KR20240013965A - 8-메톡시부틴을 포함하는 피부암 예방, 치료 또는 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 피부암 예방, 치료 또는 개선용 조성물 및 피부 외용제를 제공한다. 본 발명의 조성물 및 피부 외용제는 정상 피부 세포를 보호하면서 피부암의 성장을 특이적으로 억제하는 효능을 가져, 약학 조성물, 화장료 조성물 또는 식품 조성물 등으로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

8-메톡시부틴을 포함하는 피부암 예방, 치료 또는 개선용 조성물{A Composition for Prevention, Treatment or Improvement of Skin Cancer Comprising 8-Methoxybutin}

본 발명은 8-메톡시부틴의 피부암 예방, 치료 또는 개선 용도에 관한 것이다.

매년 피부암 환자의 발병율은 급격하게 증가하는 추세를 보이고 있다. 이중, 흑색종은 전체 피부암 중 낮은 비율을 차지하지만, 점이나 과색소침착 등 여타 피부 증상과 착각해 초기 치료 시기를 놓치기 쉽고 발병 초기에는 증상도 없어 발견도 쉽지 않다. 따라서, 본격적인 흑색종 치료 단계에 이르기 전에 흑색종 진행을 억제, 완화, 경감할 수 있는 피부 관리가 무엇보다 중요하다.

8-메톡시부틴은 큰금계국(Coreopsis lanceolata) 꽃 추출물에서 분리된 플라보노이드 화합물로서 항산화 효능 등의 생리학적 활성이 일부 알려져있다.

대한민국 특허 10-1965978호는 본 발명자의 선행 특허로, 8-메톡시부틴의 피부 미백 또는 열노화 개선 효과를 확인한 바 있다. 그러나, 상기 문헌은 항암 효능에 주목하지 않으며, 오히려 세포 분열 효과를 확인하기 위한 MTT 분석 실험 결과 암세포의 세포 생존율이 100% 정도로 높게 유지된다는 점을 기재하고 있다.

문헌[Pardede, Antoni, et al. "Flavonoid profile and antileukemic activity of Coreopsis lanceolata flowers."　Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters　26.12 (2016): 2784-2787.]은 큰금계국 꽃의 메탄올 추출물의 항암 효능을 개시한다. 그러나, 상기 문헌은 큰금계국 추출물의 혈액암 세포주에 대한 성장 억제 효능만을 개시할 뿐이며 피부암에 대해서는 언급하고 있지 않다.

문헌[ZHAO, Ping-Ping. "Purification of butin and butein from the Vernonia anthelmintica Willd and their effects on proliferation and melanogenesis of A375 human melanoma cells."　Chinese Pharmaceutical Journal　(2013): 1724-1727.]은 8-메톡시부틴과 유사한 부틴을 흑색종 세포에서 처리하고, 세포 증식에 미치는 영향을 개시하고 있다. 그러나, 상기 문헌은 피부암 성장 억제 효능은 언급하고 있지 않다.

문헌[Huang, Yu-Chun, Chao-Hsun Yang, and Yi-Ling Chiou. "Citrus flavanone naringenin enhances melanogenesis through the activation of Wnt/β-catenin signalling in mouse melanoma cells."　Phytomedicine　18.14 (2011): 1244-1249.]은 흑색종에서 대표적인 플라바논 화합물인 나린제닌(naringenin)의 영향을 개시하고 있으며, 상기 플라바논 화합물이 멜라닌 생성과 MITF 단백질 발현을 증진한다고 알려져있다.

이러한 배경 하에, 본 발명자는 피부 세포에 대한 8-메톡시부틴의 유용한 효능 발굴을 위해 노력한 결과, 놀랍게도 8-메톡시부틴이 흑색종 발생의 핵심 단백질인 MITF(microphthalmia-associated transcription factor)의 신규 억제제이며, 정상 피부 세포를 보호하면서도 흑색종과 같은 피부암 세포의 성장을 특이적으로 억제하는 효과를 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 화학식 1로 표시되는 화합물의 피부암 예방, 치료 또는 개선 용도를 제공하는 것이다.

본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 피부암 예방, 치료 또는 개선용 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

상기 조성물에서, 화학식 1로 표시되는 화합물은 천연물에서 유래하거나 또는 화학적으로 합성된 것일 수 있다.

상기 조성물에서, 피부암은 기저 세포 암종, 피부 편평 세포 암종 및 흑색종으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 바람직하게는 흑색종일 수 있다.

상기 조성물은 피부암 세포의 성장을 특이적으로 억제할 수 있고, 구체적으로 정상 피부 세포의 성장을 억제하지 않으면서 피부암 세포의 성장을 억제하는 것일 수 있다.

상기 조성물은 정상 피부 표피 세포 보호 효과를 가질 수 있고, 구체적으로 각질세포(keratinocyte) 보호 효과를 가질 수 있다. 상기 각질세포 보호 효과는 바람직하게는 각질세포 증식 촉진 효과일 수 있다.

상기 조성물에서, 화학식 1로 표시되는 화합물은 MITF (microphthalmia-associated transcription factor) 단백질 활성 억제 효과를 가질 수 있다. 상기 조성물에서, 피부암은 MITF 단백질 의존적 암일 수 있고, 구체적으로 MITF 단백질이 정상 멜라닌세포(melanocyte)에 비해 과발현 또는 과활성된 암일 수 있다.

상기 조성물은 적용 분야에 따라 약학 조성물, 화장료 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 피부암 개선용 피부 외용제를 제공한다. 상기 피부 외용제는 정상 피부 표피 세포 보호 효과를 가질 수 있다.

상기 조성물에 관한 사항은 별도의 언급이 없는 이상 상기 피부 외용제에도 동일하게 적용된다.

본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물 및 피부 외용제는 피부암 세포의 성장을 특이적으로 억제하고, 정상 피부 표피 세포 보호 효과를 가지므로, 단독으로 또는 다른 피부 적용 제품과 함께 사용되어 피부암의 예방, 치료 또는 개선에 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 8-메톡시부틴의 농도별 피부암 세포주(B16F10) 성장 억제 효능을 CCK-8 assay로 측정한 결과를 나타내고,
도 2는 8-메톡시부틴의 처리 시간별 피부암 세포주(B16F10) 성장 억제 효능을 CCK-8 assay로 측정한 결과를 나타내고,
도 3 및 도 4는 8-메톡시부틴의 농도별 피부암 세포주(B16F10) 성장 억제 효능을 콜로니 형성 분석 실험으로 측정한 결과를 나타내고,
도 5는 8-메톡시부틴의 농도별 정상 표피 세포(HaCaT)에 대한 영향을 CCK-8 assay로 측정한 결과를 나타내고,
도 6은 8-메톡시부틴의 처리 시간별 정상 표피 세포(HaCaT)에 대한 영향을 CCK-8 assay로 측정한 결과를 나타내고,
도 7은 8-메톡시부틴과 MITF 단백질의 결합도를 Pull-down assay로 측정한 결과를 나타내고,
도 8은 8-메톡시부틴의 MITF 단백질 내 결합 부위를 나타내는 3차원 이미지이고,
도 9는 8-메톡시부틴의 MITF 단백질 활성 부위와의 상호작용을 나타내는 3차원 이미지이고,
도 10은 8-메톡시부틴과 MITF 단백질의 결합으로 인한 MITF 단백질의 E-box 도메인 결합 억제 활성을 측정한 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.

일 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 피부암 예방, 치료 또는 개선용 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 7,3',4'-트리히드록시-8-메톡시플라바논(7,3',4'-trihydroxy-8-methoxyflavanone) 또는 8-메톡시부틴(8-methoxybutin)으로 명명되며, 큰금계국(Coreopsis lanceolata)의 꽃 추출물에 함유된 성분으로 항산화 효능 등이 알려져있다(문헌[Okada, Yoshiharu, et al. "Isolation and identification of flavonoids from Coreopsis lanceolata L. petals."　Natural product research　28.3 (2014): 201-204.]). 8-메톡시부틴은 플라보노이드 골격의 A 고리 7번, 8번 탄소에 각각 히드록시기 및 메톡시기가 부착되고, B 고리의 3', 4'번 탄소에 각각 히드록시기가 부착된 독특한 구조로, 이를 통해 다른 플라보노이드 화합물과 차별화되는 생물학적 활성을 발휘할 수 있다(문헌[Lopez-Lazaro, M. "Flavonoids as anticancer agents: structure-activity relationship study."　Current Medicinal Chemistry-Anti-Cancer Agents　2.6 (2002): 691-714.], [Shi, Lei, et al. "Synthesis and biological activity of flavanone derivatives."　Bioorganic & medicinal chemistry letters　20.18 (2010): 5466-5468.], [Cabrera, Mauricio, et al. "Synthetic chalcones, flavanones, and flavones as antitumoral agents: Biological evaluation and structure-activity relationships." Bioorganic & Medicinal Chemistry 15.10 (2007): 3356-3367.] 등).

일 실시양태에서, 8-메톡시부틴은 천연물에서 유래된 것이고, 구체적으로 큰금계국(Coreopsis lanceolata) 꽃 추출물 내에 함유된 것이거나 또는 큰금계국 꽃 추출물에서 추출 및 분리된 것일 수 있다.

본 발명에서, 8-메톡시부틴 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 조성물은 큰금계국 꽃 추출물이거나 또는 상기 추출물을 포함할 수 있다. 또한, 큰금계국 꽃 추출물 내 8-메톡시부틴이 유효 농도로 함유된 이상, 8-메톡시부틴 또는 이의 염을 포함하는 조성물은 큰금계국 꽃 추출물 이외에 1종 이상의 식물 추출물을 더 포함할 수 있다.

본 발명에서, 8-메톡시부틴의 염은 상기 염이 포함된 조성물의 적용 분야에 따라 적합한 염, 예컨대 의약품, 의약외품, 화장품 또는 식품 등에 통상적으로 사용가능한 염을 의미한다. 상기 염은 예컨대, 8-메톡시부틴의 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 리튬, 구리, 망간, 아연, 철 등을 비롯한 무기이온 염과 염산, 인산, 황산과 같은 무기산 염, 그 외에 아스코르브산, 시트르산, 타르타르산, 락트산, 말레산, 말론산, 푸마르산, 글리콜산, 숙신산, 프로피온산, 아세트산, 오로테이트산, 아세틸살리실산과 같은 유기산 염과 라이신, 아르기닌, 구아니딘 등의 아미노산 염 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 8-메톡시부틴의 피부암 세포 성장 억제 효능을 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 실시예에서 피부암의 일종인 흑색종 세포를 대상으로 8-메톡시부틴의 암세포 성장 억제 효능을 확인하였다(도 1 내지 도 4). 이에 따라, 8-메톡시부틴을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 피부암 예방, 치료 또는 개선 효과를 발휘할 수 있다. 상기 조성물은 적용 분야에 따라 의약품, 의약외품, 피부 외용제, 화장품, 식품 등으로 유용하게 활용될 수 있다.

본 발명에서, 피부암의 예방, 치료 또는 개선은 8-메톡시부틴이 적용되는 기술 분야의 맥락에 따라 피부암과 관련된 병태 또는 증상의 예방, 방지, 지연, 호전, 해소, 완화, 경감, 개선, 치료하는 등의 효과를 포함하며, 반드시 피부암의 완전한 발병 억제에 제한되지 않는다.

본 발명에서, 피부암이란 피부에서 발생되는 암 또는 악성 신생물로, 피부 세포의 정상적인 세포 사멸 균형이 무너져 세포가 과다 증식하게 됨으로써 생기는 상태 또는 질병을 지칭한다. 상기 피부암은 피부 조직 내 구체적인 기원 세포에 따라 편평 상피세포암(squamos　cell　carcinoma), 기저세포암(basal cell carcinoma), 흑색종(melanoma) 등을 포함한다.

본 발명의 실시예에서, 8-메톡시부틴의 흑색종 성장 억제 효능을 구체적으로 확인하였으므로(도 1 내지 도 4), 본 발명에서 피부암은 바람직하게는 흑색종이다.

본 발명에서, 피부암은 피부에서 발생한 암으로 처음부터 피부에서 발생한 원발 피부암 외에도 다른 장기에서 발생하여 피부로 전이된 전이 피부암을 포함한다.

본 발명에서, 피부암은 종래 항암제에 대한 저항성을 갖거나 반응성이 상대적으로 낮은 피부암일 수 있다. 여기서, 항암제는 피부암 예방, 치료 또는 개선을 위해 사용가능한 세포독성 항암제, 표적 항암제, 면역 항암제 또는 이들의 조합을 포함한다.

일반적으로 항암 효능을 나타내는 물질은 암세포 외에도 정상 세포의 성장을 억제시킬 수 있으며, 정상 세포의 성장에 영향을 미치지 않고 암세포 특이적인 성장 억제 효능을 달성하는 것은 항암 물질의 인체 부작용을 최소화할 수 있는 장점을 가질 수 있다. 본 발명의 실시예에서, 8-메톡시부틴은 흑색종 세포를 효과적으로 억제할 뿐 아니라, 정상 피부 세포에 대해서는 세포 사멸 효과를 갖지 않음을 확인하였다(도 5 및 도 6). 따라서, 8-메톡시부틴은 피부 조직에 적용되어 정상 피부 세포에 대해서는 세포 성장을 억제하지 않으면서, 피부암 세포 성장을 특이적으로 억제하는 장점을 가진다.

나아가, 본 발명에서 8-메톡시부틴 또는 이의 염은 피부 표피 세포 보호 효과를 가질 수 있다. 상기 피부 표피 세포 보호 효과는 구체적으로 각질세포 보호 효과이며, 바람직하게는 각질세포 증식 촉진 효과일 수 있다. 각질세포(keratinocyte)는 활발한 증식과 분화과정을 수반하는 피부 표피의 주된 세포로 기저층의 줄기 세포에서 유래하여 증식되고, 세포 분열하여 유극층, 과립층을 거쳐 가장 바깥층의 각질층까지 이동하면서 피부 장벽을 형성하게 된다. 따라서, 8-메톡시부틴의 각질세포 보호 효과는 피부 상태 개선, 피부 노화 개선, 피부 재생 효과 등의 장점을 발휘할 수 있다. 본 발명의 실시예에서, 8-메톡시부틴은 정상 피부 표피 세포인 각질세포(HaCaT 세포)의 증식을 촉진하는 효과를 가짐을 확인하였다(도 5 및 도 6). 따라서, 본 발명의 8-메톡시부틴은 피부 조직에 적용시 정상 피부 표피 세포의 증식을 촉진함으로써 피부 세포를 보호하는 장점을 가진다.

본 발명에서, 8-메톡시부틴은 MITF 단백질 활성을 억제하는 효과를 가질 수 있다. 본 발명에서, MITF 단백질 활성은 세포 내에서 전사 인자인 MITF 단백질이 타겟 DNA에 결합하여 하위 유전자의 발현을 조절할 수 있는 생물학적 활성을 의미한다. 본 발명의 실시예에서, 8-메톡시부틴은 MITF 단백질에 직접 결합할 수 있음을 확인하였고(도 7), MITF 단백질과의 결합 과정에서 MITF 단백질 활성을 발휘하는 핵심 아미노산(Leu257, Arg259, Gln261 등)과 상호작용할 수 있음을 확인하였으며(도 8 및 도 9), MITF 단백질과 결합할 경우 MITF 단백질의 활성을 직접적으로 억제함을 확인하였다(도 10). 즉, 본 발명의 실시예에서 8-메톡시부틴이 신규 MITF 단백질 활성 억제제임을 최초로 확인하였다.

본 발명에서, MITF (microphthalmia-associated transcription factor microphthalmia-associated transcription factor) 단백질은 mitf 유전자에서 발현된 단백질로서 그 서열정보가 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있으며, 예컨대 서열번호 1로 제공된 인간 MITF 단백질의 아미노산 서열을 참고할 수 있다. mitf 유전자는 흑색종의 리니지-의존성 종양 유전자(lineage addiction oncogene)로서, CDK2, TBX2, BCL2, BCL2A1, BIRC7(ML-IAP), HIF1A, C-MET, APE1, CDKN1A(p21), BRCA1 등 다수의 세포주기 및 사멸, 항-아폽토시스 유전자의 발현을 조절할 수 있다고 알려져있다(문헌[Garraway, Levi A., et al. "Integrative genomic analyses identify MITF as a lineage survival oncogene amplified in malignant melanoma."　Nature　436.7047 (2005): 117-122.], 문헌[Fontana, Fabrizio, et al. "Unraveling the molecular mechanisms and the potential chemopreventive/therapeutic properties of natural compounds in melanoma."　Seminars in Cancer Biology. Vol. 59. Academic Press, 2019.], 문헌[Seberg, Hannah E., Eric Van Otterloo, and Robert A. Cornell. "Beyond MITF: Multiple transcription factors directly regulate the cellular phenotype in melanocytes and melanoma."　Pigment cell & melanoma research　30.5 (2017): 454-466.], 문헌[Hartman, Mariusz L., and Malgorzata Czyz. "MITF in melanoma: mechanisms behind its expression and activity."　Cellular and Molecular Life Sciences　72.7 (2015): 1249-1260.] 등).

본 발명에서, 8-메톡시부틴은 MITF 단백질 활성 억제를 통해 MITF 단백질의 하위 종양 유전자의 발현을 효과적으로 조절함으로써 피부암 성장 억제 효능을 발휘할 수 있다(실시예 4).

본 발명에서, 흑색종 등 피부암은 암종 특이적인 바이오 마커에 의해 보다 세부적인 암종으로 진단 및 구별될 수 있으며, 본 발명에서 피부암은 바람직하게는 MITF 의존적 암일 수 있다. 상기 MITF 의존적 암은 정상 세포와 비교하여 MITF 단백질이 상대적으로 과발현되거나 또는 과활성된 암일 수 있다. 본 발명에서, 8-메톡시부틴이 MITF 단백질의 억제제임을 확인하였으므로(도 7 내지 도 10) 피부암 중에서 MITF 의존적 암에 대해 효과적인 항암 효능을 발휘할 수 있다.

본 발명에서, 8-메톡시부틴 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 조성물은 적용 분야에 따라 약학 조성물, 화장료 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다.

일 실시양태에서, 본 발명은 8-메톡시부틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학 조성물은 유효성분으로서 8-메톡시부틴 또는 이의 염외에도, 약학적으로 허용 가능한 1종 이상의 담체, 부형제, 희석제, 가용화제 등을 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있고, 가용화제로는 폴록사머 및 라브라솔 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여를 위한 적합하고 다양한 제형으로 존재할 수 있다. 본 발명에서, 경구 투여용 제형은 정제, 환제, 분말, 산제, 과립, 펠렛, 캡슐, 트로키, 로젠지, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 엘릭시르제 등을 포함할 수 있고, 비경구 투여용 제형은 주사제, 좌제, 호흡기 흡입제, 에어로졸제, 연고, 액제, 로션제, 패치제, 도포용 분말, 오일, 크림, 겔 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 약학 조성물은 제형에 따라 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 비경구 투여는 피부 도포 외에도 피하 투여, 피내 투여, 경피 투여, 모발 투여, 복강 투여, 직장 투여, 정맥 투여, 근육 투여, 흉부 투여 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 약학 조성물은 피부 외용제 형태로 피부에 도포되어 피부암 세포의 성장을 억제하면서 적용 부위의 정상 피부 세포를 보호하는 효능을 발휘할 수 있다.

상기 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 여기서, 약학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효한 양의 수준은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 건강상태, 질병의 정도, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

상기 약학 조성물은 1종 이상의 항-피부암 요법과 병용될 수 있다. 상기 항-피부암 요법은 피부암에 대해 실시되는 화학요법, 면역항암요법, 방사선요법, 수술, 나노의학, 또는 이들의 조합을 포함하며, 본 발명의 조성물 투여에 의해 피부암 치료 효과가 증진될 수 있는 요법이라면 그 종류 및 횟수가 특별히 제한되지 않는다.

상기 약학 조성물은 의약품 또는 의약외품 등으로 제품화될 수 있다.

일 실시양태에서, 본 발명은 8-메톡시부틴 또는 이의 화장품으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부암 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다. 상기 화장료 조성물은 피부 표피 세포 보호 효과 및 피부암 개선 효과를 가질 수 있다. 상기 화장료 조성물은 피부 외용제 형태로 피부에 도포되어 피부 조직 내 피부암 세포 성장을 억제하면서 적용 부위의 정상 피부 세포를 보호하는 효능을 발휘할 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물은 단독으로 또는 다른 피부 적용 제품과 함께 사용되어 정상 피부 표피 조직을 보호하면서도 피부암의 진행을 완화, 경감 또는 개선하는 효과를 발휘할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 8-메톡시부틴 또는 이의 화장품으로 허용가능한 염 이외에 화장품으로 허용 가능한 1종 이상의 첨가제 또는 담체를 더 포함할 수 있다.

상기 화장품으로 허용 가능한 첨가제는 8-메톡시부틴의 물리화학적 특성에 비추어 볼 때 8-메톡시부틴의 기능성을 해치지 않는 첨가제라면 당업계에 알려진 화장품 첨가제, 예컨대 충전제, 결합제, 붕해제, 윤활제, 현탁화제, 용제, 산화방지제, pH 조절제, 습윤제, 감미제 또는 보존제 등을 적절히 혼합하여 사용할 수 있다. 또한, 담체로서 당업계에 알려진 화장품 담체, 예컨대 겔화제, 활성제, 보존제, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 용매, 방향제, 충전제, 차단제, 안료, 흡취제 또는 염료 등을 적절히 혼합하여 사용할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 화장품으로 적용가능한 임의의 제형으로 제조될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 화장료 조성물은 패치, 마스크팩, 마스크시트, 유연화장수, 영양화장수, 수렴화장수, 영양크림, 마사지크림, 아이크림, 클렌징크림, 에센스, 아이에센스, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 선스크린, 립스틱, 비누, 샴푸, 계면활성제-함유 클렌 징, 입욕제, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 바디세정제, 염모제, 헤어토닉 등으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 화장료 조성물은 피부 세포를 보호하면서, 피부암 세포 성장을 특이적으로 억제하는 데에 적당한 용법, 용량을 투여될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 화장료 조성물은 피부 부위에 1일 1회 내지 3회의 주기로 적절한 부피를 취하여 도포에 의해 국부 투여될 수 있고 예컨대 1 주 이상, 4주 이상, 12주 이상, 또는 30 주 이상 투여될 수 있다. 투여횟수 및 투여주기는 피부암 진행 정도 및 함께 투여되는 성분의 투여방법 등에 따라 적절히 조절될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 사용자가 직접 피부에 도포하거나, 장치 또는 기구에 의해 피부에 도포될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 1종 이상의 피부암 개선 또는 완화용 성분과 병용될 수 있으며, 피부암에 대한 시술 또는 처치와 함께 또는 그 전후로 사용될 수 있다.

일 실시양태에서, 본 발명은 8-메톡시부틴 또는 이의 식품으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부암 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 식품 조성물은 건강식품, 건강기능식품, 음료, 식품 첨가제, 식품 보조제 등 모든 식품 형태를 포함하며, 동물에게 적용될 경우 사료를 포함한다. 상기 식품 조성물은 바람직하게는 건강기능식품일 수 있으며, 여기서 건강기능식품은 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 제조 및 가공한 식품을 의미한다.

본 발명에서, 피부 외용제는 피부 외용에 사용될 수 있는 제제를 모두 포함하며, 경고제, 로션제, 리니먼트제, 액제, 에어로졸제, 엑스제, 연고제, 유동엑스제, 유제, 현탁제, 크림제, 외용산제, 외용정제, 좌제 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<제조예>

8-메톡시부틴은 하기 과정을 통해 큰금계국 꽃에서 추출 및 분리된다. 큰금계국 꽃 건물 3 kg을 80% 메탄올 수용액에 24시간 담가서 실온에서 반복 추출하였다. 얻어진 여액을 40 ℃에서 감압농축하여 메탄올 추출물 (1.1 kg)을 얻었다. 얻어진 메탄올 추출물은 물 분획과 에틸아세테이트 (Ethyl acetate)분획으로 분배 추출하였고, 다시 물 분획을 부틸 알코올 (n-butyl alcohol) 로 분배 추출하였다. 에틸아세테이트 분획 (194 g)에 대하여 실리카겔 (silica gel) 컬럼크로마토그래피 (φ13 × 17 cm, CHCl₃-MeOH-H₂O = 32:3:1 → 12:3:1 → 9:3:1→ 6:4:1 비율 변경)를 실시하여 총 13개의 분획물을 얻었으며 반복적인 컬럼 크로마토그래피 실험을 통해 8-메톡시부틴을 분리하였다. 분리된 8-메톡시부틴은 NMR 분석을 통해 검정되었다.

<실험 재료 및 방법>

1. 피부암 세포 및 정상 표피 세포의 준비

피부암 세포는 흑색종 세포인 B16F10 세포주를 사용하였고, 정상 피부 표피 세포는 인간 각질세포(keratinocyte)인 HaCaT 세포를 사용하였다. 세포의 배양을 위해, 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)과 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)을 영양 공급원으로 사용하였으며, 37 ℃에 5%의 이산화탄소를 유지하는 배양기에서 배양하였다.

2. 항체

항체는 각각의 제조사로부터 구입하였고, 항-MITF (Abcam), 항-GAPDH (Bethyl) 등을 사용하였다.

3. CCK-8 실험

CCK-8(cell counting kit-8) 실험을 위해, 세포를 96구 세포 배양판에 1×10⁴ 개의 밀도로 분주하였다. 24 시간이 지난 후 배양액을 제거하고, 인산염 완충 식염수(phosphate-buffered saline; PBS)로 세척해서 남아있는 배양액을 제거해주었다. 그 후에 소태아혈청이 들어있지 않은 배양액에 8-메톡시부틴을 넣어 세포에 처리하고, 추가적으로 24 시간을 배양하였다. 24 시간 뒤에 CCK-8을 배양접시 별로 넣어주고 2시간 배양 후에 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 또한 시간에 따른 성장속도를 확인하기 위해 24시간, 48시간, 72시간동안 8-메톡시부틴을 처리한 후 성장속도를 확인하였다.

4. 콜로니 형성 분석

피부암 세포에 대한 콜로니 형성 분석(Colony formation assay) 실험을 위해, 세포를 6 개 구멍으로 된 배양 접시판에 1×10³ 개의 밀도로 분주하였다. 24 시간이 지난 후 배양액을 제거하고, 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척해서 남아있는 배양액을 제거해주었다. 그 후에 소태아혈청이 들어있지 않은 배양액에 8-메톡시부틴을 넣어 세포에 처리하고, 추가적으로 4 일간 배양하였다. 24시간 뒤에 0.5% 크리스탈 바이올렛(crystal violet)을 25% 메탄올에 녹여 배양접시 별로 넣어주고 1시간 후에 사진을 찍어 이미지를 생성하였고 ImageJ 프로그램으로 염색 부분을 측정하였다.

5. CNBr-bead conjugation assay

8-메톡시부틴과 MITF 단백질 간의 결합도 측정을 위해 CNBr-activated Sepharose 4B (Sigma)에 8-메톡시부틴을 결합시키고 8-메톡시부틴이 결합된 비드(bead)와 MITF 단백질을 함께 반응시켜 pull-down assay를 통해 MITF 단백질이 검출되는지 확인하였다.

6. 8-메톡시부틴과 MITF의 결합 예측을 위한 In silico 분석

8-메톡시부틴이 MITF의 어느 부분에 결합하는지 알아보기 위해 Autodock 및 Phymol 컴퓨터 예측 프로그램을 통해 결합 예측 부위와 결합 에너지를 측정하였다. MITF의 구조는 4ATH (resolution: 1.95 )을 사용하였다.

7. Biotinylated DNA pull-down assay

8-메톡시부틴이 MITF 전사 인자의 타겟 유전자에 대한 결합을 저해하는지 확인해보기 위해 biotinylated DNA pull down assay를 진행하였다. 전사 인자인 MITF 단백질의 타겟 DNA 부위인 E-Box 서열(서열번호 2) 및 돌연변이 E-Box 서열(서열번호 3)에 Biotin을 결합하였고, MITF 단백질과의 pull-down assay를 통해 8-메톡시부틴의 존재 여부가 MITF와 유전자의 결합에 영향을 미치는지 조사하였다.

8. RNA 추출, cDNA 합성, RT-PCR 및 정량적 real-time PCR

전체 RNA는 각각의 세포로부터 TRI 시약(Molecular Research Center)을 사용하여 추출하였다. 추출한 RNA는 ImProm-II™ Reverse Transcription System (Promega)를 통해 역전사하였다. StepOnePlus™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems)을 이용하여 측정하였다.

9. 웨스턴 블롯팅

전체 단백질은 각각의 세포로부터 용해 버퍼를 사용하여 추출하였다. 추출한 단백질은 브래드포드(Bradford) 시약을 이용한 정량분석을 통해 동일한 양으로 정량하여 웨스턴 블롯팅을 진행하였다. 얻은 결과는 ImageJ 프로그램을 통해 단백질의 양을 측정하였다.

<실시예>

실시예 1. 8-메톡시부틴의 피부암 세포 성장 억제 효능

8-메톡시부틴의 피부암 세포 성장 억제 효능을 측정하기 위해, 흑색종 세포인 B16F10 세포주를 대상으로 CCK-8 분석 및 콜로니 형성 분석을 실시하였다.

CCK-8 assay 결과, 8-메톡시부틴을 농도 의존적으로 세포에 처리한 경우 대조군과 대비하여 피부암 세포의 성장이 억제됨을 확인하였다(도 1). 처리 시간에 따른 세포 성장 억제 효과를 측정한 경우에도 역시 8-메톡시부틴은 피부암 세포의 성장을 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다(도 2).

콜로니 형성 분석 결과, 8-메톡시부틴을 다양한 농도로 피부암 세포에 처리하였을 때 피부암 세포의 성장이 효과적으로 억제됨을 확인하였다(도 3 및 도 4).

실시예 2. 8-메톡시부틴의 정상 피부 세포 보호 효능

8-메톡시부틴이 정상 피부 조직에 미치는 영향을 확인하기 위해, 정상 피부 표피 세포에 해당하는 각질세포(HaCaT)에 대해 CCK-8 분석 및 콜로니 형성 분석을 실시하였다.

그 결과, 8-메톡시부틴을 농도 의존적 및 시간별로 세포에 처리하였을 때 정상 피부 세포는 사멸되지 않았으며, 오히려 세포 성장을 촉진시켜 피부 보호 효과를 나타냄을 확인하였다(도 5 및 도 6).

실시예 3. 8-메톡시부틴의 MITF 활성 억제 효능

상술한 실시예에서 확인된 8-메톡시부틴의 피부암 특이적 성장 억제 효능을 보다 구체적으로 조사한 결과, 8-메톡시부틴은 흑색종 세포에서 발암 유전자들의 핵심적인 발현 조절 인자로 알려진 MITF 단백질과 직접 결합하여 MITF 단백질의 활성을 억제함을 확인하였다.

구체적으로, 8-메톡시부틴이 MITF 단백질과 직접 결합하는지 살펴보기 위해 CNBr-bead conjugation assay를 실시한 결과, 8-메톡시부틴은 MITF 단백질과 직접 결합할 수 있음을 확인하였다(도 7). 상기 결과는 MITF 단백질과 8-메톡시부틴의 상호작용에 관한 in silico 분석을 통해 추가로 지지되며, 8-메톡시부틴의 MITF 단백질 내 결합 부위는 MITF 단백질의 표적 DNA와의 결합을 조절하는 데에 관련된 leucine kink 부위의 Gln261, Leu257, Arg259로 예측되었다(도 8 및 도 9).

또한, 8-메톡시부틴이 실제로 MITF 단백질과 그 표적 DNA 간 결합을 억제하는지 확인하기 위해 MITF 단백질의 타겟 유전자의 E-Box 부위에 바이오틴을 결합시킨 염기서열을 제작하고, MITF와의 결합 정도가 8-메톡시부틴 처리 유무에 따라 변하는지 확인하였다. 그 결과, 8-메톡시부틴 처리시 MITF와 그 타겟 도메인인 E-box 부위 유전자의 결합 정도가 감소하여, 8-메톡시부틴이 MITF 단백질의 활성을 직접적으로 억제할 수 있음을 확인하였다(도 10).

실시예 4. 8-메톡시부틴의 피부암 유전자 발현 조절 효능

MITF 단백질의 활성 억제제로 확인된 8-메톡시부틴이 실제로 흑색종에서 MITF 단백질의 하위 발암 유전자들의 발현을 조절할 수 있는지 측정하기 위해, 유전자 발현 및 단백질 양을 측정하였다. 구체적으로, B16F10 세포주에 α-MSH (100 nM)를 처리하여 MITF 단백질의 신호전달 경로를 활성화시켰으며 8-메톡시부틴 처리군과 비교군 샘플에서의 MITF 및 하위 발암 유전자의 발현량을 웨스턴 블롯팅을 통해 확인하였다.

그 결과, MSH 처리 후 48 시간동안 세포 배양을 진행하였을 때 MITF 하위 조절 유전자들의 발현이 가장 증가하였고, 8-메톡시부틴을 처리한 샘플에서 MITF의 하위 유전자들의 발현이 유의미하게 감소됨을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 피부암 예방, 치료 또는 개선용 조성물.
   [화학식 1]
   
2. 제 1 항에 있어서, 화학식 1로 표시되는 화합물은 천연물에서 유래하거나 또는 화학적으로 합성된 것인 조성물.
3. 제 1 항에 있어서, 피부암은 기저 세포 암종, 피부 편평 세포 암종 및 흑색종으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 조성물.
4. 제 3 항에 있어서, 피부암 세포의 성장을 특이적으로 억제하는 것인 조성물.
5. 제 3 항에 있어서, 정상 피부 표피 세포 보호 효과를 갖는 조성물.
6. 제 5 항에 있어서, 정상 피부 표피 세포는 각질세포인 조성물.
7. 제 3 항에 있어서, 화학식 1로 표시되는 화합물은 MITF 단백질 활성 억제 효과를 갖는 것인 조성물.
8. 제 7 항에 있어서, 피부암은 MITF 단백질 의존적 암인 조성물.
9. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 피부암 개선용 피부 외용제.
   [화학식 1]
   
10. 제 9 항에 있어서, 정상 피부 표피 세포 보호 효과를 갖는 피부 외용제.