KR20240023337A - 신경줄기세포 증식 촉진용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신경줄기세포의 증식 촉진용 조성물, 신경줄기세포의 증식 방법 및 증식된 신경줄기세포를 포함하는 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

신경줄기세포 증식 촉진용 조성물{A composition for promoting proliferation of neural stem cells}
본 발명은 신경줄기세포의 증식 촉진용 조성물, 신경줄기세포의 증식 방법 및 증식된 신경줄기세포를 포함하는 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
21세기 생명과학 시대를 맞이하여 기초 생물학을 기반으로 보건 및 산업적 측면에서 인간 줄기세포를 활용한 난치성 질환에 대한 연구와 치료법의 개발이 주목을 받고 있다. 최근의 여러 연구에 따르면 신경줄기세포(neural stem cell; NSC)는 발달단계 태아 및 성인의 중추신경계에 존재하며 이를 채취하여 생체 외에서 미분화/미성숙한 상태로 증식(self-renewal)시킬 수 있고, 신경원세포(neuron), 성상교세포(astrocyte), 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)로의 분화 다능성(multipotency)이 있음이 확인되었다. 따라서 난치성 신경계질환 치료에서 신경줄기세포의 유효성에 대한 관심이 크다.
이와 관련하여, 신경계 질환은 특정 신경세포가 기능부전 및 사멸을 시작한 후 신경네트워크가 기능이상을 나타내고 신경행동장애가 발생하면서 점차 더 많은 신경세포가 사멸하면서 개체를 장애 및 사망에 이르게 한다. 따라서, 뇌질환 즉, 뇌졸중, 간질, 정신분열증, 뇌척수 손상 등도 대부분 만성적으로 신경세포 사멸을 동반하며 치매의 경우 정상인의 10배의 신경세포가 사멸하여 7-8년 후에는 뇌 부피가 크게 감소하고 죽음에 이른다. 이러한 이유로 인해서 중추신경계의 퇴행성 뇌질환 뿐 아니라 척수손상 및 말초신경계 손상 등 거의 모든 신경계 질환에서 세포사멸을 극복하고 신경줄기세포의 증식과 분화에 의한 신경재생을 유도하는 것은 중요한 문제가 된다.
이에, 난치성/퇴행성 신경계 질환의 치료를 위해서는 이미 사멸했거나 기능 부전을 보이는 신경세포를 대체하는 것이 우선인데 최근에는 질환에 의해 파괴되거나 손상받은 세포를 외부로부터 공급해주는 세포 대체 요법 (cell replacement therapy)이 효과적인 치료법으로 제시되고 있다. 이러한 세포 치료 요법에서, 재생이 필요한 조직으로 증식 및 분화가 가능한 줄기세포 (stem cell)가 각광을 받고 있다. 예를 들어, 최근 유럽에서는 퇴행성 뇌질환 환자 특히 파킨슨병 환자의 경우 태아에서 얻은 신경세포를 이식하는 것이 임상적으로 적용되고 있는데 이식 후에 환자는 매우 빨리 회복되어 행동이 좋아지지만 한 명의 환자를 다수의 태아 유래 신경조직의 확보는 매우 어렵다는 문제가 있다.
또한, 태아의 신경계 조직을 직접적으로 세포치료제로 이용할 경우 현실적으로 다수의 태아공여가 요구되어 현실적/기술적인 문제가 있을 뿐만 아니라 윤리적 문제가 발생할 여지가 있으므로 태아조직을 일차적으로 세포치료제로 활용하는 것은 한계가 있는 상황이다.
한편, 태아의 중추신경계에서 추출된 신경줄기세포는 생체 외에서 미분화 및 미성숙 상태로 계속 증식시킬 수 있어 대량생산이 가능한 것으로 알려져 있다. 뿐만 아니라 설치류 내 종양원성에 대한 전임상 시험과 다양한 신경계 질환 환자를 대상으로 실시한 다수의 임상시험에서 현재까지 안전성 및 일부 치료효과가 확인되었다.
이와 관련하여, 신경줄기세포의 임상적 적용을 위해서는 세포의 증식 및 분화 특성 확립, 유전자 발현 형태, 세포 형질 및 핵형의 안정성 및 정상성 등을 확인하기 위한 실험이 진행되어야 하기 때문에 충분한 수의 신경줄기세포가 필요하다. 태아로부터 얻어지는 신경줄기세포의 숫자는 많지 않기 때문에 연구 및 세포치료제 개발을 위해서 신경줄기세포의 증식 및 배양 기술의 연구의 필요성이 대두되고 있다.
본 발명의 하나의 목적은 인간 혈소판 용해물(human platelet lysate, hPL)을 포함하는 신경줄기세포의 증식 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 인간 혈소판 용해물(human platelet lysate, hPL)을 포함하는 조성물에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 신경줄기세포를 증식시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 방법으로 증식된 신경줄기세포를 유효성분으로 포함하는 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 방법으로 증식된 신경줄기세포를 유효성분으로 포함하는 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을, 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 발명의 일 양태는 인간 혈소판 용해물(human platelet lysate, hPL)을 포함하는 신경줄기세포의 증식 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 용어 "인간 혈소판 용해물(human platelet lysate, hPL)"은 인간의 혈소판 동결(freeze)/해동(thaw) 후 얻어지는 탁한 담황색의 액체이다. 혈소판 동결/해동은 혈소판을 용해시켜 세포 확장에 필요한 많은 양의 성장 인자를 방출한다.
구체적으로, 상기 조성물은 인간 혈소판 용해물을 0.01중량% 내지 0.2중량%, 구체적으로 0.01중량% 내지 0.15중량%, 0.015중량% 내지 0.1중량%, 0.02중량% 내지 0.1중량%, 더욱 구체적으로는, 0.03 내지 0.1중량%의 함량으로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 용어 “신경줄기세포(neural stem cell)”는 배아의 발달시 모든 뇌 영역을 형성하는 신경 및 신경교세포의 근원으로, 신경세포(neuron), 성상교세포(astrocyte), 회돌기세포(oligodendrocyte)등 어떠한 중추신경계를 구성하는 세포로도 분화할 수 있는 능력을 가진 미분화세포를 의미한다.
구체적으로, 상기 신경줄기세포는 신경전구세포인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 용어 "신경 전구 세포 (neuronal progenitor cell 또는 neuronal precursor cell)"는 여러 형태의 신경 세포로 분화할 수 있는 세포를 의미한다. 본 발명에서 용어, “신경 전구 세포”는 “신경줄기세포”와 혼용되어 사용될 수 있다. 또한, 상기 신경 전구 세포는 신경줄기세포로부터 유래된 세포를 의미할 수 있다. 상기 신경 전구 세포는 예를 들면, 포유 동물의 태아 또는 성체로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 신경 전구 세포는 예를 들면, 상기 태아의 뇌조직으로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 신경 전구 세포는 예를 들면, 상기 태아의 중뇌 조직으로부터 유래한 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 신경줄기세포는 인간 태아 중뇌 유래 신경전구세포인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 신경줄기세포는 예를 들면, 미분화 상태로 증식되는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 "증식"은 세포 수가 증가하는 것을 의미한다. 상기 미분화 증식은 특정 세포로 분화되지 않은 채 원래의 세포와 동일한 성질을 가지는 세포로 증식하는 것을 의미한다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 인간 혈소판 용해물(human platelet lysate; hPL)을 포함하는 조성물에서 배양할 경우, 신경줄기세포의 증식률이 증가되는 것을 확인하였다. 또한 장기간의 세포증식기간 동안 줄기능(stemness)이 변하지 않아, 신경줄기세포의 대량생산에 유리할 수 있음을 확인하였다.
구체적으로, 상기 조성물은 bFGF(basic fibroblast growth factor) 및 EGF(epidermal growth factor)를 추가 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 인간 혈소판 용해물(human platelet lysate, hPL)을 포함하는 조성물에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 신경줄기세포를 증식시키는 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "배양"은 본 발명의 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 인간 혈소판 용해물을 포함하는 조성물은 줄기세포를 배양하기 위한 배지로 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "배지"는 본 발명의 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 발명의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 발명의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
구체적으로, 상기 조성물은 인간 혈소판 용해물을 0.01중량% 내지 0.2중량%, 구체적으로 0.01중량% 내지 0.15중량%, 0.015중량% 내지 0.1중량%, 0.02중량% 내지 0.1중량%, 더욱 구체적으로는 0.03 내지 0.1중량%의 함량으로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 신경줄기세포는 신경전구세포인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 신경줄기세포는 인간 태아 중뇌 유래 신경전구세포인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 조성물은 bFGF(basic fibroblast growth factor) 및 EGF(epidermal growth factor)를 추가 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 조성물은 신경줄기세포의 증식을 유도하고 촉진시키므로, 신경세포의 세포수 부족, 세포 손상 또는 세포 사멸 등을 원인으로 하는 신경질환에 대한 세포치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명의 신경줄기세포를 증식시키는 방법으로 증식된 신경줄기세포를 유효성분으로 포함하는 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "유효성분"은 단독으로 목적으로 하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체 등과 함께 목적으로 하는 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
본 발명의 용어 "예방"이란 본 발명의 조성물의 투여로 신경질환의 발생, 확산 및 재발을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 본 발명의 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
구체적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 증식된 신경줄기세포를 이용함으로써 신경질환을 예방 또는 치료할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
더욱 구체적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 증식된 신경줄기세포를 신경세포 손상의 회복이 필요한 대상의 손상 부위에 투여됨으로써 신경질환을 예방 또는 치료할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이와 관련하여, 신경줄기세포는 태아기에는 다양한 해부학적 부위에 존재하여 신경계를 형성하며, 한번 손상되면 재생되지 않는 것으로 알려져 있다. 신경줄기세포는 포유류의 성체 중추신경계에도 존재하며 일생을 통하여 증식·분화하여 새로운 신경 세포를 생성한다. 신경줄기세포는 시험관 내에서 장기 배양할 수 있고, 생체 내 이식 시 생착, 이주 및 분화하여 숙주 신경계에 통합될 수 있다. 이에 따라, 신경계 질환에서 신경줄기세포를 이용한 신경 재생치료 가능성에 대해 관심이 증가하고 있다.
본 발명의 용어 “신경질환”은 운동 및 감각에 관여하는 신경이 손상되어 운동 및 감각을 포함하는 행동기능에 이상이 생기는 질환을 의미한다.
구체적으로, 상기 신경질환은 파킨슨씨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 근위축성 측삭경화증, 다계통위축증, 파킨슨병성 치매, 뇌졸중, 다발성 경화증, 외상성 뇌손상, 뇌실내출혈, 태아 저산소성 허혈증, 국소빈혈 및 척수손상에 의한 신경질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분으로서　인간 혈소판 용해물을 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9 중량%, 구체적으로는 0.01 내지 80 중량%, 보다 구체적으로는 0.01중량% 내지 0.15중량%, 0.015중량% 내지 0.1중량%, 0.02중량% 내지 0.1중량%, 더욱 구체적으로는 0.03 내지 0.1중량%의 함량으로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사 용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥내, 복강내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 이러한 조성물에 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토즈, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제가 사용될 수 있다.
경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈61. 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 한편, 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
예컨대, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
구체적으로, 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물을 사람을 포함하는 동물에 하루 동안 1 내지 10 mg/체중 kg으로 투여할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 조성물의 투여 빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명의 신경줄기세포를 증식시키는 방법으로 증식된 신경줄기세포를 유효성분으로 포함하는 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을, 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 용어, "개체"는 암이 발병되었거나 발병할 가능성이 있는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이, 인간 등의 모든 동물을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 상기 예방 또는 치료 방법은 구체적으로, 신경세포 손상의 회복이 필요한 개체의 손상 부위에 상기 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 암 및 관련된 질병의 증상이 나타나거나 또는 나타날 우려가 있는 개체에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등의 경로를 통해 투여 될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물을 사람을 포함하는 동물에 하루 동안 1 내지 10 mg/체중 kg으로 투여할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 조성물의 투여 빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 인간 혈소판 용해물을 포함하는 신경줄기세포의 증식 촉진용 조성물은 신경줄기세포의 증식 촉진 효과를 나타내므로, 신경질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물에서 인간 신경 전구 세포를 배양한 후, 증식 모양을 현미경으로 확인한 결과 및 세포 계수 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물의 인간 신경 전구 세포의 증식에서의 유전자 발현에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물이 신경줄기/전구세포(SOX2, NESTIN) 표지자의 발현에 미치는 영향을 면역화학염색법(immunocytochmestry)으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 인간 신경 전구 세포의 배양 및 증식 모양 분석
본 발명에서 사용한 인간 신경 전구 세포는 연세의료원의 세브란스병원 연구심의위원회의 승인(승인번호: 4-2021-0003)을 받아 인간 신경 전구 세포(KCTC11370BP, KR 10-1102483 B1)를 제공받았다.
모든 세포 배양은 37°C, 5% CO2 배양기에서 실시하였고 Growth Media (GM)는 세포 seeding 후 3일, 5일차에 완전히 교체하였다. GM은 DMEM/F12-Gutamax (Gibco)에 0.5% gentamicin (Gibco), 2% B27-xenofree (Gibco), 10 mM glucose (SIGMA), 10 ng/mL bFGF (Gibco), 20 ng/mL EGF (PEPROTECH), 0.005 UI heparin, 0.5 ng/mL LIF (SIGMA)가 기본적으로 포함되어 있으며 각 그룹별로 0/0.025/0.05/0.1% hPL (STEMCELL)이 첨가되어 있다. 세포증식에 사용되는 flask는 Poly-L-Ornithine (SIGMA)과 Fibronectin (SIGMA)으로 coating (PLO+FN)되어 있는 것을 사용하였다. 세포는 T25 flask에 1 x 106 세포/5 mL로 seeding 되었고 monolayer로 증식되었으며 seeding 7일차에 계대배양 하였다.
이어서, 배양 1주차 및 4주차의 세포의 증식 모양을 현미경으로 확인하고자 하였다.
그 결과는 도 1의 A에 나타내었다.
도 1의 A에 나타난 바와 같이, 4주차까지의 배양 동안 광학현미경을 통해 육안으로 관찰된 세포의 증식 모양은 hPL 0.1%까지는 별다른 차이가 없었지만 hPL 0.3%이상의 농도에서부터 세포가 뭉치는 경향을 보임을 확인하였다.
실시예 2. 계대 배양 및 세포 계수
상기 실시예 1에서 증식된 세포는 GM이 모두 제거되었고 TrypLE 1 mL를 처리해 37℃, 5% CO2 배양기에서 3분간 반응시켰다. 이후 3 mL GM을 추가해 세포 현탁액을 15 mL tube로 옮기고 3 mL GM을 추가해 잔여 세포들을 15 mL tube로 옮겼다. 300 x g, 3분동안 원심분리 하여 상층액을 제거하고 GM 1 mL로 세포를 부유시킨 다음 세포수를 측정한 후 T25 flask에 1 x 106 세포/5 mL로 seeding 하였다.
세포 계수 결과는 도 1의 B 및 도 1의 C에 나타내었다.
도 1의 B 및 도 1의 C에 나타난 바와 같이, 신경 전구 세포는 hPL을 처리했을 때 그렇지 아니한 그룹보다 더 많은 세포 증식률을 나타냈으며 특히 0.03% hPL의 농도에서 가장 높은 세포 증식률을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 유전자 분석
신경 전구 세포의 증식에서 hPL이 유전자 발현에 미치는 영향을 분석하고자 하였다.
상기 실시예 2에서 각 그룹별로 계대배양 하고 남은 세포를 T25 flask에 2 x 106 세포/5 mL로 seeding 하여 3일간 배양한 후에 RNeasy Plus Kits (Qiagen)를 사용하여 사용법에 따라 세포의 total RNA를 분리하였고, cDNA는 ReverTra AceTM qPCR RT Master Mix (Toyobo)를 이용해 제조사의 지침에 따라 RNA 1 μg으로 만들어졌다.
Quantitative real-time PCR은 QuantStudioTM 3 Real-Time PCR System (ABI)에서 수행하였다. 각 유전자의 증폭은 PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix (ABI) 5 μL, 각각의 primer 10 pM, 합성된 50 ng cDNA를 함유하는 총 20 μL의 부피에서 수행하였다. 증폭 조건은 50℃ 2분, 95℃ 10분 후 95℃ 15초, 60℃ 30초를 45회 수행하였다. 유전자의 상대적인 발현 수준은 18S ribosomal RNA로 표준화를 하였고 2-ΔΔCT method로 생성된 데이터를 분석하였다. Primer 서열은 하기 표 1에 나타내었다.
No. Gene of interest Primer sequence (5'-3')
Sense Anti-sense
1 SOX2 TACAGCATGTCCTACTCGCAG
(서열번호 1)		 GAGGAAGAGGTAACCACAGGG
(서열번호 2)
2 TUBB3 GGCCAAGGGTCACTACACG(서열번호 3) GCAGTCGCAGTTTTCACACTC
(서열번호 4)
3 GFAP AGGTCCATGTGGAGCTTGAC(서열번호 5) GCCATTGCCTCATACTGCGT
(서열번호 6)
4 PDGFRA TTGAAGGCAGGCACATTTACA(서열번호 7) GCGACAAGGTATAATGGCAGAAT
(서열번호 8)
5 RN18S CGGACAGGATTGACAGATTG
(서열번호 9)		 CAAATCGCTCCACCAACTAA
(서열번호 10)
그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 신경 전구 세포의 증식에서 hPL은 농도 의존적으로 신경줄기/전구세포(NSPC) 표지자인 SOX2의 발현을 감소시키는 경향을 보였다. 그러나 hPL 0.1% 이하의 농도에서는 SOX2의 발현이 대조군(hPL 0%)과 비슷하게 유지됨을 확인하였다. 또한, 뉴런(neuron) 표지자인 TUBB3의 발현은 대조군과 비교했을 때 hPL 0.3% 이상에서 약간 감소하거나 비슷하게 유지되는 경향을 보였지만 그 이하의 농도에서는 발현 증가가 확인되었다. 또한, 희소 돌기 아교 세포(oligodendrocyte) 표지자인 PDGRFA는 대조군 대비 hPL 0.1% 이상의 농도에서 감소되어 나타났지만 0.03%에서는 일정하게 유지됨을 확인하였다. 별 아교 세포(astrocyte) 표지자로 알려진 GFAP의 발현은 hPL 처리 1주차에 농도 의존적으로 증가했다가 시간이 지남에 따라 농도에 상관없이 일정한 수준으로 발현이 증가됨을 확인하였다.
실시예 4. 면역세포화학 분석
증식 중인 세포의 특성을 확인하기 위하여 신경줄기/전구세포(SOX2, NESTIN) 표지자의 발현을 면역화학염색법(immunocytochmestry)으로 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2에서 각 그룹별로 계대배양 하고 남은 세포를 8 well chamber slide에 3 x 104 세포/400 μL로 seeding 하여 3일간 배양한 후 cold PBS로 세척한 다음 4% 파라포름알데하이드로 고정하고 다시 cold PBS로 세척하였다. 세포는 다음의 1차 항체로 배양하였다: anti-NESTIN (1:400; Millipore), anti-SOX2 (1:500; Cell Signaling)항체. 1차 항체 결합을 검출하기 위해 Alexa fluor 488/594 (1:500/1:1000; Jackson)가 연결된 2차 항체를 이용하였다. 4,6-diamino-2-phenylindole (DAPI; Vector)를 포함하는 Vectashield 마운팅 미디엄으로 샘픔을 마운팅하고 면역형광 현미경(BX53C-32XFL; OLYMPUS)으로 분석하였다. 인 비트로 정량을 위해 선택 영역에서 총 DAPI 양성 세포 가운데 마커에 양성인 세포의 비율을 계산하였다. 이어서, 각 조건에서 인간 신경 전구 세포를 7일 동안 배양한 후, 면역염색하여 SOX2와 NESTIN 마커의 발현을 나타내었다.
그 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 인간 신경 전구 세포의 증식에서 hPL은 0.1% 농도에서 SOX2의 발현을 유의적으로 증가시켰지만 나머지 농도에서는 큰 변동을 보이지 않고 그대로 유지되는 경향을 보였다(*, p < 0.05; #, p < 0.05; $, p < 0.05 (n = 3)).
종합해보면, hPL은 인간 신경 전구 세포의 증식을 높일 수 있음을 확인하였다. 그러나 처리 농도가 너무 높을 경우 세포의 증식이 점점 감소하는 결과를 보였고, 줄기능(stemness) 및 다능성(multipotency)과 관련된 몇몇 표지자(SOX2, PDGFRA)들의 발현 또한 감소하는 경향을 나타내었다. 따라서 신경 전구 세포의 줄기능과 다능성을 유지하면서 증식률을 높이기 위하여 hPL을 0.03% 이상 0.1% 미만의 농도로 첨가하는 것이 최적의 농도임을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (13)

  1. 인간 혈소판 용해물(human platelet lysate, hPL)을 포함하는 신경줄기세포의 증식 촉진용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 인간 혈소판 용해물을 0.03중량% 내지 0.1중량%의 함량으로 포함하는 것인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 신경줄기세포는 신경전구세포인 것인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 신경줄기세포는 인간 태아 중뇌 유래 신경전구세포인 것인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 bFGF(basic fibroblast growth factor) 및 EGF(epidermal growth factor)를 추가 포함하는 것인, 조성물.
  6. 인간 혈소판 용해물(human platelet lysate, hPL)을 포함하는 조성물에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 신경줄기세포를 증식시키는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 조성물은 인간 혈소판 용해물을 0.03중량% 내지 0.1중량%의 함량으로 포함하는 것인, 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 신경줄기세포는 신경전구세포인 것인, 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 신경줄기세포는 인간 태아 중뇌 유래 신경전구세포인 것인, 방법.
  10. 제6항에 있어서, 상기 조성물은 bFGF(basic fibroblast growth factor) 및 EGF(epidermal growth factor)를 추가 포함하는 것인, 방법.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 증식된 신경줄기세포를 유효성분으로 포함하는 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 신경질환은 파킨슨씨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 근위축성 측삭경화증, 다계통위축증, 파킨슨병성 치매, 뇌졸중, 다발성 경화증, 외상성 뇌손상, 뇌실내출혈, 태아 저산소성 허혈증, 국소빈혈 및 척수손상에 의한 신경질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 질환인 것인, 약학 조성물.
  13. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 증식된 신경줄기세포를 유효성분으로 포함하는 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을, 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경질환의 예방 또는 치료방법.
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