KR20230173443A - SNP marker for determining the color of a pig and the use thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 백색돼지 품종의 유전자에 유색인자의 존재 여부를 판별하는 SNP 마커, 상기 SNP 마커를 포함하는 유색인자 판별용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 돼지의 유색인자 판별용 키트, 마이크로어레이, 및 백색돼지 품종 돼지의 유전자에 유색인자의 존재 여부를 판별하는 방법에 관한 것이다.The present invention provides a SNP marker for determining the presence or absence of colored people in the genes of white pig breeds, a composition for determining colored people including the SNP marker, a kit for determining colored people in pigs containing the composition, a microarray, and a white pig. This is about a method to determine whether a colored person is present in the genes of a breed of pig.
Description
본 발명은 백색돼지 품종의 유전자에 유색인자의 존재 여부를 판별하는 SNP 마커, 상기 SNP 마커를 포함하는 유색인자 판별용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 돼지의 유색인자 판별용 키트, 마이크로어레이, 및 백색돼지 품종의 유전자에 유색인자의 존재 여부를 판별하는 방법에 관한 것이다.The present invention provides a SNP marker for determining the presence or absence of colored people in the genes of white pig breeds, a composition for determining colored people including the SNP marker, a kit for determining colored people in pigs containing the composition, a microarray, and a white pig. It concerns a method of determining the presence or absence of colored individuals in the genes of a breed.
국내 사육돼지의 흑돼지는 대부분 버크셔 품종이며, 일부 햄프셔 품종이 사육 중이다. 한국재래흑돼지(제주재래흑돼지 포함)는 생산성이 없는 관계로 순종은 거의 사육을 하지 않고 있고, 다만 일부 지자체에서 종보존 차원에서 순종을 보유하고 있다. Most black pigs raised domestically are the Berkshire breed, and some Hampshire breeds are also being raised. Because Korean native black pigs (including Jeju native black pigs) are not productive, purebreds are rarely bred. However, some local governments retain purebreds for species conservation purposes.
모색이 적색인 두록(D)은 육질이 좋은 관계로, 대표적인 백색돼지 품종인 랜드레이스(L)와 대요크셔(Y)와 함께 LYD 삼원교잡종으로 사용되는데, 두록의 모색은 백색 또는 흑색 품종과 교배시 완전열성으로 작용한다.Durok (D), which has red hair, has good meat quality and is used as a LYD three-way cross with the representative white pig breeds, Landrace (L) and Great Yorkshire (Y). Durok's color is obtained by crossing with white or black breeds. It acts completely recessively.
특히 랜드레이스와 대요크셔 품종은 외국에서 수백년간 백색으로 고정한 품종으로 대표적인 백색돼지 품종으로 알려져 있다. 그러나 유전자 수준에서 살펴보면 일부가 고정이 안된 이모색(유색) 인자를 보유하고 있다.In particular, the Landrace and Great Yorkshire breeds are known as representative white pig breeds, as they have been fixed as white for hundreds of years in foreign countries. However, if you look at the genetic level, some of them have non-fixed hair color factors.
그 결과 삼원교잡종을 만들 때 L(랜드레이스) x Y(대요크셔)를 교배한 후 적색의 D(두록)을 교배하여 생산하는데, L x Y 자손은 모두 백색의 자손이 생산되지만, 성장 후 LY에 D(두록)을 교배하면 모두 백색이 나오지 않고 일부는 이모색 개체들이 생산된다. 이는 백색돼지 품종의 KIT 유전자 때문에 발생한다는 것이 알려져 있다.As a result, when creating a three-way hybrid, L (Landrace) When crossing D (Durok), not all white ones are produced, but some bicolored ones are produced. It is known that this occurs due to the KIT gene in white pig breeds.
백색돼지 품종은 일반 유색종과 달리 KIT 유전자가 2~3개 반복(CNV: copy number variation)되는 특성이 있다(2개 이상의 KIT 유전자가 반복해서 나오면 유전자형은 I로 표기함). 그러나 일부 개체에서는 유색종과 같이 KIT 유전자가 1개로 나오는데(KIT 유전자가 1개만 나오면 유전자형은 I로 표기함), I가 i에 대해 완전우성으로 작용한다. 따라서 백색돼지 품종간 교배시 대부분 I/I 또는 I/i의 유전자형으로 구성되기 때문에, 백색의 표현형으로 보이게 된다.White pig breeds, unlike general colored breeds, have the characteristic of having 2 to 3 repetitions (CNV: copy number variation) of the KIT gene (if 2 or more KIT genes are repeated, the genotype is indicated as I). However, in some individuals, like colored species, there is only one KIT gene (if only one KIT gene is present, the genotype is indicated as I), and I acts completely dominant over i. Therefore, when crossing between white pig breeds, most of them are composed of I/I or I/i genotype, so they appear to have a white phenotype.
그러나 적색의 두록 품종과 I/i 유전자형을 보유한 랜드레이스나 대요크셔 품종간 교배시 정상적인 모색은 백색이나, 백색이 아닌 이모색 개체들이 생산이 되는 경우가 있으며, 실제로 이런 상황이 대형 종돈장에서 분양한 돼지에서 빈번히 발생하고 있어 종돈의 순수성에 대해 민원이 자주 발생하고 있다.However, when crossing the red Duroc breed with the Landrace or Great Yorkshire breeds with the I/i genotype, the normal coat is white, but in some cases, non-white colored individuals are produced. In fact, this situation occurs in pigs sold from large breeding farms. It occurs frequently in pigs, and there are frequent complaints about the purity of pigs.
KIT 유전자를 분석하기 위해서는 CNV, 엑손2, 인트론17 부위를 분석해야 정확한 유전자형을 파악할 수 있는데, 특히 CNV 분석은 고가의 장비와 분석의 난이도가 대단히 높아 대부분의 실험실에서 분석이 불가능하다(OLA 테스트).In order to analyze the KIT gene, the CNV, exon 2, and intron 17 regions must be analyzed to determine the exact genotype. In particular, CNV analysis is impossible in most laboratories due to expensive equipment and extremely high difficulty in analysis (OLA test). .
이에 백색돼지 품종내에서 유색인자를 간단히 식별할 수 있는 방법에 대한 필요성이 지속적으로 제기되고 있다.Accordingly, the need for a method to easily identify colored people within white pig breeds continues to be raised.
본 발명의 목적은 백색돼지 품종 유전자의 유색인자 판별용 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커 및 상기 마커를 포함하는, 백색돼지 품종 유전자의 유색인자 판별용 조성물을 제공하는 것이다.The purpose of the present invention is to provide a SNP (single nucleotide polymorphism) marker for identifying colored people from the genes of a white pig breed and a composition containing the marker for determining colored people from the genes of a white pig breed.
본 발명의 다른 목적은 상기 유색인자 판별용 조성물을 포함하는, 백색돼지 품종 유전자의 유색인자 판별용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit for determining colored people from white pig breed genes, including the composition for determining colored people.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 유색인자 판별용 SNP 마커를 포함하는, 백색돼지 품종 유전자의 유색인자 판별용 마이크로어레이를 제공한다.Another object of the present invention is to provide a microarray for distinguishing colored people from white pig breed genes, including the SNP marker for distinguishing colored people.
본 발명의 또 다른 목적은 백색돼지 품종의 유전자의 유색인자를 판별하는 방법에 관한 것이다.Another object of the present invention relates to a method for identifying colored genes in white pig breeds.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 양상은, 서열번호 1로 이루어지는 백색돼지의 유색인자 관련 폴리뉴클레오타이드에서 501번째 염기가 A 또는 T이고, 상기 501번째 염기를 포함하는 5 내지 1,001개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편인 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커를 제공한다.In order to achieve the above object, one aspect of the present invention is that in the polynucleotide related to the colored person of a white pig consisting of SEQ ID NO: 1, the 501st base is A or T, and 5 to 1,001 consecutive sequences containing the 501st base are used. It provides a single nucleotide polymorphism (SNP) marker, which is a polynucleotide composed of bases, a complementary polynucleotide thereof, or a fragment thereof.
본 발명의 다른 일 양상은 상기 SNP 마커, 및 상기 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 백색돼지 품종 유전자의 유색인자 판별용 조성물을 제공하는 것이다.Another aspect of the present invention is to provide a composition for determining colored people from white pig breed genes, including the SNP marker and an agent capable of detecting or amplifying the marker.
본 발명의 다른 일 양상은 Another aspect of the present invention is
(a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편의 다형성 부위를 증폭시키는 단계; 및(a) amplifying a polymorphic site of the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 or a complementary polynucleotide or fragment thereof from the DNA of a sample isolated from an individual; and
(b) 상기 (a) 단계의 증폭된 각 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계(b) determining the base of each polymorphic site amplified in step (a)
를 포함하는, 백색돼지 품종의 유전자의 유색인자를 판별하는 방법을 제공한다.Provides a method for determining the colored genes of white pig breeds, including.
외국에서 매년 수천두의 백색돼지 품종이 도입되고 있으나, 이들 개체의 모색 유전자형이 고정되지 않아 종돈장에서 일반농장으로 분양시 종돈의 순수성에 대한 민원이 지속적으로 발생하고 있다. 본 발명에 따른 유전자 마커를 사용하게 되면 종돈장 단계에서 유색인자 보유 개체를 자연스럽게 도태 처리할 수 있게 되므로, 모색이 완전 백색으로 고정된 개체를 생산할 수 있게 된다.Thousands of white pig breeds are introduced every year from foreign countries, but because the color genotype of these individuals is not fixed, complaints regarding the purity of the pigs when they are sold from breeding farms to general farms continue to occur. By using the genetic marker according to the present invention, it is possible to naturally cull colored individuals at the sow stage, thereby producing individuals with completely white hair.
도 1은 백색돼지 품종(랜드레이스, 대요크셔)에서 확인 가능한 KIT 유전자 구조 변이를 나타낸 것이다.
도 2는 백색돼지의 유색인자 검출을 위한 SNP를 추출하기 위한 돼지 NGS 데이터이다.
도 3은 PCR 증폭 결과 사진이다.
도 4는 PCR 산물을 제한효소 MspⅠ로 처리한 후 절단 양상을 나타낸 것이다( K(제주재래흑돼지), D(두록), B(버크셔), H(햄프셔), L(랜드레이스), Y(대 요크셔)).Figure 1 shows the KIT gene structural variations that can be identified in white pig breeds (Landrace, Greater Yorkshire).
Figure 2 shows pig NGS data for extracting SNPs for detection of colored people in white pigs.
Figure 3 is a photo of PCR amplification results.
Figure 4 shows the cleavage pattern after treating the PCR product with the restriction enzyme MspI (K (Jeju native black pig), D (Durok), B (Berkshire), H (Hampshire), L (landrace), Y (versus Yorkshire)).
본 발명의 용어 "SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제"란, 유전자의 다형성 부위를 증폭을 통해 확인하여 돼지의 유색인자 존재 여부를 판별할 수 있는 조성물을 의미하며, 구체적으로는 상기 SNP 마커의 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 의미할 수 있다.The term "agent capable of detecting or amplifying a SNP marker" in the present invention refers to a composition that can determine the presence or absence of a colored person in a pig by confirming the polymorphic site of the gene through amplification, and specifically, the SNP marker. It may refer to a primer that can specifically amplify a polynucleotide.
구체적으로는 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 프라이머 쌍을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Specifically, it may include a primer pair consisting of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 that can amplify the polynucleotide consisting of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
본 발명에서 SNP 마커 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 상기 프라이머 서열은 상기 SNP 마커와 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 상기 SNP 마커와 혼성화할 수 있을 정도로 충분히 상보적이어야 한다.Primers used for SNP marker amplification in the present invention are template- It can be a single-stranded oligonucleotide that can act as a starting point for directed DNA synthesis. The appropriate length of the primer may vary depending on the purpose of use, but is usually 15 to 30 nucleotides. Short primer molecules generally require lower temperatures to form stable hybrids with the template. The primer sequence need not be completely complementary to the SNP marker, but must be sufficiently complementary to hybridize to the SNP marker.
본 발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점의 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 돼지의 유색인자 존재 여부를 판별할 수 있다.The term "primer" of the present invention refers to a base sequence having a short free 3' terminal hydroxyl group, which can form a base pair with a complementary template and serves as a starting point for copying the template strand. It refers to a short sequence that functions as a branch. Primers can initiate DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and reagents for polymerization (i.e., DNA polymerase or reverse transcriptase) in an appropriate buffer solution and temperature. By performing PCR amplification, the presence or absence of colored individuals in pigs can be determined by whether or not the desired product is produced.
PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.PCR conditions and lengths of sense and antisense primers can be modified based on those known in the art.
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있을 수 있다.The primer of the present invention can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method or other well-known methods. These nucleic acid sequences can also be modified using many means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include methylation, “capsation,” substitution of a native nucleotide with one or more homologues, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkages (e.g., methyl phosphonates, phosphotriesters, phosphoroamidate, carbamate, etc.) or charged linkages (e.g. phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.).
본 발명의 목적상 백색돼지의 모색은 본 발명의 SNP 마커의 유전자형에 의해 영향을 받는데, 상기 SNP 마커를 구성하는 서열번호 1로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 변이 부위의 염기(돼지 8번 염색체의 42,232,884번 위치)가 A 또는 C로 나타날 수 있으며, 이에 따라 변이 부위의 유전자형이 AA이면 백색으로 유전자형이 완전 고정된 것이고, AT이면 이형접합체로서 표현형은 백색이며, TT이면 백색바탕에 작은 흑색 반점이 나타나게 된다고 판단할 수 있다.For the purpose of the present invention, the color of white pigs is influenced by the genotype of the SNP marker of the present invention, the base of the mutation site of the polynucleotide consisting of SEQ ID NO. 1 constituting the SNP marker (position 42,232,884 of pig chromosome 8) ) can appear as A or C. Accordingly, if the genotype of the mutation site is AA, the genotype is completely fixed as white, if AT, it is heterozygous and the phenotype is white, and if TT, small black spots appear on a white background. can do.
본 발명의 목적상 상기 SNP은 특별히 이에 제한되지 않으나, 모색형질에 관여하는 유전자의 다형성 부위(polymorphism)를 포함하는 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 구체적으로 서열번호 1로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 SNP 부위를 포함하는 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 더욱 구체적으로 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 501번째 염기가 A 또는 C이고, 상기 501번째 염기를 포함하는 5 내지 1,001개, 바람직하게는 20 내지 901개, 더 바람직하게는 30 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체를 포함하는, 돼지의 유색인자 존재 판별용 SNP 마커일 수 있다.For the purpose of the present invention, the SNP is not particularly limited thereto, but may be all or part of a polynucleotide containing a polymorphism of a gene involved in hair coloring, and specifically, the SNP portion of the polynucleotide consisting of SEQ ID NO: 1. It may be all or part of a polynucleotide containing, and more specifically, in the polynucleotide consisting of SEQ ID NO: 1, the 501st base is A or C, and 5 to 1,001, preferably 20 to 901, containing the 501st base. It may be a SNP marker for determining the presence of colored people in dogs, more preferably pigs, containing part or all of a polynucleotide consisting of 30 to 501 consecutive bases.
본 발명의 용어 "다형성(polymorphism)"이란, 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 의미하며 다형성 부위 중에서, 단일 염기만이 다른 것을 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 5% 또는 10% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.The term "polymorphism" of the present invention refers to the presence of two or more alleles at one genetic locus, and a single base polymorphism refers to a polymorphic site that differs by only a single base. It is called nucleotide polymorphism (SNP). Preferred polymorphic markers have two or more alleles with an occurrence frequency of 1% or more, more preferably 5% or 10% or more in the selected population.
본 발명의 용어 "대립유전자(allele)"란, 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 의미한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.The term “allele” in the present invention refers to several types of one gene that exist at the same genetic locus on a homologous chromosome. Alleles are also used to represent polymorphisms, for example, a SNP has two types of alleles.
상기 "서열번호 1"은 다형성 부위를 포함하는 다형성 서열(polymorphic sequence)이다. 다형성 서열이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 SNP를 포함하는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 DNA 또는 RNA가 될 수 있다.The “SEQ ID NO: 1” is a polymorphic sequence containing a polymorphic site. A polymorphic sequence refers to a sequence containing a polymorphic site containing a SNP in a polynucleotide sequence. The polynucleotide sequence may be DNA or RNA.
본 발명의 또 다른 일구현예는 상기 조성물을 포함하는 백색돼지의 유색인자 판별용 키트에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 키트는 Multi-plexing PCR 키트 또는 DNA 분석용(예, DNA 칩) 키트일 수 있다.Another embodiment of the present invention relates to a kit for determining color in white pigs containing the above composition. Specifically, the kit may be a multi-plexing PCR kit or a DNA analysis (eg, DNA chip) kit.
본 발명의 키트는 백색돼지의 유색인자 존재를 나타내는 유전자를 증폭시킨 후 제한효소로 절단하여 나타나는 밴드의 양상을 확인함으로써 백색돼지의 유색인자 존재 여부를 판단할 수 있다. 구체적인 일례로서, 본 발명에서 백색돼지의 유색인자 존재 여부를 판별하기 위한 키트는 Multi-plexing PCR을 수행하기 위해 필요한 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 상기 Multi-plexing PCR 키트는, 상기 SNP 마커 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 등의 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.The kit of the present invention can determine the presence of colored people in white pigs by amplifying the gene indicating the presence of colored people in white pigs and then cutting it with a restriction enzyme to check the pattern of the band that appears. As a specific example, in the present invention, the kit for determining the presence of colored people in white pigs may be a kit containing the elements necessary to perform multi-plexing PCR. The Multi-plexing PCR kit includes, in addition to a primer pair specific for the SNP marker gene, a test tube or other appropriate container, a reaction buffer (pH and magnesium concentration vary), deoxynucleotides (dNTPs), Taq-polymerase, etc. It may contain enzymes, DNase, RNAse inhibitors, DEPC-water, sterilized water, etc.
또한, 구체적으로 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 백색돼지의 유색인자 존재 여부 판별용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 일반적으로 편평한 고체 지지판, 전형적으로는 현미경용 슬라이드보다 크지않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열(gridded array)로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중혼성화(hybridization) 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구로서, 이를 이용하여 백색돼지의 유색인자 존재 여부를 판단할 수 있다.Additionally, specifically, the kit of the present invention may be a kit for determining the presence or absence of colored individuals in white pigs, which includes the essential elements required to perform a DNA chip. DNA chip kits are generally made by attaching nucleic acid species in a gridded array to a flat solid support plate, typically a glass surface no larger than a microscope slide. Nucleic acids are arranged uniformly on the chip surface, forming a DNA chip. It is a tool that enables massively parallel analysis by causing a multiple hybridization reaction between the nucleic acid on the chip and the complementary nucleic acid contained in the solution treated on the chip surface. It can be used to determine the presence of colored people in white pigs.
본 발명의 또 다른 일 구현예는, Another embodiment of the present invention is,
(a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편의 다형성 부위를 증폭시키는 단계; 및(a) amplifying a polymorphic site of the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 or a complementary polynucleotide or fragment thereof from the DNA of a sample isolated from an individual; and
(b) 상기 (a) 단계의 증폭된 각 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계;(b) determining the base of each polymorphic site amplified in step (a);
를 포함하는, 백색돼지 품종의 유전자의 유색인자를 판별하는 방법에 관한 것이다. 이때, 상기 분리된 시료의 DNA는 개체로부터 분리된 시료로부터 수득할 수 있다.It relates to a method for determining the colored genes of white pig breeds, including. At this time, the DNA of the isolated sample can be obtained from a sample isolated from an individual.
본 발명의 용어 "개체"란, 유색인자의 존재 여부를 확인하고자 하는 대상인 돼지, 보다 구체적으로는 백색돼지를 의미하며, 상기 돼지로부터 얻어진 검체를 이용하여, SNP의 유전자형을 분석함으로써 돼지가 유색인자를 가지고 있는지 여부를 판별할 수 있다. 상기 검체로는 털, 뇨, 혈액, 각종 체액, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액과 같은 시료 등으로부터 DNA를 수득할 수 있으나, 이에 특별히 제한되지는 않는다.The term "individual" of the present invention refers to a pig, more specifically a white pig, for which the presence of a person of color is to be confirmed. Using a sample obtained from the pig, the genotype of the SNP is analyzed to determine whether the pig has a person of color. You can determine whether it exists or not. DNA can be obtained from samples such as hair, urine, blood, various body fluids, separated tissues, separated cells, or saliva, but is not particularly limited thereto.
상기 (a) 단계의 DNA로부터 상기 SNP 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 프로브와 혼성화하는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR)(Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification)(Kwoh 등, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제(Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA)이 사용될 수 있다.The step of amplifying the polymorphic site of the SNP marker from the DNA in step (a) or hybridizing it with a probe can be performed by any method known to those skilled in the art. For example, target nucleic acid can be amplified through PCR and purified. In addition, ligase chain reaction (LCR) (Wu and Wallace, Genomics 4, 560 (1989), Landegren et al., Science 241, 1077 (1988)), transcription amplification (Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173 (1989)) and self-sustaining sequence cloning (Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874 (1990)) and nucleic acid-based sequence amplification (NASBA) can be used.
상기 방법 중 (b)단계의 다형성 부위의 염기를 결정하는 것은 서열 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ 및 SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 이용 가능한 다른 방법에 의해, 마이크로새틀라이트, SNP 또는 다른 종류의 다형성 마커를 포함한, 다형성 마커에서의 하나 이상의 대립유전자가 확인될 수 있다. 이와 같은 다형성 부위의 염기를 결정하는 것은 구체적으로는 SNP 칩을 통해 수행할 수 있다.Among the above methods, determining the base of the polymorphic site in step (b) includes sequence analysis, hybridization by microarray, allele-specific PCR, and dynamic allele-specific hybridization. , DASH), PCR extension assay, PCR-SSCP, PCR-RFLP assay or TaqMan technique, SNPlex platform (Applied Biosystems), mass spectrometry (e.g., Sequenom's MassARRAY system), mini-sequencing method, Including, but not limited to, Bio-Plex systems (BioRad), CEQ and SNPstream systems (Beckman), Molecular Inversion Probe array technologies (e.g., Affymetrix GeneChip), and BeadArray Technologies (e.g., Illumina GoldenGate and Infinium assays). It doesn't work. By the above methods or other methods available to those skilled in the art to which the present invention pertains, one or more alleles in a polymorphic marker, including microsatellites, SNPs or other types of polymorphic markers, can be identified. Determining the base of such a polymorphic site can be specifically performed using a SNP chip.
상기 용어, "SNP 칩"이란, 수십만 개의 SNP의 각 염기를 한번에 확인할 수 있는 DNA 마이크로어레이의 하나를 의미한다.The term “SNP chip” refers to a DNA microarray that can identify each base of hundreds of thousands of SNPs at once.
TaqMan 방법은, (1) 원하는 DNA 단편을 증폭할 수 있도록 프라이머 및 TaqMan 탐침을 설계 및 제작하는 단계; (2) 서로 다른 대립유전자의 탐침을 FAM 염료 및 VIC 염료로 표지(Applied Biosystems)하는 단계; (3) 상기 DNA를 주형으로 하고, 상기의 프라이머 및 탐침을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; (4) 상기의 PCR 반응이 완성된 후, TaqMan 분석 플레이트를 핵산 분석기로 분석 및 확인하는 단계; 및 (5) 상기 분석결과로부터 단계 (1)의 폴리뉴클레오티드의 유전자형을 결정하는 단계를 포함한다.The TaqMan method includes the following steps: (1) designing and producing primers and TaqMan probes to amplify the desired DNA fragment; (2) labeling probes of different alleles with FAM dye and VIC dye (Applied Biosystems); (3) using the DNA as a template and performing PCR using the primers and probes; (4) After the above PCR reaction is completed, analyzing and confirming the TaqMan assay plate with a nucleic acid analyzer; and (5) determining the genotype of the polynucleotide of step (1) from the analysis results.
시퀀싱 분석은 염기서열 결정을 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 자동화된 유전자분석기를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 대립유전자 특이적 PCR은 SNP가 위치하는 염기를 3' 말단으로 하여 고안한 프라이머를 포함한 프라이머 세트로 상기 SNP가 위치하는 DNA 단편을 증폭하는 PCR 방법을 의미한다. 상기 방법의 원리는, 예를 들어, 특정 염기가 A에서 G로 치환된 경우, 상기 A를 3' 말단염기로 포함하는 프라이머 및 적당한 크기의 DNA 단편을 증폭할 수 있는 반대 방향 프라이머를 고안하여 PCR 반응을 수행할 경우, SNP 위치의 염기가 A인 경우에는 증폭반응이 정상적으로 수행되어 원하는 위치의 밴드가 관찰되고, 상기 염기가 G로 치환된 경우에는 프라이머는 주형 DNA에 상보적으로 결합할 수 있으나, 3' 말단 쪽이 상보적 결합을 하지 못함으로써 증폭 반응이 제대로 수행되지 않는 점을 이용한 것이다. DASH는 통상적인 방법으로 수행될 수 있고, 구체적으로는 프린스 등에 의한 방법에 의하여 수행될 수 있다.Sequencing analysis can use conventional methods for determining base sequences and can be performed using an automated genetic analyzer. In addition, allele-specific PCR refers to a PCR method that amplifies the DNA fragment where the SNP is located using a primer set including a primer designed with the base where the SNP is located as the 3' end. The principle of the method is, for example, when a specific base is substituted from A to G, PCR is performed by designing a primer containing A as the 3' terminal base and a reverse primer capable of amplifying a DNA fragment of an appropriate size. When performing the reaction, if the base at the SNP position is A, the amplification reaction is performed normally and a band at the desired position is observed, and if the base is replaced with G, the primer can bind complementary to the template DNA. , it takes advantage of the fact that the amplification reaction is not performed properly due to the failure of complementary binding at the 3' end. DASH can be performed by conventional methods, specifically by the method by Prince et al.
한편, PCR 연장 분석은 먼저 단일 염기 다형성이 위치하는 염기를 포함하는 DNA 단편을 프라이머 쌍으로 증폭시킨 다음, 반응에 첨가된 모든 뉴클레오티드를 탈인산화시킴으로써 불활성화시키고, 여기에 SNP 특이적 연장 프라이머, dNTP 혼합물, 디데옥시뉴클레오티드, 반응 완충액 및 DNA 중합효소를 첨가하여 프라이머 연장반응을 수행함으로써 이루어진다. 이때, 연장 프라이머는 SNP가 위치하는 염기의 5' 방향의 바로 인접한 염기를 3' 말단으로 삼으며, dNTP 혼합물에는 디데옥시뉴클레오티드와 동일한 염기를 갖는 핵산이 제외되고, 상기 디데옥시뉴클레오티드는 SNP를 나타내는 염기 종류 중 하나에서 선택된다. 예를 들어, A에서 G로의 치환이 있는 경우, dGTP, dCTP 및 TTP 혼합물과 ddATP를 반응에 첨가할 경우, 상기 치환이 일어난 염기에서 프라이머는 DNA 중합효소에 의하여 연장되고, 몇 염기가 지난 후 A 염기가 최초로 나타나는 위치에서 ddATP에 의하여 프라이머 연장반응이 종결된다. 만일 상기 치환이 일어나지 않았다면, 그 위치에서 연장반응이 종결되므로, 상기 연장된 프라이머의 길이를 비교함으로써 SNP를 나타내는 염기 종류를 판별할 수 있게 된다.Meanwhile, in the PCR extension analysis, a DNA fragment containing the base where the single nucleotide polymorphism is located is first amplified with a pair of primers, and then all nucleotides added to the reaction are inactivated by dephosphorylation, followed by SNP-specific extension primer, dNTP This is accomplished by performing a primer extension reaction by adding the mixture, dideoxynucleotide, reaction buffer, and DNA polymerase. At this time, the extension primer uses the base immediately adjacent in the 5' direction of the base where the SNP is located as the 3' end, and the dNTP mixture excludes nucleic acids having the same base as the dideoxynucleotide, and the dideoxynucleotide represents the SNP. It is selected from one of the base types. For example, when there is a substitution from A to G and a mixture of dGTP, dCTP and TTP and ddATP are added to the reaction, the primer is extended by DNA polymerase at the base where the substitution occurred, and after a few bases, A The primer extension reaction is terminated by ddATP at the position where the base first appears. If the substitution has not occurred, the extension reaction is terminated at that position, so that the type of base representing the SNP can be determined by comparing the lengths of the extended primers.
이때, 검출방법으로는 연장 프라이머 또는 디데옥시뉴클레오티드를 형광 표지한 경우에는 일반적인 염기서열 결정에 사용되는 유전자 분석기(예를 들어, ABI사의 Model 3700 등)를 사용하여 형광을 검출함으로써 상기 SNP을 검출할 수 있으며, 무-표지된 연장 프라이머 및 디데옥시뉴클레오티드를 사용할 경우에는 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) 기법을 이용하여 분자량을 측정함으로써 상기 SNP를 검출할 수 있다.At this time, the detection method is to detect the SNP by detecting fluorescence using a genetic analyzer (for example, ABI's Model 3700, etc.) used for general base sequence determination in the case of fluorescently labeled extension primers or dideoxynucleotides. When using unlabeled extension primers and dideoxynucleotides, the SNP can be detected by measuring the molecular weight using matrix assisted laser desorption ionization-time of flight (MALDI-TOF) technique.
구체적으로, 서열번호 1로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서, 다형성 부위인 501번째 염기의 대립유전자가 AA이면 백색으로 유전자형이 완전 고정된 것이고, AT이면 이형접합체로서 표현형은 백색이며, TT이면 백색바탕에 작은 흑색 반점이 나타나게 된다고 판단할 수 있다.Specifically, in the polynucleotide consisting of SEQ ID NO: 1, if the allele at base 501, which is the polymorphic site, is AA, the genotype is completely fixed as white, if AT, it is heterozygous and the phenotype is white, and if TT, the allele is white on a white background. It can be judged that spots appear.
본 발명의 또 다른 일구현예는 상기 백색돼지 품종의 유전자에 유색인자의 존재 여부 판별용 SNP 마커를 포함하는 마이크로어레이에 관한 것이다.Another embodiment of the present invention relates to a microarray containing SNP markers for determining the presence of colored people in the genes of the white pig breed.
상기 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 프로브 폴리뉴클레오티드에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어진다.The microarray may include DNA or RNA polynucleotides. The microarray consists of a conventional microarray except that the probe polynucleotide includes the polynucleotide of the present invention.
프로브 폴리뉴클레오티드를 기판상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 프로브 폴리뉴클레오티드는 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명의 프로브는 대립유전자 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립유전자간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립유전자 중 하나에만 혼성화 하도록 충분히 엄격해야 한다. 이렇게 함으로써 다른 대립유전자 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 상기 프로브는 대립유전자를 검출하여 백색돼지의 유색인자 존재 여부의 판별 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 판단방법에는 서던 블롯트 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다. 상기 혼성화란 엄격한 조건, 예를 들면 1M 이하의 염 농도 및 25℃ 이상의 온도 하에서 보통 수행될 수 있다. 예를 들면, 5x SSPE(750 mM NaCl, 50 mM Na Phosphate, 5 mM EDTA, pH 7.4) 및 25 내지 30℃의 조건이 대립유전자 특이적 프로브 혼성화에 적합할 수 있다.Methods for manufacturing microarrays by immobilizing probe polynucleotides on a substrate are well known in the art. The probe polynucleotide refers to a polynucleotide capable of hybridization, and refers to an oligonucleotide capable of sequence-specific binding to the complementary strand of a nucleic acid. The probe of the present invention is an allele-specific probe, in which a polymorphic site is present among nucleic acid fragments derived from two members of the same species, and hybridizes to the DNA fragment derived from one member, but does not hybridize to the fragment derived from the other member. . In this case, hybridization conditions must be sufficiently stringent to ensure that only one of the alleles hybridizes, as there is a significant difference in hybridization strength between alleles. This can lead to good hybridization differences between different allelic forms. The probe of the present invention can be used in a method for detecting alleles and determining whether a colored person is present in a white pig. The above determination methods include detection methods based on hybridization of nucleic acids such as Southern blot, and in the method using a DNA chip, the detection method may be provided in a form pre-bound to the substrate of the DNA chip. The hybridization can usually be performed under stringent conditions, for example, at a salt concentration of 1M or less and a temperature of 25°C or higher. For example, conditions of 5x SSPE (750mM NaCl, 50mM Na Phosphate, 5mM EDTA, pH 7.4) and 25-30°C may be suitable for allele-specific probe hybridization.
본 발명의 백색돼지의 유색인자 존재 여부 판별과 연관된 프로브 폴리뉴클레오티드의 기판상에 고정화하는 과정도 또한 이러한 종래 기술을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질 예를 들면 Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.The process of immobilizing the probe polynucleotide involved in determining the presence or absence of colored individuals in white pigs of the present invention on a substrate can also be easily manufactured using this conventional technology. Additionally, hybridization of nucleic acids and detection of hybridization results on microarrays are well known in the art. The detection may be performed, for example, by labeling a nucleic acid sample with a labeling material capable of generating a detectable signal, including fluorescent substances such as Cy3 and Cy5, and then hybridizing it on a microarray and generating a detectable signal from the labeling material. Hybridization results can be detected by detecting the signal.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples. However, the following examples are merely illustrative of the present invention, and the present invention is not limited by the following examples.
[실시예 1] 국내 사육 주요 돼지 품종별 모색 특성[Example 1] Hair color characteristics of major domestic pig breeds
국내에서 주로 사용되는 돼지의 품종에 따른 모색을 하기 표 1에 나타내었다.The hair color according to the breeds of pigs mainly used in Korea is shown in Table 1 below.
[실시예 2] 백색 랜드레이스 품종의 유색(이모색) 인자 보유여부에 대한 판별[Example 2] Determination of whether white landrace varieties have colored (double-colored) factors
백색돼지의 품종에 있어서, 이모색 인자가 발생하게 되는 원인 유전자는 KIT 유전자이며, SNP이외에 유전자 구조차이(CNV; copy number variation)로 인해 발생하게 된다(도 1).In white pig breeds, the gene responsible for hair coloring is the KIT gene, and it is caused by gene structure differences (CNV; copy number variation) in addition to SNPs (Figure 1).
일단 I 유전자형은 KIT 유전자형의 반복개수와 17번 인트론 시작부위에 따라서 I 1 , I 2 , I 3 로 나누어지고, I RN 유전자형은 유색의 i와 거의 비슷하다. 즉 KIT 유전자가 단 1개만 확인된다.First of all, the I genotype is divided into I 1 , I 2 , and I 3 depending on the number of repeats of the KIT genotype and the start of intron 17, and the I RN genotype is almost similar to the colored i . In other words, only one KIT gene was identified.
KIT 유전자형인 I 1 , I 2 , I 3 는 I RN 유전자형에 대해 완전 우성으로 작용하여 표현형이 완전 백색으로 나타난다. The KIT genotypes I 1 , I 2 , and I 3 are completely dominant over the I RN genotype, resulting in a completely white phenotype.
그러나 I와 I RN 유전자형이 결합된 이형접합체 즉 I 1 /I RN , I 2 /I RN , I 3 /I RN 는 표현형이 백색이지만 이협접합체간 교배시 자돈에서는 I RN /I RN 의 동형접합체가 생산될 수 있는데, 이때 자돈의 모색은 전신 백색이 아니라 백색 바탕에 부분 흑색 반점이 확인된다. KIT 유전자 수준에서 설명하면 CNV는 각각 1개이며 엑손2영역, 즉 mRNA 기준으로 ATG 개시코돈에서 120번째 서열이 T인 반면, 유색 품종에서는 해당 부위의 서열이 G이어서, 유색과 백색 품종에 있어서 차이가 있는 염기서열인 것으로 확인되었다. 또한 인트론17 시작부위가 G로 시작한다는 점에서도 차이가 있다However, heterozygotes combining the I and I RN genotypes, that is, I 1 / I RN , I 2 / I RN , and I 3 / I RN , have a white phenotype, but when crossing between heterozygotes, piglets homozygous for I RN / I RN It can be produced, but in this case, the piglet's color is not entirely white, but partial black spots are identified on a white background. When explained at the level of the KIT gene, there is one CNV each, and the 120th sequence from the ATG start codon in the exon 2 region, that is, on an mRNA basis, is T, whereas in colored varieties, the sequence of that region is G, so there is a difference between colored and white varieties. It was confirmed that it was a base sequence with . There is also a difference in that the start site of intron 17 begins with G.
그러나 표현형이 백색인 경우 CNV 개수에서 한쪽은 최소 2개 이상이고, 엑손2영역에서 T/T이며, 인트론 17 시작부위는 G/A의 이형접합체만 확인되는 등, 백색품종과 유색품종 간에 유전자 수준에서 차이가 있다.However, if the phenotype is white, the number of CNVs is at least 2 on one side, T/T in the exon 2 region, and only G/A heterozygosity at the start of intron 17 is confirmed, etc., at the genetic level between white and colored breeds. There is a difference in
[실시예 3] 돼지 NGS 데이터에서 백색돼지의 유색인자 검출용 SNP 추출[Example 3] SNP extraction for detection of colored people in white pigs from pig NGS data
백색품종과 유색품종 간의 유전자 차이를 구체적으로 분석하기 위해서는, CNV, 엑손2(c.120T>G), 인트론 17 시작 부위의 분석이 동반되어야 하는데, 특히 CNV 분석은 고가의 장비와 분석의 난이도가 대단히 높아 대부분의 실험실에서 분석이 불가능하다(OLA test). 따라서, 본 발명에서는 대부분의 실험실에서 수행이 가능한 SNP 수준에서 간단히 분석할 수 있는 방법을 개발할 목적으로 NGS 데이터를 활용하였다(도 2).In order to specifically analyze the genetic differences between white and colored breeds, analysis of CNV, exon 2 (c.120T>G), and intron 17 start site must be performed. In particular, CNV analysis requires expensive equipment and difficulty in analysis. It is so high that analysis is impossible in most laboratories (OLA test). Therefore, in the present invention, NGS data was utilized for the purpose of developing a simple analysis method at the SNP level that can be performed in most laboratories (FIG. 2).
NGS 데이터는 두록 9개체, 재래돼지 23개체, 랜드레이스 17개체 총 49개체를 이용하였고, KIT는 8번-염색체의 41Mb 위치에 있다. 이미 원인 유전자가 KIT로 확인되었으므로, 보유한 이형접합체를 이용하여 나머지 백색으로 고정된 랜드레이스 동형접합체로 필터링(filtering)한 후에 두록 품종과 재래돼지는 동형접합체로 필터링(filtering)하여 SNP를 줄이는 작업을 진행하였다.NGS data used a total of 49 individuals, including 9 Durok individuals, 23 native pigs, and 17 Landrace individuals, and KIT is located at 41Mb of chromosome 8. Since the causative gene has already been identified as KIT, the remaining heterozygotes are used to filter the remaining white fixed landrace homozygotes, and then the Durok breed and native pigs are filtered with homozygotes to reduce SNPs. proceeded.
실제로 NGS 데이터에서 SNP를 추출한 결과 39.1Mb ~ 71.7Mb까지 1,373개의 SNP가 추출되었다. 원인유전자인 KIT 유전자에서 SNP가 추출되지 않아 분석의 정확도를 높이기 위하여 KIT 유전자에서 가장 가까이 있는 SNP를 선정(8번 염색체_position 42,232,884. A>C)하였다.In fact, as a result of extracting SNPs from NGS data, 1,373 SNPs were extracted ranging from 39.1Mb to 71.7Mb. Since the SNP was not extracted from the KIT gene, which is the causal gene, the SNP closest to the KIT gene was selected (chromosome 8_position 42,232,884. A>C) to increase the accuracy of analysis.
8번 염색체_position 42,232,884의 A>C 변이를 기준으로 앞뒤 각각 500bp의 염기서열 총 1,001bp를 추출하여 분석용 프라이머 제작에 활용하였다.Based on the A>C mutation of chromosome 8_position 42,232,884, a total of 1,001 bp of nucleotide sequence of 500 bp each forward and backward were extracted and used to create primers for analysis.
-백색돼지 품종에서 이모색 인자 분석용 추출 염기서열(8번 염색체_position 42,232,884; 서열번호 1)-Extracted base sequence for analysis of hair color factor in white pig breeds (chromosome 8_position 42,232,884; SEQ ID NO. 1)
[실시예 4] 유전자형 분석[Example 4] Genotyping analysis
유전자형 분석을 위하여 다음의 프라이머를 사용하여 유전자 증폭(PCR)을 진행하였다.For genotyping, gene amplification (PCR) was performed using the following primers.
KIT_roan6_F: ATCGGCTGCCCAAAACTACA (20mer; 정방향; 서열번호 2)KIT_roan6_F: ATCGGCTGCCCAAAACTACA (20mer; forward; SEQ ID NO: 2)
KIT_roan6_R: AGGTATGGGATCACGTCATCT(21mer; 역방향; 서열번호 3) KIT_roan6_R: AGGTATGGGATCACGTCATCT (21mer; reverse; SEQ ID NO. 3)
Roan4_mini seq: TTAGGAGGCTGAAGGATGCT (서열번호 4) Roan4_mini seq: TTAGGAGGCTGAAGGATGCT (SEQ ID NO: 4)
PCR 진행 조건은 다음과 같으며, 진행 결과는 도 3에 제시되어 있다.PCR progress conditions are as follows, and the progress results are presented in Figure 3.
PCR 수행 후 제한효소 MspⅠ로 처리하여 절단 양상을 확인하였으며, 이는 도 4에 나타나 있다.After performing PCR, the cleavage pattern was confirmed by treatment with restriction enzyme MspI, which is shown in Figure 4.
유색종을 포함하여 백색돼지 품종인 랜드레이스와 대요크셔 품종의 백색으로 완전 고정된 개체의 경우 제한효소 MspⅠ으로 절단되지 않은 472bp만 확인이 되는 반면, 백색돼지 품종에서 유색인자를 가진 개체의 경우 313bp와 159bp가 확인되었다.In the case of individuals completely fixed as white from the white pig breeds Landrace and Great Yorkshire breeds, including colored species, only 472 bp that was not cut with the restriction enzyme MspⅠ was confirmed, while in the case of individuals with colored characters in the white pig breeds, 313 bp and 159bp was confirmed.
따라서 백색돼지 품종에서 유색인자 보유여부는 제한효소 MspⅠ에 의해 절단되면 유색인자를 보유하고 있다고 판단할 수 있다.Therefore, the presence of colored individuals in white pig breeds can be determined by cutting them with the restriction enzyme MspI.
결론적으로 백색이 완전우성이므로 이형접합체라도 표현형은 완전 백색으로 나타난다. 그러나, 본 발명에 따른 방법을 이용하면, 백색돼지 품종에서 모색이 완전 고정된 것이지 아니면 이형접합체인지를 유전자 수준으로 쉽게 확인이 가능하다. In conclusion, since white is completely dominant, even heterozygotes will have a completely white phenotype. However, using the method according to the present invention, it is possible to easily confirm at the genetic level whether the hair color of a white pig breed is completely fixed or heterozygous.
[실시예 5] 돼지 품종별 제한효소 처리 분석 결과[Example 5] Analysis results of restriction enzyme treatment for each pig breed
돼지 품종에 따른 제한효소 MspⅠ-RFLP 분석 결과는 다음과 같다(표 2).The results of restriction enzyme Msp I-RFLP analysis according to pig breed are as follows (Table 2).
* C 유전자형이 백색돼지에서 유색인자임. * C genotype is colored in white pigs.
AA 유전자형은 백색으로 완전 고정된 유전자형을 의미하며, AC 유전자형은 이형접합체로서 표현형은 백색이다. CC 유전자형은 백색바탕에 작은 흑색 반점이 백색돼지 품종에서 확인 가능하다.The AA genotype refers to a completely fixed white genotype, and the AC genotype is heterozygous and has a white phenotype. The CC genotype can be identified in white pig breeds by showing small black spots on a white background.
조모색의 경우 랜드레이스 품종에서 I RN 과 유색의 i가 결합하면 흑색과 백색의 털이 고르게 확인되는데 전체 144두 중에서 AC 유전자형이 138두, AA 유전자형이 6두로 확인되었다.In the case of hair color, when I RN and colored i are combined in the landrace breed, black and white hairs are evenly confirmed. Among the total 144 dogs, 138 dogs were confirmed to have the AC genotype and 6 dogs were identified as the AA genotype.
<110> REPUBLIC OF KOREA(Rural Development Administration) <120> SNP marker for determining the color of a pig and the use thereof <130> DP20220082 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1001 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 8 chromosome_position 41,004,413 <400> 1 agattctcca atttgactaa ttagtaagtt ggtagtacat cctaatacag atgattatcc 60 tacatcctaa tacagatgat gtgagaggtg gggatacaac cagcagccta aatagccttt 120 atttttgtat cttgtactac tagtaggaag aggaaggatt aaagagtcac catgcatgat 180 ctagccaatc ggctgcccaa aactacagac aaatgtgctt gcttgtatta tctgtgttgt 240 tgctctactt tcagtatcag ttactcatgg tacctccctc agctctagca gcattgagca 300 gaatccaatg aaaactgtgt gatcctctca ctagatgctg aaaaagcctt tgacaaaacc 360 caacacctat ttctgagaaa aacccttcag caagtgggaa gagagggaac ctacctcaac 420 ataataaagg gcacagatga caaacccaca gcgaacatca ttctcaatgg tgaaaagctg 480 aaagaattcc cactctgatc aggaacatga cacgaatgtc tactctcacc actacacttc 540 aacataggtt tggaagtcct agccacagca attggagaag aaaaagacat aaaaggaatc 600 caaattggaa aggaagaaga gaaactagca ctatttgtag atgacgtgat cccataccta 660 gagaatccta aagattctac cagaaaaatg tttgagctca tacatgaatt tggcagagtt 720 gcaggataca aaattaatac acagaaatca actgcatttg tatatactaa caatgaaaca 780 tcagaaagag aaattaggga agcaatccca tttaccatca catccaaaaa ataaaatacc 840 tagcagtaaa cctacctaaa gagacaaaag acctgtactc tgaaaactgt aagacactga 900 tgaaagaagt caaagatgac acaaacagat ggaaagacat accatgctct tggattggaa 960 gagtcaatag tatcaaaatg actatactgc ccaaggcaat c 1001 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KIT_roan6_F <400> 2 atcggctgcc caaaactaca 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KIT_roan6_R <400> 3 aggtatggga tcacgtcatc t 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Roan4_mini seq <400> 4 ttaggaggct gaaggatgct 20 <110> REPUBLIC OF KOREA(Rural Development Administration) <120> SNP marker for determining the color of a pig and the use thereof <130> DP20220082 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1001 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 8 chromosome_position 41,004,413 <400> 1 agattctcca atttgactaa ttagtaagtt ggtagtacat cctaatacag atgattatcc 60 tacatcctaa tacagatgat gtgagaggtg gggatacaac cagcagccta aatagccttt 120 atttttgtat cttgtactac tagtaggaag aggaaggatt aaagagtcac catgcatgat 180 ctagccaatc ggctgcccaa aactacagac aaatgtgctt gcttgtatta tctgtgttgt 240 tgctctactt tcagtatcag ttactcatgg tacctccctc agctctagca gcattgagca 300 gaatccaatg aaaactgtgt gatcctctca ctagatgctg aaaaagcctt tgacaaaacc 360 caacacctat ttctgagaaa aacccttcag caagtgggaa gagagggaac ctacctcaac 420 ataataaagg gcacagatga caaacccaca gcgaacatca ttctcaatgg tgaaaagctg 480 aaagaattcc cactctgatc aggaacatga cacgaatgtc tactctcacc actacacttc 540 aacataggtt tggaagtcct agccacagca attggagaag aaaaagacat aaaaggaatc 600 caaattggaa aggaagaaga gaaactagca ctatttgtag atgacgtgat cccataccta 660 gagaatccta aagattctac cagaaaaatg tttgagctca tacatgaatt tggcagagtt 720 gcaggataca aaattaatac acagaaatca actgcatttg tatatactaa caatgaaaca 780 tcagaaagag aaattaggga agcaatccca tttaccatca catccaaaaaa ataaaatacc 840 tagcagtaaa cctacctaaa gagacaaaag acctgtactc tgaaaactgt aagacactga 900 tgaaagaagt caaagatgac acaaacagat ggaaagacat accatgctct tggattggaa 960 gagtcaatag tatcaaaatg actatactgc ccaaggcaat c 1001 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KIT_roan6_F <400> 2 atcggctgcc caaaactaca 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KIT_roan6_R <400> 3 aggtatggga tcacgtcatc t 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Roan4_mini seq <400> 4 ttaggaggct gaaggatgct 20
Claims (6)
(b) 상기 (a) 단계의 증폭된 각 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계;
를 포함하는, 백색돼지 품종의 유전자의 유색인자를 판별하는 방법.(a) amplifying a polymorphic site of the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 or a complementary polynucleotide or fragment thereof from the DNA of a sample isolated from an individual; and
(b) determining the base of each polymorphic site amplified in step (a);
A method for determining the colored genes of a white pig breed, including a method.
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2022
- 2022-06-17 KR KR1020220074213A patent/KR20230173443A/en unknown
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101677517B1 (en) | 2014-06-27 | 2016-11-21 | 대한민국 | Novel SNP marker for discriminating level of meat quality and Black Coat Color of pig and use thereof |
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