JP2024517509A - 細胞担体として有用なコラーゲンヒドロゲル - Google Patents
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Abstract
a)1~15重量%からなる濃度で水中に分散された天然I型コラーゲン線維の酸性質量を提供する工程、b)酸性質量を中和してそのpHを生理学的pHに調整する工程、およびc)50KGyまでの範囲のβ放射線を照射する工程を含むプロセスによって得ることができるミクロ孔を有する3Dフィブリル構造を含むコラーゲンヒドロゲルであって、酸性質量は0.5~5からなるpHを有し、かつ酸性質量は、当該線維の全質量の少なくとも90%が1~2のpHで測定した1μm~2500μmの範囲からなる長さおよび0.1~150μmの範囲からなる線維直径を有するコラーゲンヒドロゲルを開示している。それはその調製のためのプロセスならびに細胞組織のための支持体または培養される肉の足場としてのその使用、ならびに生物医学的用途に使用するためのヒドロゲルも開示している。【選択図】なし
Description
本出願は、2021年4月19日に出願された欧州特許出願第21382331.3号の利益を主張する。
本発明は、コラーゲンヒドロゲル、その調製のためのプロセスならびに細胞の培養のための足場としてのその使用に関する。
生体細胞の培養のための担体が当該技術分野で一般に知られている。そのような担体はマトリックスまたは足場と呼ばれることが多い。これらの担体は増殖場所、一般に細胞培養において細胞が増殖するための土台を提供する。
コラーゲン含有化合物は公知の種類の細胞担体である。コラーゲンは、コラーゲンヘリックスとして知られている細長いフィブリルの三重らせんを形成するために互いに結合されたアミノ酸からなる。コラーゲンは全身タンパク質含有量の25~35%を構成している、哺乳類の体内において最も豊富なタンパク質である。それは大部分が軟骨、骨、腱、靱帯および皮膚などの結合組織に存在する。ミネラル化の程度に応じて、コラーゲン組織は剛直であったり(骨)、柔軟であったり(腱)、剛直から柔軟までの段階を有していたりする(軟骨)。コラーゲンは角膜、血管、腸、椎間板および歯の象牙質においても豊富である。筋肉組織では、それは筋内膜の主成分として機能している。コラーゲンは筋肉組織の1~2パーセントを構成しており、かつ強い腱の筋肉の重量の6%を占めている。線維芽細胞はコラーゲンを作り出す最も一般的な細胞である。コラーゲンは、細胞外マトリックスの主要な構造タンパク質すなわち組織に構造および安定性をもたらし、細胞が接着する場所を提供し、かつ接着細胞に影響を及ぼし、かつそれを支持するタンパク質足場を表す。
動物由来のコラーゲンベースの生体材料は、ここ数年にわたって医学において既に使用されている。特に止血のために臨床的に適用可能な製品または異なる領域の形成外科手術において、コラーゲン材料は担体材料として提案されてきた。しかしコラーゲンのみの組成物は可溶性コラーゲンをベースとしており、十分に一貫しておらず、かつ堅くない場合が多く、すなわちそれらは架橋剤の助けなしでは機械的強度を欠いていたり、天然の立体構造を有していなかったりする(すなわちゼラチンである)。
従来の作製では、コラーゲンは酸または酵素処理により可溶化形態で抽出される。得られるサブユニットすなわち三重らせんトロポコラーゲンはインビトロで再組織化しなければならず、ヒドロゲルまたは薄いコーティングを構築するためにのみ適したフィブリルおよび細い線維のみが得られる。
ヒドロゲルは水を含有しているが水不溶性のポリマーであり、その分子は化学的に(例えば、共有結合またはイオン結合により)、あるいは物理的に(例えば、ポリマー鎖を連結することにより)結合されて3次元ネットワークを形成する。不可欠な親水性ポリマー成分により、それらはかなりの体積の取り込みにより水中で膨張するが、それらの物質凝集は失われない。しかしヒドロゲルの欠点は、それらの莫大な水保持能力を考慮すると機械的に不安定であることである。コラーゲンヒドロゲルは細胞の培養のための担体として提案されてきた。しかし機械的安定性の欠如および複合線維の天然構造に起因し、かつヒドロゲルが細胞とのコロニー形成中に凝縮する場合が多いという事実に起因して、コラーゲンヒドロゲルはそれらの使用において非常に限られている。
コラーゲン特性をいくつかの方法で修正し、イオン結合、水素結合または共有結合の形成を得てもよい。網状物の形成によりコラーゲン材料の生分解時間およびコラーゲン線維の機械的強度を増加させると共に、これらの線維の水吸収率、溶解性および酵素分解率を減少させる。コラーゲンを物理的方法または化学的方法のいずれかにより架橋させてもよい。
化学的方法は、アルデヒド化合物、カルボジイミド、ジイソシアネートまたはアジド誘導体などの架橋剤を使用する。そのような方法は、それらの薬剤のいくつかが非常に有毒であり、過剰な架橋がコラーゲン線維の天然構造を損ない、従ってそれらの生体適合性および生分解性に相反するという欠点を有する。
物理的方法のうち、コラーゲン材料を滅菌するだけではなく網状化するためにも、βもしくはγ照射が使用されてきた。β放射線を使用して脱水コラーゲンを滅菌する場合、その抵抗性を予測することが難しい材料が生じる。米国特許第6706684B1号は、濡れた状態のコラーゲン材料をβ放射線で照射することに基づき、インビボでのその生分解速度および機械的特性が調整可能である、コラーゲン材料の調製のためのプロセスについて記載している。使用されるコラーゲン材料は、酸性pHで天然可溶化コラーゲンであったりペプシンでの消化による処理後に得たりしてもよい。それはウシのI型もしくはIII型コラーゲンあるいはそれらの混合物、主に過ヨウ素酸を用いた酸化による切断により修飾されたコラーゲン、加熱によりそのらせん構造を部分的に失ったコラーゲン、官能化コラーゲン、または高分子親水性添加剤(a macro-molecular hydrophilic additive)を含むコラーゲンであってもよい。これらの全ての場合に可溶性コラーゲンが使用される。これらの全てのコラーゲン材料は術後の癒着の予防および/または創傷の治癒のために有用なものとして開示されており、可溶性コラーゲンから調製される。
コラーゲン材料の機械的特性を高めるために当該技術分野において開示されている別の方法は、コラーゲンを他の材料に組み立てることである。先に言及した米国特許第6706684B1号は、照射によって構造化されることが意図されているコラーゲン成分が前もって未変性コラーゲン線維網と組み合わせられている、圧縮物の形態である組み立て体を開示している。他の代替法は、他の成分との足場の形成に基づいている。例えばP.N.Oliveiraらは、異なるコラーゲン:キトサン(Coll:Ch)比を有する多孔性コラーゲン/キトサン足場を開示しており、これは凍結乾燥およびその後の脱水熱処理(DHT)による自己架橋、およびその後のβ放射線による滅菌により調製された。それは、得られたコラーゲン材料を組織工学のための生体材料として使用することも開示している(P.N.Oliveiraら;「自己架橋型線維性コラーゲン/キトサン混合物:処理、特性評価および2波長蛍光イメージングによる分解の監視(Self-crosslinked fibrous collagen/chitosan blends:Processing,properties evaluation and monitoring of degradation by bi-fluorescence imaging)」;International Journal of Biological Macromolecules,2019,pp.353-367を参照)。
当該技術分野において既に開示されているものにも関わらず、望ましくない毒性を有さず、高い品質および安定性ならびにコラーゲン材料を使用目的に適合させるために調整することができる特性を有する、大規模に作製することができるコラーゲン材料を提供することがなお必要とされている。
本発明者らは、安定用薬液を添加せずに調製することができ、架橋剤を使用することを必要とすることなく抵抗性構造が得られ、さらに広範囲の機械的強度を示す非可溶性の天然線維性コラーゲンヒドロゲル構造体を開発した。これらのヒドロゲルは、良好な安定性、特に培地における良好な完全性を示す一連のミクロ孔を有する堅い3D構造体である。それらは他の生体分子と相互作用してもよく、細胞接着を媒介し、かつ従って細胞支持のために有用である。
それらは、特定のサイズの天然フィブリルコラーゲンの酸性媒体中の分散系、特に1~15重量%からなる濃度で水中に分散された天然I型コラーゲン線維から調製することができ、ここでは当該線維は可溶性コラーゲンの場合よりも大きいサイズを有する。酸性質量(acidic mass)は、当該線維の質量の少なくとも90%が1~2のpHで測定した1μm~2500μmの範囲からなる長さおよび0.1~150μmの範囲からなる線維直径を有する線維を含む。より詳細には、酸性質量は、当該線維の全質量の少なくとも90%が1~2のpHで測定した10μm~2500μmの範囲からなる長さおよび5~80μmの範囲からなる線維直径を有し、かつコラーゲン線維の全質量における線維長さの中央値が100~900μmからなる線維を含む。
一般にゼラチンの形態である(不可逆的に加水分解されているコラーゲン)か酵素的に処理されている先行技術で一般に使用されるコラーゲンとは異なり、出発物質として本発明において使用されるI型コラーゲンは、非常に天然であることおよび線維サイズを特徴とする。本発明において使用されるこの天然フィブリルコラーゲン出発物質は、食品産業、例えばネットと肉とを分離するフィルムとしてハム生産の領域で一般に使用される。
従って、可溶性コラーゲン(関連する目的のために先行技術でよく使用されるもの)を使用する米国特許第6706684B1号とは異なり、ヒドロゲルを調製するために出発物質として本発明において使用されるコラーゲンは不溶性コラーゲンであり、これは食品産業が発端であるためにより経済的である。そのような不溶性コラーゲン出発物質が、生物学的材料の培養のために特に適している本発明のコラーゲンヒドロゲルなどのコラーゲンヒドロゲルに対する適当な処理後に得ることができたことは予想外のことである。不溶性コラーゲンの使用は、適当な機械的特性を細胞支持体として使用されるヒドロゲルに与えることに寄与する。そのようなコラーゲンに対して行われる処理(先の酸性質量の中和、生理学的pHへの調整およびβ放射線の照射)は、恐らく得られる架橋結合の程度により最終ヒドロゲルの剛性を制御することに寄与する。
従って本発明の第1の態様は、a)1~15重量%からなる濃度で水中に分散された天然I型コラーゲン線維の酸性質量を提供する工程、b)酸性質量を中和してそのpHを生理学的pHに調整する工程、およびc)最大50KGy(すなわち50KGy以下)の量で工程b)の中和された質量にβ放射線を照射する工程を含むプロセスによって得ることができるミクロ孔を有する3Dフィブリル構造を含むコラーゲンヒドロゲルであって、酸性質量は0.5~5からなるpHを有し、かつ当該線維の全質量の少なくとも90%が1~2のpHで測定した10μm~2500μmの範囲からなる長さおよび5~80μmの範囲からなる線維直径を有する線維を含み、かつコラーゲン線維の全質量における線維長さの中央値が100~900μmからなるコラーゲンヒドロゲルに関する。当該線維のサイズは、実施例3Aに開示されているSympatec QICPIC/Lixell粒子分析器で測定した。
本発明の第2の態様は、a)上に定義されている水中に分散された天然I型コラーゲン線維の酸性質量を提供する工程、b)酸性質量を中和してそのpHを生理学的pHに調整する工程、およびc)最大50KGyの量で工程b)の中和された質量にβ放射線を照射する工程を含む、上に定義されているコラーゲンヒドロゲルを調製するためのプロセスに関する。本発明に係るコラーゲンヒドロゲルの調製は大規模に再現することができ、かつ一定の高品質を有する。
本発明のコラーゲンヒドロゲルは、広範囲の用途で得られるその良好な生体適合性およびその高い機械的安定性により際立っている。特に細胞接着および器官形成におけるその中心的役割により、それは細胞培養および組織工学のための理想的な基質である。従って、本発明の第3の態様は、細胞増殖のための支持体または培養される肉のための足場としての上に定義されているコラーゲンヒドロゲルの使用に関する。
本発明の第4の態様は、a)上に定義されているコラーゲンヒドロゲルである担体材料を提供する工程、b)生物学的材料を工程a)のコラーゲンヒドロゲルと接触させる工程、およびc)前記生物学的材料を培養条件下でコラーゲンヒドロゲル材料と共にインキュベートする工程を含む、生物学的材料の培養のための方法に関する。
本発明の第5の態様は、細胞ベースの治療法または組み合わせ先端医療医薬品(ATMP)などの生物医学的用途に使用するための接着細胞の層を含む上に定義されているコラーゲンヒドロゲルに関する。
定義
本出願において本明細書中で使用される全ての用語は特に明記しない限り、当該技術分野で知られているそれらの通常の意味で理解されるものとする。本出願において使用されている特定の用語のための他のより具体的な定義は以下に記載されているとおりであり、本明細書および特許請求の範囲全体を通して適用されることが意図されている。
本出願において本明細書中で使用される全ての用語は特に明記しない限り、当該技術分野で知られているそれらの通常の意味で理解されるものとする。本出願において使用されている特定の用語のための他のより具体的な定義は以下に記載されているとおりであり、本明細書および特許請求の範囲全体を通して適用されることが意図されている。
本明細書で使用される「約~」または「~前後」または「およそ~」という用語は、値の範囲±指定されている値の10%を指す。例えば「約10」または「10前後」という表現は10の±10%、すなわち9~11を含む。
本明細書で使用される「x~yからなる」または「x~yの範囲からなる」という用語は、その範囲の端点を含む値の範囲を指す。本明細書に開示されている値のどの範囲も、使用されている言い回しに関わらずその領域内での範囲の端点を包含する。
本発明の目的のための「~を含む」という言葉は「~からなる」の場合を包含する。
「当該線維の少なくともx重量%」という表現における「少なくとも」という用語は、与えられている値と等しいかそれよりも高い割合を意味している。
コラーゲン分子は、水素結合相互作用または水素結合によって安定化された三重らせんを構成する互いにらせんを巻いた3つのポリペプチド鎖から構成された細長い分子であり、これが天然コラーゲンの構造である。例えば水の存在下でそれを加熱することにより、あるいはそれを極端なpH値まで加熱することによりコラーゲンが変性された場合、これらの鎖は分離して溶解し、ゼラチンを形成する。ゼラチンの形成はコラーゲン三重らせんを安定化させる水素結合の破壊によるものであり、コラーゲンのゼラチンへの変換プロセスは典型的な変性プロセスとみなされている。本コラーゲン線維の分散系では、ゼラチンは存在しないかその存在は大したものではない。
本明細書における「天然コラーゲン」は、完全または顕著に変性、加水分解またはゼラチン化されていないコラーゲンを意味するように理解される。本発明のヒドロゲルのコラーゲン線維は、変性することなくコラーゲンの単位の三重らせん分子構造を維持する。
「天然I型コラーゲン」という用語は、大部分がI型コラーゲンであるコラーゲンと理解され、それは例えばコラーゲンIIIなどの少量の他のコラーゲンを含有していてもよい。一般にコラーゲンIの量は90重量%以上、好ましくは92重量%以上、より好ましくは95重量%以上、さらにより好ましくは98重量%以上、さらになおより好ましくは99重量%以上である。
「生理学的pH」という用語は、ヒトの体内で通常優勢であるpHと理解される。それはおよそ7.3~7.4である。
本発明のプロセスのpH測定は、pH計を用いて行った(20℃で測定したNaCl0.5%中の試料)。
「ミクロ孔」という用語は、マイクロメートル範囲の孔径を有する孔と理解される。一般に本発明のヒドロゲルにおいて、孔は50μm以上の孔径を有する。多孔度は、環境制御型走査電子顕微鏡(ESEM)技術によって観察する。
「水中に分散された天然I型コラーゲン線維の酸性質量」という文中の「分散された」という用語は、当該質量がpH濃度条件下で溶解されていないが分散されているコラーゲン線維を含有する状態を意味している。
特に明記しない限り本明細書において言及される全ての割合は、その成分の量の合計が100%に等しいという条件で、コラーゲン酸性質量またはヒドロゲルの総重量に対する重量で表されている。
a)1~15重量%からなる濃度で水中に分散された天然I型コラーゲン線維の酸性質量を提供する工程、b)酸性質量を中和してそのpHを生理学的pHに調整する工程、およびc)最大50KGyの量で工程b)の中和された質量にβ放射線を照射する工程を含むプロセスであって、酸性質量は0.5~5からなるpHを有し、かつ当該線維の質量の少なくとも90%が1~2のpHで測定した10μm~2500μmの範囲からなる長さおよび5~80μmの範囲からなる線維直径を有する線維を含み、かつコラーゲン線維の全質量における線維長さの中央値が100~900μmからなるプロセスによって得ることができるミクロ孔を有する3Dフィブリル構造を含むコラーゲンヒドロゲルは、本発明の一部である。一般に本プロセスは室温(20~30℃、一般に20~25℃)で行う。
不溶性I型コラーゲンのこの酸性質量は、その線維が高度に保存された状態であり、長く、強く、かつ天然であることも特徴とする。
上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせられた特定の実施形態では、酸性質量中に分散されているコラーゲン線維の質量の少なくとも90%は20μm~2500μmの範囲からなる線維長さを有する。上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせられた別の特定の実施形態では、酸性質量中に分散されたコラーゲン線維の質量の少なくとも90%は50μm~2500μmの範囲からなる線維長さを有する。
任意に上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせられた別の特定の実施形態では、酸性質量中に分散されたコラーゲン線維の質量の少なくとも80%は50μm~1500μmの範囲からなる線維長さを有する。
上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせられた別の特定の実施形態では、酸性質量中に分散されたコラーゲン線維の質量の少なくとも80%は50μm~1300μmの範囲からなる線維長さを有する。上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせられた別の特定の実施形態では、酸性質量中に分散されたコラーゲン線維の質量の少なくとも80%は50μm~1250μmの範囲からなる線維長さを有する。上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせられた特定の実施形態では、水中に分散されたコラーゲン線維の質量の少なくとも80%は90~1235μmの範囲の線維長さを有する。別の特定の実施形態では、水中に分散されたコラーゲン線維の80%は99~1235μmの範囲の線維長さを有する。
上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせられた別の特定の実施形態では、当該線維の90%が含まれる長さは1500~2500μmの範囲からなる。
コラーゲン線維の全質量における線維長さの中央値は100~900μmの範囲に含まれ、すなわちそれは100~900μmの値である。これは、コラーゲン線維の質量の50%が中央値よりも短い線維によるものであり、かつコラーゲン線維の質量の50%が中央値よりも長い線維によるものであることを意味している。これらの割合は、総酸性質量におけるコラーゲン線維の累積分布(長さ分布)の割合を指す。上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせられた別の特定の実施形態では、コラーゲン線維の全質量における線維長さの中央値は100~500μmの範囲からなる。上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせられた別の特定の実施形態では、コラーゲン線維の全質量における線維長さの中央値は200~400μmからなる。
さらに、酸性質量中に分散されているコラーゲン線維の質量の少なくとも90%は5~80μmの範囲からなる線維直径を有する。任意に上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせられた特定の実施形態では、酸性質量中に分散されたコラーゲン線維の質量の少なくとも80%は5μm~50μmの範囲からなる線維直径を有する。
上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせられた特定の実施形態では、酸性質量中に分散されたコラーゲン線維の質量の少なくとも80%は5~35μmの範囲からなる直径を有する。別の特定の実施形態では、酸性質量中に分散されたコラーゲン線維の質量の少なくとも80%は10~31μmの範囲からなる直径を有する。別の特定の実施形態では、酸性質量中に分散されたコラーゲン線維の質量の80%は10~31μmの範囲からなる直径を有する。
上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせられた別の特定の実施形態では、当該線維の90%が含まれる直径は80~150μmの範囲からなる。上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせられた別の特定の実施形態では、コラーゲン線維の全質量における線維直径の中央値は10~25μmの範囲からなり、すなわちそれは10~25μmの値である。これは、コラーゲン線維の質量の50%が中央値よりも細い線維によるものであり、かつコラーゲン線維の質量の50%が中央値よりも太い線維によるものであることを意味している。これらの割合は、総酸性質量におけるコラーゲン線維の累積分布(直径分布)の割合を指す。上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせられた別の特定の実施形態では、コラーゲン線維の全質量における線維直径の中央値は15~25μmからなる。
上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせられた特定の実施形態では、酸性質量は1~10重量%の天然I型コラーゲンからなる濃度を有する。別の特定の実施形態では、酸性質量は1~8重量%の天然I型コラーゲンからなる濃度を有する。別の特定の実施形態では、酸性質量は1~5重量%の天然I型コラーゲンからなる濃度を有する。別の特定の実施形態では、酸性質量は2~4重量%の天然I型コラーゲンからなる濃度を有する。酸性質量は1~15重量%の間隔に含まれる任意の特定の濃度、すなわち1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%および15%であってもよい。
上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせられた特定の実施形態では、酸性質量は1~3からなるpHを有する。その中和は、水酸化ナトリウム、塩化アンモニウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム緩衝液、トリス緩衝液、炭酸カルシウムまたは4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(Hepes)などの適当なアルカリ化剤を用いて必要とされるpHまで塩基を添加することにより行う。
β放射線の線量は50KGy以下の範囲で照射する。上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせられた特定の実施形態では、照射されるβ放射線は1~50KGyの範囲である。上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせられた別の特定の実施形態では、照射されるβ放射線は5~50KGyの範囲である。上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせられた別の特定の実施形態では、照射されるβ放射線は10~50KGyの範囲である。上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせられた別の特定の実施形態では、照射されるβ放射線は10~25KGyの範囲である。上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせられた別の特定の実施形態では、照射されるβ放射線は15~25KGyの範囲である。
特定の実施形態では、工程c)におけるβ放射線は濡れた状態のコラーゲンに照射する。特定の実施形態では、β放射線は工程b)のコラーゲン質量に直接照射する。
上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせられた特定の実施形態では、本発明に係るコラーゲンヒドロゲルは化学的架橋を有していない。
a)上に定義されている水中に分散された天然I型コラーゲン線維の酸性質量を提供する工程、b)酸性質量を中和してそのpHを生理学的pHに調整する工程、およびc)50KGyまでの範囲で工程b)の中和された質量にβ放射線を照射する工程を含む、上に定義されているコラーゲンヒドロゲルを調製するためのプロセスも本発明の一部である。一般に本プロセスは室温(20~25℃)で行う。
上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせられた本プロセスの特定の実施形態では、β放射線は5~50KGyからなる範囲である。
上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせられた本プロセスの特定の実施形態では、凍結乾燥工程を行うことなくβ放射線を工程b)のコラーゲン質量に直接照射する。
出発物質として使用される酸性質量は、通常は処理に供される大きい線維束および/またはフィブリル凝集体からなり、天然構造を保存しており、より小さい直径および長さの線維を得ることを目的としたコラーゲンの生物学的供給源から得られる。このコラーゲンは水に不溶性である。
従って、本発明のプロセスにおいて使用される酸性質量は、a)コラーゲンを含有する組織を洗浄および切断する工程、b)刻まれた組織を制御された方法で化学的に浸軟する工程、c)工程b)から得られた生成物を水で洗浄する工程、d)c)で得られた洗浄済み生成物のpHを0.5~5の値に調整して工程c)の洗浄済み生成物を膨潤させる工程、e)工程d)の生成物を機械的に切り刻む工程、およびf)それを所望の濃度、特に1%~15重量%まで水中に分散させる工程を含むプロセスにより前もって調製することができる。
特定の実施形態では、コラーゲン含有組織は結合組織である。一般に結合組織は、真皮、骨、腱、軟骨および腸から選択される。特定の実施形態では、結合組織は真皮組織であり、より好ましくはコラーゲンは真皮と呼ばれる層から抽出される。特定の実施形態では、結合組織はウシ、ヒツジ、ブタ、トリまたは魚由来のものあるいはそれらの混合物である。別の特定の実施形態では、結合組織はウシ由来のものであり、1歳を超える年齢、一般に1~3歳の動物からのものである。
一般に結合組織が真皮である場合には、工程a)の前に真皮を脱毛および漂白する。漂白工程のための酸化剤の例は希釈過酸化水素である。
工程b)はアルカリ化剤、例えば水酸化カルシウムまたは水酸化ナトリウムの存在下であって酵素の存在下または非存在下で行うことができる。特定の実施形態では、工程b)は、例えばNa2SおよびCa(OH)2などの硫化物塩およびアルカリ処理を用いて行う。
特定の実施形態では、工程d)において酸性化するために使用される酸は塩酸、乳酸、酢酸およびクエン酸から選択される。別の特定の実施形態では、それを1~5のpHまで酸性化させる。
Viscolma(登録商標)(水中に最大15%のコラーゲン線維含有量)などの市販のコラーゲン質量もコラーゲン酸性質量として使用することができる。
そのプロセスによって画定される生成物の具体的な特定の実施形態は、それを得るためのプロセスの特定の実施形態でもある。
本発明のプロセスによって得ることができるコラーゲンヒドロゲルの構造が実施例に示されている。従って例えば実施例4Aは、本発明のコラーゲンヒドロゲルが600μm前後の平均長さおよび15μm前後の平均直径を有する実施例のこの特定の事例において、その構造の線維を含むことを示している。
生物医学的用途において、特に細胞増殖のための支持体としてヒドロゲルを使用するために、ヒドロゲルの最小のコンシステンシーおよび完全性は細胞が増殖するために必要とされる剛性を維持するために保証されなければならない。これは最小の弾性率を必要とする。弾性率すなわち貯蔵弾性率(G’)は、材料中に蓄積されるエネルギーに関連している。粘性すなわち損失弾性率(G’’)は材料によって散逸されるエネルギーに関連している。
全ての組織が、それらの構造および機能において重要な異なる固有の物理的特性を有する。体の最も硬い組織は歯であり、骨の筋肉は中間であり、最も軟らかいものの中には肺および脳が存在する。本発明のヒドロゲルの剛性は、使用目的に必要とされる剛性を有するように調整することができる。有利には、本発明のコラーゲンヒドロゲルは広範囲の剛性で調製することができる。
実施例は、25KGyで照射されており、かつ1重量%~10重量%のコラーゲン含有量のヒドロゲルにおいて2500Pa~70000Paの範囲の弾性率G’(すなわち広範囲の剛性)および90Pa~4730Paの範囲の粘性弾性率G’’を有する本発明に係るコラーゲンヒドロゲルを例証している。
細胞増殖のための支持体としての上に定義されているコラーゲンヒドロゲルの使用も、本発明の一部である。
本発明者らが見出したように、生体細胞の培養は指定されているpH値で特に成功している。従ってコラーゲンヒドロゲルは、生理学的領域に位置するpH値を示し、従って生体細胞の自然環境に広く類似している設定を提供する。この場合、コラーゲンが天然であることが非常に有利であるが、その理由は、このようにそれが元のコラーゲン構造により酷似し、生物において細胞増殖が生じる元の環境をより大きい類似性で複製するからである。その上、本発明のヒドロゲルは生理学的pHにおいて長期間インタクトであり、かつ堅いままであるために十分な程に剛直である。
a)上に定義されているコラーゲンヒドロゲル材料である担体材料を提供する工程、b)生物学的材料を工程a)のコラーゲンヒドロゲル材料と接触させる工程、およびc)培養条件下で前記生物学的材料をコラーゲンヒドロゲル材料と共にインキュベートする工程を含む、生物学的材料の培養のための方法も本発明の一部である。好適な培養条件は、例えば37℃前後の温度および5%CO2である。
特定の実施形態では、生物学的材料はマウスの皮下結合組織からの線維芽細胞である。別の特定の実施形態では、生物学的材料はヒトの腎臓胚細胞である。
本発明のコラーゲンヒドロゲルは、生体適合性および取り扱い性の点で良好な特性を有する。これらは再生医療における新しい治療法のための生体材料に対する重要な要件である。
その上、用途に応じて弾性、引き裂き抵抗性および生分解性に関する要件は非常に異なり得る。天然線維で作られた本発明のヒドロゲルは、細胞移入および移植が目的とされる場合には適当であるとみなされる。
従って、細胞系治療などの生物医学的使用のため、あるいは組み合わせ先端医療医薬品(ATMP)として接着細胞の層を含む上に定義されているコラーゲンヒドロゲルも、本発明の一部である。
接着細胞の層を含む上に定義されているコラーゲンヒドロゲルは、移植片として使用するためのものであってもよい。細胞が播種されるコラーゲンヒドロゲルは即座に移植するができ、あるいは培養後に移植することができる。
それは培養される肉のための足場として適当であるともみなされる。従って、この使用も本発明の一部である。
本明細書および特許請求の範囲全体を通して、「~を含む」という単語およびその単語の変形は、他の技術的特徴、添加剤、成分または工程を排除するものではない。本発明のさらなる目的、利点および特徴は、本明細書を考察すれば当業者には明らかになり、あるいは本発明の実施によって学んでもよい。以下の実施例および図面は例示として提供されており、本発明を限定するものではない。図面に関連しており、かつ請求項ではカッコに入れて付されている符号は、単に請求項の理解容易性を高めることを試みるためのものであり、請求項の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。さらに本発明は、本明細書に記載されている特定の好ましい実施形態の全ての可能な組み合わせを包含する。
完全性のために、本発明の様々な態様が以下の番号付きの条項に記載されている。
条項1.a)1~15重量%からなる濃度で水中に分散された天然I型コラーゲン線維の酸性質量を提供する工程、b)前記酸性質量を中和してそのpHを生理学的pHに調整する工程、およびc)50KGyまでの範囲で工程b)の前記中和された質量にβ放射線を照射する工程を含むプロセスによって得ることができるミクロ孔を有する3Dフィブリル構造を含むコラーゲンヒドロゲルであって、前記酸性質量は0.5~5からなるpHを有し、かつ前記酸性質量は、前記線維の全質量の少なくとも90%が1~2のpHで測定した1μm~2500μmの範囲からなる長さおよび0.1~150μmの範囲からなる線維直径を有する線維を含むコラーゲンヒドロゲル。
条項2.前記酸性質量中の前記線維の質量の少なくとも80%は50~1300μmの範囲からなる線維長さを有する、条項1に記載のコラーゲンヒドロゲル。
条項3.前記コラーゲン線維の全質量における前記線維長さの中央値は100~900μmからなる、条項1~2のいずれかに記載のコラーゲンヒドロゲル。
条項4.前記コラーゲン線維の全質量における前記線維長さの中央値は100~500μmからなる、条項3に記載のコラーゲンヒドロゲル。
条項5.酸性質量中の前記線維の質量の少なくとも80%は5~50μmの範囲からなる線維直径を有する、条項1~4のいずれかに記載のコラーゲンヒドロゲル。
条項6.前記コラーゲン線維の全質量における前記線維直径の中央値は10~25μmの範囲からなる、条項1~5のいずれかに記載のコラーゲンヒドロゲル。
条項7.前記酸性質量は1~10重量%の天然I型コラーゲンからなる濃度を有する、条項1~6のいずれかに記載のコラーゲンヒドロゲル。
条項8.前記酸性質量は2~4重量%の天然I型コラーゲンからなる濃度を有する、条項7に記載のコラーゲンヒドロゲル。
条項9.前記酸性質量は1~3からなるpHを有する、条項1~8のいずれかに記載のコラーゲンヒドロゲル。
条項10.前記放射線は10~25KGyからなる、条項1~9のいずれかに記載のコラーゲンヒドロゲル。
条項11.条項1~10のいずれかに記載のコラーゲンヒドロゲルを調製するためのプロセスであって、a)条項1~10のいずれかに記載の水中に分散された天然I型コラーゲン線維の酸性質量を提供する工程、b)前記酸性質量を中和してそのpHを生理学的pHに調整する工程、およびc)50KGyまでの範囲で工程b)の前記中和された質量にβ放射線を照射する工程を含むプロセス。
条項12.a)コラーゲンを含有する組織を洗浄および切断する工程、b)前記刻まれた組織を制御された方法で化学的に浸軟する工程、c)工程b)から得られた前記生成物を水で洗浄する工程、d)c)で得られた前記洗浄済み生成物のpHを0.5~5の値に調整して工程c)の前記洗浄済み生成物を膨潤させる工程、e)工程d)の前記生成物を機械的に切り刻む工程、およびf)それを好ましくは1%~15%の濃度まで水中に分散させる工程を含むプロセスによって前記酸性質量を調製することをさらに含む、条項11に記載のプロセス。
条項13.細胞増殖のための支持体または培養される肉のための足場としての条項1~10のいずれかに記載のコラーゲンヒドロゲルの使用。
条項14.a)条項1~10のいずれかに記載のコラーゲンヒドロゲル材料である担体材料を提供する工程、b)生物学的材料を工程a)の前記コラーゲンヒドロゲル材料と接触させる工程、およびc)前記生物学的材料を培養条件下で前記コラーゲンヒドロゲル材料と共にインキュベートする工程を含む、生物学的材料の培養のための方法。
条項15.生物医学的用途に使用するための接着細胞の層を含む、条項1~10のいずれかに記載のコラーゲンヒドロゲル。
実施例1:非変性I型コラーゲン酸性質量の調製
コラーゲン質量を調製するために、18~26月齢のウシ動物の皮膚を標準的な脱毛プロセス(例えば硫黄塩(Na2S)を用いる)に供した。次いで皮膚を分割し、真皮を抽出し、そこからコラーゲンを得た。次いで、
a)コラーゲンを含有する組織を水で洗浄し、かつ細かく切断する工程、
b)切断した組織をNa2SおよびCa(OH)2により化学的に浸軟する工程、
c)工程b)から得られた生成物を水で洗浄する工程、
d)c)で得られた洗浄済み生成物のpHを0.5~5の値、より詳細には1~3の値に調整して工程c)の洗浄済み生成物を膨潤させる工程、
e)工程d)の生成物を機械的に切り刻む工程、および
f)それを好ましくは1%~15%の濃度まで水中に分散させる工程
を続けた。
コラーゲン質量を調製するために、18~26月齢のウシ動物の皮膚を標準的な脱毛プロセス(例えば硫黄塩(Na2S)を用いる)に供した。次いで皮膚を分割し、真皮を抽出し、そこからコラーゲンを得た。次いで、
a)コラーゲンを含有する組織を水で洗浄し、かつ細かく切断する工程、
b)切断した組織をNa2SおよびCa(OH)2により化学的に浸軟する工程、
c)工程b)から得られた生成物を水で洗浄する工程、
d)c)で得られた洗浄済み生成物のpHを0.5~5の値、より詳細には1~3の値に調整して工程c)の洗浄済み生成物を膨潤させる工程、
e)工程d)の生成物を機械的に切り刻む工程、および
f)それを好ましくは1%~15%の濃度まで水中に分散させる工程
を続けた。
当該質量中のコラーゲンの割合を見い出すために、公知の量の質量を秤量し、一定の重量が得られるまで160℃の真空オーブン中で乾燥させ、得られた乾燥抽出物を秤量した。全質量に対する乾燥コラーゲンの比を計算した。
実施例2:コラーゲンヒドロゲルの調製
コラーゲンヒドロゲルを調製するために、実施例1に従って得られた5~10%のコラーゲン濃度のコラーゲン質量を使用した。
コラーゲンヒドロゲルを調製するために、実施例1に従って得られた5~10%のコラーゲン濃度のコラーゲン質量を使用した。
それを4%の固体濃度になるまで捏和機を用いて水で希釈し、これを実施例1で述べた方法に従って計算した。その後に1.5mm厚のフィルムを作製し、50mMのNaOH中に浸漬してそれをpHの上昇により凝固させ、最後にpH7.4のリン酸緩衝液(PBS)で洗浄した。このヒドロゲルを25kGyのβ放射線で照射してコラーゲンを架橋させ、かつそれを滅菌した。
2%コラーゲン質量からヒドロゲルを作製するために、当該質量を2%乾燥コラーゲンまで希釈したこと以外は上で述べた同じプロトコルに従った。
図1は得られたヒドロゲルの画像を示し、図1Aは4%コラーゲン質量からのヒドロゲルを示し、図1Bは2%コラーゲン質量からのヒドロゲルを示す。
実施例3:未変性I型コラーゲン酸性質量の特性評価
実施例3A:動的画像解析による実施例1の酸性質量の形態学的解析。可溶性コラーゲンおよびコラーゲンゼラチンとの比較
実施例1の酸性質量の動的画像解析により形態学的解析を行った。この目的のために、それを脱イオン水中で1%になるまで希釈し、1MのHClによりおよそ1.5のpHに調整した。希釈した試料を2500rpmで10分間ボルテックスで撹拌し、脱イオン水で1/20に希釈した。
実施例1の酸性質量の動的画像解析により形態学的解析を行った。この目的のために、それを脱イオン水中で1%になるまで希釈し、1MのHClによりおよそ1.5のpHに調整した。希釈した試料を2500rpmで10分間ボルテックスで撹拌し、脱イオン水で1/20に希釈した。
4~2888μmの粒径測定範囲でキュベット(0.5mmの幅)連続フローを備えたSympatec社製QICPIC/Lixell粒子分析器で測定を行った。コラーゲン懸濁液には典型的である粒子分布の大きい不均一性により、2つの副次試料の少なくとも3回の個々の測定を行った。全部で百万から三百万個の粒子が検出された。
線維長さおよび直径分布に基づく評価を行った。試料におけるコラーゲン線維の全質量中の特定の長さまたは幅の線維の割合を計算した。表1および表2は、平均値から計算した全質量中のコラーゲン線維の累積分布の10、16、50、50、84および90%の割合についての長さおよび直径(単位:μm)を示す。
線維長さの中央値の値は383μmである。これは、当該質量に含まれている線維の半分が383μmよりも大きい長さを有し、80%が99~1235μmの範囲を含むことを意味している。そして線維直径の累積分布は19μmの中央値を有し、線維の80%は10μm~31μmの直径範囲である。
製造業者の説明書に従って、ゲル化前に光学顕微鏡において可溶性コラーゲン溶液(比較例は米国特許第6706684B1号と同様に可溶性コラーゲンの使用を表してる)を観察することを試みたが、コラーゲンフィブリルを全く観察することができなかった。従ってフィブリルが検出不可能であるため、動的画像解析は行わなかった。
ウシ由来のゼラチン(比較用)を可溶化して上で述べた同じ分析を行い、線維は検出されなかった。
実施例4:本発明のヒドロゲルの特性評価
実施例4A:光学顕微鏡法によるヒドロゲルの線維サイズの決定
実施例2に従って作製した本発明の2%コラーゲンヒドロゲル、可溶性コラーゲンから作製したゲル(比較用)、および2%ゼラチンゲル(比較用)の線維のサイズを決定した。
実施例2に従って作製した本発明の2%コラーゲンヒドロゲル、可溶性コラーゲンから作製したゲル(比較用)、および2%ゼラチンゲル(比較用)の線維のサイズを決定した。
2%コラーゲンヒドロゲル中に存在するコラーゲン線維のサイズの分析を行った。この目的のために、このゲルをULTRATURRAXの助けを借りて1:10の比で脱イオン水中で粉砕し、少量をスライド上に置き、乾燥させた。それを0.1%シリウスレッド(ダイレクトレッド80)染料溶液で1時間覆い、次いで過剰な染料を除去した。次いでこれらの試料を観察し、光学顕微鏡下で定量化した。
ゼラチン粉末を30分間にわたって50℃の温度で脱塩水中に可溶化させることにより、2%ウシゼラチン溶液(比較用)を調製した。粉末を溶解したら、1NのNaOHの添加によりこの溶液をpH7.4に中和した。次いでヒドロゲルの場合と同じプロトコルを続け、すなわちそれを同じ比になるまで粉砕し、スライド上に置き、染色した。
可溶性コラーゲンの測定のために、0.5%可溶性コラーゲン(比較用)を製造業者のプロトコルに従ってゲル化して線維を形成させ、このゲルを粉砕し、スライド上に置き、上記同じプロトコルに従った。
図2は、光学顕微鏡法による本発明のヒドロゲルの線維サイズを示す。画像1および2はヒドロゲルの線維サイズに対応しており、画像3および4は可溶性コラーゲン(比較用)の線維サイズに対応している。画像5および6はヒドロゲル線維の直径を示し、画像7は可溶性コラーゲンの直径を示す。
従って、ヒドロゲルでは318μm(画像1)~1214μm(画像2)の長さのフィブリルが検出された。他方、可溶性コラーゲンでは67(画像3)~245μm(画像4)の範囲のフィブリルのクラスターが検出された。
当該線維の直径は明らかに異なり、ヒドロゲルの場合には10μmの最小直径(画像5)および29μmの最大直径(画像6)であり、可溶性コラーゲンでは0.7μmの最小直径および1.5μmの最大直径(画像7)である。
他方、ゼラチンゲルでは線維は検出されなかった。
その後に、1MのHClでpH2.5に調整した脱イオン水で酸性媒体ゲルを再可溶化することを試み、それを撹拌しながら24時間放置した。それを0.05%の最終濃度まで希釈し、スライド上に置き、乾燥させ、0.1%シリウスレッド染色で1時間染色した。ヒドロゲルの場合、10μm~300μm超の直径を有する線維の凝集体が観察された(図3、画像8)。これらの中で、凝集体から巻き解かれたいくつかの線維を観察することができた(図2、画像9)。他方、可溶性コラーゲンでは線維は観察されなかった。
実施例4B:ESEM技術を用いた1、2、3および4%コラーゲンを含有するヒドロゲルの内部構造
ヒドロゲルの内部構造を調べるために環境制御型走査電子顕微鏡(ESEM)技術を使用し、これは当該試料の温度を変化させ、かつ機器に導入される水蒸気圧力と組み合わせるのを可能にし、当該試料の湿度を制御することができる(1%~100%の相対湿度)。これにより、それらを修正することなく、現実と可能な限り近い当該試料の構造を知ることが可能になる。
ヒドロゲルの内部構造を調べるために環境制御型走査電子顕微鏡(ESEM)技術を使用し、これは当該試料の温度を変化させ、かつ機器に導入される水蒸気圧力と組み合わせるのを可能にし、当該試料の湿度を制御することができる(1%~100%の相対湿度)。これにより、それらを修正することなく、現実と可能な限り近い当該試料の構造を知ることが可能になる。
当該試料を横方向に切断し、SEMスタンドの上に垂直に置いた。それらを100%湿度およびより低い湿度(30%~60%)の両方で観察し、従ってそれらを乾燥させ、より強いコントラストでそれらが含む孔を観察することができた。
細胞内在化を促進するために多孔度は重要である。図3はヒドロゲルの2つの異なるスケールでのESEM写真である。図3の写真は、コラーゲンの割合が増加するにつれて当該構造の多孔度がどのように減少するかを示すが、それは大きい孔(50μmよりも大きい)をなお有し、それらの多くにおいて相互接続を認めることができる。
示されている写真はおよそ50%の湿度で撮影された画像に対応しており、各種類のヒドロゲルのために2つの異なるスケールで含まれており、それらはコラーゲンのフィブリル構造およびこれらの線維の接続を示す。
実施例5:本発明のヒドロゲルのレオロジー
実施例5A:異なるコラーゲン濃度と照射線量とを組み合わせたヒドロゲルのレオロジー
実施例2に従って1%~10%のコラーゲン割合を有する質量からヒドロゲルを調製し、その後にこれらを照射なしで分析し、10kGyおよび25kGyの強度でβ線で照射してヒドロゲルのレオロジーに対するこれらの変数の効果を観察した。
実施例2に従って1%~10%のコラーゲン割合を有する質量からヒドロゲルを調製し、その後にこれらを照射なしで分析し、10kGyおよび25kGyの強度でβ線で照射してヒドロゲルのレオロジーに対するこれらの変数の効果を観察した。
この分析のためのプロトコル:この目的のために、20mmのプレート-プレート回転子を備えたModulate Advanced Rheometer System MARS 40(Thermo Haake)を使用した。1Pa~15000Paの応力範囲
、非照射試料ではヒドロゲルの試料の初期の厚さの50%(通常は1.5~2.5mm)、照射試料では脆さの増加により30%の高さのプレート間距離を維持する1Hzの固定周波数、および15.0℃の測定温度で、振動応力掃引試験を行った。試験前に測定温度を保証するために、設定した間隙に達したら当該試料をプレート間で10分間適切な状態にした。
固定された周波数での応力掃引により、線形の粘弾性領域を特定することができる。
材料の応答は材料構造のみに依存しており、応力または歪みなどのレオロジーパラメータとは独立しているため、線形の粘弾性領域における振動測定は非常に重要である。
試験中に、G’およびG’’(縦座標軸)の値を応力(横座標軸)の関数としてプロットした。
弾性率すなわち貯蔵弾性率(G’)は材料に蓄積されているエネルギーに関連しており、粘性すなわち損失弾性率(G’’)は材料によって散逸されるエネルギーに関連している。
コラーゲン線量が増加するにつれて、1%ゲルにおける860Paから10%コラーゲン含有量ゲルにおける20980Paの範囲でヒドロゲルの弾性率が上昇する。
同じことがゲルに照射した場合にも生じ、照射線量が増加するにつれて材料架橋および弾性率が著しく上昇する。
図4は、本発明のヒドロゲルのこれらのレオロジーデータも示す。
このようにして、照射なしでの1%ゲルに対応する860Paから25kGyで照射した10%ゲルに対応する66340Paまでの範囲が達成され、これにより、これらのパラメータを変えることにより弾性率をカスタマイズすることが可能になる。
実施例5B:4%ヒドロゲル対4%ゼラチンおよび可溶性コラーゲンゲルのレオロジーの比較
レオロジー分析のために、ヒドロゲルを4%コラーゲン質量から調製し、実施例2に従って25kGyで照射し、実施例3の第2部と同じ方法でゼラチンおよび可溶性コラーゲンゲルから調製し、その後に25kGyで照射した。レオロジー測定は実施例4の第1部(ヒドロゲルのレオロジー)の場合と同じプロトコルに従った。
レオロジー分析のために、ヒドロゲルを4%コラーゲン質量から調製し、実施例2に従って25kGyで照射し、実施例3の第2部と同じ方法でゼラチンおよび可溶性コラーゲンゲルから調製し、その後に25kGyで照射した。レオロジー測定は実施例4の第1部(ヒドロゲルのレオロジー)の場合と同じプロトコルに従った。
細胞増殖のための支持体として使用される生物医学的用途に使用するためのゲルの剛性を維持することが重要である。これは高い弾性率(G’)を必要とする。
応力掃引試験の結果が表5に示されている。
ヒドロゲルの弾性率は他の2つの試験したゲルよりも著しく高かった。可溶性コラーゲンの場合、他の材料と同じ位に高いコラーゲン濃度を達成することは不可能であるが、照射された生成物のG’値は非常により低かった。
実施例6-第1部:線維芽細胞株による細胞培養
実施例2で述べたように、25KGyで照射した4%コラーゲンを含む質量からヒドロゲルを得、その後にインビトロアッセイを行った。この目的のために、ゲルを栄養強化ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)において24時間平衡化した。マウスの皮下結合組織からの線維芽細胞(l929株)を培養し、全部で100,000細胞/cm2を再懸濁させた。
実施例2で述べたように、25KGyで照射した4%コラーゲンを含む質量からヒドロゲルを得、その後にインビトロアッセイを行った。この目的のために、ゲルを栄養強化ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)において24時間平衡化した。マウスの皮下結合組織からの線維芽細胞(l929株)を培養し、全部で100,000細胞/cm2を再懸濁させた。
細胞の正しい可視化のために、DilC12染色プロトコル(膜標識)を行い、その後に倒立蛍光顕微鏡(TxRedフィルタ)を用いて可視化を行った。図5の画像1および2はそれぞれ、播種から2日および5日後に得られたl929株を用いたDilC12染色後のコラーゲンゲル上での細胞培養を示す。
実施例6-第2部:ヒトの腎臓胚株を用いた細胞培養
次いで、異なるコラーゲン濃度、照射線量および弾性率(表6を参照)のコラーゲンヒドロゲル上でインビトロ実験を行い、その入手プロセスは実施例2および実施例4Aで述べたものである。ヒドロゲルを得たら、それらを栄養強化ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)において24時間平衡化し、ヒトの腎臓胚細胞(293T株)を500,000細胞/cm2のコンフルエンスで培養した。
次いで、異なるコラーゲン濃度、照射線量および弾性率(表6を参照)のコラーゲンヒドロゲル上でインビトロ実験を行い、その入手プロセスは実施例2および実施例4Aで述べたものである。ヒドロゲルを得たら、それらを栄養強化ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)において24時間平衡化し、ヒトの腎臓胚細胞(293T株)を500,000細胞/cm2のコンフルエンスで培養した。
異なるヒドロゲルでの培養後に、ゲルの完全な溶解まで、それらをトリプシンおよびコラゲナーゼによる組み合わせ処理(トリプシン-EDTA(0.05%)と共に20分の第1のインキュベーション、その後にコラゲナーゼ500U/mlと共に第2のインキュベーション)により脱細胞化した。この後に、トリパンブルーによる染色およびノイバウエル計算板での計数により、細胞計数を行った。図6は、異なるゲル上での1日、6日および10日間の増殖後に得られた細胞数を示す。より高い弾性率(G’)を有するゲル(10および25kGyで処理した4%コラーゲンを含むもの)が、より高い細胞コンフルエンスで6日および10日後の両方において存在した。
図7は、前もって25KGyで照射した4%ヒドロゲル上の293T細胞株を示す。細胞をヘマトキシリン-エオシンで染色した。1日目(図8.1)に細胞を単層を形成しているヒドロゲルに接着させた。6日目(図8.2)および10日目(図8.3)の両方において2~3層を含む多層の細胞によって覆われたいくつかの領域が観察された。10日目(図8.4)に複数の層(14~15層)の細胞を含むいくつかの領域が検出された。
実施例7:培地における安定性
実施例2に従って2%質量からヒドロゲルを調製し、10kGyおよび25kGyで照射して培地における安定性を評価した。この目的のために、それらをDMEM栄養強化培地に浸漬し、オーブン中37℃で7日間インキュベートした。インキュベーション期間後に、ヒドロゲルの直径は僅かに減少したが、コンシステンシーは実質的に変化しなかった。
実施例2に従って2%質量からヒドロゲルを調製し、10kGyおよび25kGyで照射して培地における安定性を評価した。この目的のために、それらをDMEM栄養強化培地に浸漬し、オーブン中37℃で7日間インキュベートした。インキュベーション期間後に、ヒドロゲルの直径は僅かに減少したが、コンシステンシーは実質的に変化しなかった。
図8の画像1は培地に浸漬する前のヒドロゲルを示し、画像2はインキュベーションから7日後のヒドロゲルを示し、ここではヒドロゲルの直径の減少を認めることができる。
図8の画像3、4および5は、培地への浸漬前の10kGyで照射したコラーゲンの2%質量から調製したヒドロゲル、インキュベーションから7日後の10kGyで照射したコラーゲンの2%質量から調製したヒドロゲル、およびインキュベーションから7日後の25kGyで照射したコラーゲンの2%質量から調製したヒドロゲルをそれぞれ示し、ここでは、その剛性および構造が実質的に影響されていないことが分かる。
より高い質量濃度のコラーゲンから調製したヒドロゲルでは、直径の減少はより少なく、これは図8の画像6および7に示されており、これらは培地への浸漬前(画像6)およびインキュベーションから7日後(画像7)の10kGyおよび25kGyで照射したコラーゲンの4%質量から調製したヒドロゲルに対応している。
先行技術文献
特許文献
・米国特許第56706684B1号
非特許文献
・P.N.Oliveiraら;「自己架橋型線維性コラーゲン/キトサン混合物:処理、特性評価および2波長蛍光イメージングによる分解の監視(Self-crosslinked fibrous collagen/chitosan blends:Processing,properties evaluation and monitoring of degradation by bi-fluorescence imaging)」;International Journal of Biological Macromolecules,2019,pp.353-367
特許文献
・米国特許第56706684B1号
非特許文献
・P.N.Oliveiraら;「自己架橋型線維性コラーゲン/キトサン混合物:処理、特性評価および2波長蛍光イメージングによる分解の監視(Self-crosslinked fibrous collagen/chitosan blends:Processing,properties evaluation and monitoring of degradation by bi-fluorescence imaging)」;International Journal of Biological Macromolecules,2019,pp.353-367
Claims (15)
- a)1~15重量%からなる濃度で水中に分散された天然I型コラーゲン線維の酸性質量を提供する工程、
b)前記酸性質量を中和してそのpHを生理学的pHに調整する工程、および
c)50KGyまでの範囲で工程b)の前記中和された質量にβ放射線を照射する工程
を含むプロセスによって得ることができるミクロ孔を有する3Dフィブリル構造を含むコラーゲンヒドロゲルであって、
・前記酸性質量は0.5~5からなるpHを有し、
・前記酸性質量は、前記線維の全質量の少なくとも90%が1~2のpHで測定した10μm~2500μmの範囲からなる長さおよび5~80μmの範囲からなる線維直径を有する線維を含み、かつ
前記コラーゲン線維の全質量における前記線維長さの中央値は100~900μmからなるコラーゲンヒドロゲル。 - 前記酸性質量中の前記線維の質量の少なくとも80%は50~1300μmの範囲からなる線維長さを有する、請求項1に記載のコラーゲンヒドロゲル。
- 前記コラーゲン線維の全質量における前記線維長さの中央値は100~500μmからなる、請求項2に記載のコラーゲンヒドロゲル。
- 前記コラーゲン線維の全質量における前記線維長さの中央値は200~400μmからなる、請求項3に記載のコラーゲンヒドロゲル。
- 前記酸性質量中の前記線維の質量の少なくとも80%は5~50μmの範囲からなる線維直径を有する、請求項1~4のいずれかに記載のコラーゲンヒドロゲル。
- 前記コラーゲン線維の全質量における前記線維直径の中央値は10~25μmの範囲からなる、請求項1~5のいずれかに記載のコラーゲンヒドロゲル。
- 前記酸性質量は1~10重量%の天然I型コラーゲンからなる濃度を有する、請求項1~6のいずれかに記載のコラーゲンヒドロゲル。
- 前記酸性質量は2~4重量%の天然I型コラーゲンからなる濃度を有する、請求項7に記載のコラーゲンヒドロゲル。
- 前記酸性質量は1~3からなるpHを有する、請求項1~8のいずれかに記載のコラーゲンヒドロゲル。
- 前記放射線は10~25KGyからなる、請求項1~9のいずれかに記載のコラーゲンヒドロゲル。
- 請求項1~10のいずれかに記載のコラーゲンヒドロゲルを調製するためのプロセスであって、
a)請求項1~10のいずれかに記載の水中に分散された天然I型コラーゲン線維の酸性質量を提供する工程、
b)前記酸性質量を中和してそのpHを生理学的pHに調整する工程、および
c)50KGyまでの範囲で工程b)の前記中和された質量にβ放射線を照射する工程
を含むプロセス。 - a)コラーゲンを含有する組織を洗浄および切断する工程、
b)前記切断された組織を制御された方法で化学的に浸軟する工程、
c)工程b)から得られた生成物を水で洗浄する工程、
d)c)で得られた前記洗浄済み生成物のpHを0.5~5の値に調整して工程c)の前記洗浄済み生成物を膨潤させる工程、
e)工程d)の前記生成物を機械的に切り刻む工程、および
f)それを好ましくは1%~15%の濃度まで水中に分散させる工程
を含むプロセスによって前記酸性質量を調製することをさらに含む、請求項11に記載のプロセス。 - 細胞増殖のための支持体または培養される肉のための足場としての請求項1~10のいずれかに記載のコラーゲンヒドロゲルの使用。
- a)請求項1~10のいずれかに記載のコラーゲンヒドロゲル材料である担体材料を提供する工程、
b)生物学的材料を工程a)の前記コラーゲンヒドロゲル材料と接触させる工程、および
c)前記生物学的材料を培養条件下で前記コラーゲンヒドロゲル材料と共にインキュベートする工程
を含む、生物学的材料の培養のための方法。 - 生物医学的用途に使用するための接着細胞の層を含む、請求項1~10のいずれかに記載のコラーゲンヒドロゲル。
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