KR20240011630A - 신규 칼콘 유도체 및 이를 포함하는 아디포사이토카인감소 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

신규 칼콘 유도체 및 이를 포함하는 아디포사이토카인감소 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDF

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노민수
안명환
안성진
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Abstract

본 발명은 신규 칼콘(chalcone) 유도체 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 및 건강기능식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 상기 신규 칼콘 유도체 화합물은 전사-조절 핵 수용체(Transcription-regulating nuclear receptor)인 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체 감마(peroxisome proliferator activated receptor gamma, PPARγ) 및 글루코코르티코이드 수용체(glucocorticoid receptor, GR)에 대한 효능제(agonist)로 작용하여 PPARγ 및 GR를 동시에 조절할 수 있는 이중 조절제(dual modulator)로 기능하는 이점이 있다. 이에 다중약리학적 특성(polypharmacological profile)을 발휘함으로써, 아디포넥틴(adiponectin) 및 렙틴(leptin)과 같은 아디포사이토카인(adipocytokine)의 생성 촉진 활성이 상당히 우수하여 아디포사이토카인 감소 관련 질환의 예방, 개선 및/또는 치료 효능이 탁월하여, 약학적 조성물 및 건강기능식품 등으로 효과적으로 활용될 수 있다.

Description

신규 칼콘 유도체 및 이를 포함하는 아디포사이토카인 감소 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물{Novel chalcone analogs and composition for preventing, ameliorating or treating adipocytokine reduction-related diseases containing the same}
본 발명은 신규 칼콘 유도체에 관한 것이며, 상기 신규 칼콘 유도체를 유효성분으로 포함하는 아디포사이토카인 감소 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
정상적인 지방 조직의 지방 세포는 근육, 간 및 뇌를 포함한 다른 조직과 지방 사이의 대사 누화(metabolic crosstalk)를 조절할 수 있는 다양한 아디포사이토카인(adipocytokine)을 생성한다. 아디포사이토카인은 지방조직에서 분비되는 단백질로, 자가분비(autocrine), 근거리 분비(paracrine) 및 호르몬 작용을 통해 생체 내 대사 항상성 조절에 중요한 역할을 수행한다. 아디포사이토카인은 골격근, 간, 신경계 등 다양한 장기에 작용하며, 대표적인 예로써 아디포넥틴(adiponectin)과 렙틴(leptin)이 존재한다.
아디포넥틴은 생체 내에서 지질대사 및 당대사 등을 조절하며, 인슐린 감수성을 높이고 항염 효과를 나타낸다. 렙틴은 시상하부에서 음식 섭취 및 에너지 균형을 조절하며, 지방조직 및 간에서 지방산의 산화를 직접적으로 촉진시킨다. 아디포넥틴 및 렙틴의 유전적 다형성(genetic polymorphism) 또는 유전자 결핍은 다양한 대사성 질환과 관련이 높은 것으로 알려져 있다. 정상인에 비하여 지방이영양증(lipodystrophy) 환자의 경우, 혈중 아디포사이토카인 농도가 상대적으로 낮은 것으로 알려져 있으며, 이러한 아디포넥틴 및 렙틴의 결핍은 심각한 인슐린 저항성과 대사 합병증을 유발할 수 있다.
이에, 지방세포에서 아디포넥틴 및/또는 렙틴의 생성을 증가시켜줄 수 있는 화합물의 경우, 당뇨, 비만, 비알콜성 간질환 등의 다양한 대사성 질환에 대한 치료 효능을 나타내는 새로운 치료제가 될 것으로 여겨지고 있다.
생체 내 지방조직에서 아디포넥틴 및 렙틴의 분비는 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체(peroxisome proliferator activated receptor, PPAR), 글루코코르티코이드 수용체(glucocorticoid receptor, GR), 간 X 수용체(liver X receptor, LXR), 레티노이드 X 수용체(retinoid X receptor, RXR), 에스트로겐 수용체(estrogen receptor, ER) 등과 같은 다양한 전사-조절 핵 수용체(Transcription-regulating nuclear receptor)에 의해 조절되며, 이들 핵수용체를 타겟으로 하는 의약품에 대한 연구 개발의 필요성이 대두되고 있다. 특히 최근에는 대사질환을 통합적으로 조절하기 위하여 다중약리학적(polypharmacological)인 관점에서 단일 타겟이 아닌 다중 타겟을 동시에 조절할 수 있는 PPAR 이중조절제 또는 PPAR 다중조절제 등에 대한 연구 개발의 필요성이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
KR 10-2093247 B1
본 발명은 상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여, 아디포사이토카인(adipocytokine) 생성 촉진 활성을 갖는 신규 칼콘(chalcone) 유도체를 제공하는 것을 주된 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 칼콘 유도체를 유효성분으로 포함하는 아디포사이토카인 감소 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 다른 하나의 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 칼콘 유도체를 유효성분으로 포함하는 아디포사이토카인 감소 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것을 다른 하나의 목적으로 한다.
본 발명의 목적은 상기의 기재에 국한되지 않으며 본 발명을 활용하여 적절한 효과를 얻을 수 있는 모든 경우를 목적으로 하여 제공된다.
본 발명자들은 아디포사이토카인의 비정상적인 조절(생성 및 분비)에 의한 대사성 질환 및 대사염증질환 등 관련 질환 치료제를 제조하기 위하여, 꿀풀과(Lamiaceae)에 속하는 식물 중 하나인 포고스테몬 헤이니누스(Pogostemon heyneanus)로부터 신규 칼콘 유도체인 (E)-4-히드록시-3-(3-(4-히드록시-3-메톡시페닐)아크릴로일)-6-메틸-2H-피란-2-온((E)-4-hydroxy-3-(3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)acryloyl)-6-methyl-2H-pyran-2-one)(화합물 1)을 분리하여 연구하였으며, 인간골수중간엽줄기세포(human bone marrow mesenchymal stem cells, hBM-MSC)를 이용한 실험을 통하여 상기 신규 칼콘 유도체의 아디포넥틴(adiponectin) 및 렙틴(leptin) 생성 촉진 활성을 규명하였다.
또한, 상기 신규 칼콘 유도체 화합물 1을 합성을 통해 제조하고, 상기 화합물 1과 구조적으로 유사한 신규 칼콘 유도체(화합물 2 내지 16)를 합성하여 이들의 아디포넥틴 및 렙틴 생성 촉진 활성을 규명하였으며, 상기 신규 칼콘 유도체 화합물 1 내지 16이 전사-조절 핵 수용체(Transcription-regulating nuclear receptor)인 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체 감마(peroxisome proliferator activated receptor gamma, PPARγ) 및 글루코코르티코이드 수용체(glucocorticoid receptor, GR)에 대한 효능제(agonist)로 작용하여 PPARγ 및 GR를 동시에 조절할 수 있는 이중 조절제(dual modulator)로 기능할 수 있음을 규명함으로써, 다중약리학적 특성(polypharmacological profile)을 갖는 신규 칼콘 유도체 화합물 1 내지 16 및 이의 용도에 관한 본 발명을 완성하였다.
이하에서, 본 발명에 대하여 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 구체적인 일 양태로, 하기 [화학식 a] 또는 [화학식 b]로 표시되는 칼콘(chalcone) 유도체 화합물을 제공한다:
[화학식 a]
[화학식 b]
상기 R4는 , , , , , 및 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이다.
본 발명의 구체적인 일 양태에서, 상기 [화학식 a] 또는 [화학식 b]로 표시되는 칼콘 유도체 화합물은 하기 [화학식 1] 내지 [화학식 16]으로 표시되는 화합물 1 내지 16 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다:
본 발명의 상기 [화학식 1] 내지 [화학식 16]으로 표시되는 신규 칼콘 유도체 화합물 1 내지 16은 하기 [반응식 1]에 개략적으로 도시한 합성과정을 통하여 제조될 수 있다.
[반응식 1]
본 발명의 상기 [화학식 1]로 표시되는 신규 칼콘 유도체 화합물 1은 상기 [반응식 1]에 따른 합성과정을 통하여 제조될 수 있으며, 또한, 꿀풀과(Lamiaceae)에 속하는 식물인 포고스테몬 헤이니누스(Pogostemon heyneanus)로부터 자연적으로 분리하여 수득할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 꿀풀과(Lamiaceae)에 속하는 식물인 포고스테몬 헤이니누스(Pogostemon heyneanus)로부터 자연적으로 분리한 신규 칼콘 유도체 화합물 1 및 합성을 통하여 제조한 신규 칼콘 유도체 화합물 1에 대하여, 인간골수중간엽줄기세포(human bone marrow mesenchymal stem cells, hBM-MSC)를 이용한 실험을 통하여 아디포사이토카인(adipocytokine), 보다 구체적으로 아디포넥틴(adiponectin) 및 렙틴(leptin) 생성 촉진 활성을 규명하였으며, 상기 신규 칼콘 유도체 화합물 1을 비롯한, 이와 구조적으로 유사한 신규 칼콘 유도체(화합물 2 내지 16)를 합성하여 이들의 아디포넥틴 및 렙틴 생성 촉진 활성을 규명하였다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 자연적으로 분리한 신규 칼콘 유도체 화합물 1 및 합성을 통하여 제조한 신규 칼콘 유도체 화합물 1에 대한 실험 결과를 비교하기 위하여, 해당 실시예에 한하여 자연적으로 분리한 상기 칼콘 유도체 화합물 1을 "GPL3A04"로 표기하여 구분하였으나, 상기 화합물 1은 그 제조방법 또는 수득방법과 무관하게 [화학식 1]의 구조로 표시되는 화합물이라면 본 발명의 신규 칼콘 유도체 화합물 1에 속하는 것으로 해석되어야 한다.
또한, 상기 신규 칼콘 유도체 화합물 1 내지 16이 핵 수용체인 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체 감마(peroxisome proliferator activated receptor gamma, PPARγ) 및 글루코코르티코이드 수용체(glucocorticoid receptor, GR)에 대한 효능제(agonist)로 작용하여 PPARγ 및 GR를 동시에 조절할 수 있는 이중 조절제(dual modulator)로 기능할 수 있음을 규명함으로써, 신규 칼콘 유도체 화합물 1 내지 16의 다중약리학적 특성(polypharmacological profile)을 확인하고, 이의 아디포사이토카인 감소 관련 질환에 대한 예방, 개선 및/또는 치료 효능을 규명하였다.
본 발명의 구체적인 일 양태에서, 상기 [화학식 b]로 표시되는 칼콘 유도체 화합물은 상기 [화학식 10]으로 표시되는 신규 칼콘 유도체 화합물 10, 또는 [화학식 11]로 표시되는 신규 칼콘 유도체 화합물 11일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 화합물 10 및 11은 본 발명의 상기 신규 칼콘 유도체 화합물 1 내지 16 중, 아디포사이토카인 생성 촉진 활성이 가장 우수하게 나타났다.
본 발명에서, 아디포사이토카인(adipocytokine), 아디포넥틴(adiponectin) 및/또는 렙틴(leptin)의 생성을 촉진한다는 의미는, 지방세포로부터의 생합성 및/또는 분비를 촉진하거나 자극하는 등, 아디포사이토카인, 아디포넥틴 및/또는 렙틴의 수준(level)이 증가되는 것을 모두 포함하는 개념일 수 있다.
본 발명은 또 다른 구체적인 일 양태로, 상기 [화학식 1] 내지 [화학식 16]으로 표시되는 신규 칼콘 유도체 화합물 1 내지 16, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 아디포사이토카인 감소 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 약학적으로 허용 가능한 염은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있는 것으로, 양이온과 음이온이 정전기적 인력에 의해 결합하고 있는 물질인 염 중에서도 약제학적으로 사용될 수 있는 형태의 염을 의미하며, 통상적으로 금속염, 유기 염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염 등이 될 수 있다. 예를 들면, 염산, 브롬화수소, 황산, 황산수소나트륨, 인산, 탄산 등의 무기산과의 염, 또는 개미산, 초산, 옥살산, 벤조산, 시트르산, 타르타르산, 글루콘산, 게스티스산, 푸마르산, 락토비온산, 살리실릭산 또는 아세틸살리실릭산(아스피린)과 같은 유기산과 함께 산의 염을 형성하거나, 또는 나트륨, 칼륨 등의 알칼리금속이온과 반응하여 이들의 금속염을 형성하거나, 또는 암모늄 이온과 반응하여 또 다른 형태의 약제학적으로 허용 가능한 염을 형성하는 것을 의미한다. 상기 약학적으로 허용 가능한 염의 비제한적인 예로, 염산염, 브롬산염, 황산염, 인산염, 구연산염, 아세트산염, 트리플루오로아세트산염, 젖산염, 주석산염, 말레인산염, 푸마린산염, 글루콘산염, 메탄설폰산염, 글리콘산염, 숙신산염, 4-톨루엔설폰산염, 글루투론산염, 엠본산염, 글루탐산염, 아스파트산염 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서 상기 아디포사이토카인 감소 관련 질환은 지방세포로부터 아디포사이토카인의 생합성 및/또는 분비의 촉진이나 자극 등이 감소하여 아디포사이토카인, 예를 들어 아디포넥틴 및/또는 렙틴 등의 수준이 감소됨으로써 유발되는 관련 질환을 모두 포함하는 개념일 수 있다. 상기 아디포사이토카인 감소 관련 질환의 비제한적인 예로, 대사성 질환, 대사성 염증질환, 심혈관 질환, 암 등이 포함될 수 있으며, 보다 구체적인 비제한적인 예로, 당뇨병, 비만, 지질이영양증(lipodystrophy), 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, NASH), 인슐린 저항성(insulin resistance), 고혈당증(hyperglycemia), 고케톤혈증(hyperketonemia), 고혈압, 암, 피부염 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서 "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 대사성 질환을 억제시키거나 이의 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 대사성 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 "유효성분으로 포함"은 원하는 생물학적 효과를 실현하는데 필요하거나 또는 충분한 양으로 해당 성분이 포함되는 것을 의미한다. 실제 적용에 있어서 유효 성분으로 포함되는 양의 결정은 대상 질병을 치료하기 위한 양으로서, 다른 독성을 야기하지 않는 사항을 고려해서 결정될 수 있으며, 예를 들어 치료되는 질병 또는 병태, 투여되는 조성물의 형태, 피험체의 크기, 또는 질병 또는 병태의 심각도 등과 같은 다양한 인자에 따라서 변화될 수 있다. 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술을 지닌 기술자라면 과도한 실험을 동반하지 않고 개별적 조성물의 유효량을 경험적으로 결정할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 상술한 플라보노이드 유도체를 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.
상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다.
또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있다.
본 발명은 또 다른 구체적인 일 양태로, 상기 [화학식 1] 내지 [화학식 16]으로 표시되는 신규 칼콘 유도체 화합물 1 내지 16, 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 아디포사이토카인 감소 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 식품학적으로 허용 가능한 염은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있는 것으로, 양이온과 음이온이 정전기적 인력에 의해 결합하고 있는 물질인 염 중에서도 식품학적으로 사용될 수 있는 형태의 염을 의미하며, 그 종류에 대한 구체적인 예는 상술한 약학적으로 허용 가능한 염의 예를 포함한다.
본 발명에서 건강기능식품(health functional food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품, 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공되어 의학적 및/또는 의료효과가 높은 식품 등을 모두 포함하는 개념일 수 있다. 경우에 따라, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU), 기능성식품, 건강식품, 건강보조식품 등의 용어와 혼용 가능하다.
본 발명에서 달리 정의되지 않은 용어들은 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것으로 해석한다. 또한, 본 발명에 기재된 "또는" 이라는 표현은 별도의 언급이 없는 경우, "및"을 포함하는 개념으로 해석될 수 있다.
본 발명에서 개시되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한되지 않으며, 본 발명에서 개시되는 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시되는 다양한 요소들의 모든 가능한 조합이 본 발명의 범주에 속하는 것으로 해석된다. 또한, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험을 통하여 본 발명의 특정 실시예에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있으며, 이러한 등가물은 본 발명의 범주에 속하는 것으로 해석된다.
본 발명은 신규 칼콘(chalcone) 유도체 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 및 건강기능식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 상기 신규 칼콘 유도체 화합물은 전사-조절 핵 수용체(Transcription-regulating nuclear receptor)인 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체 감마(peroxisome proliferator activated receptor gamma, PPARγ) 및 글루코코르티코이드 수용체(glucocorticoid receptor, GR)에 대한 효능제(agonist)로 작용하여 PPARγ 및 GR를 동시에 조절할 수 있는 이중 조절제(dual modulator)로 기능하는 이점이 있다. 이에 다중약리학적 특성(polypharmacological profile)을 발휘함으로써, 아디포넥틴(adiponectin) 및 렙틴(leptin)과 같은 아디포사이토카인(adipocytokine)의 생성 촉진 활성이 상당히 우수하여, 아디포사이토카인 감소 관련 질환의 예방, 개선 및/또는 치료를 위한 약학적 조성물 및 건강기능식품 등으로 효과적으로 활용될 수 있다.
도 1은 포고스테몬 헤이니누스(Pogostemon heyneanus)로부터 자연적으로 분리된 신규 칼콘(chalcone) 유도체 화합물 1 ("GPL3A04"로 표기)과 이의 합성 유도체 화합물인 신규 칼콘 유도체 화합물 1 ("1"로 표기)의 아디포사이토카인(adipocytokine) 생합성-촉진 활성을 확인한 실험 결과를 나타낸 것이다. 도 1a는 아디포넥틴(adiponectin) 생합성-촉진 활성 평가 결과, 도 1b는 오일 레드 오(Oil Red O, ORO) 및 헤마톡실린(hematoxylin) 염색 결과, 도 1c는 상대적 오일 레드 오 염색 정량 결과, 도 1d는 렙틴(leptin) 생합성-촉진 활성 평가 결과를 나타낸 것이다(n=3, 평균±SD, *p≤0.05, #p≤0.05, **p≤0.01).
도 2는 본 발명의 신규 칼콘 유도체 화합물 10 및 11의 아디포사이토카인 생합성-촉진 활성에 대한 농도-효과 분석 결과를 나타낸 그래프이다. 도 2a는 아디포넥틴 생합성-촉진 활성에 대한 농도-효과 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 2b는 렙틴 생합성-촉진 활성에 대한 농도-효과 분석 결과를 나타낸 것이다(n=3, 평균±SD).
도 3은 본 발명의 신규 칼콘 유도체 화합물 10 및 11의 타겟 규명 실험 결과를 나타낸 그래프이다. 도 3a는 핵 수용체(PPARα, PPARγ, PPARδ 및 GR)에 대한 경쟁적 방사선 리간드 결합 분석 결과, 도 3b는 GR에 대한 농도-의존적 결합 활성 분석 결과, 도 3c는 PPARγ에 대한 농도-의존적 결합 활성 분석 결과, 도 3d는 CDK 복합체에 대한 γ-32P-ATP 혼입 측정을 통한 키나아제 활성 억제 분석 결과를 나타낸 것이다(n=3, 평균±SD, *p≤0.05, **p≤0.01).
도 4는 본 발명의 신규 칼콘 유도체 화합물 10 및 11이 PPARγ 및 GR의 완전 효능제로 작용하는 지 여부를 실험한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 4a 및 4b는 PPARγ 효능제로 피오글리타존(pioglitazone, Pio) 및 PPARγ 길항제로 T0070907를 처리하였을 때의 아디포넥틴 생성-촉진 활성 분석 결과, 도 4c 및 4d는 GR 효능제로 덱타메타손(dexamethasone, Dexa) 및 GR 길항제로 미페프리스톤(mifepristone)을 처리하였을 때의 렙틴 생성-촉진 활성 분석 결과를 나타낸 것이다(n=4, 평균±SD).
도 5는 본 발명의 신규 칼콘 유도체 화합물 11과 PPARγ 및 GR의 결합 형태를 분자 모델링을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다. 도 5a는 PPARγ 및 피오글리타존(pioglitazone)의 최적화 결합 모드, 도 5b는 PPARγ 및 화합물 11의 최적화 결합 모드, 도c는 GR 및 덱사메타손(dexamethasone)의 최적화 결합 모드, 5d는 GR 및 화합물 11의 최적화 결합 모드를 나타낸 것이다.
도 6은 스트렙토조토신(streptozotocin, STZ)-유도 당뇨병 마우스 모델에 대한 본 발명의 신규 칼콘 유도체 화합물 11의 항당뇨 효과를 확인한 실험 결과를 나타낸 것이다. 도 6a는 매일 투여 2일째 투여일에서, 투여 전(0h), 투여 1시간 후(1h), 및 투여 4시간 후(4h)의 혈청 당(serum glucose) 수준 측정 결과(n=7, 평균±SD, **p≤0.01), 도 6b는 매일 투여 5일째 투여일에 측정한 혈청 젖산(serum lactate) 수준 측정 결과(n=7, 평균±SD, *p≤0.05, **p≤0.01), 도 6c는 매일 투여 5일째 투여일에 측정한 혈청 아디포넥틴(serum adiponectin) 수준 측정 결과를 나타낸 것이다(n=4 (25 mg/kg 화합물 11 처리군), n=7 (그 밖의 다른 처리군), 평균±SD, *p≤0.05).
이하, 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 예시에 불과하며, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 어떠한 의미로든 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.
[합성예]
본 발명에 따른 [화학식 1] 내지 [화학식 16]으로 표시되는 신규 칼콘(chalcone) 유도체 화합물 1 내지 16은 다음과 같다:
화합물 1: (E)-4-히드록시-3-(3-(4-히드록시-3-메톡시페닐)아크릴로일)-6-메틸-2H-피란-2-온 [화학식 1]
화합물 2: (E)-3-(3-(3,4-디히드록시페닐)아크릴로일)-4-히드록시-6-메틸-2H-피란-2-온 [화학식 2]
화합물 3: (E)-3-(3-(3,4-디메톡시페닐)아크릴로일)-4-히드록시-6-메틸-2H-피란-2-온 [화학식 3]
화합물 4: (E)-3-신나모일-4-히드록시-6-메틸-2H-피란-2-온 [화학식 4]
화합물 5: (E)-3-(3-(3,4-디메틸페닐)아크릴로일)-4-히드록시-6-메틸-2H-피란-2-온 [화학식 5]
화합물 6: (E)-3-(3-(4-플루오로-3-메톡시페닐)아크릴로일)-4-하이드록시-6-메틸-2H-피란-2-온 [화학식 6]
화합물 7: (E)-3-(3-(4-플루오로페닐)아크릴로일)-4-히드록시-6-메틸-2H-피란-2-온 [화학식 7]
화합물 8: (E)-3-(3-(3,4-디플루오로페닐)아크릴로일)-4-히드록시-6-메틸-2H-피란-2-온 [화학식 8]
화합물 9: (E)-3-(3-(3,5-디플루오로페닐)아크릴로일)-4-히드록시-6-메틸-2H-피란-2-온 [화학식 9]
화합물 10: (E)-4-히드록시-6-메틸-3-(3-(피리딘-4-일)아크릴로일)-2H-피란-2-온 [화학식 10]
화합물 11: (E)-3-(3-(2-플루오로피리딘-4-일)아크릴로일)-4-하이드록시-6-메틸-2H-피란-2-온 [화학식 11]
화합물 12: (E)-4-히드록시-6-메틸-3-(3-(피리딘-2-일)아크릴로일)-2H-피란-2-온 [화학식 12]
화합물 13: (E)-3-(3-(1H-인돌-3-일)아크릴로일)-4-히드록시-6-메틸-2H-피란-2-온 [화학식 13]
화합물 14: (E)-4-히드록시-6-메틸-3-(3-(티오펜-3-일)아크릴로일)-2H-피란-2-온 [화학식 14]
화합물 15: (E)-3-(3-(푸란-3-일)아크릴로일)-4-히드록시-6-메틸-2H-피란-2-온 [화학식 15]
화합물 16: (E)-3-(3-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)아크릴로일)-4-히드록시-6-메틸-2H-피란-2-온 [화학식 16]
1. 시약 및 방법
반응에 사용된 모든 화학물질과 용매는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), TCI 및 아크로스(Acros)에서 구입했으며 추가 정제 없이 사용하였다. 반응 진행 과정은 실리카겔 60F254 (Merck; Darmstadt, Germany)로 미리 코팅된 실리카겔 플레이트에서 박막 크로마토그래피(TLC)로 모니터링하고, 검출 목적을 위해 UV254 빛 및/또는 KMnO4 염색으로 발색시켜서 시각화하였다.
컬럼 크로마토그래피는 실리카겔(실리카겔 60; 230-400 메쉬 ASTM, Merck, Darmstadt, Germany)에서 수행하였다. 핵자기 공명(NMR) 스펙트럼은 실온에서 BRUKER BioSpin AVANCE 300 MHz NMR (1H, 300 MHz; 13C, 75 MHz) 또는 Bruker UltraShield 600MHz Plus (1H, 600MHz; 13C, 150MHz) 분광계로 기록되었다.
모든 화학적 이동은 백만분율(ppm)로 기록되었으며, 테트라메틸실란(tetramethylsilane)(δ = 0)으로부터 샘플이 분석된 용매(CDCl3: δ7.26 for 1H NMR, δ77.0 for 13C NMR; DMSO-d 6 : δ2.50 for 1H NMR, δ39.52 for 13C NMR)에 대하여 상대적으로 측정되었다.
1H NMR 이동값은 chemical shift(δ), corresponding integral, multiplicity(s = singlet, br = broad, d = doublet, t = triplet, q = quartet, m = multiplet, dd = doublet of doublets, td = triplet of doublets, qd = quartet of doublets), coupling constant(J in Hz) 및 assignments로 기록되었다. 고해상도 질량 스펙트럼(HRMS)은 Agilent 6530 Accurate Mass Q-TOF LC/MS 분광계로 기록되었다.
최종 화합물의 녹는점은 Linkam THMS600 variable temperature stage (Linkam Instruments, Tadworth, U.K.)를 Nikon DS-Fi1 카메라 및 Nikon NIS-Elements BR 소프트웨어(버전 4.00.06) 및 Linksys 32 소프트웨어 데이터 캡처 시스템(Linkam Instruments, Tadworth, U.K)이 장착된 NIKON Eclipse LV100POL (NIKON, NY, USA) 편광 광학 현미경과 함께 사용하여 핫 스테이지 현미경(hot stage microscopy)으로 측정하였다.
최종 화합물의 순도는 C18 컬럼(Phenomenex, 150 mm Х 4.6 mm, 3 μm, 110 Å)이 있는 Agilent 1260 Infinity (Agilent)에서 분석용 RP-HPLC로 측정되었다. RP-HPLC는 다음과 같은 등용매 조건을 사용하여 두 가지 다른 용매 시스템에서 수행되었다: 방법(method) A 이동상은 아세토니트릴(ACN) 및 물(50:50, v/v, 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)); 방법 B 이동상은 아세토니트릴 및 물(40:60, v/v, 0.1% 트리플루오로아세트산); 방법 C 이동상은 아세토니트릴 및 물(30:70, v/v, 0.1% 트리플루오로아세트산); 방법 D 이동상은 아세토니트릴 및 물(15:85, v/v, 0.1% 트리플루오로아세트산); 방법 E 이동상은 메탄올(MeOH) 및 물(70:30, v/v, 0.1% 포름산(FA)); 방법 F 이동상은 메탄올 및 물(65:35, v/v, 0.1% 포름산); 방법 G 이동상은 메탄올 및 물(60:40, v/v, 0.1% 포름산); 방법 H 이동상은 메탄올 및 물(50:50, v/v, 0.1% 포름산); 방법 I 이동상은 메탄올 및 물(30:70, v/v, 0.1% 포름산).
모든 화합물은 1.0 mL/min (방법 A 내지 D) 또는 0.7 mL/min (방법 E 내지 I)의 유속으로 용출되었고, UV 검출기(254 nm)를 사용하여 모니터링되었다. 모든 화합물은 RP-HPLC에 의한 순도가 > 97%이다.
2. 디하이드로아세트산(dehydroacetic acid) 및 알데하이드(aldehyde)로부터 신규 칼콘 유도체(chalcone analog)를 합성하는 방법
본 발명의 상기 신규 칼콘 유도체 화합물 1 내지 화합물 16은 다음과 같은 방법으로 합성하였다. 구체적으로, 클로로포름(chloroform)(25 mL) 중의 디하이드로아세트산(dehydroacetic acid)(0.01 mol, 1.68 g)의 용액에 적절한 알데하이드(aldehyde)(0.01 mol, 1 eq) 및 피페리딘(piperidine)(0.008 mol, 0.8 eq)을 첨가하였다. TLC 분석이 완전한 전환을 나타낼 때까지 작용 혼합물을 환류 하에 80℃에서 5시간 내지 21시간 동안 교반하였다. 그 다음, 침전물을 여과하고 에탄올 및 에테르(ether)로 여러 번 세척하였다. 여액을 적절한 용매(클로로포름, 에탄올, 에테르)로부터 결정화하여 화합물 1 내지 16을 수득하였다.
상기 방법에 따른 본 발명의 신규 칼콘 유도체 화합물 1 내지 16의 합성 과정을 하기 반응식 1에 개략적으로 도시하였다.
[반응식 1]
합성예 1: (E)-4-Hydroxy-3-(3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)acryloyl)-6-methyl-2H-pyran-2-one (화합물 1)
상기 합성 방법에 따라 다음과 같은 조건으로 합성을 수행하여, 수율 68%의 노란색 분말(Yellow powder) 형태로 화합물 1을 수득하였다.
1) 알데하이드: 4-하이드록시-3-메톡시벤즈알데하이드(4-Hydroxy-3-methoxybenzaldehyde),
2) 반응시간: 8시간,
3) 결정화 용매(Crystallization solvent): 클로로포름,
Rf = 0.21 (Hexane/EtOAc = 3:2), m.p: 250-252℃, 1H NMR (600 MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.95 (s, 1H), 8.02 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.90 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.30 - 7.21 (m, 2H), 6.87 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.26 (s, 1H), 3.82 (s, 3H), 2.26 (s, 3H); 13C NMR (75 MHz, DMSO-d 6 ): δ 191.95, 151.18, 148.45, 147.29, 126.33, 124.19, 119.43, 116.53, 113.10, 102.56, 56.11, 20.51; HRMS m/z calculated for C16H14O6 [M + H]+: 303.0863, found: 303.0811; > 97% purity (as determined by RP-HPLC, method B, tR = 10.53 min, method G, tR = 11.56 min).
합성예 2: (E)-3-(3-(3,4-Dihydroxyphenyl)acryloyl)-4-hydroxy-6-methyl-2H-pyran-2-one (화합물 2)
상기 합성 방법에 따라 다음과 같은 조건으로 합성을 수행하여, 수율 44%의 주황색 분말(Orange powder) 형태로 화합물 2를 수득하였다.
1) 알데하이드: 3,4-디하이드로벤즈알데하이드(3,4-Dihydroxybenzaldehyde)
2) 반응시간: 10시간,
3) 결정화 용매: 에탄올,
Rf = 0.22 (Hexane/EtOAc = 3:2), m.p: 256-258℃, 1H NMR (600 MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.97 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.82 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.18 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.06 (dd, J = 8.2, 2.0 Hz, 1H), 6.81 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.25 (s, 1H), 2.25 (s, 3H); 13C NMR (75 MHz, DMSO-d 6 ): δ 196.59, 188.11, 174.56, 155.29, 152.25, 151.16, 131.13, 129.12, 123.68, 121.24, 119.49, 107.44, 103.90, 25.23; HRMS m/z calculated for C15H12O6 [M + H]+: 289.0707, found: 289.0710; > 97% purity (as determined by RP-HPLC, method B, tR = 6.14 min, method G, tR = 8.63 min).
합성예 3: (E)-3-(3-(3,4-Dimethoxyphenyl)acryloyl)-4-hydroxy-6-methyl-2H-pyran-2-one (화합물 3)
상기 합성 방법에 따라 다음과 같은 조건으로 합성을 수행하여, 수율 39%의 주황색 분말(Orange powder) 형태로 화합물 3을 수득하였다.
1) 알데하이드: 3,4-디하이드로벤즈알데하이드(3,4-Dimethoxybenzaldehyde)
2) 반응시간: 12시간,
3) 결정화 용매: 에탄올,
Rf = 0.25 (Hexane/EtOAc = 3:2), m.p: 224-226℃, 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.21 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.96 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.29 (dd, J = 8.3, 1.9 Hz, 1H), 7.22 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 5.96 (d, J = 0.6 Hz, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.94 (s, 3H), 2.28 (d, J = 0.6 Hz, 3H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) : 192.35, 183.35, 168.28, 161.43, 152.10, 149.27, 146.75, 127.83, 124.47, 120.51, 111.01, 110.46, 102.46, 99.29, 56.02, 55.96, 20.61; HRMS m/z calculated for C17H16O6 [M - H]-: 315.0874, found: 315.0862 ; > 97% purity (as determined by RP-HPLC, method B, tR = 18.06 min, method G, tR = 16.60 min).
합성예 4: (E)-3-Cinnamoyl-4-hydroxy-6-methyl-2H-pyran-2-one (화합물 4)
상기 합성 방법에 따라 다음과 같은 조건으로 합성을 수행하여, 수율 45%의 노란색 분말(Yellow powder) 형태로 화합물 4를 수득하였다.
1) 알데하이드: 벤즈알데하이드(benzaldehyde)
2) 반응시간: 12시간,
3) 결정화 용매: 에탄올,
Rf = 0.24 (Hexane/EtOAc = 3:2), m.p: 132-134℃, 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.32 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 7.97 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 7.72 - 7.66 (m, 2H), 7.45 - 7.39 (m, 3H), 5.97 (d, J = 0.6 Hz, 1H), 2.28 (d, J = 0.6 Hz, 3H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) : 192.81, 183.17, 168.66, 161.27, 146.36,134.73, 131.12, 129.20, 128.96, 123.02, 102.42, 99.49, 20.66; HRMS m/z calculated for C15H12O4 [M - H]-: 256.0736, found: 256.0731; > 97% purity (as determined by RP-HPLC, method A, tR = 11.67 min, method E, tR = 9.84 min).
합성예 5: (E)-3-(3-(3,4-Dimethylphenyl)acryloyl)-4-hydroxy-6-methyl-2H-pyran-2-one (화합물 5)
상기 합성 방법에 따라 다음과 같은 조건으로 합성을 수행하여, 수율 36%의 노란색 분말(Yellow powder) 형태로 화합물 5를 수득하였다.
1) 알데하이드: 3,4-디메틸벤즈알데하이드(3,4-Dimethylbenzaldehyde)
2) 반응시간: 5시간,
3) 결정화 용매: 에테르(Ether),
Rf = 0.21 (Hexane/EtOAc = 3:1), m.p: 108-110℃, 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.25 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 7.93 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 7.45 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 7.42 (dd, J = 7.8, 1.5 Hz, 1H), 7.16 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 5.93 (d, J = 0.6 Hz, 1H), 2.29 (s, 6H), 2.26 (d, J = 0.6 Hz, 3H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 205.26, 192.67, 183.32, 181.09, 169.10, 168.44, 161.30, 146.94, 140.78, 137.30, 132.43, 130.28, 127.14, 121.57, 102.54, 101.45, 99.37, 30.07, 20.66, 19.98, 19.70; HRMS m/z calculated for C17H16O4 [M + H]+: 285.1122, found: 285.1127; > 97% purity (as determined by RP- HPLC, method C, tR = 5.86 min, method H, tR = 5.32 min).
합성예 6: (E)-3-(3-(4-Fluoro-3-methoxyphenyl)acryloyl)-4-hydroxy-6-methyl-2H-pyran-2-one (화합물 6)
상기 합성 방법에 따라 다음과 같은 조건으로 합성을 수행하여, 수율 36%의 노란색 분말(Yellow powder) 형태로 화합물 6을 수득하였다.
1) 알데하이드: 4-플루오로-3-메톡시벤즈알데하이드(4-Fluoro-3-methoxybenzaldehyde)
2) 반응시간: 12시간,
3) 결정화 용매: 에테르(Ether),
Rf = 0.14 (Hexane/EtOAc = 5:1), m.p: 174-176℃, 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.23 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 7.89 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 7.26 - 7.23 (m, 2H), 7.16 - 7.07 (m, 1H), 5.97 (s, 1H), 3.96 (s, 3H), 2.29 (s, 3H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): 192.60, 183.12, 168.74, 161.34, 148.18, 145.33, 131.47, 131.42, 123.11, 123.02, 122.79, 122.76, 116.68, 116.43, 113.03, 113.00, 102.41, 99.44, 56.30, 20.68 ; HRMS m/z calculated for C15H12FO5 [M + H]+: 305.0819, found: 305.0821; > 97% purity (as determined by RP-HPLC, method A, tR = 12.06 min, method F, tR =14.43 min).
합성예 7: (E)-3-(3-(4-Fluorophenyl)acryloyl)-4-hydroxy-6-methyl-2H-pyran-2-one (화합물 7)
상기 합성 방법에 따라 다음과 같은 조건으로 합성을 수행하여, 수율 36%의 상아색 분말(Ivory powder) 형태로 화합물 7을 수득하였다.
1) 알데하이드: 4-플루오로벤즈알데하이드(4-Fluorobenzaldehyde)
2) 반응시간: 21시간,
3) 결정화 용매: 에탄올,
Rf = 0.25 (Hexane/EtOAc = 6:1), m.p: 132-134℃, 1H NMR (300 MHz, CDCl3): 8.24 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.91 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.70 - 7.66 (m, 2H), 7.13 - 7.08 (m, 2H), 5.96 (s, 1H), 2.28 (s, 3H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 192.68, 183.13, 168.75, 161.27, 144.92, 131.23, 131.12, 122.81, 116.33, 116.04, 102.39, 20.67 (CH3); HRMS m/z calculated for C15H11FO4 [M + H]+: 275.0714, found: 275.0830; > 97% purity (as determined by RP- HPLC, method A, tR = 12.01 min, method F, tR = 14.29 min).
합성예 8: (E)-3-(3-(3,4-Difluorophenyl)acryloyl)-4-hydroxy-6-methyl-2H-pyran-2-one (화합물 8)
상기 합성 방법에 따라 다음과 같은 조건으로 합성을 수행하여, 수율 45%의 노란색 분말(Yellow powder) 형태로 화합물 8을 수득하였다.
1) 알데하이드: 3,4-디플루오로벤즈알데하이드(3,4-Difluorobenzaldehyde)
2) 반응시간: 15시간,
3) 결정화 용매: 에탄올,
Rf = 0.17 (Hexane/EtOAc = 5:1), m.p: 176-178℃, 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.24 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 7.84 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 7.56 - 7.49 (m, 1H), 7.45 - 7.41 (m, 1H), 7.28 - 7.18 (m, 1H), 5.99 (s, 1H), 2.32 (s, 3H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3); 192.51, 182,98, 169,05, 161.22, 143.49, 132.03, 125.84, 124.15, 117.96, 117.84, 117.36, 117.24, 102.27, 99.51, 20.71; HRMS m/z calculated for C15H10F2O4 [M + H]+: 293.0619, found: 293.0617; > 97% purity (as determined by RP-HPLC, method A, tR = 13.43 min, method F, tR = 16.52 min).
합성예 9: (E)-3-(3-(3,5-Difluorophenyl)acryloyl)-4-hydroxy-6-methyl-2H-pyran-2-one (화합물 9)
상기 합성 방법에 따라 다음과 같은 조건으로 합성을 수행하여, 수율 47%의 노란색 분말(Yellow powder) 형태로 화합물 9를 수득하였다.
1) 알데하이드: 3,5-디플루오로벤즈알데하이드(3,5-Difluorobenzaldehyde)
2) 반응시간: 17시간,
3) 결정화 용매: 에탄올,
Rf = 0.20 (Hexane/EtOAc = 5:1), m.p: 182-184℃, 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ): 8.11 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.83 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 7.50 - 7.48 (m, 2H), 7.39-7.38 (m, 1H), 6.36 (s, 1H), 2.29 (s, 3H); 13C NMR (75 Hz, CDCl3) : δ 192.54, 182.88, 169.25, 161.12, 143.01, 142.97, 137.98, 125.78, 111.68, 111.34, 105.98, 102.16, 99.63, 20.73; HRMS m/z calculated for C15H10F2O4 [M + H]+: 293.0619, found: 293.0616; > 97% purity (as determined by RP-HPLC, method A, tR = 14.08 min, method E, tR =11.47 min).
합성예 10: (E)-4-Hydroxy-6-methyl-3-(3-(pyridine-4-yl)acryloyl)-2H-pyran-2-one (화합물 10)
상기 합성 방법에 따라 다음과 같은 조건으로 합성을 수행하여, 수율 50%의 노란색 분말(Yellow powder) 형태로 화합물 10을 수득하였다.
1) 알데하이드: 4-피리딘카복스알데하이드(4-Pyridinecarboxaldehyde)
2) 반응시간: 12시간,
3) 결정화 용매: 클로로포름/에테르,
Rf = 0.26 (Hexane/EtOAc = 2:3), m.p: 158-160℃, 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.69 (dd, J = 4.5, 1.6 Hz, 2H), 8.43 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 7.51 (dd, J = 4.5, 1.6 Hz, 2H), 6.00 (s, 1H), 2.31 (s, 3H); 13C NMR(75 MHz, CDCl3) : 192.60, 182.83, 169.47, 161.10, 150.65, 142.43, 141.82, 127.65, 122.40, 102.11, 99.73, 20.77; HRMS m/z calculated for C14H11NO4 [M + H]+: 258.0760, found: 258.0763; > 97% purity (as determined by RP-HPLC, method D, tR = 7.89 min, method I, tR = 8.83 min).
합성예 11: (E)-3-(3-(2-Fluoropyridin-4-yl)acryloyl)-4-hydroxy-6-methyl-2H-pyran-2-one (화합물 11)
상기 합성 방법에 따라 다음과 같은 조건으로 합성을 수행하여, 수율 31%의 노란색 분말(Yellow powder) 형태로 화합물 11을 수득하였다.
1) 알데하이드: 2-플루오로피리딘-4-카복스알데하이드(2-Fluoropyridine-4-carboxaldehyde)
2) 반응시간: 7시간,
3) 결정화 용매: 에테르,
Rf = 0.19 (Hexane/EtOAc = 5:2), m.p: 204-206℃, 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.42 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 8.29 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 7.77 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 7.41 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 7.13 (s, 1H), 6.02 (s, 1H), 2.32 (s, 3H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 192.37, 182.70, 169.71, 164.45 (d, J = 238 Hz), 161.04, 148.44, 147.47, 140.57, 128.88, 120.00, 108.52 (d, J = 38 Hz), 102.01, 99.76, 20.77; HRMS m/z calculated for C14H10FNO4 [M + H]+: 276.0666, found: 276.0650; > 97% purity (as determined by RP-HPLC, method B, tR = 10.76 min, method G, tR = 8.67 min).
합성예 12: (E)-4-hydroxy-6-methyl-3-(3-(pyridin-2-yl)acryloyl)-2H-pyran-2-one (화합물 12)
상기 합성 방법에 따라 다음과 같은 조건으로 합성을 수행하여, 수율 40%의 갈색 분말(Brown powder) 형태로 화합물 12를 수득하였다.
1) 알데하이드: 3-피리딘카복스알데하이드(3-Pyridinecarboxaldehyde)
2) 반응시간: 12시간,
3) 결정화 용매: 클로로포름/에테르,
Rf = 0.26 (Hexane/EtOAc = 2:3), m.p: 144-146℃, 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.71 (s, 1H), 8.60 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.93 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.74 (dd, J = 7.8, 7.0 Hz, 1H), 7.65 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.29 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 5.98 (s, 1H), 2.29 (s, 3H); 13C NMR(75 MHz, CDCl3) : 192.60, 182.83, 169.47, 161.10, 150.65, 142.43, 141.82, 127.65, 122.40, 102.11, 99.73, 20.77; HRMS m/z calculated for C14H11NO4 [M + H]+: 258.0760, found: 258.0763; > 97% purity (as determined by RP-HPLC, method D, tR = 13.65 min, method H, tR = 11.19 min).
합성예 13: (E)-3-(3-(1H-Indol-3-yl)acryloyl)-4-hydroxy-6-methyl-2H-pyran-2-one (화합물 13)
상기 합성 방법에 따라 다음과 같은 조건으로 합성을 수행하여, 수율 65%의 붉은색 분말(Red powder) 형태로 화합물 13을 수득하였다.
1) 알데하이드: 1H-인돌-3-카브알데하이드(1H-indole-3-carbaldehyde)
2) 반응시간: 17시간,
3) 결정화 용매: 에틸 아세테이트(Ethyl acetate),
Rf = 0.22 (Hexane/EtOAc = 7:3), m.p: 264-266℃, 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ): 12.23 (s, 1H, NH), 8.29 - 8.15 (m, 3H), 7.97 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 7.54 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.31 - 7.28 (m, 2H), 6.13 (s, 1H), 2.22 (s, 3H); 13C NMR (75 MHz, DMSO-d 6 ): 190.66, 183.63, 161.86, 141.47, 138.42, 136.34, 125.25, 123.71, 122.29, 120.58, 114.23, 113.39, 103.90, 98.99, 20.35; HRMS m/z calculated for C17H13NO4 [M + H]+: 296.0917, found: 296.0901; > 97% purity (as determined by RP-HPLC, method B, tR = 19.32 min, method G, tR = 18.55 min).
합성예 14: (E)-4-Hydroxy-6-methyl-3-(3-(thiophen-3-yl)acryloyl)-2H-pyran-2-one (화합물 14)
상기 합성 방법에 따라 다음과 같은 조건으로 합성을 수행하여, 수율 37%의 주황색 분말(Orange powder) 형태로 화합물 14를 수득하였다.
1) 알데하이드: 티오펜-3-카브알데하이드(Thiophene-3-carbaldehyde)
2) 반응시간: 16시간,
3) 결정화 용매: 에탄올,
Rf = 0.21 (Hexane/EtOAc = 3:1), m.p: 174-176℃, 1H NMR (300 MHz, CDCl3): 8.12 (d, J =15.6 Hz, 1H), 7.96 (d, J =15.6 Hz, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.49 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 5.96 (s, 1H), 2.28 (s, 3H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 192.90, 183.18, 168.51, 161.26, 138.64, 130.53, 127.07, 125.95, 122.64, 102.46, 99.38, 20.64; HRMS m/z calculated for C13H10O4S [M + H]+: 263.0372, found: 263.0357; > 97% purity (as determined by RP-HPLC, method B, tR = 21.92 min, method G, tR = 16.91 min).
합성예 15: (E)-3-(3-(furan-3-yl)acryloyl)-4-hydroxy-6-methyl-2H-pyran-2-one (화합물 15)
상기 합성 방법에 따라 다음과 같은 조건으로 합성을 수행하여, 수율 38%의 주황색 분말(Orange powder) 형태로 화합물 15를 수득하였다.
1) 알데하이드: 푸란-3-카브알데하이드(Furan-3-carbaldehyde)
2) 반응시간: 6시간,
3) 결정화 용매: 에탄올,
Rf = 0.21 (Hexane/EtOAc = 3:1), m.p: 176-178℃, 1H NMR(300 MHz, CDCl3): 8.02 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.89 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.77 (s, 1H), 7.47 (s, 1H), 6.79 (s, 1H), 5.95 (s, 1H), 2.28 (s, 3H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 192.52, 183.21, 168.50, 161.23, 146.35, 144.66, 136.45, 123.66, 122.74, 107.97, 102.44, 99.18, 20.62; HRMS m/z calculated for C13H10O5 [M + H]+: 247.0600, found: 247.0603; > 97% purity (as determined by RP-HPLC, method B, tR = 14.16 min, method G, tR = 14.16 min).
합성예 16: (E)-3-(3-(Benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)acryloyl)-4-hydroxy-6-methyl-2H-pyran-2-one (화합물 16)
상기 합성 방법에 따라 다음과 같은 조건으로 합성을 수행하여, 수율 33%의 노란색 분말(Yellow powder) 형태로 화합물 16을 수득하였다.
1) 알데하이드: 벤조[d][1,3]디옥솔-5-카브알데하이드(Benzo[d][1,3]dioxole-5-carbaldehyde)
2) 반응시간: 10시간,
3) 결정화 용매: 에탄올,
Rf = 0.21 (Hexane/EtOAc = 5:1), m.p: 198-200℃, 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.15 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.90 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.23 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 7.17 (dd, J = 8.0, 1.5 Hz, 1H), 6.84 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.04 (s, 2H), 5.95 (s, 1H), 2.28 (s, 3H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): 192.43, 183.32, 168.40, 148.50, 146.42, 129.36, 126.38, 120.85, 108.66, 107.41, 102.57, 101.76, 20.65; HRMS m/z calculated for C16H12O6 [M + H]+: 301.0707, found: 301.0710; > 97% purity (as determined by RP-HPLC, method A, tR = 10.10 min, method E, tR = 9.91 min).
[실험방법]
1. 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(human bone marrow mesenchymal stem cells, hBM-MSCs)의 세포 배양 및 지방 분화
hBM-MSC는 Lonza (Walkers ville, MD, USA)에서 상업적으로 구입하였으며, 세포 배양 시 사용된 배지의 조성은 DMEM (글루코스 1 g/L) 배지에 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)(Invi trogen, Carlsbad, CA, USA), 1% 글루타맥스(Glutamax™, Invitrogen) 및 10% 소태아혈청(FBS)을 섞어 사용하였다.
지방분화를 유도하기 위한 IDX (insulin, dexamethasone, IBMX) 배지 조성은 DMEM (글루코스 4.5 g/L) 배지에 10 μg/ml 인슐린, 0.5 μM 덱사메타손(dexamethasone) 및 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸잔틴(3-isobutyl-1-methylxanthine)(IBMX), 10% 소태아혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 섞어 사용하였다.
아스피린, 글리벤클라마이드(glibenclamide), 덱사메타손, 피오글리타존(pioglitazone), WY-14643, 로시글리타존(rosiglitazone), 미페프리스톤(mifepristone), IBMX 및 인슐린은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. T0070907은 Tocris Bioscience (Bristol, UK)에서 구입하였다. 배지는 지방세포(adipocyte)가 분화되는 동안 3일마다 교체하였다.
2. 오일 레드 오(Oil red O, ORO) 및 헤마톡실린(hematoxylin) 염색 및 정량
hBM-MSC의 지방 분화 수준을 측정하기 위하여 오일 레드 오(ORO) 및 헤마톡실린(hematoxylin) 염색을 수행하였다. 상기 hBM-MSC 세포를 PBS (phosphate-buffered saline) 용액으로 2회 헹구고 10% 중성 완충 포르말린(pH 7.4)으로 40분 동안 고정시켰다. 상기 고정된 세포를 60% 이소프로필 알코올 용액으로 세척하고 완전히 건조시켰다. 상기 고정된 세포의 지방 방울(lipid droplet)을 실온에서 15분 동안 0.2% ORO 용액으로 염색하고 수돗물로 3회 헹구었다. 지방 형성을 평가하기 위하여 ORO 염색된 세포를 100% 이소프로판올(isopropanol) 용액을 사용하여 25℃에서 10분 동안 용해시키고, 분광계를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 고정된 세포의 핵을 시각화하기 위하여 헤마톡실린 시약을 30초 동안 처리하고 수돗물로 3회 세척하였다. 염색된 세포는 Eclipsed TS100 inverted microscope (Nikon Co., Tokyo, Japan)을 사용하여 사진 촬영을 하였다.
3. 아디포사이토카인(adipocytokine) ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
hBM-MSC 상등액의 아디포넥틴 및 렙틴 수준을 정량하기 위하여 Quantikine™ 면역분석 키트(R&D systems, Minneap olis, NM, USA)를 사용하였다. 아디포넥틴 및 렙틴 수준의 정량화는 제조사 방법에 따라 측정하였다.
4. 핵 수용체(nuclear receptor, NR) 결합 분석 및 in vitro 키나아제(kinase) 억제 분석
인간 PPARα, PPARγ, PPARδ 및 GR 방사선 리간드 결합 분석은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 방사선 리간드 200 nM [3H] WY14643, 5 nM [3H] 로시글리타존, 2.5 nM [3H] L-783483 및 5 nM [3H] 덱사메타손을 사용하여 각각 일련의 PPARα, PPARγ, PPARδ 및 GR 리간드를 확인하였다. IC50 값은 MathIQ™ (ID Business Solutions Ltd., UK)를 사용하여 비선형(non-linear), 최소 제곱 회귀 분석(least squares regression analysis)으로 계산하였으며, Ki 값은 Cheng 및 Prusoff의 방정식을 사용하여 측정하였다.
키나아제 억제 분석은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. γ32P-ATP 및 히스톤 H1을 인간 CDK5/p25 및 CDK5/p35와 공동 배양하였다. 그 다음, 마그네슘 ATP 혼합물을 첨가 후 반응이 시작되었다. 실온에서 40분 동안 인큐베이션한 후, 3% 인산 용액을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 10 μl의 반응 혼합물을 P30 필터매트(filtermat)(PerkinElmer, Richmond, CA, USA)에 점적하고 멤브레인을을 75 mM 인산을 사용하여 5분 동안 3회 세척하고 메탄올을 사용하여 5분 동안 1회 세척하였다. 필터매트를 27℃에서 1시간 동안 건조시키고 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)(Beckman Coulter, Indian apolis, IN, USA)로 방사선 활성을 측정하였다.
5. 동물 실험
모든 동물 실험은 삼육대학교의 동물 관리 및 사용 지침(IACUC)에 따라 삼육대학교 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인하고 검토한 프로토콜에 따라 수행되었다. 5주령의 수컷 C57BL/6J 마우스에서 스트렙토조토신(Streptozotocin, STZ) 180 mg/kg을 1회 복강내 주사하여 당뇨병을 유발하였다. STZ 투여 후 7일째부터 2시간 금식 후 연속 3일 동안 매일 혈당 수치를 측정하였다. 혈당 수치는 휴대용 혈당 측정기 Accu-Check Active (Boehringer-Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN, USA)를 사용하여 측정하였다. STZ로 유발된 당뇨병 마우스는 혈당 수치가 300 mg/dL 이상인 것으로 정의하였다. 항당뇨 활성을 조사하기 위하여 각 실험군에서 7마리의 STZ-유발 당뇨병 마우스를 무작위로 선택하였다. 0.5% 카복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose, CMC)를 약물 제형에 사용하였고 대조군에는 비히클을 투여하였다. 약물 치료 전 금식 2시간 후 다시 혈당 수치를 측정하고 약물 후보 물질을 경구 투여하였다. 5일째, 약물 치료 직전(0시간)과 약물 치료 1시간 및 4시간 후에 혈당 수치를 측정하였다. 헤파린 처리된 주사기로 꼬리 정맥을 통해 혈액 샘플을 채취하였다. 혈장 젖산 수치는 젖산 분석 키트(MAK064, Sigma-Aldrich)로 측정하였고 혈청 아디포넥틴 및 렙틴 수치는 Quantikine™ 면역분석 키트(R&D systems, Minneapolis, NM, USA)로 측정하였다.
6. 분자 모델링
리간드-수용체 상호작용 모델링은 Discovery Studio 소프트웨어(Dassault Syst`emes, BIODIVA Corporation, San Diego, CA, USA)를 사용하여 수행하였다. 수용체와 리간드의 도킹 사이트는 최적의 리간드 결합 사이트에서 반경 20Å의 구형으로 설정되었다. PPARγ 및 GR LBD의 단백질 결정 구조는 RCSB PDB (PDB ID: 2PRG 및 6EL9)로부터 획득하였다. 각 리간드-수용체 상호작용의 상위 10개 결합 모드에서 상호작용 모드 분석을 위하여 각 PPARγ 및 GR에 대해 CDOCKER 에너지가 가장 낮은 결합 모드를 선택하였다.
7. 통계 분석
RStudio® for Windows (RStudio Inc., Boston, MA, USA)를 통계 분석에 사용하였다. 데이터는 3회의 독립적인 실험으로부터의 평균±표준 편차(SD)로 계산하였다. 통계적 유의성은 일원 분산 분석(ANOVA) 및 사후 검정 테스트(post-hoc test)에 의해 결정되었다. 유의성 임계값은 * P≤0.05 및 ** P≤0.01로 설정되었다.
[실시예]
실시예 1: GPL3A04 및 화합물 1의 아디포사이토카인(adipocytokine) 생합성- 촉진 활성 확인 평가
꿀풀과(Lamiaceae)에 속하는 식물인 포고스테몬 헤이니누스(Pogostemon heyneanus)로부터 자연적으로 분리된 신규 칼콘 유도체인 (E)-4-hydroxy-3-(3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)acryloyl)-6-methyl-2H-pyran-2-one) 및 본 발명의 합성 방법에 따라 합성된 화합물 1의 아디포넥틴(adiponectin) 및 렙틴(leptin) 분비 촉진 활성을 평가하기 위하여 hBM-MSC 기반 표현형 분석을 수행하였다. 상기 자연적으로 분리된 칼콘 유도체와 본 발명의 합성 방법에 따라 합성된 화합물 1은 [화학식 1]로 표시되는 동일한 구조를 갖는 화합물이나, 본 실시예에서 한하여, 자연적으로 분리한 상기 칼콘 유도체를 "GPL3A04"로 표기하여 구분하였다.
먼저, 아디포넥틴 분비 촉진 활성을 측정하기 위하여, 지방분화유도 배지 조건 IDX (insulin, dexamethasone, IBMX)에 상기 자연적으로 분리된 GPL3A04 및 상기 화합물 1을 각각 섞고 hBM-MSC에 각각 처리하였다. GPL3A04 및 화합물 1이 포함된 IDX 배지는 3일째와 6일째 교체하였으며, 7일째에 세포 배양 상등액을 회수하여 아디포넥틴 ELISA를 수행하여 아디포넥틴 수준을 측정하였다. 아스피린, 글리벤클라마이드(glibenclamide) 및 피오글리타존(pioglitazone)을 양성 대조군으로 사용하였다. 실험 결과, 상기 자연적으로 분리된 GPL3A04 및 상기 화합물 1은 IDX 대조군과 비교한 결과, 각각 30 μM에서 3.30배 및 3.18배까지 아디포넥틴 생산을 상당히 촉진하는 것으로 확인되었다(도 1a).
또한, 배양 7일째 포르말린으로 세포를 고정시킨 후, 오일 레드 오(Oil Red O, ORO) 및 헤마톡실린(hematoxylin) 염색을 수행한 다음, 현미경으로 관찰하여 분화된 hBM-MSC의 지질 축적 수준을 관찰하였다. 실험 결과, 화합물 1은 IDX 대조군과 비교하여 지질 방울의 수를 증가시켰으나, 글리벤클라마이드 및 피오글리타존보다는 효과가 약한 것으로 나타났다(도 1b).
그 다음, GPL3A04 및 화합물 1의 렙틴 생합성 촉진 활성을 측정하기 위하여, hBM-MSC를 GPL3A04 및 화합물 1로 각각 처리하고, 각 화합물이 포함된 배지는 3일째, 6일째 및 9일째 교체하였다. 10일째에 세포 배양 상등액을 회수하여 ELISA를 통해 렙틴 수준을 측정하였으며, 상대적 ORO 정량을 540 nm에서 수행하였다(도 1c). 실험에서 덱사메타손(dexamethasone)을 양성 대조군으로 사용하였다. 실험 결과, 화합물 1은 DMEM 대조군과 비교하여 30 μM에서 렙틴 생합성을 2.58배 크게 증가시켰으며, 이는 GPL3A04 만큼 우수한 효과인 것으로 확인되었다(도 1d).
실시예 2: 화합물 1 내지 16의 아디포사이토카인 생합성-촉진 활성 확인 평가
hBM -MSC에서의 신규 칼콘 유도체 화합물 1 내지 16의 아디포사이토카인 생합성-촉진 활성을 평가하였다. IDX 대조군과 비교하여, 화합물 9를 제외한 화합물 1 내지 16은 hBM-MSC의 지방세포 분화 모델에서 측정된 바와 같이 아디포넥틴 생성을 상당히 증가시켰다(표 1). hBM- MSC에서의 렙틴 생합성-촉진 활성 분석에서, 화합물 1, 3, 8, 10, 11, 12, 14, 15 및 16 은 배지 대조군과 비교할 때 렙틴 생산을 유의하게 촉진하였으나, 화합물 2, 4, 5, 6, 7, 9 및 13은 렙틴 생합성을 촉진하지 않았다. 아디포사이토카인 생합성-촉진 활성과 구조-활성 관계를 고려할 때, 페닐 잔기의 피리딘(pyridine) 또는 2-플루오로피리딘(2-fluoropyridine)으로의 전환은 아디포사이토카인 생합성-촉진 활성을 강하게 부여하였다. 또한, 화합물 1의 페닐기를 티오펜(thiophene) 또는 푸란(furan)과 같은 헤테로아릴(heteroaryl) 모이어티로 대체한 경우, 렙틴 생성 촉진 활성이 증가되었다.
[표 1] 화합물 1 내지 16의 아디포사이토카인 생합성-촉진 활성a
상기 표 1에서,
a 값은 평균±SD(표준편차)(n=3, 3회 독립적 실험), *p≤0.05 및 **p≤0.01;
b hBM -MSC의 지방 분화 모델에서 세포 배양 상등액을 회수하고 아디포넥틴 생합성-촉진 활성을 ELISA로 측정;
c DMEM에서 배양한 hBM-MSC를 사용하여 렙틴 생합성-촉진 활성을 측정.
본 발명의 상기 신규 칼콘 유도체 화합물 1 내지 16 중, 아디포사이토카인 생합성 촉진 활성이 가장 우수하게 나타난 화합물 10 및 11을 선택하여 농도-효과 분석을 수행하였다. 아디포넥틴 생산의 농도-효과 분석을 위하여, hBM-MSs의 지방 분화 모델에서 세포 배양 상등액을 회수하고 ELISA로 아디포넥틴 생합성-촉진 활성을 측정하였다. 양성 대조군으로 현재 처방되는 PPARγ 효능제인 피오글리타존(pioglitazone, Pio)을 사용하였으며, 피오글리타존의 최대 효과를 100%로 하여 최대 유효 농도의 절반(EC50) 값을 계산하였다. 실험 결과, 화합물 10 및 11의 EC50 값은 각각 9.3 및 2.9 μM로 나타났다(도 2a).
렙틴 생산의 농도-효과 분석을 위하여, hBM-MSs의 지방 분화 모델에서 세포 배양 상등액을 회수하고 ELISA로 렙틴 생합성-촉진 활성을 측정하였다. 양성 대조군으로 덱사메타손(dexamethasone, Dexa)을 사용하였으며, 덱사메타손의 최대 효과를 100%로 하여 EC50 값을 계산하였다. 실험 결과, 화합물 10 및 11에 대한 EC50 값은 각각 8.5 및 2.2 μM로 확인되었다(도 2b).
실시예 3: 화합물 10 및 11의 타겟 규명
PPARα, PPARγ, PPARδ, FXR (farnesoid X receptor) 및 GR과 같은 전사-조절 핵 수용체(Transcription-regulating nuclear receptor)는 포유류 지방세포에서 아디포사이토카인 생합성의 세포 조절과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 아디포넥틴 및 렙틴 생합성-촉진 활성을 매개하는 본 발명의 신규 칼콘 유도체 화합물 1 내지 16 중, 화합물 10 및 11의 분자 타겟을 확인하기 위하여, 핵 수용체에 대한 경쟁적 방사선 리간드-결합 실험을 수행하였다.
방사선 리간드-결합 분석에서, 핵 수용체인 PPARα, PPARγ, PPARδ 및 GR에 대한 양성 대조군으로, 차례대로 WY-14643, 로시글리타존(rosiglitazone, Rosi), L-783483 및 덱사메타손(Dexa)을 각각 사용하였으며, Ki 값은 Cheng 및 Prusoff 방정식으로 계산하였다. 실험 결과, 화합물 10 및 11은 PPARγ 및 GR에 경쟁적으로 결합하였으나, PPARα 및 PPARδ에 대하여는 표지된 리간드를 대체하여 경쟁적으로 결합하지 않았다(도 3a). GR 결합의 농도-반응 평가에서, 화합물 11의 Ki 값은 33.6 μM 로 나타났으며, 화합물 10은 비히클 대조군과 비교하여 GR에 유의하게 결합하였다(도 3b). PPARγ 결합의 농도-반응 분석에서, 화합물 10 및 11에 대한 Ki 값은 각각 12.9 및 3.3 μM으로 확인되었다(도 3c).
한편, CDK5 (cyclin-dependent kinase 5)에 의한 PPARγ 인산화 억제가 아디포사이토카인 생합성을 조절할 수 있다고 보고된 바 있으며, 이에 CDK5 활성에 대한 화합물 10 및 11의 효과를 분석하였다. 키나아제 활성은 CDK 복합체에 대한 γ-32P-ATP 혼입을 측정하여 평가하였다. CDK5/p25 및 CDK5/p35의 인산화에 대한 화합물 10 및 11의 억제 활성을 각 Km ATP 농도에서 실험하였다. 실험에서 DMSO를 음성 대조군으로 사용하였다. 실험 결과, 화합물 10 및 11 모두 최대 30 μM 농도에서 CDK5 활성에 어떠한 영향도 미치지 않았다(도 3d). 종합적으로, hBM -MSC에서 화합물 10 및 11의 아디포사이토카인 생합성 활성은 PPARγ 및 GR의 이중 조절에 기인한 것으로 확인되었다.
실시예 4: 화합물 10 및 11의 약리학적 특성 평가
PPARγ 및 GR에 대한 신규 칼콘 유도체 화합물 10 및 11의 다중약리학적 특성(polypharmacological profile)을 규명하기 위하여, 완전 효능제(full agonist) 또는 길항제(antagonist)를 hBM -MSC에 화합물 10 또는 11과 공동 투여하고, ELISA를 이용해 아디포사이토카인 수준을 측정하였다(도 4). 먼저, 화합물 10 및 11이 완전한 또는 부분적인 PPARγ 효능제인지 확인하기 위하여, 상기 화합물 10 및 11를 PPARγ의 완전한 효능제인 피오글리타존, 또는 PPARγ의 길항제인 T0070907과 hBM-MSC에 공동 처리하였다. 유사하게, 화합물 10 및 11 역시 단독 처리 시 농도-의존적으로 아디포넥틴 생산을 촉진하였고, T0070907로 처리 시 아디포넥틴 촉진 효과가 억제되었다. 이는 화합물 10 및 11의 아디포넥틴 생합성-촉진 효과가 PPARγ 효능제 효과에 의존함을 나타낸다. 화합물 10 및 1 μM 피오글리타존의 공동 처리는 부가적인 아디포넥틴 생합성-촉진 효과를 나타내었으며, 이는 화합물 10이 PPARγ 완전 효능제로서 기능함을 시사한다(도 4a). 화합물 11 또한 PPARγ 완전 효능제로 확인되었다(도 4b).
다음으로, 화합물 10 및 11을 GR 완전 효능제인 덱사메타손, 또는 GR 길항제인 미페프리스톤(mifepristone)과 함께 hBM-MSC에 공동 처리하였다. 덱사메타손은 농도-의존적으로 렙틴 수치를 증가시킨 반면, 1 μM 미페프리스톤은 덱사메타손에 의해 유도된 렙틴 생합성을 억제하였다. 또한, 덱사메타손과의 공동 처리 후, 화합물 10은 hBM-MSC에서 부가적인 렙틴 생합성 효과를 나타내었으며, 미페프리스톤은 화합물 10에 의해 유도된 렙틴 생합성을 억제하였다(도 4c). 동일한 조건에서 화합물 11에 대하여 실험하였을 때 유사한 결과가 얻어졌다(도 4d). 이들 결과는 화합물 10 및 11이 GR 완전 효능제로 기능함을 나타내며, 따라서 화합물 10 및 11이 PPARγ 및 GR 이중 효능제의 약리작용단(pharmacophore)을 갖는 것을 나타낸다.
실시예 5: 화합물 11과 GR 및 PPARγ의 분자 모델링
방사선 리간드 결합 분석에서, 화합물 11은 PPARγ 및 GR과 직접적으로 상호 작용하였다. 화합물 11의 결합 방식을 규명하기 위하여, BIOVIA Discovery Studio software를 사용하여 RCSB 단백질 데이터 뱅크(PDB)의 GR 및 PPARγ 단백질 결정 구조를 이용해 PPARγ 및 GR과 화합물 11의 분자 모델링 연구를 수행하였다(도 5).
먼저, PPARγ의 리간드-결합 도메인(LBD) 내의 화합물 11 또는 피오글리타존(pioglitazone)의 분자 상호작용 모델을 PDB PPARγ 구조 2PRG (RCSB PDB ID 2PRG)를 사용하여 분석하였다. PPARγ 완전 효능제인 피오글리타존은 PPARγ LBD에서 단백질 사슬 3(helix 3)을 중심으로 C자형 배열을 형성하고, Gln 286, His 323 및 Tyr 473과 수소 결합을 형성하였다(도 5a). Tyr 473과의 리간드 상호작용은 PPARγ LBD의 H12를 안정화하는데, 이는 PPARγ 타겟 유전자의 전사를 조절하는 다양한 보조 활성화 단백질(coactivator protein)을 모으는 것에 필수적이다. 또한, Met 346은 pi-황(pi-sulfur) 상호작용을 형성하고, Cys 285, Arg 288, Leu 330 및 Ile 341은 PPARγ-LBD 내에서 피오글리타존과 pi-알킬(pi-alkyl) 상호작용을 형성하였다(도 5a). 피오글리타존과 유사하게, 에너지 최소화 모델은 화합물 11이 H3 주위에 C자형 배열을 형성함을 보여주었다(도 5b). PPARγ-LBD 내 아미노산 잔기 Cys 285, Gln 286, Ser 289, His 323, His 449 및 Tyr 473은 수소 결합을 통해 화합물 11과 상호작용하였다. 또한, 화합물 11이 결합된 PPARγ-LBD 모델에서 Arg 288 및 His 449와 소수성 상호작용을 하는 것으로 확인되었다(도 5b). 따라서 최적화된 도킹 모델은 화합물 11이 피오글리타존과 유사한 PPARγ 완전 효능제로 기능한다는 것이 확인되었다.
다음으로, 12α 및 4β 단백질 사슬(helix)로 구성된 PDB GR 단백질 구조 6EL9 (RCSB PDB ID 6EL9)를 사용하여 화합물 11 또는 덱사메타손(dexamethasone)과 GR-LBD의 분자 상호작용 모델링을 수행하였다. 일반적으로 GR-LBD에 결합하는 효능제는 GR에서 H3, H4 및 H12의 AF-2 도메인의 활성 형태를 안정화시켰으며, 이는 SRC 및 TIF-2와 같은 다양한 보조활성화 단백질을 모으는 것에 필요하다. 최적화된 도킹 모델에서, 덱사메타손은 Leu 536, Asn 564, Gln 642 및 Thr 739와의 수소 결합을 통해 GR-LDB와 상호작용하고, Met 601, Met 604, Leu 732, Tyr 735 및 Cys 736과 알킬 상호작용을 형성하였다. GR-LBD 내 Tyr 735 및 Thr 739와의 리간드 상호은 GR 효능제와 길항제를 구별하는 잘 알려진 특징이다. Tyr 735 및 Thr 739 두가지 모두와 효능제의 상호작용은 GR 타겟 유전자를 전이 활성화(transactivation)하는 것에 필수적이다. GR 효능제와 대조적으로, 미페프리스톤(mifepristone)과 같은 GR 길항제는 Tyr 735 및 Thr 739와의 분자 상호작용이 부족하다. 도킹 모델에서, Tyr 735 및 Thr 739 모두와의 상호작용은 덱사메타손이 결합된 GR-LBD에 존재하였다(도 5c). GR-LBD에 대한 화합물 11의 분자 도킹 모델은 덱사메타손과 같은 GR 효능제의 전형적인 특징을 나타냈다. 특히, 화합물 11의 피리딘-4-일(pyridine-4-yl) 그룹 상의 질소 원자는 Gln 642와의 수소결합 형성에 기여하였다. Gln 642는 돌연변이유발 연구에서 GR 효능제의 결합에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으므로, 피리딘-4-일 유도체인 화합물 10 및 11이 다른 화합물들보다 강력한 렙틴 생합성-촉진 활성을 나타낸 것으로 여겨진다. 화합물 11은 또한 Gly 567, Met 646 및 Thr 739와 수소 결합을 형성할 뿐만 아니라, Met 604 및 Tyr 735와 소수성 상호작용을 나타냈다. 실험 데이터에 제시된 바와 같이, 분자 상호작용 모델은 화합물 11이 GR 효능제임을 뒷받침한다.
실시예 6: 스트렙토조토신(streptozotocin, STZ)-유도 당뇨병 마우스 모델에서의 화합물 11의 항당뇨 활성
아디포사이토카인 생합성-촉진 화합물 11은 PPARγ 및 GR에 결합하는 다중약리작용단(polypharmacophore)을 갖는다. 일부 대사질환 환자는 저아디포넥틴혈증(hypoadiponectinemia) 및/또는 저렙틴혈증(hypoleptinemia)을 경험한다. 아디포사이토카인 생합성-촉진 화합물 11이 인간 대사질환에 대한 치료 효능이 있음을 추가로 확인하기 위하여, 스트렙토조토신(STZ)-유도 마우스 모델에서 화합물 11의 인슐린 감작 활성(insulin-sensitizing activity)을 분석하였다(도 6).
스트렙토조토신(STZ)-유도 당뇨병 C57BL/6J 마우스에 5일동안 화합물 11 (두 가지 용량: 25 mg/kg, 50 mg/kg), 비히클 및 양성 대조군으로 글리벤클라마이드(glibenclamide, Gliben)를 각각 경구투여하였다. 실험 결과, 비히클 처리군과 비교하여 화합물 11 처리군에서 매일 처리 2일째 용량-의존적으로 유의한 항당뇨 활성이 관찰되었다(도 6a). 일반적으로 혈청 젖산 수치는 건강한 개인과 비교할 때 비만인 당뇨병 환자에서 만성적으로 증가한다. 따라서 고젖산혈증(hyperlactatemia)은 인슐린 저항성의 시작과 관련이 있다. 매일 처리 5일째에, 화합물 11은 비히클 대조군과 비교하여 용량-의존적으로 혈청 젖산 수준을 유의하게 하향 조절하였다(도 6b). 이러한 결과는 화합물 11이 당뇨병 합병증 또는 메트포르민(metformin)과 같은 약물과 관련된 대사성 산증(metabolic acidosis)의 위험을 잠재적으로 감소시킬 수 있음을 보여준다. 또한, 화합물 11은 대조군과 비교할 때 혈청 아디포넥틴 수준을 유의하게 증가시켰다(도 6c). 따라서 이중 PPARγ 및 GR 조절제 화합물 11은 인간 대사질환을 개선할 수 있는 치료 가능성을 나타낸다.
[실시예 결과 종합]
아디포사이토카인 생합성-촉진 PPARγ/GR 이중 조절제 기능을 발휘하는 신규 칼콘 유도체 화합물 1 내지 16의 치료 효능
본 발명의 신규 칼콘 유도체 화합물 1 내지 16, 그 중 특히 활성이 가장 우수한 화합물 10 및 11은 새로운 다중약리학적 특성(polypharmacological profile), 즉 PPARγ 및 GR 이중 효능제 특성을 나타내며, 아디포넥틴 및 렙틴 생합성-촉진 활성을 갖는다. 아디포넥틴 생합성을 촉진하기 위한 화합물의 사용은 당뇨병, 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, NASH), 심혈관 질환, 포도당 및 지질 대사와 관련된 암을 개선할 수 있다. 외인성(exogenous) 렙틴 처리는 동물 모델에서 고혈당증(hyperglycemia)과 고케톤혈증(hyperketonemia)을 개선하는 것으로 나타났으며, 지방이영양증(lipodystrophy) 및 NASH와 같은 다양한 대사질환에 유익한 효과가 있는 것으로 확인되었다. 또한, GR 및 PPARγ의 공동 조절은 지방세포에서 지방분해와 지방생성 사이의 균형을 이루는 조절에 의하여 지질 항상성 유지에 유익한 효과를 나타낸다. 본 발명의 일 실시예에서, 신규 칼콘 유도체 화합물 11은 STZ-유도 당뇨병 마우스 모델에서 당뇨병성 젖산 산증(diabetic lactic acidosis)을 개선시켰다. 아디포사이토카인 생합성-촉진 및 PPARγ 및 GR 이중 조절제로서, 본 발명의 신규 칼콘 유도체 화합물 1 내지 16은 결론적으로 다양한 대사질환에서 치료 효능을 갖는다.
또한 염증과 관련하여, PPARγ 및 GR 이중 조절제는 부가적 또는 시너지적 항염증 효과를 유도할 수 있다. 글루코코르티코이드(glucocorticoid)는 일반적으로 잘 알려진 항염증 화합물이다. 최근 대식세포(macrophage) 기능에 대한 PPARγ 효능제의 효과에 대한 연구에서 직접적인 항염증 활성이 보고된 바 있다. PPARγ 및 GR의 공동 조절은 아토피 행진(atopic march) 및 만성 위궤양에 대한 동물 모델에서 다양한 염증 반응의 개선을 가져왔다. 특히, 글루코코르티코이드 및 PPARγ 효능제의 공동 처리는 피부병 동물 모델에서 피부 장벽 파괴와 같은 글루코코르티코이드 치료의 주요 부작용을 약화시키는 것으로 보고되었다. 또한, PPARγ 리간드는 신증후군(nephrotic syndrome)에서 글루코코르티코이드의 치료 효과를 강화하였다.
PPARγ 및 GR 이중 조절제로서, 본 발명의 신규 칼콘 유도체 화합물 1 내지 16은 비-티아졸리딘디온(non-thiazolidinedione) PPARγ 기능 및 비-스테로이드성(non-steroidal) GR 효능제 활성을 나타낸다. 일부 티아졸리딘디온 계열 PPAR 효능제는 다양한 생리학적 시스템에 대한 심각한 부작용으로 인해 금지되었다. 많은 연구에서 부작용이 적을 것으로 예상되는 비-티아졸리딘디온 PPAR 특이적 효능제, 이중 조절제 또는 범-조절제(pan-modulator)의 발견이 보고되었다. 특히, 글루코코르티코이드 요법과 관련된 심각한 부작용은 본 발명의 신규 칼콘 유도체 화합물 1 내지 16의 비스테로이드성 GR 효능제 기능을 사용함으로써 개선될 수 있다.
본 명세서는 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 충분히 인식하고 유추할 수 있는 내용은 그 상세한 기재를 생략하였으며, 본 명세서에 기재된 구체적인 예시들 이외에 본 발명의 기술적 사상이나 필수적 구성을 변경하지 않는 범위 내에서 보다 다양한 변형이 가능하다. 따라서 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 설명하고 예시한 것과 다른 방식으로도 실시될 수 있으며, 이는 본 발명의 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자이면 이해할 수 있는 사항이다.

Claims (11)

  1. 하기 [화학식 a] 또는 [화학식 b]로 표시되는 칼콘(chalcone) 유도체 화합물:
    [화학식 a]

    [화학식 b]

    상기 [화학식 a] 및 [화학식 b]에서,
    상기 R1 및 R2는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 -OCH3, -OH, -H 및 -F로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이고;
    상기 R3은 -H 또는 -F이고; 및
    상기 R4는 , , , , , 및 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 [화학식 a] 또는 [화학식 b]로 표시되는 칼콘 유도체 화합물은 하기 [화학식 1] 내지 [화학식 16]으로 표시되는 화합물 중에서 선택되는 어느 하나인 것인, 칼콘 유도체 화합물:
  3. 제1항에 있어서, 상기 [화학식 b]로 표시되는 칼콘 유도체 화합물은 하기 [화학식 10] 또는 [화학식 11]로 표시되는 화합물인 것인, 칼콘 유도체 화합물.
    [화학식 10]

    [화학식 11]
  4. 제1항에 있어서, 상기 [화학식 b]로 표시되는 칼콘 유도체 화합물은 하기 [화학식 11]로 표시되는 화합물인 것인, 칼콘 유도체 화합물.
    [화학식 11]
  5. 제1항에 있어서, 상기 [화학식 a] 또는 [화학식 b]로 표시되는 칼콘 유도체 화합물은 아디포사이토카인(adipocytokine)의 생성 촉진 활성을 갖는 것인, 칼콘 유도체 화합물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 아디포사이토카인은 아디포넥틴(adiponectin) 및 렙틴(leptin)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 칼콘 유도체 화합물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 상기 [화학식 a] 또는 [화학식 b]로 표시되는 칼콘 유도체 화합물은 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체 감마(peroxisome proliferator activated receptor gamma, PPARγ) 및 글루코코르티코이드 수용체(glucocorticoid receptor, GR)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 핵 수용체에 대한 효능제(agonist)인 것인, 칼콘 유도체 화합물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 따른 칼콘 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 아디포사이토카인 감소 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 아디포사이토카인 감소 관련 질환은 당뇨병, 비만, 지질이영양증(lipodystrophy), 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, NASH), 인슐린 저항성(insulin resistance), 고혈당증(hyperglycemia), 고케톤혈증(hyperketonemia), 고혈압, 암 및 피부염으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 아디포사이토카인 감소 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 따른 칼콘 유도체 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 아디포사이토카인 감소 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 아디포사이토카인 감소 관련 질환은 당뇨병, 비만, 지질이영양증(lipodystrophy), 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, NASH), 인슐린 저항성(insulin resistance), 고혈당증(hyperglycemia), 고케톤혈증(hyperketonemia), 고혈압, 암 및 피부염으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 아디포사이토카인 감소 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR102093247B1 (ko) 2018-03-09 2020-03-25 부산대학교 산학협력단 신규한 메로테르펜 화합물 및 이를 포함하는 ppar-감마 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물

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