KR20230153844A - Covid-19 중증도 예측 및 경과 모니터링 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 COVID-19 중증도 예측 또는 진단용 바이오 마커 및 이의 용도, COVID-19 예방, 치료 또는 개선용 후보 물질을 스크리닝하는 방법, COVID-19 경과 예측 또는 모니터링용 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 바이오 마커는 COVID-19 중증도 여부를 정확히 판별할 수 있고, 병변에 대한 상태 및 치료 후 환자의 호전 여부를 명확하게 판단할 수 있다.
Description
본 발명은 COVID-19 중증도 예측 또는 진단을 위한 정보 제공 방법, COVID-19 중증도 예측 또는 진단용 바이오 마커 조성물, COVID-19 중증도 예측 또는 진단용 조성물, COVID-19 예방, 치료 또는 개선용 후보 물질 스크리닝 방법, COVID-19 경과 예측 또는 모니터링 방법, COVID-19 경과 예측 또는 모니터링용 바이오 마커 조성물, 및 COVID-19 경과 예측 또는 모니터링용 조성물에 관한 것이다.
현재 코로나바이러스감염증-19(COVID-19)는 증증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2: SARS-CoV-2)에 감염되어 발생한다. SARS-CoV-2 감염은 무증상 감염에서 급성 호흡곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome) 및 다기관 부전(multi-organ failure)을 동반하는 중증 또는 위중한 COVID-19에 이르기까지 다양한 형태로 임상적으로 나타난다.
어린이와 건강한 젊은 성인은 SARS-CoV-2 감염 시 무증상 또는 경증의 증상을 보이는 경향이 있다. 그러나, SARS-CoV-2 감염은 노인과 기저 만성 질환이 있는 사람에게서 심각하거나 치명적일 수 있다. COVID-19의 출현 이후 중증(severe) 또는 치명적인(critical) COVID-19의 병태생리학적 기전을 이해하기 위한 연구가 수행되고 있으며, 중증 또는 치명적인 COVID-19의 진행에 있어서, 과잉 염증 반응(hyper-inflammatory responses)이 관련되어 있는 것으로 밝혀졌다.
COVID-19의 진행을 뒷받침하는 메커니즘에 대하여 연구 중에 있지만, COVID-19가 치유 또는 완화되는데 있어서 어떠한 신호 및 분자가 관여하는지 명확하게 규명된 바 없어, COVID-19에서 항염 메커니즘을 규명한다면, 경증, 중증 또는 치명적인 COVID-19 환자를 대상으로 하는 치료법을 발굴 및 확립할 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명의 목적은 COVID-19 중증도 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 COVID-19 중증도 예측 또는 진단용 바이오 마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 COVID-19 중증도 예측 또는 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 COVID-19 예방, 치료 또는 개선용 후보 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 COVID-19 경과 예측 또는 모니터링 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 COVID-19 경과 예측 또는 모니터링용 바이오 마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 COVID-19 경과 예측 또는 모니터링용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계를 포함하는 COVID-19 중증도 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 COVID-19 중증도 예측 또는 진단용 바이오 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는 COVID-19 중증도 예측 또는 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 HBEGF, VEGFA, CXCL1, CXCL2, CXCL3 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계를 포함하는 COVID-19 예방, 치료 또는 개선용 후보 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 시료에서 HBEGF, VEGFA, CXCL1, CXCL2, CXCL3, PDGFC, CCL4, CCL7, IL1A 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계를 포함하는 COVID-19 경과 예측 또는 모니터링 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 HBEGF, VEGFA, CXCL1, CXCL2, CXCL3, PDGFC, CCL4, CCL7, IL1A 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 COVID-19 경과 예측 또는 모니터링용 바이오 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 HBEGF, VEGFA, CXCL1, CXCL2, CXCL3, PDGFC, CCL4, CCL7, IL1A 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는 COVID-19 경과 예측 또는 모니터링용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 바이오 마커는 감염 및 확진 시기 또는 환자의 개인적인 상태에 관계없이, COVID-19의 중증도 유형을 사전에 정확히 예측 및 판별할 수 있고, 이에 따른 선호되는 조치 및 치료법을 위한 정보를 제공할 수 있다. 또한 COVID-19 환자의 질환 진행 과정에서 악화 또는 호전 여부를 신속하고 정확하게 모니터링할 수 있고, 이를 통해 환자에게 보다 적합한 맞춤형 치료를 위한 정보를 제공할 수 있다.
도 1은 COVID-19 환자 혈액 내 면역 세포에 대한 정밀 단일 세포 전사체 데이터베이스 생산 과정에 대한 것으로, COVID-19 환자 3 코호트, 58명(정상인 12명 포함), 171 샘플, 244,722개 혈액 내 면역세포에 대하여, 혈액세포 분리 및 임시 보관, 정밀 단일 세포 전사체 분석을 위한 구체적인 실험 설계 및 과정, 사용된 장비 및 기술과 그 순서도를 나타낸 것이다.
도 2는 COVID-19 환자 중증도에 따른 MALAT1 및 NEAT1의 발현 및 이를 발현하는 세포의 빈도 변화에 대한 것으로, A. 혈액 내 면역 세포 가운데 MALAT1 및 NEAT1을 특이적으로 발현하고 있는 골수성 세포(Myeloid cell) 아종 (녹색)의 빈도 분포(P, 통계적 유의값; x축, 질환의 중증도; y축, 각 세포의 빈도), B. 중증도에 따른 MALAT1 및 NEAT1의 mRNA 발현양(x축, 해당 유전자의 발현양; y축, 질환의 중증도), C. 타 아종의 골수성 세포와 비교했을 때, A의 세포에서 차등적으로 발현된 유전자의 볼케이노 플롯(x축, Log2 배수 변화; y 축 - Log 10 통계적 유의값; 빨간점, log2 배수 0.25 이상 및 통계적 유의값 0.05 이하; 파란점, log2 배수 0.25 미만 및 통계적 유의값 0.05 이하; 회색점, 통계적 유의값 0.05 초과; MALAT1 과 NEAT1 유전자의 위치 문자로 표시됨)을 나타낸 것이다.
도 3a 내지 3g는 COVID-19의 진행 과정에서 여러 면역 세포 간의 분자적 상호작용 (Crosstalk)에 관한 것으로, 질병이 악화(b, d, f) 또는 호전(c, e, g)되는 시기에 서로 다른 면역 세포 유형 간의 잠재적 및 총체적 상호작용체(Interactome)를 나타낸 것이다(선과 화살표의 너비는 각각 리간드와 수용체의 상대적인 log2 배 변화를 나타냄, 화살표 머리+점선은 수용체의 차등 수준을 나타냄, 점+실선은 리간드의 차등 수준을 나타냄, 화살표 머리+실선은 리간드와 수용체(동시)의 차등 수준을 나타냄, 붉은 색은 상향 조절된 유전자 발현을 나타내며, 청록색은 하향 조절된 유전자 발현을 나타냄).
도 2는 COVID-19 환자 중증도에 따른 MALAT1 및 NEAT1의 발현 및 이를 발현하는 세포의 빈도 변화에 대한 것으로, A. 혈액 내 면역 세포 가운데 MALAT1 및 NEAT1을 특이적으로 발현하고 있는 골수성 세포(Myeloid cell) 아종 (녹색)의 빈도 분포(P, 통계적 유의값; x축, 질환의 중증도; y축, 각 세포의 빈도), B. 중증도에 따른 MALAT1 및 NEAT1의 mRNA 발현양(x축, 해당 유전자의 발현양; y축, 질환의 중증도), C. 타 아종의 골수성 세포와 비교했을 때, A의 세포에서 차등적으로 발현된 유전자의 볼케이노 플롯(x축, Log2 배수 변화; y 축 - Log 10 통계적 유의값; 빨간점, log2 배수 0.25 이상 및 통계적 유의값 0.05 이하; 파란점, log2 배수 0.25 미만 및 통계적 유의값 0.05 이하; 회색점, 통계적 유의값 0.05 초과; MALAT1 과 NEAT1 유전자의 위치 문자로 표시됨)을 나타낸 것이다.
도 3a 내지 3g는 COVID-19의 진행 과정에서 여러 면역 세포 간의 분자적 상호작용 (Crosstalk)에 관한 것으로, 질병이 악화(b, d, f) 또는 호전(c, e, g)되는 시기에 서로 다른 면역 세포 유형 간의 잠재적 및 총체적 상호작용체(Interactome)를 나타낸 것이다(선과 화살표의 너비는 각각 리간드와 수용체의 상대적인 log2 배 변화를 나타냄, 화살표 머리+점선은 수용체의 차등 수준을 나타냄, 점+실선은 리간드의 차등 수준을 나타냄, 화살표 머리+실선은 리간드와 수용체(동시)의 차등 수준을 나타냄, 붉은 색은 상향 조절된 유전자 발현을 나타내며, 청록색은 하향 조절된 유전자 발현을 나타냄).
본 발명은 (a) 시료에서 NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준을 대조군의 NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준과 비교하는 단계를 포함하는 COVID-19 중증도 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 상기 (a) 단계에서 NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준이 대조군의 NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준보다 상향된 경우, 상기 시료가 경증 이상의 COVID-19 개체 유래인 것으로 판단하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법은 상기 (a) 단계에서 NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준이 대조군의 NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준보다 1.3배 이상 및 1.4배 이하로 상향된 경우, 상기 시료가 경증 또는 중등도 COVID-19 개체 유래인 것으로 판단하는 단계를 포함하는 것 일 수 있다.
상기 방법은 상기 (a) 단계에서 NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준이 대조군의 NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준보다 1.4배 초과 및 1.6배 이하로 상향된 경우, 상기 시료가 중증 또는 심각 COVID-19 개체 유래인 것으로 판단하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 중증도은 무증상, 경증(mild), 중등도(moderate), 중증/위중증(severe), 및 치명/심각(critical)을 구별하는 것으로, COVID-19 발병 위험의 증감 정도, 병변의 진행 정도 및 재발 위험의 증감 정도를 포함하는 의미일 수 있다. 상기 발병 위험의 증감 정도는 COVID-19 발병할 위험이 있거나 발병한 가능성이 있는 정도를 포함하는 의미이다. 상기 병변의 진행 정도라 함은 COVID-19가 발병하여 병변이 진행되어 COVID-19가 경미한 정도 내지 심각한 정도를 포함하는 의미이다. 또한, 상기 재발 위험의 증감 정도라 함은 COVID-19 완치 판정 후 재발 위험이 있거나 재발된 가능성이 있는 정도를 포함하는 의미이다. 상기 COVID-19의 중증도는 정성적 및/또는 정량적으로 나타낼 수 있으며, 중증도는 그 정도에 따라 분류될 수 있다.
본 발명에 따른 COVID-19 중증도 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 당업계 공지된 COVID-19 중증도 진단방법에 대체하여 사용될 수도 있고, 당업계 공지된 COVID-19 중증도 진단방법과 병행하여 사용될 수도 있다. 예를 들면, COVID-19의 중증도 분류 체계 및 정의는 대한민국 중앙방역대책본부, 미국 NIH(National Institutes of Health) 등에 공지되어 있다. 본 발명의 COVID-19 중증도 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 하기 중증도 분류 체계를 대체 또는 병행하는 것일 수 있다.
| 중증도 분류 | 미국 National Institutes of Health |
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무증상
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코로나19 검사에 대해 양성 반응은 보이지만 일치하는 증상이 없음 )Individuals who test positive for SARS-CoV-2 using a virologic test (i.e., a nucleic acid amplification test or an antigen test), but who have no symptoms that are consistent with COVID-19) |
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경증
(Mild) |
코로나19의 다양한 징후와 증상을 가지고 있지만 호흡곤란, 기타 흉부촬영 검사상 이상 소견 없음 (Individuals who have any of the various signs and symptoms of COVID-19 (e.g., fever, cough, sore throat, malaise, headache, muscle pain, nausea, vomiting, diarrhea, loss of taste and smell) but who do not have shortness of breath, dyspnea, or abnormal chest imaging) |
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중등도
(Moderate) |
임상적인 평가 또는 영상검사에서 호흡기질환 소견이면서 산호포화도 94% 이상 (Individuals who show evidence of lower respiratory disease during clinical assessment or imaging and who have saturation of oxygen (SpO2) ≥ 94% on room air at sea level) |
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중증
(Severe) |
산소포화도 94% 미만, (PaO2/FiO2) < 300 mmHg, 호흡빈도 분당 30회 초과 또는 폐실질 침투 50% 초과 (Individuals who have SpO2 < 94% on room air at sea level, a ratio of arterial partial pressure of oxygen to fraction of inspired oxygen (PaO2/FiO2) < 300 mmHg, respiratory frequency > 30 breaths per minute, or lung infiltrates > 50%) |
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심각
(Critical) |
호흡부전, 패혈성 쇼크 그리고/또는 다발성 기관 장애 (Individuals who have respiratory failure, septic shock, and/or multiple organ dysfunction) |
상기 진단은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 상기 진단은 발병 여부 뿐만 아니라 예후, COVID-19의 경과, 병기 등을 확인하는 것을 모두 포함하는 의미이다. 본 발명의 목적상, 진단은 COVID-19의 중증도를 정확하게 구별하여 진단하는 것이다.
상기 NEAT1 및/또는 MALAT1 또는 이를 암호화하는 유전자는 COVID-19 중증도 예측 또는 진단을 위한 바이오 마커로 사용된다. 코호트 1은 정상, 경증(mild)/중등도(moderate) 및 중증/심각(critical) COVID-19의 비교 분석을 위해 설계된 것으로, 중증도가 심해질 수록 환자에서 긴 비암호화(long non-coding) RNA인 NEAT1 및 MALAT1, 및 NEAT1 및 MALAT1을 발현하는 세포의 비율이 유의하게 증가한 것으로 나타났다. NEAT1 및 MALAT1는 단백질을 만들지 않으면서 mRNA 상태로 짧은 시간 안에 다른 면역 인자들의 발현 및 활성을 조절할 수 있다.
상기 NEAT1는 Nuclear Paraspeckle Assembly Transcript 1으로, 동물의 유래인 것일 수 있고, 예컨대 사람, 소, 염소, 양, 돼지, 마우스, 토끼 등의 유래인 것일 수 있고, HGNC(30815), NCBI Entrez Gene(283131), Ensembl(ENSG00000245532), OMIM(612769) Open Targets Platform(ENSG00000245532) 등의 유전자 및 이로부터 암호화된 것일 수 있다.
상기 MALAT1는 Metastasis Associated Lung Adenocarcinoma Transcript 1으로, 동물의 유래인 것일 수 있고, 예컨대 사람, 소, 염소, 양, 돼지, 마우스, 토끼 등의 유래인 것일 수 있고, HGNC(29665), NCBI Entrez Gene(378938), Ensembl(ENSG00000251562), OMIM(607924) 등의 유전자 및 이로부터 암호화된 것일 수 있다.
NEAT1 및/또는 MALAT1의 아미노산 서열 및 염기 서열은 공지된 유전자 데이터베이스, NCBI, GeneCards 등에서 그 서열 정보를 확인할 수 있다.
상기 시료는 COVID-19의 중증도를 진단하기 위한 대상체(환자 등)의 NEAT1 및/또는 MALAT1를 포함하는 조직, 세포, 전혈, 혈장, 혈청, 혈액, 타액, 객담, 림프액, 뇌척수액, 세포간액, 점액 또는 소변 등을 포함하는 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 시료는 골수성 세포(myeloid cell)인 것일 수 있고, 단핵구일 수 있다. 상기 시료는 전형적인 단핵구(classical monocyte: CM), 비전형적인 단핵구(non-classical monocyte: NM), 중간 단핵구(intermediatemonocyte: IM) 등인 것일 수 있다.
상기 대조군은 COVID-19 환자가 아닌 자의 시료, 건강인의 시료, 또는 다른 시기에 채취한 시료, 또는 이의 데이터인 것일 수 있다. 상기 다른 시기는 COVID-19 환자의 치료 중, 치료 후 또는 완치 후인 것일 수 있다.
상기 NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준이 대조군의 NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준보다 상향된 것은 NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합을 발현하는 골수성 세포의 비율이 대조군보다 유의하게 상향된 것일 수 있다.
본 발명은 NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 COVID-19 중증도 예측 또는 진단용 바이오 마커 조성물을 제공한다.
상기 바이오 마커라 함은 단백질이나 DNA, RNA, 대사물질 등을 이용해 몸 안의 변화를 알아낼 수 있는 지표를 의미하고, COVID-19 중증도를 구분하여 지시할 수 있다. 상기 바이오 마커는 NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상, 이를 암호화하는 유전자 또는 전사체 등인 것일 수 있다.
본 발명은 NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는 COVID-19 중증도 예측 또는 진단용 조성물을 제공한다.
상기 제제는 NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하여, NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준을 확인함으로써 바이오 마커 검출에 사용될 수 있는 물질을 의미한다.
예를 들면, NEAT1 및/또는 MALAT1 또는 이를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 올리고펩티드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid), 앱타머(aptamer), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항체는 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 바이오 마커에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 바이오 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 본 발명의 바이오 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
상기 프라이머는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명에서는 NEAT1 및/또는 MALAT1의 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
상기 프로브란 유전자와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 핵산의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 NEAT1 및/또는 MALAT1과 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
상기 NEAT1 및/또는 MALAT1 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 것은, COVID-19 중증도를 예측 또는 진단하기 위하여 시료에서 NEAT1 및/또는 MALAT1 또는 이를 암호화하는 유전자의 존재 여부, 발현 정도 또는 활성 정도를 확인하는 과정일 수 있으며, 예를 들면, 상기 NEAT1 및/또는 MALAT1 또는 이를 암호화하는 유전자에 대하여 특이적으로 결합하는 분자를 이용하여 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 양 또는 활성 수준을 확인하는 방법이 적용될 수 있다.
상기 NEAT1 및/또는 MALAT1의 발현 또는 활성 수준을 확인하기 위한 방법으로는, 예컨대 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직 면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, NEAT1 및/또는 MALAT1 단백질을 코딩하는 유전자(DNA, mRNA 등)의 발현 또는 활성 수준을 확인하기 위한 방법으로는, 예컨대, 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 중합효소반응(real time RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 유전자 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 상기 COVID-19 중증도 예측 또는 진단용 조성물을 포함하는 COVID-19 중증도 예측 또는 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트는 NEAT1 및/또는 MALAT1 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제뿐만 아니라, 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등을 포함하는 것일 수 있다. 상기 도구 또는 시약은, 예를 들면, 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 발색단(chromophores), 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 담체는 가용성 담체, 불용성 담체 등을 포함하는 것일 수 있고, 가용성 담체는 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들면 PBS인 것일 수 있고, 불용성 담체는 예를 들면 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 종이, 유리, 금속, 아가로오스 등을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 (a) 시료에서 NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준을 대조군의 NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준과 비교하는 단계를 포함하는 COVID-19 개체에 코르티코스테로이드 요법 적용 여부를 결정하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 상기 (a) 단계에서 NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준이 대조군의 NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준보다 상향된 경우, 상기 COVID-19 개체에 코르티코스테로이드 요법을 적용는 것으로 판단하는 것일 수 있다.
상기 방법은 상기 (a) 단계에서 NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준이 대조군의 NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준보다 1.4배 초과 및 1.6배 이하로 상향된 경우, 상기 COVID-19 개체에 코르티코스테로이드 요법을 적용는 것으로 판단하는 것일 수 있다.
상기 방법은 (a) 단계에서 NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준이 대조군의 NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준보다 1.4배 초과 및 1.6배 이하로 상향된 경우 중증 또는 심각 COVID-19 환자로 판단할 수 있고, 중증 또는 심각 COVID-19 환자에 코르티코스테로이드 요법을 적용한 경우 COVID-19가 개선되어, 본 발명의 정보 제공 방법을 통하여 COVID-19 질환의 중증도에 따른 적절한 치료법의 제공이 가능하다.
상기 시료는 골수성 세포(myeloid cell)인 것일 수 있고, 단핵구일 수 있다. 상기 시료는 전형적인 단핵구(classical monocyte: CM), 비전형적인 단핵구(non-classical monocyte: NM), 중간 단핵구(intermediatemonocyte: IM) 등인 것일 수 있다.
상기 대조군은 COVID-19 환자가 아닌 자의 시료, 건강인의 시료, 또는 다른 시기에 채취한 시료, 또는 이의 데이터인 것일 수 있다. 상기 다른 시기는 COVID-19 환자의 치료 중, 치료 후 또는 완치 후인 것일 수 있다.
상기 NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준이 대조군의 NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준보다 상향된 것은 NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합을 발현하는 골수성 세포의 비율이 대조군보다 유의하게 상향된 것일 수 있다.
상기 코르티코스테로이드는 덱사메타손, 하이드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프리드니손 등인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 (a) 시료에 미지의 물질 처리 후 HBEGF, VEGFA, CXCL1, CXCL2, CXCL3 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 HBEGF, VEGFA, CXCL1, CXCL2, CXCL3 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준을 대조군의 HBEGF, VEGFA, CXCL1, CXCL2, CXCL3 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준과 비교하는 단계를 포함하는 COVID-19 예방, 치료 또는 개선용 후보 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 상기 (a) 단계에서 HBEGF, VEGFA, CXCL1, CXCL2, CXCL3 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준이 상기 미지의 물질을 처리하지 않은 시료의 HBEGF, VEGFA, CXCL1, CXCL2, CXCL3 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준보다 상향된 경우, 해당 물질을 선별하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 HBEGF(Proheparin-binding EGF-like growth factor), VEGFA(vascular endothelial growth factor A), CXCL1(Growth-regulated alpha protein), CXCL2(C-X-C motif chemokine 2) 및 CXCL3(C-X-C motif chemokine 3)는 서로 다른 분비성 단백질로, 성장인자 및/또는 사이토카인인 것일 수 있고, 혈관신생 및/또는 상처치유에 관여하는 것일 수 있다.
상기 HBEGF는 Proheparin-binding EGF-like growth factor으로, 동물의 유래인 것일 수 있고, 예컨대 사람, 소, 염소, 양, 돼지, 마우스, 토끼 등의 유래인 것일 수 있고, HGNC(3059), NCBI Entrez Gene(1839), Ensembl(ENSG00000113070), OMIM(126150), UniProtKB(Q99075) 등의 유전자 및 이로부터 암호화된 것일 수 있다.
상기 VEGFA는 vascular endothelial growth factor A로, 동물의 유래인 것일 수 있고, 예컨대 사람, 소, 염소, 양, 돼지, 마우스, 토끼 등의 유래인 것일 수 있고, HGNC(12680), NCBI Entrez Gene(7422), Ensembl(ENSG00000112715), OMIM( 192240), UniProtKB(P15692) 등의 유전자 및 이로부터 암호화된 것일 수 있다.
상기 CXCL1는 C-X-C Motif Chemokine Ligand 1 또는 Growth-regulated alpha protein으로, 동물의 유래인 것일 수 있고, 예컨대 사람, 소, 염소, 양, 돼지, 마우스, 토끼 등의 유래인 것일 수 있고, HGNC(4602), NCBI Entrez Gene(2919), Ensembl(ENSG00000163739), OMIM(155730), UniProtKB(P09341) 등의 유전자 및 이로부터 암호화된 것일 수 있다.
상기 CXCL2는 C-X-C Motif Chemokine Ligand 2 또는 C-X-C motif chemokine 2로, 동물의 유래인 것일 수 있고, 예컨대 사람, 소, 염소, 양, 돼지, 마우스, 토끼 등의 유래인 것일 수 있고, HGNC(4603), NCBI Entrez Gene(2920), Ensembl( ENSG00000081041), OMIM(139110), UniProtKB(P19875) 등의 유전자 및 이로부터 암호화된 것일 수 있다.
상기 CXCL3는 C-X-C Motif Chemokine Ligand 3 또는 C-X-C motif chemokine 3로, 동물의 유래인 것일 수 있고, 예컨대 사람, 소, 염소, 양, 돼지, 마우스, 토끼 등의 유래인 것일 수 있고, HGNC(4604), NCBI Entrez Gene(2921), Ensembl( ENSG00000163734), OMIM(139111) UniProtKB(P19876) 등의 유전자 및 이로부터 암호화된 것일 수 있다.
이들의 아미노산 서열 및 염기 서열은 공지된 유전자 데이터베이스, NCBI, GeneCards 등에서 그 서열 정보를 확인할 수 있다.
본 발명은 상기 (a) 단계에서 HBEGF, VEGFA, CXCL1, CXCL2, CXCL3 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준이 미지의 물질 처리 전 HBEGF, VEGFA, CXCL1, CXCL2, CXCL3 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준보다 상향된 경우, 해당 물질을 선별하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 또는 상기 (a) 단계에서 HBEGF, VEGFA, CXCL1, CXCL2, CXCL3 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성을 갖는 세포에 미지의 물질 처리 후 HBEGF, VEGFA, CXCL1, CXCL2, CXCL3 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성이 상향된 경우, 해당 물질을 선별하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 미지의 물질은 단백질 또는 유전자의 발현 또는 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 시험 물질을 의미하며, 뉴클레오티드, DNA, RNA, 아미노산, 압타머, 단백질, 화합물, 천연물, 천연 추출물 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 후보 물질은 COVID-19 예방, 치료 또는 개선 용도로 사용가능한 물질을 의미한다.
상기 예방은 COVID-19를 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 상기 개선 또는 치료는 COVID-19의 증세가 일부 또는 전부 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
상기 시료는 골수성 세포인 것일 수 있고, 단핵구일 수 있다. 상기 시료는 전형적인 단핵구(classical monocyte: CM) 및/또는 중간 단핵구(intermediatemonocyte: IM)인 것일 수 있다.
본 발명은 (a) 시료에서 HBEGF, VEGFA, CXCL1, CXCL2, CXCL3, PDGFC, CCL4, CCL7, IL1A 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 HBEGF, VEGFA, CXCL1, CXCL2, CXCL3, PDGFC, CCL4, CCL7, IL1A 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준을 대조군의 HBEGF, VEGFA, CXCL1, CXCL2, CXCL3, PDGFC, CCL4, CCL7, IL1A 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준과 비교하는 단계를 포함하는 COVID-19 경과 예측 또는 모니터링 방법을 제공한다.
상기 방법은 상기 (a) 단계에서 HBEGF, VEGFA, CXCL1, CXCL2, CXCL3 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준이 대조군의 HBEGF, VEGFA, CXCL1, CXCL2, CXCL3 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준보다 상향된 경우, COVID-19 개체가 호전된 것으로 판단하거나, PDGFC, CCL4, CCL7, IL1A 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준이 대조군의 PDGFC, CCL4, CCL7, IL1A 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준보다 상향된 경우, COVID-19 개체가 악화된 것으로 판단하는 것일 수 있다.
상기 방법은 상기 (a) 단계에서 HBEGF 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준이 대조군의 HBEGF 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준보다 1.9배 이상 상향된 경우, VEGFA 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준이 대조군의 VEGFA 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준보다 1.6배 이상 상향된 경우, CXCL1 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준이 대조군의 CXCL1 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준보다 4배 이상 상향된 경우, CXCL2 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준이 대조군의 CXCL2 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준보다 3.7배 이상 상향된 경우, 또는 CXCL3 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준이 대조군의 CXCL3 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준보다 7.2배 이상 상향된 경우, COVID-19 개체가 호전된 것으로 판단하거나,
PDGFC 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준이 대조군의 PDGFC 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준보다 2.9배 이상 상향된 경우, CCL4 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준이 대조군의 CCL4 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준보다 3.2배 이상 상향된 경우, CCL7 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준이 대조군의 CCL7 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준보다 5.7배 이상 상향된 경우, 또는 IL1A 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준이 대조군의 IL1A 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준보다 6.3배 이상 상향된 경우, COVID-19 개체가 악화된 것으로 판단하는 것일 수 있다.
상기 PDGFC(Platelet Derived Growth Factor C), CCL4(C-C motif chemokine 4), CCL7(C-C motif chemokine 7) 및 IL1A(Interleukin-1 alpha)은 서로 다른 분비성 단백질로, 성장인자 및/또는 사이토카인인 것일 수 있다.
상기 PDGFC는 Platelet Derived Growth Factor C로, 동물의 유래인 것일 수 있고, 예컨대 사람, 소, 염소, 양, 돼지, 마우스, 토끼 등의 유래인 것일 수 있고, HGNC(8801), NCBI Entrez Gene(56034), Ensembl(ENSG00000145431), OMIM(608452), UniProtKB(Q9NRA1) 등의 유전자 및 이로부터 암호화된 것일 수 있다.
상기 CCL4는 C-C Motif Chemokine Ligand 4로, 동물의 유래인 것일 수 있고, 예컨대 사람, 소, 염소, 양, 돼지, 마우스, 토끼 등의 유래인 것일 수 있고, HGNC(10630), NCBI Entrez Gene(6351), Ensembl(ENSG00000275302), OMIM(182284), UniProtKB(P13236) 등의 유전자 및 이로부터 암호화된 것일 수 있다.
상기 CCL7는 C-C Motif Chemokine Ligand 7로, 동물의 유래인 것일 수 있고, 예컨대 사람, 소, 염소, 양, 돼지, 마우스, 토끼 등의 유래인 것일 수 있고, HGNC(10634), NCBI Entrez Gene(6354), Ensembl(ENSG00000108688), OMIM(158106) UniProtKB(P80098) 등의 유전자 및 이로부터 암호화된 것일 수 있다.
상기 IL1A은 Interleukin-1 alpha로, 동물의 유래인 것일 수 있고, 예컨대 사람, 소, 염소, 양, 돼지, 마우스, 토끼 등의 유래인 것일 수 있고, HGNC(5991), NCBI Entrez Gene(3552), Ensembl(ENSG00000115008), OMIM(147760), UniProtKB(P01583) 등의 유전자 및 이로부터 암호화된 것일 수 있다.
이들의 아미노산 서열 및 염기 서열은 공지된 유전자 데이터베이스, NCBI, GeneCards 등에서 그 서열 정보를 확인할 수 있다.
상기 방법은 HBEGF, VEGFA, CXCL1, CXCL2, CXCL3 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성이 시간의 흐름에 따라 또는 상대적으로 상향된 경우, 상기 피검체는 COVID-19가 호전, 개선 또는 완화된 것, 또는 중증도가 경미해진 것일 수 있다. 상기 PDGFC, CCL4, CCL7, IL1A 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성이 시간의 흐름에 따라 또는 상대적으로 상향된 경우, 상기 피검체는 COVID-19가 악화된 것, 또는 중증도가 높아진 것일 수 있다.
상기 시료는 골수성 세포인 것일 수 있고, 단핵구일 수 있다. 상기 시료는 전형적인 단핵구(classical monocyte: CM) 및/또는 중간 단핵구(intermediatemonocyte: IM) 인 것일 수 있다.
상기 대조군은 COVID-19 환자로부터 채취한 시료 또는 다른 시기에 채취한 시료, 또는 이의 데이터인 것일 수 있다. 상기 다른 시기는 COVID-19 환자의 치료 전인 것일 수 있다. 상기 다른 시기는 시료 채취 3일 전, 4일 전, 5일 전, 6일 전 또는 1주일 전인 것일 수 있다.
본 발명은 HBEGF, VEGFA, CXCL1, CXCL2, CXCL3, PDGFC, CCL4, CCL7, IL1A 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 COVID-19 경과 예측 또는 모니터링용 바이오 마커 조성물을 제공한다.
상기 바이오 마커라 함은 시료에서 COVID-19 치료에 따른 호전, 개선 또는 악화를 지시할 수 있는 물질 또는 지표를 말한다. 상기 바이오 마커는 HBEGF, VEGFA, CXCL1, CXCL2, CXCL3, PDGFC, CCL4, CCL7, IL1A 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상, 이를 암호화하는 유전자 또는 전사체 등인 것일 수 있다.
본 발명은 HBEGF, VEGFA, CXCL1, CXCL2, CXCL3, PDGFC, CCL4, CCL7, IL1A 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는 COVID-19 경과 예측 또는 모니터링용 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 조성물을 포함하는 COVID-19 경과 예측 또는 모니터링용 키트를 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이며 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐이므로 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험예>
1. COVID-19 환자 모집 및 샘플 수득
본 연구는 충남대학교병원, 서울아산병원 및 삼성서울병원에서 COVID-19 진단을 받은 환자와 건강인 자원봉사자를 대상으로 하였다. SARS-CoV-2 RNA는 환자의 비인두 도말로 타액, 객담 등을 채취하고 Allplex™ 2019-nCoV 어세이 키트(Seegene, Seoul, 대한민국)를 사용하여 다중 실시간 역전사효소 PCR(multiplex real-time reverse-transcriptase PCR)을 통해 수득하였다. 각 병원의 전자 의무 기록에서 환자의 임상 양상, 검사 결과 및 흉부 방사선 사진을 수집하였다. 환자의 중증도는 National Institutes of Health 기준에 따라 구별하였고, 그 결과는 다음과 같다. 연구 프로토콜은 모든 참여 기관의 연구 윤리 심의 위원회(institutional review boards)에서 검토하고 승인하였으며, 모든 참여자로부터 서면 동의를 득하였다.
전혈에서 표준 Ficoll-Paque(GE Healthcare, Uppsala, Sweden) 밀도 구배 원심분리로 말초 혈액 단핵 세포(Peripheral blood mononuclear cells: PBMC)를 분리하고, 동결 배지에서 동결하고, 액체 질소 탱크에 보관하였다.
2. 단일 세포 RNA-seq(Single cell RNA-seq) 라이브러리 제작
동결된 PBMC를 37℃의 수조에서 1분간 해동하고 50㎖ 튜브로 옮기고 10% FCS 및 0.1mg/㎖ DNase I을 함유한 RPMI 1640 배지를 첨가한 다음, 5분간 300g에서 원심분리하였다. 이후, 세포 펠릿을 수집하고 Luna-II 자동 세포 계수기(Logos Biosystems)에서 트립판 블루를 사용하여 세포수와 생존력을 확인하였다. 각각의 PBMC 샘플을 다중화 항체(Single-Cell multiplex kit - Human; BD Biosciences)로 표지한 후, 6개의 샘플을 10,000개의 동일한 수의 세포를 풀링하여 총 약 60,000개 세포로 구성하고 마이크로웰 카트리지(BD Rhapsody Express 시스템, BD Biosciences)에 로딩하였다. 단일 세포 전체 전사체 분석 라이브러리를 BD Rhapsody WTA 시약 키트(BD, 633802)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 제작하고, Illumina HiSeq X에서 8bp 단일 인덱스(single index)가 있는 2 x 75bp 페어드 엔드 리드(paired end reads)를 사용하여 시퀀싱하였다.
3. 단일 세포 RNA-seq 데이터 처리
FASTQ 형식의 시퀀싱 로 데이터(raw data)는 인간 참조 게놈(human reference genome GRCh38)에 정렬(alignment)하고, 샘플 역다중화(demultiplexing)를 위하여 개별 샘플 다중화 태그 IDs를 사용하는 SevenBridges Genomics 온라인 플랫폼(SevenBridges)의 BD Rhapsody WTA 분석 파이프라인(버전 1.0)으로 처리하였다. 총 171개 샘플에서 유전자 x 세포 발현 매트릭스를 RSEC_Adjusted_Molecules 값을 사용하여 추출하였다. 달리 지정되지 않은 경우, Seurat(버전 3.1.5)를 사용하여 데이터 정규화 및 추가 분석을 수행하였다. 추출된 유전자-세포 매트릭스의 초기 품질 관리를 위해, 세포 당 유전자 수에 대하여 파라미터가 nFeature_RNA > 500 및 nFeature_RNA < 3000 및 미토콘드리아 유전자의 백분율.mito < 25인 세포 및, 파라미터 min.cell=3인 유전자인 경우를 필터링하였다. 필터링된 매트릭스는 스케일 팩터(scale factor)=10,000인 로그 정규화(LogNormalize) 방법으로 정규화하였다. 변수 유전자는 파라미터 selection.method = vst, mean.function = ExpMean, dispersion.function = LogVMR, x.low.cutoff = 0.0125, x.high.cutoff = 3 및 y.cutoff = 0.5로 도출하였다. 모든 샘플 데이터 세트를 통합하기 위하여 상호(Reciprocal) PCA를 사용하였다.
데이터 세트 간에 반복적이고 가변적인 특징은 Select Integration Features 함수를 사용하여 선택하고, 각 데이터 세트의 PCA에 사용한 다음, Find Integration Anchors 및 Integrate Data 함수를 데이터 통합에 사용하였다. 통계적으로 유의미한 주성분은 JackStraw 방법으로 결정하였으며, UMAP 비선형 차원 축소(non-linear dimensional reduction) 및 비지도 계층적 클러스터링 분석(unsupervised hierarchical clustering analysis) (해상도 0.2)의 다운스트림 분석을 위해 처음 11개의 주성분을 선택하였다.
각 클러스터의 세포 식별은 Find All Markers 기능을 사용하여 25% 이상의 세포가 특정 유전자를 발현하는(min.pct=0.25) 클러스터 특이적인 마커 유전자를 발굴하고, 클러스터 특이적인 마커 유전자를 종래 세포 유형별 특이적인 유전자 마커와 비교하고, 각 단일 세포의 전사체를 참조 데이터세트와 비교하여 세포 식별(identity)을 결정하는 R 패키지 SingleR을 사용하여 추가로 확인하였다.
4. 세포-세포 상호작용체 분석(Cell-cell interactome analysis)
R 패키지 iTALK(doi: https://doi.org/10.1101/507871)를 리간드-수용체 상호작용체 분석에 사용하였다. 질병이 악화 또는 개선되는 동안 차등적으로 발현된 유전자(Differentially expressed genes)는 각 세포 유형에서 비모수 Wilcoxon 순위 합 테스트(non-parameteric Wilcoxon rank sum test)를 사용하여 확인하였으며, 리간드-수용체 쌍은 FindLR 기능을 사용하여 검출하였다. 결과는 데이터 유형 = DEG인 LRPlot 함수로 표시(plot)하였다.
<실시예>
1. COVID-19 코호트의 PBMC에 대한 scRNA-seq 분석
독립적인 COVID-19 코호트의 PBMC를 이용하여 scRNA-seq 분석을 수행하였다(도 1).
코호트 1은 28명의 환자로부터 47개의 PBMC 샘플을 수득한 것이며, COVID-19 환자를 비교 분석하였다. 코호트 2는 15명의 환자로부터 57개 PBMC 샘플을 수득한 것이며, 질병이 악화 및 개선되는 과정을 포함, COVID-19 진행 과정 동안의 종적 분석을 수행하였다. 대조군으로는 12명의 건강인으로부터 12개 PBMC 샘플을 수득하여 사용하였다.
PBMC는 BD 랩소디 워크플로(BD rhapsody workflow)로 단일 세포 라이브러리를 제작하기 직전에 동결 및 해동하였다. BD 인간 샘플 멀티플렉싱(multiplexing)키트를 사용하여 각 실험에서 6개의 샘플을 풀링(pool)하였다. 라이브러리의 품질 검사 후, 전사체(transcriptome) 및 샘플 태그(tag)에 대해 세포당 200 리드(reads) 및 세포당 20,000 리드의 뎁스로 일루미나 플랫폼에서 시퀀싱하였다. 시퀀싱 로데이터(raw data)는 BD Rhapsody WTA 파이프라인에서 처리한 다음, 심층 바이오인포매틱 분석을 수행하였다.
11개의 주요 세포 유형, 즉 NK 세포, CD8 T 세포, CD4 T 세포, B 세포, 형질 세포(plasma cell), 전형적인 단핵구(classical monocyte: CM), 비전형적인 단핵구(non-classical monocyte: NM), 수지상 세포(dendritic cells: DC), 형질세포형 DC(plasmacytoid DC: pDC), 유사분열 세포(mitotic cell) 및 혈소판(platelet)을 확인하였다. 각 코호트에서 세포 유형을 식별하고 상대적 비율을 확인하였다.
다음으로, T/NK 및 골수성 두 집단으로 하위 클러스터링 분석을 수행하였다. T/NK 세포 집단은 NK 세포, 효과(effector) CD8 T 세포, GZMK+ CD8 T 세포, 효과 CD4 T 세포, 나이브(naive) CD4 T 세포 및 조절(regulatory) T 세포로 클러스터링하였다. 골수성 세포 집단은 CM, 중간 단핵구(intermediatemonocyte) IM, NM 및 DCs으로 식별하였다. 또한, 혈액 내 면역 세포 가운데 NEAT1 및 MALAT1를 특이적으로 발현하는 골수성 세포의 아종을 확인하고 이를 lncM으로 명명하였다.
2. 코호트 1: COVID-19 환자의 중증도에 따라 특이적인 바이오 마커 확인
코호트 1은 12명의 심각한 COVID-19 환자 및 31개의 PBMC 샘플, 및 16명의 경증/중등도의 COVID-19 환자 및 16개의 PBMC 샘플을 대상으로 하였다.
건강인 대조군, 무증상, 경증, 중등도, 중증 및 심각한 COVID-19의 환자 그룹을 비교하여 각 세포 유형에 대해 차등적으로 발현된 유전자(differentially expressed genes: DEGs)를 분석하였다.
비암호화 RNA인 NEAT1 및 MALAT1을 높은 수준으로 발현하는 lncM를 골수성 집단에서 클러스터링하였다. lncM의 비율은 건강인 대조군이나 중증이 아닌 환자에 비하여 중증 이상 환자의 경우에 유의하게 증가하였다(p=0.003). 즉, 중증도가 심해 질수록, MALAT1 및 NEAT1 두 종류의 발현양, mRNA 수준이 증가할 뿐만 아니라, 이를 발현하는 세포 빈도 또한 증가하였다. MALAT1 및 NEAT1 두 종류의 긴 비암호화 RNA(long non-coding RNA: IncRNA)가 환자의 중증도와 높은 상관관계가 있는 것을 알 수 있다.
3. 코호트 2: COVID-19 환자의 진행 경과 동안 종적 분석
코호트 2의 종적 데이터를 분석하여 COVID-19 경과 동안 PBMC의 분자적 변화를 확인하였다. 이 코호트에서 4쌍은 질병이 악화되는 기간 동안 분석하였고, 14쌍은 질병이 개선되는 기간 동안 분석하였다.
COVID-19 질병이 악화 및 개선되는 메커니즘을 이해하기 위하여, 여러 세포 유형 간의 포괄적인 세포 간 상호작용체(cell-to-cell interactomes)를 분석하였다. 질병이 악화되는 동안, CM 및 IM은 신호 상호작용에 있어서 가장 유의미하고 가변적인 변화를 나타내었다(도 3b). CM 및 IM은 여러 세포 유형과 상호작용하였다. 반면, 질병이 개선되는 동안, 세포 유형에 관계없이 세포 간 상호작용이 하향 조절되었다(도 3c). 특히, NM에서 다중 상호작용이 관찰되었다.
사이토카인과 성장 인자를 심도 깊게 분석하였다. 질병이 악화되는 동안 CCL4, CCL7 등을 포함하는 케모카인과 그 수용체는 여러 세포 유형에서 상향 조절되었으며, IL1A가 상향 조절되었다(도 3d 및 3f). 이러한 데이터는 IL-1 경로의 활성화와 함께 염증 세포 이동이 COVID-19의 악화에 관여한다는 것을 나타낸 것이다. 또한, 성장인자 중 혈관 염증과 관련된 PDGFC와 그 수용체 사이의 상호 작용이 우세하게 나타났다(도 3d).
질병이 개선되는 동안, 혈관 신생과 그 수용체에 관여하는 것으로 알려진 CXCL1/CXCL2/CXCL3-CXCR2를 포함하는 케모카인은 질병이 개선되는 동안 여러 세포 유형에서 상향 조절되었다(도 3e 및 3g). 또한, 질병이 개선되는 동안 혈관 신생 및 상처 치유에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 VEGFA 및 HBEGF가 상향 조절되는 것을 확인하였다.
즉, 질병이 악화되는 동안 염증성 케모카인 및 IL-1을 특징으로 하는 염증 반응이 증강되었으며, 반면, 질병이 개선되는 동안 혈관신생/상처 치유 성장 인자 및 케모카인을 특징으로 하는 조직 재생 반응이 나타났다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통 상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.
Claims (7)
- 하기 단계를 포함하는 COVID-19 중증도 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법:
(a) 시료에서 NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준을 대조군의 NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준과 비교하는 단계. - NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 COVID-19 중증도 예측 또는 진단용 바이오 마커 조성물.
- NEAT1, MALAT1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는 COVID-19 중증도 예측 또는 진단용 조성물.
- 하기 단계를 포함하는 COVID-19 예방, 치료 또는 개선용 후보 물질을 스크리닝하는 방법:
(a) 시료에 미지의 물질 처리 후 HBEGF, VEGFA, CXCL1, CXCL2, CXCL3 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 HBEGF, VEGFA, CXCL1, CXCL2, CXCL3 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준을 대조군의 HBEGF, VEGFA, CXCL1, CXCL2, CXCL3 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준과 비교하는 단계. - 하기 단계를 포함하는 COVID-19 경과 예측 또는 모니터링 방법:
(a) 시료에서 HBEGF, VEGFA, CXCL1, CXCL2, CXCL3, PDGFC, CCL4, CCL7, IL1A 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 HBEGF, VEGFA, CXCL1, CXCL2, CXCL3, PDGFC, CCL4, CCL7, IL1A 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준을 대조군의 HBEGF, VEGFA, CXCL1, CXCL2, CXCL3, PDGFC, CCL4, CCL7, IL1A 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준과 비교하는 단계. - HBEGF, VEGFA, CXCL1, CXCL2, CXCL3, PDGFC, CCL4, CCL7, IL1A 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 COVID-19 경과 예측 또는 모니터링용 바이오 마커 조성물.
- HBEGF, VEGFA, CXCL1, CXCL2, CXCL3, PDGFC, CCL4, CCL7, IL1A 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는 COVID-19 경과 예측 또는 모니터링용 조성물.
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| KR1020220053786A KR20230153844A (ko) | 2022-04-29 | 2022-04-29 | Covid-19 중증도 예측 및 경과 모니터링 방법 |
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2022
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