1 mL)에 용해된 과량의 BocAmine1(237 mg, 0.97 mmol, 3 eq)에 첨가하였다. 건조 DCM(1 mL) 중의 DMAP(79 mg, 0.64 mmol) 및 DIPEA(0.22 ml, 1.28 mmol, MW 129.24, d 0.742)의 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 아르곤 분위기 하에서 23℃에서 16시간 교반하였다. 다음날, 용매를 진공에서 제거하고, 40분 동안 100% CH₂Cl₂(이동상 a)부터 75:22:3 CH₂Cl₂/MeOH/NH₄OHaq(부피 기준, 이동상 b)까지의 구배 용출로 실리카 컬럼(24 g) 상에서 플래시 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 원하는 생성물이 40% 이동상 b에서 용출되었다(이동상 a/이동상 b에서 실리카겔 TLC Rf = 0.55). 수율 140 mg(54%).

화합물 21: PE-G1-아세틸렌-OH(641 mg, 3.73 mmol)를 건조 DCM(6 mL)에 용해시키고, (5.4 ml, 30 mmol)을 첨가한 후 건조 DCM(15 mL)에 용해된 p-니트로페닐 클로로포르메이트(2 g, 10 mmol, 2.7 eq)를 첨가하고, 반응 혼합물을 0℃ 내지 23℃에서 16시간 동안 교반하였다. 다음날, TLC는 생성물 형성을 보여준다. 반응 혼합물을 1.33 M NaHSO₄로 희석하고, EtOAc로 추출하였다. 유기층을 염수로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시키고, Rotavap에서 증발시켰다. 그 다음, 조 물질을 DCM/EtOAc를 이용한 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 화합물이 DCM에서 용출되었다(Rf = 0.7(19:1 DCM/EtOAc)). 수율 765 mg(41%).

화합물 22: 건조 DCM(3 mL)에 용해된 화합물 21(350 mg, 0.70 mmol, MW 502.4)의 용액을 건조 DCM(6 mL)에 용해된 과량의 BocAmine1(513 mg, 2.09 mmol, MW 245.4)에 첨가하였다. 건조 DCM(1 mL) 중의 DMAP(170 mg, 1.39 mmol) 및 DIPEA(0.49 ml, 2.8 mmol)의 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 아르곤 분위기 하에서 23℃에서 16시간 교반하였다. 다음날, 용매를 진공에서 제거하고, 40분 동안 100% CH₂Cl₂(이동상 a)부터 75:22:3 CH₂Cl₂/MeOH/NH₄OHaq(부피 기준, 이동상 b)까지의 구배 용출로 실리카 컬럼(40 g) 상에서 플래시 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 원하는 생성물이 50% 이동상 b에서 용출되었다(이동상 a/이동상 b에서 실리카겔 TLC Rf = 0.55). 수율 300 mg(60%).

화합물 23: 아지드, 화합물 20(MW:802.03, 70 mg, 0.087 몰)을 50 ml RBF에 취한 다음, THF(0.6 mL)에 용해된 알킨, 화합물 22(MW:742.48, 65 mg, 0.087 몰)를 CuSO4.5H₂O(7 mg, 30 몰%, MW 249.69) 및 아스코르브산 나트륨(11 mg, 60 몰%, MW 198.11), 및 탈기된 THF:H₂O(2 mL, 1:1)와 함께 첨가하였다. 반응 혼합물을 23℃에서 16시간 교반하였다. 다음날, 용매를 진공에서 제거하고, 40분 동안 100% CH₂Cl₂(이동상 a)부터 75:22:3 CH₂Cl₂/MeOH/NH₄OHaq(부피 기준, 이동상 b)까지의 구배 용출로 실리카 컬럼(24 g) 상에서 플래시 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 원하는 생성물은 65% 이동상 b에서 용출되었다(1:1 이동상 a/이동상 b에서 실리카겔 TLC Rf = 0.65). 수율 70 mg(50%). C₇₁H₁₃₃N₁₅O₂₀에 대한 MS (ESI): [M+2H]²⁺ m/z 759.0(계산치), 758.6(실험치).

화합물 24: 화합물 23(0.027 mmol) 70 mg을 3 ml MeOH에 용해시킨 후 20 eq의 AcCl(0.04 ml, 0.54 mmol)로 처리하고, 반응을 0℃ 내지 23℃에서 5시간 동안 교반하고, 건조 때까지 증발시키고, 조 생성물을 2 ml DMF에 용해시키고, Et₃N(0.08 ml, 0.54 mmol)을 첨가한 후, 1 ml DMF에 용해된 리시놀레익-NHS(64 mg, 0.16 mmol, 6 eq)를 첨가하였다. 다음날, 반응 혼합물을 농축하고, 40분 동안 100% CH₂Cl₂(이동상 a)부터 75:22:3 CH₂Cl₂/MeOH/NH₄OHaq(부피 기준, 이동상 b)까지의 구배 용출로 실리카 컬럼(24 g) 상에서 플래시 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 원하는 생성물이 74% 이동상 b에서 용출되어(Rf = 0.85(2:1 이동상 b/이동상 a)), 황색 오일(32 mg, 31%)로서 원하는 생성물을 얻었다. C₁₂₃H₂₂₉N₁₅O₂₀에 대한 MS (ESI): [M+2H]²⁺ m/z 1119.9(계산치), 1119.3(실험치); [M+3H]³⁺ m/z 746.6(계산치), 746.5(실험치).

합성 도식 7:

화합물 25: 아지드, PE-G1-아지드-OH(230 mg, 0.89 mol, MW 259.3)를 25 ml RBF에 취한 다음, THF(0.6 mL)에 용해된 알킨, PE-G2-아세틸렌-OH(327 mg, 0.80 mmol, MW 404.4)를 CuSO₄.5H₂O(22 mg, 10 몰%, MW 249.69, 사용된 35 mg) 및 아스코르브산 나트륨(35 mg, 20 mol%, MW 198.11: 첨가된 실제 50 mg), 및 탈기된 THF:H₂O(2 mL, 1:1)와 함께 첨가하고, 반응 혼합물을 23℃에서 16시간 교반하였다. 다음날, 용매를 진공에서 제거하고, 40분 동안 100% CH₂Cl₂(이동상 a)부터 75:22:3 CH₂Cl₂/MeOH/NH₄OHaq(부피 기준, 이동상 b)까지의 구배 용출로 실리카 컬럼(24 g) 상에서 플래시 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 원하는 생성물이 65% 이동상 b에서 용출되었다(1:1 이동상 a/이동상 b에서 실리카겔 TLC Rf = 0.60). 수율 398 mg(74%, MW 663.32). C₂₉H₄₉N₃O₁₄에 대한 MS (ESI): [M+H]⁺ m/z 663.3(계산치), 663.8(실험치).

화합물 26: 화합물 25(349 mg, 0.526 mmol)를 건조 DCM(8.5 mL)에 용해시키고, 여기에 피리딘(0.34 ml, 4.21 mmol, 8 eq)을 첨가하고, 드라이 아이스에서 냉각시키고, 건조 DCM(10 mL)에 용해된 p-니트로페닐 클로로포르메이트(1.7 g, 8.42 mmol, 201.5 MW)를 첨가하고, 반응 혼합물을 0℃에서 16시간 동안 교반하였다. 다음날, TLC는 생성물 형성을 보여주고, 1.33 M NaHSO₄ 및 염수로 세척하고, 증발시켰다. 그 다음, 로딩된 화합물을 DCM(A)/EtOAc(B)를 사용한 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 생성물이 2% EtOAc에서 용출되었다(Rf = 0.4(19:1 DCM/EtOAc). 수율 573 mg(66%).

화합물 27: 건조 DCM(1 mL)에 용해된 화합물 26(250 mg, 0.15 mmol)의 용액을 건조 DCM(1 mL)에 용해된 과량의 BocAmine1(223 mg, 0.91 mmol)에 첨가하였다. 건조 DCM(1 mL) 중의 DMAP(37 mg, 0.62 mmol) 및 DIPEA(0.11 ml, 1.26 mmol)의 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 아르곤 분위기 하에서 23℃에서 16시간 교반하였다. 다음날, 용매를 진공에서 제거하고, 40분 동안 100% CH₂Cl₂(이동상 a)부터 75:22:3 CH₂Cl₂/MeOH/NH₄OHaq(부피 기준, 이동상 b)까지의 구배 용출로 실리카 컬럼(24 g) 상에서 플래시 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 원하는 생성물이 53% 이동상 b에서 용출되었다(1:1 이동상 a/이동상 b에서 실리카겔 TLC Rf = 0.6). 수율 260 mg(75%).

화합물 28(PE 덴드론-G2-A1-리시놀레익.PE 덴드론-G1-A1-리시놀레익): 화합물 27(0.044 mmol, MW 2290.46) 100 mg을 3 ml MeOH에 용해시킨 후 20 eq의 AcCl(0.06 ml, 0.87 mmol)로 처리하고, 반응을 0℃ 내지 23℃에서 5시간 동안 교반하고, 건조 때까지 증발시키고, 조 생성물을 2 ml DMF에 용해시켰다. 0.12 ml Et₃N(0.87 mmol)을 첨가한 후, 1 ml DMF에 용해된 리시놀레익-NHS(138 mg, 0.26 mmol)를 첨가하였다. 다음날, 반응 혼합물을 농축하고, 40분 동안 100% CH₂Cl₂(이동상 a)부터 75:22:3 CH₂Cl₂/MeOH/NH₄OHaq(부피 기준, 이동상 b)까지의 구배 용출로 실리카 컬럼 상에서 플래시 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 원하는 생성물이 60% 이동상 b에서 용출되어(1:1 이동상 a/이동상 b에서 Rf = 0.7), 황색 오일(98 mg, 45%)로서 원하는 생성물을 얻었다. C₁₈₅H₃₄₃N₂₁O₃₂에 대한 MS (ESI):[M+3H]³⁺ m/z 1125.6(계산치), 1125.2(실험치); [M+4H]⁴⁺ m/z 843.9(계산치), 844.1(실험치).

실시예 7. 화학식 Ia의 핵산 운반체를 함유하는 나노입자 제제

PE-G2-헥사데실-프로필피롤리딘: DSPC: 콜레스테롤: DMG-PEG2k를 1:0.5:2.4:0.04의 몰비로 함유하는 나노입자를 NanoAssemblr 벤치탑(Precision NanoSystems Inc, Vancouver, BC, Canada)을 사용하여 제제화하였다. RNA를 DNase/RNase가 없고 내독소가 없는 증류수 및 멸균 시트레이트 완충액을 이용하여 최종 원하는 pH로 희석하였다. 벤치탑에서 제제화하기 위해 총 유속을 수성상 대 유기상의 3:1 비율로 분당 12 mL로 유지시켰다. 250℃에서 24시간 동안 가열하여 발열원이 제거된 유리제품을 사용하여, 나노입자를 20,000 분자량 컷오프 투석을 사용하여 멸균된 내독소가 없는 PBS에 대해 투석하였다. 투석된 나노입자를 0.2 마이크론 폴리(에테르 설폰) 필터를 사용하여 멸균 여과하고, Zetasizer NanoZS 기계(Malvern)를 사용하여 특성화하였다. 캡슐화 효율은 Ribogreen® 분석(마치 전부가 제시되어 있는 것처럼 본원에 참고로 포함되어 있는 문헌: Geall et al. 10.1073/pnas.1209367109)을 이용하여 PE-G2-헥사데실-프로필피롤리딘 및 SEAP 레플리콘 RNA(pH 5에서 제제화됨)를 함유하는 나노입자 조성물에 대해 90%인 것으로 측정되었다.

유체역학 크기 측정

도 1 및 2를 참조할 때, 크기의 함수로서 PE-G2-헥사데실-프로필피롤리딘 및 SEAP 레플리콘 RNA를 함유하는 나노입자 조성물의 "Z 평균"은 동적 광 산란(DLS)에 의해 결정하였다. "Z 평균"은 동적 광 산란(DLS)에 의해 측정된 입자의 앙상블 집합의 강도 가중된 평균 유체역학 크기이다. 도 1을 참조할 때, 가장 강한 강도가 192.5 d.nm 크기의 나노입자(pH 5.0에서 제제화됨)에서 관찰되었다. 크기 분포는 낮은 다분산 지수를 갖는 단일 피크를 특징으로 하였는데, 이는 상대적으로 단분산 크기를 나타낸다.

겔 지연 분석

아가로스 겔 전기 영동은 공지된 방법(마치 전부가 제시되어 있는 것처럼 본원에 참고로 포함되어 있는 문헌: Geall et al. 10.1073/pnas.1209367109)에 따라 덴드론 운반체와 RNA와의 결합을 평가하기 위해 수행하였다. 도 3은 PE-G2-헥사데실-프로필피롤리딘과 레플리콘 RNA와의 결합을 보여주는 아가로스 겔의 사진이다. 겔을 에티듐 브로마이드(EB)로 염색하고, 겔 이미지를 Syngene G Box 이미징 시스템(Syngene, USA) 상에서 촬영하였다. 도 3을 참조할 때, 레인 1은 PE-G2-헥사데실-프로필피롤리딘 및 SEAP 레플리콘 RNA의 제제의 생성물(제제화 pH 5.0)을 함유하였고, 레인 2는 PE-G2-헥사데실-프로필피롤리딘 및 SEAP 레플리콘 RNA의 제제의 생성물(제제화 pH 6.0)을 함유하였으며, 레인 3은 제제화되지 않은 SEAP mRNA를 함유하였다. 로딩하기 전에, 샘플을 포름알데히드 로딩 염료와 함께 인큐베이션하고, 65℃에서 10분 동안 변성시키고, 23℃로 냉각시켰다. 겔을 90 V에서 진행시키고, 겔 이미지를 Syngene G Box 이미징 시스템(Syngene, USA) 상에서 촬영하였다. RNA 검출을 위해, 겔을 에티디움 브로마이드로 염색하였다. 도 3을 참조할 때, 하부 밴드는 작은 크기의 유리 RNA(레인 3)에 해당하고, 상부 밴드는 RNA가 핵산 운반체에 결합함으로써 형성된 큰 크기의 나노입자를 나타낸다.

생체내 SEAP 생산 결과.

화학식 Ia의 핵산 운반체의 제제를 시험하기 위해, 분비된 배아 알칼리성 포스파타제 SEAP 리포터 시스템을 사용하였다. 생체내 실험을 위해, 마우스에게 5 ug의 용량의 SEAP 레플리콘 RNA로 나노입자를 주사하고, 투여 1일, 4일, 6일 후 마우스로부터 혈청을 수집하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 SEAP 검출을 위한 Invitrogen NovaBright™ Phospha-Light™ EXP 분석 키트를 사용하여 양을 정량화하였다. 마우스 혈청 샘플에서의 SEAP 양은 BioTek Synergy HTX 마이크로플레이트 판독기에서 측정된 바와 같이 임의 단위(A.U.)로 보고된다. 오차 막대는 ± S.E.M이다. 도 4를 참조할 때, SEAP 양은 pH 5.0과 비교하여 pH 6.0 제제에서 더 높은 것으로 관찰되었는데, RNA가 더 약한 결합으로 인해 pH 6.0 제제로부터 더 빨리 방출되었기 때문이다.

실시예 8. 화학식 Id의 핵산 운반체를 함유하는 나노입자 제제

초순수, DNase/RNase가 없는, 내독소가 없는 증류수(Invitrogen) 및 멸균 100 mM(pH 5.0) QB 시트레이트 완충제(Teknova)를 이용하여 10 mM의 최종 시트레이트 농도로 희석된 90 μl의 SEAP 레플리콘 RNA을 갖는 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000](PEG-지질, Avanti Polar Lipids)과 조합된 화학식 Id의 핵산 운반체(예컨대, PE-G2-A1-리시놀레익.PE-G2-리놀레익)를 함유하는 30 μl의 에탄올 상의 직접 혼합물에 의해 나노입자를 제제화하였다. 생성된 나노입자는 핵산 운반체 대 PEG-지질 대 레플리콘 RNA의 16:2.3:6 질량 비율을 함유하였다. 제제를 Zetasizer Nano ZS(Malvern Panalytical)를 사용한 입자 크기 분포, Z-평균의 분석을 위해 1000배 희석하였다.

유체역학 크기 측정

도 5는 나노입자의 크기(d.nm; nm 직경)에 기초하여 강도로서 측정된 나노입자 조성물의 분포를 예시한다. 도 5를 참조할 때, "Z 평균"은 동적 광 산란(DLS)에 의해 측정된 입자의 앙상블 집합의 강도 가중된 평균 유체역학 크기이다. 도 5를 참조할 때, 가장 강한 강도가 234.5 d.nm 크기의 나노입자에서 관찰되었다.

겔 지연 분석

아가로스 겔 전기 영동은 공지된 방법(마치 전부가 제시되어 있는 것처럼 본원에 참고로 포함되어 있는 문헌: Geall et al. 10.1073/pnas.1209367109)에 따라 PE-G2-A1-리시놀레익.PE-G2-리놀레익과 RNA와의 결합을 평가하기 위해 수행하였다. 도 6은 PE-G2-A1-리시놀레익.PE-G2-리놀레익과 SEAP 레플리콘 RNA와의 결합을 보여주는 아가로스 겔의 사진이다. 겔을 에티듐 브로마이드(EB)로 염색하고, 겔 이미지를 Syngene G Box 이미징 시스템(Syngene, USA) 상에서 촬영하였다. 도 6을 참조할 때, 레인 1은 제제화되지 않은 SEAP RNA 레플리콘을 함유하였고, 레인 2는 PE-G2-A1-리시놀레익.PE-G2-리놀레익과 SEAP 레플리콘 RNA의 제제의 생성물을 함유하였다. 로딩하기 전에, 샘플을 포름알데히드 로딩 염료와 함께 인큐베이션하고, 65℃에서 10분 동안 변성시키고, 23℃로 냉각시켰다. 겔을 90 V에서 진행시키고, 겔 이미지를 Syngene G Box 이미징 시스템(Syngene, USA) 상에서 촬영하였다. RNA 검출을 위해, 겔을 에티디움 브로마이드로 염색하였다. 도 6을 참조할 때, 하부 밴드는 작은 크기의 유리 RNA에 해당하고(레인 1), 상부 밴드는 RNA가 핵산 운반체에 결합함으로써 형성된 큰 크기의 나노입자를 나타낸다(레인 2).

시험관내 SEAP 생산 결과.

상기 나노입자 조성물이 시험관내에서 SEAP를 발현하는 능력을 시험하기 위해, BHK 세포를 나노입자로 처리하였다. BHK의 12 웰 디쉬의 각 웰을 1:1 Optimem:PBS 혼합물로 500 μL의 최종 부피로 희석된 10 μL(대략 1 μg)의 제제 생성물로 처리하였다. 처리되지 않은 웰은 500 μL의 50/50 PBS/OptiMEM을 가지고 있었다. 처리 또는 감염 24시간 후, 각 배양액으로부터 조건화된 배지를 수집하였다. 배지를 QuantiBlue 분석(InvivoGen)을 사용하여 분석하였다. 150 μL QuantiBlue 시약을 50 μL의 배지와 조합하였다. 제조업체의 프로토콜에 의해 지시된 바와 같이 650 nm에서 흡광도를 측정함으로써 10분 후 판독값을 취하였다. 무처리 샘플 또는 음성 대조군의 경우, 나노입자로 처리되지 않은 웰로부터의 50 μL의 배지를 150 μL QuantiBlue 시약에 첨가하였다. 도 7은 핵산 운반체로서 PE-G2-A1-리시놀레익.PE-G2-리놀레익을 함유하는 나노입자 제제의 시험관내 SEAP 발현을 예시한다.

실시예 9. 화학식 If의 핵산 운반체를 함유하는 나노입자 제제

PE-G1-A1-리시놀레익.PE-G1-A1-리시놀레익 또는 PE-G2-A1-리시놀레익.PE-G1-A1-리시놀레익: DOPE: 콜레스테롤: DMG-PEG2k를 1:0.6:2.88:0.1의 몰비로 함유하는 나노입자를 NanoAssemblr 벤치탑(Precision NanoSystems Inc, Vancouver, BC, Canada)을 사용하여 제제화하였다. RNA를 DNase/RNase가 없고 내독소가 없는 증류수 및 멸균 시트레이트 완충제를 이용하여 최종 원하는 pH로 희석하였다. 벤치탑에서 제제화하기 위해 총 유속을 수성상 대 유기상의 3:1 비율로 분당 10 mL로 유지시켰다. 250℃에서 24시간 동안 가열함으로써 발열원이 제거된 유리제품을 사용하여, 나노입자를 20,000 분자량 컷오프 투석을 사용하여 멸균된 내독소가 없는 PBS에 대해 투석하였다. 투석된 나노입자를 0.2 마이크론 폴리(에테르 설폰) 필터를 사용하여 멸균 여과하고, Zetasizer NanoZS 기계(Malvern)를 사용하여 특성화하였다. 캡슐화 효율은 Ribogreen® 분석(마치 전부가 제시되어 있는 것처럼 본원에 참고로 포함되어 있는 문헌: Geall et al. 10.1073/pnas.1209367109)을 이용하여 PE-G1-A1-리시놀레익.PE-G1-A1-리시놀레익 또는 PE-G2-A1-리시놀레익.PE-G1-A1-리시놀레익 및 SEAP 레플리콘 RNA(pH 6에서 제제화됨)를 함유하는 나노입자 조성물에 대해 93% 및 90%인 것으로 측정되었다.

유체역학 크기 측정

도 8a 및 8b는 나노입자의 크기(d.nm; nm 직경)에 기초한 강도로서 측정된 나노입자 조성물의 분포를 예시한다. 도 8a 및 8b를 참조할 때, 가장 강한 강도가 각각 86.90 d.nm 크기와 102.6 d.nm 크기의 나노입자에서 관찰되었다. 크기 분포는 낮은 다분산 지수를 갖는 단일 피크를 특징으로 하며, 이는 상대적으로 단분산 크기를 나타낸다.

시험관내 SEAP 생산 결과.

상기 나노입자 조성물이 시험관내에서 SEAP를 발현하는 능력을 시험하기 위해, BHK 세포를 나노입자로 처리하였다. BHK의 12 웰 디쉬의 각 웰에 1:1 Optimem:PBS 혼합물로 500 μL의 최종 부피로 희석된 10 μL(대략 1 μg)의 제제 생성물을 처리하였다. 처리되지 않은 웰은 500 μL의 50/50 PBS/OptiMEM을 가지고 있었다. 처리 또는 감염 24시간 후, 각 배양액으로부터 조건화된 배지를 수집하였다. 배지를 QuantiBlue 분석(InvivoGen)을 사용하여 분석하였다. 150 μL QuantiBlue 시약을 50 μL의 배지와 조합하였다. 제조업체의 프로토콜에 의해 지시된 바와 같이 650 nm에서 흡광도를 측정함으로써 10분 후 판독값을 취하였다. 무처리 샘플 또는 음성 대조군의 경우, 나노입자로 처리되지 않은 웰로부터의 50 μL의 배지를 150 μL QuantiBlue 시약에 첨가하였다. 도 9a는 핵산 운반체로서 PE-G1-A1-리시놀레익.PE-G1-A1-리시놀레익 또는 PE-G2-A1-리시놀레익.PE-G1-A1-리시놀레익을 함유하는 나노입자 제제의 시험관내 SEAP 발현을 예시한다.

생체내 SEAP 생산 결과.

생체내에서 PE-G1-A1-리시놀레익.PE-G1-A1-리시놀레익 또는 PE-G2-A1-리시놀레익.PE-G1-A1-리시놀레익을 갖는 제제를 시험하기 위해, 마우스에게 2 ug의 용량의 SEAP 레플리콘 RNA로 나노입자를 주사하고, 투여 3일 후 마우스로부터 혈청을 수집하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 SEAP 검출을 위한 Invitrogen NovaBright™ Phospha-Light™ EXP 분석 키트를 사용하여 양을 정량화하였다. 마우스 혈청 샘플에서의 SEAP 양은 BioTek Synergy HTX 마이크로플레이트 판독기에서 측정된 바와 같은 임의 단위(A.U.)로 보고된다. 오차 막대는 ± S.E.M이다. 도 9b를 참조할 때, SEAP 양은 PE-G2-A1-리시놀레익.PE-G1-A1-리시놀레익과 비교하여, PE-G1-A1-리시놀레익.PE-G1-A1-리시놀레익에서 더 높은 것으로 관찰되었다.

COVID-19 우한 스파이크 RBD 직접 혈청 ELISA

마우스(BALB/c)에게 PE-G1-A1-리시놀레익.PE-G1-A1-리시놀레익 및 PE-G2-A1-리시놀레익.PE-G1-A1-리시놀레익(100 μL PBS의 총 부피)을 이용하여 제제화된 2 μg의 스파이크 레플리콘 RNA를 다리 근육 내에 양측에 IM 주사에 의해 백신 접종하였다. 주사 14일 후 마우스를 채혈하고, 응고된 샘플을 10000 RCF에서 1.5분간 원심분리하여 전혈로부터 혈청을 단리하였다. 이 혈청을 직접 ELISA에 의해 항-스파이크 RBD 항체 역가에 대해 분석하였다. Greiner Bio High Binding Microlon ELISA 플레이트를 4℃에서 재조합 우한 스파이크 RBD 단백질을 함유하는 PBS로 밤새 코팅하였다. 웰을 실온에서 1시간 동안 PBS + 0.5% BSA로 차단하였다. 혈청 샘플을 1:50 희석부터 시작하여 PBS + 0.5% BSA에서 최대 1:6400까지 연속 1:2 희석하여 웰에 첨가하였다. 샘플을 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하고, PBST로 3회 세척한 다음, 염소 항-마우스 IgG HRP를 PBS + 0.5% BSA 중의 1:20,000 희석으로 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 다시 PBST로 5회 세척하고, 발색성 HRP 기질 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 사용하여 발색시켰다. 반응을 0.5 M H2SO4를 첨가하여 중단하고, 흡광도를 450 nm 및 570 nm에서 측정하였다. 종점 역가를 450에서 흡광도 - 570에서 흡광도의 값이 ≥ 0.08인 최고 희석 농도로 지정하였다. 2주에, PE-G1-A1-리시놀레익.PE-G1-A1-리시놀레익 및 PE-G2-A1-리시놀레익.PE-G1-A1-리시놀레익을 사용하여 제제화된 2 μg의 나노입자 백신으로 면역화된 군에 대한 종점 희석 역가(도 10)는 200 내지 1600이었다. 이것은 역가가 기저선에 머물렀던 면역화되지 않은 혈청음성 군과 대조적이다.

참고문헌:

본 출원 전반에 인용된 참고문헌은 마치 각 참고문헌이 전부 제시되어 있는 것처럼 본원 및 참고문헌 자체 내의 명백한 모든 목적을 위해 포함되어 있다. 설명을 위해, 이들 참고문헌 중 특정한 참고문헌이 본원의 특정 위치에 인용되어 있다. 특정 위치에서의 참고문헌의 인용은 참고문헌의 교시내용이 포함되는 방식을 나타낸다. 그러나, 특정 위치에서의 참고문헌의 인용은 인용된 참고문헌의 모든 교시내용이 모든 목적을 위해 포함되는 방식을 제한하는 것은 아니다.

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Claims

하기 화학식 Ia, Ib, Ic, Id, Ie, 또는 If의 덴드론 또는 덴드리머를 포함하는 핵산 운반체:
화학식 Ia,
화학식 Ib,
화학식 Ic,
화학식 Id,
화학식 Ie, 또는
화학식 If
식 중, PE는 코어, 및 하나 이상의 세대를 형성하는 복수의 단량체 폴리에스테르 단위를 포함하는 폴리에스테르 덴드론이고, A는 아민이며, B는 소수성 단위이고, z는 표면 기의 수이다.
제1항에 있어서, PE는 하기 화학식 II를 갖는 것인 핵산 운반체:
화학식 II
식 중, G는 덴드론의 층 또는 세대이고, n은 세대 수이며, 1 내지 10의 범위이다.
제1항에 있어서, 복수의 단량체 폴리에스테르 단위는 2,2-비스(하이드록시메틸)프로피온산 또는 2,2-비스(하이드록시메틸)부티르산인 핵산 운반체.
제1항에 있어서, z는 하기 화학식 III을 갖는 것인 핵산 운반체:
z = bⁿ 화학식 III
식 중, b는 분기점 다중도 또는 각 분기점에서의 분기의 수이고, n은 세대 수이며 1 내지 10의 범위인 핵산 운반체.
제1항에 있어서, A는 1-(2-아미노에틸)피페라진, 1-피페리딘에탄아민, 1-디메틸아미노-2-프로필아민, 1-(3-아미노프로필)피롤리딘, 1-(2-아미노에틸)피롤리딘, 1-(2-아미노에틸)피페리딘, 2-(1-피페라지닐)에틸아민, 2-(4-메틸-피페라진-1-일)-에틸아민, 3-(디메틸아미노)-1-프로필아민, 3-(디에틸아미노)프로필아민, (4-아미노부틸)디메틸아민, 4-(1-피롤리디닐)-1-부틸아민, 4-모르폴린에탄아민, 4-모르폴린프로판아민, 4-메틸-1-피페라진에탄아민, 4-(디에틸아미노)부틸아민, N,N-디메틸에틸렌디아민, N,N-디메틸디프로필렌트리아민, N,N'-디메틸-N,N'-비스(3-메틸아미노프로필)트리메틸렌디아민, N1-(3-아미노프로필)프로판-1,3-디아민, N1-(3-아미노프로필)-N1-메틸프로판-1,3-디아민, 3-((3-아미노프로필)(메틸)아미노)프로판-1-올, 1-디메틸아미노-2-프로판올, 1-[비스[3-(디메틸아미노)프로필]아미노]-2-프로판올, 2-디메틸아미노에탄올, 2-(디에틸아미노)에탄올, 2-[2-(디메틸아미노)에톡시]에탄올, 2-(2-아미노에톡시)에탄올, 2-{[2-(디메틸아미노)에틸]메틸아미노}에탄올, 3-디메틸아미노-1-프로판올, 3-디메틸아미노-1-프로판올, 4-(디메틸아미노)-1-부탄올, 4-디에틸아미노-2-부틴-1-올, N-메틸디에탄올아민, 4-(디에틸아미노)부탄-1-올, 3-(아제티딘-1-일)프로판-1-올, 3-(피롤리딘-1-일)프로판-1-올, 3-(피페리딘-1-일)프로판-1-올, 4-(아제티딘-1-일)부탄-1-올, 4-(피롤리딘-1-일)부탄-1-올, 4-(피페리딘-1-일)부탄-1-올, 3-모르폴리노프로판-1-올, 4-모르폴리노부탄-1-올, 3-(4-메틸피페라진-1-일)프로판-1-올, 또는 4-(4-메틸피페라진-1-일)부탄-1-올인 핵산 운반체.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, B는 지방산(C4-C28) 또는 이의 유도체로부터 유래되는 것인 핵산 운반체.
제6항에 있어서, 지방산은 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 아라키돈산, 및 에이코사펜타노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 핵산 운반체.
제6항에 있어서, 지방산 유도체는 12-하이드록시-9-cis-옥타데세노산, 12-메틸테트라데카노산, 12-메틸트리데카노산, 14-메틸헥사데카노산, 14-메틸헥사데카노산, 18-메틸노나데카노산, 19-메틸아라키드산, 이소팔미트산, 이소스테아르산, 피탄산, (±)-2-하이드록시옥타노산, (±)-3-하이드록시데카노산, (±)-3-하이드록시옥타노산, 10-하이드록시데카노산, 12-하이드록시옥타데카노산, 15-하이드록시펜타데카노산, 16-하이드록시헥사데카노산, 2-하이드록시헥사데카노산, 2-하이드록시테트라데카노산, 2-하이드록시도데카노산, DL-α-하이드록시스테아르산, DL-β-하이드록시라우르산, DL-β-하이드록시미리스트산, 및 DL-β-하이드록시팔미트산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 핵산 운반체.
제6항에 있어서, 지방산 또는 유도체는 하나 이상의 안정한 동위원소를 포함하는 것인 핵산 운반체.
제9항에 있어서, 안정한 동위원소는 탄소 또는 수소의 안정한 동위원소인 핵산 운반체.
제10항에 있어서, 탄소의 안정한 동위원소는 ¹³C인 핵산 운반체.
제10항에 있어서, 수소의 안정한 동위원소는 ²H인 핵산 운반체.
제10항에 있어서, 안정한 동위원소를 포함하는 지방산은 옥타노산-1-13C, 옥타노산-8-13C, 옥타노산-8,8,8-d3, 옥타노익-2H15 산, 데카노산-1-13C, 데카노산-10-13C, 데카노익-10,10,10-d3 산, 데카노익-d19 산, 운데카노산-1-13C, 라우르산-12,12,12-2H3, 라우릭-2H23 산, 라우르산-1-13C, 라우르산-1,12-13C2, 트리데카노익-2,2-2H2 산, 미리스트산-14-13C, 미리스트산-1-13C, 미리스트산-14,14,14-2H3, 미리스틱-2H27 산, 팔미트산-1-13C, 팔미트산-16-13C, 팔미트산-16-13C,16,16,16-2H3, 팔미트산-2H31, 스테아르산-1-13C, 스테아르산-18-13C, 스테아르산-18,18,18-2H3, 스테아릭-2H35 산, 올레산-1-13C, 올레산-2H34, 리놀렌산-1-13C, 리놀레산-2H32, 아라키도닉-5,6,8,9,11,12,14,15-2H8 산, 및 에이코사노익-2H39 산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 핵산 운반체.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 핵산 운반체, 및 그 내에 전부 또는 일부 캡슐화된 치료적 또는 면역원성 핵산 제제를 포함하는 나노입자 조성물.
제14항에 있어서, 치료적 또는 면역원성 핵산 제제는 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, DNA, cDNA, RNA, repRNA, siRNA, miRNA, sgRNA, 및 mRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 나노입자 조성물.
제14항에 있어서, 치료적 또는 면역원성 핵산 제제는 감염성 질환, 병원체, 암, 자가면역 질환 및 알레르기성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항원을 코딩하는 것인 나노입자 조성물.
제14항에 있어서, 치료적 또는 면역원성 핵산 제제는 유전자의 활성을 침묵, 억제 또는 변형시킬 수 있는 RNA 또는 DNA를 포함하는 것인 나노입자 조성물.
제14항에 있어서, PEG-지질을 추가로 포함하는 나노입자 조성물.
제18항에 있어서, 치료적 또는 면역원성 핵산 제제는 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, DNA, cDNA, RNA, repRNA, siRNA, miRNA, sgRNA, 및 mRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 나노입자 조성물.
제18항에 있어서, 치료적 또는 면역원성 핵산 제제는 감염성 질환, 병원체, 암, 자가면역 질환 및 알레르기성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항원을 코딩하는 것인 나노입자 조성물.
제18항에 있어서, 치료적 또는 면역원성 핵산 제제는 유전자의 활성을 침묵, 억제 또는 변형시킬 수 있는 RNA 또는 DNA를 포함하는 것인 나노입자 조성물.
제18항에 있어서, PEG-지질은 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] 또는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000인 나노입자 조성물.
제18항에 있어서, 나노입자 조성물은 나노입자 조성물당 PEG-지질 1 몰% 내지 10 몰% 범위로 PEG-지질을 포함하는 것인 나노입자 조성물.
제18항에 있어서, 인지질 및 콜레스테롤 또는 이의 유도체를 추가로 포함하는 나노입자 조성물.
제24항에 있어서, PEG-지질은 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] 또는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000인 나노입자 조성물.
제24항에 있어서, 나노입자 조성물은 나노입자 조성물당 PEG-지질 1 몰% 내지 10 몰% 범위로 PEG-지질을 포함하는 것인 나노입자 조성물.
제24항에 있어서, 인지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE) 또는 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC)인 나노입자 조성물.
제24항에 있어서, 나노입자 조성물은 나노입자 조성물당 인지질 10 몰% 내지 15 몰%의 범위로 인지질을 포함하는 것인 나노입자 조성물.
제24항에 있어서, 나노입자 조성물은 나노입자 조성물당 콜레스테롤 또는 이의 유도체 50 몰% 내지 75 몰%의 범위로 콜레스테롤 또는 이의 유도체를 포함하는 것인 나노입자 조성물.
대상체에서 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 치료적 유효량의 제14항의 나노입자 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제30항에 있어서, 치료적 또는 면역원성 핵산 제제는 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, DNA, cDNA, RNA, repRNA, siRNA, miRNA, sgRNA, 및 mRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제30항에 있어서, 치료적 또는 면역원성 핵산 제제는 감염성 질환, 병원체, 암, 자가면역 질환 및 알레르기성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항원을 코딩하는 것인 방법.
제30항에 있어서, 치료적 또는 면역원성 핵산 제제는 유전자의 활성을 침묵, 억제 또는 변형시킬 수 있는 RNA 또는 DNA를 포함하는 것인 방법.
제30항에 있어서, 나노입자 조성물은 PEG-지질을 추가로 포함하는 것인 방법.
제34항에 있어서, 치료적 또는 면역원성 핵산 제제는 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, DNA, cDNA, RNA, repRNA, siRNA, miRNA, sgRNA 및 mRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제34항에 있어서, 치료적 또는 면역원성 핵산 제제는 감염성 질환, 병원체, 암, 자가면역 질환 및 알레르기성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항원을 코딩하는 것인 방법.
제34항에 있어서, 치료적 또는 면역원성 핵산 제제는 유전자의 활성을 침묵, 억제 또는 변형시킬 수 있는 RNA 또는 DNA를 포함하는 것인 방법.
제34항에 있어서, PEG-지질은 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] 또는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000인 방법.
제34항에 있어서, 나노입자 조성물은 나노입자 조성물당 PEG-지질 1 몰% 내지 10 몰% 범위로 PEG-지질을 포함하는 것인 방법.
제39항에 있어서, 나노입자 조성물은 인지질 및 콜레스테롤 또는 이의 유도체를 추가로 포함하는 것인 방법.
제40항에 있어서, PEG-지질은 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] 또는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000인 방법.
제40항에 있어서, 나노입자 조성물은 나노입자 조성물당 PEG-지질 1 몰% 내지 10 몰% 범위로 PEG-지질을 포함하는 것인 방법.
제40항에 있어서, 인지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE) 또는 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC)인 방법.
제40항에 있어서, 나노입자 조성물은 나노입자 조성물당 인지질 10 몰% 내지 15 몰%의 범위로 인지질을 포함하는 것인 방법.
제40항에 있어서, 나노입자 조성물은 나노입자 조성물당 콜레스테롤 또는 이의 유도체 인지질 50 몰% 내지 75 몰%의 범위로 콜레스테롤 또는 이의 유도체를 포함하는 것인 방법.
제30항에 있어서, 나노입자 조성물의 치료적 유효량은 대상체의 kg 체중당 핵산 0.01 mg 내지 핵산 10 mg의 범위로 치료적 또는 면역원성 핵산 제제를 포함하는 것인 방법.
제46항에 있어서, 대상체는 포유동물인 방법.
제47항에 있어서, 포유동물은 설치류, 개, 영장류, 말, 고가 농업용 동물, 및 인간으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.