KR20240026135A - 단리된 췌도를 저장하기 위한 배지 및 단리된 췌도를 저장하기 위한 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 단리된 췌도를 저장하기 위한 배지 및 단리된 췌도를 저장하는 방법에 관한 것이다. 이러한 배지는 생리학적 온도 및 냉장 저장 모두에서 췌도를 저장하는 데 적합하다.
Description
본 발명은 단리된 췌도를 저장하기 위한 보충(supplemented) 배지 및 단리된 췌도를 저장하는 방법에 관한 것이다. 이러한 배지는 생리학적 온도 및 냉장(refrigerated) 저장 모두에서 췌도를 저장하는 데 적합한다.
단리된 세포, 조직 및 기관을 저장하기 위한 수많은 배지가 당업계에 알려져 있다. 이러한 배지에는 세포외 기질(ECM), 단백질 첨가물 등과 같은 다양한 성분이 포함되어 있다.
문헌 KR1020170011676A는 탈세포화된 생물학적 조직(ECM)으로부터 유래된 농축물을 사용하여 줄기세포를 간세포로 분화시키는 방법을 개시하고 있으며, 여기서 ECM은 포유동물의 간, 심장, 신장, 위, 소장, 결장, 비장, 방광, 폐 또는 피부로부터 유래될 수 있다. 저자는 ECM이 생체내 세포-특이적 미세 환경을 모방하며, 특정 조직으로부터 천연 세포외 기질을 획득하고 사용하는 것이 최적의 성장 환경을 제공할 수 있다고 지적한다. 이들은 또한 콜라겐, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌 또는 마트리겔의 단일 단백질 조합을 사용하면, 그러한 결과를 달성할 수 없을 것이라고 지적한다. 실시예에서, 간-유래 ECM(LECM)은 2, 5, 10 및 20%로 배지에 첨가되었다.
문헌 WO2019185017A는 L-글루타민 및 pH 조절제가 보충된 기본 배지를 기반으로 간세포 및 오가노이드를 배양하기 위한 배지에 관한 것이다. 이들의 생존율을 향상시키기 위해, 간세포를 ECM과 접촉시키는데, 여기서 ECM은 천연 또는 상업적 기원일 수 있다(예를 들어, Matrixgel TM, BD Biosciences).
문헌 BR112013002249 A2는 표피 성장 인자(EGF), Wnt 작용제, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 및 니코틴아미드가 보충된 기본 배지에서 ECM(Matrigel)과 접촉하는 간 단편으로부터 유래된 줄기 세포를 배양하는 것에 관한 것이다.
또 다른 문헌 US20080241919A1은 ECM을 함유하는 배지를 포함하는 세포 배양용 용기를 포함하는 배아 줄기 세포 배양 시스템을 기재하고 있으며, 여기서 ECM은 라미닌, 피브로넥틴, 콜라겐 및 젤라틴을 함유할 수 있다. ECM 성분은 솔루션에 존재할 수도 있다. 이러한 배지에는 bFGF, 인슐린 및 아스코르브산도 포함되어 있다.
문헌 E1S20030026788A1은 배양된 세포의 고유한 특성을 보존하기 위해 조직 기증자로부터 수득한(harvested) ECM을 포함하는, 세포외 기질(ECM) 조각(pieces)의 사용을 기재한다.
문헌 AU2002314621 A1은 라미닌 및/또는 유형 IV 콜라겐일 수 있는 ECM 성분을 함유하는 배지에서 혈관 조직을 갖는 기관으로부터 단리된 세포 클러스터(랑게르한스 섬)를 배양하는 방법에 관한 것이다.
문헌 US5985539A는 ECM 성분(콜라겐, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌, 프로테오글리칸 또는 글리코사미노글리칸)을 포함하는 세포 배양 배지 용액을 혈관계를 통해 기관에 관류시키는 것을 포함하는 동물 기관을 재구성하는 방법에 관한 것이다. 예로는 0.25% 유형 I 콜라겐을 사용하는 것을 포함한다.
문헌 EP0703978A1은 세포, 특히 조혈 및 골수 간질 세포의 단기 및 장기 증식 및 성장을 위한 무혈청 또는 혈청-고갈(serum-depleted) 배지를 기재하고 있다. 배지는 Iscove의 수정된 둘베코(Modified Dulbecco) 배지와 같은 표준 배양 배지를 기반으로 한다. 콜라겐(바람직하게는 유형 I 및 IV), 피브로넥틴 및 라미닌과 같은 세포외 기질의 성분은 표면의 세포 접착에 사용된다.
문헌 US20080248570A1은 다른 세포외 기질 성분(예를 들어, 콜라겐 I, III 및 IV, 기본 접착 분자, 프로테오글리칸 또는 글리코사미노글리칸)이 있거나 없거나 호르몬 및/또는 성장 인자가 있거나 없는 히알루로네이트 위 또는 히알루로네이트 내에서 생체외 간 전구체를 포함하는 간 세포를 증식시키는 방법을 개시한다. ECM을 함유한 조성물도 개시되었다. 실시예에서는 1% 히알루론산 겔의 사용을 개시한다.
문헌 US20110150823A1는 콜라겐과 히알루로네이트를 0.01-100:1의 중량비로 함유한 겔, 및 줄기세포 배양을 위한 겔의 용도를 개시한다. 실시예에서, 세포는 20% 소태아혈청 및 200 U/mL 겐타마이신이 105-107 세포/mL의 농도로 보충된 저당 둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(Gibco BRL, Life Technologies)에서 재현탁되고, 히알루로네이트의 다양한 양과 혼합되어, 현탁액을 형성한다. 돼지 진피로부터 콜라겐을 얻고 0.01 N HCl에 용해시켜서, pH 4-7의 콜라겐 용액을 생성하였다. 콜라겐 용액을 동일한 부피의 줄기세포를 함유하는 현탁액과 혼합하여, 6 mg/mL 콜라겐과 0.05 mg/mL, 0.2 mg/mL 또는 0.5 mg/mL 히알루로난, 또는 9 mg/mL 콜라겐과 0.2 mg/mL 히알루로난을 함유하는 혼합물을 형성하였다.
문헌 US20070155009A1은 (a) 단리된 간 전구 세포를 제공하는 단계 및 (b) 간으로부터의 세포외 기질 성분 층에서 단리된 간 유래 전구 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 시험관 내에서 간 전구 세포를 증식시키는 방법을 기재하고 있다. 세포외 기질 성분은 유형 III 콜라겐, 유형 IV 콜라겐, 라미닌, 히알루로난 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
문헌 WO2013116446 A1은 콜라겐 또는 콜라겐-라미닌 현탁액에서의 평활근 배양에 관한 것이다.
문헌 CN1816279B는 액체 영양 베이스를 함유한 기관, 생물학적 조직 또는 살아있는 세포를 보존하기 위한 배지에 관한 것으로서, 고분자량 히알루론산 및 염화나트륨을 함유하고, 동물 유래 성분을 함유하지 않는 것을 특징으로 한다. 상기 배지는 80-4000mg/l, 바람직하게는 100-200mg/l, 바람직하게는 100-160mg/l의 고분자량 히알루론산을 함유한다. 상기 배지는 CMRL1066 배지를 기반으로 할 수 있다.
문헌 W02007009981A1은 예를 들어, 히알루론산 50mg/L이 보충된 DMEM/F12 배지를 기반으로 하는 조직 배양 배지를 기재하고 있다.
문헌 CN112608899A은 회전타원체 종양 조직 배양에서의 혈청 배지의 사용에 관한 것이다. 1.3 mg/L 콜라겐을 함유한 F-12 배지 기반의 콜라겐 겔도 배양에 사용되었다.
문헌 JP1993184356A은 무척추 신경 조직을 배양하기 위한 배지 및 방법을 개시하고 있다. 타겟 배지는 (A) L-15 배지, (B) 불활성화 혈청, (C) 글루코스 및 (D) 항생물질을 함유하는 콜라겐 겔로 구성된다. 바람직하게는, 성분 B의 양은 배지에 대해 10-20 중량%이고, 성분 C의 양은 바람직하게는 10-20 mg/mL이다. 배지의 콜라겐 함량은 바람직하게는 0.1-0.3 중량%이다.
문헌 US7550294B2는 CMRL1066에 기초한 배지에서 생체 내에서 세포, 조직 및 기관을 배양하는 방법을 개시하는 반면, 문헌 JP1988146785A는 L-카미틴이 보충된 배지(예를 들어 CMRL1066)에서 동물 세포의 배양을 기재하고 있다.
본 발명의 목적은 분비 특성의 손실 없이, 단리된 췌도를 생리학적 온도 및 냉장 저장을 가능하게 하는 배지를 개발하는 것이다. 이는 세포외 기질(ECM) 또는 이의 단리된 단백질을 적절한 비율로 상업용 배지에 첨가함으로써 달성되었다.
본 발명에 따른 단리된 췌도를 저장하기 위한 배지는 상업용 배지 CMRL 1066 또는 RPMI를 기반으로 하며, 세포외 기질(ECM) 단백질의 첨가물(additive)을 포함한다.
바람직하게는, 상업용 배지 CMRL 1066을 기반으로 한다.
바람직하게는, 상기 ECM 단백질의 첨가물은 배지 1L에 대해 다음의 단백질을 적절한 중량으로 포함하는 배지:
- 배지의 67 내지 100 mg/L, 바람직하게는 배지의 84.3 mg/L 양의 라미닌
- 배지의 5 내지 8 mg/L, 바람직하게는 배지의 6.7 mg/L 양의 히알루론산
- 배지의 32 내지 48 mg/L, 바람직하게는 배지의 40.7 mg/L 양의 콜라겐 I
- 배지의 100 내지 145 mg/L, 바람직하게는 배지의 122.3 mg/L 양의 콜라겐 IV.
바람직하게는, 상기 ECM 단백질의 첨가물은 배지의 부피에 대해 다음의 단백질을 적절한 부피%로 포함하는 배지:
- 라미닌: 배지의 부피 기준 6.74 내지 10.12%, 바람직하게는 8.43%,
- 히알루론산: 배지의 부피 기준 0.10 내지 0.16%, 바람직하게는 0.13%,
- 콜라겐 I: 배지의 부피 기준 3.26 내지 4.88%, 바람직하게는 4.07%; 및
- 콜라겐 IV: 배지의 부피 기준 9.78 내지 14.67%, 바람직하게는 12.23%,
여기서, 1 mg/mL 농도의 라미닌, 5 mg/mL 농도의 히알루론산, 1 mg/mL 농도의 콜라겐 I, 및 1 mg/mL 농도의 콜라겐 IV가 배지에 첨가됨.
바람직하게는, 상기 히알루론산은 고분자량 또는 저분자량의 히알루론산일 수 있다.
바람직하게는, 바람직하게는 동물 기원의 무세제(detergent-free) dECM 용액이 ECM 단백질의 첨가물로서 사용된다.
바람직하게는, 상기 배지는 ECM 단백질 첨가물을 부피 기준으로 1% 내지 2.5%, 바람직하게는 1% 함유한다.
바람직하게는, 상기 배지는 동결 방지제 및/또는 항생제 및/또는 살균제 및/또는 글루코스 및/또는 혈청 및/또는 아미노산을 추가로 포함한다.
바람직하게는, 상기 배지는 바람직하게는 기본 배지의 각 500mL당 5mL 양의 L-글루타민, 바람직하게는 기본 배지의 각 500mL당 5mL 양의 100X 페니실린-스트렙토마이신, 바람직하게는 기본 배지의 500mL당 5mL 양의 암포테리신 B, 바람직하게는 기본 배지의 각 500mL당 280mM 글루코스 용액 10mL와 동등한 양의 글루코스, 및 바람직하게는 기본 배지의 각 500mL당 50mL 양의 FBS를 포함한다.
본 발명에 따른 단리된 췌도를 저장하는 방법은 상기 단리된 췌도가 본 발명에 따른 배지에서, 4 내지 37℃, 바람직하게는 4℃의 온도에서 저장되는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 췌도를 배지에 넣기 전에, 상기 췌도는 처리되거나 미처리된 상태로 유지된다.
바람직하게는, 상기 배지의 성분을 구성하는 dECM 용액 형태의 ECM 단백질의 첨가물은 특허 출원 EP19218191에 따른 방법에 의해 획득된다.
실시예에서 본 발명의 목적은 도면에 도시되어 있다:
도 1 내지 도 3은 4℃ 및 37℃의 온도에서 24시간 동안 췌도 인큐베이션 후 미처리된(untreated) 췌도와 처리된(treated) 췌도의 기능성을 보여주는 그래프이며, 여기서 배지는 1% 및 2.5% 무세제(detergent-free) ECM이 강화된(enriched) CMRL1066 배지를 함유하고, 대조군 샘플을 CMRL1066 배지에서 배양하였다;
도 4 내지 도 6은 4℃ 및 37℃의 온도에서 48시간 동안 췌도 인큐베이션 후 미처리된 췌도와 처리된 췌도의 기능성을 보여주는 그래프이며, 여기서 배지는 1% 및 2.5% 무세제 ECM이 강화된 CMRL1066 배지를 함유하고, 대조군 샘플을 CMRL1066 배지에서 배양하였다;
도 7은 4℃ 및 37℃의 온도에서 72시간 동안 췌도 인큐베이션 후 미처리된 췌도와 처리된 췌도의 기능성을 보여주는 그래프이며, 여기서 배지는 1% 및 2.5% 무세제 ECM이 강화된 CMRL1066 배지를 함유하고, 대조군 샘플을 CMRL1066 배지에서 배양하였다;
도 8은 4℃ 및 37℃의 온도에서 96시간 동안 췌도 인큐베이션 후 미처리된 췌도의 기능성을 보여주는 그래프이며, 여기서 배지는 1% 및 2.5% 무세제 ECM이 강화된 CMRL1066 배지를 함유하였다.
도 9는 4℃의 온도에서 120시간 동안 췌도 인큐베이션 후 미처리된 췌도의 기능성을 보여주는 그래프이며, 여기서 배지는 1% 및 2.5% 무세제 ECM - B2 - ECM 1% - 미처리됨, 4℃, El - 미처리된 대조군, 4℃, E2 - ECM 2.5% 미처리됨, 4℃가 강화된 CMRL1066 배지를 함유하였다;
도 10은 4℃의 온도에서 72시간 동안 췌도 인큐베이션 후 미처리된 췌도의 기능성을 나타내는 그래프이며, 여기서 배지는 상업적 첨가물인 라미닌, 히알루론산, 콜라겐 I 및 IV가 강화된 CMRL1066 배지를 함유하였다.
도면 중 아래쪽 축은 15분마다의 시점(time point)을 나타낸다:
1 - 저혈당 조절점(control point), 2, 3 - 저혈당에서 15분 후 30분에서의 측정, 4 - 고혈당 조절 측정, 5-8 - 고혈당에서 15, 30, 45 및 60분에서의 측정, 9 - 저혈당 조절점, 10 - 13 - 저혈당에서 15, 30, 45 및 60분에서의 측정.
본 발명에 따른 배지는 단리된 췌도를 저장하는데 사용된다. 상기 배지는 생리학적 온도 조건, 즉 37℃ 및 냉장 상태(표준 냉장 저장 온도, 즉 4℃) 모두에서 췌도를 저장하는 데 적합하다.
도 1 내지 도 3은 4℃ 및 37℃의 온도에서 24시간 동안 췌도 인큐베이션 후 미처리된(untreated) 췌도와 처리된(treated) 췌도의 기능성을 보여주는 그래프이며, 여기서 배지는 1% 및 2.5% 무세제(detergent-free) ECM이 강화된(enriched) CMRL1066 배지를 함유하고, 대조군 샘플을 CMRL1066 배지에서 배양하였다;
도 4 내지 도 6은 4℃ 및 37℃의 온도에서 48시간 동안 췌도 인큐베이션 후 미처리된 췌도와 처리된 췌도의 기능성을 보여주는 그래프이며, 여기서 배지는 1% 및 2.5% 무세제 ECM이 강화된 CMRL1066 배지를 함유하고, 대조군 샘플을 CMRL1066 배지에서 배양하였다;
도 7은 4℃ 및 37℃의 온도에서 72시간 동안 췌도 인큐베이션 후 미처리된 췌도와 처리된 췌도의 기능성을 보여주는 그래프이며, 여기서 배지는 1% 및 2.5% 무세제 ECM이 강화된 CMRL1066 배지를 함유하고, 대조군 샘플을 CMRL1066 배지에서 배양하였다;
도 8은 4℃ 및 37℃의 온도에서 96시간 동안 췌도 인큐베이션 후 미처리된 췌도의 기능성을 보여주는 그래프이며, 여기서 배지는 1% 및 2.5% 무세제 ECM이 강화된 CMRL1066 배지를 함유하였다.
도 9는 4℃의 온도에서 120시간 동안 췌도 인큐베이션 후 미처리된 췌도의 기능성을 보여주는 그래프이며, 여기서 배지는 1% 및 2.5% 무세제 ECM - B2 - ECM 1% - 미처리됨, 4℃, El - 미처리된 대조군, 4℃, E2 - ECM 2.5% 미처리됨, 4℃가 강화된 CMRL1066 배지를 함유하였다;
도 10은 4℃의 온도에서 72시간 동안 췌도 인큐베이션 후 미처리된 췌도의 기능성을 나타내는 그래프이며, 여기서 배지는 상업적 첨가물인 라미닌, 히알루론산, 콜라겐 I 및 IV가 강화된 CMRL1066 배지를 함유하였다.
도면 중 아래쪽 축은 15분마다의 시점(time point)을 나타낸다:
1 - 저혈당 조절점(control point), 2, 3 - 저혈당에서 15분 후 30분에서의 측정, 4 - 고혈당 조절 측정, 5-8 - 고혈당에서 15, 30, 45 및 60분에서의 측정, 9 - 저혈당 조절점, 10 - 13 - 저혈당에서 15, 30, 45 및 60분에서의 측정.
본 발명에 따른 배지는 단리된 췌도를 저장하는데 사용된다. 상기 배지는 생리학적 온도 조건, 즉 37℃ 및 냉장 상태(표준 냉장 저장 온도, 즉 4℃) 모두에서 췌도를 저장하는 데 적합하다.
Llacua et al.(콜라겐 유형 VI 상호작용은 당뇨병 치료를 위한 면역분리 마이크로캡슐에서 인간 췌도(islet) 생존을 향상시킨다. ISLETS(2018), vol. 10, no. 2, 60-68)이 제시한 문헌 데이터에 따르면, 췌도를 분리할 때, 췌도를 둘러싸고 내분비 세포를 서로 연결하는 ECM 입자는 콜라게나아제를 첨가한 결과로서 손상된다. 이는 췌도의 성분인 라미닌 및 콜라겐 유형 I, III, IV, V 및 VI 모두에 부정적인 영향을 미치고, 궁극적으로 전체 ECM 구조를 손상시킨다. 외부에서 공급되는 ECM 또는 ECM 성분이 포함된 배지를 보충하면, 생존율이 향상되고 췌도가 그 기능을 유지할 수 있다. 생화학적 조성, 섬유질 구조 및 점탄성 특성을 포함하여 이러한 배지가 제공하는 조건들이 타겟 기관의 조건들과 더 가깝기 때문에, 세포가 성장할 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 세포외 기질(ECM) 단백질은 바람직하게는 동물 기원(예를 들어, 돼지, 소, 양 등으로부터 유래함), 바람직하게는 탈세포화된/무세포(decellularized/cell-free)(dECM) ECM을 정의하며, 바람직하게는 유럽 특허 출원 EP19218191에 기재된 방법, 또는 시판되는 ECM 단백질, 즉 라미닌, 히알루론산, 콜라겐 I 및 콜라겐 IV의 적절한 비율의 혼합물을 사용하여 획득된다.
바람직한 실시예에서, 배지 내 ECM의 각각의 단백질 성분은 다음과 같다:
- 라미닌: 배지의 부피 기준 8.43 %,
- 히알루론산: 배지의 부피 기준 0.13%,
- 콜라겐 I: 배지의 부피 기준 4.07%, 및
- 콜라겐 IV: 배지의 부피 기준 12.23%,
여기서, 1 mg/mL 농도의 라미닌, 5 mg/mL 농도의 히알루론산, 1 mg/mL 농도의 콜라겐 I, 및 1 mg/mL 농도의 콜라겐 IV가 배지에 첨가된다.
본 발명에 따른 혼합물에 사용되는 히알루론산은 고분자량 산이거나 저분자량 산일 수 있다.
배지는 또한 동결 방지제, 항생제, 살균제, 글루코스, 혈청(FBS), 당업계에서 일반적으로 사용되는 농도로 첨가된 아미노산과 같은 다른 선택적인 성분을 함유할 수 있고, 예를 들어 배지는 FBS, D-글루코스, 항생제(페니실린, 스트렙토마이신, 암포테리신 B, 세팔로스포린) 및 L-글루타민의 혼합물을 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 배지는 상기와 같은 성분을 적절한 비율로 혼합하여 얻어진다. 혼합은 계량봉을 사용하여 수동으로 수행하거나 자기 교반기와 같은 적합한 교반기를 사용하여 자동으로 수행할 수 있다. 바람직하게는, 선택된 방법에 관계없이, 혼합은 멸균 조건 하에서 수행된다.
본 발명에 따라, 상기 및 하기에서 사용된 "대략"이라는 단어는 표시된 값으로부터 +/- 5%의 편차로 이해되어야 하며, 이는 본 발명에 따른 조성물의 제조 공정의 과정(예를 들어, 성분을 계량하는 과정)에서 발생할 수 있는 부정확성을 반영한 것이다.
실시예
다음의 실시예를 구현하기 위해, 테스트 재료를 얻기 위해 여러 절차를 수행하였다. 이들 절차는 모든 실시예에 공통되므로, 실시예 자체를 설명하기 전에 먼저 설명하기로 한다.
1) 재료 수득
췌장은 사육 돼지로부터 수득되었다. 췌장 채취의 첫 번째 단계는 십이지장 구멍(duodenal ostium) 근처의 췌장관을 절단하고 여기에 얼음처럼 차가운(ice-cold) 보존 용액 UW 20mL를 역으로 주입하는 것이었다. 세척 후, 가위를 사용하여 췌장을 주변 조직과 분리하고, 얼음처럼 차가운 UW 보존 용액 500mL가 담긴 멸균 백에 넣고, 그 다음 분쇄된 얼음이 담긴 용기에 담아 격리 실험실로 옮겼다. 총 평균 온허혈(warm ischaemia) 시간은 10분이었다.
2) 췌도의 분리
췌도의 분리는 장기가 분리 실험실로 전달된 직후에 시작되었다. 첫 번째 단계에서, 췌장은 3단계 오염 제거 과정을 거쳤다. 장기의 오염을 제거하기 위해, 췌장을 1x PBS 중 5% 베타딘의 얼음처럼 차가운 용액에 5분 동안 담갔다. 이어서, 췌장을 차가운 항생제 용액(페니실린/스트렙토마이신-1x PBS 중 10,000U/10,000U)으로 2회 세척하였다. 다음 단계에서는, 남은 혈관, 림프절 및 지방 조직을 제거하여, 장기를 기계적으로 세척하였다. 세척 과정은 저체온 조건 하에서 수행되었다. 그 다음, 장기의 무게를 측정한 후, 췌장관에 근위측으로 삽입한 카테터를 통해, 콜라게나제 NB8(2.73mg 콜라게나제/g 췌장) 및 중성 프로테아제(100DMC-U)(pH 7.2 내지 7.4, 18mM HEPES, 7mM CaCl2 및 0.05% NaHCO3를 갖는 150mL 링거액)의 얼음처럼 차가운 용액을 주입하였다. 수액은 비르숭(Wirsung) 튜브를 통해 약 5mL/분의 속도로 투여되었다. 췌장의 무게를 측정하고, 기계적으로 단편화하여, 리코르디(Ricordi) 챔버에 배치하였다. 그 다음, 시스템을 용해된 프라이밍 용액(pH 7.2 내지 7.4의 링거액 중 1.25% 니코틴아미드, 0.5% 글루코스, 0.025% NaHCO3, 37℃로 가열, 14mM HEPES, 5mM 피루브산 나트륨 및 44U/44U 페니실린/스트렙토마이신) 1리터로 채웠다. 췌장 소화는 구슬이 배치된 리코르디 챔버를 흔들어 기계적으로 보조하였다. 30 내지 60초마다 시스템으로부터 작동 유체 샘플을 채취하여, 0.1% 디티존으로 염색하고, 현미경으로 췌도를 정량화함으로써, 소화 진행 상황을 모니터링하였다. 다량의 췌도가 시야에 나타나면, 시스템에 약 200mL의 FBS를 첨가하고 쿨러를 얼음에 담금함으로써, 소화를 중단하였다(임의의 평가; 평균 소화 시간은 19분 및 40초였다. -그룹들 간에 통계적 차이는 없었다). 그 다음, 프라이밍 용액을 5 l 희석 용액(pH 7.2 내지 7.4의 링거액 중 1.2% 니코틴아미드, 0.05% 글루코스, 0.0255% NaHCO3, 14mM HEPES 및 4.3mM 피루브산 나트륨)으로 대체하였다. 생성된 여과액을 이전에 4℃로 냉각된 5mL FBS로 채워진 150mL 코닝(Corning) 튜브에 수집하였다. 췌도가 포함된 여과액을 750 x g, 2분, 4℃로 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 췌도 및 소화된 외분비 조직을 함유한 펠릿을 100mL의 스토어 프로덕트(Store Protect) 용액(UW 용액)에 현탁시켰다. 단리된 췌도 등가물을 계산하기 위해, 췌도 현탁 샘플 100μl를 수집하고, 0.1% 디티존 2 내지 3방울을 첨가하였다.
췌도는 표준화된 방식으로 계산되어, 얻은 결과를 IEQ 번호로 변환하였다.
3) 단리된 췌도의 선택적 정제
췌도를 정제하기 위해, 히스토페이크(Histopaque)를 시약으로 사용하여 단리된 췌도의 외분비 조직을 제거하였다.
- 췌도 펠릿을 10mL의 히스토페이크에 현탁시키고, 펠릿을 부드럽게 부순 다음, 또 다른 5mL의 히스토페이크를 상기 현탁된 펠릿에 첨가하였다; 모든 시약은 실온에 있었다
- 15 mL의 HBSS(FBS 없음)를 히스토페이크 내의 췌도 층에 적가하였다.
- 이를 구배정제하고(gradient purified), 2100rpm에서 24분간 원심분리하였다.
- 원심분리 후, 펠릿(약 15 mL)으로부터 전체 히스토페이크 층을 수집하였다.
- 상기 수집된 층을 50 mL의 팔콘(Falcon) 튜브로 옮기고, 50 mL HBSS + 10% FBS로 채웠다.
- 이를 1000rpm에서 2분간 원심분리하였다.
- 상층액을 제거하여 최종 부피가 30mL가 되도록 하고, 신선한 HBSS + 10% FBS를 최대 50mL까지 채웠다.
- 이를 1000rpm에서 2분간 원심분리하였다.
- 상층액을 제거하여 최종 부피가 20mL가 되도록 하고, 신선한 HBSS + 10% FBS를 최대 50mL까지 채웠다.
- 이를 1000rpm에서 2분간 원심분리하였다.
- 상층액을 제거하여 최종 부피가 10mL가 되도록 하고, 신선한 HBSS + 10% FBS를 최대 50mL까지 채웠다.
- 이를 1000rpm에서 2분간 원심분리하였다.
- 상층액을 제거하여 최종 부피가 5mL가 되도록 하였다.
- 이 부피에서 췌도는 서스펜디드되었다(suspended).
- 획득한 췌도의 무게를 측정하였다.
- 췌도 단독을 10 mL Falcon 튜브에 수집하였다.
- 이를 1000rpm에서 2분간 원심분리하였다.
대안적으로, COBE 장치를 사용하여 췌도를 처리할 수 있다. 이는 또한 (췌도 구배 1.108 및 1.069 또는 다른 구배 용액을 사용하는) 구배 정제를 포함한다.
테스트를 위한 샘플 준비
다양한 저장 조건에서 샘플의 열 안정성을 테스트하기 위해, 적합한 배양 배지를 준비하고, 샘플당 3000 iEQ 췌도를 3 mL의 배지에 현탁시켰다. 샘플을 120시간 동안 테스트 온도에서 배양하여, 24시간마다 샘플링을 수행하고, 췌도 기능을 평가하기 위해 GSIS 테스트를 수행하였다.
모든 실시예에서, 시판되는 3mL의 CMRL 1066 기본 배지(중탄산나트륨이 없고 L-글루타민이 포함된 CMRL 1066, Sigma-Aldrich, Inc. https://www.sigmaaldrich.eom/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/254/308/c0422dat.pdf)를 사용하였다.
각각의 경우, 테스트 샘플과 대조군 샘플 모두에 대해, CMRL 1066 배지는 사용 전에 추가 성분들(배지 500mL당)로 보충되었다.
● L-글루타민 - 5mL
● 100X 페니실린/스트렙토마이신 - 5mL
● 암포테리신 B - 5mL
● 글루코스 280mM -10mL
● FBS - 50mL
4) 췌도 기능 평가
췌도 기능은 글루코스-자극 인슐린 분비(GSIS)를 사용하여 평가되었다. 멸균 크렙스(Krebs) 완충액(25mM HEPES, 115mM NaCl, 24mM NaHCO3, 5mM KCl, 1mM MgCbx6H2O, 0.1% BSA, 2.5mM CaCl2 x 2H2O)에 글루코스을 희석하여, 2.5mM 및 16.7mM 글루코스 용액을 제조하고, 0.22μm 필터로 여과하였다. 용액은 이전에 37℃로 가열되었고, 두 용액 모두로부터 샘플이 수집되지 않았다. 3000 IEQ를 각 삽입물에 배치하고 2.5mM 글루코스 용액에 침지하였다. 30분 후, 삽입물을 티슈 페이퍼 위에서 건조시키고, 16.7mM 글루코스 용액에 60분 동안 두었고, 건조시킨 다음 추가 60분 동안 2.5mM 글루코스 용액에 두었다.
15분마다 각각 100μL의 샘플을 수집하였다. 테스트 전반에 걸쳐, 플레이트는 37℃의 세포 배양 인큐베이터에 저장되었고, GSIS 테스트 중에 수집된 모든 샘플은 ELISA 테스트를 수행하기 전에, -80℃에서 동결되었다. ELISA 테스트는 인슐린 ELISA 키트를 사용하여 수행되었다.
실시예 1 - dECM 용액 형태의 ECM 제제를 함유하는 배지에서 췌도를 4℃ 및 37℃로 저장한다.
다음 성분을 혼합함으로써, 각각 1% 및 2.5% ECM 제제 농도의 배지를 얻었다.
*특허출원 EP 19218191에 설명된 대로 적절한 농도의 dECM 용액을 제조하였다.
실험을 수행하기 위해, 각각의 배지 3 mL를 처리된 췌도 및 미처리된 췌도와 혼합하고, 120시간 동안 배양하였다. 실험 결과가 도 1 내지 도 5에 도시되었다. 대조군 샘플은 첨가물가 없는 CMRL1066 배지였다.
ECM의 추가는 췌도 기능에 상당한 영향을 미쳤다. 저장 온도를 낮추고 단리 직후 미처리된 췌도를 사용할 경우, 유사한 효과가 관찰되었다.
결과 그래프는 췌도의 기능이 4℃에서보다 37℃에서 24시간 동안 저장됐을 때 두 배 이상 낮았다는 것을 명확하게 보여준다. 또한, 미처리된 경우, 췌도 기능이 우수하다는 것을 관찰할 수 있었다(4℃에서 24시간 저장 후, 미처리된 췌도의 활성은 처리된 췌도의 활성보다 거의 100유닛 더 높았다).
또한, ECM의 추가는 췌도 기능에 상당한 영향을 미쳤다. 2.5% ECM에 대해 얻은 결과는 대조군 샘플의 결과보다 15% 높지만, 1% ECM 제제로 얻은 결과보다는 낮았다. 따라서, 췌도를 저장하기 위한 최적의 조건은 다음과 같다: CMRL1066 상업용 배지에서 1%의 ECM 제제 함량, 4℃의 온도 및 미처리된 췌도이다.
실시예 2 - ECM 단백질 혼합물 형태의 ECM 제제를 함유하는 배지에서 췌도를 4℃로 저장한다.
ECM 단백질 성분의 혼합물을 함유하는 배지는 다음 성분을 혼합하여 얻었다.
**테스트는 고분자량 히알루론산과 저분자량 히알루론산의 두 가지 변형으로 수행되었다. 두 가지 변형에 대한 결과는 동일하였다.
실험을 수행하기 위해, 배지 3 mL를 미처리된 췌도와 혼합하고, 각각 4℃에서 72시간 동안 배양하였다. 실험 결과가 도 6에 도시되어 있다. 대조군 샘플은 첨가물이 없는 CMRL1066 배지였다.
72시간 배양 후, 대조 샘플과 비교하여 본 발명에 따른 배지에 저장된 췌도의 기능 증가가 관찰되었다.
고분자량 히알루론산과 저분자량 히알루론산 사이에는 차이가 없었다(도 10은 평균 결과를 보여준다).
Claims (12)
- 상업용 배지 CMRL 1066 또는 RPMI을 기반으로 하며, 단리된 췌도를 저장하기 위한 배지로서,
세포외 기질(ECM) 단백질의 첨가물을 포함하는 것을 특징으로 하는 배지. - 제1항에 있어서, 상업용 배지 CMRL 1066을 기반으로 하는 배지.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 ECM 단백질의 첨가물은 배지 1L에 대해 다음의 단백질을 적절한 중량으로 포함하는 배지:
- 배지의 67 내지 100 mg/L, 바람직하게는 배지의 84.3 mg/L 양의 라미닌
- 배지의 5 내지 8 mg/L, 바람직하게는 배지의 6.7 mg/L 양의 히알루론산
- 배지의 32 내지 48 mg/L, 바람직하게는 배지의 40.7 mg/L 양의 콜라겐 I
- 배지의 100 내지 145 mg/L, 바람직하게는 배지의 122.3 mg/L 양의 콜라겐 IV. - 제3항에 있어서, 상기 ECM 단백질의 첨가물은 배지의 부피에 대해 다음의 단백질을 적절한 부피%로 포함하는 배지:
- 라미닌: 배지의 부피 기준 6.74 내지 10.12%, 바람직하게는 8.43%,
- 히알루론산: 배지의 부피 기준 0.10 내지 0.16%, 바람직하게는 0.13%,
- 콜라겐 I: 배지의 부피 기준 3.26 내지 4.88%, 바람직하게는 4.07%; 및
- 콜라겐 IV: 배지의 부피 기준 9.78 내지 14.67%, 바람직하게는 12.23%,
여기서, 1 mg/mL 농도의 라미닌, 5 mg/mL 농도의 히알루론산, 1 mg/mL 농도의 콜라겐 I, 및 1 mg/mL 농도의 콜라겐 IV가 배지에 첨가됨. - 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 히알루론산은 고분자량 또는 저분자량의 히알루론산일 수 있는 배지.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 바람직하게는 동물 기원의 무세제(detergent-free) dECM 용액이 ECM 단백질의 첨가물로서 사용되는 배지.
- 제6항에 있어서, ECM 단백질 첨가물을 부피 기준으로 1% 내지 2.5%, 바람직하게는 1% 함유하는 배지.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 동결 방지제 및/또는 항생제 및/또는 살균제 및/또는 글루코스 및/또는 혈청 및/또는 아미노산을 추가로 포함하는 배지.
- 제8항에 있어서, 바람직하게는 기본 배지의 각 500mL당 5mL 양의 L-글루타민, 바람직하게는 기본 배지의 각 500mL당 5mL 양의 100X 페니실린-스트렙토마이신, 바람직하게는 기본 배지의 500mL당 5mL 양의 암포테리신 B, 바람직하게는 기본 배지의 각 500mL당 280mM 글루코스 용액 10mL와 동등한 양의 글루코스, 및 바람직하게는 기본 배지의 각 500mL당 50mL 양의 FBS를 포함하는 배지.
- 단리된 췌도를 저장하는 방법으로서,
상기 단리된 췌도는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 배지에서, 4 내지 37℃, 바람직하게는 4℃의 온도에서 저장되는 것을 특징으로 하는 저장 방법. - 제10항에 있어서, 상기 췌도를 배지에 넣기 전에, 상기 췌도는 처리되거나 미처리된 상태로 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 배지의 성분을 구성하는 dECM 용액 형태의 ECM 단백질의 첨가물은 특허 출원 EP19218191에 따른 방법에 의해 획득되는 것을 특징으로 하는 방법.
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