KR20240030566A - 흑룡각 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역기능증진용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 흑룡각 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역기능증진용 조성물을 제공한다. 본 발명의 흑룡각 추출물은 미토콘드리아 활성 증진에 따른 에너지 대사 활성, 포도당 흡수 증진에 따른 포도당 대사 활성 효과가 있다. 본 발명의 흑룡각 추출물은 면역력 증진 또는 면역 세포 활성 증진용 건강기능식품, 면역 결핍 질환 치료용 약학 조성물 등으로 사용될 수 있다.

Description

흑룡각 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역기능증진용 조성물{Composition for enhancing immune function with Caralluma melanantha as an active ingredient}
본 발명은 흑룡각(Caralluma melanantha) 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역기능증진용 조성물에 관한 것이다.
코로나바이러스감염증-19(COVID-19) 사태가 지속되며 면역력에 대한 국민적 관심이 증가하였고, 면역력 증진 기능성 소재에 대한 수요가 증가하였다. 면역력 (immunity)은 특정 바이러스나 미생물 등에 의한 감염 또는 다양한 독소에 저항해 신체를 방어하는 능력으로, 일정한 수준으로의 유지가 중요하다. 과도한 염증은 면역력 불균형의 대표적인 증상이다. 염증이 면역 체계를 활성화하는 면역 반응의 핵심 과정이지만, 과도한 염증은 세포 사멸을 유발하여 류머티즘성 관절염, 치매, 크론병(염증성 장 질환), 비만, 당뇨병, 천식, 습진 등 다양한 질병의 원인이 될 수 있다. 이에, 가장 널리 알려지고 강력한 염증 유도 효소인 COX(cyclooxygenase)를 억제하는 다양한 항염증(anti-inflammation) 기능성 소재가 개발되고 있으나, 저하된 염증 반응을 회복시키는 기능성 소재의 개발은 관심받지 못하고 있다.
P2Y14(P2Y purinoceptor 14)는 UDP-glucose(uridine diphosphate glucose)를 인식하여 COX2를 발현시키고 염증 반응을 유발하는 수용체 단백질로, 대식세포, T-세포, 자연살해세포 등 다양한 면역 세포에서 발현된다. 당 흡수가 부족하거나 P2Y14 단백질이 결핍되면 대식세포가 정상적으로 활성화되지 못하며, 감염으로부터 신체를 보호하지 못하게 된다. 당원축적병 1b형(glycogen storage disease type 1b)은 G6PT(glucose-6-phosphate transporter) 유전자의 돌연변이로 발병하는 희귀질환으로, 대식세포에서 COX2 단백질 발현과 감염 제거 능력의 감소가 발생한다. 건선(psoriasis)은 원인이 아직 불명확하며, 피부가 은백색 비늘처럼 변하게 되고, 피부 섬유아세포에서 COX2가 정상적으로 발현되지 못한다. 원발성 면역 결핍증(primary immunodeficiency)은 다양한 유전적 돌연변이로 인해 발병하며, 감염과 심혈관 질환에 취약해진다. COX 결핍증(COX deficiency)은 COX 유전자의 돌연변이로 인해 발병하며, 점막 축적, 뇌출혈, 심부전(죽상경화증) 증상이 발생한다. 이와 유사하게, COX2 활성을 선택적으로 억제하는 셀레콕시브(celecoxib)와 로페콕시브(rofecoxib) 등의 비스테로이드성 항염증제(non-steroidal anti-inflammatory drugs; NSAIDs) 의 사용은 심부전의 위험을 최대 5배까지 증가시켜 사용에 주의가 필요하다.
이에 본 발명은 흑룡각(Caralluma melanantha) 추출물의 P2Y14와 COX2의 발현 조절 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였으며, 본 발명의 흑룡각 추출물은 면역력 증진 또는 면역 세포 활성 증진용 건강기능식품, 면역 결핍 질환 치료용 약학 조성물 등에 적용될 수 있다.
KR 10-1758338 B1
본 발명은 흑룡각 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역기능증진용 조성물을 제공하고자 한다. 상기 조성물은 건강기능식품 조성물 또는 약학 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명은 흑룡각 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역기능증진용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 흑룡각 추출물은, 바람직하게는 100~120℃, 38~40kPa 조건에서 10~20분간 열수추출한 것이 좋다.
본 발명에 있어서, 상기 흑룡각 추출물은, 바람직하게는 미토콘드리아 활성을 증진시키는 것이 좋다.
본 발명에 있어서, 상기 흑룡각 추출물은, 바람직하게는 대식세포의 포도당 흡수를 증진시키는 것이 좋다.
본 발명에 있어서, 상기 흑룡각 추출물은, 바람직하게는 P2Y14의 활성을 증진시키는 것이 좋다.
본 발명에 있어서, 상기 흑룡각 추출물은, 바람직하게는 COX2의 활성을 증진시키는 것이 좋다.
또한, 본 발명은 흑룡각 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역기능증진용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 흑룡각 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역기능증진용 조성물을 제공한다. 본 발명의 흑룡각 추출물은 미토콘드리아 활성 증진에 따른 에너지 대사 활성, 포도당 흡수 증진에 따른 포도당 대사 활성 효과가 있으며, PPTN에 의해 억제된 P2Y14(P2Y purinoceptor 14) 활성을 증가시키고, COX2 발현을 유도할 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 흑룡각 추출물은 면역력 증진 또는 면역 세포 활성 증진용 건강기능식품, 면역 결핍 질환 치료용 약학 조성물 등으로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 흑룡각 추출물(CMAE)의 제조방법을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 흑룡각 추출물(CMAE)의 미토콘드리아 활성 증진 효과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 흑룡각 추출물(CMAE)의 포도당 흡수 증진 효과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 흑룡각 추출물(CMAE)의 P2Y14의 단백질과 COX2 단백질 발현 증가 효과를 나타낸 도이다.
본 발명은 흑룡각(Caralluma melanantha) 추출물을 유효성분으로 면역기능증진용 조성물에 관한 것이다.
흑룡각(Caralluma melanantha)은 다육식물의 일종으로, 마다가스카르를 원산지로 한다. 용의 뿔을 닮아 흑룡각이라 불린다고 알려져 있다. 도 1a에 흑룡각의 외관을 나타내었다.
본 발명에 있어서, 상기 흑룡각 추출물은, 바람직하게는 흑룡각의 줄기를 사용하는 것이 좋으며, 100~120℃, 38~40kPa 조건에서 10~20분간 열수추출한 것이 좋다.
본 발명의 흑룡각 추출물은 대식세포에서 미토콘드리아의 활성을 증진시켜 미토콘드리아의 에너지 대사를 활성화하고, 포도당 흡수를 증진시켜 포도당 대사를 활성화함에 따라 면역기능을 증진시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 흑룡각 추출물은 PPTN에 의해 억제된 P2Y14(P2Y purinoceptor 14) 활성을 증가시키고, COX2 발현을 유도하는 효과가 있다. 이에, 본 발명의 흑룡각 추출물은 P2Y14 활성 억제 또는 COX2 활성 억제에 따라 발병하는 질환에 대한 개선, 치료 효과가 있는 것으로 판단된다.
본 발명에 따른 추출물은 당업계에 공지된 추출 및 분리방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된 "추출물"은 적절한 용매를 이용하여 흑룡각으로부터 추출한 것이며, 예를 들어, 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함한다. 상기 흑룡각으로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 식품학/약학적으로 허용되는 유기용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 정제수, 메탄올(Methanol), 에탄올(Ethanol), 프로판올(Propanol), 이소프로판올(Isopropanol), 부탄올(Butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알콜, 아세톤(Acetone), 에테르(Ether), 벤젠(Benzene), 클로로포름(Chloroform), 에틸아세테이트(Ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(Methylene chloride), 헥산(Hexane) 및 시클로헥산 (Cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법, 고온고압추출법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다.
본 발명의 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함되는 추출물은 상기한 열수 추출 또는 용매 추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말상태로 제조할 수 있다. 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(Thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(High performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다. 따라서, 본 발명에 있어서 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 유효성분인 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제(타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 하기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화 되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알콜 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 유효성분인 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공될 수 있다. 본 발명에서 '건강기능식품 조성물'이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 본 발명의 건강 기능성 식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다. 상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다. 예를 들어, 정제 형태의 건강 기능성 식품은 본 발명의 유효성분을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강 기능성 식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다. 캅셀 형태의 건강 기능성 식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀 기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다. 환 형태의 건강 기능성 식품은 본 발명의 유효성분과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다. 과립 형태의 건강 기능성 식품은 본 발명의 유효성분의 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은, 유효성분 이외에 보조제(Adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(Witepsol), 트윈(Tween) 61, 카카오 지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(Witepsol), 트윈(Tween) 61, 카카오 지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.
상기 약학 조성물은 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화 될 수 있다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경질, 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제제이며, 주사용 제제의 용매로서 물, 링거액, 등장성 생리식염수 또는 현탁액을 들 수 있다. 상기 주사용 제제의 멸균 고정 오일은 용매 또는 현탁 매질로서 사용할 수 있으며 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있다.
또한, 상기 주사용 제제는 올레산과 같은 지방산을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 실험은 개별적으로 3회 이상 수행되었으며, 3개 실험의 데이터를 mean ± Standard deviation(SD)로 표기하였다. 통계적 분석은 GraphPad PRISM software를 사용하여 unpaired two-tailed student’s T.test 방식으로 수행되었으며, p 값이 0.05 미만이면 통계적 유의성을 지니는 것으로 간주하였다. 도면상에 p 값이 0.05 미만일 경우 *, 0.01 미만은 ** 그리고 0.001 미만은 ***으로 표시하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (w/w) %, 고체/액체는 (w/v) %, 그리고 액체/액체는 (v/v) %이다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 보다 자세히 설명한다. 다만, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
<실시예 1> 흑룡각 추출물의 제조
흑룡각 줄기를 증류수로 세척하고 2~3cm 간격으로 절단하였다. 흑룡각 줄기 50g과 150mL의 증류수를 넣고 110℃ 39.23kPa 조건에서 15분간 고압 열수 추출하였다. 흑룡각 줄기를 제거하고, 0.22μm pore size의 필터로 제균 여과하여 흑룡각 추출물(CMAE)을 제조하였다. 제조된 흑룡각 추출물의 건조 중량을 Speed Vac 진공 농축기로 분석한 결과 6mg/mL로 측정되었다.
도 1a는 흑룡각의 외관을 나타낸 도이고, 도 1b는 흑룡각 추출물의 제조방법을 나타낸 도이다.
<실시예 2> 흑룡각 추출물의 미토콘드리아 활성 증진 효과
본 실험에서는 흑룡각 추출물이 미토콘드리아 활성에 미치는 영향을 확인하였다. 미토콘드리아는 에너지 대사를 담당하는데, 적혈구를 제외한 모든 세포에 존재하며, 건강을 유지하는 중요한 세포 소기관이다. 미토콘드리아는 각 장기에 존재하면서 생명 유지에 필요한 여러 가지 생리 활성 물질을 만들어낸다. 미토콘드리아의 기능에 장애가 발생하면 에너지 대사가 쇠퇴하면서 신진대사에 문제가 발생하고, 세포의 활력 약화, 체력 약화 등 노화와 질병이 진행될 수 있다.
Dulbecco’s modified Eagle’s medium과 Roswell Park Memorial Institute 1640 medium이 3:7 부피 비율로 혼합되고, 10%(v/v) 우태아 혈청, 1%(v/v) 페니실린-스트렙토마이신 및 1%(v/v) non-essential amino acid solution이 첨가된 배지를 사용하여 36.5℃ 및 5% CO2 조건에서 3D4/31 대식세포를 배양하였다. 3D4/31 대식세포를 12시간 배양한 뒤, 상기 실시예 1에서 제조한 흑룡각 추출물을 각각 0, 2, 6, 20, 60, 200μg/mL를 처리하고 24시간 배양하였다. 50nM 농도의 MitoTracker Deep Red(MTDR)을 30분간 처리하고, 세포를 PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4)로 세척하였다. 세포를 수거하여 유세포분석으로 MTDR의 MFI(median fluorescence intensity)를 측정하고 결과를 도 2에 나타내었다. 유세포분석은 Guava EasyCyte 유세포 분석기와 GuavaIncyte software 및 FlowJo software를 사용하였다.
도 2에서 보듯이, 흑룡각 추출물은 3D4/31 대식세포에서 농도 의존적으로 미토콘드리아 활성을 증진시켰으며, 60μg/mL 농도의 흑룡각 추출물은 3D4/31 대식세포의 미토콘드리아 활성을 0μg/mL 처리군 대비 12.58±0.03% 증가시킨 반면, 200μg/mL의 농도에서는 그 효과가 감소하는 것으로 확인되었다.
즉, 본 발명의 흑룡각 추출물은 면역 세포에 대한 미토콘드리아 활성 증진 효과를 발휘함에 따라 면역 세포의 에너지 생성 효과 및 건강 증진 효과를 발휘할 수 있음을 확인하였다.
<실시예 3> 흑룡각 추출물의 포도당 흡수 증진 효과
상기 실시예 2와 같이, 3D4/31 대식세포를 12시간 배양한 후, 상기 실시예 1의 흑룡각 추출물을 60μg/mL 농도로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 대조군으로 vehicle(증류수)을 처리하였다. 세포를 수거하여, PBS에 옮긴 후, 50μM 농도의 2NBDG와 함께 30분간 배양하였다. PBS로 세척한 후, 유세포분석으로 2NBDG의 MFI를 측정하고 결과를 도 3에 나타내었다. 유세포분석은 Guava EasyCyte 유세포 분석기와 GuavaIncyte software 및 FlowJo software를 사용하였다.
도 3에서 보듯이, 흑룡각 추출물 처리에 따라 3D4/31 대식세포에서 2NBDG 흡수가 증가하는 것을 확인하였다. 흑룡각 추출물은 3D4/31 대식세포의 포도당 흡수를 vehicle 대비 10.52±0.05% 증가시켰다.
즉, 본 발명의 흑룡각 추출물은 면역 세포에 대한 포도당 흡수 증진 효과를 발휘함에 따라, 면역 세포의 포도당 대사와 면역 활성 증진 효과를 발휘할 수 있음을 확인하였다.
<실시예 4> 흑룡각 추출물의 P2Y14 및 COX2 단백질 발현 유도
상기 실시예 2와 같이, 3D4/31 대식세포를 12시간 배양한 후, vehicle(증류수), 상기 실시예 1의 흑룡각 추출물(60μg/mL) 그리고 P2Y14 억제제로 알려진 PPTN(1nM, CAS No. 1160271-30-6)을 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 이후, 면역 세포를 활성화하는 PMA(CAS No. 1561-29-8)를 2nM 농도로 처리하고 12시간 배양하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고 수거하여, PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)가 포함된 RIPA(radioimmunoprecipitation assay) buffer로 세포를 용해하고, 단백질을 회수하였다. SDS-PAGE로 30μg의 단백질을 분리하고, PVDF(polyvinylidene fluoride)멤브레인에 트랜스퍼 하였다. 멤브레인은 25℃에서 1시간 동안 1%(w/v) skim milk로 블로킹 되었다. TBST(0.05%(v/v) tween-20가 포함된 Tris-buffered saline)로 세척하고 anti-P2Y14 또는 anti-COX2 일차 항체와 horse radish peroxidase가 결합된 이차 항체를 처리하였다. 단백질 수준은 enhanced chemiluminescence와 X-ray film을 사용해 시각화하였다. ImageJ software의 densitometry를 통해 β-actin에 대비한 단백질의 수준을 도 4에 나타내었다.
도 4에서 보듯이, PPTN은 3D4/31 대식세포에서 P2Y14의 단백질 수준을 49.18±0.10% 감소시켰다. 반면, PPTN과 흑룡각 추출물을 함께 처리할 경우에는 PPTN 단독 처리에 비해 P2Y14 단백질 수준이 144.24±0.27% 증가하였다.
또한, 이를 통해 흑룡각 추출물이 PPTN에 의한 P2Y14 활성 억제를 치료함을 확인하였다. 다음으로, 흑룡각 추출물 처리는 COX2 단백질 발현을 약 49.21±0.07% 증가시켰다. PPTN은 COX2 단백질 발현은 35.08±0.13% 감소되었고, 흑룡각 추출물을 PPTN과 함께 처리하면 PPTN을 단독으로 처리했을 때보다 142.00±0.81% 증가되었다. 이를 통해 흑룡각 추출물이 P2Y14 활성화를 통해 COX2 발현을 유도함이 확인되었다.
종합적으로 본 발명에서는 흑룡각 추출물이 면역 세포에서 미토콘드리아 활성, 포도당 흡수, P2Y14 활성, COX2 단백질 발현을 유도하여 면역력 증진 효과가 우수한 것을 검증하였다. 따라서, 본 발명의 흑룡각 추출물은 면역 세포 활성화, 면역력 증진 그리고 면역 결핍 질환의 예방 및 치료 효과가 우수하므로 식품, 건강기능식품, 화장료 및 제약 분야에서 높은 활용 가치를 지닌다.

Claims (7)

  1. 흑룡각 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역기능증진용 건강기능식품 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 흑룡각 추출물은,
    100~120℃, 38~40kPa 조건에서 10~20분간 열수추출한 것인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 흑룡각 추출물은,
    미토콘드리아 활성을 증진시키는 것인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 흑룡각 추출물은,
    대식세포의 포도당 흡수를 증진시키는 것인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 흑룡각 추출물은,
    P2Y14 활성을 증가시키는 것인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 흑룡각 추출물은,
    COX2의 활성을 증진시키는 것인, 조성물.
  7. 흑룡각 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역기능증진용 건강기능식품 조성물.
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