KR20240000826A - 면역활성을 촉진하는 치즈의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 초유를 첨가하여 면역활성을 촉진하는 특성화된 치즈의 제조방법에 관한 것으로, TGF-β가 함유된 초유 치즈소재 개발로 면역력을 증가시킬 수 있는 기능성 식품으로써 유가공 분야의 저변 확대를 도모하는데 기여하여 유가공 업체의 경쟁력을 향상시킬 수 있다.

Description

면역활성을 촉진하는 치즈의 제조방법{MANUFACTURING METHOD OF CHEESE ACTIVATING IMMUNITY}

본 발명은 면역활성을 촉진하는 치즈의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 치즈에 초유를 첨가하는 단계를 포함하여 면역활성을 촉진하는 기능성을 갖는 치즈의 제조방법에 관한 것이다.

치즈는 원유를 원료로 하여 제조하는 것으로서, 단백질과 지방 등의 영양소가 많고 각종 무기질과 비타민 등의 함유량도 많은 식품이다. 그러나 초유를 이용하여 기능성을 갖는 치즈는 없었다.

현재 국내에 유통되는 초유 관련 건강보조식품 형태의 제품들은 국내에서 생산되는 초유를 이용한 것이 거의 없으며 수입된 초유분말을 이용한 제품들이 유통되고 있다. 특히 초유를 치즈에 활용한 연구는 전무한 실정이다.

이에 본 발명에서는 항염 및 면역활성을 촉진을 위한 TGF-β를 포함하는 초유를 첨가하여 기능성 치즈를 개발하였다. 기능성 치즈 개발 연구를 통하여 초유의 항염 및 면역활성을 규명하여 국내 잉여 초유를 산업적으로 이용하는 방안을 모색함과 동시에 농가의 소득증대에 기여할 수 있을 것으로 판단된다.

한편 기능성 치즈로서, 공개특허공보 제10-2011-0130589호에는 막걸리를 첨가한 경질 치즈의 제조방법이 개시되어 있고, 공개특허공보 제10-2011-0123296호에는 고추 분말을 첨가한 자연 치즈의 제조방법이 개시되어 있으며,

공개특허공보 제10-2011-0111975호에는 한외여과를 이용한 비숙성 치즈의 제조방법이 개시되어 있고, 공개특허 공보 제10-2011-0023137호에는 새우를 함유한 치즈 및 이의 제조방법이 개시되어 있다.

그러나 아직까지 치즈에 초유가 첨가된 기능성 제품이 개발되어 있지 않다. 따라서, TGF-β를 함유한 초유를 첨가하여 항염, 면역활성을 촉진하는 기능성 치즈를 개발할 필요성이 있다. 이러한 견지에서 TGF-β을 함유한 초유 첨가 자연치즈가 개발된다면 외부 감염원으로부터 신체를 보호하고 주요 항상성 유지에 도움이 되는 기능성 치즈의 개발이 이루어지리라고 사료된다.

공개특허공보 제10-2011-0130589호

본 발명은 초유를 첨가하여 면역활성을 촉진하는 특성화된 치즈 제품을 개발하여 고부가가치의 기능성 치즈를 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 TGF-β가 함유된 초유 치즈소재 개발로 면역력을 증가시킬 수 있는 기능성 식품으로써 유가공 분야의 저변 확대를 도모하는데 기여하여 유가공 업체의 경쟁력을 향상시킬 수 있도록 하는 것을 목적으로 한다.

본 발명에 따른 면역활성을 촉진하는 기능성 치즈는 원유를 이용하여 제조한 치즈에 초유가 첨가되어 있는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 면역활성을 촉진하는 기능성 치즈의 제조방법은 원유를 이용하여 제조한 치즈에 초유를 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 면역활성을 촉진하는 기능성 치즈 제조방법에서 초유를 첨가하는 단계는 치즈 90~99.8중량%과 그 위에 초유 분말 0.2~10중량%를 도포하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 TGF-β가 함유된 초유 치즈소재 개발로 면역활성의 기능이 탁월한 기능성 치즈를 제공하는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 초유를 첨가한 카티지 치즈의 제조방법을 도시한 흐름도이다.

본 발명의 내용은 다음과 같이 구성된다.

1. 적합한 모델 치즈 선별한 후 초유첨가 자연치즈를 제조하였다.

2. 기능성 치즈의 품질분석을 실시하였다.

3. 기능성 치즈에 대한 관능평가를 실시하였다.

4. 동물실험을 통한 기능성 치즈의 효능을 확인하였다.

이하, 본 발명에 따른 면역활성을 촉진하는 초유를 첨가한 기능성 치즈에 관하여 상세히 설명한다.

1. 초유첨가 자연치즈의 선정기준

초유첨가 기능성 치즈의 선정기준은 다음과 같다.

가. 초유의 기능적 안정성을 유지할 수 있는 치즈

나. 초유가 고르게 첨가될 수 있는 형태의 치즈

다. 실제 소비대상을 고려하여 적용 가능한 치즈

본 연구에서는 다음과 같은 조건을 최적으로 만족할 수 있는 치즈로 카티지를 선정하였다.

2. 초유를 첨가한 기능성 치즈의 제조

초유의 특성 및 치즈 제조공정 조사에서 얻어진 결과에 따라 초유를 첨가한 기능성치즈의 최적 제조 공정도를 확립하고 공정도에 따라 기능성 치즈를 제조하였다. 초유를 첨가한 기능성 치즈의 제조 공정도가 도 1에 도시되어 있다.

먼저, 원유(Raw milk)(TA:0.16%, pH:6.8)를 63℃에서 30분간 저온살균하였다. 이후, 32℃에서 식히고 (Cooling), 치즈를 제조하기 위해 탱크에 넣었다(Setting in Vat).

살균한 후 냉각한 원유 100중량부에 대하여 발효배양균을 1.5중량부를 접종하고, 원유 100ℓ에 대하여 렌넷(Rennet) 19㎖를 첨가하였다. 이후, 치즈 나이프로 분쇄하고 3분 동안 기다렸다. 이후, 58℃에서 40분간 휘저으면서 가열하고(Cooking), 32℃에서 30분간 휘젓는다.

다음으로, 유청을 배수하고 세척한다. 세척시에는 먼저, 33℃~35℃ 물에서 1차 세척하고, 5℃에서 2차 세척을 하였다. 이와 같이 세척한 후에는 카티지 치즈가 제조되고, 제조된 카티지 치즈에 초유 분말을 도포하면(adding colostrum) 본 발명에 따른 기능성 치즈가 만들어진다.

초유의 첨가는 치즈의 제조공정 중에 어느 단계에서나 가능하나, 처음부터 원유와 초유를 혼합하여 치즈를 제조하게 되면, 초유에 함유되어 있는 특유한 영양소의 일부가 파괴되는 단점이 있다. 따라서, 초유가 갖고 있는 성분의 영양소를 그대로 유지하도록 하기 위하여, 치즈를 포장하기 전단계에서 초유를 첨가하는 것이 바람직하다.

또한, 초유의 첨가하는 방법에는 여러 가지 방식이 있으나, 영양소의 파괴를 줄이면서도 치즈의 고유한 형태를 유지하도록 하기 위해, 초유를 분말화한 분말 초유를 치즈 위에 도포하는 것이 바람직하다.

또한, 초유 분말은 초유를 동결건조함으로써 분말 상태로 제조된다.

본원발명에서, 초유 분말은 임실 지역 낙농가에서 사육중인 분만 젖소의 초유(최대 72시간 이내에 분비된 것)를 수집하여 사용하였으며, 초유는 동결건조하여 분말상태로 치즈에 첨가하였다.

3. 기능성 치즈의 품질분석

가. 영양성분 분석

초유를 첨가하지 않은 치즈와, 3중량% 초유를 첨가한 치즈의 영양성분을 분석한 결과는 표 1과 같다. 9대 영양성분에 대해서 초유를 첨가한 치즈는 100g을 기준으로 열량 322 kcal, 수분 4947g, 조지방 2646g, 포화지방 1952g, 조단백 1728g 순으로 함량을 보였다. 초유를 첨가하지 않은 치즈와 비교시 초유를 첨가함으로써 열량과 지방함량이 증가하고 탄수화물이 감소하는 경향을 보였다. 비타민류 분석에서 초유를 첨가한 치즈에서 대조군 치즈에 비하여 비타민 A, B군, C 모두 증가하였다. 또한 무기질 성분을 분석한 결과 초유를 첨가한 치즈는 칼슘함량이 가장 많이 함유되어 있으며 캄슘, 칼륨, 마그네슘, 아연 등의 함량이 초유를 첨가하지 않은 치즈에 비해 높은 함량을 나타내었다. 이상의 분석 결과들을 종합해 보면 초유를 첨가함으로써 탄수화물과 지질의 함량이 변화하여 열량에 차이가 있었으며 특히, 초유 첨가에 따른 비타민과 무기질의 함량이 크게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

[표 1]

나. 기준규격 검사

초유를 첨가한 치즈가 식품으로써 적합한가를 판정하기 위해 기준규격 검사를 실시하였다. 검사항목으로는 유고형분, 보존료 (데히드로초산, 소르빈산), 미생물 중 살모넬라, 리스테리아 모노사이토제네스 및 대장균으로 총 6개 항목에 대해 검사를 실시하였다. 이는 연질 치즈의 공전규격을 따른 것으로 검사 결과는 표 2와 같다. 유고형분은 44.92%로 공전규격상 35.0%보다 10%가량 많았으며 보존료인 데히드로초산과 소르빈산은 검출되지 않았다. 또한 살모넬라, 리스테리아 모노사이토제네스 및 대장균에서도 음성으로 나타나 치즈제품에 대한 기준규격을 만족하였다. 초유를 첨가한 기능성 치즈를 제품화함에 적합하다고 판단되었다.

[표 2]

4. 기능성 치즈의 관능검사

초유를 첨가하여 기능성 치즈를 제조한 후 제품으로써의 가능성을 평가하기위해 초유를 첨가하지 않은 치즈와 초유를 첨가한 치즈를 맛, 색, 향, 조직감 및 종합적인 기호도를 9단계 블라인드 테스트로 관능검사를 실시한 결과는 하기 표와 같다. 그 결과 초유를 첨가하지 않은 치즈에서 보다 초유를 첨가한 치즈에서 맛, 향, 조직감 및 종합적인 기호도에서 높은 점수를 얻을 수 있었다. 이를 통해 초유 첨가에 따른 소비자의 기호가 증가하는 것을 확인할 수 있었으며 기능성 치즈의 제품화하는데 의미 있는 자료로 사용될 수 있을 것으로 판단된다.

[표 3]

5 동물실험을 통한 기능성 치즈의 효능평가

가. 실험동물

BALB/c 및 C57BL/6 mouse 수컷을 (주)중앙실험동물(korea)에서 구입한 후 일주일 간 적응기간을 가진 뒤 실험에 사용하였다. 각 mouse의 체중을 측정하여 각 군당 5마리씩으로 나누었으며 온도 23±1℃, 습도 53±2%, 조명 12hr/12 hr light-dark cycle을 유지하였고 사료와 물은 자유롭게 공급하였다.

나. 실험설계

초유를 첨가하여 치즈를 제조한 후 기능성 치즈의 효능검증을 위해 실험동물을 하기 표와 같이 1군은 정상 control(NC), 2군은 알코올 control (EC), 3군은 알코올+20% 치즈 (E+CH), 4군은 알코올+10% 치즈+10% 초유(E+CH+FM10), 5군은 알코올+17% 치즈+3% 초유 (E+CH+FM3), 6군은 알코올+19% 치즈+1% 초유 (E+CH+FM1), 7군은

알코올+198% 치즈+02% 초유 (E+CH+FM02)으로 설계하여 일정기간(8주) 동안 구별 사육하였다. 알코올은 매일 일정한 시간에 400㎕씩 경구투여하여 기능성 치즈의 효능이 평가되도록 하였다. 사육기간 동안 실험동물에 사용한 식이조성에 관한 내용은 하기 표와 같다.

[표 4]

[표 5]

다. 실험방법

(1) 식이 섭취, 체중 및 체지방량 측정

실험 사육기간 동안 식이는 이틀에 한번 급여하였고 잔량을 측정하여 1일 식이섭취량을 산출하였으며, 물은 수도수를 신선하게 공급하였다. 체중변화는 1주일에 1회 일정시간에 측정하였다. 실험사육 8주간의 총 식이섭취량(g)을 총 실험일수로 나누어 1일 평균 식이섭취량을 산출하였으며, 식이효율(food efficiency ratio, FER)은 동일 기간 내 체중증가량을 총 식이섭취량으로 나누어 계산하였다.

(2) 실험동물의 처리

실험 최종일에 16시간 절식시킨 후 안와채혈 방법으로 전혈을 수집하였으며 혈액은 1시간 동안 빙수 중에 정치한 후 1,100 rpm, 4℃에서 15분간 원심분리하여 혈청을 얻었다. 영양생화학적 분석 시까지 혈청과 각 장기들은 -80℃에 보관하였다.

(3) 체내 지질 및 간기능 개선 효과 검증

(가) 혈 중 지질 함량

혈 중 지질(총콜레스테롤, 중성지방, HDL-콜레스테롤, LDL-콜레스테롤) 함량은 kit를 이용하여 분석하였다. 혈청 총콜레스테롤, 중성지방은 각 혈청 5 uL에 지질 발색시약, 1 mL을 가하고 37℃에서 10분간 방치한 후 Spectrophotometer (UV-visible spectrophotometer, Shimadzu, JP)를 이용하여 각각 500 nm, 550 nm에서 흡광도를 측정한 뒤 standard 표준곡선과 비교 계산하였다. 혈청 HDL-콜레스테롤은 혈청 10 uL에 동량의 분리액을 첨가하여 약 10분간 실온에 방치 후 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 LDL-c 및 VLDL-c 등을 제거하였다. 분리된 상청액 10 uL와 발색시액을 첨가한 후 37℃에서 5분간 반응시키고 500 nm에서 흡광도를 측정한 뒤 standard 표준곡선과 비교하여 계산하였다.

(나) 혈 중 간손상 지표 효소 변화

간손상 정도 지표(GOT, GPT)의 변화는 kit를 이용하여 분석하였다. 혈청 5 uL에 미리 예열해 둔 기질액 100 uL를 첨가한 뒤 37℃에서 GOT는 60분, GPT는 30분간 방치한 뒤 발색시액 100 uL를 첨가하여 실온에서 20분간 방치하였다. 0.4 N NaOH 용액 1 mL을 첨가하여 반응을 정지시키고 505 nm에서 흡광도를 측정한 뒤 standard 표준곡선과 비교하여 계산하였다.

(다) 간조직 중 지질 변화

간조직 중의 지질을 측정하기 위하여 간조직 100 mg에 PBS 300 uL을 첨가한 뒤 초음파 마쇄기로 균일하게 마쇄하였다. chloroform과 methanol (2:1) 혼합액 500 uL를 첨가하여 약 30초간 잘 혼합한 후 원심분리 (3,000rpm, 4℃, 15분)한 후 하층의 유기용매층을 분리하였다. 유기용매를 완전히 제거한 후 1% triton X가 첨가된 PBS로 재현탁하여 간조직 중 총콜레스테롤과 중성지방의 함량을 혈청에서의 지질 함량과 동일한 방법으로 측정하였다.

(라) 간조직 중 지질대사 관련 유전자 발현

간조직 중 Total RNA 분리는 Trizol reagent를 이용하였으며 제조회사의 방법에 준하였다. Total RNA의 농도와 순도는 260nm와 280nm에서 흡광도를 측정하여 산출하였으며 cDNA는 Prime Script™ Ⅱ reverse transcriptase와 oligo dT primer로 이용하여 합성하였다. 각 효소들의 reverse 및 forward primer, DNA polymerase, dNTPs를 첨가하여 PCR kit를 이용한 Real-time PCR (7500 Real time PCR system, Applied Biosystems, USA)을 실시한 후 증폭된 PCR product를 확인하였다.

(마) 통계처리

실험결과는 평균과 표준편차로 나타내며, 그룹간의 유의성 검증은 SPSS 120을 이용하여 ANOVA를 사용하였다.

(4) 면역증강 효과 검증

(가) 비장 및 흉선 림프구의 아집단 측정

BALB/c 마우스를 경추탈구시켜 비장 및 흉선을 적출 한 후, 비장 및 흉선세포 부유액을 조제하였다. 비장 및 흉선세포를 1×10⁶ cells/well에 PE/FITC conjugated-anti B220 및 Thy1 monoclonal antibody와 PE-anti CD4/FITC-anti CD8 monoclonal antibody (1:30)로 이중 염색하여 4℃에서 30분 동안 반응시키고 flow cytometer (excitation: 488 nm, emission: 525 nm/FITC, 575 nm/PE)를 이용하여 림프구의 아집단을 측정하였다.

(나) 혈청 림포카인 (IL-2, IL-4, IFN-γ)의 측정

ELISA 방법으로 혈청 내 림포카인의 농도를 측정하였다. 4 μg/mL의 농도로 01 M phosphate buffer (pH 90)에 희석한 anti-mouse antibody를 각 well당 100 μL씩 코팅하여 4℃에서 24시간동안 반응시켜 흡착시켰다. 그 후 PBS로 3회 세척하고, 1% BSA-PBS를 각 well당 150 μL씩 가하여 실온에서 1시간동안 blocking을 하고 PBS로 3회 세척하였다. 1% BSA-PBS로 희석한 혈청시료와 표준용액 (recombinant mouse)을 각 well당 100 μL씩 첨가하여 실온에서 1시간 반응시킨 후 PBS로 3회 세척하였다. 그 후 2 μg/mL의 농도로 1% BSA-PBS에 희석한 biotinylated anti-mouse antibody를 각 well당 100 μL씩 넣어 실온에서 1시간 반응시킨 후 PBS로 3회 세척하고 2 μg/mL 농도로 희석한 streptavidin-alkaline phosphatase를 각 well당 100 μL를 가한 후 다시 실온에서 1시간 반응시켰다. 그 후 PBS로 5회 세척한 후 p-nitrophenyl phosphate용액을 각 well당 100 μL씩 가하고 실온에서 차광하여 발색반응 하였다. 약 30분 후 50 μL의 2 N H2SO4용액으로 반응을 정지시키고, 30분 내에 ELISA reader로 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 비교하였다.

(다) 염증 관련 효소 (TNF-α, IL-6)의 mRNA 발현량 조사

염증 관련 효소의 mRNA 발현 정도를 PCR을 이용해 측정하였다. 각 효소들의 reverse 및 forward primer, DNA polymerase, dNTPs를 첨가하여 PCR kit를 이용한 Real-time PCR을 실시한 후 증폭된 PCR product를 확인하였다.

(라) 마우스 복강 대식세포 활성 평가

C57BL/6 마우스를 경추탈구 시켜 5 mL cold-PBS를 복강투여 한 후, 마사지를 하여 다시 복강액을 회수하여 원심분리하였다. 이를 RPMI 1640배지에 부유시켜 petridish에 넣고 37℃, CO2 incubator에서 4시간 배양하였다. 부착된 대식세포를 수거하여 원심분리하고 세포수를 5×10⁴ cells /well이 되도록 계대배양한 후 시료를 첨가하여 24시간 배양하였다. 배양액을 제거하고 well당 5×10⁶ particles/mL의 zymosan과 0.6 mg/mL의 NBT를 각 50 μL넣어 1시간 처리하고 PBS로 2회 세척한 후, 540 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.

(마) 통계처리

결과는 mean±SD으로 나타내었으며, t-test의 통계처리방법으로 통계적 유의성 검정을 조사하였다. 유의수준 p<005로 하였다.

자. 비장 및 흉선세포의 림프구 아집단 변화

비장 및 흉선세포의 림프구 아집단변화에 미치는 효과를 살펴본 결과, 알코올 섭취로 인해 감소된 T세포와 B세포가 초유 섭취로 인해 증가되는 경향을 보였으며 특히 초유 섭취를 통해 비장세포에서 Th세포가 유의적으로 증가되었다.

차. 혈청 림포카인의 생성

혈청 내 림포카인의 생성 여부를 살펴본 결과 IL-2 (T 세포 증식인자)의 경우 초유 섭취군에서 증가하였으며 특히, 10% 초유 섭취군에서 크게 증가 하였다. IL-4 (B 세포 증식인자)는 모든 초유 섭취군에서 증가하였으며 1% 초유 섭취군에서 거의 2배 가까운 증가를 보였다. 대식세포 활성인자인 IFN-γ는 02%, 10% 초유 섭취군에서 유의적으로 증가하였다.

알코올 섭취로 인하여 체중과 식이 섭취량은 감소하고 간손상 지표 물질과 함께 체내 지질의 함량은 높아졌다.

또한 간중 염증과 관련된 유전자와 지질 합성에 관련된 유전자의 발현은 증가하고 지질 분해에 관련된 유전자 발현 및 면역세포는 감소하였다. 그러나 이러한 알코올 투여로 인한 지질대사 및 면역관련 이상 증상들이 초유가 첨가된 식이를 통해 소폭 또는 정상수준으로 개선됨을 확인하였다.

[표 6]

[표 7]

Claims (2)

1. 원유를 이용하여 제조한 치즈에 초유를 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역활성을 촉진 하는 치즈의 제조방법.
   
2. 제2항에 있어서,
   상기 초유를 첨가하는 단계는 치즈 90~99.8중량%에 초유 분말 0.2~10중량%를 도포하는 것을 특징으로 하는 면역활성을 촉진하는 치즈의 제조방법.