KR20240005757A - 세포 담체로서 유용한 콜라겐 하이드로겔 - Google Patents

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비스코판, 쏘시에다드 아노니마
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Abstract

세포 담체로서의 콜라겐 하이드로겔
본 발명은 다음을 포함하는 공정에 의해 얻을 수 있는, 미세 기공을 갖는 3D 섬유상 구조를 갖는 콜라겐 하이드로겔을 개시한다: a) 1-15 중량% 사이를 포함하는 농도로 물에 분산된 천연 제1형 콜라겐 섬유의 산성 덩어리를 제공하는 단계; b) 상기 산성 덩어리를 중화하여 pH를 생리학적 pH로 조정하는 단계; 및 c) 최대 50kGy의 범위에서 베타 방사선을 가하는 단계; 이때 상기 산성 덩어리는 0.5-5 사이의 pH를 갖고; 섬유를 갖는데, 이때 산성 덩어리는 섬유들을 포함하고, 이때 pH 1 내지 2 사이에서 측정시, 섬유들의 총 덩어리의 적어도 90%는 1μm에서 2500μm 까지의 범위를 포함하는 길이를 갖고, 섬유 직경은 0.1에서 150μm 까지의 범위를 포함한다. 또한, 이의 제조 공정과, 세포 조직을 위한 지지체 또는 배양육의 스캐폴드로서의 이의 용도, 생체의학 분야에서의 하이드로겔의 용도 또한 개시한다.

Description

세포 담체로서 유용한 콜라겐 하이드로겔
본 출원은 2021년 4월 19일에 출원된 유럽 특허 출원 EP21382331.3에 대한 우선권의 이익을 주장한다.
본 발명은 하이드로겔, 이의 제조를 위한 공정, 및 세포 배양을 위한 스캐폴드(scaffold)로서의 이의 용도에 관한 것이다.
생물학적 세포 배양을 위한 담체(carrier)는 일반적으로 당업계에 알려져 있다. 이러한 담체는 종종 매트릭스(matrix) 또는 스캐폴드라고 한다. 이러한 담체는 번식지(breeding ground) 또는, 일반적으로 세포 배양에서 세포가 성장하는 기초를 제공한다.
콜라겐 함유 화합물은 세포 담체로 알려진 유형이다. 콜라겐은 콜라겐 나선(helix)으로 알려진 기다란 원섬유(fibril)의 삼중 나선을 형성하기 위해 결합된 아미노산으로 구성되어 있다. 콜라겐은 포유류의 체내에서 가장 풍부한 단백질로 전신 단백질 함량의 25 내지 35%를 차지한다. 콜라겐은 주로 연골, 뼈, 힘줄, 인대, 및 피부와 같은 결합 조직에서 발견된다. 미네랄화 정도에 따라, 콜라겐 조직은 단단하거나 (뼈), 유연하거나(compliant) (힘줄), 단단한 것에서부터 유연한 구배 (연골)를 가질 수 있다. 콜라겐은 각막, 혈관, 장, 추간판, 치아의 상아질에도 풍부하다. 근육 조직에서는, 근육내막의 주요 구성요소로 작용한다. 콜라겐은 근육 조직의 1 내지 2 %를 구성하며 튼튼하고 힘줄이 많은 근육 무게의 6%를 차지한다. 섬유아세포는 콜라겐을 생성하는 가장 흔한 세포이다. 콜라겐은 세포 외 기질의 주요 구조 단백질로, 조직에 구조와 안정성을 전달하는 단백질 스캐폴드로서, 세포가 부착할 수 있는 부위를 제공하고, 부착된 세포에 영향을 미치고 이를 지지한다.
동물성 콜라겐 기반 생체물질은 이미 몇 년 전부터 의학분야에서 사용되고 있다. 특히 지혈을 위한 임상 적용 제품이나 성형 수술의 상이한 분야에서, 콜라겐 물질(material)이 담체 물질로서 제안되고 있다. 그러나, 콜라겐만의(collagen-only) 조성물은 가용성(soluble) 콜라겐을 기초로 하며, 종종 충분히 일관되거나 견고하지 않으며, 즉, 가교제의 도움 없이는 기계적 강도가 부족하거나 고유한 구성 즉, 젤라틴을 갖지 않는 경우가 많다.
기존의 생산에서는, 콜라겐은 산이나 효소 처리를 통해 가용화 형태로 추출하였다. 그 결과 생성된 하위단위(subunit)인 삼중 나선형 트로포콜라겐은 하이드로겔 또는 얇은 코팅을 형성하는데 적합한 원섬유와 얇은 섬유만을 생산하도록 시험관 내(in vitro)에서 재구성되어야만 한다.
하이드로겔은 물을 함유하지만 물에 녹지 않는 폴리머로서, 하이드로겔의 분자들은 화학적으로 (예를 들어, 공유 결합 또는 이온 결합을 통해) 또는 물리적으로 (예를 들어, 폴리머 사슬 간의 연결을 통해) 연결되어 3차원 네트워크를 형성한다. 필수적인 친수성 폴리머 성분으로 인해, 하이드로겔은 물 속에서 상당한 부피를 섭취(intake)해도 하이드로겔의 물질 응집력(cohesion)을 잃지 않고 팽창한다. 하지만, 하이드로겔의 단점은, 엄청난 수분 보유 능력으로 인해 기계적으로 불안정하다는 점이다. 콜라겐 하이드로겔은 세포 배양을 위한 담체로서 제안되어왔다. 그러나, 기계적 안정성이 부족하고 복잡한 섬유의 자연적인 구조와 하이드로겔이 세포와의 집락형성(colonization) 동안 종종 농축(condense)된다는 사실로 인하여, 하이드로겔의 사용은 매우 제한적이었다.
콜라겐의 특성은 이온 결합, 수소 결합 또는 공유 결합을 형성하는 여러가지 방법으로 변형될 수 있다. 망상조직(reticulation)의 생성은 콜라겐 물질의 생분해 시간 및 콜라겐 섬유의 기계적 강도를 증가시키고, 콜라겐 섬유의 수분 흡수성, 용해도, 및 효소 분해 속도는 감소시킨다. 콜라겐은 물리적 방법이나 화학적 방법에 의해 가교 결합할 수 있다.
화학적 방법은 알데하이드 화합물, 카르보디이미드(carbodiimide), 디아이소시아네이트(diisocyanate) 또는 아자이드 유도체(azide derivative)와 같은 가교제를 사용한다. 이러한 제제 중 일부는 독성이 강하고, 여분의 가교결합들이 콜라겐 섬유의 자연적인 구조를 손상시키기 때문에 콜라겐의 생체 적합성 및 생분해성에 적대적이라는 단점을 가지고 있다.
물리적 방법 중, 베타 또는 감마 조사는 멸균뿐만 아니라 콜라겐 물질을 망상화하기 위해 사용된다. 베타 방사선을 사용하여 탈수된 콜라겐을 멸균하면, 저항(resistance)을 예측하기 어려운 물질이 만들어진다. US6706684B1는 습윤(wet) 상태의 콜라겐 물질에 베타 방사선을 조사하여 생체 내(in vivo) 생분해 속도 및 기계적 특성을 조절할 수 있는 콜라겐 물질을 제조하는 공정을 설명한다. 사용되는 콜라겐 물질은 산성 pH에서 천연(native) 가용화 콜라겐이거나 펩신으로 분해(digestion) 처리한 후 얻은 것일 수 있다. 이는 소(bovine)의 제1형 또는 제3형 콜라겐 또는 이들의 혼합물, 주로 과요오드산에 의한 산화를 통해 파괴되어 변형된 콜라겐일 수 있다; 가열을 통해 나선형 구조를 부분적으로 잃은 콜라겐, 기능성 콜라겐, 또는 거대 분자 친수성 첨가제를 갖는 콜라겐. 이 모든 경우에 가용성 콜라겐이 사용된다. 이러한 모든 콜라겐 물질은 수술 후 유착(adhesion) 방지 및/또는 상처 치유에 유용한 것으로 개시되어 있으며, 가용성 콜라겐으로부터 제조된다.
콜라겐 물질의 기계적 특성을 증가시키기 위해 당업계에 개시된 또 다른 방법은 콜라겐을 다른 물질에 조립하는 것이다. 앞서 언급한 US6706684B1은 조사(irradiation)에 의해 구조화하려는 콜라겐 성분과 꽉 찬 압축 형태인 변성되지 않은 콜라겐 섬유의 네트워크와 함께 미리 결합된 조립체(assembly)를 개시하고 있다. 다른 대안은 다른 성분과 함께 스캐폴드를 형성하는 것에 기초한다. 예를 들어, P.N. Oliveira 등은 동결 건조 후 탈수열 처리(dehydrothermal treatment, DHT)를 통한 자기 가교(self-crosslinking)와 베타 방사선으로 멸균하여 제조된 상이한 콜라겐 : 키토산 (Coll:Ch) 비율을 갖는 다공성 콜라겐/키토산 스캐폴드를 개시하고있다. 또한, 그렇게 얻어진 콜라겐 물질이 조직 공학용 생체물질로 사용되는 것도 개시한다 (참조: P.N. Oliveira et al; “Self-crosslinked fibrous collagen/chitosan blends: Processing, properties evaluation and monitoring of degradation by bi-fluorescence imaging”; International Journal of Biological Macromolecules, 2019, pp. 353-367).
당업계에 이미 개시된 내용에도 불구하고, 바람직하지 않은 독성 없이 경제적으로 대규모로 생산될 수 있고, 높은 품질 및 안정성을 가지며, 의도된 용도에 맞게 조절될 수 있는 특성을 갖는 콜라겐 물질을 제공할 필요성은 여전히 존재한다.
발명의 요약
본 발명자들은 안정화 화학물질의 첨가 없이도 제조될 수 있고, 가교제를 사용하지 않고도 저항성 구조로 제조될 수 있는 비용해성 및 천연 섬유질 콜라겐 하이드로겔 구조체를 개발하였으며, 이는 광범위한 범위의 기계적 강도도 보여준다. 이 하이드로겔은 일련의 미세기공이 있는 견고한 3D 구조로, 배양 배지에서 우수한 안정성, 특히 우수한 완결성(integrity)을 보여준다. 이 하이드로겔은 다른 생체분자들과 상호작용하고, 세포 부착을 매개할 수 있으므로, 세포 지지에 유용하다.
이 하이드로겔은 특정 크기의 천연 섬유상 콜라겐, 특히 천연 제1형 콜라겐 섬유가 1 내지 15 중량%의 농도로 물에 분산 되어있는 산성배지 내 분산액으로부터 제조될 수 있고, 여기서 섬유들은 가용성 콜라겐의 경우보다 더 큰 크기를 갖는다. 산성 덩어리(mass)는 섬유들을 포함하며, 이때 1과 2 사이의 pH에서 측정시, 섬유들의 덩어리의 적어도 90%는 1μm에서 2500μm 범위를 포함하는 길이를 갖고, 0.1에서 150μm 범위를 포함하는 섬유 직경을 갖는다. 보다 정확하게는, 산성 덩어리는 섬유들을 포함하며, 이때 1과 2 사이의 pH에서 측정시, 섬유들의 총 덩어리의 적어도 90%는 10μm 내지 2500μm 범위를 포함하는 길이를 갖고, 5에서 80μm 범위를 포함하는 섬유 직경을 갖고; 이때 콜라겐 섬유들의 총 덩어리의 섬유 길이의 중앙값(median)은 100 과 900μm 사이를 포함한다.
일반적으로 젤라틴 형태로 종래 기술에서 일반적으로 사용된 콜라겐, (비가역적으로 가수분해된 콜라겐) 또는 효소 처리된 콜라겐과 달리, 본 발명에서 출발 물질로 사용된 제1형 콜라겐은 높은 천연성과 섬유들의 크기를 특징으로 한다. 본 발명에서 사용된 이러한 천연 섬유상 콜라겐 출발 물질은 일반적으로 식품 산업, 예를 들어, 햄 생산 분야에서 그물과 고기 사이의 분리막(separating film)으로 사용된다.
따라서, 가용성 콜라겐 (관련 목적으로 종래 기술에서 일반적으로 사용되는 콜라겐)을 사용하는 US6706684B1과 달리, 본 발명에서 하이드로겔 제조의 출발 물질로 사용되는 콜라겐은 비용해성 콜라겐으로, 식품 산업으로부터 나왔기 때문에 더 경제적이다. 이러한 비용해성 콜라겐 출발 물질이 적절한 처리 후에 생물학적 물질 배양에 특히 적합한 본 발명의 콜라겐 하이드로겔을 생산할 수 있다는 것은 예상치 못한 일이다. 비용해성 콜라겐의 사용은 하이드로겔에 세포 지지체(support)로서 사용하기에 적합한 기계적 특성을 제공하는데 기여한다. 이러한 콜라겐에 대한 처리 (이전의 산성 덩어리의 중화, 생리학적 pH의 조절, 및 베타 방사선의 적용)는 아마도 얻어진 가교의 정도를 통해 최종 하이드로겔의 강성(stiffness)을 제어하는데 기여한다.
따라서, 본 발명의 제1 측면은 하기의 단계를 포함하는 공정에 의해 얻을 수 있는, 미세기공(micropore)을 갖는 3D 섬유상 구조(fibrillar structure)를 포함하는 콜라겐 하이드로겔에 관한 것이다: a) 1-15 중량% 사이를 포함하는 농도로 물에 분산된 천연 제1형 콜라겐 섬유의 산성 덩어리를 제공하는 단계; b) 산성 덩어리를 중화하여 pH를 생리학적 pH로 조정하는 단계; c) b) 단계의 중화된 덩어리에 최대 50 kGy (즉, 50 kGy 이하)의 양으로 베타 방사선을 가하는 단계;를 포함하고, 이때 산성 덩어리는 0.5-5 사이의 포함하는 pH를 갖고, 섬유들을 포함하고, 이때 1과 2 사이의 pH에서 측정시, 섬유들의 총 덩어리의 적어도 90%는 10μm에서 2500μm 까지의 범위를 포함하는 길이를 갖고, 5에서 80μm 까지의 범위를 포함하는 섬유 직경을 갖고, 이때 콜라겐 섬유들의 총 덩어리 내 섬유 길이의 중앙값(median)은 100 과 900μm 사이를 포함한다. 섬유들의 크기는 실시예 3A에서 개시한 대로 Sympatec QICPIC/Lixell 입자 분석기를 사용하여 측정했다.
본 발명의 제2 측면은 상기 정의된 콜라겐 하이드로겔을 제조하는 공정에 관한 것으로서, 하기 단계들을 포함한다: a) 위에서 정의된 대로 물에 분산된 천연 제1형 콜라겐의 산성 덩어리를 제공하는 단계, b) 산성 덩어리를 중화하여 pH를 생리학적 pH로 조정하는 단계; c) b) 단계의 중화된 덩어리에 베타 방사선을 최대 50 kGy의 양으로 가하는 단계. 본 발명에 따른 콜라겐 하이드로겔의 제조는 대규모로 재생산될 수 있으며 일정한 고품질을 유지한다.
본 발명의 콜라겐 하이드로겔은 생체적합성이 우수하고, 기계적 안정성이 높아 광범위한 응용이 가능하다. 특히, 세포 부착과 기관 형성에 중심적인 역할을 하기 때문에, 세포 배양 및 조직 공학에 이상적인 기질(substrate)이다. 따라서, 본 발명의 제3 측면은 세포 성장을 위한 지지체 또는 배양육을 위한 스캐폴드로서의 위에서 정의된 콜라겐 하이드로겔의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 제4 측면은 생물학적 물질의 배양 방법에 관한 것으로, 하기 단계를 포함한다: a) 상기 정의된 콜라겐 하이드로겔인 담체 물질을 제공하는 단계; b) 상기 생물학적 물질을 단계 a)의 콜라겐 하이드로겔과 접촉시키는 단계; 및 c) 배양 조건에서 상기 생물학적 물질을 콜라겐 하이드로겔 물질과 함께 인큐베이션하는 단계.
본 발명의 제5 측면은 세포 기반 치료법 또는 복합 첨단 치료 의약품(combined advanced therapy medicinal products, ATMP)와 같은 생물의학 분야에서 사용하기 위해 부착된 세포 층을 포함하는 상기 정의된 콜라겐 하이드로겔에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 하이드로겔의 두 장의 사진 (이미지 a) 및 b))을 보여준다. 도 1의 a)는 4% 덩어리의 콜라겐 하이드로겔, b)는 2% 덩어리의 콜라겐 하이드로겔이다.
도 2a 내지 2i는 광학 현미경으로부터 얻은 것으로, 본 발명의 하이드로겔의 섬유 크기를 나타내고 (도 2a, 2b, 2e, 2f), 가용성 콜라겐과의 비교 (도 2c, 2d, 2g) 및 산에 용해된 하이드로겔 (도 2h, 2i)을 보여준다.
도 3은 본 발명의 하이드로겔의 내부 구조를 ESEM 기술로 1, 2, 3 및 4% 콜라겐에서 촬영한 사진을 보여준다.
도 4는 본 발명에 따른 하이드로겔의 유동학(rheology) 결과를 보여준다.
도 5의 1)과 2)는 l929 라인을 DilC 12 염색한 후, 시딩(seeding) 후 각각 2일 후와 5일 후에 얻은, 콜라겐 겔에서의 세포 배양을 보여준다.
도 6은 각각 1일차, 6일차, 10일차에서 상이한 겔 상에서의 세포 증식을 나타낸 그래프이다.
도 7은 25 kGy로 이전에 조사된 4% 하이드로겔 상의 293T 세포주를 보여준다.
도 8a 내지 8g는 배양 배지에서 본 발명의 하이드로겔의 안정성을 보여준다. 도 8a: 배양액 침지(immersion) 전 하이드로겔. 왼쪽: 10kGy에서 2% 콜라겐 조사. 오른쪽: 25kGy에서 2% 콜라겐 조사. 도 8b: 배양액에서 7일간 인큐베이션한 하이드로겔. 왼쪽: 10kGy에서 2% 콜라겐 조사. 오른쪽: 25kGy에서 2% 콜라겐 조사. 도 8c: 배양액에 침지하기 전에 10kGy에서 조사한 2% 콜라겐 하이드로겔. 도 8d: 배양액에서 7일간 인큐베이션한 10kGy에서 조사한 2% 콜라겐 하이드로겔. 도 8e: 배양액에서 7일간 배양한 25kGy에서 조사된 2% 콜라겐 하이드로겔. 도 8f: 배양액 침지 전 하이드로겔. 왼쪽: 10kGy에서 4% 콜라겐 조사. 오른쪽: 25kGy에서 4% 콜라겐 조사. 도 8g: 배양액에서 7일간 인큐베이션한 하이드로겔. 왼쪽: 10kGy에서 4% 콜라겐 조사. 오른쪽: 25kGy에서 4% 콜라겐 조사.
정의:
달리 명시되지 않는 한, 본 출원에서 사용된 모든 용어들은 당업자에게 알려진 통상적인 의미로 이해되어야 한다. 본 출원에서 사용된 특정 용어에 대한 보다 구체적인 정의는 아래에 명시되어 있으며, 청구항 및 발명의 설명 전체에 적용되는 것이 의도된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약(about)"또는"약(around)"또는"대략(approximately)"은 명시된 값의 ±10% 범위의 값을 의미한다. 예를 들어, "약 10" 또는 "대략 10"이라는 표현은 10의 ±10%, 즉 9에서 11까지를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "~사이를 포함하는" 또는 "x에서 y까지의 범위를 포함하는"은 해당 범위의 끝점을 포함한 값의 범위를 의미한다. 사용된 표현과 관계없이 본 명세서에서 공개된 모든 값의 범위는 해당 범위의 끝점을 포함한다.
본 발명의 목적상 "포함하다(comprise)"라는 단어는 "구성하는(consisting of)"의 경우를 아우른다.
"섬유의 적어도 x 중량%"라는 표현에서 "적어도"는 주어진 값과 같거나 더 높은 백분율을 의미한다.
콜라겐 분자는 수소 다리(bridge) 상호작용 또는 결합에 의해 안정화된 삼중 나선을 구성하는 3개의 폴리펩티드 사슬로 구성된 기다란 분자로, 이는 천연 콜라겐의 구조이다. 콜라겐이 변성되면, 예를 들어, 물의 존재 하에 가열하거나, 극단적인 pH 값으로 가열함으로써, 이러한 사슬이 분리되고 용해되어, 젤라틴을 형성한다. 젤라틴의 형성은 콜라겐 삼중 나선을 안정화시키는 수소 결합이 끊어지기 때문이며, 콜라겐이 젤라틴으로 변하는 과정은 전형적인 변성 과정으로 여겨진다. 본 발명의 콜라겐 섬유의 분산액에는 젤라틴이 없거나, 그 존재가 중요하지 않다.
본 설명에서 "천연(native) 콜라겐"은 완전히 또는 상당히 변성되거나, 가수분해되거나, 젤라틴화되지 않은 콜라겐을 의미하는 것으로 이해된다. 본 발명의 하이드로겔의 콜라겐 섬유는 변성되지 않고 콜라겐 단위의 삼중 나선 분자 구조를 유지한다.
"천연 제1형 콜라겐(native Type 1 collagen)"이라는 용어는 대부분 제1형 콜라겐인 콜라겐으로 이해되며, 이는 제3형 콜라겐과 같은 다른 콜라겐을 소량 함유할 수 있다. 일반적으로, 제1형 콜라겐의 양은 90 중량% 이상, 바람직하게는, 92 중량% 이상, 더 바람직하게는, 95 중량% 이상, 좀 더 바람직하게는, 98 중량% 이상, 더 더욱 바람직하게는 99 중량% 이상이다.
"생리학적 pH"라는 용어는 정상적으로 인체에서 만연한 pH로 이해된다. 이는 대략 7.3-7.4 이다.
본 발명의 공정의 pH 측정은 pH-미터를 가지고 수행되었다 (20℃에서 NaCl 내의 샘플을 측정했다).
"미세기공(micropore)"이라는 용어는 기공 직경이 마이크로미터 범위인 기공으로 이해된다. 일반적으로, 본 발명의 하이드로겔에서 기공은 50 μm 이상의 기공 직경을 갖는다. 다공성(porosity)은 환경 주사 전자 현미경(environmental scanning electron microscopy, ESEM) 기술을 통해 관찰된다.
"물에 분산된 천연 제1형 콜라겐 섬유의 산성 덩어리"라는 문장에서 "분산된(dispersed)"이라는 용어는 덩어리가 pH 농도 조건에서 용해되지 않고 분산되어 있는 콜라겐 섬유를 함유하고 있는 상태를 의미한다.
달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 언급된 모든 백분율은 모든 성분의 양의 합이 100%라면, 콜라겐 산성 덩어리 또는 하이드로겔의 총 중량에 대한 중량으로 표현된다.
본 발명의 일부인 콜라겐 하이드로겔은 다음과 같은 공정을 통해 얻을 수 있는 미세기공을 갖는 3D 섬유상 구조를 포함하는 콜라겐 하이드로겔로서, a) 1-15 중량% 사이를 포함하는 농도로 물에 분산된 천연 제1형 콜라겐 섬유의 산성 덩어리를 제공하고; b) 산성 덩어리를 중화하여 pH를 생리학적 pH로 조정하고; c) b) 단계의 중화된 덩어리에 베타 방사선을 최대 50 kGy의 양으로 가하고; 이때: 산성 덩어리는 0.5-5 사이를 포함하는 pH를 갖고; 섬유를 포함하는데, 이때 섬유들의 덩어리의 적어도 90%는 1과 2 사이의 pH에서 측정시, 10μm에서 2500μm 까지의 범위를 포함하는 길이를 갖고, 5에서 80μm 까지의 범위를 포함하는 섬유 직경을 갖고, 이때 콜라겐 섬유들의 총 덩어리의 섬유 길이의 중앙값은 100 과 900μm 사이를 포함한다. 일반적으로, 이 공정은 상온 (20-30℃, 일반적으로 20-25℃)에서 수행된다.
이 비용해성 제1형 콜라겐의 산성 덩어리는 섬유가 고도로 보존된 상태이며, 길고 강하며 천연 상태(native)라는 특징이 있다.
상기 또는 하기 구현예들 중 임의의 구현예와 조합된 특정 구현예에서, 산성 덩어리 내에 분산된 콜라겐 섬유의 덩어리의 적어도 90%는 20μm에서 2500μm 까지의 범위를 포함하는 섬유 길이를 갖는다. 상기 또는 하기 구현예들 중 임의의 구현예와 조합된 또 다른 특정 구현예에서, 산성 덩어리 내에 분산된 콜라겐 섬유의 덩어리의 적어도 90%는 50μm에서 2500μm 까지의 범위를 포함하는 섬유 길이를 갖는다.
다른 특정 구현예에서, 선택적으로 상기 또는 하기 구현예들 중 임의의 구현예와 조합하여, 산성 덩어리 내에 분산된 콜라겐 섬유의 덩어리의 적어도 80%는 50μm에서 2500μm까지의 범위를 포함하는 섬유 길이를 갖는다.
상기 또는 하기 구현예들 중 임의의 구현예와 조합된 다른 특정 구현예에서, 산성 덩어리 내에 분산된 콜라겐 섬유의 덩어리의 적어도 80%는 50μm에서 2500μm까지의 범위를 포함하는 섬유 길이를 갖는다. 상기 또는 하기 구현예들 중 임의의 구현예와 조합되는 또 다른 특정 구현예에서, 산성 덩어리 내에 분산된 콜라겐 섬유의 덩어리의 적어도 80%는 50μm에서 1250μm까지의 범위를 포함하는 섬유 길이를 갖는다. 상기 또는 하기 구현예들 중 임의의 구현예와 조합된 특정 구현예에서, 물에 분산된 콜라겐 섬유의 덩어리의 적어도 80%는 90μm에서 1235μm 까지의 범위의 섬유 길이를 갖는다. 또 다른 특정 구현예에서, 물에 분산된 콜라겐 섬유의 80%는 99μm에서 1235μm 까지의 범위의 섬유 길이를 갖는다.
상기 또는 하기 구현예들 중 임의의 구현예와 조합된 또 다른 특정 구현예에서, 섬유의 90%가 놓이는 아래 길이는 1500μm에서 2500μm까지의 범위를 포함한다.
콜라겐의 섬유의 총 덩어리 내에서 섬유 길이의 중앙값은 100에서 900 μm까지의 범위를 포함하고, 즉, 이는 100에서 900 μm까지의 값이다. 이는 콜라겐의 섬유의 덩어리의 50%는 중앙값보다 짧은 섬유이고, 콜라겐의 섬유의 덩어리의 50%는 중앙값보다 긴 섬유임을 의미한다. 이 백분율은 총 산성 덩어리 내에서 콜라겐 섬유의 누적 분포 (길이 분포)의 백분율을 나타낸다. 상기 또는 하기 구현예들 중 임의의 구현예와 조합되는 또 다른 특정 구현예에서, 콜라겐의 섬유의 총 덩어리의 섬유 길이의 중앙값은 100에서 500μm 범위를 포함한다. 상기 또는 하기 구현예들 중 임의의 구현예와 조합되는 또 다른 특정 구현예에서, 콜라겐의 섬유의 총 덩어리 내의 섬유 길이의 중앙값은, 200에서 400μm 범위를 포함한다.
또한, 산성 덩어리에 분산된 콜라겐 섬유의 덩어리의 적어도 90%는 5에서 80 μm 범위를 포함하는 섬유 직경을 갖는다. 특정 구현예에서, 선택적으로 상기 또는 하기 구현예들 중 임의의 구현예와 조합하여, 산성 덩어리 내에 분산된 콜라겐 섬유의 덩어리의 적어도 80%는 5μm에서 50μm 범위를 포함하는 섬유 직경을 갖는다.
상기 또는 하기의 구현예들 중 임의의 구현예와 조합된 특정 구현예에서, 산성 덩어리 내에 분산된 콜라겐 섬유의 덩어리의 적어도 80%는 5에서 35μm 범위를 포함하는 직경을 갖는다. 또 다른 특정 구현예에서, 산성 덩어리 내에 분산된 콜라겐 섬유의 덩어리의 적어도 80%는 10에서 31μm 범위를 포함하는 직경을 갖는다. 또 다른 특정 구현예에서, 산성 덩어리 내에 분산된 콜라겐 섬유의 덩어리의 80%는 10에서 31μm 범위를 포함하는 직경을 갖는다.
상기 또는 하기 구현예들 중 임의의 구현예와 조합된 또 다른 특정 구현예에서, 섬유들의 90% 아래가 놓이는 직경은 80에서 150μm 범위를 포함한다. 상기 또는 하기 구현예들 중 임의의 구현예와 조합되는 또 다른 특정 구현예에서, 콜라겐의 섬유의 총 덩어리 내의 섬유 직경의 중앙값은 10에서 25μm 범위를 포함하며, 즉, 이는 10 내지 25 μm의 값이다. 이는 콜라겐의 섬유의 덩어리의 50%는 중앙값보다 얇고, 콜라겐의 섬유의 덩어리의 50%는 중앙값 보다 두꺼운 섬유임을 의미한다. 이 백분율은 총 산성 덩어리 내의 콜라겐 섬유의 누적 분포 (직경 분포)의 백분율을 나타낸다. 상기 또는 하기 구현예들 중 임의의 구현예와 조합되는 또 다른 특정 구현예에서, 콜라겐의 섬유의 총 덩어리 내의 섬유 직경의 중앙값은 15 내지 25μm 사이를 포함한다.
상기 또는 하기의 구현예들 중 임의의 구현예와 조합된 특정 구현예에서, 산성 덩어리는 천연 제1형 콜라겐의 1-10 중량% 사이의 농도를 포함한다. 또 다른 특정 구현예에서, 산성 덩어리는 천연 제1형 콜라겐의 1-8 중량% 사이를 포함하는 농도를 갖는다. 또 다른 특정 구현예에서, 산성 덩어리는 천연 제1형 콜라겐의 1-5 중량% 사이를 포함하는 농도를 갖는다. 또 다른 특정 구현예에서, 산성 덩어리는 천연 제1형 콜라겐의 2-4 중량% 사이를 포함하는 농도를 갖는다. 산성 덩어리는 1-15 중량% 사이의 간격(interval)을 포함하는 임의의 특정 농도, 즉, 1 중량%, 2 중량%, 3 중량%, 4 중량%, 5 중량%, 6 중량%,7 중량%, 8 중량%, 9 중량%, 10 중량%, 11 중량%, 12 중량%, 13 중량%, 14 중량% 및 15 중량%일 수 있다.
상기 또는 하기 구현예들 중 임의의 구현예와 조합된 특정 구현예에서, 산성 덩어리는 1과 3 사이를 포함하는 pH를 갖는다. 중화는 수산화 나트륨, 염화 암모늄, 칼륨 및 나트륨 인산염 완충액, 트리스 완충액, 탄산 칼슘, 또는 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산 (Hepes) 등과 같은 적절한 알칼리화제를 사용하여 요구되는 pH까지 염기를 첨가하여 수행된다.
베타 방사선의 선량(dose)은 50kGy 이하의 범위에서 가해진다. 상기 또는 하기 구현예들 중 임의의 구현예와 조합된 특정 구현예에서, 가해지는 베타 방사선은 1-50 kGy 사이의 범위 내에 있다. 상기 또는 하기 구현예들 중 임의의 구현예와 조합된 또 다른 특정 구현예에서, 가해지는 베타 방사선은 5-50 kGy 사이의 범위 내에 있다. 상기 또는 하기의 구현예들 중 임의의 구현예와 조합된 또 다른 특정 구현예에서, 가해지는 베타 방사선은 10-50 kGy 사이의 범위 내에 있다. 상기 또는 하기의 구현예들 중 임의의 구현예와 조합된 또 다른 특정 구현예에서, 가해지는 베타 방사선은 10-25 kGy 사이의 범위 내에 있다. 상기 또는 하기의 구현예들 중 임의의 구현예와 조합된 또 다른 특정 구현예에서, 가해지는 베타 방사선은 15-25 kGy 사이의 범위 내에 있다.
특정 구현예에서, 단계 c)의 베타 방사선은 습윤 상태의 콜라겐에 가해진다. 특정 구현예에서, 베타 방사선은 단계 b)의 콜라겐 덩어리에 직접 가해진다.
상기 또는 하기 구현예들 중 임의의 구현예와 조합된 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 콜라겐 하이드로겔은 화학적 가교가 존재하지 않는다.
또한, 본 발명의 일부인, 상기 정의된 콜라겐 하이드로겔을 제조하는 공정은 다음 단계들을 포함한다: a) 상기 정의된 대로 물에 분산된 천연 제1형 콜라겐 섬유의 산성 덩어리를 제공하는 단계, b) 산성 덩어리를 중화시켜 pH를 생리학적 pH로 조정하는 단계; 및 c) b) 단계의 중화된 덩어리에 베타 방사선을 최대 50 kGy로 가하는 단계. 일반적으로, 이 공정은 실온 (20-25 ℃)에서 수행된다.
상기 또는 하기 구현예들 중 임의의 구현예와 조합된 특정 구현예에서, 베타 방사선은 5와 50 kGy 사이를 포함하는 범위 내에 있다.
상기 또는 하기 구현예들 중 임의의 구현예와 조합된 특정 구현예에서, 베타 방사선은 동결건조 단계를 수행하지 않고, 단계 b)의 콜라겐 덩어리에 직접 가해진다.
출발 물질로 사용되는 산성 덩어리는 콜라겐의 생물학적 공급원(source)로부터 얻어지며, 일반적으로 더 작은 직경과 길이의 섬유를 얻기 위해 원시 구조를 보존하는 처리를 거친 큰 다발 및/또는 섬유상 응집체(aggregates)로 구성된다. 이러한 콜라겐은 물에 녹지 않는다.
따라서, 본 발명의 공정에서 사용되는 산성 덩어리는 다음의 단계들을 포함하는 공정에 의해 미리 제조될 수 있다: a) 콜라겐을 함유한 조직을 세척하고 절단하는 단계; b) 절단된 조직을 조절된 방식(controlled manner)으로 화학적 침연(macerating)하는 단계; c) b) 단계에서 얻은 생성물을 물로 세척하는 단계; d) c) 단계에서 얻은 세척된 생성물의 pH를 0.5와 5 사이의 값으로 조정하여 c) 단계의 세척된 생성물을 팽창시키는 단계; e) d) 단계의 생성물을 기계적으로 다지는(mincing) 단계; 및 f) 원하는 농도로, 특히 1 중량%과 15 중량% 사이의 농도로 물에 분산시키는 단계.
특정 구현예에서, 콜라겐 함유 조직은 결합 조직이다. 일반적으로, 결합 조직은 진피, 뼈, 힘줄, 연골 및 장으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 결합 조직은 진피 조직이며, 더 바람직하게는 콜라겐은 코리움(corium)이라고 불리는 층에서 추출된다. 특정 구현예에서, 결합 조직은 소, 양, 돼지, 조류, 어류에서 기원하거나 이들의 혼합물이다. 다른 특정 구현예에서, 결합 조직은 소로부터 유래하며 1세 이상, 일반적으로 1세에서 3세 사이의 동물로부터 유래한다.
일반적으로, 결합 조직이 진피인 경우에, a) 단계 전에 진피를 제모하고 표백한다. 표백 단계를 위한 산화제의 예로는 묽은 과산화 수소가 있다.
b) 단계는 알칼리성 제제(alkaline agent), 예를 들어, 수산화칼슘 또는 수산화나트륨이 있는 상태에서, 효소의 존재 또는 부재 하에, 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, b) 단계는 설파이드 염(sulfide salt) 및 알칼리성 처리, 예컨대 Na2S 및 Ca(OH)2를 사용하여 수행된다.
특정 구현예에서, d) 단계에서 산성화를 위해 사용되는 산은 염산, 젖산, 아세트산 및 시트르산으로부터 선택된다. 또 다른 특정 구현예에서, 이는 1 내지 5 사이의 pH로 산성화된다.
Viscolma® (물에 콜라겐 섬유 함량이 최대 15%)와 같은 상업용 콜라겐 덩어리도 콜라겐 산성 덩어리로 사용될 수 있다.
이러한 공정으로 정의된 생성물의 구체적인 특정 구현예들은 생성물을 얻기 위한 공정의 특정 구현예들이기도 하다.
본 발명의 공정에 의해 얻을 수 있는 콜라겐 하이드로겔의 구조는 실시예들에 나타나있다. 따라서, 예를 들어, 실시예 4A에서 본 발명의 콜라겐 하이드로겔은 그 구조에 섬유를 포함하며, 이 특정 실시예의 경우에는 평균 길이는 약 600 μm 및 평균 직경은 약 15 μm을 갖는다는 것을 예시한다.
하이드로겔을 생물의학 분야, 특히 세포 성장을 위한 지지체로 사용하기 위해, 세포가 성장하기 위해 필요한 견고성을 유지하기 위한 하이드로겔의 최소한의 점조도(consistency)과 완결성(integrity)이 보장되어야한다. 이는 최소 탄성 계수를 요구한다. 탄성 계수 또는 저장 계수 (G')는 물질 내에 저장된 에너지와 관련이 있다. 점성 또는 손실 계수 (G")는 물질에 의해 손실(dissipate)되는 에너지와 관련이 있다.
모든 조직들은 그들의 구조와 기능에 중요한 고유한 물리적 특성을 갖는다. 신체에서 가장 딱딱한 조직은 치아이고, 뼈 근육은 중간 정도이며, 가장 부드러운 조직은 폐와 뇌이다. 본 발명의 하이드로겔의 강성(stiffness)은 의도된 용도에 필요한 강성을 갖도록 조절될 수 있다.
유리하게는, 본 발명의 콜라겐 하이드로겔은 광범위한 강성(stiffness)으로 제조될 수 있다.
실시예들은 25 kGy에서 조사되고, 1 중량%-10 중량%의 콜라겐 함량 하이드로겔에서 2500 Pa 내지 70000 Pa의 탄성 계수 G'을 갖고 (즉, 광범위한 강성 정도를 갖고), 90 Pa 내지 4730 Pa의 범위의 점성 계수 G"을 갖는 본 발명에 따른 콜라겐 하이드로겔을 예시한다.
또한, 상기 정의된 바와 같은 콜라겐 하이드로겔의 세포 성장을 위한 지지체로서의 용도도 본 발명의 일부이다.
발명자들이 알아낸 것과 같이, 생물학적 세포의 배양은 특정한 pH 값에서 특히 성공적이다. 따라서, 콜라겐 하이드로겔은 생리학적 영역에 속하는 pH 값을 나타내며, 이로 인해, 생물학적 세포의 자연 환경과 매우 유사한 환경을 제공한다. 이 경우, 콜라겐이 천연인 것이 매우 유리한데, 이러한 방식으로 원래의 콜라겐 구조와 더 밀접하게 유사해지고, 유기체에서 세포 증식이 일어나는 원래 환경을 더 유사하게 모사하기 때문이다. 게다가, 본 발명의 하이드로겔은 생리학적 pH에서 시간이 지나도 온전하고 견고한 상태를 유지하기에 충분히 단단(rigid)하다.
다음의 단계들을 포함하는 생물학적 물질의 배양 방법도 본 발명의 일부이다: a) 상기 정의된 콜라겐 하이드로겔 물질인 담체 물질을 제공하는 단계; b) 상기 생물학적 물질을 a) 단계의 콜라겐 하이드로겔 물질과 접촉시키는 단계; 및 c) 배양 조건에서 상기 생물학적 물질을 콜라겐 하이드로겔 물질과 함께 인큐베이션 하는 단계. 적합한 배양 조건은 예를 들어 약 37℃의 온도와 5%의 CO2이다.
특정 구현예에서 생물학적 물질은 뮤린(murine) 피하 결합 조직으로부터의 섬유아세포이다. 또 다른 특정 구현예에서, 생물학적 물질은 인간 신장 배아 세포이다.
본 발명의 콜라겐 하이드로겔은 생체적합성 및 취급성(handling capability) 측면에서 우수한 특성을 갖는다. 이는 재생 의학에서 새로운 치료법을 위한 생체물질에 대한 중요한 요구사항이다.
또한, 분야에 따라, 탄성, 인열 저항성(tear-resistance) 및 생분해성에 관한 요구사항이 상당히 다를 수 있다. 천연 섬유로 만들어진 본 발명의 하이드로겔은 세포 전달 및 이식을 의도하는 경우에 적합한 것으로 여겨진다.
따라서, 상기 정의된 콜라겐 하이드로겔에 세포 기반 치료법 또는 복합 첨단 치료 의약품(ATMP)과 같은 생물의학적 용도를 위해 부착된 세포층을 포함하는 것도 본 발명의 일부이다.
부착된 세포층을 포함하는 상기 정의된 콜라겐 하이드로겔은 이식물(implant)로서 사용될 수 있다. 세포가 이식되는 콜라겐 하이드로겔은 즉시 이식되는 것이거나, 배양 후에 이식되는 것일 수 있다.
또한 이는 배양육의 스캐폴드로서도 적합하다고 여겨진다. 따라서, 이러한 용도 또한 본 발명의 일부이다.
설명 및 청구항 전체에서 "포함하다(comprise)"라는 단어와 이 단어의 변형은, 다른 기술적 특징, 첨가제, 구성 요소 또는 단계들을 배제하는 것을 의도하지 않는다. 본 발명의 추가적인 목적, 장점 및 특징들은 당업자가 본 명세서를 검토함에 따라 명백해지거나, 본 발명의 실시에 의해 학습될 수 있을 것이다. 하기의 실시예 및 도면들은 예시적인 것으로 제공되며, 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니다. 도면과 관련되어 청구항의 괄호 안에 배치된 참조 부호는 청구항의 명확성을 높이기 위한 것일 뿐이며 청구항의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 또한, 본 발명은 본 명세서에서 설명된 특정하고 바람직한 구현예들의 가능한 모든 조합을 포함한다.
완전성(completeness)을 위해, 본 발명의 다양한 측면이 다음의 번호가 매겨진 항목(clause)에 의해 제시되어 있다:
항목 1. 콜라겐 하이드로겔로서, 상기 콜라겐 하이드로겔은 하기 단계를 포함하는 공정으로 얻어지는 미세기공이 있는 3D 섬유상 구조를 포함한다: a) 1 내지 15 중량% 사이를 포함하는 농도로 물에 분산된 천연 제1형 콜라겐 섬유의 산성 덩어리를 제공하는 단계; b) 상기 산성 덩어리를 중화하여 pH를 생리학적 pH로 조정하는 단계; 및 c) b) 단계의 중화된 덩어리에 베타 방사선을 최대 50 kGy의 범위에서 가하는 단계; 이때, 산성 덩어리는 0.5 내지 5 사이의 pH를 갖고; 산성 덩어리는 섬유를 포함하며, 이때 pH 1 내지 2 사이에서 측정시, 섬유의 총 덩어리의 적어도 90%가 1μm에서 2500μm 까지의 범위를 포함하는 길이를 갖고, 0.1에서 150μm 까지의 범위를 포함하는 섬유 직경을 갖는다.
항목 2. 항목 1에 있어서, 상기 산성 덩어리의 섬유의 덩어리의 적어도 80%는 50에서 1300μm 까지의 범위를 포함하는 섬유 길이를 갖는 것인, 콜라겐 하이드로겔.
항목 3. 항목 1 또는 항목 2에 있어서, 상기 콜라겐의 섬유의 총 덩어리 내 섬유 길이의 중앙값은 100 과 900 μm 사이를 포함하는 것인, 콜라겐 하이드로겔.
항목 4. 항목 3에 있어서, 상기 콜라겐의 섬유의 총 덩어리 내 섬유 길이의 중앙값은 100 과 500 μm 사이를 포함하는 것인, 콜라겐 하이드로겔.
항목 5. 항목 1 내지 항목 4 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 산성 덩어리 내 섬유의 덩어리의 적어도 80%는 5에서 50μm 까지의 범위를 포함하는 섬유 직경을 갖는 것인, 콜라겐 하이드로겔.
항목 6. 항목 1 내지 항목 5 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 콜라겐의 섬유의 총 덩어리 내 섬유 직경의 중앙값은 10에서 25μm 까지의 범위를 포함하는 것인, 콜라겐 하이드로겔.
항목 7. 항목 1 내지 항목 6 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 산성 덩어리는 천연 제1형 콜라겐을 1-10 중량% 사이를 포함하는 농도로 갖는 것인, 콜라겐 하이드로겔.
항목 8. 항목 7에 있어서, 상기 산성 덩어리는 천연 제1형 콜라겐을 2-4 중량% 사이를 포함하는 농도로 갖는 것인, 콜라겐 하이드로겔.
항목 9. 항목 1 내지 항목 8 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 산성 덩어리는 1과 3 사이를 포함하는 pH를 갖는 것인, 콜라겐 하이드로겔.
항목 10. 항목 1 내지 항목 9 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 방사선은 10과 25 kGy 사이를 포함하는 것인, 콜라겐 하이드로겔.
항목 11. 항목 1 내지 항목 10 중 어느 한 항목의 콜라겐 하이드로겔을 제조하는 공정으로, 다음 단계를 포함한다: a) 항목 1 내지 항목 10 중 어느 한 항목에서 정의된 바와 같이, 물에 분산된 천연 제1형 콜라겐 섬유의 산성 덩어리를 제공하는 단계; b) 산성 덩어리를 중화하여 pH를 생리학적 pH로 조정하는 단계; 및 c) b) 단계의 중화된 덩어리에 베타 방사선을 최대 50 kGy의 범위에서 가하는 단계.
항목 12. 항목 11에 있어서, 다음의 단계들을 포함하는 공정에 의해 산성 덩어리를 제조하는 것을 더 포함하는, 공정: a) 콜라겐 함유 조직을 세척한 후, 자르는 단계; b) 잘린 조직을 조절된 방식으로 화학적 침연시키는 단계; c) b) 단계에서 얻은 생성물을 물로 세척하는 단계; d) c) 단계에서 얻은 세척된 생성물의 pH를 0.5와 5 사이의 값으로 조정하여 c) 단계의 세척된 생성물을 팽창시키는 단계; e) d) 단계의 생성물을 기계적으로 다지는 단계; 및 f) 바람직하게 1%와 15% 사이의 농도로 물에 분산시키는 단계.
항목 13. 항목 1 내지 항목 10 중 어느 한 항목의 콜라겐 하이드로겔의 용도로서, 세포 성장을 위한 지지체 또는 배양육을 위한 스캐폴드로서의, 용도.
항목 14. 생물학적 물질의 배양 방법으로서, 다음 단계들을 포함한다: a) 항목 1 내지 항목 10 중 어느 한 항목의 콜라겐 하이드로겔 물질인 담체 물질을 제공하는 단계; b) 상기 생물학적 물질을 a) 단계의 콜라겐 하이드로겔 물질과 접촉시키는 단계; 및 c) 배양 조건에서 상기 생물학적 물질을 콜라겐 하이드로겔 물질과 함께 인큐베이션하는 단계.
항목 15. 항목 1 내지 항목 10 중 어느 한 항목에 있어서, 생물의학 분야에서 사용하기 위해, 부착된 세포 층을 포함하는, 콜라겐 하이드로겔.
실시예
실시예 1: 변성되지 않은 제1형 콜라겐 산성 덩어리의 준비
콜라겐 덩어리를 준비하기 위해, 18-26개월 된 소의 동물 피부는 표준 탈모 과정 (예를 들어, 유황염 (sulfur salt, Na2S)의 사용)을 거쳤다. 그런 다음 피부를 벌리고(split), 진피(dermis)를 추출하여 콜라겐을 얻었다. 그런 다음 하기의 단계들이 뒤따랐다:
a) 콜라겐을 함유한 조직을 물로 세척한 후, 조각으로 잘랐다;
b) 잘린 조직을 Na2S 및 Ca(OH)2로 화학적으로 침연(macerate)하였다;
c) b) 단계에서 얻은 생성물(product)을 물로 세척했다;
d) c) 단계에서 얻은 세척 생성물의 pH를 0.5 와 5 사이의 값으로 조절하고, 더 정확하게는 1-3 사이의 값으로 조절하여, 단계 c)의 세척 생성물을 팽창시켰다;
e) d) 단계의 생성물을 기계적으로 다졌다;
f) 그리고, 이를 중량 농도, 바람직하게는 1 중량%와 15 중량% 사이로, 물에 분산시켰다.
덩어리에서 콜라겐의 비율을 알아내기 위해, 알려진 덩어리의 양을 칭량하고, 160℃의 진공 오븐에서 일정한 중량이 될 때까지 건조시킨 후 결과물인 건조 추출물의 무게를 칭량했다. 총 덩어리 대비 건조 콜라겐의 비율을 계산하였다.
실시예 2: 콜라겐 하이드로겔의 준비
콜라겐 하이드로겔을 제조하기 위해, 실시예 1에 따라 얻은 콜라겐 농도 5 내지 10%의 콜라겐 덩어리를 사용했다.
반죽기를 사용하여 물로 희석하여 4%의 고형물 농도로 희석했으며, 실시예 1에 언급된 방법에 따라 계산되었다. 그 후, 1.5 mm 두께의 필름을 만들고 pH를 올려 응고시키기위해 50 mM NaOH에 담갔으며, 마지막으로 pH 7.4의 인산 완충액(PBS)으로 세척하였다. 하이드로겔은 콜라겐 가교시키고 이를 멸균하기 위해 25 kGy의 베타선으로 조사하였다.
2% 콜라겐 덩어리로부터 하이드로겔을 만들기 위해, 덩어리를 2% 건조 콜라겐이 되도록 희석한 것만 제외하고는, 상기 언급된 것과 동일한 프로토콜을 따랐다.
도 1은 얻어진 하이드로겔의 이미지를 보여주고, 도 1에서 a)는 4% 콜라겐 덩어리의 하이드로겔을 보여주고, 도 1에서 b)는 2% 콜라겐 덩어리의 하이드로겔을 보여준다.
실시예 3: 변성되지 않은 제1형 콜라겐의 산성 덩어리의 특성 분석
실시예 3A: 동적 이미지 분석을 통한 실시예 1의 산성 덩어리의 형태학적 분석. 가용성 콜라겐 및 콜라겐 젤라틴과의 비교
실시예 1의 산성 덩어리에 대한 동적 이미지 분석을 통해 형태학적 분석을 수행하였다. 이를 위해, 산성 덩어리를 탈이온수에서 1%로 희석하고, 1M의 HCl을 이용해 대략 1.5의 pH로 조절하였다. 희석된 샘플을 2500 rpm에서 10분간 볼텍싱(vortexing)하고 탈이온수로 1/20 희석하였다.
측정은 4-2888 μm 입자 크기 측정 범위에서 큐벳 (폭 0.5 mm) 연속 흐름이 있는 Sympatec QICPIC/Lixell 입자 분석기에서 수행되었다. 콜라겐 현탁액의 경우 입자 분포의 이질성이 크기 때문에, 두 개의 하위샘플(subsample)에 대해 적어도 3번의 개별 측정을 수행했다. 총 100만 개에서 300만개의 입자가 검출되었다.
섬유 길이 및 직경 분포에 기초한 평가를 수행하였다. 샘플 내 콜라겐 섬유의 총 덩어리에서 특정 길이 또는 너비의 섬유에 해당하는 비율이 계산되었다. 표 1 및 표 2는 총 덩어리 내에서 평균값으로 계산된 콜라겐 섬유의 누적분포(cumulative distribution)의 10, 16, 50, 50, 84 및 90 %의 길이와 직경 (μm 단위)을 보여준다.
표 1. 총 콜라겐 섬유 덩어리의 10, 16, 50, 50, 84, 및 90%의 누적 백분율에 상응하는 섬유 길이 (μm)
표 2. 총 콜라겐 섬유 덩어리의 10, 16, 50, 50, 84, 및 90%의 누적 백분율에 상응하는 섬유 직경 (μm)
섬유 길이의 중앙값은 383μm이다. 이는 덩어리에 함유된 섬유의 절반은 길이가 383μm 보다 길며, 80%는 99에서 1235 μm까지의 범위를 포함하고 있다는 것을 의미한다. 그리고, 섬유 직경의 누적 분포는 중앙값이 19μm이며, 섬유의 80%는 10μm와 31μm 사이의 직경 범위를 갖는다.
제조업체의 지침에 따라 겔화(gelation) 전에 가용성 콜라겐 용액 (US6706684B1에서와 같이 가용성 콜라겐의 용도를 나타내는 비교예)을 광학 현미경으로 관찰하려고 시도했으나 콜라겐 원섬유를 관찰하지 못했다. 따라서, 원섬유를 검출할 수 없기 때문에 동적 이미지 분석은 수행되지 않았다.
소 유래의 젤라틴 (비교군)을 상기 언급한 것과 동일한 분석을 수행하기 위해 용해하였지만 섬유가 검출되지 않았다.
실시예 4: 본 발명의 하이드로겔의 특성 분석
실시예 4A: 광학 현미경으로 하이드로겔의 섬유 크기 측정
실시예 2에 따라 만들어진 본 발명의 2% 콜라겐 하이드로겔, 가용성 콜라겐으로 제조된 겔 (비교군), 및 2% 젤라틴 겔 (비교군)의 섬유의 크기를 측정하였다.
2% 콜라겐 하이드로겔에 존재하는 콜라겐 섬유의 크기 분석을 수행하였다. 이를 위해, 겔을 울트라투렉스(ultraturrax)를 사용하여 1:10의 비율로 탈이온수에 분쇄하고, 소량을 슬라이드에 증착하고 건조하였다. 이를 0.1% 시리우스 레드 (Direct Red 80) 염료 용액으로 1시간 동안 덮은 다음, 여분의 염료를 제거하였다. 그 후 샘플들은 광학 현미경으로 관찰하고 정량화하였다.
젤라틴 분말을 50℃의 온도에서 30분 동안 탈염수(demineralized water)에서 용해시킴으로써 2% 소 젤라틴 용액 (비교군)을 제조하였다. 분말이 용해되면, 용액에 1N NaOH를 첨가하여 pH 7.4까지 중화하였다. 그런 다음, 하이드로겔과 동일한 프로토콜을 계속하여, 즉, 하이드로겔과 동일한 비율로 분쇄하고 슬라이드 위에 놓고 염색하였다.
가용성 콜라겐, 0.5% 가용성 콜라겐 (비교군)의 측정을 위해, 제조업체의 프로토콜에 따라 겔화하여 섬유가 형성되도록 한 후, 겔을 분쇄하고 슬라이드에 증착한 후 위와 동일한 프로토콜을 따랐다.
표 3:
도 2는 광학 현미경으로 본 발명의 하이드로겔의 섬유 크기를 나타낸 것이다. 도 2a 및 2b는 하이드로겔의 섬유 크기에 상응하고, 도 2c 및 2d는 가용성 콜라겐 (비교군)에 상응한다. 도 2e 및 2f는 하이드로겔 섬유의 지름을, 도 2g는 가용성 콜라겐의 지름을 나타낸다.
따라서, 하이드로겔에서 318μm (도 2a)에서 1214μm (도 2b) 길이의 원섬유가 검출되었다. 반면, 가용성 콜라겐에서는 67 (도 2c)에서 245μm (도 2d)의 범위의 원섬유 클러스터가 검출되었다.
섬유의 직경이 명확하게 상이하였는데, 하이드로겔의 경우, 10μm의 최소 직경 (도 2e), 29μm의 최대 직경 (도 2f)을 가졌고, 가용성 콜라겐의 경우, 0.7μm의 최소 직경, 1.5μm의 최대 직경 (도 2g)을 가졌다.
반면, 젤라틴 겔에서는 섬유질이 검출되지 않았다.
그 후, 산성 매질(medium) 겔을 1M HCl로 pH 2.5로 조절된 탈이온수와 함께, 24시간동안 교반하여 재용해시키려고 시도했다. 이는 최종 농도 0.05%로 희석하여 슬라이드에 놓고, 건조시킨 후 0.1% 시리우스 레드 염색으로 1시간동안 염색했다. 하이드로겔의 경우, 직경이 10μm에서 300μm 이상인 섬유 응집체(agglomerate)가 관찰되었다 (도 2h). 이 중 일부 섬유는 응집체로부터 풀리는 것을 관찰할 수 있었다 (도 2i). 반면, 가용성 콜라겐에서는 섬유들이 관찰되지 않았다.
실시예 4B: ESEM 기술에 의한 1, 2, 3, 4% 콜라겐을 함유한 하이드로겔의 내부 구조.
하이드로겔의 내부 구조를 연구하기 위해, 샘플의 온도를 변화시킬 수 있고, 장비에 도입된 수증기 압력과 조합하여 샘플의 습도를 조절할 수 있는 (상대 습도 1%에서 100%까지), 환경 주사 전자 현미경 (ESEM) 기술을 사용하였다. 이를 통해 샘플들을 변형시키지 않고도 최대한 실제에 가까운 구조를 파악할 수 있었다.
샘플들을 옆으로(crosswise) 자르고 SEM 스탠드에 수직으로 배치하였다. 샘플들은 습도 100%와 낮은 습도 (30%와 60% 사이)에서 관찰되었기 때문에, 건조되고 샘플들이 함유한 구멍(pore)들을 더욱 선명하게 관찰할 수 있었다.
다공성은 세포 내재화(cell internalization)을 촉진하는데 중요하다. 도 3a 내지 3d는 하이드로겔의 두 가지 다른 스케일에서 촬영한 ESEM 사진이다. 도 3a 내지 3d의 사진은 콜라겐의 비율이 증가함에 따라, 구조의 다공성이 감소하지만, 여전히 큰 구멍 (50μm 이상)을 가지고 있으며 많은 기공들에서 상호 연결이 관찰되는 것을 보여준다.
보여지는 사진은 습도 약 50%에서 촬영한 이미지에 해당하며, 각 유형의 하이드로겔에 대한 콜라겐의 섬유상 구조와 이러한 섬유들의 연결을 보여주는 두 가지 다른 스케일을 포함한다.
실시예 5: 본 발명의 하이드로겔의 유동학
실시예 5A: 상이한 콜라겐 농도와 조사 선량을 조합한 하이드로겔의 유동학
하이드로겔은 실시예 2에 따라 콜라겐 백분율이 1%에서 10%인 덩어리로부터 제조되었으며, 그 후, 조사없이 분석하고, 베타선을 10kGy 및 25kGy의 강도에서 조사하여, 이러한 변수들이 하이드로겔의 유동학에 미치는 영향을 확인하였다.
분석을 위한 프로토콜: 이를 위해, 20mm 플레이트-플레이트 로터가 장착된 모듈레이트 어드벤스드 레오미터 시스템 MARS 40 (Thermo Haake)을 사용하였다. 진동 응력 스윕(sweep) 테스트는 15.0 ℃의 측정 온도에서 깨짐성(fracturability)의 증가로 인해, 비조사(non-irradiate) 샘플의 경우 하이드로겔의 샘플의 초기 두께의 높이의 50% (일반적으로 1.5에서 2.5 mm 사이), 조사 샘플의 경우 30%의 플레이트 간 거리를 유지하면서, 1 Hz의 고정 주파수에서 응력 범위 (τ) 1 Pa 내지 15000 Pa에서 수행하였다. 테스트 전, 측정 온도를 확인하기 위해, 설정된 간격(gap)에 도달한 후 플레이트 사이에서 샘플을 10분 동안 담금질(temper)하였다.
고정 주파수에서의 응력 스윕은 선형 점탄성 영역을 식별할 수 있게 하였다.
선형 점탄성 영역에서의 진동 측정은 물질의 응답이 오직 물질의 구조에만 의존하고 응력 또는 압력(strain)과 같은 유동학적 파라미터들과는 무관하기 때문에 중요하다.
테스트 동안, G' 및 G"의 값 (세로축)은 응력 (가로축)의 함수로 플롯되었다.
탄성 또는 저장 계수 (G')은 물질에 저장된 에너지와 관련이 있고, 점성 또는 손실 계수 (G")은 물질이 손실하는 에너지와 관련이 있다.
표 4 1 Hz의 주파수에서 응력 스윕을 수행한 후 본 발명의 하이드로겔의 유동학 데이터.
* 분석의 처음 100초 동안의 G'및 G"의 평균값에 상응하며, 곡선의 선형 단계에 있음을 확인한다.
하이드로겔의 탄성 계수는 콜라겐 용량이 증가함에 따라 증가하며, 1% 콜라겐 함량 겔의 경우 860 Pa에서 10% 콜라겐 함량 겔의 경우 20980 Pa에 이른다.
겔에 방사선을 조사할 때도 마찬가지인데, 조사 선량이 증가하면 물질이 가교되고 탄성 계수가 크게 증가한다.
도 4는 본 발명의 하이드로겔의 유동학 데이터를 보여준다.
이러한 방식으로, 조사되지 않은 1% 겔에 상응하는 860 Pa 부터 25kGy로 조사된 10% 겔에 상응하는 66340 Pa까지 얻을 수 있으므로; 이러한 파라미터들을 변경하여 탄성 계수를 맞춤화할 수 있다.
실시예 5B: 4% 하이드로겔 대(vs.) 4% 젤라틴 및 가용성 콜라겐 겔의 유동학 비교
유동학적 분석을 위해, 하이드로겔은 4% 콜라겐 덩어리로 제조하고 실시예 2에 따라 25kGy로 조사하였으며, 젤라틴과 가용성 콜라겐은 실시예 3의 파트 2와 동일한 방법으로 제조한 후 25kGy로 조사하였다. 유동학 측정은 실시예 4의 파트 1 (하이드로겔의 유동학)에서와 동일한 프로토콜을 따랐다.
생물의학 분야에서 세포 성장을 지지하는 역할로 사용하려면 겔의 견고성(firmness)을 유지하는 것이 중요하다. 이를 위해서는 높은 탄성 계수 (G')가 필요하다.
응력 스윕 테스트 결과는 표 5에 나타나있다.
표 5:
하이드로겔의 탄성 계수는 테스트된 다른 두 겔보다 훨씬 높았다. 가용성 콜라겐의 경우, 다른 물질만큼 높은 콜라겐 농도를 달성하는 것은 불가능하지만 조사된 생성물의 G'값은 훨씬 낮았다.
실시예 6. 파트 1. 섬유아세포주 세포 배양
실시예 2에서 언급된 대로 25 kGy로 조사된 4% 콜라겐을 갖는 덩어리로부터 하이드로겔을 얻은 후, 시험관 내(in vitro) 분석을 수행하였다. 이를 위해, 겔을 농축된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM)에서 24시간동안 평형화하였다. 뮤린 피하 결합 조직 (l929 라인)의 섬유아세포를 배양하여, 총 100,000 세포/cm2를 재현탁하였다.
세포를 정확하게 시각화하기 위해서, DilC12 염색 프로토콜 (막 라벨링)을 수행한 후, 역상 형광 현미경 (TxRed 필터)을 사용하여 시각화하였다. 도 5의 1)과 2)는 각각 시딩(seeding) 후 2일과 5일 후에 얻은 l929 라인으로 DilC 염색 후의 콜라겐 겔에서의 세포 배양을 보여준다.
실시예 6. 파트 2. 인간 신장 배아주 세포 배양
차례로, 상이한 콜라겐 농도, 조사 선량 및 탄성 계수를 갖는 콜라겐 하이드로겔에 대한 시험관 내 실험을 수행하였다 (표 6 참조); 그 획득 과정은 실시예 2 및 실시예 4A에 언급되어 있다. 하이드로겔을 얻은 후, 농축된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 24시간 동안 평형화하고, 인간 신장 배아 세포 (라인 293T)를 500,000 세포/cm2로 배양하였다.
표 6. 293T 세포주를 사용하여 시험관 내에서 테스트한 콜라겐 하이드로겔의 요약
상이한 하이드로겔에서 배양한 후, 트립신과 콜라게나제를 병용처리하여 (트립신-EDTA 0.05%로 20 분간 1차 배양한 후, 콜라게나제 500U/ml로 2차 배양), 겔이 완전히 녹을때까지 세포를 탈세포화하였다. 그 후, 트리판블루(TrypanBlue)로 염색하고 노이바우어(Neubaauer) 챔버로 세포를 세어 세포 계수를 수행하였다. 도 6은 상이한 겔에서 1일, 6일, 10일 동안 성장 후 얻은 세포의 수를 보여준다. 탄성 계수(G')가 높은 겔 (4% 콜라겐을 10 및 25kGy로 처리한 겔)은 6일과 10일차 모두에서 더 높은 세포 융합(confluence)을 나타낸다.
도 7은 이전에 25 kGy로 조사된 4% 하이드로겔 상의 293T 세포주를 보여준다. 세포들은 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin)으로 염색되었다. 1일차 (도 7a)에 세포는 하이드로겔에 부착하여 단층(monolayer)을 형성하였다. 6일차 (도 7b)와 10일차 (도 7c) 모두에서 2-3 층의 세포를 갖는 다층으로 덮인 일부 영역이 관찰되었다. 10일차 (도 7d)에 여러 층 (14-15 층)의 세포를 갖는 일부 영역이 검출되었다.
실시예 7: 배양 배지 내 안정성
실시예 2에 따라 2% 덩어리로부터 하이드로겔을 제조하고 배양 배지 내의 안정성을 평가하기 위해 10 kGy 및 25 kGy로 조사하였다. 이를 위해, DMEM 농축 배양 배지에 담그고 37℃의 오븐에서 7일간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 후에, 하이드로겔의 직경은 약간 감소하였으나, 점조도(consistency)는 크게 변하지 않았다.
도 8a는 배양 배지에 담그기 전 하이드로겔을 보여주고, 도 8b는 7일간 인큐베이션 한 후로, 하이드로겔의 직경이 줄어들 것을 볼 수 있다.
도 8c, 8d 및 8e는 각각 배양 배지에 담그기 전 10 kGy로 조사된 2% 콜라겐 덩어리로부터 만든 하이드로겔, 인큐베이션 7일 후 10 kGy로 조사된 2% 콜라겐 덩어리로부터의 하이드로겔, 및 인큐베이션 7일 후 25 kGy로 조사된 2% 콜라겐 덩어리로부터의 하이드로겔을 나타낸 것으로, 견고성과 구조가 크게 영향받지 않았음을 확인할 수 있다.
더 높은 콜라겐 농도의 덩어리로부터 제조된 하이드로겔에서는 직경 감소가 더 낮으며, 이는 도 8f 및 도 8g에 나타나있으며, 이는 배지에 담그기 전 (도 8f) 및 7일간의 인큐베이션 후 (도 8g)에 10kGy 및 25kGy로 조사된 4% 콜라겐 덩어리로부터 제조된 하이드로겔에 상응한다.
인용 목록
특허 문헌
- US56706684B1
비특허 문헌
- P.N. Oliveira et al; "Self-crosslinked fibrous collagen/chitosan blends: Processing, properties evaluation and monitoring of degradation by bi-fluorescence imaging"; International Journal of Biological Macromolecules, 2019, pp. 353-367.

Claims (15)

  1. 미세기공(micropore)이 있는 3D 섬유상 구조(fibrillar structure)를 포함하는 콜라겐 하이드로겔로서, 상기 콜라겐 하이드로겔은 하기 단계들:
    a) 1 내지 15 중량% 사이를 포함하는 농도로 물에 분산된 천연(native) 제1형 콜라겐 섬유의 산성 덩어리(mass)를 제공하는 단계;
    b) 상기 산성 덩어리를 중화하여 pH를 생리학적 pH로 조정하는 단계; 및
    c) b) 단계의 중화된 덩어리에 베타 방사선을 최대 50 kGy의 범위에서 가하는 단계;를 포함하는 공정에 의해 수득가능하고,
    이때,
    - 상기 산성 덩어리는 0.5 내지 5 사이의 pH를 갖고;
    - 상기 산성 덩어리는 섬유를 포함하며, 이때 pH 1 내지 2 사이에서 측정시, 섬유의 총 덩어리의 적어도 90%는 10μm에서 2500μm 까지의 범위를 포함하는 길이를 갖고, 5에서 80μm 까지의 범위를 포함하는 섬유 직경을 갖고;
    이때 콜라겐 섬유들의 총 덩어리 내 섬유 길이의 중앙값(median)은 100 과 900μm 사이를 포함하는, 콜라겐 하이드로겔.
  2. 제1항에 있어서, 상기 산성 덩어리의 섬유의 덩어리의 적어도 80%는 50에서 1300μm 까지의 범위를 포함하는 섬유 길이를 갖는 것인, 콜라겐 하이드로겔.
  3. 제2항에 있어서, 상기 콜라겐의 섬유의 총 덩어리 내 섬유 길이의 중앙값은 100 과 500 μm 사이를 포함하는 것인, 콜라겐 하이드로겔.
  4. 제3항에 있어서, 상기 콜라겐의 섬유의 총 덩어리 내 섬유 길이의 중앙값은 200 과 400 μm 사이를 포함하는 것인, 콜라겐 하이드로겔.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산성 덩어리 내 섬유의 덩어리의 적어도 80%는 5에서 50μm 까지의 범위를 포함하는 섬유 직경을 갖는 것인, 콜라겐 하이드로겔.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜라겐의 섬유의 총 덩어리 내 섬유 직경의 중앙값은 10에서 25μm 까지의 범위를 포함하는 것인, 콜라겐 하이드로겔.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산성 덩어리는 천연 제1형 콜라겐을 1 내지 10 중량% 사이의 농도로 갖는 것인, 콜라겐 하이드로겔.
  8. 제7항에 있어서, 상기 산성 덩어리는 천연 제1형 콜라겐을 2 내지 4 중량% 사이의 농도로 갖는 것인, 콜라겐 하이드로겔.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산성 덩어리는 1과 3 사이를 포함하는 pH를 갖는 것인, 콜라겐 하이드로겔.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방사선은 10과 25 kGy 사이를 포함하는 것인, 콜라겐 하이드로겔.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 콜라겐 하이드로겔을 제조하는 공정으로,
    a) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에서 정의된, 물에 분산된 천연 제1형 콜라겐 섬유의 산성 덩어리를 제공하는 단계;
    b) 상기 산성 덩어리를 중화하여 pH를 생리학적 pH로 조정하는 단계; 및
    c) b) 단계의 중화된 덩어리에 베타 방사선을 최대 50 kGy의 범위에서 가하는 단계;를 포함하는, 공정.
  12. 제11항에 있어서, 다음의 단계들을 포함하는 공정에 의해 산성 덩어리를 제조하는 것을 더 포함하는, 공정:
    a) 콜라겐 함유 조직을 세척한 후, 자르는 단계;
    b) 잘린 조직을 조절된 방식(controlled manner)으로 화학적 침연(macerating)시키는 단계;
    c) b) 단계에서 얻은 생성물을 물로 세척하는 단계;
    d) c) 단계에서 얻은 세척된 생성물의 pH를 0.5와 5 사이의 값으로 조정하여 c) 단계의 세척된 생성물을 팽창시키는 단계;
    e) d) 단계의 생성물을 기계적으로 다지는 단계; 및
    f) 바람직하게 1%와 15% 사이의 농도로 물에 분산시키는 단계.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 콜라겐 하이드로겔의 용도로서, 세포 성장을 위한 지지체 또는 배양육을 위한 스캐폴드로서의, 용도.
  14. 생물학적 물질의 배양 방법으로서,
    a) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 콜라겐 하이드로겔 물질인 담체 물질을 제공하는 단계;
    b) 상기 생물학적 물질을 a) 단계의 콜라겐 하이드로겔 물질과 접촉시키는 단계; 및
    c) 배양 조건에서 상기 생물학적 물질을 콜라겐 하이드로겔 물질과 함께 인큐베이션하는 단계;를 포함하는, 방법.
  15. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 생물의학 분야에서 사용하기 위해, 부착된 세포 층을 포함하는, 콜라겐 하이드로겔.
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