KR20240001836A

KR20240001836A - 지방축적 저해 효능 평가를 위한 전체 간 세포의 3차원 세포배양 방법

Info

Publication number: KR20240001836A
Application number: KR1020220078625A
Authority: KR
Inventors: 전희숙; 최철수; 최호중
Original assignee: 가천대학교 산학협력단; (의료)길의료재단
Priority date: 2022-06-28
Filing date: 2022-06-28
Publication date: 2024-01-04

Abstract

본 발명은 향상된 지방축적 저해 효능 평가를 위한 전체 간세포의 3차원 배양 방법에 관한 것으로, 간단한 방법을 통해 분리한 전체 간세포 및 알지네이트를 이용하여 간 조직과 유사한 환경을 가진 인공 간 조직을 제공하고, 따라서 신규 지방산 축적 저해 약물의 효능 평가의 정확도를 향상시킬 수 있으며, 96웰 플레이트 및 마이크로필러를 이용한 3차원 세포배양 방법을 제공함으로서, 인공 간 조직의 대량생산이 가능하다.

Description

지방축적 저해 효능 평가를 위한 전체 간 세포의 3차원 세포배양 방법 {Method of three-dimensional cell culture using primary hepatocyte cell for evaluating the reducing effect of lipid accumulation}

본 발명은 향상된 지방축적 저해 효능 평가를 위한 전체 간세포의 3차원 배양 방법에 관한 것이다.

간은 각종 대사 작용, 해독, 분해, 합성 및 분비를 담당하는 중요한 장기로, 간의 기능에 이상이 발생하면 생체의 영양소 대사에 문제를 유발하게 되며, 간 기능 이상을 일으키는 간 질환에는 지방간, 간염, 간경변증, 간암 등이 있다.

특히, 지방간은 중성지방(트리글리세라이드; triglyceride)이 간세포에 축적되어 발생하는 질환이며, 간 조직 중에 축적된 지방의 비율이 5% 이상인 경우 지방간으로 판단한다. 지방간의 발생 원인으로는 과도한 음주, 비만(복부비만), 당뇨병, 고지혈증 등이 있고, 그 원인에 따라 알코올성 지방간과 비알코올성 지방간으로 분류된다. 또한, 지방간의 축적된 지방산은 간세포에 혈액을 통한 산소와 영양분 공급과정을 차단하는 역할을 하기 때문에 간세포를 손상시키며 나아가 간 손상을 일으킨다.

하지만, 고에너지 식생활 및 복잡한 사회적 환경이 증가함에 따라 지방간을 유발할 수 있는 요인들에 현대인들은 더 많이 노출되고 있으며, 그 결과로 매년 지방간 환자가 증가하는 추세이다. 이에, 지방간 치료제 연구가 활발하게 진행되고 있고, 지방간 치료제의 유효성을 스크리닝하기 위한 기존 지방축적 저해 효능 평가 방법으로 간 세포주(cell line)을 이용하여, 평면적인 2차원 세포배양 방법이 사용되어 왔다. 그러나, 간 세포주의 2차원 세포배양 기법을 이용할 경우, 생체 내 간조직의 미세환경의 구현이 어려워, in vitro에서의 효능과 동물 모델에서의 효능이 상이하게 나타나는 등의 문제가 발생할 수 있어, 신약개발의 개발 비용 및 기간이 늘어나는 문제점이 있다. 즉, 다양한 지방간 치료제의 유효성을 스크리닝하기 위한 in vitro 수준의 간 모델이 부족한 상황이다.

이에, 지방간 치료제의 유효성을 스크리닝하기 위해 3차원 세포배양 방법이 연구되고 있다. 간 조직 제조를 위한 종래의 3차원 세포배양 방법으로는, 대한민국 등록특허공보 제 10-2264117 호(지방줄기세포 및 간세포를 포함하는 3차원 세포집합체의 제조방법)은 간 세포와 줄기세포를 공배양하여 3차원 세포집합체를 제조하는 방법을 개시하고 있고, 대한민국 등록특허공보 제 10-2100781 호(세포 배양 및 전달 기판, 및 이를 이용한 3차원 세포 구상체 제조 및 전달 방법)은 세포접착분자 및 간세포를 이용한 3차원 세포 구상체의 제조방법을 개시하고 있다. 다만, 간 조직은 간세포(hepatocyte) 외에도 간 성상 세포(hepatic stellate cell), 쿠퍼 세포(Kupffer cell), 대식세포(macrophage) 등의 여러 종류의 세포들로 구성되어 있으므로, 간세포만을 이용하여 간 조직을 구현하는 데에는 한계가 있다.

따라서, 간 조직의 미세환경 구현을 위해서는, 간세포뿐만이 아닌 전체 간 조직의 세포를 분리하고, 이를 3차원 세포 배양함으로써 생채 내의 조직과 비슷한 미세환경을 구현하고 이를 이용한 약물의 효능 평가 방법을 구축하여, 지방축적 억제물질을 찾아낼 필요가 있다.

이에, 본 발명자들은 간 조직과 비슷한 미세환경을 구현하고 이를 이용한 약물의 효능 평가 방법을 구축하기 위하여, 전체 간 조직 세포를 이용한 최적화된 3차원 세포배양 방법을 고안하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은 전체 간세포를 이용한 3차원 세포배양 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 방법으로 제조된 3차원 인공 간 조직을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 방법을 이용하여 지방 축적 감소 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 측면은,

a) 간 조직에서 전체 간세포를 분리하여 전체 간세포를 얻는 단계;

b) 상기 전체 간세포를 0.5 X 10⁷ 내지 1.5 X 10⁷ cell/ml의 농도로 포함하는 세포 배지를 준비하는 단계;

c) 상기 전체 간세포를 포함하는 세포 배지에 ECM을 혼합하여 ECM-세포 혼합물을 얻는 단계;

d) 상기 ECM-세포 혼합물을 마이크로필러(micropillar)에 분배(loading)하는 단계;

e) 상기 분배된 ECM-세포 혼합물을 포함하는 마이크로필러를 배양 배지가 포함된 웰에 결합 후, 세포를 안정화하여 안정화된 ECM-세포 혼합물을 얻는 단계; 및

f) 상기 안정화된 ECM-세포 혼합물을 포함하는 마이크로필러를 새로운 배양 배지가 포함된 웰에 결합하는 단계;를 포함하고,

상기 단계 c)의 ECM은 알지네이트(alginate)인 것을 특징으로 하는, 전체 간세포를 이용한 3차원 세포배양 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 측면은,

a) 상기의 방법으로 제조된 3차원 세포배양 배지를 혼합 지방산이 포함된 배지로 교환하여 배양하여 지방이 축적된 3차원 인공 간 조직을 얻는 단계;

b) 상기 3차원 인공 간 조직에 지방 축적 감소 후보물질을 접촉시키는 단계; 및

c) 상기 단계 b)의 3차원 인공 간 조직의 지방 또는 지질의 양을 측정하는 단계;를 포함하는 지방 축적 감소 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 비교적 간단한 방법을 통해 전체 간세포를 분리할 뿐만 아니라, 이를 3차원 세포배양에 이용함으로서, 실제 조직과 유사한 환경을 가진 인공 간 조직을 제공하고, 따라서 신규 지방산 축적 저해 약물의 효능 평가의 정확도를 향상시킬 수 있다. 또한, 96웰을 이용한 3차원 세포배양 방법을 제공함으로서, 인공 간 조직의 대량생산이 가능하고 다양한 약물을 한 번에 평가할 수 있어 시간 단축의 효과를 가진다.

도 1a는 마이크로필러(micropillar)에 ECM-세포 혼합물을 분배하는 것을 나타낸 개략도이다.
도 1b는 ASFA™ SPOTTER(MBD, Korea)를 이용하여 마이크로필러(micropillar)에 ECM-세포 혼합물을 분배하는 것을 나타낸 개략도이다.
도 2는 ECM-세포 혼합물이 분배된 마이크로필러는 배양 배지가 포함된 웰에 결합하는 것을 나타낸 개략도이다.
도 3은 총 3마리의 C57BL/6N mice에서 각각 전체 간세포를 분리한 뒤 LUNA Cell counter 로 세포 수를 측정하여 살아있는 세포와 죽은 세포 수를 측정하여 cell viability를 계산한 값은 나타낸 것이다.
도 4는 분리한 전체 간세포를 96 well plate의 1 well 당 (a) 1 × 10⁴ cell/well 및 (b) 2.5 × 10⁴ cell/well로 seeding 후 24시간 뒤 palmitate 와 oleate를 1:2(molar ratio (몰 농도비))로 섞은 혼합 지방산 250 μM을 24시간 처리한 후 지방 축적을 확인한 결과를 나타낸 것으로,
도 5은 분리한 전체 간세포를 96 well plate에 seeding 후 혼합 지방산 24시간 처리 후 세포 생존율의 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6는 BODIPY 염색 기법을 이용하여 중성지방(triglyceride)을 축적을 확인하기 위하여 세포에서 지질(lipid)를 추출하여 중성지방을 측정한 뒤 BODIPY 염색을 통해 얻은 결과와 비교한 결과를 나타낸 것으로, (a)는 Folch method로 지질을 분리하여 TG 수준을 측정하였고, (b)는 BODIPY 염색을 통해 지질을 FITC-Fluorescence로 측정하여 나타낸 것이다.
도 7는 3D culture을 위한 세포 외 기질 (ECM) 선택을 위해 세포 외 기질을 이용한 뒤 세포 생존률을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 3D 배양 조건에서 BODIPY 염색 기법을 이용하여 지방의 축적을 형광 이미지 및 형광 세기 측정을 통해 확인한 결과를 도식화한 것으로, 도 8a는 1500 cells/필러이고, 도 8b는 5000 cells/필러이다.
도 9는 2D culture를 이용해 중성지방 축적 감소 물질의 스크리닝 시스템을 구축하기 위해 fenofibrate, oltipraz, metformin을 이용하여 지방 축적 억제 평가를 진행한 결과를 나타낸 것이다.
도 10a는 3D culture를 이용한 중성지방 축적 감소 물질의 스크리닝 시스템을 구축하기 위해 fenofibrate, oltipraz, metformin을 이용하여 지방 축적 억제 평가를 진행한 뒤 BODIPY 염색을 통해 나타나는 형광 이미지를 나타낸 것이고, 도 10b는 도10a의 형광이미지를 수치화하여 그래프로 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은, a) 간 조직에서 전체 간세포를 분리하여 전체 간세포를 얻는 단계;

상기 단계 c)의 ECM은 알지네이트(alginate)인 것을 특징으로 하는, 전체 간세포를 이용한 3차원 세포배양 방법을 제공한다.

상기 단계 a)는 간 조직에서 전체 간세포를 분리하여 전체 간세포(primary hepatocyte)를 얻는 단계이다.

단일 간세포는 간의 실질세포와 다른 성질을 가지고 있기 때문에 간 독성 평가 등에 있어서 생체 내에서의 간 독성을 대표하지 못하며, 따라서 상기 전체 간세포를 이용하는 경우 간 조직의 미세환경을 보다 잘 구현하고 신뢰성 높은 간 독성 평가를 할 수 있다.

바람직하게 상기 전체 간세포는 간세포(hepatocyte), 간 성상 세포(hepatic stellate cell), 쿠퍼 세포(Kupffer cell), 대식세포(macrophage)를 포함한다.

상기 단계 b)는 단계 a)에서 얻은 전체 간세포를 0.5 X 10⁷ 내지 1.5 X 10⁷ cell/ml의 농도로 포함하는 세포 배지를 준비하는 단계이다.

상기 세포 배지는 바람직하게 HepatoZYME, BCS, 및 Antibiotics을 포함한다. 상기 HepatoZYME은 간세포 배양에 최적화된 기본 배양배지이고, 상기 BCS는 세포가 최적의 상태를 위지 하기 위한 미량의 인자들을 공급하기 위해 첨가되는 혈청이며, 상기 Antibiotics는 세포 배지의 오염을 방지하기 위해 첨가된다.

상기 단계 c)는 단계 b)의 전체 간세포를 포함하는 세포 배지에 ECM을 혼합하여 ECM-세포 혼합물을 얻는 단계이다.

상기 ECM(extracellular matrix; 세포외 기질)은 세포의 외부를 둘러싸고 있는 기질을 의미하며, 세포와 세포 사이를 차지하고 있으며, 주로 단백질과 다당류로 이루어진 망상 구조를 가지고 있다. ECM은 세포가 집합하여 구성하는 조직의 형태를 결정할 뿐만 아니라 세포가 정상 적인 기능을 할 수 있는 환경을 제공하며, 세포의 분화에도 관여하는 주요 물질이다. 통상적으로 ECM은 콜라겐 및 엘라스틴과 같은 구조체(structural component); 피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌 및 테나신 등의 접착성 단백질; 콘드로이틴황산(chondroitin sulfate)이나 헤파란황산(heparan sulfate) 그리고 주단백질로부터 생성되는 프로테오글리칸; 및 다당류로만 이루어진 히알루론산 등, 성분에 따라 구분되고 있다.

본 발명에서 상기 단계 c)에서 사용되는 ECM은 바람직하게 알지네이트(alginate)이다. 알지네이트는 세포벽에서 분리된 천연 다당류로 칼슘이온과 같은 양이온에 반응하여 겔화가 이루어지는 재료이다. 본 발명에 있어서 상기 알지네이트는 0.5 내지 1.0 (v/v)%의 농도로 사용될 수 있고, 더욱 바람직하게는 0.75 %의 농도로 사용된다.

또한, 상기 단계 c)의 전체 간세포를 포함하는 세포 배지 및 ECM은 1:1의 부피비로 혼합된다.

상기 단계 d)는 상기 ECM-세포 혼합물을 마이크로필러(micropillar) 위에 분배(loading)하는 단계이다. 상기 마이크로필러는 ECM-세포 혼합물을 배양 배지에 결합하기 위해 적합한 크기로 분배하고 이동시키기 위해 사용되는 것으로, ECM-세포 혼합물이 마이크로필러에 부착된 형태이다. 또한, 도 1a에 나타난 것과 같이, ECM-세포 혼합물은 spotter에 의해 마이크로필러로 분배되며, 분배된 ECM-세포 혼합물은 통상적으로 물방울(droplet) 형태로 분배된다.

본 발명의 일 실시예에서, 마이크로필러에 ECM-세포 혼합물을 분배하기 위한 SPOTTER로 ASFA™ SPOTTER(MBD, Korea)를 사용하였으나 이에 국한되는 것은 아니다. 상기 ASFA™ SPOTTER로 ECM-세포 혼합물 분배시, 상기 혼합물을 노즐(nozzle)에 의해 마이크로필러 위에 분배된다(도 1b).

상기 단계 d)의 마이크로필러 (micropillar)에 분배된 ECM-세포 혼합물은 0.5 내지 5 μl이다. 분배된 ECM-세포 혼합물의 부피가 0.5 μl보다 적은 경우, 낮은 농도로 인해 3차원 배양이 잘 일어나지 않을 수 있고, 5 μl보다 큰 경우, 부피가 커져 마이크로필러의 위에 잘 분배되지 않을 수 있다.

상기 단계 e)는 상기 분배된 ECM-세포 혼합물을 포함하는 마이크로필러를 배양 배지가 포함된 웰에 결합 후, 세포를 안정화하여 안정화된 ECM-세포 혼합물을 얻는 단계이다. 상기 단계 e)는 도 2에서 나타낸 바와 같이, 상기 ECM-세포 혼합물을 포함하는 마이크로필러는 거꾸로 뒤집은 뒤, 마이크로필러는 배양배지가 포함된 웰에 담그는 것을 특징으로 한다.

상기와 같이 ECM-세포 혼합물이 부착된 상태의 마이크로필러를 뒤집어 배양 배지가 포함된 웰에 결합시, 배양 시기에 따라 배양 배지가 포함된 웰플레이트만 교체하면 되므로 세포의 배양이 통상적인 방법보다 간편하며, 특히 본 발명은 일 실시예에서 96웰 플레이트 및 마이크로필러를 이용한 3차원 세포배양 방법을 제공함으로서, 인공 간 조직의 대량생산이 가능하다.

또한, 상기 단계 e)에서 ECM-세포 혼합물을 포함하는 마이크로필러는 ECM-세포 혼합물이 마이크로필러에 부착되어 떨어지지 않고, 마이크로필러에 부착된 상태로 3차원 배양되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 필러 및 웰은 Cellvitro™ Pillar/Well Platform(MBD, Korea)를 사용하였으나 이에 국한되는 것은 아니다.

상기 단계 e)의 세포 안정화는 37℃ 및 5% CO₂에서 20 내지 40분 동안 배양하고, 상기 단계 e)의 배양 배지는 HepatoZYME, BCS, 및 Antibiotics을 포함한다.

상기 단계 f) 상기 안정화된 ECM-세포 혼합물을 포함하는 마이크로필러를 새로운 배양 배지가 포함된 웰에 결합하는 단계이다.

상기 단계 f)의 배양 배지는 HepatoZYME, BCS, 및 Antibiotics을 포함한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따라 제조된 3차원 인공 간 조직을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기를 포함하는 지방 축적 감소 물질의 스크리닝 방법을 제공한다;

a) 본 발명에 따라 제조된 3차원 세포배양 배지를 혼합 지방산이 포함된 배지로 교환하여 배양하여 지방이 축적된 3차원 인공 간 조직을 얻는 단계;

c) 상기 단계 b)의 3차원 인공 간 조직의 지방 또는 지질의 양을 측정하는 단계.

상기 단계 a)에 있어서, 혼합 지방산은 포화지방산과 불포화지방산이 1:1 내지 1:3의 비로 혼합된 것으로, 바람직하게는 포화지방산과 불포화지방산이 1:2의 비로 혼합된 것이다.

상기 포화지방산은 2 ~ 6개의 탄소로 구성된 단쇄지방산 (짧은사슬지방산, Short Chain Fatty Acid, SCFA), 6 ~ 12개의 탄소로 구성된 중쇄지방산 (중간사슬지방산, Middle Chain Fatty Acid, MCFA), 13개 이상의 탄소로 구성된 장쇄지방산 (긴사슬지방산, Long Chain Fatty Acid, LCFA)을 포함하지만, 바람직하게는 16 개의 탄소로 이루어진 팔미테이드(palmitate)이다.

상기 불포화지방산은 팔미톨레산 (palmitoleic acid), 스테아르산(stearic acid), 올레인산(oleate), 리놀레산(linolate) 등을 포함하지만, 바람직하게는 올레인산이다.

상기 지방간 관련 대사질환은 만성 간염, 간경변증, 인슐린 비의존성, 당뇨병, 이상지질혈증, 비만, 고콜레스테롤혈증, 고지혈증 등을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 실시예 및 실험예에서, 혼합 지방산 처리에 의한 지방 축적 증가 및 세포 생존율을 분석하였다. 혼합 지방산 (palmitate : oleate = 1:2)에 대한 반응을 분석한 결과 세포 수에 관계 없이 혼합 지방산 처리에 의해 지방축적이 증가됨을 확인하였으며(도 4), 세포 생존율이 감소하지 않았음을 확인하여(도 5), 세포 사멸이 발생하지 않고 지방축적이 일어났음을 확인하였다.

또한, 혼합 지방산 처리에 의한 중성지방 축적 증가를 분석하였다. 먼저 중성지방 (triglyceride)의 축적을 비교하기 위해 세포에서 지질(lipid)를 분리하여 지질의 축적을 확인하였으며, 그 결과 약 200%의 지질이 축적되었음을 확인하였다. 또한, 그 중 중성지방을 측정한 결과, 약 2.5 배의 중성지방이 증가했다는 것을 확인하였다(도 6).

또한, 3차원 배양에 적합한 세포외 기질(ECM)을 분석하였다. alginate, matrigel을 다양한 농도로 단독 혹은 조합하여 ECM으로 이용하였으며, 분석 결과 0.75 % alginate을 섞었을 때, 세포 쟁존율의 감소가 나타나지 않아, 3차원 배양에 가장 적합한 ECM임을 확인하였다(도 7).

또한, 3차원 배양에 최적화된 세포 수를 선정하기 위해 1500 또는 5000 cells/필러의 조건으로 세포를 시딩하고 상기에 언급한 것과 동일하게 혼합지방산 처리 및 지질 축적양을 분석하였다. 그 결과, 5000 cells을 사용한 경우 지방산 축적의 증가 정도가 더욱 확연하게 나타났으므로, 3D 세포 배양을 통한 지방 축적 저해 효과 확인은 5000 cells/필러의 조건을 사용하였다(도 8).

또한, 효과적인 중성지방 축적 감소 물질 스크리닝 시스템 구축하기 위해 2차원 배양 시스템과 3차원 배양 시스템을 비교 분석하였다. 분석 결과, 2차원 배양 시스템과 비교하여 3차원 배양 시스템에서 더 적은 수의 세포를 이용하여 중성지방의 양을 측정할 수 있었으며, 이를 통해 지방산 축적 억제 약물을 스크리닝하기 위해 3차원 배양 시스템이 더 적합함을 확인하였다(도 9 및 도 10).

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 전체 간세포의 분리

간세포의 2차원 또는 3차원 배양을 위해서, C57BL/6N 마우스에서 전체 간세포를 분리하였다.

6~8주령의 male mouse를 케타민 (ketamine) 또는 아이소플루레인(Isoflurane)을 이용하여 마취시켰다(150 μL/mouse). 그 후, 동물의 심장이 멈추기 전에 배를 가르고 횡경막 아래까지 개복하였다. 그 다음, 간문맥(portal vain) 주변에 존재하는 지방층을 잡고 간문맥의 아래에 1cm 간격으로 고정한 포셉(forcep)을 아래에 넣어 포셉이 간문맥이 아래에 위치하게 하였다. 간문맥과 포셉 사이의 공간을 통해 간문맥에 수술용 실을 느슨하게 묶은 후, IV catheter를 간문맥 안쪽으로 찔러 넣어 피가 흘러 나오는지 확인하였다. 피가 흘러 나오면 IV catheter이 빠지지 않게 앞에서 묶었던 수술용 실을 완전하게 묶었다. 그 다음, IV Catheter에서 바늘 부분을 제거하고 Y-shape tube의 끝 부분과 연결하였다.

Perfusion buffer I (142 mM NaCl, 6.7 mM KCl, 10 mM HEPES, and 2.5 mM EGTA (pH 7.4))을 간문맥으로 약 1초간 흘려 보내주어 간 색깔이 연해지면 복대정맥을 잘라 피가 나오게 하였다. Perfusion buffer I의 경우 약 10분간 50mL 전부를 흘려 보내주었다. 기포가 들어가지 않도록 25 mL의 perfusion buffer II (0.5 mg/ml collagenase and 10 mg/ml albumin in 66.7 mM NaCl, 6.7 mM KCl, 10 mM HEPES, 4.8 mM CaCl, (pH 7.6))로 바꿔 collagenase가 들어가게 하였다. 시간이 지나면 간 색깔이 점점 연해지고, 흐물흐물해지는 것을 확인할 수 있었다.

간을 떼어내어 Petri-dish에 옮기고. DMEM (high glucose)를 약 20ml 넣고 간을 흔들어주면서 세포가 간에서 떨어지도록 한다. 간의 형태가 거의 없어졌으면, 100 μm cell strainer를 통과하여 50 mL conical tube에 담았다. 그 다음, 회수된 세포를 50g에서 5분간 4°C에서 원심분리 하였다. 원심분리한 샘플의 상층액 (media)를 제거하고 5mL의 HepatoZYME + 2% BCS + 1% Antibiotics 배지에 재분산하였다. 10 μL의 Cell 과 5 μL PBS + 5 μL trypan blue를 섞은 후 7μm 이상의 직경을 갖는 세포 중 염색이 되지 않은 살아있는 세포와 염색되어 푸른색으로 보이는 죽어있는 세포수를 측정하여 최종적으로 cell viability를 확인하였다(도 3).

분리 결과, 평균적으로 C57BL/6N 마우스 1마리에서 6.5 × 10⁷ cell/mL 의 세포가 분리되었으며, 그 중 약 70%의 세포가 생존하는 것을 확인하였다.

<실시예 2> 전체 간세포를 이용한 2차원 배양

실시예1에서 분리한 세포 중 생존한 세포 수를 바탕으로 하여, 96 well plate 에는 2.5 X 10⁴ cell/100 μL의 농도로 12 well plate 에는 2.5 X 10⁵ cell/mL이 되도록 HepatoZYME + 2% BCS + 1% Antibiotics 배지를 이용하여 희석한다. 희석된 세포는 well 당 각각 96 well plate에는 100 μL씩, 12 well plate 에는 1 mL을 넣고 well에 골고루 분포하게 한 후 37℃ CO₂ incubator (5% CO₂)에서 24시간 배양한다.

<실시예 3> 전체 간세포를 이용한 3차원 배양

전체 간세포를 이용한 3차원 배양을 위해서 ASFA™ SPOTTER(MBD, Korea)와 Cellvitro™ Pillar/Well Platform (MBD, Korea)을 이용하였다.

세포 및 배지(HepatoZYME + 2% BCS + 1% Antibiotics )는 1 × 10⁷ cell/ml의 농도로 준비하였다. 2ml의 배지와 1ml의 ECM 스톡 용액을 혼합하여 0.75 (v/v)% 의 alginate를 ECM 용액으로 준비하였다. 그 다음, 1ⅹ10⁷ cells/ml의 세포배지 250ul와 위에서 준비한 최종 ECM 용액 250ul를 혼합한 후 loading plate에 load하였다. 최종 세포 밀도는 5 x 10⁶ cells/ml로 준비하였다.

기계는 냉각기능을 켜고 완전히 cooling 시켰다. 그 후, 프로그램을 실행하여 washing 단계를 진행하였다. 그 다음, 마이크로필러가 포함된 플레이트를 기계의 타겟 플레이트 배치 위치에 놓고, 기계의 프로그램을 사용하여 마이크로필러에 세포를 분배한 후 플레이트를 4°C에서 3분 동안 두어 이온 상호작용을 형성시켰다. 최종적으로 각 마이크로필러에 분배된 ECM-세포 혼합물의 부피는 1 μl 이며, 각 마이크로필러당 셀 수는 5,000개/μl가 되었다. micropillar를 배양 배지 (HepatoZYME + 2% BCS + 1% Antibiotics )가 포함된 well plate에 결합 후 37°C 및 5% CO₂에서 30분 동안 배양하여 세포를 안정화시켰다. 그 다음, 마이크로필러를 플레이트를 새로운 배양 배지 (HepatoZYME + 2% BCS + 1% Antibiotics )가 포함된 well plate에 결합하고 이후 실험을 진행하였다.

<실험예 1> 지방산 처리에 의한 지방 축적 증가 분석

분리한 전체 간세포 중 live cell 세포수를 기준으로 하여 HepatoZYME + 2% BCS + 1% Antibiotics 배지(배양배지)에 1 × 10⁴ cell/well (도 2a) 또는 2.5 × 10⁴ cell/well (도 2b) 의 세포를 96 well plate에 seeding 후 37도 CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 그 뒤, 배양 배지에 250 μM의 혼합 지방산 (palmitate : oleate = 1:2)이 포함된 배지로 교환해 준 뒤 37도 CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 그 뒤, 배양배지를 제거하고 PBS로 3번 세척 후 2μM 의 BODIPY 가 포함된 PBS 100 μL 를 well 당 넣어 준 뒤 37℃ CO₂ 배양기에서 15분간 반응시켰다. PBS로 3번 세척 후 10% NBF (Neutral Buffered formalin)을 100 μL씩 넣어 준 뒤 상온에서 30분간 반응시켰다. 그 후 PBS로 3번 세척 후 새로운 PBS 100 μL를 well 당 넣어준 뒤 493/503nm의 파장으로 형광을 측정하였다

측정 결과, 세포 수에 관계없이 혼합 지방산 처리에 의해 지방축적이 증가됨을 확인할 수 있었으며, <실험예 2>에서 진행하는 세포 생존율 실험에서 지방산에 의한 지방 축적이 충분하게 일어남을 확인 할 수 있었으며, 분리된 간세포를 이용하여 적은 수의 세포를 이용하여 지방축적을 확인하였으므로, 지방축적 감소 물질 스크리닝을 대량으로 진행 할 수 있음을 의미한다.(도 4)

<실험예 2> 혼합 지방산 처리시 세포 생존율

분리한 전체 간세포 중 live cell 세포수를 기준으로 하여 HepatoZYME + 2% BCS + 1% Antibiotics 배지(배양 배지)에 1 × 10⁴ cell/well 의 세포를 96 well plate 에 seeding 후 37℃ CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 그 뒤, 배양 배지에 250 μM의 혼합 지방산이 포함된 배지로 교환해 준 뒤 37℃ CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 그 뒤, 배양 배지를 제거하고 새로운 배양 배지 100 μL로 교환하였다. 그 뒤, CCK-8 시약 10 μL를 첨가한 뒤 2시간 동안 37℃ CO₂ 배양기에서 반응시켰다. 그 후 450 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 측정하였다 (도 5).

측정결과, 250 μM 혼합 지방산 처리에 의해 세포 생존율이 감소하지 않았음을 확인하였다. 과량의 지방산 처리에 의해 지방축적이 일어나면 세포의 사멸이 나타나게 되는데, 이 결과를 통해, <실험예 1>에서 수행한 250 μM 혼합 지방산 처리에 의해 세포 사멸이 발생하지 않고 지방축적이 일어났음을 확인하였다. 이는 지방 축적 감소 물질 스크리닝 시스템 구축 시 지방산 처리에 의한 세포사멸 없이 지방축적이 일어나고 있다는 전제조건을 실험적으로 확인했음을 의미한다.

<실험예 3> 혼합 지방산 처리시 중성지방 축적 확인

상기 <실험예 2>에서 전체 간세포에 혼합 지방산 처리시 지질 축적이 증가하는 것을 BODIPY 염색을 통해 확인하였다. 그 중 중성지방(triglyceride)의 축적을 비교하기 위해 세포에서 지질(lipid)를 분리하여, 그 중 중성지방을 측정하였다.

분리한 전체 간세포 중 live cell 세포수를 기준으로 하여 HepatoZYME + 2% BCS + 1% Antibiotics 배지(배양 배지)에 2.5 × 10⁵ cell/well (12 well plate), 1 × 10⁴ cell/well (96 well plate)에 seeding 후 37℃ CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 그 뒤, 배양 배지에 250 μM의 혼합 지방산이 포함된 배지로 교환해 준 뒤 37℃ CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 그 뒤, 배양배지를 제거하고 새로운 배양 배지 1mL (12 well plate) 또는 100 μL (96 well plate)로 교환하였다. 12 well plate의 경우, 배양 배지 제거 후 trypsin을 이용하여 세포를 well에서 분리하여 세포수를 측정하였다. 세포수 측정 후 남은 세포에 chloroform/methanol (1:1) 200 μL를 넣고 상온에서 20분간 shaking 하여 cell을 완전하게 파쇄하였다. 12000 rpm으로 상온에서 20분간 원심분리를 진행하였다. 원심 분리 후 40 μL (chloroform/ methanol 의 0.2배 volume)의 0.9% NaCl 용액을 넣고 15초간 vortexing 하였다. 2000 rpm으로 상온에서 5분간 원심분리 후 아래의 chloroform 층을 새로운 tube에 옮겼다. fume hood에서 자연증발 시키거나, evaporator를 이용하여 용액을 모두 증발시킨 후 50 μL의 isopropanol을 넣어 lipid를 녹여내는 Folch method를 이용하여 lipid를 분리하였다. 분리된 lipid 용액 10 μL를 96 well plate에 넣었다. 그 뒤 완전히 증발시킨 후 TG assay kit (아산제약, AM157S-K) 시약을 300 μL씩 넣어 37℃에서 10분간 반응 후 60분 이내에 500 nm에서 흡광도를 측정하는 방식으로 중성지방의 양을 측정하였다. 96 well plate의 경우, <실험예 1>와 동일한 방법으로 BODIPY 염색을 진행하여 지질의 양을 측정하여 Folch method로 lipid를 분리하여 측정한 것과의 비교를 진행하였다 (도 6).

측정결과, BODIPY 염색에 의해 약 200%의 지질 축적이 확인되었고, Folch method를 이용하여 지방을 분리하여 중성지방을 측정하였을 때, 약 2.5배의 증가를 확인할 수 있었다. 따라서, BODIPY 염색을 통해 측정하는 지질의 양은 중성지방의 양과 거의 동일하기 때문에, BODIPY 염색을 통해 얻어지는 결과는 중성지방의 결과로 판단할 수 있다.

<실험예 4> 3차원 배양을 위한 세포외 기질 (ECM) 선택

전체 간세포를 이용하여 3D culture를 진행하기 위하여 적절한 세포외 기질(ECM)을 선택하여 세포가 생존할 수 있는 미세환경을 구축하기 위해서, 같은 수의 간세포주를 2D 세포 배양방법인 96 well plate에 seeding 및 상기 <실시예 3>의 방법에 기초하여 다양한 ECM의 조건에서 3D 세포 배양을 진행하였다. alginate, matrigel을 다양한 농도로 단독 혹은 조합하여 ECM으로 이용하였으며, 50% matrigel을 사용하는 경우, 세포 안정화 과정 전에 마이크로필러를 37°C CO₂ 인큐베이터에 10분 동안 두는 과정을 추가적으로 수행하였다.

세포 생존율른 D-Plus™ CCK cell viability assay kit (동인LS, CCK-3000)을 이용하여 측정하였다. 안정화를 위해 seeding 다음날 2D 및 3D 배양 조건에서 seeding 된 세포를 37°C에서 1시간분 동안 CCK-8 assay 용액이 담겨 있는 배지에 넣어 반응시킨 후 450 nm 에서 흡광도를 측정하여 세포 생존률를 확인하였다.

분석 결과, 50% matrigel을 사용하였을 때, 세포 생존률이 가장 낮았다. 또한, 0.5% alginate, 0.75 % alginate, 및 alginate+matrigel을 혼합한 시료가 2차원 세포 배양 시료보다 세포 생존율이 더 우수하였으며, 특히 0.75 % alginate을 섞었을 때, 세포 생존률의 감소가 나타나지 않아 0.75 % alginate를 최종 ECM으로 선택하였다(도 7).

<실험예 5> 3차원 배양에 최적화 된 세포 수 선정

3D 세포 배양에 적합한 세포수를 확인하기위해 1500 또는 5000 cell/필러의 조건으로 세포를 seeding 하고, <실시예 2>, <실시예 3>, <실험예 3>에서 이용한 방법으로 혼합지방산을 처리하였다. <실험예 1>와 동일한 방법으로 BODIPY 염색을 진행하여 추적된 지질의 양을 측정하였다.

그 결과, 1500 cell을 사용한 경우보다 5000 cell을 사용한 경우 지방산 축적의 증가 정도가 더욱 확연하게 드러나므로 이후 3D 세포 배양을 통한 지방 축적 저해 효과 확인은 5000 cell/필러의 조건으로 진행하기로 하였다(도 8).

<실험예 6> 3차원 배양을 이용한 중성지방 축적 감소 물질 스크리닝 시스템 구축

3D culture 시스템을 이용한 중성지방 축적 감소 물질의 스크리닝 시스템을 구축하기 위하여 40 μM fenofibrate, 40 μM oltipraz, 1mM metformin을 처리하여 중성지방 축적을 2D culture와 3D culture 시스템을 이용하여 확인하였다(도 9 및 도 10). 2D 및 3D culture 실험 방법은 <실시예 2>, <실시예 3>, <실험예 3>에서 이용한 방법을 사용하였으며, 사용한 세포의 수는 2D의 경우 1 × 10⁴ cell/well (96 well plate), 3D 경우 5000cell/필러이다. 혼합지방산 처리시 fenofibrate, oltipraz, metformin을 동시에 처리하였다.

2D 배양의 경우 40 μM fenofibrate, 40 μM oltipraz 와 1mM metformin 처리를 진행하였을 때, 혼합지방산 처리에 의해 증가된 지방 축적이 유의적으로 확인할 수 있었다 (도 9). 3D 세포 배양 조건과 같은 5000cell/well로 96well plate에서 2D 배양을 통해 실험을 진행한 경우 형광이 측정되지 않았다.

3D 배양의 경우, 40 μM oltipraz 와 1mM metformin 처리를 진행하였을 때, 유의적으로 지방 축적이 감소함을 확인할 수 있었으며, 따라서, 3D culture 시스템에서 BODIPY 염색을 통해 중성지방의 양을 측정할 수 있었으며, 지방산 축적을 억제하는 약물을 처리하여 이를 선별할 수 있으며, 2D 세포 배양의 경우보다 더 적은 수의 세포를 이용하여 이를 확인할 수 있음을 알 수 있었다 (도 10).

Claims

a) 간 조직에서 전체 간세포를 분리하여 전체 간세포를 얻는 단계;
b) 상기 전체 간세포를 0.5 X 10⁷ 내지 1.5 X 10⁷ cell/ml의 농도로 포함하는 세포 배지를 준비하는 단계;
c) 상기 전체 간세포를 포함하는 세포 배지에 ECM을 혼합하여 ECM-세포 혼합물을 얻는 단계;
d) 상기 ECM-세포 혼합물을 마이크로필러(micropillar)에 분배(loading)하는 단계;
e) 상기 분배된 ECM-세포 혼합물을 포함하는 마이크로필러를 배양 배지가 포함된 웰에 결합 후, 세포를 안정화하여 안정화된 ECM-세포 혼합물을 얻는 단계; 및
f) 상기 안정화된 ECM-세포 혼합물을 포함하는 마이크로필러를 새로운 배양 배지가 포함된 웰에 결합하는 단계;를 포함하고,
상기 단계 c)의 ECM은 알지네이트(alginate)인 것을 특징으로 하는, 전체 간세포를 이용한 3차원 세포배양 방법.
제1항에 있어서,
상기 알지네이트는 0.5 내지 1.0 (v/v/)%인 것을 특징으로 하는, 3차원 세포배양 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 a)의 전체 간세포는 간세포(hepatocyte), 간 성상 세포(hepatic stellate cell), 쿠퍼 세포(Kupffer cell), 대식세포(macrophage)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 3차원 세포배양 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 b)의 세포 배지는 HepatoZYME, BCS, 및 Antibiotics을 포함하는 것을 특징으로 하는, 3차원 세포배양 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 c)의 포함하는 전체 간세포를 포함하는 세포 배지 및 ECM은 1:1의 부피비로 혼합하는 것을 특징으로 하는, 3차원 세포배양 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 d)의 마이크로필러(micropillar)에 분배된 ECM-세포 혼합물은 0.5 내지 5 μl인 것을 특징으로 하는, 3차원 세포배양 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 e)의 배양 배지는 HepatoZYME, BCS, 및 Antibiotics을 포함하는 것을 특징으로 하는, 3차원 세포배양 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 e)의 세포 안정화는 37℃ 및 5% CO₂에서 20 내지 40분 동안 배양하는 것을 특징으로 하는, 3차원 세포배양 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 f)의 배양 배지는 HepatoZYME, BCS, 및 Antibiotics을 포함하는 인 것을 특징으로 하는, 3차원 세포배양 방법.
제1항의 방법으로 제조된 3차원 인공 간 조직.
하기를 포함하는 지방 축적 감소 물질의 스크리닝 방법:
a) 제1항의 방법으로 제조된 3차원 세포배양 배지를 혼합 지방산이 포함된 배지로 교환하여 배양하여 지방이 축적된 3차원 인공 간 조직을 얻는 단계;
b) 상기 3차원 인공 간 조직에 지방 축적 감소 후보물질을 접촉시키는 단계; 및
c) 상기 단계 b)의 3차원 인공 간 조직의 지방 또는 지질의 양을 측정하는 단계.
제11항에 있어서,
상기 단계 a)의 혼합 지방산은 포화지방산과 불포화지방산이 1:1 내지 1:3의 비로 혼합된 것이고;
상기 포화지방산은 palmitate이고; 및
상기 불포화지방산은 oleate인 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
제11항에 있어서,
상기 지방간 관련 대사질환은 만성 간염, 간경변증, 인슐린 비의존성, 당뇨병, 이상지질혈증, 비만, 고콜레스테롤혈증, 고지혈증 등을 포함하는 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.