KR20240028486A - 핵산의 경구 전달용 제형 - Google Patents

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KR20240028486A
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에두아르도 말반
아흐메드 지. 이브라힘
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세다르스-신나이 메디칼 센터
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Abstract

본원에서는 핵산, 예를 들어 비-암호화 RNA의 경구 전달용으로 구성된 제형이 제공된다. 본원에 제공된 제형은 미셀 내에 핵산을 캡슐화하기 위해 사용되는 복수의 양이온성 지질, 및 상기 지질을 코팅하기 위해 사용되고 미셀 상에 코팅을 형성하는, 카세인 단백질과 키토산 중합체의 혼합물을 포함한다. 상기 코팅된 미셀은 제형에 내산성을 부여하여, 염증 또는 섬유증과 관련된 병태, 예를 들어 비대성 심근증, 보존된 분출률을 갖는 심부전, 근육 장애, 예를 들어 근이영양증, 피부경화증 및/또는 바이러스 감염에 대한 핵산의 생체이용성을 향상시켜서 경구 투여를 가능하게 한다.

Description

핵산의 경구 전달용 제형
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2021년 7월 1일에 출원된 미국 가출원 제63/202,970호에 대한 우선권을 주장하며, 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
연방정부가 지원하는 R&D에 관한 진술
본 발명은 국립보건기구(National Institutes of Health)의 에두아르도 마르반 박사(Dr. Eduardo Marban)에게 수여된 보조금번호 R01 HL124074 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대하여 일정한 권리를 갖는다.
서열목록에 대한 참조
본 출원은 전자 형식의 서열목록과 함께 제출되고 있다. 서열목록은 크기 16,471 바이트인 2022년 6월 30일에 작성된 CSMC018WO2_ST25.txt라는 파일로 제공된다. 서열목록의 전자 형식의 정보는 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
분 야
본 발명은 핵산, 예를 들어 치료용 RNA(예를 들어 비-암호화 또는 암호화 RNA)의 경구 전달용 제형에 관한 것이다. 몇몇 구현예에서, 상기 제형은 예를 들어 주사에 의한 전달보다는 경구 전달이 다양한 질환, 특히 염증 및/또는 섬유증에 의해 표시되는 질환의 치료를 허용하도록 이러한 RNA의 경구 생체이용성을 향상시킨다.
몇몇 구현예에서, 핵산, 양이온성 지질, 적어도 하나의 카세인 단백질, 및 키토산을 포함하는, 핵산의 경구 전달용 제형이 본원에서 제공된다.
몇몇 구현예에서, 상기 제형의 핵산은 리보핵산(RNA)을 포함하되, 상기 RNA는 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 0.0001 내지 약 0.01% 범위의 양으로 존재한다. 몇몇 구현예에서, 상기 적어도 하나의 카세인 단백질은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.25 내지 약 7% 범위의 양으로 존재하는 적어도 α-s1 카세인 서브유닛을 포함하고, 상기 키토산은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.0001 내지 약 4% 범위의 양으로 존재한다.
몇몇 구현예에서, 복수의 인공 지질 미셀(artificial lipid micelles), 복수의 핵산을 포함하는, 핵산의 경구 전달용 제형이 제공되되, 상기 핵산의 일부는 인공 지질 미셀 내에 캡슐화되고, 코팅은 카세인 단백질과 키토산 중합체의 혼합물을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 핵산은 리보핵산(RNA)을 포함하고 상기 RNA는 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.00001 내지 약 0.05% 범위의 양으로 존재하고, 상기 카세인 단백질과 키토산 중합체의 혼합물은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.5 내지 약 5% 범위의 양으로 존재하는 적어도 α-s1 카세인 서브유닛을 포함하고, 상기 키토산은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.001 내지 약 1% 범위의 양으로 존재한다.
몇몇 구현예에서, 상기 제형은 산을 더 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 산은 부피 기준으로 제형의 약 0.001 내지 약 1% 범위의 양으로 존재하고, 상기 산은 아세트산, 시트르산, 인산 및 시트르산으로부터 선택된다. 한 구현예에서, 상기 제형은 아세트산을 더 포함하되, 상기 아세트산은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.01 내지 약 1% 범위의 양으로 존재한다.
몇몇 구현예에서, 상기 양이온성 지질은 핵산의 각 마이크로그램에 대해 약 0.1 내지 약 5 마이크로리터 범위의 양으로 존재한다. 몇몇 구현예에서, 상기 핵산은 비-암호화 RNA, 암호화 RNA(예를 들어 mRNA), 또는 이들의 조합을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 키토산은 저분자량 키토산이다. 몇몇 구현예에서, 저분자량 키토산은 약 50 내지 약 190 킬로달톤(kiloDaltons)의 질량 범위이다.
몇몇 구현예에서, 상기 핵산은 비-암호화 RNA 또는 암호화 RNA를 포함하되, 상기 RNA는 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.001 내지 약 0.005% 범위의 양으로 존재하고, 상기 적어도 하나의 카세인 단백질은 α-s1 카세인 서브유닛, α-s2 카세인 서브유닛, β 카세인 서브유닛, 및 κ 카세인 서브유닛의 혼합물을 포함하되, 상기 카세인 서브유닛은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 1 내지 3% 범위의 양으로 존재하고, 상기 키토산은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.01 내지 0.1% 범위의 양으로 존재한다.
몇몇 구현예에서, 상기 핵산은 비-암호화 RNA 또는 암호화 RNA를 포함하되, 상기 RNA는 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.0015 내지 약 0.004% 범위의 양으로 존재하고, 상기 카세인 서브유닛의 혼합물은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 2 내지 3% 범위의 양으로 존재하고, 상기 키토산은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.05 내지 0.1% 범위의 양으로 존재하고, 상기 양이온성 지질은 핵산의 각 마이크로그램에 대해 약 1 내지 약 3 마이크로리터 범위의 양으로 존재한다.
몇몇 구현예에서, 상기 핵산은 비-암호화 RNA 또는 암호화 RNA를 포함하되, 상기 RNA는 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.0015 내지 약 0.0035% 범위의 양으로 존재하고, 상기 카세인 서브유닛의 혼합물은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 2.2 내지 2.8% 범위의 양으로 존재하고, 상기 키토산은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.06 내지 0.09% 범위의 양으로 존재하고, 상기 양이온성 지질은 핵산의 각 마이크로그램에 대해 약 1 내지 약 2 마이크로리터 범위의 양으로 존재한다.
몇몇 구현예에서, 대상체에 투여시, 상기 RNA는 IL1-B, IL-6, TGF 베타, NLRP3, p21, 및 IL-4 중의 하나 이상의 발현을 감소시킨다. 몇몇 구현예에서, 대상체에 투여시, 상기 RNA는 대상체의 수축기 혈압(systolic blood pressure)을 감소시킨다. 몇몇 구현예에서, 대상체에 투여시, 상기 RNA는 대상체의 확장기 혈압을 감소시킨다. 몇몇 구현예에서, 대상체에 투여시, 상기 RNA는 대상체의 적어도 하나의 근육의 근지구력(muscular endurance), 피로에 대한 근육 저항성, 근육 강도 및/또는 근육 수축성을 향상시킨다. 구현예에 따라, 상기 근육은 골격근 또는 심근일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 대상체에 투여시, 상기 RNA는 뇌성 나트륨이뇨 펩티드의 발현을 감소시킨다.
몇몇 구현예에서, 대상체에 투여시, 상기 RNA는 승모판 환상 조직 속도(mitral annular tissue velocity)에 대한 확장기 승모판 유입 속도(diastolic mitral inflow velocity)(E/e')를 감소시킨다. 몇몇 구현예에서, 대상체에 투여시, 상기 RNA는 대상체 내의 글루코스 내성을 향상시킨다. 몇몇 구현예에서, 대상체에 투여시, 상기 RNA는 대상체의 단위 체질량당 비만 및/또는 피하 지방 조직을 감소시킨다. 몇몇 구현예에서, 심근경색증을 갖는 대상체에 투여시, 상기 RNA는 심근경색증 후 경색 크기를 감소시킨다. 몇몇 구현예에서, 심근경색증을 갖는 대상체에 투여시, 상기 RNA는 심근경색증 후 순환성 심장 트로포닌 I 농도를 감소시킨다.
몇몇 구현예에서, 상기 제형은 증가된 염증 및/또는 섬유증과 관련된 질환의 하나 이상의 증상을 완화시킨다. 몇몇 구현예에서, 상기 질환은 보존된 박출률(ejection fraction)을 갖는 심부전, 심근경색증, 근이영양증, 피부경화증, 바이러스 감염, 및 비대성 심근증으로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서, 상기 제형은 서열번호 1-25, 31, 32 중의 하나 이상에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 제형은 서열번호 1-25, 31, 32 중의 하나 이상에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열로 본질적으로 이루어진 핵산을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 제형은 서열번호 26 내지 30 중의 하나 이상에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 카세인 단백질을 포함한다
또한, 본원에 개시된 제형의 치료적 유효량을 염증 및/또는 섬유증을 나타내는 질환을 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 염증 및/또는 섬유증과 관련된 질환을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 추가로, 염증 및/또는 섬유증과 관련된 질환의 치료를 위한 본원에 개시된 제형의 용도가 제공된다. 추가로, 염증 및/또는 섬유증과 관련된 질환의 치료를 위한 의약(medicament)의 제조를 위한 본원에 개시된 제형의 용도가 제공된다. 몇몇 구현예에서, 상기 질환은 보존된 박출률을 갖는 심부전, 심근경색, 근이영양증, 피부경화증, 바이러스 감염 및/또는 비대성 심근증을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 핵산의 경구 전달용 제형을 제조하는 방법이 제공되되, 핵산을 양이온성 지질을 포함하는 용액과 접촉시켜서 인공 지질 미셀에 핵산을 캡슐화함으로써, 상기 핵산을 포함하는 인공 지질 미셀을 생성하는 단계; 상기 핵산을 포함하는 인공 지질 미셀을 2 내지 10%의 카세인 단백질을 포함하는 용액과 접촉시켜서 상기 핵산을 포함하는 인공 지질 미셀을 카세인 단백질로 코팅함으로써, 상기 핵산을 포함하는 카세인 코팅된 인공 지질 미셀을 생성하는 단계; 및 상기 핵산을 포함하는 카세인 코팅된 인공 지질 미셀을 산과 키토산 중합체의 혼합물에 노출시키는 단계;를 포함하되, 상기 산과 키토산 중합체의 혼합물은 상기 카세인 단백질과의 상기 키토산의 인터칼레이션(intercalation) 및 상기 핵산을 포함하는 카세인-키토산 코팅된 지질 미셀의 침전을 허용한다.
몇몇 구현예에서, 상기 핵산은 핵산의 각 마이크로그램에 대해 약 0.5 내지 2.0 ㎕의 지질 용액의 비율로 양이온성 지질과 접촉된다. 몇몇 구현예에서, 상기 방법은 핵산 및 양이온성 지질 용액에 액체 배지를 약 100 ㎕의 최종 부피로 첨가하는 것을 더 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 카세인 단백질은 5% 소 카세인 용액(bovine casein solution) 내에 존재하고, 상기 핵산을 포함하는 인공 지질 미셀에 1:10의 부피비로 첨가된다. 몇몇 구현예에서, 산과 키토산 중합체의 혼합물은 약 0.05 내지 2%의 아세트산 용액 및 약 0.1% 내지 2%의 키토산 용액을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 핵산, 양이온성 지질, 적어도 하나의 카세인 단백질, 및 키토산을 포함하는 경구 제형을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증 및/또는 섬유증과 관련된 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 몇몇 구현예에서, 상기 경구 제형은 1일 기준으로 제공된다. 몇몇 구현예에서, 단일 경구 투여는 염증 및/또는 섬유증과 관련된 질환을 개선하거나 그렇지 않은 경우 치료하는데 효과적이다. 몇몇 구현예에서, 상기 핵산은 리보핵산(RNA)을 포함하되, 상기 RNA는 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.00001 내지 약 0.01% 범위의 양으로 존재하고, 적어도 하나의 카세인 단백질은 적어도 α-s1 카세인 서브유닛을 포함하고, 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.5 내지 약 5% 범위의 양으로 존재하고, 상기 키토산은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.001 내지 약 1% 범위의 양으로 존재한다.
본원에서는 CGUCCGAUGGUAGUGGGUUAUCAG(서열번호 12)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산이 제공되되, 상기 핵산은 RNA이며, 상기 핵산은 최대 30 nt 길이이다. 또한, CGUCCGAUGGUAGUGGGUUAUCAG(서열번호 12)에 대해 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산이 제공되되, 상기 핵산은 RNA이며, 상기 핵산은 최대 30 nt 길이이다. 선택적으로, 상기 핵산은 적어도 하나의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 1 내지 10개의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 위치 1-12 내에 적어도 하나의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 서열의 위치 13-24 내에 적어도 하나의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 화학적으로-변형된 뉴클레오티드는 백본 변형(backbone modification)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 백본 변형은 백본 당 변형(backbone sugar modification)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 상기 뉴클레오티드 서열의 위치 1, 3, 5, 20, 22 및 24 중의 하나 이상에 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 화학적으로-변형된 뉴클레오티드는 잠긴 핵산(locked nucleic acid; LNA)이다. 일부 구현예에서, 상기 뉴클레오티드 서열은 상기 뉴클레오티드 서열의 위치 1, 3, 5, 20, 22 및 24에 LNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산의 길이는 24개의 뉴클레오티드이다.
본원에서는 CGUCCGAUGGUAGUGGGUUAUCAG(서열번호 12)에 대해 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산이 제공되되, 상기 핵산은 RNA이다. 선택적으로, 상기 뉴클레오티드 서열은 CGUCCGAUGGUAGUGGGUUAUCAG(서열번호 12)이다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 적어도 하나의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 1 내지 10개의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 위치 1-12 내에 적어도 하나의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드 및/또는 상기 뉴클레오티드 서열의 위치 13-24 내에 적어도 하나의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 화학적으로-변형된 뉴클레오티드는 백본 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 백본 변형은 백본 당 변형이다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 상기 뉴클레오티드 서열의 위치 1, 3, 5, 20, 22 및 24 중의 하나 이상에 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 화학적으로-변형된 뉴클레오티드는 잠긴 핵산(LNA)이다. 일부 구현예에서, 상기 뉴클레오티드 서열은 상기 뉴클레오티드 서열의 위치 1, 3, 5, 20, 22 및 24에 LNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산의 길이는 최대 30 nt이다.
일부 구현예에서, 상기 핵산은 뉴클레오티드 서열 CGUCCGAUGGUAGUGGGUUAUCAG로 구성되거나 또는 본질적으로 구성된다.
뉴클레오티드 서열 CGUCCGAUGGUAGUGGGUUAUCAG로 구성된 핵산으로서, 상기 핵산은 RNA이며, 상기 뉴클레오티드 서열의 위치 1, 3, 5, 20, 22 및 24 각각은 LNA이다.
또한, 본 발명의 단리된 핵산 중의 어느 하나; 및 약학적으로 허용가능한 부형제;를 포함하는 조성물이 제공된다. 선택적으로, 상기 조성물은 형질 감염 시약(transfection reagent)을 더 포함한다. 선택적으로, 상기 형질 감염 시약은 리포좀, 세포외 소포(extracellular vesicle; EV), 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-양이온성 지질 복합체(PCLC) 중의 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 형질 감염 시약은 심장구 유래 세포(CDC)로부터 유래된 EV를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 카세인 인단백질을 더 포함한다. 선택적으로, 상기 조성물은 키토산을 더 포함한다. 선택적으로, 상기 단리된 핵산은 카세인-키토산 복합체에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 카세인 미셀을 포함한다.
본원에서는 본 발명의 핵산 중의 어느 하나에 노출되거나 형질 감염된 대식세포가 제공되되, 상기 대식세포의 항-염증 활성은 핵산 부재의 대식세포에 비해 증가된다. 선택적으로, 상기 대식세포는 대상체에 존재한다. 선택적으로, 상기 대식세포는 배양 중에 있다.
또한 본 발명의 핵산 중의 어느 하나; 및 형질 감염 시약;을 포함하는 키트가 제공된다. 선택적으로, 상기 형질 감염 시약은 리포좀, 세포외 소포(EV), 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-양이온성 지질 복합체(PCLC) 중의 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 상기 키트는 약학적으로 허용가능한 부형제를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 키트는 카세인 인단백질을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 키트는 키토산을 더 포함한다.
또한, 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 조성물 중의 어느 하나의 치료적 유효량을 심장 병태 또는 그의 증상을 치료할 필요가 있는 대상체에 투여하고, 그에 의해서 심장 병태 또는 그의 증상을 치료하는 것을 포함하는, 심장 병태 또는 그의 증상을 치료하는 방법이 제공된다. 선택적으로, 상기 심장 병태는 심부전의 증상 및/또는 후유증을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 심장 병태는 비대성 심근증을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 심장 병태는 보존된 박출률을 갖는 심부전(HFpEF)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 심장 병태는 감염성 질환의 증상 또는 후유증을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 감염성 질환은 바이러스 감염을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 심장 병태를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 심장 병태가 발달할 위험이 있다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 투여 전에 고혈압, 심초음파에 의한 E/e' 비율 상승, 심장 비대, 심근 섬유증, 비만, 소모성 질환(wasting), 지구력 감소, 및 전신 염증 마커 상승 중의 하나 이상을 나타낸다.
또한, 본 발명의 어느 하나의 핵산 또는 본 발명의 어느 하나의 조성물의 치료적 유효량을 근육 장애 또는 그의 증상을 치료할 필요가 있는 대상체에게 투여하고, 그에 의해서 근육 장애 또는 그의 증상을 치료하는 것을 포함하는, 근육 장애 또는 그의 증상을 치료하는 방법이 제공된다. 선택적으로, 상기 근육 장애는 근이영양증 또는 심장 병태를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 근육 장애는 뒤시엔느 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 근육 장애를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 근육 장애가 발달할 위험이 있다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 유전적으로 근육 장애를 발달시키기 쉽다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 투여 전에 지구력 감소 및 골격근 기능 감소 중의 하나 이상을 나타낸다.
또한, 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 조성물 중의 어느 하나의 치료적 유효량을 염증성 질환을 치료할 필요가 있는 대상체에게 투여하고, 그에 의해서 염증성 질환을 치료하는 것을 포함하는 염증성 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 선택적으로, 상기 염증성 병태는 감염성 질환의 증상 또는 후유증을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 감염성 질환은 바이러스 감염을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 염증성 병태는 사이토카인 폭풍을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 염증성 병태는 면역요법(예를 들어 암의 경우)과 관련이 있다. 일부 구현예에서, 상기 염증성 병태는 피부에 영향을 미치는 자가면역 병태인 피부경화증이다. 일부 구현예에서, 상기 염증성 병태는 피부뿐만 아니라 폐와 심장을 포함하는 내부 기관에도 영향을 미치는 피부경화증과 유사한 자가면역 병태인 전신성 경화증이다.
또한, 본 발명의 어느 하나의 핵산 또는 본 발명의 어느 하나의 조성물의 치료적 유효량을 섬유성 질환을 치료할 필요가 있는 대상체에게 투여하고, 그에 의해서 섬유성 질환을 치료하는 것을 포함하는 섬유성 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 선택적으로, 상기 섬유성 질환은 감염성 질환의 증상 또는 후유증을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 감염성 질환은 바이러스 감염을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 섬유증 병태는 특발성 폐 섬유증이다. 일부 구현예에서, 상기 섬유증 병태는 간경변증이다.
일부 구현예에서, 상기 핵산의 치료적 유효량은 약 0.001 ㎍/g 내지 약 100 ㎍/g을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 치료 방법 중의 어느 하나는 상기 핵산 또는 조성물의 치료적 유효량을 주 2회 이하로 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 치료적 유효량의 핵산 또는 조성물을 정맥내, 근육내, 심장내 또는 경구 투여하는 것을 포함한다. 선택적으로, 상기 핵산 또는 조성물의 치료적 유효량은 경구 투여된다.
또한, 본 발명의 핵산 중의 어느 하나 또는 본 발명의 조성물 중의 어느 하나를 대식세포의 집단과 접촉시켜서 상기 집단의 대식세포의 항-염증 활성을 촉진시키는 것을 포함하는, 대식세포의 항-염증 활성을 촉진시키는 방법이 제공된다. 선택적으로, 상기 접촉은 염증 또는 섬유증을 특징으로 하는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 핵산 또는 조성물을 투여하여 상기 대상체에서 대식세포의 항-염증 활성을 촉진시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 대식세포는 인간 대식세포이다.
도 1a 및 도 1b는 본원에 제공되는 경구 제형에 대한 다양한 비-제한적 개략도를 도시한다. 도 1a는 핵산, 예를 들어 치료용 핵산을 캡슐화하는데 지질이 사용되고, 캡슐화된 핵산이 경구 전달을 허용하는 카세인-키토산 복합체로 코팅되는 비-제한적 개략도를 나타내며, 도 1b는 치료용 핵산, 예를 들어 RNA(예를 들어 비-암호화 RNA 또는 암호화 RNA)에 대한 대안적인 제형의 대안적인 비-제한적 개략도를 나타낸다.
도 2a 내지 도 2c는 본원에서 제공되는 경구 제형과 관련된 개략도 및 데이터를 나타낸다. 도 2a 및 도 2b는 본원에 개시된 구현예에 따른 비-암호화 RNA(도 2a에서는 TY4, 도 2b에서는 piR-659/piREX1) 및 지질-카세인-키토산 복합체의 캡슐화에 대한 다양한 비-제한적 개략도를 나타낸다. 도 2c는 piREX1(및 그의 유도체, U 내지 A)의 경구 투여가 (대조군과 비교하여) 경색 질량(infarct mass) 및 심장 트로포닌 수준을 감소시키는데 효과적임을 입증하는 데이터를 보여준다.
도 3a 내지 도 3m은 본 발명의 일부 비-제한적 구현예에 따른, 보존된 박출률을 갖는 심부전증(HFPEF)에서 TY4를 투여하는 치료 효과를 보여준다. 도 3a는 HFpEF의 모델에서 TY4의 치료 효과를 측정하기 위한 프로토콜을 보여주는 개략도이다. 도 3b는 수축기 혈압(좌측 패널)과 확장기 혈압(우측 패널)을 비교한 그래프이다. 도 3c는 트레드밀 운동 거리를 비교한 그래프이다. 도 3d는 승모판 환상 조직 속도(mitral annular tissue velocity)에 대한 초기 확장기 승모판 유입 속도(early diastolic mitral inflow velocity)의 비율(E/e')을 비교한 그래프이다. 도 3e는 전신 뇌성 나트륨이뇨 펩티드(BNP) 수준을 비교한 그래프이다. 도 3f는 수축기 혈압(좌측 패널)과 확장기 혈압(우측 패널)을 비교한 그래프의 모음이다. 도 3g는 승모판 환상 조직 속도에 대한 초기 확장기 승모판 유입 속도의 비율(E/e')을 비교한 그래프이다. 도 3h는 트레드밀 운동 거리(treadmill exercise distances)를 비교한 그래프이다. 도 3i는 체계적인 BNP 수준을 비교한 그래프이다. 도 3j는 시간에 따른 수축기 혈압을 비교한 그래프이다. 도 3k는 시간에 따른 확장기 혈압을 비교한 그래프이다. 도 3l은 시간에 따른 E/e' 비율을 비교한 그래프이다. 도 3m은 시간에 따른 트레드밀 운동 거리를 비교한 그래프이다.
도 4a 내지 도 4f는 본 발명의 일부 비-제한적 구현예에 따른 보존된 박출률을 갖는 심부전증(HFpEF)에서 TY4를 투여하는 경우의 치료 효과를 나타낸다. 도 4a 내지 도 4e의 데이터는 도 3의 해당 데이터의 추가 복제(예를 들어 더 큰 샘플 크기)로부터 얻어진다. 도 4a는 대조군, 비히클, 구강제제를 투여받은 동물의 수축기 혈압을 비교한 그래프이다. 도 4b는 대조군, 비히클, 경구 제형을 투여받은 동물의 확장기 혈압을 비교한 그래프이다. 도 4c는 대조군, 비히클, 경구 제형을 투여받은 동물의 승모판 환상 조직 속도에 대한 초기 확장기 승모판 유입 속도의 비율(E/e')을 비교한 그래프이다. 도 4d는 대조군, 비히클, 경구 제형을 투여받은 동물의 전신 뇌성 나트륨이뇨 펩티드(BNP) 수준을 비교한 그래프이다. 도 4e는 대조군, 비히클, 경구 제형을 투여받은 동물의 트레드밀 운동거리를 비교한 그래프이다. 도 4f는 대조군, 비히클, 경구 제형을 투여받은 동물의 혈당 순환 수준을 비교한 그래프이다. 도 4g는 대조군, 비히클, 경구 제형을 투여받은 동물의 심장 크기를 나타낸다.
도 5a 내지 5e는 심근경색 모델에서 치료용 RNA의 경구 투여 효능과 관련된 데이터를 나타낸다. 도 5a는 경색 크기와 관련된 데이터를 나타낸다. 도 5b는 다양한 치료군의 심장 조직 절편을 나타낸다. 도 5c는 손상 후 48시간에 심장 트로포닌의 순환 수준에 대한 데이터를 나타낸다. 도 5d는 경구 제형에 키토산을 사용하지 않은 치료군을 포함한 경색 질량 관련 추가 데이터를 나타낸다. 도 5e는 경구 제형에 키토산을 사용하지 않은 치료군을 포함한 순환성 심장 트로포닌 수준 관련된 추가 데이터를 나타낸다.
도 6a 내지 6e는 피부경화증 모델에서 치료용 핵산을 전달하는 경구 제형과 관련된 데이터를 나타낸다. 도 6a는 표시된 치료군에서 트레드밀 상의 주행 거리와 관련된 데이터를 나타낸다. 도 6b는 체중과 관련된 데이터를 나타낸다. 도 6c는 심박수(HI)를 나타내는 체중에 대한 심박수의 비율과 관련된 데이터를 나타낸다. 도표 6d는 폐지수(PI)를 나타내는 체중에 대한 폐 중량의 비율과 관련된 데이터를 나타낸다. 도 6e는 지시된 그룹에 대한 폐 중량과 관련된 데이터를 나타낸다.
도 7a 내지 7d는 피부경화증 모델에서 치료용 핵산을 전달하는 경구 제형과 관련된 추가적인 데이터를 보여준다. 도 7a는 심장 섬유증과 관련된 조직학적 데이터를 나타낸다. 도 7b는 치료군별로 표로 만든 심장 섬유증 데이터의 요약을 보여준다. 도 7c는 피부 섬유증과 관련된 조직학을 보여준다. 도 7d는 치료군별로 표로 만든 피부 섬유증 데이터의 요약을 보여준다.
도 8a 내지 8f는 피부경화증과 관련된 추가 데이터를 나타낸다. 도시된 데이터는 IL1-B(도 8a), IL-6(도 8b), TGF 베타(도 8c), NLRP3(도 8d), p21(도 8e), IL-4(도 8f)의 정량을 보여준다
도 9a 내지 9h는 근이영양증 모델에서 치료용 핵산을 전달하는 경구 제형과 관련된 데이터를 나타낸다. 도 9a는 좌심실 박출률(EF)을 측정하기 위한 경흉부 심초음파와 관련된 데이터를 나타낸다. 도 9b는 마슨의 삼색 현미경 사진(Masson's trichrome micrographs)과 치료용 핵산의 경구 투여가 비히클 대조군 마우스에 비해 심근 섬유증이 적음을 보여주는 풀링된 데이터(우측 하위 패널)를 보여준다. 도 9c는 기준선에서 8주 후에 근육 기능을 요약한 자료를 나타낸다. 도 9d는 마슨의 삼색 현미경 사진과 치료용 핵산의 경구 투여가 비히클 대조군 마우스에 비해 근육 섬유증이 적음을 보여주는 풀링된 데이터(우측 하위 패널)를 보여준다. 도 9e는 대조군 대비 경구 전달된 치료용 RNA의 근섬유 수와 관련된 데이터를 보여준다. 도 9f는 경구 치료된 동물 대 대조군의 운동 능력과 관련된 데이터를 나타낸다. 도 9g는 경구 치료된 동물 대 대조군의 심장 기능과 관련된 데이터를 나타낸다. 도 9h는 경구 치료된 동물 대 대조군의 근육 기능과 관련된 데이터를 나타낸다.
핵산 치료제는 유전자 수준에서 질환을 치료할 수 있는 잠재력을 제공한다. 많은 종래의 치료는 일반적으로 근본적인 원인보다는 단백질을 표적으로 하기 때문에 일시적인 치료 효과를 유도한다. 대조적으로, 핵산 치료제는 유전자 억제, 부가, 대체 또는 편집을 통해 장기간-지속되는(또는 심지어 영구적인, 예를 들어 치유적) 효과에 대한 잠재력을 갖는다. 그러나 핵산 치료제의 성공적인 사용은 안정성 및/또는 생체이용성을 향상시키는 전달 기술에 대한 경쟁력을 가질 것이다.
몇몇 구현예에서, 본원에 제공된 제형은 대상체에 대한 핵산의 향상된 전달을 허용한다. 몇몇 구현예에서, 상기 핵산은 DNA를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 핵산은 RNA를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 핵산은 암호화 RNA(예를 들어 메신저 RNA 또는 mRNA)를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 핵산은 비-암호화 RNA(ncRNA)를 포함한다. mRNA는 치료 효과를 나타내는 단백질을 암호화하는 서열의 전달에 의해 치료 효과를 제공할 수 있다. 상기 구현예에 따라, 이는 비기능성 단백질을 대체하는 단백질일 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 암호화 RNA는 면역 반응이 요망되는 단백질(예를 들어 바이러스 단백질)을 암호화할 수 있는데, 예를 들어 그 단백질에 대한 항체의 생산을 위해 암호화할 수 있다. ncRNA는 항-염증성 사이토카인의 분비를 증가시키거나 염증성 사이토카인의 분비를 감소시키는 능력에 기초하여 긍정적인 치료 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 특정 ncRNA는 심장보호, 항-섬유화 및/또는 항-비대 효과를 나타낸다.
본원에서 제공된 개시 이전에, ncRNA는 비경구 투여 경로, 예를 들어 근육 내, 피하, 또는 정맥 내 투여를 통해 이를 필요로 하는 대상체에게 전달되었다. 본원에서 제공되는 몇몇 구현예에서는 ncRNA 또는 다른 치료용 핵산의 경구 전달을 가능하게 하는 제형이다. 몇몇 구현예에서, 상기 제형은 핵산이 온전한 형태로 하부 GI 관에 도달하고 그의 항-염증 및/또는 항-섬유화 효과가 실현될 수 있는 형태로 흡수되도록 상부/중간 GI 관(예를 들어 위)의 저산 환경으로부터 핵산을 보호한다.
몇몇 구현예에서, 본원에 제공된 제형은 염증 및/또는 조직 손상이 병리학의 주요한 구동자인 병태를 치료하는데 있어서 핵산의 사용을 허용한다. 일부 구현예에서, 이러한 제형을 사용하여 치료되는 병태는 염증성 질환, 근이영양증, 또는 심장 손상을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 제한됨이 없이 피부경화증(scleroderma) 및/또는 근이영양증과 같은 다른 질병 중에서도 심근경색 및/또는 심부전으로 인해 심장 손상을 앓고 있는 대상체에게 투여될 때 심장보호 효과를 갖는다. 이론에 구애됨이 없이, 본 발명의 조성물은 ncRNA와 같은 핵산이 쉽게 흡수되는 하부 GI 관으로 성공적으로 전달될 수 있게 하며, 예를 들어 대식세포로부터 인터루킨 10(IL-10)의 분비를 촉진함으로써 대식세포의 항-염증 활성을 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 핵산, 예를 들어 ncRNA의 하부 GI 관으로의 성공적인 전달을 허용하고, 핵산에 노출된 대식세포에서 하나 이상의 유전자 생성물의 발현 및/또는 후성적 변화를 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 핵산을 포함하는 제형을 투여하여 치료되는 질환, 예를 들어 염증성 질환, 근이영양증, 또는 심장 손상을 치료한다.
정 의
본원에서 사용되는 용어 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오티드"는 인산기(phosphate group) 및 교환가능한 유기 염기에 연결된 다수의 뉴클레오티드(예를 들어 당(예를 들어 리보스 또는 데옥시리보스)을 포함하는 분자를 지칭하며, 이는 치환된 피리미딘(예를 들어 시토신(C), 티미딘(T) 또는 우라실(U)) 또는 치환된 퓨린(예를 들어 아데닌(A) 또는 구아닌(G))이다. 상기 용어는 폴리뉴클레오시드(즉, 폴리뉴클레오티드에서 포스페이트를 뺀 것) 및 임의의 다른 유기 염기 함유 중합체를 포함한다. 퓨린 및 피리미딘은 아데닌, 시토신, 구아닌, 티미딘, 이노신, 5-메틸시토신, 2-아미노퓨린, 2-아미노-6-클로로퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 하이포크산틴, 및 기타 천연 및 비천연 핵염기, 치환 및 비치환된 방향족 모이어티를 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 핵산은 임의의 다른 적합한 변형을 포함할 수 있다. 따라서, 상기 용어 핵산은 또한 염기 및/또는 당과 같은 치환 또는 변형을 갖는 핵산을 포괄한다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 핵산 분자는 예를 들어 당해 분야에 기술된 분자(예를 들어 조작된 또는 설계된 분자 또는 야생형 분자)와 참조 분자(예를 들어 참조 폴리펩티드 또는 참조 폴리뉴클레오티드)와 어느 정도의 서열 유사성 또는 동일성을 공유할 수 있다. 당해 분야에서 얄려진 용어 "동일성"은, 서열을 비교하여 결정된, 둘 이상의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 서열 사이의 관계를 지칭한다. 당해 분야에서 동일성은 또한 둘 이상의 아미노산 잔기 또는 핵산 잔기의 일련의 매치 횟수에 의해 결정된 서열 사이의 서열 관련성의 정도를 의미한다. 동일성은 특정 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램(예를 들어 "알고리즘")에 의해 어드레싱된 (존재한다면) 갭 정렬을 갖는 둘 이상의 더 작은 서열 사이의 동일한 매치의 백분율을 측정한다. 관련 펩티드의 동일성은 공지된 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다. 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 적용되는 "% 동일성"은 서열을 정렬하고 필요에 따라 갭을 도입한 후 제 2 서열의 아미노산 서열 또는 핵산 서열의 잔기와 동일한 후보 아미노산 서열 또는 핵산 서열의 백분율(아미노산 잔기 또는 핵산 잔기)로 정의되어 최대 퍼센트 동일성을 달성한다. 임의의 적합한 방법 및 정렬을 위한 컴퓨터 프로그램이 사용될 수 있다. 동일성은 퍼센트 동일성의 계산에 따라 달라지지만, 계산에 도입된 갭 및 벌점으로 인해 값이 다른 값이 될 수 있는 것으로 이해된다. 일반적으로 특정 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 변이체는 본원에 기재되고 당업자에게 공지된 서열 정렬 프로그램 및 파라미터에 의해 결정된 바와 같이 특정 참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%이지만 100% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 이러한 정렬 도구로는 BLAST 스위트(Stephen F. Altschul 등 (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs". Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)의 것을 포함한다. 또 다른 대중적인 로컬 정렬 기법은 스미스-워터맨 알고리즘(Smith, T. F. & Waterman, M. S. (1981) "Identification of common molecular subsequences." J. Mol. Biol. 147:195-197.)에 기반한다. 동적 프로그래밍에 기반한 일반적인 글로벌 정렬 기법은 니들만-운쉬 알고리즘(Needleman, S. B. & Wunsch. C.D. (1970) "A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins" J. Mol. Biol. 48:443-453)에 기반한다. 더욱 최근에는 니들만-운쉬 알고리즘을 포함한 다른 최적의 글로벌 정렬 방법보다 빠르게 뉴클레오티드 및 단백질 서열의 글로벌 정렬을 목적으로 하는 패스트 옵티멀 글로벌 서열 정렬 알고리즘(FOGSAA)이 개발되었다. 다른 도구는 본원에서 구체적으로 후술하는 "동일성"의 정의에 기재되어 있다.
상기 용어 "동일성"은 중합체 분자, 예를 들어 폴리뉴클레오티드 분자(예를 들어 DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 및/또는 폴리펩티드 분자 사이의 전반적인 관련성을 지칭한다. 예를 들어 2개의 폴리핵산 서열의 퍼센트 동일성의 계산은 최적의 비교 목적으로 2개의 서열을 정렬함으로써 수행될 수 있다(예를 들어 최적의 정렬을 위해 제 1 및 제 2 핵산 서열 중의 하나 또는 둘 다에 갭이 도입될 수 있고, 비교 목적으로 동일하지 않은 서열은 무시될 수 있다). 특정 구현예에서, 비교 목적으로 정렬된 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%이다. 이어서, 상응하는 뉴클레오티드 위치의 뉴클레오티드를 비교한다. 제 1 서열 내의 위치가 제 2 서열 내의 상응하는 위치와 동일한 뉴클레오티드에 의해 점유되는 경우, 분자는 그 위치에서 동일하다. 두 서열 사이의 퍼센트 동일성은 갭의 수와 두 서열의 최적의 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 각각의 갭의 길이를 고려하여 서열이 공유하는 동일한 위치의 수의 함수이다. 서열의 비교 및 두 서열 사이의 퍼센트 동일성의 결정은 적절한 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어 2개의 핵산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 문헌 [Computational Molecular Biology, Lesk, A. M. ed., Oxford University Press, New York, 1988]; [Biocomputing: Informatics and Genome Projects. Smith. D. W., ed., Academic Press. New York, 1993]; [Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987]; [Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991];에 기재된 것과 같은 방법을 사용하여 결정될 수 있으며, 상기 문헌 각각은 본원에서 참조로 포함된다. 예를 들어 2개의 핵산 서열 간의 퍼센트 동일성은 문헌 [Meyers and Miller (CABIOS, 1989, 4:11-17)]의 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있으며, 상기 문헌은 PAM 120 중량 잔류표(weight residue table), 12의 간격 길이 패널티(gap length penalty) 및 4의 간격 패널티를 사용하는 ALING 프로그램(버전 2.0)에 포함되었다. 2개의 핵산 서열 간의 퍼센트 동일성은 대안적으로 NWSgapdna.CMP 매트릭스를 이용하여 GCG 소프트웨어 패키지에서 GAP 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다. 서열 간의 퍼센트 동일성을 결정하기 위하여 통상적으로 사용되는 방법으로는 본원에서 참조로 포함된 문헌 [Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48:1073 (1988)] Carillo, H, and Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48:1073(1988)에 개시된 방법을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 동일성을 결정하는 기술은 공개적으로 입수 가능한 컴퓨터 프로그램에서 선별된다. 두 서열 간의 상동성을 결정하기 위한 컴퓨터 소프트웨어의 예로는 GCG 프로그램 패키지, [Devereux, J 등, Nucleic Acids Research, 12(1), 387(1984), BLASTP, BLASTN] 및 [FASTA Altschul, S.F. 등, J. Molec. Biol., 215, 403(1990)]의 것을을 들 수 있으나, 이로써 제한되지는 않는다.
용어 "왓슨-크릭 염기쌍" 또는 "염기쌍"은 특정 염기쌍 사이의 수소 결합("상보적 염기쌍")을 형성하는 것을 의미한다. 예를 들어 2개의 수소 결합은 아데닌(A)과 우라실(U) 사이에 형성되고, 3개의 수소 결합은 구아닌(G)과 시토신(C) 사이에 형성된다. 2개의 폴리뉴클레오티드 사이의 결합력을 평가하는 한 가지 방법은 2개의 폴리뉴클레오티드의 구아닌과 시토신 염기 사이에 형성된 결합의 백분율("GC 함량")을 정량하는 것이다. 일부 구현예에서, 다량체 분자(예를 들어 다량체 mRNA 분자)의 2개의 핵산 사이의 결합의 GC 함량은 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50%이다. 일부 구현예에서, 다량체 분자(예를 들어 다량체 mRNA 분자)의 2개의 핵산 사이의 결합의 GC 함량은 10% 내지 70%, 약 20% 내지 약 60%, 또는 약 30% 내지 약 60%이다. 상보적 염기쌍의 결합을 통한 핵산 이합체의 형성은 "혼성화"로도 지칭될 수 있다. 일반적으로 상보적 영역을 공유하는 2개의 핵산은 적절한 조건 하에서 (예를 들어 핵산 염기쌍을 통해) 혼성화되어 이중구조를 형성할 수 있다. 상보적 영역의 크기는 다양할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 상보적 영역의 길이는 약 2개의 염기쌍 내지 약 100개의 염기쌍의 범위이다. 일부 구현예에서, 상기 상보적 영역의 길이는 약 5개의 염기쌍 내지 약 75개의 염기쌍의 범위이다. 일부 구현예에서, 상기 상보적 영역의 길이는 약 10개의 염기쌍 내지 약 50개의 염기쌍의 범위이다. 일부 구현예에서, 상기 상보적 영역의 길이는 약 20개의 염기쌍 내지 약 30개의 염기쌍의 범위이다.
본원에서 단리된 생체분자, 예를 들어 핵산과 관련하여 사용되는 용어 "단리된"은 본 발명에 비추어 볼 때 당업자에게 통상적이고 관용적인 의미를 갖는다. 단리된 생체분자, 예를 들어 단리된 핵산은 일반적으로 비자연적 환경, 또는 생체분자의 인간 개입이 없는 환경 또는 그 환경이 아닌 환경에 존재한다. 일부 구현예에서, 상기 단리된 생체분자는 세포 또는 유기체 내부에 존재하지 않는다.
본원에서 사용되는 "세포외 소포" 또는 "EV"는 본 발명에 비추어 볼 때 당업자에게 이해되는 통상적이고 관용적인 의미를 갖는다. EV는 세포에 의해 생성되는 지질 이중층 구조를 포함하며, 엑소좀(exosomes), 미세소포(microvesicles), 에피디이모좀(epididimosomes), 아르고좀(argosomes), 엑소좀-유사 소포(exosome-like vesicles), 미세입자(microparticles), 프로미노시좀(promininosomes), 프로스타좀(prostasomes), 덱소좀(dexosomes), 텍소좀(texosomes), 덱스(dex), 텍스(tex), 아키오좀(archeosomes) 및 온코좀(oncosomes)를 포함한다.
본원에서 카세인 미셀과 관련하여 사용되는 용어 "미셀"은 본 발명에 비추어 볼 때 당업자에게 이해되는 통상적이고 관용적인 의미를 갖는다. 카세인 미셀은 하나 이상의 카세인 인단백질의 응집체(aggregates)를 포함할 수 있는 콜로이드성 입자(예를 들어 알파 s1 카세인, 알파 s2 카세인, 베타 카세인, 카파 카세인 중의 하나 이상, 둘 이상, 셋 이상 또는 넷 이상)이다.
본원에서 사용되는 용어 "대상체"는 포유류 및 비포유류를 포함하는 임의의 척추동물을 의미한다. 상기 대상체는 인간을 포함하는 영장류, 및 비-영장류 포유류, 예를 들어 설치류, 가축 또는 게임 동물(game animals)을 포함할 수 있다. 비-영장류 포유류는 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 개, 먹이, 골프, 고양이, 말, 소, 돼지, 양, 염소, 낙타, 사슴, 버팔로, 비손(bison) 등을 포함할 수 있다. 비-포유류는 조류(예를 들어 닭, 타조, 에뮤(emu), 비둘기), 파충류(예를 들어 뱀, 도마뱀, 거북), 양서류(예를 들어 개구리, 도룡뇽), 어류(예를 들어 연어, 대구, 복어, 참치) 등을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어, "개체", "환자" 및 "대상체"는 서로 바꿔 사용할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "투여"는 본원에 개시된 치료제 또는 조성물을 투여하는 임의의 적절한 경로를 포함할 수 있다. 적절한 투여 경로는 경구, 비경구, 정맥내, 근육내, 피하, 경피, 기도(에어로졸), 폐, 피하, 주사 또는 국소 투여를 포함하지만, 이로써 한정되지는 않는다. 상기 투여는 국소 또는 전신일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하다" 및 "치료"는 질환, 병태 및/또는 그의 증상을 치유, 개선, 완화(ameliorating), 경감, 중증도 경감, 예방, 진행 지연 및/또는 지연을 포함한다.
치료는 본원에 기재된 방법에 따른 치료 후에 본원에 기재된 병태의 징후 또는 증상 중의 하나 이상이 유익한 방식으로 변경되거나, 다른 임상적으로 허용되는 증상이 개선되거나, 심지어 완화되거나, 원하는 반응이 예를 들어 적어도 2%, 3%, 4%, 5%, 10% 이상 유도되는 경우, 본원에 사용된 바와 같이 "유효한" 또는 "치료적으로 유효한" 것으로 간주될 수 있다. 상기 효능은 예를 들어 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 병태의 마커, 지표, 증상 및/또는 발생률 또는 적절한 임의의 다른 측정가능한 파라미터, 예를 들어 운동 지구력(exercise endurance)을 측정함으로써 평가될 수 있다. 상기 효능은 또한 입원 평가에 따른 개인의 악화 또는 의료 개입의 필요성(예를 들어 질환의 진행이 중지됨)에 의해 측정될 수 있다. 상기 치료는 개체 또는 동물(일부 비-제한적 예로는 인간 또는 동물을 포함함)에서의 질환 또는 병태의 임의의 치료를 포함하며, 이는 (1) 질환 또는 병태를 억제하는 것, 예를 들어 증상(예를 들어 통증 또는 염증)의 악화를 예방하는 것; 또는 (2) 질환 또는 병태의 중증도를 완화하는 것, 예를 들어 증상의 퇴행을 유발하는 것을 포함한다. 질환 또는 병태의 치료에 유효한 양은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 때, 상기 용어가 본원에 정의된 질환 또는 병태에 대해 유효한 치료를 결과하기에 충분한 양을 의미한다. 제제의 효능은 병태의 신체 지표 또는 원하는 반응의 물리적 지표(예를 들어 근육 기능, 질량 또는 부피)을 평가함으로써 결정될 수 있다. 당업자는 이러한 파라미터 중의 어느 하나 또는 상기 파라미터들의 임의의 조합을 측정함으로써 투여 및/또는 치료의 효능을 모니터링할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 질환 또는 병태의 적어도 하나 이상의 증상을 완화시키는데 필요한 조성물 또는 제제의 양을 지칭하며, 원하는 효과를 제공하기에 충분한 양의 치료 조성물에 관한 것이다. 상기 용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 전형적인 대상체에게 투여될 때 특정한 항-염증 및/또는 심장보호 효과를 제공하기에 충분한 조성물 또는 치료제의 양을 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 용어 유효량은 다양한 맥락에서 질환 또는 병태의 증상의 발달을 지연시키거나, 증상 질환 또는 병태의 진행을 변경(예를 들어 질환 또는 병태의 증상의 진행을 느리게 함)시키거나, 질환 또는 병태의 증상을 역전시키기에 충분한 양을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 치료적 유효량은 치료제의 하나 이상의 투여량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 상기 치료적 유효량은 단일 투여로, 또는 복수의 투여량으로 일정 기간에 걸쳐 투여된다.
본원에서 사용되는 표현 "생리학적으로 상용성" 및 "약학적으로 허용가능한"은 타당한 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 합리적인 유익/위험 비율에 상응하는 것으로 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
세포 생물학 및 분자 생물학에서의 통상적인 용어의 정의는 문헌 ["The Merck Manual of Diagnosis and Therapy", 19th Edition, Merck Research Laboratories, 2006(ISBN 0-91 1910-19-0)]; [Robert S. Porter 등 (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994(ISBN 0-632-02182-9); Benjamin Lewin, Genes X, Jones & Bartlett Publishing, 2009(ISBN-10: 0763766321)]; [Kendrew 등 (eds.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995(ISBN 1-56081-569-8) 및 Current Protocols in Protein Sciences 2009, Wiley Intersciences, Coligan 등, eds.]에서 찾을 수 있다.
단수 용어 "a," "an," 및 "the"는 문맥상 명백하게 다르게 지시하지 않는 한 복수 개의 지시 대상을 포함한다. 유사하게, 단어 "또는"은 문맥상 명백하게 다르게 지시하지 않는 한 "및"을 포함하는 것으로 의도된다. 본원에서 사용되는 약어 "예를 들어(e.g.)"는 비-제한적 예를 나타내기 위해 사용된다. 따라서, 상기 약어 "예를 들어(e.g.)"는 용어 "예를 들어(for example)"와 동의어이다. 본원에서 예를 들어 분자량의 값 및 범위를 정의하기 위해 사용되는 용어 "약"은 지시된 값 및/또는 범위 한계가 ±20% 이내, 예를 들어 ±10% 이내, ±5% 이내에서 변할 수 있음을 의미한다. 수치 앞에 "약"을 사용하는 것은 수치 그 자체를 포함한다. 예를 들어 "약 5"는 "5"에 대한 명시적 지지를 제공한다. 범위로 제공되는 수치는 중복되는 범위 및 그 사이의 정수를 포함하며; 예를 들어 1 내지 4 및 5 내지 7의 범위는 예를 들어 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 2 내지 5, 2 내지 7, 4 내지 7, 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7을 포함한다.
조성물
몇몇 구현예에서, 본원에서 제공되는 조성물은 경구 투여용으로 구성되고 치료용 핵산(예를 들어 조성물에 의해 캡슐화된 RNA(암호화 또는 비-암호화 RNA) 분자)을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 조성물은 약학 조성물이다. 몇몇 구현예에서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 조성물은 세포-부재 조성물(cell-free composition)이며, 예를 들어 상기 조성물은 CDC와 같은 세포가 실질적으로 존재하지 않는다. 몇몇 구현예에서, 상기 조성물은 세포-유래된 물질, 예를 들어 엑소좀 또는 세포 소포가 실질적으로 존재하지 않는다. 몇몇 구현예에서, 상기 조성물은 인공 소포(예를 들어 양이온성 지질로 형성된 소포)를 포함한다.
약학적으로 허용가능한 부형제로 기능할 수 있는 물질의 비-제한적 예는 (1) 당, 예를 들어 락토스, 글루코스 및 수크로스; (2) 전분, 예를 들어 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로오스, 및 그의 유도체, 예를 들어 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트; (4) 분말화된 트라가칸트(tragacanth); (5) 맥아(malt); (6) 젤라틴; (7) 윤활제, 예를 들어 스테아린산 마그네슘, 라우릴황산나트륨 및 탈크; (8) 코코아 버터 및 좌제 왁스; (9) 오일, 예를 들어 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; (10) 글리콜, 예를 들어 프로필렌글리콜; (11) 폴리올, 예를 들어 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌글리콜(PEG); (12) 에스테르, 예를 들어 에틸올레이트 및 에틸라우레이트; (13) 한천; (14) 완충제, 예를 들어 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; (15) 알긴산; (16) 발열원-부재 수(pyrogen-free water); (17) 등장성 식염수(isotonic saline); (18) 링거 용액(Ringer's solution); (19) 에틸 알코올; (20) pH 완충 용액; (21) 폴리에스테르, 폴리카보네이트 및/또는 폴리안하이드라이드(polyanhydrides); (22) 벌킹제(bulking agents), 예를 들어 폴리펩티드 및 아미노산; (23) 혈청 성분, 예를 들어 혈청 알부민, HDL 및 LDL; (22) C2-C12 알코올, 예를 들어 에탄올; 및 (23) 약학 제형에 사용되는 기타 무독성의 상용성 물질을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 예를 들어 표적 세포 표적(시험관 내 또는 생체 내)에 핵산의 전달을 촉진하기 위한 형질 감염 시약을 포함한다. 임의의 적절한 형질 감염 시약이 상기 조성물에 포함될 수 있다. 적절한 형질 감염 시약은 리포좀, 세포외 소포(EV) 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)-양이온성 지질 복합체(PCLC)를 포함하지만, 이로써 제한되지는 않는다. 몇몇 구현예에서, 양이온성 지질이 사용된다. 일부 구현예에서, 상기 형질 감염 시약은 DharmaFECT® 또는 Lipofectamine®을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 형질 감염 시약은 DharmaFECT®을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 핵산은 핵산의 세포 흡수 및/또는 약동학을 촉진하기 위하여 조성물 중에 형질 감염 시약과 함께 제형화된다.
리포좀은 주로 지질 이중층(lipid bilayer)(또는 지질의 소수성 꼬리가 구(sphere) 내에 위치하도록 배향된 구형 단층)으로 구성될 수 있는 인공적으로 제조된 소포로서, 약학 제형의 투여를 위한 전달 비히클로 사용될 수 있다. 리포좀은 직경 수백 나노미터일 수 있고 좁은 수성 구획으로 분리된 일련의 동심 이중층을 함유할 수 있는 다층 소포(MLV), 직경 50nm 미만일 수 있는 작은 단세포 소포(SUV), 및 직경 50nm 내지 500nm일 수 있는 큰 단세포 소포(LUV)와 같이 상이한 크기일 수 있으나, 이로써 제한되지는 않는다. 리포좀 디자인은 표적 조직/세포에 대한 리포좀의 부착을 개선하거나 엔도시토시스(endocytosis)를 활성화하기 위하여 오소닌 또는 리간드를 포함할 수 있으나, 이로써 제한되지는 않는다. 리포좀은 화물(cargo), 예를 들어 본 발명의 핵산의 전달을 개선하기 위해 낮은 또는 높은 pH를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은, 제한 없이, 리포좀, 예를 들어 1,2-디올레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DODMA) 리포좀, 마리나 바이오테크(Marina Biotech)(Bothell, Wash.)의 DiLa2 리포좀, 1,2-디리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-DMA), 2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(DLin-KC2-DMA), 및 MC3 및 리포좀, 예를 들어 제한되지는 않지만 얀센 바이오테크 인코포레이티드(Janssen Biotech, Inc.)(Horsham, Pa.)로부터의 DOXIL®을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 양이온성 지질을 포함한다. 본 발명의 조성물에는 임의의 적절한 양이온성 지질이 사용될 수 있다. 적절한 양이온성 지질은 DLin-DMA, DLin-D-DMA, DLin-MC3-DMA, DLin-KC2-DMA, DODMA 및 아미노 알코올 지질을 포함하지만, 이로써 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 양이온성 지질 복합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-양이온성 지질 복합체(PCLC)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 양이온성 지질은 페길화된(PEGylated), 예를 들어 2 kDa PEG("PEG2000")이다. 임의의 적절한 옵션이 양이온성 지질을 페길레이션(pegylate))하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 PCLC는 PEG와 양이온성 지질의 혼합물을 하나 이상의 냉동/해동 사이클, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5회 이상의 냉동/해동 사이클에 노출시킴으로써 형성된다. 일부 구현예에서, 상기 냉동/해동 사이클은 약 5분 동안 액체 질소(예를 들어 약 -190℃)로 혼합물을 냉동시키고, 약 5분 동안 약 60℃에서 해동시키는 것을 포함한다. 본 발명의 핵산은 PCLC와 혼합되어 핵산과 PCLC의 복합체를 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 카세인, 예를 들어 카세인 미셀을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 키토산을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 카세인 및 키토산을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 카세인-키토산 복합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물 중의 단리된 핵산은 카세인-키토산 복합체에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 하나 이상의 인단백질: 알파 s1 카세인, 알파 s2 카세인, 베타 카세인, 및 카파 카세인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 2개 이상, 3개 이상, 또는 모두 4개의 인단백질: 알파 s1 카세인, 알파 s2 카세인, 베타 카세인, 및 카파 카세인을 포함한다. 상기 인단백질은 조성물 내에 임의의 적절한 농도로 (서로에 대해, 그리고 조성물의 총 부피에 대해) 존재할 수 있으며, 일부 구현예에서는 카세인 미셀을 형성하기에 적절한 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 상기 카세인 인단백질은 약 5 내지 10%(부피당 중량 기준)로 조성물에 집합적으로 존재한다. 달리 나타내지 않는 한, 용어 부피당 중량 기준 또는 부피당 중량의 사용은 1g/100mL = 1% w/v인 것으로 가정한다. 일부 구현예에서, 상기 카세인 인단백질은 조성물 중에 약 8%(부피당 중량 기준)로 일괄적으로 존재한다. 상기 카세인 인단백질은 임의의 적절한 동물, 예를 들어 포유동물 예를 들어 인간, 비인간 영장류, 소, 돼지, 말, 낙타, 염소 및 양으로부터 유래된 것일 수 있지만, 이로써 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 상기 카세인 인단백질은 소 알파 s1 카세인, 알파 s2 카세인, 베타 카세인 및 카파 카세인이다. EV를 갖는 적절한 카세인 제형은 예를 들어 문헌 [Aminzadeh 등, J Extracell Vesicles 2021 Jan;10(3):e12045]에 제공되어 있으며, 그 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같이 카세인과 함께 제형화된 본 발명의 조성물, 예를 들어 약학 조성물은 대상체에 대한 경구 투여에 적합하다.
몇몇 구현예에서, 본 발명의 치료용 핵산의 경구 생체이용성을 증진시키기 위한 조성물은 생리학적으로 상용성 부형제 중에 알파 s1 카세인, 알파 s2 카세인, 베타 카세인 및 카파 카세인으로부터 선택되는 적어도 2개의 인단백질을 포함하되, 상기 인단백질은 조성물의 약 5% 내지 약 10%(부피당 중량 기준)의 양으로 존재한다. 몇몇 구현예에서, 조성물은, 상기 조성물 중의 인단백질 질량의, 약 0% 내지 약 50%(예를 들어 약 10% 내지 약 45%, 약 20% 내지 약 40%, 약 25% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 40% 포함)(중량 기준)의 양의 알파 s1 카세인; 약 0% 내지 약 20%(예를 들어 약 5% 내지 약 15%, 약 7% 내지 약 12%, 약 8% 내지 약 12% 포함)(중량 기준)의 양의 알파 s2 카세인, 약 0% 내지 약 50%(예를 들어 약 10% 내지 약 45%, 약 20% 내지 약 40%, 약 25% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 40% 포함)(중량 기준)의 양의 베타 카세인; 및 약 0% 내지 약 20%(예를 들어 약 5% 내지 약 18%, 약 8% 내지 약 18%, 약 10% 내지 약 15% 포함)(중량 기준)의 양의 카파 카세인;을 포함한다. 본 발명의 조성물은 치료용 핵산, 예를 들어 비-암호화 RNA의 향상된 경구 생체이용성을 제공할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 상기 치료용 핵산은 RNA, 예를 들어 mRNA 및 비-암호화 RNA(예를 들어 miRNA, lncRNA)를 포함하지만, 이로써 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 페이로드(payload)는 합성 분자, 예를 들어 소분자 또는 약물이다.
몇몇 구현예에서, 본원에 제공된 제형은 지질-결합된 소포, 예를 들어 미셀 또는 리포좀의 형태이며, 따라서 임의의 적합한 수의 입자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 미셀(예를 들어 카세인-키토산 코팅된 미셀)의 양은 약 106 내지 약 1010개의 입자, 예를 들어 약 2×106 내지 약 1010개의 입자, 약 5×106 내지 약 1010개의 입자, 약 107 내지 약 5×109개의 입자, 약 2×107 내지 약 5×109개의 입자, 약 5×107 내지 약 5×109개의 입자, 예를 들어 약 1×108 내지 약 2×109개의 입자이다. 일부 구현예에서, 집단 중 미셀(예를 들어 카세인-키토산 코팅된 미셀)의 양은 약 106개, 약 2×106개, 약 5×106개, 약 107개, 약 2×107개, 약 5×107개, 약 107개, 약 2×107개, 약 5×107개, 약 108개, 약 2×109개, 약 5×109개, 또는 약 1010개 입자, 또는 선행 값들 중의 임의의 두 값 사이의 양이다.
몇몇 구현예에서, 상기 조성물은 카세인-키토산 코팅된 지질 미셀을 포함하되, 상기 카세인 인단백질은 조성물 중에 적절한 양(예를 들어 조성물 중 인단백질 질량의 적절한 총량, 서로에 대한 인단백질의 적절한 비율)으로 존재한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 알파 s1 카세인, 알파 s2 카세인, 베타 카세인, 및 카파 카세인으로부터 선택되는 2개, 3개, 또는 4개 모두의 인단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물 중의 인단백질의 양은 조성물 중에 존재하는 하나 이상의 다른 인단백질의 양에 따라 달라진다.
일부 구현예에서, 알파 s1 카세인은 유전자명 CSN1S1과 관련된 인단백질이다. 상기 알파 s1 카세인은 임의의 적당한 포유류의 CSN1S1 인단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 알파 s1 카세인은 소(유전자 ID: 282208), 돼지(유전자 ID: 445514), 말(유전자 ID: 100033982), 양(유전자 ID: 443382), 염소(유전자 ID: 100750242), 염소(유전자 ID: 105090954) 또는 인간(유전자 ID: 1446)이다. 일부 구현예에서, 상기 알파 s1 카세인은 비-인간 알파 s1 카세인이다. 일부 구현예에서, 상기 알파 s1 카세인은 서열번호 26에 제시된 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 임의의 적절한 양의 알파 s1 카세인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 조성물 중의 인단백질 질량의, 약 0% 내지 약 50%, 예를 들어 약 5% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 50%, 약 15% 내지 약 45%, 약 20% 내지 약 45%, 예를 들어 약 25% 내지 약 40%의 양으로 알파 s1 카세인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 약 0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%(중량 기준)의 양, 또는 선행하는 값 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위 내의 양으로 알파 s1 카세인을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 알파 s2 카세인은 유전자명 CSN1S2와 관련된 인단백질이다. 상기 알파 s2 카세인은 임의의 적당한 포유류의 CSN1S2 인단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 알파 s2 카세인은 소(유전자 ID: 282209), 돼지(유전자 ID: 445515), 말(유전자 ID: 100327035), 양(유전자 ID: 443383), 염소(유전자 ID: 100861229), 또는 염소(유전자 ID: 105090951)이다. 일부 구현예에서, 상기 알파 s2 카세인은 서열번호 27에 제시된 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다.
상기 조성물은 임의의 적절한 양의 알파 s2 카세인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 조성물 중의 인단백질 질량의 약 0% 내지 약 20%, 예를 들어 약 2% 내지 약 18%, 약 3% 내지 약 18%, 약 4% 내지 약 17%, 약 5% 내지 약 16%, 약 5% 내지 약 15%(중량 기준)의 양으로 알파 s2 카세인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 약 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 18%, 20%(중량 기준)의 양, 또는 선행 값들 중의 임의의 2개로 정의된 범위 내의 양으로 알파 s2 카세인을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 베타 카세인은 CSN2 유전자명과 관련된 인단백질이다. 상기 베타 카세인은 임의의 적절한 포유동물로부터의 CSN2 인단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 베타 카세인은 소(유전자 ID: 281099), 돼지(유전자 ID: 404088), 말(유전자 ID: 100033903), 양(유전자 ID: 443391), 염소(유전자 ID: 100860784), 낙타류(유전자 ID: 105080412), 또는 인간(유전자 ID: 1447)이다. 일부 구현예에서, 상기 베타 카세인은 비인간 베타 카세인이다. 일부 구현예에서, 상기 베타 카세인은 서열번호 28 또는 29에 제시된 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다.
상기 조성물은 베타 카세인을 임의의 적절한 양으로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 조성물 중의 인단백질 질량의 약 0% 내지 약 50%, 예를 들어 약 5% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 50%, 약 15% 내지 약 45%, 약 20% 내지 약 45%, 약 25% 내지 약 40%(중량 기준)의 양으로 베타 카세인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 약 0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%(중량 기준)의 양, 또는 선행 값들 중의 임의의 2개로 정의된 범위 내의 양으로 베타 카세인을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 카파 카세인은 CSN3 유전자명과 관련된 인단백질이다. 베타 카세인은 임의의 적절한 포유동물로부터 유래한 CSN3 인단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 카파 카세인은 소(유전자 ID: 281728), 돼지(유전자 ID: 445511), 말(유전자 ID: 100033983), 양(유전자 ID: 443394), 염소(유전자 ID: 100861231), 낙타류(유전자 ID: 105080408 또는 105090949), 또는 인간(유전자 ID: 1448)이다. 일부 구현예에서, 상기 카파 카세인은 비인간 카파 카세인이다. 일부 구현예에서, 상기 카파 카세인은 서열번호 30에 제시된 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다.
상기 조성물은 카파 카세인을 임의의 적절한 양으로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 조성물 중의 인단백질 질량의 약 0% 내지 약 20%, 예를 들어 약 2% 내지 약 18%, 약 3% 내지 약 18%, 약 4% 내지 약 17%, 약 5% 내지 약 16%, 예를 들어 약 5% 내지 약 15%(중량 기준)의 양으로 카파 카세인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 약 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 18%, 20%(중량 기준)의 양, 또는 선행 값들 중의 임의의 2개로 정의된 범위 내의 양으로 카파 카세인을 포함한다.
일부 구현예에서, 상이한 종으로부터의 카세인의 조합이 사용된다. 예를 들어 몇몇 구현예에서, 하나 이상의 인간 카세인은 하나 이상의 소 카세인과 조합하여 사용된다. 몇몇 구현예에서 카세인의 비율, 예를 들어 3:1:3:1의 알파 S1 카세인:알파 s2 카세인:베타 카세인:카파 카세인의 비율로 사용된다. 몇몇 구현예에서, 예를 들어 4:1:4:1, 2:1:2:1, 또는 1:1:1:1이 사용될 수 있다. 비율은 또한 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2 등의 범위의 조성으로 주어진 임의의 2개의 카세인 사이의 다른 비율로 사용될 수 있다.
임의의 적절한 총량의 인단백질이 조성물 중에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 인단백질은 조성물의 5% 내지 약 10%, 예를 들어 약 6% 내지 약 10%, 약 6% 내지 약 9%, 예를 들어 약 6% 내지 약 8%(부피당 중량 기준)의 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 상기 인단백질은 조성물의 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%(부피당 중량 기준)의 양, 또는 선행 값들 중의 임의의 2개에 의해 정의된 범위 내의 양으로 존재한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 카세인 인단백질은 비-인간 카세인 인단백질이다. 일부 구현예에서, 상기 엑소좀 및 카세인 인단백질 중의 적어도 하나는 상이한 종으로부터의 것이다. 일부 구현예에서, 상기 엑소좀은 인간 엑소좀이고, 하나 이상의 카세인 인단백질은 비-인간 카세인 인단백질이다. 일부 구현예에서, 상기 엑소좀은 인간 엑소좀이고, 하나 이상의 카세인 인단백질은 소(또는 양, 돼지, 염소, 낙타, 또는 말) 카세인 인단백질이다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 카세인 인단백질의 적어도 일부에 의해 형성된 미셀 구조를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 카세인 미셀은 실질적으로 구형이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물 중의 카세인 미셀은 약 40 nm, 약 50 nm, 약 60 nm, 약 70 nm, 약 80 nm, 약 90 nm, 약 100 nm, 약 110 nm, 약 120 nm, 약 130 nm, 약 150 nm, 약 200 nm, 약 250 nm, 약 300 nm, 약 350 nm, 약 400 nm, 약 450 nm, 약 500 nm 이상의 평균 직경(미셀 당 측정됨), 또는 선행 값들 중의 임의의 두 값으로 정의된 범위 내의 평균 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 조성물 중의 카세인 미셀은 약 40 nm 내지 약 500 nm, 예를 들어 약 40 nm 내지 약 400 nm, 약 50 nm 내지 약 300 nm, 약 60 nm 내지 약 250 nm, 약 70 nm 내지 약 250 nm, 약 80 nm 내지 약 200 nm, 예를 들어 약 90 nm 내지 약 150 nm 범위의 평균 직경(미셀 당 측정됨)을 갖는다. 본 발명의 조성물의 카세인 미셀은 일반적으로 침전되거나 겔 형태가 아니다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 하나 이상의 콜로이드성 미네랄(예를 들어 현탁액 중의 미네랄)을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 복합체(예를 들어 2개 이상의) 광물이 콜로이드성 광물 복합체로서 사용된다. 상기 콜로이드성 미네랄 착물은 임의의 적합한 미네랄 화합물 및/또는 그의 염을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 콜로이드성 미네랄 복합체는 칼슘, 마그네슘, 무기 포스페이트, 시트레이트, 나트륨, 칼륨, 및 클로라이드, 또는 이들 각각의 염 중의 하나 이상을 포함하지만, 이로써 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 상기 콜로이드성 미네랄 복합체는 상기 조성물 중의 인단백질 질량의 약 2% 내지 약 15%, 예를 들어 약 2% 내지 약 12%, 약 5% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 9%의 양(약 6% 내지 약 9%를 포함함)(중량 기준)으로 존재한다. 일부 구현예에서, 콜로이드성 미네랄 복합체는 약 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%의 양 또는 선행 값들 중의 임의의 2개로 정의된 범위 내의 양으로 존재한다.
본 발명의 조성물은 일반적으로 생리학적으로 상용성 부형제, 예를 들어 제한되지는 않지만 물 또는 완충제를 포함한다. 일반적으로 생리학적으로 상용성 부형제는 카세인 인단백질의 보호 특성을 실질적으로 방해하지 않는 부형제이다(예를 들어 카세인 인단백질 및/또는 그의 보호 특성에 의해 형성된 미셀 구조를 실질적으로 방해하지 않는다). 적절한 생리학적으로 상용성 부형제는 제한되지는 않지만 식염수, 완충 수용액, 용매 및/또는 분산매를 포함한다. 일부 구현예에서, 생리학적으로 상용성 부형제는 인산염 완충 식염수(PBS)이다. 약학적으로 허용가능한 부형제로 기능할 수 있는 물질의 비-제한적 예는 (1) 당, 예를 들어 락토스, 글루코스 및 수크로스; (2) 전분, 예를 들어 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로오스, 및 그의 유도체, 예를 들어 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트; (4) 분말화된 트라가칸트(tragacanth); (5) 맥아(malt); (6) 젤라틴; (7) 윤활제, 예를 들어 스테아린산 마그네슘, 라우릴황산나트륨 및 탈크; (8) 코코아 버터 및 좌제 왁스; (9) 오일, 예를 들어 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; (10) 글리콜, 예를 들어 프로필렌글리콜; (11) 폴리올, 예를 들어 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌글리콜(PEG); (12) 에스테르, 예를 들어 에틸올레이트 및 에틸라우레이트; (13) 한천; (14) 완충제, 예를 들어 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; (15) 알긴산; (16) 발열원-부재 수(pyrogen-free water); (17) 등장성 식염수(isotonic saline); (18) 링거 용액(Ringer's solution); (19) 에틸 알코올; (20) pH 완충 용액; (21) 폴리에스테르, 폴리카보네이트 및/또는 폴리안하이드라이드(polyanhydrides); (22) 벌킹제, 예를 들어 폴리펩티드 및 아미노산; (23) 혈청 성분, 예를 들어 혈청 알부민, HDL 및 LDL; (22) C2-C12 알코올, 예를 들어 에탄올; 및 (23) 약학 제형에 사용되는 기타 무독성의 상용성 물질을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 생리학적으로 상용성 부형제는 음료이다. 일부 구현예에서, 상기 생리학적으로 상용성 부형제는 유아용 액체 조제식이다. 일부 구현예에서, 상기 부형제는 활성제, 예를 들어 미셀을 포함하는 핵산의 분해를 억제한다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 카세인 미셀을 함유하되, 상기 카세인 미셀은: (중량 기준으로) 약 30-40%(예를 들어 약 36%)의 알파 S1 카세인, 약 5-15%(예를 들어 약 10%)의 알파 s2 카세인, 약 30-40%(예를 들어 약 34%)의 베타 카세인, 약 5-15%(예를 들어 약 12%)의 카파 카세인, 및 약 7%의 콜로이드 미네랄 복합체(인산염, 칼슘, 마그네슘 및 구연산염 포함)를 포함하고, 상기 카세인 인단백질의 총량은 상기 조성물의 약 8%(부피당 중량 기준)이다.
또한, 본원에 기술된 바와 같이, 치료용 핵산의 증진된 경구 생체이용성을 위한 조성물을 제조하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 일반적으로, 조성물 중에 적어도 2개의 인단백질을 포함하는 미셀을 형성하기에 충분한 조건 하에서 치료용 핵산, 알파 s1 카세인, 알파 s2 카세인, 베타 카세인, 및 카파 카세인 중에서 선택된 적어도 2개의 인단백질; 및 생리학적으로 적합한 부형제를 조합하는 것을 포함한다. 상기 조성물의 성분들은 임의의 적절한 옵션을 이용하여 조합될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 카세인 인단백질은 먼저 생리학적으로 상용성 부형제와 조합하여 카세인 조성물을 제조한 후, 상기 핵산과 카세인 조성물을 조합하여 핵산의 증진된 경구 생체이용성을 위한 조성물을 생성한다. 임의의 적절한 욥션을 이용하여 카세인 조성물을 생성할 수 있다. 적절한 방법은 예를 들어 유럽특허 제2732710B1호에 기술되어 있으며, 상기 특허의 전체 개시는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 상기 조성물의 하나 이상의 성분은 보존되고, 대상체에 핵산을 경구 투여하기 위한 조성물로 재구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 카세인 인단백질은 보존되고, 대상체에 핵산을 경구 투여하기 위한 조성물로 재구성된다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 보존되고, 대상체에 경구 투여하기 위한 조성물(예를 들어 카세인 인단백질을 갖는 조성물 및 생리학적으로 상용성 부형제)로 재구성된다. 본원에서 사용되는 "보존된"은 본원에 기재된 핵산의 기능적 활성(단독이든, 또는 본원에 제공된 조성물에 통합된 것이든)이 표준 보관 조건 하에서 적어도 소정의 기간 동안 유지되는 상태를 기술할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 보존된 핵산은 보존되기 전의 기능적 활성과 비교하여 보관 후 재구성될 때 기능적 활성의 10% 이상, 예를 들어 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 약 100%를 유지한다.
일부 구현예에서, (예를 들어 카세인-키토산 코팅된 미셀에 캡슐화된) 상기 핵산은 표준 보관 조건 하에서 1일 이상, 예를 들어 2일 이상, 5일 이상, 2주 이상, 1개월 이상, 3개월 이상, 6개월 이상, 1년 이상, 3년 이상(5년 이상을 포함함) 동안 보존 및 보관된다. 일부 구현예에서, (예를 들어 카세인-키토산 코팅된 미셀에 캡슐화된) 상기 핵산은 표준 보관 조건 하에서 1일 내지 5년, 예를 들어 5일 내지 3년, 10일 내지 2년, 1개월 내지 1년의 기간(3개월 내지 6개월을 포함함) 동안 보존 및 보관된다.
일부 구현예에서, (예를 들어 카세인-키토산 코팅된 미셀에 캡슐화된) 상기 핵산은 임의의 적합한 표준 보관 조건 하에서 보관된다. 일부 구현예에서, 상기 표준 보관 조건은 25℃ 이하, 예를 들어 20℃ 이하, 15℃ 이하, 10℃ 이하, 5℃ 이하, 0℃ 이하, -10℃ 이하, -20℃ 이하, -30℃ 이하, -40℃ 이하, -50℃ 이하, -60℃ 이하, -70℃ 이하의 온도(-80℃ 이하를 포함함)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 표준 보관 조건은 -90℃ 내지 -80℃, -80℃ 내지 -70℃, -70℃ 내지 -60℃, -60℃ 내지 -50℃, -50℃ 내지 -40℃ 내지 -30℃, -30℃ 내지 -20℃, -20℃ 내지 -10℃, -10℃ 내지 -5℃, -5℃ 내지 0℃, 0℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 30℃ 내지 내지 35℃의 온도를 갖는다. 일부 구현예에서, 표준 보관 조건은 실온 및 표준 대기압이다.
일부 구현예에서, (예를 들어 카세인-키토산 코팅된 미셀에 캡슐화된) 상기 핵산은 임의의 적합한 방식으로 보존된다. 일부 구현예에서, 이들은 냉동된다. 엑소좀을 냉동하기 위한 수단은 예를 들어 문헌 [Bosch 등, Sci Rep. 2016 Nov 8;6:36162]에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 이들은 냉동건조된다. 엑소좀을 냉동건조하기 위한 수단은 예를 들어 PCT 국제공개공보 WO2018070939에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, (예를 들어 카세인-키토산 코팅된 미셀에 캡슐화된) 상기 핵산은 임의의 적합한 옵션을 이용하여 조성물로 재구성된다. 일부 구현예에서, 상기 엑소좀은 물 또는 생리학적으로 허용가능한 부형제, 예를 들어 완충 용액으로 재구성된다.
본 발명의 조성물은 치료용 핵산(예를 들어 암호화 또는 비-암호화 RNA)의 전신 전달이 요구되는 다양한 상황에서 예를 들어 치료용 핵산의 전신 전달에 의해 치료될 수 있는 장애 또는 질환을 치료하기 위해 사용된다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물 중의 어느 하나를 대상체에 경구 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 근퇴행성 장애를 갖거나 발병할 위험이 있으며, 상기 조성물은 치료용 핵산을 포함하고, 그에 의해서 근퇴행성 장애를 치료한다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 인간이다.
본 발명의 조성물은 상기 조성물이 경구 투여될 때 치료용 핵산의 향상된 생체이용성을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 생체이용성은 적합한 대조군 조성물, 예를 들어 카세인 인단백질, 키토산 중합체 및/또는 카세인-키토산 복합체를 포함하지 않는 조성물에 비해 향상된다.
일부 구현예에서, 상기 조성물 중의 치료용 핵산의 경구 생체이용성은, 대조군 조성물의 경구 생체이용성에 비해, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 11배, 약 12배, 약 13배, 약 14배, 약 15배, 약 16배, 약 17배, 약 18배, 약 19배, 약 20배, 약 25배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 약 60배, 약 70배, 약 80배, 약 90배, 약 100배, 약 200배, 약 300배, 약 400배, 약 500배, 약 1,000배, 약 2,000배, 약 5,000배, 약 10,000배 또는 그 이상, 또는 선행 값들 중의 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 내의 배수만큼 향상된다.
일부 구현예에서, 상기 향상된 경구 생체이용성은 페이로드 분자 부류 내의 상이한 종(예를 들어 모든 핵산 서열 중에서 독특한 핵산 서열)의 증가된 대표예를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 페이로드 분자 부류 내의 실질적으로 모든 종은 생체이용성이다. 일부 구현예에서, 상기 페이로드 분자 부류 내의 종의 적어도 약 50%, 예를 들어 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%(적어도 약 99%를 포함함)는 생체이용성이다. 일부 구현예에서, 상기 페이로드 분자는 엑소좀 핵산이다. 일부 구현예에서, 상기 페이로드 분자는 mRNA, ncRNA, lncRNA, 또는 miRNA이다. 일부 구현예에서, 상기 페이로드 분자는 단백질이다. 일부 구현예에서, 상기 페이로드 분자는 소분자이다. 일부 구현예에서, 상기 페이로드 분자는 합성 페이로드, 예를 들어 합성 핵산, 단백질, 또는 소분자이다.
일부 구현예에서, 상기 향상된 경구 생체이용성은 경구 투여 후 약 1주 이내, 약 5일 이내, 약 3일 이내, 약 1일 이내, 약 18 시간 이내, 약 12 시간 이내, 약 10 시간 이내, 약 8 시간 이내, 약 6 시간 이내, 약 5 시간 이내, 약 4 시간 이내, 약 3 시간 이내, 약 2 시간 이내, 약 1 시간 이내, 약 30 분 이내, 약 15 분 이내, 또는 선행 값들 중의 임의의 2개에 의해 정의된 범위의 시간 간격 내에서 상기 조성물에 의해 달성된다.
몇몇 구현예에서, 상기 키토산은 저분자량 키토산이다. 몇몇 구현예에서, 상기 키토산은 약 50 내지 약 190 킬로달톤 범위의 질량을 갖는다. 일부 구현예에서, 고분자량의 키토산이 사용된다. 몇몇 구현예에서, 상기 키토산은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.001 내지 약 0.1% 범위의 양으로 존재한다. 몇몇 구현예에서, 상기 키토산은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.01 내지 약 0.1% 범위의 양으로 존재한다. 몇몇 구현예에서, 상기 키토산은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.05 내지 약 0.1% 범위의 양으로 존재한다.
몇몇 구현예에서, 상기 제형은 상기 제형의 다양한 성분들의 비율에 기초하여 생성된다. 예를 들어 카세인 대 RNA 대 키토산의 비율은 약 1000:1:25 내지 약 500:1:15 (%w/v)이다. 몇몇 구현예에서, 카세인 대 RNA의 비율은 약 500:1 내지 약 1000:1이다. 몇몇 구현예에서, RNA 대 키토산의 비율은 약 1:10 내지 약 1:50이다. 몇몇 구현예에서, 이들 비율은 사용되는 RNA의 각 마이크로그램에 대해 약 0.5 내지 약 3 마이크로리터 범위의 리포좀의 부피로 사용된다. 비율은 또한 조성물의 임의의 2개의 주어진 성분 사이에서 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1, 50:1, 100:1, 1000:1, 1:1000, 1:500, 1:100, 1:50, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2 등의 범위로 사용될 수 있다.
일부 대안적인 구현예에서, 상기 조성물은 세포외 소포(EV), 예를 들어 엑소좀을 포함한다. 상기 세포외 소포(EV)는 임의의 적합한 공급원, 예를 들어 심혈관계-유래된 세포(CDC) 또는 섬유아세포로부터 유래된 EV일 수 있다. 적합한 EV, 예를 들어 CDC-유래된 EV는 예를 들어 미국출원공개번호 20080267921, 20160158291 및 20160160181; 문헌 [Smith 등, Circulation. 2007. 115:896-908]; [Aminzadeh, M. A. 등 Stem Cell Reports 10, 942-955 (2018)]; 및 [Ibrahim 등, Stem Cell Reports. 2014 May 8;2(5):606-19, Ibrahim, A. G. 등 Nanomedicine 33, 102347 (2020)]에 제공되며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, 상기 EV는 배양 중에 인간 CDC에 의해 조건화된 무혈청 배지로부터 단리된 것이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 EV 및 리포좀 및/또는 PCLC를 형질 감염 시약으로서 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 CDC-유래 EV가 실질적으로 존재하지 않는다.
본원에 개시된 EV, 예를 들어 엑소좀은 구현예에 따라 크기가 달라질 수 있다. 상기 구현예에 따르면, 상기 EV의 크기는 직경이 약 15 nm 내지 약 95 nm의 범위이며, 상기 범위는 약 15 nm 내지 약 20 nm, 약 20 nm 내지 약 30 nm, 약 30 nm 내지 약 40 nm, 약 40 nm 내지 약 50 nm, 약 50 nm 내지 약 60 nm, 약 60 nm 내지 약 70 nm, 약 70 nm 내지 약 80 nm, 약 80 nm 내지 약 90 nm, 약 90 nm 내지 약 95 nm, 및 이들의 중복 범위를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 EV는 더 크다(예를 들어 약 140 내지 약 210 nm 범위의 것, 상기 범위는 약 140 nm 내지 약 210 nm, 약 140 nm 내지 약 150 nm, 약 150 nm 내지 약 160 nm, 약 160 nm 내지 약 170 nm, 약 170 nm 내지 약 180 nm, 약 180 nm 내지 약 190 nm, 190 nm 내지 약 200 nm, 약 200 nm 내지 약 210 nm, 및 이들의 중복 범위를 포함함). 일부 구현예에서, 상기 EV 직경은 약 15 nm 내지 약 200 nm 범위이며, 상기 범위는 약 15 nm 내지 약 20 nm, 약 20 nm 내지 약 30 nm, 약 30 nm 내지 약 40 nm, 약 40 nm 내지 약 50 nm, 약 50 nm 내지 약 60 nm, 약 60 nm 내지 약 70 nm, 약 70 nm 내지 약 80 nm, 약 80 nm 내지 약 90 nm, 약 90 nm 내지 약 100 nm, 약 100 nm 내지 약 110 nm, 약 110 nm 내지 약 120 nm, 약 120 nm 내지 약 130 nm, 약 130 nm 내지 약 140 nm, 약 140 nm 내지 약 150 nm, 약 150 nm 내지 약 160 nm, 약 160 nm 내지 약 170 nm, 약 170 nm 내지 약 180 nm, 약 180 nm 내지 약 190 nm, 약 190 nm 내지 약 200 nm, 및 그의 중복 범위를 포함한다. 일부 구현예에서, 원래의 세포체로부터 생성된 EV는 원래의 세포체보다 적어도 하나의 치수(예를 들어 직경)가 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 2,000, 5,000, 또는 10,000배 작다.
본 발명의 EV 및 핵산을 함유하는 조성물은 임의의 적절한 옵션을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 핵산을 상기 EV에 로딩하는 것은: 예를 들어 상기 제공된 바와 같이 상기 핵산을 리포좀 및/또는 PCLC와 제형화하여 핵산-리포좀 혼합물을 생성하는 단계; 상기 핵산-리포좀 혼합물을 상기 EV와 결합하는 단계; 및 엑소좀 마커와 관련된 EV를 농축하여 상기 핵산이 농축된 EV 집단을 생성하는 단계;를 포함한다. 상기 리포좀 혼합물을 EV와 결합하는 단계는 임의의 적절한 옵션을 이용하여 행해질 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 핵산-리포좀 혼합물은 약 30분 이상 동안 진탕하면서 37℃에서 EV와 결합된다. 상기 핵산이 농축된 EV의 집단을 생성하기 위해 농축하는 단계는 임의의 적절한 옵션을 이용하여 행해질 수 있다. 일부 구현예에서, 엑소좀 마커와 관련된 EV를 농축시키는 단계는 엑소좀 마커에 특이적인 항체를 이용하여 엑소좀 마커와 관련된 EV를 면역침전시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 엑소좀 마커는 CD9, CD63 및 CD81 중의 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 상기 엑소좀 마커와 관련된 EV를 농축하는 단계는 모든 엑소좀 마커, CD9, CD63 및 CD81과 관련된 EV를 면역침전시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산이 농축된 EV 집단의 크기 분포는 실질적으로 단단일모달(unimodal)이다. 일부 구현예에서, 상기 집단의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%는 크기 분포에서 단일 피크 아래의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 핵산이 농축된 EV의 집단은 약 50-180 nm, 예를 들어 60-170 nm, 70-160 nm, 80-150 nm, 90-140 nm, 100-130 nm, 또는 약 110-130 nm의 평균 직경을 갖는다.
핵산
위에서 논의한 바와 같이, 핵산 치료제는 유전자 수준에서 질환을 치료할 수 있는 잠재력을 제공한다. 종래 치료법은 일반적으로 근본적인 유전적 원인보다는 단백질을 표적으로 하기 때문에 유도된 치료 효과는 일시적일 수 있다. 대조적으로, 핵산 치료제는 유전자 억제, 부가, 대체 또는 편집을 통해 오래 지속되는(또는 심지어 영구적인, 예를 들어 치유력 있는(curative)) 효과에 대한 잠재력을 갖는다. 본원에 개시된 바와 같이, 핵산 치료제의 성공적인 사용은 안정성 및/또는 생체이용성을 개선시키는 전달 기술에 대한 경쟁력을 제공할 것이다.
몇몇 구현예에서, 본원에 제공된 제형은 대상체에 대한 핵산의 향상된 전달을 허용한다. 몇몇 구현예에서, 상기 핵산은 DNA를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 핵산은 RNA를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 핵산은 암호화 RNA(예를 들어 메신저 RNA 또는 mRNA)를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 핵산은 비-암호화 RNA(ncRNA)를 포함한다. mRNA는 치료 효과를 나타내는 단백질을 암호화하는 서열의 전달에 의해 치료 효과를 제공할 수 있다. 상기 구현예에 따르면, 비-기능성 단백질을 대체하는 단백질일 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 암호화 RNA는 면역 반응이 요망되는 단백질(예를 들어 바이러스 단백질)을, 예를 들어 그 단백질에 대한 항체의 생산을 위해 암호화할 수 있다. ncRNA는 항-염증성 사이토카인의 분비를 증가시키거나 염증성 사이토카인의 분비를 감소시키는 능력에 기초하여 긍정적인 치료 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 특정 ncRNA는 심장보호, 항-섬유화 및/또는 항-비대 효과를 나타낸다.
비-암호화 RNA(ncRNA)는 점차 생물활성(bioactive)인 것으로 인식되고 있다. 전구 세포로부터 유래된 세포외 소포(EV)는 풍부하고 다양한 ncRNA를 함유하고; 심장구-유래된 세포는 예를 들어 작은 Y RNA가 풍부한 EV를 분비한다. 치료 효과를 나타내는 핵산은 본원에 제공된 제형을 사용하여 전달될 수 있다. 비-제한적 예로, 단리된 대식세포에서 비대성, 염증성 및 섬유성 유전자 패밀리를 억제하고, 심장 기능 및 운동 지구력을 회복하고, 및/또는 심부전 및 염증의 혈청 바이오마커를 감소시키는 ncRNA가 본원에 개시된 구현예에 따라 사용될 수 있다. 추가로, ERK/Map Kinase의 상향조절, 조직에서의 섬유화 및 염증 신호전달을 길항하는 ncRNA가 사용될 수 있다. 허혈(심근경색), 근변성(듀센(Duchenne) 근이영양증) 및 자가면역(피부경화증)과 같이 병리학적 과정에 대해 긍정적인 효과를 나타내거나 다른 긍정적인 질환-변형 생물활성을 나타내는 임의의 ncRNA가 본원에 개시된 실시예에 따라 사용될 수 있다. 표 1은 염증 및/또는 섬유증과 관련된 질환을 치료하기 위한 치료제로서 사용하는 상기 ncRNA의 예를 포함하지만, 이로써 제한되지는 않는다.
표 1
CGUCCGAUGGUGUAGUGGGUUAUCAG(서열번호 12)의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 단리된 핵산이 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 RNA이다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 CGUCCGAUGGUGUAGUGGGUUAUCAG(서열번호 12)에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 98%, 99% 동일한 뉴클레오티드 서열 또는 본원에 제공된 임의의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 뉴클레오티드 서열 내의 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 위치에서 서열 변이를 갖는 CGUCCGAUGGUGUAGUGGGUUAUCAG(서열번호 12)의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 뉴클레오티드 서열 또는 핵산 내의 "위치"는 뉴클레오티드 서열 또는 핵산의 5' 말단에 대해 정의된다. 일부 구현예에서, 상기 핵산의 뉴클레오티드 서열은 CGUCCGAUGGUAGUGGGUUAUCAG(서열번호 12) 또는 그의 서열 변이체이다. 상기 핵산은 임의의 적절한 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 핵산의 길이는 24개의 뉴클레오티드(nt)이다. 일부 구현예에서, 상기 핵산의 길이는 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40개의 nt 이상이다. 일부 구현예에서, 상기 핵산의 길이는 최대 30개의 nt이다. 일부 구현예에서, 핵산의 길이는 16-30개의 nt 또는 24-30개의 nt이다.
본 발명의 핵산은 단일가닥 또는 이중가닥(예를 들어 RNA/DNA 혼성체)일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 단일가닥이다.
일부 구현예에서 본 발명의 단리된 핵산은 하나 이상의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 변형된 골격을 갖는 뉴클레오티드를 포함한다. 일반적으로, 상기 화학적 변형(들)은 상기 핵산의 치료 효력을 실질적으로 보존하거나 증진시키는 것이다. 상기 핵산의 임의의 적절한 수의 뉴클레오티드는 화학적으로 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상, 27개 이상, 28개 이상, 29개 이상, 30개 이상의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 1 내지 5, 1 내지 6, 1 내지 7, 1 내지 8, 1 내지 9, 1 내지 10, 1 내지 15, 1 내지 20, 1 내지 25 또는 1 내지 30개의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 1 내지 10개의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 8개의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 6개의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
상기 화학적으로-변형된 뉴클레오티드는 임의의 적합한 방식으로 단리된 핵산을 따라 분포될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 상기 핵산의 제 1 절반, 예를 들어 상기 핵산의 5' 절반 내에 적어도 하나의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 상기 핵산의 제 2 절반, 예를 들어 상기 핵산의 3' 절반 내에 적어도 하나의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 상기 핵산의 제 1 절반, 예를 들어 핵산의 5' 절반 내에 적어도 하나의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드, 및 상기 핵산의 제 2 절반, 예를 들어 핵산의 3' 절반 내에 적어도 하나의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 핵산의 5' 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 뉴클레오티드 내에 하나 이상의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 핵산의 3' 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 뉴클레오티드 내에 하나 이상의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산에서 화학적으로-변형된 2개의 뉴클레오티드는 서로 인접하지 않는다. 일부 구현예에서, 핵산은 핵산의 5' 말단으로부터 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 뉴클레오티드 내에 1, 1, 2, 2, 3, 3, 4, 4, 5, 5개의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 상기 핵산의 3' 말단으로부터 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 뉴클레오티드 내에 1, 1, 2, 2, 3, 3, 4, 4, 5, 5개의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 상기 핵산의 5' 절반 및 3' 절반에 동일한 수의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 핵산의 5' 말단으로부터 5개의 뉴클레오티드 내에 3개의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드 및/또는 핵산의 3' 말단으로부터 5개의 뉴클레오티드 내에 3개의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 화학적으로-변형된 뉴클레오티드는 CGUCCGAUGGUAGUGGGUUAUCAG(서열번호 12)의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 서열 변이체, 또는 본원에 제공된 다른 핵산 서열 내에 있다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 뉴클레오티드 서열의 제 1 절반, 예를 들어 뉴클레오티드 서열의 5' 절반 내에 적어도 하나의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 뉴클레오티드 서열의 위치 1 내지 12 내에 적어도 하나의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 뉴클레오티드 서열의 후반부, 예를 들어 뉴클레오티드 서열의 3' 절반 내에 적어도 하나의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 뉴클레오티드 서열의 위치 13-24 내에 적어도 하나의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 뉴클레오티드 서열의 위치 1 내지 12 내에 적어도 하나의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드, 및 뉴클레오티드 서열의 위치 13 내지 24 내에 적어도 하나의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 뉴클레오티드 서열의 5' 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 뉴클레오티드 내에 하나 이상의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 뉴클레오티드 서열의 3' 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 뉴클레오티드 내에 하나 이상의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 뉴클레오티드 서열에서 화학적으로-변형된 2개의 뉴클레오티드는 서로 인접하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 뉴클레오티드 서열의 5' 말단으로부터 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 뉴클레오티드 내에 1, 1, 2, 2, 3, 3, 4, 4, 5, 5개의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 뉴클레오티드 서열의 3' 말단으로부터 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 뉴클레오티드 내에 1, 1, 2, 2, 3, 3, 4, 4, 5, 5개의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 뉴클레오티드 서열의 5' 절반 및 3' 절반에 동일한 수의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 뉴클레오티드 서열의 5' 말단으로부터 5개의 뉴클레오티드 내에 3개의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단으로부터 5개의 뉴클레오티드 내에 3개의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 뉴클레오티드 서열의 5' 절반 및 3' 절반에 상이한 수의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 뉴클레오티드 서열의 5' 절반보다 3' 절반에 더 많은 수의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 뉴클레오티드 서열의 5' 말단으로부터 5개의 뉴클레오티드 내에 3개의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단으로부터 5개의 뉴클레오티드 내에 3, 4, 또는 5개의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 단리된 핵산은 뉴클레오티드 서열의 위치 1, 3, 5, 20, 22 및 24 중의 하나 이상에 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 단리된 핵산은 뉴클레오티드 서열의 위치 1, 3, 5, 20, 22 및 24에 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 단리된 핵산은 뉴클레오티드 서열 CGUCCGAUGGUAGUGGGUUAUCAG(서열번호 12), 또는 그의 서열 변이체를 가지며, 여기서 위치 1, 3, 5, 20, 22, 및 24 중의 하나 이상은 화학적으로-변형된다. 일부 구현예에서, 상기 화학적으로-변형된 뉴클레오티드(들)는 핵산의 시험관내 및/또는 생체내 안정성을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 상기 화학적으로-변형된 뉴클레오티드(들)는 예를 들어 염증성 병태, 심장 손상, 또는 근이영양증을 치료하기 위해 핵산의 치료 효능을 증진시킨다.
일부 구현예에서 상기 단리된 핵산은 하나의 유형, 또는 둘 이상의 상이한 유형의 화학적으로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 화학적으로-변형된 뉴클레오티드는 그 구조(잠긴 핵산(LNA))를 고정시키는 뉴클레오티드 당 고리(nucleotide sugar ring)의 2'-O 원자와 4'-C 원자를 연결하는 메틸렌 브릿지를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 단리된 핵산은 뉴클레오티드 서열 CGUCCGAUGGUAGUGGGUUAUCAG(서열번호 12), 또는 그의 서열 변이체를 포함하며, 여기서 위치 1, 3, 5, 20, 22, 및 24 중의 하나 이상은 LNA이다. 일부 구현예에서, 상기 단리된 핵산은 뉴클레오티드 서열 CGUCCGAUGGUAGUGGGUUAUCAG(서열번호 12), 또는 그의 서열 변이체를 가지며, 여기서 위치 1, 3, 5, 20, 22, 및 24 중의 하나 이상은 LNA이다. 일부 구현예에서, 상기 단리된 핵산은 뉴클레오티드 서열 CGUCCGAUGGUAGUGGGUUAUCAG(서열번호 2), 또는 그의 서열 변이체를 포함하며, 여기서 위치 1, 3, 5, 20, 22, 및 24는 LNA이다. 일부 구현예에서, 상기 단리된 핵산은 뉴클레오티드 서열 CGUCCGAUGGUAGUGGGUUAUCAG(서열번호 2)를 가지며, 여기서 위치 1, 3, 5, 20, 22, 및 24는 LNA이다.
일부 구현예에서, 상기 단리된 핵산은 임의의 적합한 화학적 변형을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 화학적 변형은 백본 변형, 예를 들어 당/포스페이트 백본의 변형이다. 일부 구현예에서, 상기 화학적 변형은 백본 당 변형이다. 일부 구현예에서, 상기 화학적으로-변형된 뉴클레오티드는 LNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 화학적 변형은 뉴클레오티드 사이의 링커로서 포스포로티오에이트기의 도입을 포함한다. 상기 화학적으로-변형된 뉴클레오티드의 적합한 백본 변형은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 당간 연결 또는 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로시클릭 당간 연결(intersugar linkages)을 포함하지만, 이로써 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 상기 화학적 변형은 염기 변형이다.
본 발명의 핵산은 임의의 적합한 옵션을 사용하여 제조될 수 있다. 적절한 옵션은 제한 없이, 화학적 합성, 효소적 생산 및/또는 생물학적 생산을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 화학적 합성을 사용하여 제조된다. 상기 핵산의 화학적 합성을 위한 임의의 적절한 옵션이 사용될 수 있다. 적절한 옵션으로는 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 포스포르아미다이트(phosphoramidite), 포스파이트-트리에스테르, 및 고상 합성 방식을 포함하지만, 이로써 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 상기 핵산을 제조하는 것은 시험관내 전사를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조된다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 관심 뉴클레오티드 서열을 갖는 비변형된 핵산을 화학적으로 변형시킴으로써 제조된다.
방법
본원에서는 치료적 페이로드(therapeutic payload)로서 핵산(예를 들어 RNA)을 보유하는 경구 제형을 포함하는 본 발명의 제형(본원에서 "치료 방법"이라고도 함)를 사용하여 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 치료 방법에 의해 치료될 수 있는 병태는 예를 들어 염증 및/또는 섬유증과 관련된 질환을 포함하지만, 이로써 제한되지는 않는다. 병태는 심장 병태, 근육 장애, 심근경색, 심장 장애, 심근 변경(myocardial alterations), 근이영양증, 섬유성 질환, 염증성 질환, 바이러스 감염, 피부경화증, 보존된 박출률을 갖는 심부전, 패혈증 및/또는 상처 치유를 포함하지만, 이로써 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 본 치료 방법에 의해 치료되는 병태는 감염의 증상 및/또는 후유증이다. 일부 구현예에서, 상기 감염은 바이러스 감염, 예를 들어 호흡기 바이러스 감염, 예를 들어 COVID-19 호흡기, 다른 코로나 바이러스로 인한 감염, 또는 다른 바이러스 병원체(예를 들어 플루(flu), H1N1, C형 간염(Hepatitis C), HIV 등)이다.
일부 구현예에서, 치료 방법은 근육 장애(또는 근육 병태) 또는 그의 증상을 치료하는 방법을 포함하되, 상기 방법은 근육 장애 또는 그의 증상을 치료할 필요가 있는 대상체에게 본 발명의 핵산을 함유하는 하나 이상의 조성물의 치료적 유효량을 경구 투여하는 것을 포함한다. 상기 근육 장애는 골격근 장애 또는 심장 근육 장애일 수 있으나, 이로써 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 상기 근육 장애는 근이영양증, 예를 들어 뒤시엔느 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 근이영양증을 갖거나, 또는 근이영양증이 발병할 위험이 있다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 유전적으로 근이영양증, 예를 들어 뒤시엔느 근이영양증이 발병하기 쉽다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 상기 대상체가 근이영양증, 예를 들어 뒤시엔느 근이영양증이 발병하기 쉽게 하는 디스트로핀 유전자에 하나 이상의 돌연변이를 갖는다.
일부 구현예에서, 치료 방법은 심장 병태 또는 그의 증상을 치료하는 방법을 포함하되, 상기 방법은 심장 병태 또는 그의 증상을 치료할 필요가 있는 대상체에게 본 발명의 핵산을 함유하는 하나 이상의 조성물의 치료적 유효량을 경구 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 인간 대상체이다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 비-인간 대상체, 예를 들어 비-인간 포유동물이다.
다양한 심장 병태가 본 방법에 의해 치료될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 심장 병태는 심부전 또는 심근경색의 증상 및/또는 후유증을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 심장 병태는 비대성 심근증을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 심장 병태는 보존된 박출률을 갖는 심부전(HFpEF)을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 대상체는 심장 병태가 발달할 위험이 있다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 상기 대상체의 가족력, 유전적 소인, 생활방식, 및 의료력 중의 하나 이상을 기준으로 심장 병태를 발달시킬 위험이 있다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 상기 대상체가 비대성 심근증(HCM)이 발병하기 쉽게 하는 심장 트로포닌 I의 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 심장병에 대한 하나 이상의 동반질환을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 동반질환은 비만 및 고혈압을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 심장 병태를 갖거나 심장 병태로 진단된다.
일부 구현예에서, 상기 대상체는 고혈압, 상승된 E/e' 비율, 심장 비대증, 심근 섬유증, 비만, 소모성 질환(wasting), 감소된 지구력, 및 상승된 전신 염증 마커 중의 하나 이상을 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 고혈압을 가지며, 핵산(또는 그의 조성물)의 치료적 유효량을 투여하는 것은 대상체의 혈압을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 고혈압을 갖는 대상체는 130/90 mmHg 이상의 휴식기 혈압(resting blood pressure)을 갖는다. 일부 구현예에서, 고혈압을 갖는 대상체는 140/90 mmHg 이상의 휴식기 혈압을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 핵산(또는 그의 조성물)의 치료적 유효량을 투여하는 것은 상기 대상체의 수축기 혈압 또는 확장기 혈압을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 상기 대상체의 혈압(수축기 또는 확장기 혈압)은 핵산(또는 그의 조성물)의 치료적 유효량을 투여한 후, 적어도 약 5%, 7.5%, 10%, 12.5%, 15%, 17.5%, 20%, 25%, 30% 이상, 또는 선행 값들 중의 임의의 2개로 정의된 범위의 백분율로 감소된다. 일부 구현예에서, 상기 대상체의 혈압(수축기 또는 확장기 혈압)은 적어도 치료 유효량의 핵산(또는 그의 조성물)을 투여한 후 더 이상 고혈압이 아닌 것으로 간주되는 수준으로 감소된다.
일부 구현예에서, 상기 대상체는 상승된 E/e' 비율을 가지며, 핵산(또는 그의 조성물)의 치료적 유효량을 투여하면 E/e' 비율이 감소된다. 일부 구현예에서, 상기 대상체의 E/e' 비율은 상기 핵산(또는 그의 조성물)의 치료적 유효량을 투여한 후, 적어도 약 5%, 7.5%, 10%, 12.5%, 15%, 17.5%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 이상, 또는 선행 값들 중의 임의의 2개로 정의된 범위의 백분율로 감소된다. 일부 구현예에서, 상기 대상체의 E/e' 비율은 적어도 핵산(또는 그의 조성물)의 치료적 유효량을 투여한 후 더 이상 임상적으로 관련이 없다고 여겨지는 수준으로 감소된다.
일부 구현예에서, 상기 대상체는 심장 비대증을 가지며, 핵산을 포함하는 조성물의 치료적 유효량의 경구 투여는 심장 비대를 감소시킨다. 심장 비대증은 임의의 적절한 옵션을 이용하여 측정할 수 있다. 일부 구현예에서, 심장 비대증은 심장 초음파 검사(echocardiography)를 사용하여 측정된다. 일부 구현예에서, 심장 비대증을 갖는 대상체는 심장 초음파 검사로 측정하였을 때, 확장기 중격벽 직경(IVSd) 및/또는 좌심실 후벽 직경(LVPWd)이 증가하고, 치료적 유효량의 핵산(또는 그의 조성물)을 투여하면 IVSd 및/또는 LVPWd가 감소한다. 일부 구현예에서, 상기 대상체의 IVSd 또는 LVPWd는 상기 핵산(또는 그의 조성물)의 치료적 유효량을 투여한 후, 적어도 약 5%, 7.5%, 10%, 12.5%, 15%, 17.5%, 20%, 25%, 30% 이상, 또는 선행 값들 중의 임의의 2개로 정의된 범위의 백분율로 감소된다. 일부 구현예에서, 상기 대상체의 IVSd 또는 LVPWd는 핵산을 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 투여한 후 적어도 더 이상 비대증인 것으로 간주되지 않는 수준으로 감소된다.
일부 구현예에서, 상기 대상체는 심근 섬유증을 갖고, 본원에 제공된 치료용 핵산을 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 경구 투여하는 것은 섬유증을 예방하거나 감소시킨다. 본원에서 사용되는 "섬유증"은 심근의 임의의 리모델링(예를 들어 병리학적 리모델링), 예를 들어 섬유성 및/또는 지방 조직의 침착, 근육 조직의 섬유성 및/또는 지방 조직으로의 대체를 포함할 수 있지만, 이로써 제한되지는 않는다. 심장 섬유증은 임의의 적절한 수단, 예를 들어 생검, 초음파 또는 MRI를 사용하여 모니터링된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 치료용 핵산을 포함하는 조성물의 경구 투여는 심근 섬유증 및/또는 근육 섬유증의 발달을 제거하거나 지연시킨다.
일부 구현예에서, 상기 대상체는 소모성 질환 또는 체중 감소를 나타내며, 본원에 제공된 치료용 핵산을 포함하는 조성물을 경구 투여하는 것은 상기 소모성 질환을 지연시키거나 예방한다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 상기 핵산(또는 그의 조성물)의 치료적 유효량을 투여한 후, 최대 약 20%, 15%, 10%, 5%, 3% 이하, 또는 선행 값들 중의 임의의 2개로 정의된 범위의 백분율의 체중 감소를 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 대상체의 체중은 본원에 제공된 치료용 핵산을 포함하는 조성물을 경구 투여한 후 회복되거나, 실질적으로 치료 전 수준으로 유지된다.
일부 구현예에서, 상기 대상체는 감소된 지구력, 예를 들어 운동 지구력을 나타내고, 본원에 제공된 치료용 핵산을 포함하는 조성물을 경구 투여하는 것은 지구력의 감소를 지연시키거나 방지한다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 본원에 제공된 치료용 핵산을 포함하는 조성물을 경구 투여한 후, 최대 약 20%, 15%, 10%, 5%, 3% 이하, 또는 선행 값들 중의 임의의 2개로 정의된 범위의 백분율의 지구력 감소를 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 대상체의 운동 지구력은 본원에 제공된 치료용 핵산을 포함하는 조성물을 경구 투여한 후 회복되거나 실질적으로 치료 전 수준으로 유지된다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 본원에 제공된 치료용 핵산을 포함하는 조성물을 경구 투여한 후, 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% 35%, 40%, 50% 이상, 또는 선행 값들 중의 임의의 2개로 정의된 범위의 백분율의 지구력 개선을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 치료용 핵산을 포함하는 조성물을 경구 투여한 후의 지구력 향상은 치료 기간에 걸쳐 지속된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 치료용 핵산을 포함하는 조성물을 경구 투여한 후 지구력의 개선은 다중 투여량의 투여에 걸쳐 지속된다.
일부 구현예에서, 상기 대상체는 예를 들어 말초 혈액에서 전신 염증 마커의 상승된 수준을 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 전신 염증 마커는 IL-6 및 뇌성 나트륨이뇨 펩티드(brain natriuretic peptide; BNP) 중의 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 전신 염증 마커의 수준은 본원에 제공된 치료용 핵산을 포함하는 조성물을 경구 투여한 후, 적어도 약 5%, 7.5%, 10%, 12.5%, 15%, 17.5%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 이상, 또는 선행 값들 중의 임의의 2개로 정의된 범위의 백분율로 감소된다. 일부 구현예에서, 상기 대상체의 전신 염증 마커는 적어도 본원에 제공된 치료용 핵산을 포함하는 조성물을 경구 투여한 후 더 이상 상승되지 않는 것으로 간주되는 수준으로 감소된다.
일부 구현예에서, 상기 대상체가 비만인 경우, 상기 핵산을 투여하는 것의 치료 효과는 상기 대상체의 비만과 무관하다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 치료용 핵산을 포함하는 조성물을 경구 투여하는 것은 상기 대상체의 체중에 영향을 미치지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 대상체는 감소된 골격근 기능, 예를 들어 골격근 그룹에 의해 발휘된 힘(force) 또는 토크(torque)을 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 감소된 골격근 기능을 나타내고, 본원에 제공된 치료용 핵산을 포함하는 조성물을 경구 투여하는 것은 감소된 골격근 기능의 발달을 지연시키거나, 골격근 기능의 악화를 방지하거나, 골격근 기능을 향상시킨다. 일부 구현예에서, 상기 대상체의 골격근 기능은 본원에 제공된 치료용 핵산을 포함하는 조성물을 경구 투여한 후 회복되거나 실질적으로 전처리 수준으로 유지된다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 본원에 제공된 치료용 핵산을 포함하는 조성물을 경구 투여한 후, 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% 35%, 40%, 50% 이상, 또는 선행 값들 중의 임의의 2개로 정의된 범위의 백분율의 골격근 기능의 개선을 나타낸다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 치료용 핵산을 포함하는 조성물을 경구 투여하는 것의 임의의 치료 효과는 치료 기간에 걸쳐 지속된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 치료용 핵산을 포함하는 조성물을 경구 투여하는 것의 임의의 치료 효과는 다중 투여량의 투여에 걸쳐 지속된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 치료용 핵산을 포함하는 조성물을 경구 투여하는 임의의 치료 효과는 치료 기간에 걸쳐 일시적이지 않다.
일부 구현예에서, 본 발명의 치료 방법은 다양한 염증성 병태 중의 임의의 하나 이상을 치료한다. 일부 구현예에서, 상기 염증성 병태는 만성 병태이다. 일부 구현예에서, 상기 염증성 병태는 IL-10의 항-염증 효과에 반응하는 것이다. 일부 구현예에서, 염증성 병태는 자가면역 질환, 이식편대숙주병(graft-versus-host disease; GVHD) 또는 기관 이식에 대한 면역 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 염증성 병태는 바이러스 감염, 패혈증(sepsis), 관절염(류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 건선성 관절염), 다발성 경화증, 천포창(pemphigus), 유형 1 당뇨병(인슐린 의존성 당뇨병(insulin-dependent diabetes mellitus; IDDM)이라고도 함)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 염증성 병태는 베체트병(Behηet's disease), 다발성근염/피부근염(polymyositis/dermatomyositis), 자가면역성 혈구감소증, 자가면역성 심근염, 원발성 간경변증, 굿파스처 증후군(Goodpasture's syndrome), 자가면역성 수막염, 쇼그렌 증후군(Sjgren's syndrome), 전신 홍반성 루푸스, 애디슨병, 원형 탈모증(alopecia areata), 강직성 척추염, 자가면역성 간염, 자가면역성 홍반, 크론병(Crohn's disease), 인슐린-의존성 진성 당뇨병, 이영양성 수포성 표피박리증(ystrophic epidermolysis bullosa), 부고환염(epididymitis), 사구체신염, 그레이브스병(Graves' disease), 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre' syndrome), 하시모토병(Hashimoto's diseas), 용혈성 빈혈(hemolytic anemia), 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 건선, 류마티스열, 류마티스 관절염, 사르코이드증(sarcoidosis), 경화증(scleroma), 척추관절병증(spondyloarthropathy), 갑상선염, 혈관염, 백반증(vitiligo), 점액수종(myxedema), 악성 빈혈 및 궤양성 대장염을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 염증은 골수 이식과 관련이 있다. 일부 구현예에서, 상기 염증은 조직 이식 후 동종이식 거부반응과 관련된다. 일부 구현예에서, 상기 자가면역 질환은 심장 자가면역 질환, 예를 들어 자가면역 심근염이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 치료 방법은 다양한 감염성 질환 중의 임의의 하나 이상의 증상 및/또는 후유증을 치료한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 핵산에 의해 치료되는 심장 병태 또는 염증성 병태는 감염성 질환의 증상 및/또는 후유증을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 감염성 질환은 심근 손상과 관련이 있다. 일부 구현예에서, 상기 심장 질환은 감염성 질환과 관련된 급성 심근염을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 염증성 병태는 감염성 질환과 관련된 사이토카인 폭풍 또는 과염증을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 염증성 병태는 급성 폐 손상 또는 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS)을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 감염성 질환은 하기 병원체 중의 하나 이상에 의한 감염이다: 바이러스(코로나 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 단순 포진 바이러스, 유두종 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 간염 바이러스, 콕사키 바이러스(Coxsackie Virus), 대상 포진 바이러스(herpes zoster virus), 홍역 바이러스( measles virus), 볼거리 바이러스(mumps virus), 풍진(rubella), 광견병 바이러스, 출혈성 바이러스, H1N1 등을 포함하지만, 이로써 제한되지는 않음), 프리온(prions), 기생충, 진균, 곰팡이, 효모 및 박테리아(그램 양성 및 그램 음성 모두). 일부 구현예에서, 병원체는 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)(E. coli), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)(P. aeruginosa), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)(S. aureus), 그룹 A 스트렙토코시(Group A streptococci), 에스.뉴모니애(S. pneumoniae), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella) 및 다양한 약물 내성 박테리아를 포함하지만, 이로써 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 상기 염증은 바이러스, 예를 들어 DNA 또는 RNA 바이러스에 의한 감염에 후속하거나 동시에 일어난다. 일부 구현예에서, 상기 바이러스는 RNA 바이러스, 예를 들어 단일 또는 이중 가닥 바이러스이다. 일부 구현예에서, 상기 RNA 바이러스는 양성 센스의 단일가닥 RNA 바이러스이다. 일부 구현예에서, 상기 바이러스는 니도바이러스 목(Nidovirales　order)에 속한다. 일부 구현예에서, 상기 바이러스는 코로나비리다에 과(Coronaviridae family)에 속한다. 일부 구현예에서, 상기 바이러스는 알파코로나바이러스, 베타코로나바이러스, 감마코로나바이러스 또는 델타코로나바이러스 속(genus)에 속한다. 일부 구현예에서, 상기 알파코로나바이러스는 인간 코로나바이러스 229E, 인간 코로나바이러스 NL63 또는 전염성 위장염 바이러스(TGEV)일 수 있으나, 이로써 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 베타코로나바이러스는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(SARS-CoV), SARS-CoV-2(COVID-19), 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV), 인간 코로나바이러스 HKU1, 또는 인간 코로나바이러스 OC43이지만, 이로써 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 상기 감마 코로나바이러스는 감염성 기관지염 바이러스(IBV)이다.
상기 핵산은 임의의 적합한 양(예를 들어 본원에 제공된 경구 제형 내의 양)으로 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산의 치료적 유효량은 약 0.01 ㎍, 0.02 ㎍, 0.05 ㎍, 0.1 ㎍, 0.2 ㎍, 0.5 ㎍, 1 ㎍, 2 ㎍, 3 ㎍, 4 ㎍, 5 ㎍, 6 ㎍, 7 ㎍, 8 ㎍, 9 ㎍, 10 ㎍, 15 ㎍, 20 ㎍, 25 ㎍, 30 ㎍, 40 ㎍, 50 ㎍, 75 ㎍, 100 ㎍, 125 ㎍, 150 ㎍, 175 ㎍, 200 ㎍, 250 ㎍, 300 ㎍, 400 ㎍, 500 ㎍, 600 ㎍, 700 ㎍, 800 ㎍, 900 ㎍, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg 이상, 또는 선행 값들 중의 임의의 2개로 정의된 범위 내의 양을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산의 치료적 유효량은 체중의 약 0.001 ㎍/g, 0.002 ㎍/g, 0.005 ㎍/g, 0.01 ㎍/g, 0.02 ㎍/g, 0.05 ㎍/g, 0.1 ㎍/g, 0.15 ㎍/g, 0.2 ㎍/g, 0.5 ㎍/g, 1 ㎍/g, 2 ㎍/g, 3 ㎍/g, 4 ㎍/g, 5 ㎍/g, 6 ㎍/g, 7 ㎍/g, 8 ㎍/g, 9 ㎍/g, 10 ㎍/g, 15 ㎍/g, 20 ㎍/g, 25 ㎍/g, 30 ㎍/g, 35 ㎍/g, 40 ㎍/g, 45 ㎍/g, 50 ㎍/g, 60 ㎍/g, 70 ㎍/g, 80 ㎍/g, 90 ㎍/g, 100 ㎍/g 이상, 또는 선행 값들 중의 임의의 2개로 정의된 범위 내의 양을 포함한다.
상기 핵산 또는 조성물은 임의의 적절한 투여 스케줄로 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 핵산 또는 조성물의 치료적 유효량은 대상체에게 1주일에 2회 이하, 1주일에 1회, 2주일에 1회, 1개월에 1회, 2개월에 1회, 3개월에 1회, 4개월에 1회 이상, 또는 선행 값들 중의 임의의 2개로 정의된 범위의 빈도로 투여된다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 상기 대상체에게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30회 이상 투여된다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 상기 대상체에게 규칙적인 간격으로 투여된다.
임의의 적절한 경로를 사용하여 투여될 수 있는 제형이 본원에 개시되어 있지만, 제공된 제형의 몇몇 구현예는 예상외로 경구 전달에 적합하다. 대안적으로, 상기 투여는 국소 또는 전신적일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 투여는 비경구 투여이다. 투여에 적합한 선택은 정맥내, 근육내, 피하, 동맥내, 복강내 또는 경구 투여를 포함하지만, 이로써 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 상기 핵산 또는 조성물은 정맥내 투여된다. 일부 구현예에서, 상기 핵산 또는 조성물은 주입에 의해 투여된다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 조성물은 경구 투여된다.
키트
본원에서는 또한, 본 발명의 핵산 함유 조성물을 포함하는 키트가 제공된다. 본원에 제공되는, 본 발명의 키트는 일부 구현예에서 근육 장애, 심장 병태 또는 염증성 병태(예를 들어 바이러스 감염과 관련된 병태)를 치료하는데 사용된다. 키트는 본 발명의 핵산 및 형질 감염 시약을 포함할 수 있다. 상기 형질 감염 시약은 본원에 제공된 바와 같이 임의의 적합한 형질 감염 시약일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 키트는 본원에 제공되는 약학적으로 허용가능ㅎ나 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 키트는 카세인 및/또는 키토산을 포함한다. 키트는 키트의 하나 이상의 성분을 담기 위한 하나 이상의 용기(예를 들어 바이알, 앰플, 시험관, 플라스크 또는 병)를 포함할 수 있다. 상기 키트는 상기 키트를 사용하여 병태(예를 들어 HCM, HFpEF, 근이영양증, 피부경화증, 및/또는 바이러스 감염과 관련된 염증성 병태)를 치료하기 위한 지침을 더 포함할 수 있다. 정보 및 지침은 단어, 그림, 또는 둘 다의 형태 등일 수 있다.
본원에서 전반에 걸쳐 인용된 참고문헌, 허여된 특허, 공개된 특허출원, 및 동시 계류중인 특허출원을 포함하는 모든 특허 및 기타 간행물은, 예를 들어 본원에 기재된 기술과 관련하여 사용될 수 있는 그러한 간행물에 기술된 방법론을 기술하고 개시하기 위한 목적으로 본원에 명백히 참조로 포함된다. 이들 간행물은 본원의 출원일 이전에 그들의 개시를 위해서만 제공된다. 이와 관련하여 어떠한 것도 본 발명자들이 종래 발명에 의한 이러한 개시를 선행하거나 어떤 다른 이유로 선행할 자격이 없다고 인정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 이들 문서의 내용에 관한 날짜 또는 표현에 관한 모든 진술은 출원인이 이용할 수 있는 정보를 기반으로 하며, 이들 문서의 날짜나 내용의 정확성에 관한 어떠한 인정도 구성하지 않는다.
본 발명의 구현예들에 대한 설명은 본 발명을 철저하게 하거나 개시된 정확한 형태로 한정하고자 하는 것이 아니다. 본원에서는 본 발명의 구체적인 구현예 및 그의 구체예에 대하여 설명하고 있지만, 당업자라면 이를 인정할 수 있는 바와 같이 본 발명의 범위 내에서 다양한 균등한 변형이 가능하다. 예를 들어 방법 단계들 또는 기능들이 주어진 순서로 제시되는 동안, 대안적인 구현예들은 기능들을 상이한 순서로 수행할 수 있거나, 기능들이 실질적으로 동시에 수행될 수 있다. 본원에서 제공되는 발명의 교시는 다른 절차 또는 방법에 적절하게 적용될 수 있다. 본원에 기술된 다양한 구현예들은 추가적인 구현예들을 제공하기 위해 조합될 수 있다. 본 발명의 측면은, 필요한 경우, 상기 참고문헌 및 출원의 구성, 기능 및 개념을 사용하여 본 발명의 또 다른 구현예를 제공하도록 변형될 수 있다. 더욱이, 생물학적 기능적 동등성 고려 사항으로 인해 종류나 양에 따라 생물학적 또는 화학적 작용에 영향을 미치지 않으면서 단백질 구조에 약간의 변화를 가져올 수 있다. 이들 및 다른 변화가 상세한 설명에 비추어 본 개시 내용에 대한 변경이 이루어질 수 있다. 이러한 모든 수정은 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함되도록 의도된다.
전술한 구현예들 중의 임의의 특정 요소들은 다른 구현예의 요소들에 대해 조합되거나 치환될 수 있다. 나아가, 본 발명의 특정 구현예와 관련된 장점들이 이러한 구현예들의 맥락에서 설명되었지만, 다른 구현예들도 그러한 장점들을 나타낼 수 있으며, 모든 구현예가 반드시 본 발명의 범위 내에 속하는 그러한 장점들을 나타낼 필요는 없다.
본원에서 기재된 기술은 하기 실시예에 의해 더욱 설명되며, 이는 결코 더욱 제한적인 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
실시예 1
본원에 제공된 바와 같이, 몇몇 구현예는 치료용 핵산, 예를 들어 암호화 또는 비-암호화 RNA을 포함하는 조성물의 생성에 관한 것이며, 상기 조성물은 경구 투여용으로 제형화된다. 몇몇 구현예에서, 이들 조성물은 도 1a의 일반적인 개략도에 따라 예로서 제형화된다. 도 1b는 대안적인 구현예를 도시한다. 도 1a는 핵산(예를 들어 RNA, 특히 투여시 치료 효과를 갖는 비-암호화 RNA)이 인공 지질 미셀에 캡슐화된 비-제한적 구현예를 도시한다. 이러한 캡슐화된 RNA는 선택적 IV 전달에 적합하다. 그러나, 본원에 개시된 몇몇 구현예에 따르면, 상기 인공 미셀은 카세인 단백질로 코팅된다. 이어서 상기 카세인-코팅된 미셀을 산성 용액 및 키토산에 노출시켜서, 카세인-키토산 코팅된 미셀을 얻는다. 상기 카세인-키토산 코팅된 미셀은 카세인-키토산 코팅된 미셀이 조성물에 내산성을 부여하여 핵산의 생체이용성이 증가한 상태에서 핵산을 경구 전달할 수 있게 하여 분해가 제한된 상태에서 위장의 산성 환경을 통과할 수 있게 한다.
비-제한적 실시예로서, 도 2a 및 도 2b는 이러한 방식으로 캡슐화된 RNA의 두 가지 예를 보여준다. 도 2a는 TY4 RNA를 포함하는 조성물을 보여준다. 도 2b는 piR-659(piREX1이라고도 함)를 포함하는 조성물을 보여준다. 도 2c는 캡슐화된 piREX1 RNA(뿐만 아니라 핵산 변형을 갖는 piREX1)가 경구 전달된 경우 비히클을 투여받은 동물에 비해 경색 크기(infarct size)가 현저히 감소하였음을 보여주는 (심근경색 모델로부터의) 표본 데이터를 나타낸다. 유사하게, 심장 트로포닌 I(심장 손상의 마커)의 순환 농도는 본원에 제공된 조성물에 따라 치료용 piREX1 RNA가 경구 전달되었을 때 현저히 감소되었다.
이러한 데이터는 핵산, 예를 들어 치료 효과를 나타내는 RNA의 경구 전달이 본원에 제공된 조성물을 사용하여 달성될 수 있으며, 치료용 RNA의 생체이용성이 더 크므로 치료 효과가 향상됨을 입증한다.
실시예 2
이러한 비-제한적 실시예는 치료용 핵산의 치료 효과를 보여주는 것으로, 여기서 상기 비-제한적 실시예는 보존된 박출률을 갖는 심부전(HFpEF)의 모델에서 TY4, 특히 경구 투여된 TY4이다.
HFpEF에서 경구 TY4의 치료적 이점. 기존 연구에서는 비대증(hypertrophy)의 모델에서 EV-YF1과 같은 다양한 RNA 분자의 생물활성을 보여주었으며(본원에 그 전체가 참조로 포함된 미국 가특허출원 제63/202,970호의 실시예 2 참조), 동일한 모델에서 TY4의 유사한 치료 효능을 보여주었으며(본원에 그 전체가 참조로 포함된 미국 가특허출원 제63/202,970호의 실시예 4 참조), TY4는 HFpEF를 갖는 마우스에서 시험되었으며 경구 투여도 조사되었다. 이러한 '투-히트(two-hit)' 모델은 인간 HFpEF와 공통적으로 연관된 두 가지 동반질환(비만 및 고혈압)을 도입하고 HFpEF 환자의 심장 조직에서 나타나는 산화질소 신호 이상을 재현한다. 도 3a는 실험 프로토콜을 묘사한다. 마우스는 개입(WT) 없이 관찰되거나 고지방 식이(HFD)와 L-NAME-보충수를 먹였다. 5주 이내에, HFD/L-NAME 마우스는 비만 및 고혈압으로 되며, 확장기 기능 장애가 있지만(기준 에코 기준) EF는 정상이다. 그런 다음 HFpEF 마우스에 무작위로 할당하여 주 2회 r.o. 주사("IV 주사") 또는 비히클 또는 TY4의 경구 투여량("경구")을 투여하였다. TY4는 주사당 또는 경구 투여당 0.15 ㎍/g를 투여하였다. 경구 투여를 위해 TY4는 먼저 리포좀과 결합하여 TY4-리포좀 복합체를 형성한 후, 본원에 제공된 카세인-키토산 복합체에 캡슐화하였다. 주입 전/경구 투여 전 및 다양한 시점에, 마우스는 혈압 측정, 트레드밀 시험, 심장 초음파 검사, 및/또는 순환하는 바이오마커에 대해 수행하였다. 기준선에서 군 간의 유일한 차이점은 질병과 관련된 것들(고혈압, 낮은 운동 내성(exercise tolerance), HFpEF 대 WT에서 E/e 비율 상승)이었다.
10주 후, 다음과 같은 차이점이 명백하였다: TY4 동물(IV 주사) 혈압이 낮았고(도 3b), 운동 내성이 높았고(도 3c), E/e' 비율이 낮았고(도 3d), 뇌성 나트륨이뇨 펩티드(BNP) 수치가 비히클 투여 HFpEF 동물에 비해 낮았다(도 3e). 이러한 건강 지수는 WT 수준(비-HFpEF 동물)과 비슷하였다. 이러한 효과는 식이전환으로 인한 것이 아니었다: TY4 마우스는 비만을 유지하였다. 이 연구 결과는 특히 HFpEF의 난치성에 주어진 TY4의 현저한 질병-변형 생물활성을 보여준다.
도 3a 내지 도 3c: 정맥내 투여된 TY4는 HFpEF 마우스에서 질환 진행을 역전시킨다. 도 3a: 개략적 연구 설계. TY4를 정맥내 투여받은 동물은 연구 종점에서 수축기(SBP)와 확장기 혈압(DBP)이 낮고(도 3b), 운동 내성(도 3c)과 확장기 기능(E/e', 도 3d)이 개선되었으며, 심부전의 혈청 바이오마커(BNP; 도 3e) 수준이 감소하였다.
놀랍게도, TY4의 경구 투여는 유사한 치료 효과를 가져왔으며, 일부 경우에는 우수한 치료 결과를 가져왔다. TY4의 경구 투여는 비히클-투여된 HFpEF 동물과 비교하여 혈압, 즉 수축기 및 확장기 둘 다를 감소시키고(도 3f), E/e' 비율을 감소시키며(도 3g), 운동 내성(exercise tolerance)을 증가시키고(도 3h) 및 BNP 수준을 감소시켰다(도 3i). 혈압, 운동 내성 및 E/e' 비율은 TY4로 경구 치료된 동물의 WT 수준(비-HFpEF 동물)과 비슷하였다.
도 3f-3i: 경구 투여된 TY4는 HFpEF 마우스에서 질환 진행을 역전시킨다. 실험 프로토콜은 도 3a와 같다. 연구 종점에서 TY4를 경구 투여받은 동물은 수축기(SBP)와 확장기 혈압(DBP)이 낮고(도 3f), 확장기 기능(E/e', 도 3g) 및 운동 내성이 향상되고(도 3h), 심부전의 혈청 바이오마커(BNP; 도 3i) 수준이 감소하였다.
TY4의 치료 효과는 정맥 및 경구 치료된 동물 모두에서 치료 과정에 걸쳐 지속적으로 관찰되었다. 감소된 수축기 혈압은 9주차에 관찰되었고(도 3j), 반면 감소된 확장기 혈압은 7주차에 관찰되었다(도 3k). 개선된 E/e' 비율은 9주부터 적어도 14주까지 관찰되었다(도 3l). 경구 치료된 동물에서 개선된 운동 내성이 더 일관적으로 나타났으며, TY4 처리된 모든 동물은 적어도 11주차까지 운동 내성이 더 높게 나타났다(도 3m).
일부 구현예에서, HFpEF를 갖는 대상체에게 치료적 유효량의 치료용 핵산, 예를 들어 TY4와 기능이 유사한 비-암호화 RNA를 경구 투여하는 것은 HFpEF(또는 그의 하나 이상의 증상, 제한되지는 않지만 염증 및/또는 섬유증을 포함함)를 치료한다. 일부 구현예에서, HFpEF를 갖는 대상체에게 핵산, 예를 들어 비-암호화 RNA의 반복된 경구 투여는 HFpEF(또는 그의 하나 이상의 증상)를 치료한다. 일부 구현예에서, HFpEF를 갖는 대상체에게 치료적 유효량의 TY4를 정맥내 또는 경구 투여하는 것은 HFpEF의 하나 이상의 증상을 감소시키거나 완화시킨다. 일부 구현예에서, HFpEF를 갖는 대상체에게 치료적 유효량의 TY4를 정맥내 또는 경구 투여하는 것은 HFpEF로 인한 훼손된 운동 지구력, 혈압 상승, E/e' 비 상승, 전신 염증 중의 하나 이상을 감소시키거나 완화시킨다.
실시예 3
이러한 비-제한적 실시예는 실시예 2의 추가의 실험적 복제를 나타낸다. 도 4a는 이러한 실시예에서 치료용 핵산인 TY4 RNA의 비-제한적 구현예의 전달 후 수축기 혈압과 관련된 데이터를 보여준다. 도 4a에 나타낸 바와 같이, 카세인-키토산 코팅된 미셀에서 치료용 RNA를 경구 투여하면 비히클 대조군(및 미처리)과 비교하여 감소된 수축기 혈압을 나타낸다. 도 4b는 치료용 RNA의 경구 투여와 함께 확장기 혈압의 배위 감소를 보여준다. 도 4c는 치료용 RNA를 경구 투여한 후 E/e' 비율의 감소를 나타낸다. 도 4d는 비히클 대조군에 비해 뇌성 나트륨이뇨 펩티드의 감소를 보여준다. 도 4e는 치료용 RNA의 경구 전달 후, 실제로 대조군 수준보다 적당히 큰 지구력 회복을 나타낸다.
도 4f는 실시예 2의 데이터를 넘어서 새로운 데이터를 보여준다. 동물을 순환 혈당 농도에 대해 평가하였다. 도 4f에 나타난 바와 같이, 비히클 단독 처리는 대조군에 비해 혈당 농도가 높아지는 결과를 낳았다. 본원에 개시된 구현예에 따른 핵산 함유 조성물의 경구 투여는 HFpEF와 관련된 비만과 관련이 있을 수 있는 순환 혈당 수치의 현저한 감소를 초래한다. 도 4g는 비히클 처리된 마우스의 지방 축적량을 보여준다. 치료용 핵산을 경구 투여받은 우측 마우스에서 보듯이 지방 축적이 감소하는 것으로 나타났다.
이를 종합해보면, 이러한 추가적이고 새로운 데이터는 치료용 핵산, 예를 들어 비-암호화 RNA을 포함하는 경구 전달 조성물이 효과적으로 HFpEF를 치료할 수 있다는 것을 더욱 강화한다. 몇몇 구현예에서, 본원에 제공된 조성물 및 방법은 경구 투여시 질환의 결과 또는 증상인 염증 및/또는 섬유증을 효과적으로 감소시킬 수 있다.
실시예 4
이러한 비-제한적 실시예는 치료용 핵산의 생체 내 전달을 위한 다른 제형을 시험하는 연구 설계를 보여주며, 그의 비-제한적 실시예는 TY4 및/또는 그의 유도체이다(도 1b).
PEG 차폐. PEG-양이온성 지질 복합체(PCLC)는 2kDa 폴리에틸렌글리콜(PEG2000; 30% v/v)과 다마펙트(Dharmafect)의 혼합물을 사용하여 형성된다. 복합체는 이전의 제형으로부터 개조된 바와 같이 5회의 냉동/해동 사이클(액체 질소/60℃)을 사용하여 형성된다. 단일 냉동-해동 사이클은 -190℃(액체 질소)에서 5분 동안 혼합물을 냉동시킨 후 60℃에서 5분간 해동시키는 것을 포함한다. TY4(및/또는 그의 유도체)와 PCLC의 복합체는 적절한 농도의 TY4(및/또는 그의 유도체)와 5 ㎕의 PCLC를 최종 부피 100 ㎕로 혼합하여 제조한다. 제제를 상온에서 5분 동안 교반하면서 인큐베이션한다.
일부 구현예에서, 치료 핵산, 예를 들어 TY4(및/또는 그의 유도체)는 PCLC와의 복합체로서 제형화된다. 일부 구현예에서, 치료용 핵산, 예를 들어 TY4(및/또는 그의 유도체)의 약학 조성물은 TY4(및/또는 그의 유도체) 및 PCLC를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료용 핵산, 예를 들어 TY4(및/또는 그의 유도체)의 PEG 차폐는 RNA, 특히 핵산, 예를 들어 비-암호화 RNA의 경구 흡수를 촉진하여 치료 효과를 가져온다.
실시예 5
이러한 비-제한적 실시예는 경구 투여를 위한 CDC-EV와 카세인의 제형을 보여준다.
경구적으로 주어졌을 때 변경되지 않은 CDC-EV를 취할 수 있다. 모유에서 우세한 단백질인 카세인은 CDC-EV 섭취의 섭취와 생물활성을 높여서 mdx 마우스에서 혈중 세포의 유전자 발현을 변화시키고 근육 기능을 향상시킬 수 있다.
경구 섭취량을 정량함. 리포좀 또는 EV는 확립된 나노사이트(NanoSight) 방법을 사용하여 설명된 바와 같이 계수된다. 107개 입자의 출발 "투여량"이 선택된다. 치료용 화합물은 치료용 핵산(비-제한적 실시예로는 TY4 및/또는 그의 유도체를 포함함)을 그대로 투여하거나 인산염 완충 식염수(PBS) 중의 8% 카세인 용액과 혼합하여 투여한다. 각각의 치료용 화합물 제형, 또는 카세인 용액과 각각의 치료용 화합물 제형의 혼합물을 18시간 공복 후 경구 위관 영양법으로 HFpEF 마우스에 공급하고, 18시간 공복 후 PBS 단독 또는 8% 카세인 용액 단독을 공급하는 것과 비교하였다. 각 시험편의 경구 투여 후 1시간 만에 RNA 추출을 위해 하대정맥으로부터 혈액을 수집한다. 혈액으로의 흡수는 RNA 분리법을 이용하여 qPCR로 전혈 내 치료 화합물 수준을 측정하여 정량한다. 측정된 PCR 사이클은 알려진 수준의 TY4를 마우스 혈액에 스파이킹하여 생성된 표준과 비교된다. TY4는 인간 특이적 서열로부터 유래되므로 마우스의 배경 수준은 신뢰성 있는 PCR 검출 한계 이하이다. 추가적인 특성화를 위한 선택은 혈액 중 TY4의 측정된 수준을 기준으로 한다. 제형(카세인과 함께 또는 카세인 없이)은 TY4가 대조군의 2개의 증폭 사이클 Ct에 의해 또는 qPCR에 의해 더 일찍 검출되는 경우 경구 전달을 제공하는 것으로 간주될 수 있다. 일부 구현예에서, 제형은 qPCR에 의해 가장 가까운 경쟁자보다 >3 Ct 검출을 제공한다. 제형은 생체내 생물활성에 대해 추가로 시험될 수 있다.
생체내 생물활성. 질환-변형 생물활성을 평가하기 위해 마우스 HFpEF 모델을 사용한다. 고지방 식이 + L-NAME, HFpEF 마우스가 비히클(PBS)을 섭취한 후 5주째부터 시작해 격일로 각각의 제형을 (카세인과 함께 또는 카세인 없이) 섭취하게 된다.
일부 구현예에서, 비-암호화 RNA, 예를 들어 TY4(및/또는 그의 유도체)(리포좀 또는 CDC-EV에서)을 포함한 치료용 핵산이 카세인과 함께 제형화된다. 일부 구현예에서, TY4(및/또는 그의 유도체)의 약학적 조성물은 리포좀 또는 CDC-EV에 TY4(및/또는 그의 유도체), 및 카세인을 포함한다. 일부 구현예에서, TY4(및/또는 그의 유도체)의 약학적 조성물은 리포좀 또는 CDC-EV에 TY4(및/또는 그의 유도체) 및 8% 카세인을 포함한다. 일부 구현예에서, TY4(및/또는 그의 유도체)(리포좀 또는 CDC-EV 중) 및 카세인, 예를 들어 8% 카세인의 제형은 TY4(및/또는 그의 유도체)의 경구 흡수를 촉진한다.
실시예 6
이러한 비-제한적 실시예는 지질 미셀에 캡슐화되어 카세인-키토산 복합체로 코팅된 치료용 핵산을 포함하는 경구 제형이 심근경색 증상을 개선하는 것을 보여준다.
치료용 핵산의 경구 전달 효과를 평가하기 위해 45분 동안 좌측 전방 하행 관상 동맥을 개방 흉부 폐색한 후 재관류하여 마우스에서 심근경색을 모델링하였다. 그런 다음 가슴을 닫았다. 재관류 20분 후, 본원에 제공된 바와 같이, 마우스에 비히클 또는 지질-캡슐화된 치료용 RNA로 구성된 IV 조성물, 또는 지질 미셀에 캡슐화되고 카세인-키토산으로 코팅된 치료용 RNA를 포함하는 경구 조성물을 투여하였다. 여기서 사용하는 핵산 페이로드의 비-제한적 실시예는 TY4였다. 심장은 MI 후 48시간 절제되고 경색 크기(IS)는 조직학적으로 정량화되었다.
도 5a는 경색 크기와 관련된 풀링된 데이터를 보여준다. 도시된 바와 같이, IV와 경구 조성물 모두 경색 크기가 감소하였다. 특히 TY4의 경구 전달은 경색 크기의 감소가 증진된 것으로 나타났다. 각 군에 대한 대표적인 좌심실 절편을 도 5b에 나타내었으며, 경구 치료군은 경색 흉터가 현저히 적은 것으로 나타났다. 심장 손상의 마커로 도 5c는 경구 투여된 TY4가 대조군에 비해 유의한 감소를 나타내었음을 보여준다. 이를 종합해보면, 조직학 및 트로포닌 I에 대한 데이터는 비-암호화 RNA TY4와 같은 경구 전달 치료용 핵산의 심장보호 효능을 보여주는 상호 강화된 데이터이다.
이러한 결과를 바탕으로 추가적인 비교 분석은 도 5d 및 도 5e에 제시된다. 도 5d는 본원에 개시된 구현예에 따른 조성물에 수용된 경구 투여 TY4(또는 그의 스크램블된 형태)(예를 들어 카세인-키토산으로 코팅된 미셀)의 IV 주사를 나타낸다. 여기서 추가 군은 카세인 단독으로 코팅한 미셀에 캡슐화된 경구 TY4(키토산 없음)를 포함한다. 도 5d의 데이터는 치료용 RNA의 경구 전달에 대해 위에서 논의된 발견을 강화한 것이나, 바람직한 구현예에 따르면 지질 미셀이 카세인과 키토산 모두로 코팅되어 있음을 입증한다. 도 5d의 우측 시험군은 카세인만으로 코팅된 RNA-캡슐화 미셀이다. 이 군에 대한 경색 크기는 현저히 증가하였는데, 이는 위장의 저산 환경에서 조성물에 대한 덜 강건한 보호로 인한 TY4의 감소된 생체이용성을 시사하는 것이다. 도 5e는 카세인 단독 제형이 적어도 상승된 농도를 향한 경향이 나타남에도(치료 효과가 적음) 심장 트로포닌 I의 측정과 관련하여 효능의 하락이 적음을 보여준다. 이를 종합해보면, 이들 데이터는 여러 구현예에서 본원에 제공된 바와 같이 카세인-키토산 코팅을 이용한 비-암호화 RNA TY4와 같은 경구 전달된 치료용 핵산의 심장보호 효능을 뒷받침한다.
실시예 7
이러한 비-제한적 실시예는 지질 미셀에 캡슐화되고 카세인-키토산 복합체로 코팅된 치료용 핵산을 포함하는 경구 제형이 피부경화증 증상을 개선시킴을 보여준다.
피부경화증은 피부, 심장, 폐의 점진적인 피부 비대화와 섬유화로 나타나는 자가면역 질환이다. 3주 동안 마우스에 블레오마이신을 피내 주사한 동물모델을 사용하였다. 이후 본원에 제공된 바와 같이 동물을 치료용 RNA 분자의 경구 전달을 위해 구성된 조성물로 처리하였다. 본 실험은 카세인-키토산으로 코팅된 지질 미셀에 캡슐화되어 경구 전달되는 비-제한적인 실시예의 RNA인 TY4를 사용하였다. 대조군으로는 스크램블된 RNA 서열의 경구 전달(동일한 전달 조성물)을 사용하였다.
도 6a는 트레드밀에서의 지구력 시험과 관련된 데이터를 나타낸다. 도시된 바와 같이, 치료용 RNA의 경구 전달은 미처리 대조군 마우스의 완전한 회복을 초래하였고, PBS 대조군 및 스크램블된 RNA 서열 대조군은 각각 지구력의 상당한 감소를 초래하였다. 도 6b는 치료용 RNA의 경구 전달이 대조군과 현저히 다르지 않도록 마우스의 체중을 유지할 수 있게 한 것을 보여준다. 도 6c는 각 군의 마우스의 체중과 관련된 심장지수(HI)를 나타낸다. 비치료군과 체중 감소에서 예상되는 바와 같이 이들 군은 상승된 HI를 보였다. 또한, (예를 들어 섬유증으로 인한) 심박 중량의 증가는 증가된 HI의 측면을 설명할 수 있었다. 마찬가지로 체중의 함수로서 폐 중량을 지표로 하는 폐지수(PI)를 측정할 경우 비-치료군에 비해 유의하게 감소된 PI를 나타냈다(비록 PI가 여전히 대조군에 비해 높아졌지만). 도 6e는 폐 중량 데이터만을 나타내며, 이는 PI 데이터에 해당한다.
구체적으로 심장 측정을 살펴보면, 도 7a는 섬유증과 관련된 조직학적 데이터를 나타낸다. 맨 위 행은 두 번째 행에 제공된 확대 보기에 해당하는 점선 상자가 있는 대표적인 조직 얼룩을 보여준다. 경구 전달 치료용 RNA는 조직의 섬유증이 크게 감소된 것을 나타낸다. 도 7b는 각 군에 대한 섬유증 정량을 나타내며, 치료용 RNA의 경구 전달이 심근 섬유증을 유의하게 감소시켰음을 나타낸다. 피부에 영향을 미치는 피부경화증의 증상으로 돌아보면, 도 7c 및 도 7d는 피부의 섬유증에 관한 것이다. 도 7c는 대조군 피부를 나타내는 상부 좌측, 비히클 대조군을 나타내는 상부 우측, 스크램블드 RNA를 나타내는 하부 좌측, 경구 전달 TY4 RNA를 나타내는 하부 우측 아래의 피부와 관련된 조직학적 데이터를 나타낸다. 경구 전달 TY4 RNA는 치료용 RNA의 비-제한적 실시예로서 비치료군에 비해 피부의 비대/섬유증이 현저히 감소하였다. 도 7d는 이를 각 군에 대한 피부 두께 그래프로 확인한 것으로, 경구 전달 치료용 RNA는 대조군과 유의하게 다르지 않은 피부 두께를 나타내었다.
다양한 염증성 사이토카인의 발현 수준에 대한 추가적인 조사를 실시하였다. 도 8a 내지 8f는 IL1-B(도 8a), IL-6(도 8b), TGF 베타(도 8c), NLRP3(도 8d), p21(도 8e), IL-4(도 8f)의 정량과 관련된 qPCR 데이터를 나타낸다. 이러한 사이토카인 각각은 경구 전달 치료용 RNA를 투여하였을 때 발현이 적당히 증가한 것과 동등하거나 발현이 적당히 증가한 것으로 나타났다. 따라서 이러한 데이터는 섬유증 및/또는 염증성 질환, 예를 들어 피부경화증의 이차 또는 증상을 감소시키기 위한 치료용 RNA의 경구 전달 효능을 지원한다.
실시예 8
이러한 비-제한적 실시예는 카세인-키토산 복합체로 코팅된 지질 미셀에 캡슐화된 치료용 핵산을 포함하는 경구 제형이 근이영양증 증상을 개선시킴을 보여준다.
경구 전달 치료용 RNA의 효과를 확인하기 위하여, 12월령의 암컷 mdx 마우스에 TY4(0.15 ㎍/g(체중)) 또는 비히클을 8주 동안 매주 2회 공급하였다. 공급 전(즉, 기준선) 및 8주 연구 종료 시점에서 심장 및 골격근 기능을 측정하였다. 심장 및 전방 경골근(TA) 근육을 절제하고 간질 섬유증을 정량하기 위해 마손의 삼색 염색(Masson's trichrome staining)을 위해 가공하였다.
도 9a에 나타낸 바와 같이, 경흉 심초음파를 경감각 mdx 마우스에 대해 수행하여 좌심실 박출률(EF)을 측정하였다. 기준선에서는 군 간에 차이가 검출되지 않았다. 8주 후, 경구 투여된 치료용 RNA인 TY4를 투여받은 mdx는 비히클 대조군에 비해 EF가 더 높았으며, 이는 연구 기간 동안 감소하였다. 도 9b에 나타낸 바와 같이, 마손의 삼색 현미경 사진과 풀 데이터(우측 서브 패널)는 경구 투여된 TY4를 투여받은 mdx 마우스가 비히클 대조군 마우스보다 심근 섬유증이 적음을 보여준다. 경골 전방(TA)이 이 근육 그룹에 대한 토크 출력의 ~85%를 생성하는 전방 흉막 근육의 생체 내 근육 기능으로 전환하는 것은 mdx 마우스의 발을 알루미늄 신발(힘 변환기의 서보모터에 부착됨)에 부착하고 좌측 공통 총 비골신경(left common peroneal nerve)을 자극하여 기록하였다. 테타니 토크는 200 Hz로 기록하였다. 기준선에서는 군 간 차이가 검출되지 않았다(도 9c 참조). 8주 후, 경구 투여된 TY4를 투여받은 mdx 마우스는 비히클 대조군 마우스보다 토크가 더 많았다. 도 9d는 근육 섬유증에 관한 것으로, 마손의 삼색 현미경 사진과 풀 데이터(우측 서브 패널)를 보여준다. 이러한 데이터는 경구 투여된 TY4를 투여받은 mdx 마우스가 비히클 대조군 마우스보다 근육 섬유증이 적음을 나타낸다. 도 9e는 근섬유 수(mm2 당)가 더 많음을 보여주는 수집된 생리학적 데이터를 요약한 것이다.
수집된 기능 데이터는 치료용 RNA를 캡슐화한 지질 미셀을 이용하여 전달하고 카세인-키토산 복합체로 코팅하여 경구 투여한 치료용 RNA의 효능을 더욱 뒷받침한다. 도 9e는 치료용 RNA를 캡슐화한 지질 미셀을 이용하여 경구 투여한 치료용 RNA의 감소된 간질성 섬유증(도 9c/도 9d) 이외에도 TA에서 근섬유의 수를 증가시켰음을 보여준다. 이러한 생리학적 효과는 치료용 RNA를 캡슐화한 지질 미셀을 이용하여 전달함으로써 치료용 RNA의 경구 투여를 받은 운동 능력, 심장 기능 및 근육 기능을 각각 향상시킴을 보여주는 기능적 분석에서 확인되었다(도 9f-9h). 군 간 통계적 유의성을 결정하기 위해 2원 ANOVA 또는 독립 t-시험을 사용하였다. *P<0.05, **P<0.01. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다.
이들 데이터는 치료용 RNA를 캡슐화한 지질 미셀을 이용하여 전달하고 카세인-키토산 복합체로 코팅하여 경구 투여한 치료용 RNA의 효능을 더욱 뒷받침한다. 몇몇 구현예에서, 경구 투여된 치료용 RNA를 전달하는 조성물은 RNA의 생체이용성을 증가시키고, 이는 다시 염증 및/또는 섬유증에 의해 특징지어지는 질환, 예를 들어 근이영양증에 대한 개선된 치료 결과를 초래한다.
위에서는 본 발명을 설명하기 위한 예시 및 실시예를 통해 일부 상세히 설명하였으나, 본 발명의 사상을 벗어나지 않는 범위에서 여러 변형이 가능함은 물론이다. 따라서, 본원에 개시된 형태는 단지 예시적인 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니라, 본 발명의 구현예의 진정한 범위 및 정신으로부터 벗어나는 모든 변경 및 대안을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
전술한 구현예의 구체적인 특징 및 측면의 다양한 조합 또는 하위 조합이 가능한 것으로 고려된다. 또한, 본원의 어느 특정한 특징, 측면, 방법, 특성, 특징부, 품질, 속성, 요소 등의 개시내용은 본원에 기재된 다른 모든 구현예에서 사용될 수 있다. 따라서, 개시된 구현예의 다양한 특징 및 측면는 개시된 주제의 다양한 모드를 형성하기 위해 서로 조합 또는 치환될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명의 범위는 전술한 특정 개시된 구현예에 의해 제한되어서는 안 된다. 또한, 개시된 주제는 다양한 변형 및 대안적인 형태가 가능하지만, 그 구체적인 예는 도면에 도시되어 있으며, 본원에 상세하게 설명되어 있다. 그러나, 본 발명은 개시된 특정한 형태 또는 방법으로 제한되지 않으며, 설명된 다양한 구현예 및 첨부된 청구항의 정신 및 범위 내에 속하는 모든 변형, 균등물 및 대안을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 개시된 어떠한 방법도 인용된 순서대로 수행될 필요는 없다. 본원에 개시된 방법은 전문가에 의해 취해진 소정의 조치를 포함지만, 그들은 명시적으로 또는 함축적으로 그러한 행위의 제 3 자 지침을 포함할 수도 있다. 예를 들어 "심장 병태 또는 그 증상을 치료할 필요가 있는 대상체에게 치료적 유효량의 핵산을 투여하는 것"과 같은 행위는 "유효량의 핵산을 대상체에게 투여하는 것을 지시하는 것"을 포함한다. 또한, 본 발명의 특징 또는 측면이 마쿠쉬 군의 측면에서 설명되는 경우, 당업자는 마쿠쉬 군의 임의의 개별 구성원 또는 구성원의 하위 군의 측면에서도 본 발명이 설명된다는 것을 인식할 것이다.
본원에 개시된 범위는 또한 임의의 및 모든 중복, 하위 범위 및 이들의 조합을 포괄한다. "까지", "적어도", "초과", "미만", "사이" 등과 같은 어구는 인용된 숫자를 포함한다. "약" 또는 "대략"과 같은 용어에 선행하는 숫자는 인용된 숫자를 포함한다. 예를 들어 "약 90%"는 "90%"를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 95% 동일한 것은 참조 서열에 대해 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 동일한 것을 포함한다. 또한, 서열이 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 "포함하는" 것으로 개시될 때, 그러한 언급은 달리 나타내지 않는 한, 서열이 인용된 서열을 "포함한다", "구성된다" 또는 "본질적으로 구성된다"도 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 및 어구, 특히 첨부된 청구항에서의 그 변형은 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 제한적인 것과 반대되는 개방형으로서 해석되어야 한다. 전술한 예로써, "포함하는(including)"이라는 용어는 "포함하지만 그로써 제한되지 않는" 등을 의미하는 것으로 읽혀져야 한다.
본원에서 전반에 걸쳐 인용된 참고문헌, 허여된 특허, 공개된 특허출원, 및 동시 계류중인 특허출원을 포함하는 모든 특허 및 기타 간행물은, 예를 들어 본원에 기재된 기술과 관련하여 사용될 수 있는 그러한 간행물에 기술된 방법론을 기술하고 개시하기 위한 목적으로 본원에 명백히 참조로 포함된다. 이들 간행물은 본원의 출원일 이전에 그들의 개시를 위해서만 제공된다. 이와 관련하여 어떠한 것도 본 발명자들이 종래 발명에 의한 이러한 개시를 선행하거나 어떤 다른 이유로 선행할 자격이 없다고 인정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 이들 문서의 내용에 관한 날짜 또는 표현에 관한 모든 진술은 출원인이 이용할 수 있는 정보를 기반으로 하며, 이들 문서의 날짜나 내용의 정확성에 관한 어떠한 인정도 구성하지 않는다.
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Artificial Sequence <220> <223> Golodirsen <400> 20 gttgcctccg gttctgaagg tgttc 25 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Givosiran <400> 21 cagaaagagu gucucaucuu a 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Viltolarsen <400> 22 cctccggttc tgaaggtgtt c 21 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Volanesorsen <400> 23 agcttcttgt ccagctttat 20 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Inclisiran <400> 24 cuagaccugu tuugcuuuug u 21 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lumasiran <400> 25 gacuuucauc cuggaaauau a 21 <210> 26 <211> 214 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 26 Met Lys Leu Leu Ile Leu Thr Cys Leu Val Ala Val Ala Leu Ala Arg 1 5 10 15 Pro Lys His Pro Ile Lys His Gln Gly Leu Pro Gln Glu Val Leu Asn 20 25 30 Glu Asn Leu Leu Arg Phe Phe Val Ala Pro Phe Pro Glu Val Phe Gly 35 40 45 Lys Glu Lys Val Asn Glu Leu Ser Lys Asp Ile Gly Ser Glu Ser Thr 50 55 60 Glu Asp Gln Ala Met Glu Asp Ile Lys Gln Met Glu Ala Glu Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ser Ser Glu Glu Ile Val Pro Asn Ser Val Glu Gln Lys His Ile 85 90 95 Gln Lys Asp Asp Val Pro Ser Glu Arg Tyr Leu Gly Tyr Leu Glu Gln 100 105 110 Leu Leu Arg Leu Lys Lys Tyr Lys Val Pro Gln Leu Glu Ile Val Pro 115 120 125 Asn Ser Ala Glu Glu Arg Leu His Ser Met Lys Glu Gly Ile His Ala 130 135 140 Gln Gln Lys Glu Pro Met Ile Gly Val Asn Gln Glu Leu Ala Tyr Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Glu Leu Phe Arg Gln Phe Tyr Gln Leu Asp Ala Tyr Pro Ser 165 170 175 Gly Ala Trp Tyr Tyr Val Pro Leu Gly Thr Gln Tyr Thr Asp Ala Pro 180 185 190 Ser Phe Ser Asp Ile Pro Asn Pro Ile Gly Ser Glu Asn Ser Gly Lys 195 200 205 Thr Thr Met Pro Leu Trp 210 <210> 27 <211> 222 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 27 Met Lys Phe Phe Ile Phe Thr Cys Leu Leu Ala Val Ala Leu Ala Lys 1 5 10 15 Asn Thr Met Glu His Val Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ile Ile Ser Gln 20 25 30 Glu Thr Tyr Lys Gln Glu Lys Asn Met Ala Ile Asn Pro Ser Lys Glu 35 40 45 Asn Leu Cys Ser 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Ser Pro Glu Val Ile Glu Ser 165 170 175 Pro Pro Glu Ile Asn Thr Val Gln Val Thr Ser Thr Ala Val 180 185 190 <210> 31 <211> 26 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 31 ccccccacug cuaaauuuga cugguu 26 <210> 32 <211> 26 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 32 ccccccacug cuaaauuuga cuggua 26

Claims (89)

  1. 핵산의 경구 전달용 제형으로서,
    핵산;
    양이온성 지질;
    적어도 하나의 카세인 단백질; 및
    키토산;
    을 포함하는, 제형.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 핵산은 리보핵산(RNA)을 포함하고 상기 RNA는 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.0001 내지 약 0.01% 범위의 양으로 존재하며;
    상기 적어도 하나의 카세인 단백질은 적어도 α-s1 카세인 서브유닛을 포함하고 상기 적어도 하나의 카세인 단백질은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.5 내지 약 5% 범위의 양으로 존재하고;
    상기 키토산은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.001 내지 약 1% 범위의 양으로 존재하는, 제형.
  3. 제 2 항에 있어서,
    아세트산을 더 포함하되, 상기 아세트산은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.01 내지 약 1% 범위의 양으로 존재하는, 제형.
  4. 제 2 항에 있어서,
    상기 양이온성 지질은 핵산의 각 마이크로그램에 대해 약 0.1 내지 약 5 마이크로리터 범위의 양으로 존재하는, 제형.
  5. 제 2 항에 있어서,
    상기 핵산은 비-암호화 RNA를 포함하는, 제형.
  6. 제 2 항에 있어서,
    산을 더 포함하는, 제형.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 산은 부피 기준으로 상기 제형의 약 0.001 내지 약 1% 범위의 양으로 존재하고 여기서 상기 산은 아세트산, 시트르산, 인산 및 시트르산으로부터 선택되는, 제형.
  8. 제 2 항에 있어서,
    상기 키토산은 저분자량 키토산인, 제형.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 저분자량 키토산은 약 50 내지 약 190 킬로달톤(kiloDaltons)의 질량 범위인, 제형.
  10. 제 2 항에 있어서,
    상기 핵산은 비-암호화 RNA를 포함하되, 상기 비-암호화 RNA는 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.001 내지 약 0.005% 범위의 양으로 존재하고;
    상기 적어도 하나의 카세인 단백질은 α-s1 카세인 서브유닛(subunit), α-s2 카세인 서브유닛, β 카세인 서브유닛, 및 κ 카세인 서브유닛의 혼합물을 포함하되, 상기 카세인 서브유닛은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 1 내지 3% 범위의 양으로 존재하며;
    상기 키토산은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.01 내지 0.1% 범위의 양으로 존재하는, 제형.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 부피 기준으로 상기 제형의 약 0.0015 내지 약 0.004% 범위의 양으로 존재하고;
    상기 카세인 서브유닛의 혼합물은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 2 내지 3% 범위의 양으로 존재하며;
    상기 키토산은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.05 내지 0.1% 범위의 양으로 존재하고;
    상기 양이온성 지질은 핵산의 각 마이크로그램에 대해 약 1 내지 약 3 마이크로리터 범위의 양으로 존재하는, 제형.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 부피 기준으로 상기 제형의 약 0.0015 내지 약 0.0035% 범위의 양으로 존재하고;
    상기 카세인 서브유닛의 혼합물은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 2.2 내지 2.8% 범위의 양으로 존재하며;
    상기 키토산은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.06 내지 0.09% 범위의 양으로 존재하고;
    상기 양이온성 지질은 핵산의 각 마이크로그램에 대해 약 1 내지 약 2 마이크로리터 범위의 양으로 존재하는, 제형.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 대상체에게 투여시 IL1-B, IL-6, TGF 베타, NLRP3, p21, 및 IL-4 중의 하나 이상의 발현을 감소시키는 것인, 제형.
  14. 제 12 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 대상체에게 투여시 상기 대상체의 수축기 혈압(systolic blood pressure)을 감소시키는 것인, 제형.
  15. 제 2 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 대상체에게 투여시 상기 대상체의 확장기 혈압(diastolic blood pressure)을 감소시키는 것인, 제형.
  16. 제 12 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 대상체에게 투여시 상기 대상체의 적어도 하나의 근육의 근지구력(muscular endurance), 피로에 대한 근육 저항성, 근육 강도 및/또는 근육 수축성(muscle contractility)을 향상시키는 것인, 제형.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 근육은 골격근 또는 심근인, 제형.
  18. 제 12 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 대상체에게 투여시 뇌성 나트륨이뇨 펩티드(brain natriuretic peptide)의 발현을 감소시키는 것인, 제형.
  19. 제 12 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 대상체에게 투여시 승모판 환상 조직 속도(mitral annular tissue velocity)에 대한 확장기 승모판 유입 속도(diastolic mitral inflow velocity)(E/e')를 감소시키는 것인, 제형.
  20. 제 12 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 대상체에게 투여시 상기 대상체 내의 글루코스 내성(glucose tolerance)을 향상시키는 것인, 제형.
  21. 제 12 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 대상체에게 투여시 상기 대상체의 단위 체질량당 비만 및/또는 피하 지방 조직을 감소시키는 것인, 제형.
  22. 제 12 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 심근경색을 갖는 대상체에게 투여시 심근경색 후 경색 크기(infarct size)를 감소시키는 것인, 제형.
  23. 제 12 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 심근경색을 갖는 대상체에게 투여시 심근경색 후 순환성 심장 트로포닌 I 농도(circulating cardiac troponin I concentration)를 감소시키는 것인, 제형.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 제형은 증가된 염증 및/또는 섬유증과 관련된 질환의 하나 이상의 증상을 완화시키는 것인, 제형.
  25. 제 24 항에 있어서,
    상기 질환은 보존된 박출률(preserved ejection fraction)을 갖는 심부전, 심근경색, 근이영양증, 피부경화증, 바이러스 감염 및 비대 심근병증으로부터 선택되는, 제형.
  26. 제 1 항 내지 제 25 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산은 서열번호 1-25, 31, 32 중의 하나 이상에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 제형.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산은 서열번호 1-25, 31, 32 중의 하나 이상에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열로 필수적으로 구성되는, 제형.
  28. 핵산의 경구 전달용 제형으로서,
    인공 지질 미셀(artificial lipid micelle),
    핵산, 상기 핵산은 상기 인공 지질 미셀 내에 캡슐화됨, 및
    상기 인공 지질 미셀 상의 코팅, 상기 코팅은 카세인 단백질과 키토산 중합체의 혼합물을 포함함,
    을 포함하는, 제형.
  29. 제 28 항에 있어서,
    상기 핵산은 리보핵산(RNA)을 포함하고 상기 RNA는 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.0001 내지 0.01%의 범위의 양으로 존재하고;
    상기 카세인 단백질과 키토산 중합체의 혼합물은 적어도 α-s1 카세인 서브유닛을 포함하고 상기 적어도 하나의 카세인 단백질은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.5 내지 5%의 범위의 양으로 존재하며;
    상기 키토산은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.001 내지 1%의 범위의 양으로 존재하는, 제형.
  30. 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서,
    아세트산을 더 포함하되, 상기 아세트산은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.01 내지 1% 범위의 양으로 존재하는, 제형.
  31. 제 28 항 내지 제 30 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 양이온성 지질은 핵산의 각 마이크로그램에 대해 약 0.1 내지 약 5 마이크로리터 범위의 양으로 존재하는, 제형.
  32. 제 28 항 내지 제 31 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산은 비-암호화 RNA를 포함하는, 제형.
  33. 제 28 항, 제 29 항, 제 31 항 및 제 32 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    산을 더 포함하는, 제형.
  34. 제 33 항에 있어서,
    상기 산은 부피 기준으로 상기 제형의 약 0.001 내지 1% 범위의 양으로 존재하고 상기 산은 아세트산, 시트르산, 인산 및 시트르산으로부터 선택되는, 제형.
  35. 제 28 항 내지 제 34 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 키토산은 저분자량 키토산인, 제형.
  36. 제 35 항에 있어서,
    상기 저분자량 키토산은 약 50 내지 약 190 킬로달톤의 질량 범위인, 제형.
  37. 제 29 항에 있어서,
    상기 핵산은 비-암호화 RNA를 포함하되, 상기 비-암호화 RNA는 부피 기준으로 상기 제형의 약 0.001 내지 약 0.005% 범위의 양으로 존재하고;
    상기 적어도 하나의 카세인 단백질은 α-s1 카세인 서브유닛, α-s2 카세인 서브유닛, β 카세인 서브유닛, 및 κ 카세인 서브유닛의 혼합물을 포함하되, 상기 카세인 서브유닛은 부피 기준으로 상기 제형의 약 1 내지 3% 범위의 양으로 존재하며;
    상기 키토산은 핵산의 각 마이크로그램에 대해 약 1 내지 약 3 마이크로리터 범위의 양으로 존재하는, 제형.
  38. 제 37 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 부피 기준으로 상기 제형의 약 0.0015 내지 약 0.005%의 범위의 양으로 존재하고,
    상기 카세인 서브유닛의 혼합물은 부피 기준으로 상기 제형의 약 2 내지 3%의 범위의 양으로 존재하며;
    상기 키토산은 부피 기준으로 상기 제형의 약 0.05 내지 0.1%의 범위의 양으로 존재하고;
    상기 양이온성 지질은 핵산의 각 마이크로그램에 대해 약 1 내지 약 2 마이크로리터의 범위의 양으로 존재하는, 제형.
  39. 제 37 항 또는 제 38 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 부피 기준으로 상기 제형의 약 0.0015 내지 약 0.0035% 범위의 양으로 존재하고,
    상기 카세인 서브유닛의 혼합물은 부피 기준으로 상기 제형의 약 2.2 내지 2.8% 범위의 양으로 존재하며;
    상기 키토산은 부피 기준으로 상기 제형의 약 0.06 내지 0.09% 범위의 양으로 존재하고;
    상기 양이온성 지질은 상기 제형의 밀리리터 당 약 15 내지 약 25 ng 범위의 양으로 존재하는, 제형.
  40. 제 28 항 내지 제 39 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 대상체에게 투여시 IL1-B, IL-6, TGF 베타, NLRP3, p21, 및 IL-4 중의 하나 이상의 발현을 감소시키는 것인, 제형.
  41. 제 28 항 내지 제 40 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 대상체에게 투여시 상기 대상체의 수축기 혈압을 감소시키는 것인, 제형.
  42. 제 28 항 내지 제 41 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 대상체에게 투여시 상기 대상체의 확장기 혈압을 감소시키는 것인, 제형.
  43. 제 28 항 내지 제 42 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 대상체에게 투여시 상기 대상체의 적어도 하나의 근육의 근지구력, 피로에 대한 근육 저항성, 근육 강도 및/또는 근육 수축성을 향상시키는 것인, 제형.
  44. 제 43 항에 있어서,
    상기 근육은 골격근 또는 심근인, 제형.
  45. 제 28 항 내지 제 44 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 대상체에게 투여시 뇌성 나트륨이뇨 펩티드의 발현을 감소시키는 것인, 제형.
  46. 제 28 항 내지 제 45 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 대상체에게 투여시 승모판 환상 조직 속도에 대한 확장기 승모판 유입 속도(E/e')를 감소시키는 것인, 제형.
  47. 제 28 항 내지 제 46 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 대상체에게 투여시 상기 대상체 내의 글루코스 내성을 향상시키는 것인, 제형.
  48. 제 28 항 내지 제 47 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 대상체에게 투여시 상기 대상체의 단위 체질량당 비만 및/또는 피하 지방 조직을 감소시키는 것인, 제형.
  49. 제 28 항 내지 제 48 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 심근경색을 갖는 대상체에게 투여시 심근경색 후 경색 크기를 감소시키는 것인, 제형.
  50. 제 28 항 내지 제 48 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 심근경색을 갖는 대상체에게 투여시 심근경색 후 순환하는 심장 트로포닌 I 농도를 감소시키는 것인, 제형.
  51. 제 28 항 내지 제 50 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 제형은 증가된 염증 및/또는 섬유증과 관련된 질환의 하나 이상의 증상을 완화시키는 것인, 제형.
  52. 제 51 항에 있어서,
    상기 질환은 보존된 박출률을 갖는 심부전, 심근경색, 근이영양증, 피부경화증, 바이러스 감염 및 비대성 심근증으로부터 선택되는, 제형.
  53. 제 28 항 내지 제 52 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산은 서열번호 1-25, 31, 32 중의 하나 이상에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 제형.
  54. 제 1 항 내지 제 25 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산은 서열번호 1-25, 31, 32 중의 하나 이상에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열로 필수적으로 구성되는, 제형.
  55. 염증 및/또는 섬유증과 관련된 질환을 치료하는 방법으로서,
    염증 및/또는 섬유증을 나타내는 질환을 갖는 대상체에게 제 1 항 내지 제 54 항 중의 어느 한 항에 따른 제형을 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  56. 제 1 항 내지 제 54 항 중의 어느 한 항에 따른 제형의 용도로서,
    염증 및/또는 섬유증과 관련된 질환의 치료를 위한, 용도.
  57. 제 1 항 내지 제 54 항 중의 어느 한 항에 따른 제형의 용도로서,
    염증 및/또는 섬유증과 관련된 질환의 치료용 의약(medicament)의 제조를 위한, 용도.
  58. 제 55 항 또는 제 56 항에 있어서,
    상기 질환은 보존된 박출률을 갖는 심부전, 심근경색, 근이영양증, 피부경화증, 바이러스 감염 및/또는 비대성 심근증을 포함하는, 용도.
  59. 핵산의 경구 전달용 제형을 제조하는 방법으로서,
    핵산을 양이온성 지질을 포함하는 용액과 접촉시켜서 상기 핵산을 인공 지질 미셀(artificial lipid micelle)에 캡슐화함으로써, 상기 핵산을 포함하는 인공 지질 미셀을 생성하는 단계;
    상기 핵산을 포함하는 인공 지질 미셀을 2 내지 10%의 카세인 단백질을 포함하는 용액과 접촉시켜서 상기 핵산을 포함하는 인공 지질 미셀을 카세인 단백질로 코팅함으로써, 상기 핵산을 포함하는 카세인 코팅된 인공 지질 미셀을 생성하는 단계; 및
    상기 핵산을 포함하는 카세인 코팅된 인공 지질 미셀을 산과 키토산 중합체의 혼합물에 노출시키는 단계, 상기 산과 키토산 중합체의 혼합물은 상기 카세인 단백질과 상기 키토산의 인터칼레이션(intercalation) 및 상기 핵산을 포함하는 카세인-키토산 코팅된 지질 미셀의 침전(precipitation)을 허용하는 것임;
    을 포함하는, 방법.
  60. 제 59 항에 있어서,
    상기 핵산은 상기 양이온성 지질과 약 10 내지 30 ng의 핵산 대 1 μL의 지질 용액의 비율로 접촉되는 것인, 방법.
  61. 제 60 항에 있어서,
    상기 핵산 및 양이온성 지질 용액에 액체 배지를 약 100 μL의 최종 부피로 첨가하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  62. 제 59 항에 있어서,
    상기 카세인 단백질은 5% 소 카세인 용액(bovine casein solution) 내에 존재하며, 상기 핵산을 포함하는 인공 지질 미셀에 1:10의 부피비로 첨가되는, 방법.
  63. 제 59 항에 있어서,
    상기 산과 키토산 중합체의 혼합물은 약 0.05 내지 2%의 아세트산 용액 및 약 0.1% 내지 2%의 키토산 용액을 포함하는, 방법.
  64. 염증 및/또는 섬유증과 관련된 질환을 치료하거나 또는 완화시키는(ameliorating) 방법으로서,
    핵산;
    양이온성 지질;
    적어도 하나의 카세인 단백질; 및
    키토산;
    을 포함하는, 경구 제형을, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  65. 제 64 항에 있어서,
    상기 핵산은 리보핵산(RNA)을 포함하고 상기 RNA는 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.0001 내지 0.01% 범위의 양으로 존재하며;
    상기 적어도 하나의 카세인 단백질은 적어도 α-s1 카세인 서브유닛을 포함하고 상기 적어도 하나의 카세인 단백질은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.5 내지 5% 범위의 양으로 존재하고;
    상기 키토산은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.001 내지 1% 범위의 양으로 존재하는, 방법.
  66. 제 65 항에 있어서,
    상기 제형은 아세트산을 더 포함하되, 상기 아세트산은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.01 내지 1% 범위의 양으로 존재하는, 방법.
  67. 제 64 항 내지 제 66 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 양이온성 지질은 핵산의 각 마이크로그램에 대해 약 0.1 내지 약 5 마이크로리터 범위의 양으로 존재하는, 방법.
  68. 제 64 항 내지 제 67 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산은 비-암호화 RNA를 포함하는, 방법.
  69. 제 64 항 내지 제 68 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 제형은 산을 더 포함하는, 방법.
  70. 제 69 항에 있어서,
    상기 산은 부피 기준으로 상기 제형의 약 0.001 내지 1% 범위의 양으로 존재하고 여기서 상기 산은 아세트산, 시트르산, 인산 및 시트르산에서 선택되는, 방법.
  71. 제 64 항 내지 제 70 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 키토산은 저분자량 키토산인, 방법.
  72. 제 71 항에 있어서,
    상기 저분자량 키토산은 약 50 내지 약 190 킬로달톤의 질량 범위인, 방법.
  73. 제 64 항 내지 제 72 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산은 비-암호화 RNA를 포함하되, 상기 비-암호화 RNA는 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.001 내지 약 0.005% 범위의 양으로 존재하고,
    상기 적어도 하나의 카세인 단백질은 α-s1 카세인 서브유닛, α-s2 카세인 서브유닛, β 카세인 서브유닛 및 κ 카세인 서브유닛의 혼합물을 포함하되, 상기 카세인 서브유닛은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 1 내지 3% 범위의 양으로 존재하며;
    상기 키토산은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.01 내지 0.1% 범위의 양으로 존재하는, 방법.
  74. 제 73 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.002 내지 약 0.005% 범위의 양으로 존재하고,
    상기 카세인 서브유닛의 혼합물은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 2 내지 3% 범위의 양으로 존재하며;
    상기 키토산은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.05 내지 약 0.1% 범위의 양으로 존재하고;
    상기 양이온성 지질은 핵산의 각 마이크로그램에 대해 약 1 내지 약 3 마이크로리터 범위의 양으로 존재하는, 방법.
  75. 제 74 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.0025 내지 약 0.004% 범위의 양으로 존재하고,
    상기 카세인 서브유닛의 혼합물은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 2.2 내지 2.8% 범위의 양으로 존재하며;
    상기 키토산은 부피당 중량 기준으로 상기 제형의 약 0.06 내지 0.09% 범위의 양으로 존재하고;
    상기 양이온성 지질은 핵산의 각 마이크로그램에 대해 약 1 내지 약 2 마이크로리터 범위의 양으로 존재하는, 방법.
  76. 제 75 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 대상체에게 투여시 IL1-B, IL-6, TGF 베타, NLRP3, p21 및 IL-4 중의 하나 이상의 발현을 감소시키는 것인, 방법.
  77. 제 75 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 대상체에게 투여시 상기 대상체의 수축기 혈압을 감소시키는 것인, 방법.
  78. 제 75 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 대상체에게 투여시 상기 대상체의 확장기 혈압을 감소시키는 것인, 방법.
  79. 제 75 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 대상체에게 투여시 상기 대상체의 적어도 하나의 근육의 근지구력, 피로에 대한 근육 저항성, 근육 강도 및/또는 근육 수축성을 향상시키는 것인, 방법.
  80. 제 79 항에 있어서,
    상기 근육은 골격근 또는 심근인, 방법.
  81. 제 75 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 대상체에게 투여시 뇌성 나트륨이뇨 펩티드의 발현을 감소시키는 것인, 방법.
  82. 제 75 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 대상체에게 투여시 승모판 환상 조직 속도에 대한 확장기 승모판 유입 속도(E/e')를 감소시키는 것인, 방법.
  83. 제 75 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 대상체에게 투여시 상기 대상체 내의 글루코스 내성을 향상시키는 것인, 방법.
  84. 제 75 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 대상체에게 투여시 상기 대상체의 단위 체질량당 비만 및/또는 피하 지방 조직을 감소시키는 것인, 방법.
  85. 제 75 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 심근경색을 갖는 대상체에게 투여시 심근경색 후 경색 크기를 감소시키는 것인, 방법.
  86. 제 75 항에 있어서,
    상기 비-암호화 RNA는 심근경색을 갖는 대상체에게 투여시 심근경색 후 순환성 심장 트로포닌 I 농도를 감소시키는 것인, 방법.
  87. 제 64 항 내지 제 86 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 질환은 보존된 박출률을 갖는 심부전, 심근경색, 근이영양증, 피부경화증, 바이러스 감염 및 비대성 심근증으로부터 선택되는, 방법.
  88. 제 64 항 내지 제 87 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산은 서열번호 1-25, 31, 32 중의 하나 이상에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 방법.
  89. 제 64 항 내지 제 88 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산은 서열번호 1-25, 31, 32 중의 하나 이상에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열로 필수적으로 구성되는, 방법.
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