BR102021018255A2 - Biogel com nanopartículas piezoelétricas, processo e uso - Google Patents

Abstract

A presente tecnologia se refere a um biogel contendo nanopartículas piezoelétricas e seu processo de produção. Se refere também ao seu uso, para a produção de medicamentos com atividade osteoindutora. O processo proposto consiste na utilização de colágeno de baixo custo em forma de scaffolds em associação com nanopartículas de BaTiO3 (NPTB) piezoelétricas, para formação de biogéis. Os biogéis da presente tecnologia apresentam a capacidade de promover a osteocondução e a osteoindução de células da linhagem osteoblástica in vitro sem a necessidade de suplementação com fatores químicos osteoindutores. Quando utilizados in vivo possuem o potencial de otimizar o processo de reparo tecidual podendo ser administrados nas áreas de defeito ósseo após procedimentos cirúrgicos. Além disso, o biogel possui a vantagem de ser de fácil produção, baixo custo e biocompatível.

Description

BIOGEL COM NANOPARTÍCULAS PIEZOELÉTRICAS, PROCESSO E USO

[01] A presente tecnologia se refere a um biogel contendo nanopartículas piezoelétricas e seu processo de produção. Se refere também ao seu uso, para a produção de medicamentos com atividade osteoindutora. O processo proposto consiste na utilização de colágeno de baixo custo em forma de scaffolds em associação com titanato de bário (BaTiO3) na forma de nanopartículas piezoelétricas, para produção de biogéis. Os biogéis da presente tecnologia apresentam a capacidade de promover a osteocondução e a osteoindução de células da linhagem osteoblástica in vitro sem a necessidade de suplementação com fatores químicos osteoindutores. Quando utilizados in vivo possuem o potencial de otimizar o processo de reparo tecidual podendo ser administrados nas áreas de defeito ósseo após procedimentos cirúrgicos. Além disso, o biogel possui a vantagem de ser de fácil produção, baixo custo e biocompatível.

[02] Grande parte das hospitalizações por trauma está relacionada ao quadro clínico de fratura que gera perda da produtividade dos indivíduos internados, além de grande custo com cuidados médicos. Uma complicação no cuidado com estes indivíduos está relacionada ao quadro de não união óssea, que tem sido relacionado à diferentes aspectos como a extensão da área da lesão, presença de comorbidades tais como diabetes e osteoporose, além de características relacionadas à idade e tabagismo.

[03] Em tais condições a capacidade fisiológica de reparo ósseo está prejudicada e o processo de consolidação das fraturas exige intervenções que favoreçam a restauração tecidual. O padrão ouro nos procedimentos de reparo ósseo em lesões extensas consiste na utilização de autoenxertos que apesar de apresentarem baixo risco de infecção, estão envolvidos com ο desenvolvimento de morbidades devido à necessidade de realizar a obtenção cirúrgica do enxerto em um tecido saudável.

[04] Como alternativas terapêuticas, substitutos ósseos têm sido desenvolvidos para promover o reparo de lesões. Dentre eles encontram-se os implantes metálicos que já são amplamente utilizados para fixação e protetização, assim como diferentes polímeros e biomateriais à base de proteínas e/ou sacarídeos que são comumente associados com fatores químicos e materiais cerâmicos como fosfatoβ - tricálcico e a hidroxiapatita (HA) para formação de scaffolds que apresentem características que permitam a adesão, proliferação, diferenciação e maturação celular com a finalidade de promover o reparo do tecido.

[05] Nesse contexto os scaffolds devem ser biocompatíveis, não imunogênicos, capazes de preencher o espaço onde serão introduzidos, permitindo a integração com os tecidos ao redor. Além disso, devem mimetizar o tecido biológico possuindo propriedades físicas semelhantes às dele, permitindo o fluxo de nutrientes, a adesão e migração celular, além de serem biodegradáveis permitindo à sua substituição pelo tecido do hospedeiro.

[06] Os scaffolds produzidos com essa finalidade podem ser estruturados na forma de biogéis, que apresentam a possibilidade de serem injetáveis tornando a implantação um processo menos invasivo além de possuírem as características favoráveis de um scaffold para formação de uma estrutura tridimensional (LIU M. et al. Injectable hydrogels for cartilage and bone tissue engineering. Bone research, 2017). Entre os biomateriais utilizados para a produção de biogéis encontram-se a quitosana, alginato, celulose, ácido hialurônico e ο colágeno.

[07] Ο colágeno do tipo I é um dos biomateriais mais utilizados na produção de scaffolds osteoindutores tendo em vista que esse tipo de colágeno é o componente orgânico mais abundante na matriz extracelular do tecido ósseo. Além desse tecido, a pele, ligamentos e tendões, são locais onde encontra-se grande quantidade de colágeno tipo I, sendo esses os tecidos dos quais ele é comumente extraído. A fonte mais utilizada para obtenção do colágeno é o tendão de origem bovina, embora o tecido conjuntivo da cauda de ratos também seja muito utilizado, assim como tendões e peles de porcos e de outros mamíferos, além dos tecidos conjuntivos de aves e escamas de peixes.

[08] Em geral o processo de extração envolve tratamento químico dos tecidos para hidrólise das fibras de colágeno em solução alcalina ou ácida, sendo o ácido acético o mais utilizado. Como estratégia para gerar maior rendimento na extração tem-se realizado tratamento enzimático das amostras com papaína, alcalase, pepsina, entre outras enzimas. Recursos como ultrassom, altas temperaturas e alta pressão também são relatados na literatura, embora sejam utilizados com menos frequência. (León-López A. et al. Hydrolyzed Collagen—Sources and Applications. Molecules, 2019).

[09] O colágeno obtido é utilizado para produção de scaffolds, que consistem em uma trama de fibras que formam um arcabouço para o cultivo celular in vitro de modo tridimensional sendo que a utilização de scaffolds de colágeno já mostrou ser favorável quanto à citocompatibilidade, permitindo a adesão e proliferação celular (NOCERA, A.D. Et al. Development of 3D printed fibrillar collagen scaffold for tissue engineering. Biomedical microdevice, 2018) Nesse contexto, a indução da atividade celular para a formação óssea tem sido potencializada por meio da associação de colágeno com nanomateriais os quais podem ser naturais ou sintéticos apresentando uma de suas dimensões com diâmetro normalmente menor do que 100nm (YI H. Et al. Recent advances in nano scaffolds for bone repair. Bone research, 2016).

[010] Calabrese et al. 2016 produziram scaffolds de colágeno associados com HA e mostraram que a diferenciação osteogênica de células tronco cultivadas sobre eles ocorreu mesmo na ausência dos fatores químicos de diferenciação no meio de cultura (CALABRESE G. Et al. Collagen-Hydroxyapatite Scaffolds Induce Human Adipose Derived Stem Cells Osteogenic Differentiation In Vitro. PloS on, 2016). Esses relatos demonstram o potencial do colágeno em favorecer a diferenciação osteogênica quando associado com materiais cuja composição e/ou propriedades físicas são semelhantes às do tecido ósseo. Em semelhança ao produto desenvolvido por Calabrese et al. 2016, a tecnologia na qual se pleiteia proteção refere-se à um biogel que induz a diferenciação osteogênica e a maturação de osteoblastos, que são células responsáveis pela formação do tecido ósseo, mesmo na ausência de fatores químicos adicionais devido a composição, propriedades físicas e nanoestruturação do biogel.

[011] A utilização de nanomateriais tem por finalidade favorecer a entrega de drogas e genes, favorecer resistência mecânica e nanotopografia, responder a diferentes estímulos físicos como variação de campos magnéticos e temperatura, assim como a exposição às tensões mecânicas (HASAN, A. et al. Nanoparticles in tissue engineering: applications, challenges and prospects. International Journal of Nanomedicine, 2018). Essas, quando aplicadas sobre determinados materiais podem gerar uma resposta elétrica que influencia a atividade celular (TANDON, B; BLAKER, J.J; CARTMELL, S.H. Piezoelectric materials as stimulatory biomedical materials and scaffolds for bone repair. Acta biomaterialia, 2018).

[012] A capacidade de responder aos estímulos mecânicos com a geração de potenciais elétricos é denominada piezoeletricidade e está presente em certos materiais, como as cerâmicas de BaTiO3, cujas principais aplicações encontram-se nos campos de eletro-óptica, eletromecânica, transdutores, e capacitores (JIANG B. et al. Barium titanate at the nanoscale: controlled synthesis and dielectric and ferroelectric properties. Chemical Society Reviews, 2019). NPTB utilizadas para aplicações biológicas tem potencial para promover a formação de um microambiente eletricamente ativo que pode favorecer a atividade celular e formação tecidual, tendo em vista que a piezoeletricidade é uma propriedade natural do tecido ósseo (ZHANG K. Et al. Advanced smart biomaterials and constructs for hard tissue engineering and regeneration. Bone research, 2018).

[013] Com a finalidade de mimetizar as propriedades elétricas do tecido ósseo, a presente tecnologia foi desenvolvida utilizando-se nanopartículas de BaTiO3, (NPTB), cuja citocompatibilidade foi previamente identificada com osteoblastos primários. Além disso, já foi demonstrada citocompatibilidade de diferentes concentrações de NPTB com células tronco humanas (AMARAL, D.L. et al. In vitro evaluation of barium titanate nanoparticle/alginate 3D scaffold for osteogenic human stem cell differentiation. Biomedical materials (Bristol, England), 2019).

[014] Associado a citocompatibilidade, as NPTB apresentam a capacidade de promover melhora da osteogênese quando presente no meio de cultura de células tronco mesenquimais (CIOFANI G, et al. Effects of barium titanate nanoparticles on proliferation and differentiation of rat mesenchymal stem cells. Colloids and surfaces B, Biointerfaces. 2013). Nesse contexto, JELINEK M. et al desenvolveram revestimentos de BaTiO3 para implantes, os quais têm a capacidade de promover maior crescimento celular e diferenciação osteogênica de células Saos-2, as quais são derivadas de osteossarcoma humano (Laser-synthesized nanocrystalline, ferroelectric, bioactive BaTiO3/Pt/FS for bone implants. Journal of biomaterials applications, 2018).

[015] Partindo desse ponto, o produto da presente tecnologia apresenta como vantagem não apenas a utilização de um material com propriedades elétricas, mas sua associação com colágeno, o principal componente orgânico do tecido ósseo. Nesse sentido, Zanfir et al. 2016 desenvolveram scaffolds de colágeno com HA e colágeno com HA acrescido de NPTB, os quais foram testados in vitro com células tronco humanas obtidas de fluido amniótico. Tal produto apresenta a capacidade de promover a adesão e distribuição uniforme das células sobre suas superfícies e maior expressão de genes relacionados à diferenciação osteogênica na presença de NPTB, sendo tais características atribuídas às propriedades elétricas das NPTB (ZANFIR AV, et al. New Coll-HA/BT composite materials for hard tissue engineering. Materials science & engineering C, Materials for biological applications, 2016).

[016] No entanto, a respeito do uso das NPTB, o trabalho de Zanfir et al, 2016 não investigou a associação isolada das NPTB com o colágeno, sendo que os resultados obtidos por eles foram referentes a associação das NPTB com HA para posterior incorporação ao colágeno, e não a incorporação direta das NPTB ao colágeno (BUSUIOC C, ET al. The influence of barium titanate on the biological properties of collagen-hydroxiapatite compositescaffolds. Materials letters, 2019).

[017] Além disso, nos trabalhos de Zanfir et al. 2016 e Busuioc et al. 2019, os scaffolds foram produzidos por meio da dispersão de NPTB/HA em colágeno, seguido da utilização de glutaraldeído 1%. O glutaraldeído é utilizado em alguns estudos como agente de crosslink para gerar estruturação dos scaffolds de colágeno. No entanto, sabe-se que o uso de glutaraldeído para tal finalidade apresenta a desvantagem de que o mesmo permanece incorporado na estrutura dos scaffolds e apresenta-se como material citotóxico (GU L, et al. Novel biomedical application of crosslinked collagen, Trends biotechnology, 2019).

[018] Ο produto descrito na presente tecnologia apresenta como vantagem a ausência da utilização de agentes químicos de crosslink, fazendo uso apenas da variação de temperatura para estruturação do gel de colágeno, sendo assim um produto isento do risco de citotoxicidade causado por produtos químicos fixadores e seus possíveis efeitos adversos nas aplicações in vivo.

[019] Ademais, nos trabalhos de Zanfir et al. 2016 e Busuioc et al. 2019, os scaffolds foram produzidos e utilizados na forma liofilizada. O processo de liofilização consiste na remoção do conteúdo líquido do material gerando assim produtos com aspecto físico seco e poroso. Tal característica difere da presente tecnologia, tendo em vista que o produto aqui descrito consiste em um biogel de colágeno. Materiais na forma de biogel apresentam como vantagem sua simples forma de produção e aplicação, a qual demanda menos recursos tecnológicos e consequente baixo custo tendo em vista que não passam por processo de liofilização. Além disso, o scaffold na forma de biogel pode ser produzido em ambientes cirúrgicos previamente ao momento da enxertia por meio da associação dos componentes do gel e exposição à temperatura adequada, apresentando ainda como vantagem a possibilidade do biogel ser injetado na área da lesão tecidual moldando-se às superfícies a serem reparadas.

[020] O preparo do biogel de forma acessível e de baixo custo é fator importante a ser considerado. No documento de patente US 20190192737, de 27 de junho de 2019, utiliza-se equipamento de eletrofiação para produção do scaffold, utilizando ou não de interposição de células advindas de cartilagem alogênica objetivando especialmente o reparo de cartilagem articular. Sabe-se que o equipamento de eletrofiação é de custo elevado, sendo o manuseio realizado por profissional técnico capacitado.

[021] O produto descrito na tecnologia em análise não demanda equipamento de eletrofiação para seu preparo, sendo necessário apenas controle de pH e temperatura da solução de colágeno. Além disso, lesões de diferentes dimensões podem ser reparadas utilizando-se a presente tecnologia a ser patenteada, visto que sua consistência e maleabilidade em biogel preenche e contorna as estruturas na área da lesão.

[022] No documento de patente BR1020130321460 refere-se à extração e hidrólise de colágeno de túnica albugínea de testículos de animais imunocastrados e a caracterização das propriedades químicas e funcionais da proteína. De forma semelhante, o documento PI 0502277-0 descreve um processo de extração de resíduos de couros curtidos ao cromo. Tal método/produto difere da presente tecnologia tanto quanto a origem do material quanto ao processamento das amostras.

[023] O documento PI 0206705-6 trata-se de um método para preparar uma esponja de colágeno, que compreende a mistura de ar ao interior de um gel de colágeno, de modo a obter uma espuma de colágeno, que é secada e passa por processamentos posteriores para utilização em reparo de tecidos biológicos. Na presente tecnologia, o colágeno não passa por qualquer processo de secagem, sendo que o mesmo é utilizado na forma de um biogel.

[024] O biogel a que se refere a presente tecnologia pode ser utilizado para o cultivo de células in vitro, assim como para a aplicação em reparo de tecido ósseo invivo. De forma semelhante, o documento PI 0008 878-4 descreve um sistema à base de colágeno injetável para aplicação de células ou agentes terapêuticos. No entanto, o documento descreve a associação de células em solução de colágeno formando um complexo células-biomaterial para reparo de tecidos, não relacionando a utilização de colágeno com nanopartículas inorgânicas como descrito na tecnologia em análise.

[025] Por outro lado, o documento PI 1100878-4 descreve o processo de obtenção de compósitos orgânico-inorgânico contendo colágeno na concentração de 10mg/ml associado com componente inorgânico de aluminato de cálcio para aplicação em reparo de tecido ósseo. De forma semelhante, a presente tecnologia descreve a associação de um componente orgânico à base de colágeno, embora na concentração de 2mg/ml, em associação com nanopartículas inorgânicas com potencial para mimetizar o microambiente ósseo.

[026] O mesmo é proposto por meio do produto descrito no documento PI1012502, a qual se refere à obtenção de colágeno para a formação de um gel para reparo tecidual. O gel de colágeno obtido pode ser associado com componentes inorgânicos como a hidroxiapatita (HA) formando um compósito para aplicação como implante em reparo ósseo. No entanto, o método descrito em PI1012502 consiste em um processo de descelularização de tecidos para obtenção de matriz extracelular rica em colágeno tipo I. Nesse sentido, o produto difere da presente tecnologia devido aos métodos de obtenção do colágeno e do conteúdo inorgânico associado.

[027] O documento CN106237392 diz respeito à utilização de materiais cerâmicos como o titanato de bário para produção de um material que mimetiza o microambiente ósseo devido suas propriedades piezoelétricas. No entanto, o produto é associado com polivinil álcool e glicerol, não havendo emprego de colágeno para produção de um biogel como realizado na presente tecnologia.

[028] No entanto, o documento CA2737542C descreve a produção de compósitos contendo colágeno associado com diferentes nanomateriais, como nanopartículas de ouro, nanopartículas de prata, fosfato de cálcio, aluminatos, nanopartículas de sílica, bem como as NPTB e vários outros nanomateriais. No entanto, tal produto consiste na utilização de colágeno contido em matriz extracelular descelularizada, o que difere da presente tecnologia que utiliza fibras colágenas extraídas e purificadas por meio de tratamento químico e/ou enzimático de tecido tendíneo. Além disso, o documento CA2737542C descreve a utilização dos nanomateriais funcionalizados com diferentes radicais químicos, sendo essa uma abordagem não empregada na tecnologia em análise.

[029] O documento KR100842378 diz respeito ao método de produção de scaffolds considerando a gravidade no processo de centrifugação e recuperação das células após o cultivo. Apesar disso, a patente não se refere ao biogel de colágeno com NPTB embora cite os dois materiais separadamente, assim como vários outros materiais os quais podem ser utilizados como base para produção de scaffolds.

[030] Na tecnologia o conteúdo inorgânico é representado pelas NPTB, cuja associação com o colágeno na forma de gel forma um compósito que mimetiza as propriedades químicas e físicas do tecido ósseo. Sendo assim, não foram identificados trabalhos e produtos que consistem na utilização das NPTB dispersas em meio de cultivo celular associadas com colágeno para a formação de scaffolds, especialmente no que diz respeito à sua produção na forma de um biogel.

[031] A tecnologia refere-se ao desenvolvimento de um biogel osteoindutor utilizando-se de nanopartículas de BaTiO3 (NPTB) piezoelétricas em associação com colágeno obtido a partir de caudas de rato ou de tendão bovino. A associação entre as NPTB piezoelétricas e o colágeno formou um arcabouço para cultivo celular tridimensional, denominado scaffold, o qual se apresenta na forma de um biogel. O produto desenvolvido tem potencial para induzir a maturação de osteoblastos e otimizar o reparo de lesões do tecido ósseo tendo em vista suas características químicas e físicas que mimetizam o microambiente desse tecido. A tecnologia apresenta como vantagem também a ausência da utilização de agentes químicos de crosslink, fazendo uso apenas da variação de temperatura para estruturação do gel de colágeno, sendo assim um produto isento do risco de citotoxicidade causado por produtos químicos fixadores e seus possíveis efeitos adversos nas aplicações in vivo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[032] A Figura 1 apresenta a morfologia das NPTB. Observa-se em A) Imagem de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) de um aglomerado de nanopartículas, B) MEV de um aglomerado de nanopartículas e uma nanopartícula isolada e em C) Imagem de Microscopia de Força Atômica (MFA) de uma área com algumas nanopartículas. O quadrado pontilhado destaca uma única nanopartícula. D) Imagem tridimensional de MFA da nanopartícula destacada em D) e E) com perfil topográfico de uma NPTB isolada.

[033] A Figura 2 mostra imagem ilustrativa do biogel de colágeno.

[034] A Figura 3 apresenta a MEV da superfície dos diferentes biogéis. a) Colágeno de rato, b) Colágeno de rato + NPTB, c) Colágeno bovino e d) Colágeno bovino + NPTB. Imagens capturadas em magnitude de 1.500x.

[035] A Figura 4 mostra a MEV dos osteoblastos sobre os diferentes biogéis. A) Colágeno de rato, B) Colágeno de rato + NPTB, C) Colágeno bovino e D) Colágeno bovino + NPTB. Imagens capturadas em magnitude de 1500x.

[036] A Figura 5 mostra a representação gráfica da viabilidade celular frente aos diferentes scaffolds. Análise estatística realizada com one-way ANOVA, valor de p < 0,05 considerado estatisticamente significativo.

[037] A Figura 6 mostra a atividade de fosfatase alcalina avaliada por microscopia óptica em aumentos de 1 e 5x.

[038] A Figura 7 apresenta gráfico da análise quantitativa da atividade de fosfatase alcalina realizada com one-way ANOVA, sendo * diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle, p < 0,05.

[039] A Figura 8 apresenta análise histológica da área da lesão após 14 dias. Em A) grupo controle, B) grupo colágeno, C) grupo colágeno + NPTB e em D) representação gráfica da área de invasão trabecular na região medular.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA

[040] A presente tecnologia se refere a um biogel contendo nanopartículas piezoelétricas e seu processo de produção. Se refere também ao seu uso, para a produção de medicamentos com atividade osteoindutora. O processo proposto consiste na utilização de colágeno de baixo custo em forma de scaffolds em associação com nanopartículas de BaTiO3 (NPTB) piezoelétricas, para formação de biogéis. Os biogéis da presente tecnologia apresentam a capacidade de promover a osteocondução e a osteoindução de células da linhagem osteoblástica in vitro sem a necessidade de suplementação com fatores químicos osteoindutores. Quando utilizados in vivo possuem o potencial de otimizar o processo de reparo tecidual podendo ser administrados nas áreas de defeito ósseo após procedimentos cirúrgicos. Além disso, o biogel possui a vantagem de ser de fácil produção, baixo custo e biocompatível.

[041] O biogel com nanopartículas piezoelétricas compreende nanopartículas de BaTiO3 (NPTB) em associação com colágeno do tipo I.

[042] A proporção, em massa, entre as nanopartículas NPTB e o colágeno do tipo I pode ser de 0,1:1,5 a 1:7.

[043] No biogel, as nanopartículas NPTB apresentam concentração final de 0,01 a 0,1%(m/v) e o colágeno do tipo I apresenta concentração final de 1,45 a 6,96 mg/ml.

[044] No biogel, o colágeno apresenta-se na forma de arcabouço de sustentação (scaffold).

[045] O processo para a preparação do biogel contendo as NPTB compreende as seguintes etapas:

• a. Para cada ml de biogel de colágeno, utilizar 500 a 800 μΙ de solução aquosa de colágeno a uma concentração de 2,9 a 8,7 mg/ml, 50 a 100μΙ de meio de cultura DMEM e 50 a 120μΙ de NaOH em concentração adequada para que o pH da solução alcance valores entre 7,3 e 7,4, sendo a concentração final do colágeno nessa solução de 1,45 a 6,96 mg/ml;
• b. Homogeneizar o produto obtido na etapa “a”;
• c. Separadamente, dispersar NPTB em meio de cultura DMEM, para a concentração final de NPTB de 0,1% a 1% (m/v);
• d. Submeter a mistura obtida em “c” à sonicação por 5 a 60 min;
• e. Adicionar a dispersão obtida em “d” na solução obtida em “b” em uma proporção de 0,1:1,5 a 1:7.
• f. Homogeneizar o produto obtido em “e”;
• g. Incubar o volume desejado da mistura obtida em “f” a 36° a 37°C em atmosfera umidificada com 4,9 a 5,2% de CO2 por 1 a 12h;
• h. Adicionar meio de cultura sendo a quantidade suficiente para imergir o scaffolds formado de modo a manter a hidratação do biogel obtido ao término da etapa “g”.

[046] O biogel da presente tecnologia pode ser utilizado para preparar medicamentos com atividade osteoindutora.

[047] A presente tecnologia pode ser mais bem compreendida através dos exemplos, não limitante.

EXEMPLO 1 - Processo de obtenção de colágeno tipo I a partir de tendão bovino

[048] Ο produto da presente tecnologia foi desenvolvido utilizando-se como base estrutural moléculas de colágeno tipo I, o qual é uma proteína cuja principal característica molecular consiste em uma tripla hélice de cadeias α formadas por peptídeos nos quais se identifica uma sequência de aminoácidos Gly - X - Y que se repete em uma ou mais regiões da molécula, sendo prolina e lisina os resíduos de aminoácidos comumente encontrados nas regiões X e Y da sequência.

[049] Os peptídeos que formam a tripla hélice estruturam a molécula de pró-colágeno que sofre clivagem dos extremos pró-peptídeos COOH- e NH2 dando origem às moléculas de colágeno. Essas se associam formando microfibrilas em um padrão de periodicidade que confere uma característica estriada à molécula. As microfibrilas agrupam-se para estruturação de fibrilas que posteriormente associam-se formando densas fibras de colágeno.

[050] O colágeno bovino utilizado para a produção do biogel neste exemplo foi obtido a partir de amostras de tendão bovino cortadas em pequenos pedaços e tratadas com acetona para remoção de material gorduroso. Posteriormente, 5 g de amostra foram lavados com água destilada e colocados em solução de NaCI 10% (m/V) durante 24h e mantidos à temperatura de 4°C. Após esse período, o material foi novamente lavado com água destilada e colocado em solução de tampão citrato 0,02 mol/L pH 4,3 durante 48h em temperatura ambiente, para o intumescimento do tecido. O tecido entumescido foi homogeneizado em 500 mL de uma solução de ácido acético 0,5 mol.L-1, na presença de pepsina (Sigma Aldrich®,USA) na proporção de 1:50 (m:m) em relação à massa inicial do material. O gel formado foi mantido por 24h a 4°C. Após esse período, a proteína foi precipitada por salting out adicionando ao gel 5% de NaCI (m/V). O colágeno precipitado foi dialisado durante 72h contra água destilada e o produto final foi ultracentrifugado a 30000g por 2h e o sobrenadante coletado e armazenado em geladeira a 4°C.

EXEMPLO 2 - Processo de obtenção base de colágeno tipo I a partir de cauda de rato

[051] O desenvolvimento do biogel a partir de colágeno de rato foi realizado por meio da utilização de 12-20 caudas de ratos Wistar saudáveis que foram cortadas em suas bases e lavadas com detergente e água destilada corrente. Em seguida, o material foi colocado em recipiente com álcool 70% a 4°C pelo período de 24h. Para obtenção do tecido tendíneo rico em colágeno do tipo I o recipiente foi levado para dentro do fluxo laminar onde realizou-se a torção das vértebras das caudas. Com auxílio de uma pinça dentada a extremidade de tecido conjuntivo exposto foi puxada e torcida para retirada das fibras de colágeno que foram cortadas e colocadas em um recipiente estéril contendo ácido acético 1% em água. O mesmo procedimento foi repetido ao longo de toda extensão da cauda e as fibras obtidas foram mantidas em ácido acético pelo período de 24 a 96 h. Após esse período, a solução de colágeno foi ultracentrifugada a 30.000 g por 2 h e o sobrenadante foi coletado e armazenado em geladeira a 4°C.

EXEMPLO 3 - Processo de funcionalização do colágeno

[052] Para funcionalização do colágeno utilizou-se NPTB, as quais são constituídas por átomos de titânio, bário e oxigênio que se organizam para formar uma estrutura cristalina cuja organização varia de acordo com as condições de temperatura. Quando em temperaturas acima de 120°C o BaTiO3 apresenta-se em fase cúbica com estrutura cristalina chamada perovskita. Nessa configuração os átomos de bário se encontram nos vértices do cubo abrigando átomos de oxigênio que formam uma estrutura octaédrica na qual um único átomo de titânio é identificado em seu interior.

[053] Essa estrutura cúbica possui seus centros de cátions e ânions altamente simétricos, o que resulta na ausência de polarização, sendo esta uma configuração em que não se identificam propriedades piezoelétricas. Quando em temperaturas abaixo de 120°C e acima de 5°C, o centro de cátion desvia-se em direção a uma das faces do cubo resultando em uma estrutura tetraédrica não simétrica com polarização espontânea, na qual se encontra a característica piezoelétrica do material.

[054] As NPTB utilizadas (lote MKBF7837V, <100 nm, Sigma Aldrich®,USA) apresentam estrutura cristalina em fase tetraédrica e possuem morfologia esférica com tendência a um aspecto cúbico, sendo o diâmetro e altura das NPTB isoladas de aproximadamente 60nm (Figura 1). As NPTB apresentam potencial Zeta com valor médio de -11,17 mv e um baixo perfil condutor.

[055] A produção dos biogéis foi realizada por meio da associação das NPTB e as distintas soluções de colágeno obtidas utilizando o seguinte protocolo: Para produção de 1ml de biogel de colágeno, foram utilizados 690μΙ de solução aquosa de colágeno a 2,9 - 8,7 mg/ml, acrescido de 100μΙ de NaOH 3M, e 210μΙ de meio de cultura DMEM sendo a concentração final do colágeno nessa solução de 1,45 a 6,96 mg/ml. Após homogeneização, 300μΙ da solução do biogel foram depositados por poço em placa de 24 poços e incubados a 37°C em atmosfera de 5% de CO2. Após 24h do plaqueamento 300μΙ de DMEM foi adicionado sobre os scaffolds para manter a hidratação (Figura 2).

[056] Procedimento semelhante foi utilizado para produção do biogel de colágeno associado com NPTB. Nesses grupos foram adicionados 100μΙ de meio de cultura contendo NPTB a 1% cuja dispersão foi realizada por meio de sonicação por 5 min. A concentração final de NPTB para 1ml de biogel foi de 0,1%. Tal volume de DMEM contendo nanopartículas foi empregado em substituição de 100μΙ de DMEM puro utilizados nos scaffolds sem NPTB.

[057] O produto desenvolvido apresenta uma trama de fibras colágenas funcionalizadas com NPTB (Figura 3) que formam um arcabouço sobre o qual se realiza o cultivo de células da linhagem osteoblástica de modo tridimensional, favorecendo a atividade celular e fornecendo sinais elétricos que mimetizam o microambiente do tecido ósseo.

EXEMPLO 4 - Atividade in vitro do biogel

[058] Para avaliação da citocompatibilidade dos biogéis produzidos, 300μΙ de cada biogel foram depositados em placa de cultivo celular de 24 poços, sobre os quais 1x104 osteoblastos primários de ratos Wistar foram plaqueados. Após 72h de cultivo, o meio de cultura foi removido e as células aderidas aos biogéis foram fixadas com 0,5% de glutaraldeído em PFA 4% preparado em PBS pH7,4. As amostras ficaram imersas nesta solução por 15 minutos a 4°C. Em seguida, as amostras foram lavadas 1X com PBS pH7,4 e mantidas nesse mesmo tampão à 4°c até o processamento no centro de microscopia da UFMG para análise por MEV. As células apresentaram morfologia típica de osteoblastos, com diversos prolongamentos citoplasmáticos formando pontos de adesão com a superfície dos biogéis (Figura 4).

[059] Para avaliar a viabilidade celular frente aos diferentes biogéis, 1x104 células foram plaqueadas em triplicatas em placas de 96 poços preparadas com 50μΙ de biogel por poço. Após o período de 72h o meio de cultura foi substituído por 100μΙ de DMEM suplementado acrescido de 10μΙ do reagente Alamar Blue, o qual sofre redução mudando de cor no meio onde as células encontram-se viáveis. A % de redução do Alamar Blue foi avaliada utilizando-se espectrofotômetro, a partir do qual identificou-se que as células permanecem viáveis quando cultivadas sobre os biogéis de colágeno contendo NPTB (Figura 5).

[060] Para avaliação da maturação celular, 5x103 osteoblastos foram plaqueados em placas de 96 poços contendo 50μΙ de biogel e utilizando-se meio de cultivo DMEM suplementado, o qual foi substituído a cada 2 a 3 dias. Após 14 dias, o meio de cultivo foi removido e as células foram lavadas duas vezes com PBS e então incubadas com 100μΙ da solução de NBT-BCIP por 2 horas a 37°C e 5% de CO2. para avaliação da atividade da enzima fosfatase alcalina (ALP). Em seguida a solução foi substituída por PBS e realizou-se captura de imagem na lupa Nikon SMZ745T (Figura 6) e leitura espectrofotométrica após lise celular, observando-se maior atividade da enzima para os osteoblastos cultivados sobre o biogel de colágeno com NPTB (Figura 7).

EXEMPLO 5 - Atividade in vivo do biogel

[061] O potencial osteo reparador do biogel de colágeno com NPTB foi estudado utilizando-se modelo de osteotomia de tíbia. Para tal, 0,15ml de xilasina + 0,3ml de quetamina foram administrados intraperitonealmente em ratos Wistar machos com 12 semanas de idade. Após sedação os animais foram submetidos ao procedimento de tricotomia na região anteromedial da tíbia direita.

[062] Os animais foram então pesados e em seguida tiveram a pele higienizada com iodopovidona. Foi realizada uma incisão na região anteromedial da tíbia com afastamento da pele e tecido muscular. Em seguida procedeu-se com a osteotomia que consistiu na utilização de uma broca trefina de 2mm posicionada na região anteromedial do terço superior da tíbia, usando-se como referência a tuberosidade da tíbia. Para evitar aquecimento durante o procedimento cirúrgico, a região foi hidratada com soro fisiológico.

[063] Os animais dos grupos colágeno e colágeno + NPTB receberam 40μΙ do biogel que foi previamente preparado utilizando colágeno de rato. Os biogéis foram dispostos em superfície plástica estéril e mantidos em temperatura ambiente dentro do fluxo laminar por 30-40 minutos durante o preparo dos animais. O biogel foi então introduzido dentro da área da lesão de cada animal com o auxílio de uma agulha, sendo que o grupo controle recebeu apenas hidratação com soro fisiológico. Os animais foram em seguida suturados e tratados com antibiótico enxofloxicina 20mg/ml. o antibiótico também foi utilizado no preparo das mamadeiras dos animais na concentração final de 0,1mg/ml de água durante 3 dias após a lesão. Cada animal recebeu uma gota de dipirona mono-hidratada 23,8 mg via oral após a cirurgia e durante 3 dias a cada 24 h. Todos os procedimentos foram realizados com auxílio de um médico veterinário.

[064] Após 14 dias do procedimento de osteotomia, os animais foram eutanasiados utilizando-se isoflurano. Os ossos foram coletados e lavados em soro fisiológico para fixação com formol 10% por 24h. As amostras foram então descalcificadas durante 40 dias utilizando EDTA 10%. Após a descalcificação os ossos foram incluídos em blocos de parafina e cortados em micrótomo com espessura de 0,5μm. Posteriormente realizou-se coloração com hematoxilina e eosina seguida da captura de imagens em microscópio óptico e análise qualitativa do reparo das lesões, observando-se reparo ósseo otimizado na presença do biogel com NPTB (Figura 8).

Claims (6)

1. BIOGEL COM NANOPARTÍCULAS PIEZOELÉTRICAS, caracterizado por compreender nanopartículas de BaTiO3 (NPTB) em associação com colágeno do tipo l.
2. BIOGEL COM NANOPARTÍCULAS PIEZOELÉTRICAS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela proporção, em massa, entreas nanopartículas NPTB e o colágeno do tipo I ser de 0,1:1,5 a 1:7.
3. BIOGEL COM NANOPARTÍCULAS PIEZOELÉTRICAS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelas nanopartículas NPTB apresentarem concentração final de 0,01 a 0,1% (m/v) e o colágeno do tipo I apresentar concentração final de 1,45 a 6,96 mg/ml.
4. BIOGEL COM NANOPARTÍCULAS PIEZOELÉTRICAS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo colágeno apresentar-se como biogel na forma de arcabouço de sustentação (scaffold).
5. PROCESSO DE PREPARAÇÃO DO BIOGEL definido na reivindicação 1, caracterizado por compreender as seguintes etapas:

   • a. Para cada ml de biogel de colágeno, utilizar 500 a 800μΙ de solução aquosa de colágeno a uma concentração de 2,9 a 8,7mg/ml, 50 a 100μΙ de meio de cultura DMEM e 50 a 120μΙ de NaOH em concentração adequada para que o pH da solução alcance valores entre 7,3 e 7,4, sendo a concentração final do colágeno nessa solução de 1,45 a 6,96mg/ml;
   • b. Homogeneizar o produto obtido na etapa “a”;
   • c. Separadamente, dispersar NPTB em meio de cultura DMEM, para a concentração final de NPTB de 0,1% a 1% (m/v);
   • d. Submeter a mistura obtida em “c” à sonicação por 5 a 60 min;
   • e. Adicionar a dispersão obtida em “d” na solução obtida em “b” em uma proporção de 0,1:1,5 a 1:7;
   • f. Homogeneizar o produto obtido em “e”;
   • g. Incubar ο volume desejado da mistura obtida em “f” a 36° a 37°C em atmosfera umidificada com 4,9 a 5,2% de CO2 por 1 a 12 h;
   • h. Adicionar meio de cultura sendo a quantidade suficiente para imergir 0 scaffolds formado de modo a manter a hidratação do biogel obtido ao término da etapa “g”.
6. USO DO BIOGEL definido na reivindicação 1, caracterizado por ser para preparar medicamentos com atividade osteoindutora.

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