KR20230152073A

KR20230152073A - 비자가 다중 스트레스성 암 세포 및 암의 백신접종 및 치료를 위한 이의 용도

Info

Publication number: KR20230152073A
Application number: KR1020237032311A
Authority: KR
Inventors: 베노아 핀터; 폴 브라베티
Original assignee: 브레누스 파마
Priority date: 2021-02-26
Filing date: 2022-02-25
Publication date: 2023-11-02
Also published as: IL305401A; WO2022180251A1; EP4297874A1; US20240123045A1; CA3208783A1; CN117320732A; JP2024508003A; BR112023017053A2; AU2022226419A1

Abstract

본 발명은 세포 요법을 위한 첨단 치료 의약품 (AMTP) 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포, 및 시험관내에서 가해진 스트레스에 반응하여 상기 세포에 의해 생산되는 면역원성 스트레스 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물을 통해 암 세포 계내에서 관찰되는 다중 세포 저항성 기전에 동시에 대응할 수 있고, 따라서, 상기 조성물은 인간 환자에서의 암 백신접종 및 치료에 적합하다.

Description

비자가 다중 스트레스성 암 세포 및 암의 백신접종 및 치료를 위한 이의 용도

본 발명의 기술분야

본 발명은 세포 요법을 위한 첨단 치료 의약품 (AMTP) 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 스트레스성(stressed) HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포, 및 시험관내에서 가해진 스트레스에 반응하여 상기 세포에 의해 생산되는 면역원성 스트레스 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물을 통해 암 세포에서 관찰되는 다중 세포 저항성 기전(multiple cell resistance mechanism)에 동시에 대응할 수 있고, 따라서, 상기 조성물은 인간 환자에서의 암 백신접종 및 치료에 적합하다.

본 발명의 배경

면역계는 두 방어 기전, 즉, 신속하지만 비특이적인 선천 면역; 및 더 느리지만, 특이적이고, 기억을 하는 획득 면역을 기반으로 한다. 상기 두 보완적인 기전은 세포 매개 면역 반응 중에 직접적으로, 또는 체액성 면역 반응 동안 활성 분자 (예컨대, 면역글로불린, 사이토카인 등)의 분비를 통해 세포를 동원하여 외부 및 내부 "침략"에 맞서 싸울 수 있는 능력을 제공한다.

면역은 원발성 비바이러스성 암 발생으로부터 숙주를 방어할 뿐만 아니라, 종양 면역원성을 조작한다. 암 면역편집은 제거 (즉, 암 면역감시(cancer immunosurveillance)), 평형 및 회피의 3단계로 구성된 프로세스(process)이다. 첫 번째 단계에서, 면역계는 (비특이적 세포, 예컨대, 대식세포, NK 세포, DC 세포 등의 동원, 항증식성 및/또는 아폽토시스성(apoptotic) 분자의 분비, 사이토카인의 생산, 및 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포의 동원 및 활성화와 함께) 종양과 연관된 조직 및 환경 변화에의 관여를 수반하여 종양 증식에 맞서 싸운다. 두 번째 단계에서는 감수성 암 세포가 제거되고, 저항성이 가장 큰 세포의 면역 선택이 작동한다. 작동되는 저항성 기전은 아폽토시스(apoptosis)에 대한 저항성, 억제성 사이토카인 (예컨대, TGF-β, IL-10, PGE2 또는 IDO) 분비, (클래스 I 주조직 적합성 복합체 (MHC) 발현의 부분적 또는 완전한 손실과 함께) 항원 제시 변경, 중화 분자 분비, 및 세포 매개 면역계에 반격하는 MICA 또는 MICB 전사체의 발현이다. 이 단계 동안, 파괴된 암 세포 개수는 저항성 세포의 개수와 균형을 이루며, 본 단계의 이름은 여기서 유래된 것이다. 이는 특히 암 환자 치료 동안 관찰된 관해 단계에 상응한다. 세 번째 단계에서는 면역계의 다양한 방어 기전에 대해 저항성을 띠는 암 세포는 증식한다. 이어서, 상기 암 세포는 종양 종괴를 형성하는데, 이는 생리적 회피 현상의 임상적 징후이다. 관련된 회피 현상은 또한 암의 진행 및 전이 단계에서도 관찰된다.

항암 치료는는 수술이 포함되는데, 이 수술의 목적은 주로 종양 종괴를 제거하거나, 감소시키는 것이지만, 발암 과정에 대한 실질적인 억제 효과는 없는 바, 수술은 일반적으로는 암 세포를 완전히 제거하기 위해 다양한 치료 요법이 보충된다.

방사선 요법은 암 세포와 같이 빠르게 증식하는 세포의 DNA를 변경시키기 위한 것이다. 방사선요법의 부작용은 2가지로: 첫 번째는 암 세포 뿐만 아니라, 건강한 세포에도 방사선이 조사되어 건강한 세포의 "암화(cancerization)"를 유발할 수 있다는 것이고; 두 번째는 암 세포는 예컨대, HSP, GRP 등과 같은 샤페론 단백질(chaperone protein)을 발현하여 방사선 유도 아폽토시스에 대한 저항성을 갖게 되고, 그 결과로 회피 현상을 일으킨다는 것이다.

화학요법은 암 세포 자체에 작용하거나, 또는 특정 대사 경로를 억제함으로써 암 세포를 제거하기 위한 것이다. 화학요법제로는 DNA와 직접 상호작용하는 작용제, 예컨대, 친전자성 작용제, 인터칼레이팅제 또는 분할제, DNA와 간접적으로 상호작용하는 작용제, 예컨대, DNA 합성 억제제 (항대사물질, 토포이소머라제 억제제, 방추 형성 억제제 등), 혈관신생 억제제, 프로테아좀 억제제 등을 포함한다. 여기서도 암 세포에 의해 저항성 기전이 발생되며, 다중화학요법 전략법에도 불구하고, 대량 종양 증식과 함께 재발 현상이 관찰될 수 있다.

면역요법은 수용체를 차단하거나, 세포 용해를 유도하거나, 세포독성을 자극하거나, 아폽토시스 억제를 해제하는 항체 또는 사이토카인의 주입을 기반으로 하는 수동 면역요법; 및 EU 규정 1394/2007에 의해 유럽에서 정의된 새로운 부류의 의약인 "첨단 치료 의약품" (ATMP)을 사용하여 환자를 암에 대해 면역화시키는 것인, "백신접종에 의한 면역화"로도 불리는 능동 면역요법을 포함한다.

유전자 요법을 위한 다양한 ATMP (GTMP로 명명)가 매우 다양한 암에 대한 임상 시험에서 사용되어 왔고; 몇 가지 예를 들자면, 두부경부 암종에서 p53을 발현시키는 데 또는 방광 암종에서 CD40L을 발현시키는 데 아데노바이러스 벡터가 사용되었고; 흑색종 환자에서 GM-CSF를 코딩하는 종양용해성 헤르페스 바이러스가 사용되었고; 다양한 종양 연관 항원에 대해 재지정된 키메라 항원 수용체 (CAR)로 조작된 T 세포가 최근 사용되고 있다.

임상적으로 관련된 면역 반응을 유도하기 위한 시도로 종양 항원이 로딩된 자가 수지상 세포 (DC)를 비롯한 세포 요법을 위한 AMTP (CTMP로 명명) 또한 사용되고 있다. 예를 들어, 비록 유럽위원회(European Commission)가 2015년에 유럽 연합에서 시푸류셀-T(Sipuleucel-T)에 대한 판매 허가를 철회하기는 하였지만, FDA 및 EMA는 각각 2010년 및 2013년에 전립선암 DC 기반 치료용 백신 (시푸류셀-T, 상표명 "프로벤지(Provenge)," 덴드레온 파마슈티칼즈, LLC(Dendreon Pharmaceuticals, LLC)에 의해 개발)을 승인하였다.

그러나, AMTP를 이용하는 경우에도 면역계를 포함하는 3 단계 암 면역편집에서 기술된 자연 회피 현상과 유사한 회피 현상이 관찰된다.

따라서, 고유한 유효성을 제공하고/거나, 다중치료 전략에 기여할 수 있는 암의 치료를 위한 치료 전략법이 여전히 요구되고 있다.

암 저항성 현상, 및 특히, 아폽토시스에 대한 저항성에 있어서 샤페론 단백질의 역할을 더욱 잘 이해하기 위해 많은 연구가 수행되어 왔다. 특히, 열 충격 단백질 (HSP), 글루코스 조절 단백질 (GRP) 및 다중 약물 내성 단백질 (MRP)은 저항성 인자이고, 방어 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 이들 단백질은 저항 기전으로 예컨대, 저산소증, 낮은 탄수화물 농도 등과 같은 대사적 공격, 예컨대, 열 스트레스, 방사선 등과 같은 물리적 공격, 또는 예컨대, 약물 치료와 같은 화학적 공격의 결과로 암 세포에 의해 생산된다.

결과적으로 이러한 샤페론 단백질의 억제를 기반으로 한 치료 전략법을 개발하기 위한 연구가 진행되어 왔지만, 이는 전반적인 혼합 결과에 대해 높은 독성 수준을 비롯한 부작용이 없는 것은 아니다. 샤페론 단백질, 특히 HSP70을 마우스에서 암 세포에 대한 면역화 인자로 사용하는 연구 또한 수행되었다. 그러나, 이러한 접근법은 특정 샤페론 단백질에 초점을 맞추고, 암 세포에 의해 발생된 전체 방어 기전 세트를 고려하지 않고 있다.

이러한 문제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 다르게는 환자에게 적용된 치료 프로토콜 과정에서 생체내에서 특정 스트레스 (또는 스트레스)를 받는 암 세포에 의해 계내에서 발생된 것과 동일한 특정 저항성 기전[들]을 갖는 자가 암 세포의 시험관내 생산에 적용되는 암 세포 저항성 기전에 대응할 수 있는 제약 또는 백신 조성물을 수득하기 위한 시험관내 프로세스를 기술하였다 (미국 특허 11,096,995; 유럽 특허 3 057 981). 상기 조성물을 생체내에서 마우스에 투여한 후, 데이터는 종양 부피 및 중량에 유리한 영향을 보였고, 개념 증명을 입증하였다.

여기서 본 발명자들은 더 나아가 엄선한 비자가 다중 스트레스성 세포를 포함하고, 다중 저항성 기전에 동시에 대응하고, 인간 환자에서 다양한 암에 대해 백신접종하고, 치료하는 데 적합한 신규한 조성물을 제공한다.

요약

본 발명은 이하, 및 특히, 첨부된 청구범위에서 개시되는 바와 같다.

특히, 본 발명은 (i) 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포, 및 (ii) 시험관내에서 가해진 스트레스에 반응하여 상기 세포에 의해 생산되는 면역원성 스트레스 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포는 시험관내에서 가해진, 방사선, 열 스트레스, 화학적 스트레스, 대사 스트레스 및 이의 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 또는 수개의 스트레스[들]에 반응하여 저항성 기전을 발생시켜 스트레스 단백질을 생산한다.

한 실시양태에서, 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포는 비증식성(non-proliferative)이다.

한 실시양태에서, 면역원성 스트레스 단백질은 합텐화된다. 한 실시양태에서, 면역원성 스트레스 단백질은 2,4-디니트로페닐 (DNP); 2,4-디니트로플루오로벤젠; 술파닐산; N-아이오도아세틸-N'-(5-술포닐-나프틸)에틸렌 디아민; 아닐린; p-아미노 벤조산; 비오틴; 플루오레세인 및 이의 유도체 (FITC, TAMRA, 및 텍사스 레드(Texas Red) 포함); 디곡시게닌; 5-니트로-3-피라졸카르바미드; 4,5-디메톡시-2-니트로신나미드; 2-(3,4-디메톡시페닐)-퀴놀린-4-카르바미드; 2,1,3-벤족사디아졸-5-카르바미드; 3-히드록시-2-퀴녹살린카르바미드, 4-(디메틸아미노)아조벤젠-4'-술폰아미드 (DABSYL); 로테논 이소옥사졸린I(E)-2-(2-(2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[b][1,4]디아제핀-4-일)페녹시)아세트아미드; 7-(디에틸아미노)-2-옥소-2H-크로멘-3-카르복실산; 2-아세트아미도-4-메틸-5-티아졸술폰아미드; 및 p-메톡시페닐피라조포도필아미드를 포함하는 군으로부터 선택되는 합텐으로 합텐화된다. 한 실시양태에서, 면역원성 스트레스 단백질은 2,4-디니트로페닐 (DNP)로 합텐화된다.

한 실시양태에서, 조성물은 약제학적 조성물 또는 백신 조성물이고, 추가로 적어도 하나의 제약상 허용되는 부형제(excipient)를 포함한다.

한 실시양태에서, 조성물은 약 10⁵ 내지 약 10⁸개의 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포를 포함한다.

본 발명은 추가로 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 암 치료에서 사용하기 위한 상기 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 (i) 스트레스성 HT-29 세포, 스트레스성 HCT-116 세포 및 스트레스성 LoVo 세포 중 하나, 및 (ii) 스트레스 단백질을 포함하는 중간 조성물(intermediate compostion)로서, 여기서 스트레스성 HT-29 세포, 스트레스성 HCT-116 세포 또는 스트레스성 LoVo 세포 중 하나는 시험관내에서 가해진 (i) 대사 스트레스, (ii) 방사선 및 (iii) 열 스트레스에 반응하여 저항성 기전을 발생시켜 스트레스 단백질을 생산하는 것인 중간 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 (i) 스트레스성 HT-29 세포, 스트레스성 HCT-116 세포 및 스트레스성 LoVo 세포 중 하나, 및 (ii) 스트레스 단백질을 포함하는 중간 조성물로서, 여기서 스트레스성 HT-29 세포, 스트레스성 HCT-116 세포 또는 스트레스성 LoVo 세포 중 하나는 시험관내에서 가해진 (i) 대사 스트레스, 및 (ii) 화학적 스트레스에 반응하여 저항성 기전을 발생시켜 스트레스 단백질을 생산하는 것인 중간 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 하기 단계:

a) 적합한 배양 배지 중에서 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포를 배양하는 단계;

b) 단계 a)에서 배양된 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포에 대해 시험관내에서 하나 또는 수개의 스트레스[들]를 가하는 단계로서, 여기서 상기 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포는 하나 또는 수개의 스트레스[들]에 반응하여 저항성 기전을 발생시킴으로써 스트레스 단백질을 생산하는 것인 단계,

c) 스트레스성 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포를, 단계 b)에서 상기 세포가 생산한 스트레스 단백질과 함께 회수하는 단계, 및

d) 단계 c)에서 회수된 스트레스성 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포 및 상기 세포가 생산한 스트레스 단백질을 모두 함께, 스트레스 단백질을 면역원성으로 만들 수 있는 분자로, 또는 그러한 프로세스에 의해 처리하는 단계를 포함하는, 상기 중간 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 단계 c)는 단계 b)의 완료 후 적어도 몇 시간, 바람직하게, 단계 b)의 완료 후 적어도 12시간 이상 후에 수행된다.

한 실시양태에서, 단계 d)는 면역원성을 부여할 수 있는 수단에 스트레스 단백질을 연결시키거나, 또는 상기 수단과 스트레스 단백질의 복합체를 형성(complexing)하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 면역원성을 부여할 수 있는 수단은 합텐이다. 한 실시양태에서, 면역원성을 부여할 수 있는 수단은 2,4-디니트로페닐 (DNP); 2,4-디니트로플루오로벤젠; 술파닐산; N-아이오도아세틸-N'-(5-술포닐-나프틸)에틸렌 디아민; 아닐린; p-아미노 벤조산; 비오틴; 플루오레세인 및 이의 유도체 (FITC, TAMRA, 및 텍사스 레드 포함); 디곡시게닌; 5-니트로-3-피라졸카르바미드; 4,5-디메톡시-2-니트로신나미드; 2-(3,4-디메톡시페닐)-퀴놀린-4-카르바미드; 2,1,3-벤족사디아졸-5-카르바미드; 3-히드록시-2-퀴녹살린카르바미드, 4-(디메틸아미노)아조벤젠-4'-술폰아미드 (DABSYL); 로테논 이소옥사졸린; (E)-2-(2-(2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[b][1,4]디아제핀-4-일)페녹시)아세트아미드; 7-(디에틸아미노)-2-옥소-2H-크로멘-3-카르복실산; 2-아세트아미도-4-메틸-5-티아졸술폰아미드; 및 p-메톡시페닐피라조포도필아미드를 포함하는 군으로부터 선택되는 합텐이다. 한 실시양태에서, 면역원성을 부여할 수 있는 수단은 2,4-디니트로페닐 (DNP)이다.

방법이 (i) 스트레스성 HT-29 세포, 스트레스성 HCT-116 세포 및 스트레스성 LoVo 세포 중 하나, 및 (ii) 스트레스 단백질을 포함하는 중간 조성물 "DS-A"로서, 여기서 스트레스성 HT-29 세포, 스트레스성 HCT-116 세포 또는 스트레스성 LoVo 세포 중 하나는 시험관내에서 가해진 (i) 대사 스트레스, (ii) 방사선 및 (iii) 열 스트레스에 반응하여 저항성 기전을 발생시킴으로써 스트레스 단백질을 생산하는 것인 상기 중간 조성물을 제조하기 위한 것인 한 실시양태에서, 상기 방법의 단계 b)는 단계 a)에서 배양된 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포에 대해 시험관내에서 하기 스트레스:

(i) 저산소 상태하에, 및/또는 낮은 pH에서, 고갈된 배지에서의 시험관내 배양; 바람직하게, 2% FBS 배양 배지 중 저혈청 배양 조건에서의 시험관내 배양,

(ii) 바람직하게, 약 1 내지 약 20분 범위의 기간 동안 약 0.25 내지 약 25 Gy, 바람직하게, 약 1 내지 약 15 Gy 범위의 총 선량(total dose)의 시험관내 방사선; 바람직하게, 약 1 내지 약 5분의 기간 동안 동안험관내 방사선, 및

(iii) 약 38℃ 내지 약 45℃ 범위의 온도에서 약 15분 내지 약 4시간 범위의 기간 동안 세포에 가해지는 시험관내 열 충격(in vitro thermic choc); 바람직하게, 약 42℃의 온도에서 약 60분의 기간 동안의 시험관내 열 충격을 동시에 또는 연속적으로 가하는 것을 포함한다.

방법이 (i) 스트레스성 HT-29 세포, 스트레스성 HCT-116 세포 및 스트레스성 LoVo 세포 중 하나, 및 (ii) 스트레스 단백질을 포함하는 중간 조성물 "DS-B"로서, 여기서 스트레스성 HT-29 세포, 스트레스성 HCT-116 세포 또는 스트레스성 LoVo 세포 중 하나는 시험관내에서 가해진 (i) 대사 스트레스, 및 (ii) 화학적 스트레스에 반응하여 저항성 기전을 발생시킴으로써 스트레스 단백질을 생산하는 것인 상기 중간 조성물을 제조하기 위한 것인 한 실시양태에서, 상기 방법의 단계 b)는 단계 a)에서 배양된 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포에 대해 시험관내에서 하기 스트레스:

(ii) 약 6시간 내지 약 120시간 범위의 기간 동안 적어도 하나 또는 수개의 화학요법제 및/또는 알콜에의 시험관내 노출을 동시에 또는 연속적으로 가하는 것을 포함한다.

가장 마지막의 실시양태에 따라, 적어도 하나 또는 수개의 화학요법제 및/또는 알콜에의 시험관내 노출은 하기와 같을 수 있다:

- 세포가 HT-29 세포일 때, (ii)에서의 시험관내 노출은 약 72시간의 기간 동안 약 13 μM 옥살리플라틴에의 노출이거나; 또는

- 세포가 HCT-116 세포일 때, (ii)에서의 시험관내 노출은 약 48시간의 기간 동안 약 315 nM SN-38 (7-에틸-10-히드록시-캄프토테신)에의 노출이거나; 또는

- 세포가 LoVo 세포일 때, (ii)에서의 시험관내 노출은 약 48시간의 기간 동안 약 5 μM 플루오로우라실 (5-FU)에의 노출이다.

본 발명은 추가로

a. 6개의 중간 조성물을 수득하는 단계로서, 여기서 6개의 중간 조성물은

1) 스트레스성 HT-29 세포 및 스트레스 단백질을 포함하는 중간 조성물 "DS-A,"

2) 스트레스성 HCT-116 세포 및 스트레스 단백질을 포함하는 중간 조성물 "DS-A,"

3) 스트레스성 LoVo 세포 및 스트레스 단백질을 포함하는 중간 조성물 "DS-A,"

4) 스트레스성 HT-29 세포 및 스트레스 단백질을 포함하는 중간 조성물 "DS-B,"

5) 스트레스성 HCT-116 세포 및 스트레스 단백질을 포함하는 중간 조성물 "DS-B,"

6) 스트레스성 LoVo 세포 및 스트레스 단백질을 포함하는 중간 조성물 "DS-B"인 것인 단계,

b. 상기 6개의 중간 조성물을 함께 혼합하는 단계를 포함하는, 본 발명의 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 6개의 중간 조성물은 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포가 동일한 비로 함께 혼합된다.

정의

본 발명에서, 하기 용어는 하기 의미를 갖는다:

본원에서 사용된 "HT-29 세포"는 1964년 44세 여성으로부터 단리된 인간 결장 선암종 세포주를 지칭한다. 이는 특히 하기와 같은 서열 변이를 포함한다:

- APC p.Glu853Ter (c.2557G>T)에 대해 이형접합성,

- APC p.Thr1556Asnfs*3 (c.4666dupA)에 대해 이형접합성,

- BRAF p.Val600Glu (c.1799T>A)에 대해 이형접합성,

- PIK3CA p.Pro449Thr (c.1345C>A)에 대해 이형접합성,

- SMAD4 p.Gln311Ter (c.931C>T)에 대해 동형접합성, 및

- TP53 p.Arg273His (c.818G>A)에 대해 동형접합성.

상기 세포주는 셀로사우루스(Cellosaurus) 데이터베이스에서 수탁 번호 "CVCL_0320" 및 ATCC 저장 수집소에서 "HTB-38™" 하에 언급되며, 상기 ATCC 저장 수집소로부터 상업적으로 이용가능하다. 상기 세포주에 대한 다른 다른 수탁 번호는 뱅코 셀루라스 도 리우데자네이루(Banco Celulas do Rio de Janeiro: BCRJ)에서 "0111"; 라이프니츠 인스티튜트 DSMZ(Leibniz Institute DSMZ)-저먼 콜렉션 오브 마이크로오가니즘즈 앤드 셀 컬쳐즈 게엠베하(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH)에서 "ACC 299"; 제너럴 콜렉션 오브 더 유러피안 콜렉션 오브 오텐티케이티드 셀 컬쳐스(General Collection of the European Collection of Authenticated Cell Cultures) (ECACC)에서 "91072201"; 한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank: KCLB)에서 "30038"; 및 차이나 센터 포 타입 컬쳐 콜렉션(China Center for Type Culture Collection: CCTCC)에서 "GDC0149"를 포함한다. 상기 콜렉션의 내용, 특히, 상기 세포주의 유전자형, HLA 타입핑, STR 프로필 및 표현형에 대한 설명은 본원에서 참조로 포함된다.

본원에서 사용된 "HCT-116 세포"는 1981년 48세 남성의 원발성 종양(primary tumor)으로부터 단리된 인간 결장 암종 세포주를 지칭한다. 이는 특히 하기와 같은 서열 변이를 포함한다:

- ACVR2A p.Lys437Argfs*5 (c.1310delA)에 대해 동형접합성,

- BRCA2 p.Ile2675Aspfs*6 (c.8021dupA)에 대해 이형접합성,

- CDKN2A p.Arg24Serfs*20 (c.68dupG)에 대해 이형접합성,

- CDKN2A p.Asp74fs*21 (c.220delG)에 대해 이형접합성,

- CDKN2A p.Glu33Argfs*20 (c.97delG)에 대해 이형접합성,

- CTNNB1 p.Ser45del (c.133_135delTCT)에 대해 이형접합성,

- EP300 p.Met1470Cysfs*22 (c.4408delA)에 대해 이형접합성,

- EP300 p.Asn1700Thrfs*9 (c.5099delA)에 대해 이형접합성,

- KRAS p.Gly13Asp (c.38G>A)에 대해 이형접합성,

- PIK3CA p.His1047Arg (c.3140A>G)에 대해 이형접합성, 및

- TGFBR2 p.Lys128Serfs*35 (c.383delA)에 대해 동형접합성.

상기 세포주는 셀로사우루스 데이터베이스에서 수탁 번호 "CVCL_0291" 및 ATCC 저장 수집소에서 "CCL-247™" 하에 언급되며, 상기 ATCC 저장 수집소로부터 상업적으로 이용가능하다. 상기 세포주에 대한 다른 다른 수탁 번호는 뱅코 셀루라스 도 리우데자네이루 (BCRJ)에서 "0288"; 라이프니츠 인스티튜트 DSMZ-저먼 콜렉션 오브 마이크로오가니즘즈 앤드 셀 컬쳐즈 게엠베하에서 "ACC 581"; 제너럴 콜렉션 오브 더 유러피안 콜렉션 오브 오텐티케이티드 셀 컬쳐스 (ECACC)에서 "91091005"; 및 한국 세포주 은행 (KCLB)에서 "10247"을 포함한다. 상기 콜렉션의 내용, 특히, 상기 세포주의 유전자형, HLA 타입핑, STR 프로필 및 표현형에 대한 설명은 본원에서 참조로 포함된다.

본원에서 사용된 "LoVo 세포"는 1971년 56세 남성의 좌측 쇄골상 부위의 전이성 종양 결절 단편으로부터 단리된 인간 결장직장 선암종 세포주(colorectal adenocarcinoma cell line)를 지칭한다. 이는 특히 하기와 같은 서열 변이를 포함한다:

- ACVR2A p.Lys437Argfs*5 (c.1310delA)에 대해 이형접합성,

- APC p.Arg1114Ter (c.3340C>T)에 대해 이형접합성,

- APC p.Met1431fs*42 (c.4289delC)에 대해 이형접합성,

- APC p.Arg2816Gln (c.8447G>A)에 대해 이형접합성,

- B2M p.Leu15Phefs*41 (c.43_44delCT)에 대해 이형접합성,

- FBXW7 p.Arg505Cys (c.1513C>T)에 대해 이형접합성,

- KRAS p.Gly13Asp (c.38G>A)에 대해 이형접합성,

- SMAD2 p.Ala292Val (c.875C>T)에 대해 이형접합성, 및

- TGFBR2 p.Lys128Serfs*35 (c.383delA)에 대해 동형접합성.

상기 세포주는 셀로사우루스 데이터베이스에서 수탁 번호 "CVCL_0399" 및 ATCC 저장 수집소에서 "CCL-229™" 하에 언급되며, 상기 ATCC 저장 수집소로부터 상업적으로 이용가능하다. 상기 세포주에 대한 다른 다른 수탁 번호는 뱅코 셀루라스 도 리우데자네이루 (BCRJ)에서 "0332"; 라이프니츠 인스티튜트 DSMZ-저먼 콜렉션 오브 마이크로오가니즘즈 앤드 셀 컬쳐즈 게엠베하에서 "ACC 350"; 제너럴 콜렉션 오브 더 유러피안 콜렉션 오브 오텐티케이티드 셀 컬쳐스 (ECACC)에서 "87060101"; 및 한국 세포주 은행 (KCLB)에서 "10229"을 포함한다. 상기 콜렉션의 내용, 특히, 상기 세포주의 유전자형, HLA 타입핑, STR 프로필 및 표현형에 대한 설명은 본원에서 참조로 포함된다.

본원에 사용된 바와 같은 "화학요법제"는 종양 성장을 억제시키는 데 효과적인 임의의 분자를 지칭한다다. 화학요법제의 예로는 해부 치료 화학(Anatomical Therapeutic Chemical: ATC) 분류 체계의 서브그룹 L01 하에 기술된 것들을 포함한다. 화학요법제의 추가 예는 하기를 포함하나, 이에 제한되지 않는다:

i. 알킬화제, 예컨대, 예로서:

· 클로르메틴, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 트로포스파미드, 클로람부실, 멜팔란, 프레드니무스틴, 벤다무스틴, 우라무스틴, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라누스틴, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 노벰비친, 페네스테린, 우라실 머스타드 등을 포함한 질소 머스타드;

· 카르무스틴, 로무스틴, 세무스틴, 포테무스틴, 니무스틴, 라니무스틴, 스트렙토조신, 클로로조토신 등을 포함한 니트로소우레아;

· 부술판, 만노술판, 트레오술판 등을 포함한 알킬 술포네이트;

· 카르보쿠온, 티오테파, 트리아지쿠온, 트리에틸렌멜라민, 벤조도파, 메투레도파, 우레도파 등을 포함한 아지리딘; 프로카르바진 등을 포함한 히드라진;

· 다카르바진, 테모졸로미드 등을 포함한 트리아젠; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스파오르아르니드, 트리메틸올로멜라민 등을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 및

· 미토브로니톨, 피포브로만, 악티노마이신, 블레오마이신, 미토마이신(미토마이신 C 등 포함), 플리카마이신 등을 포함한 기타;

ii. 아세토게닌, 예컨대, 예로서, 불라타신, 불라타시논 등;

iii. 벤조디아제핀, 예컨대, 예로서, 2-옥소쿠아제팜, 3-히드록시페나제팜, 브로마제팜, 카마제팜, 카르부라제팜, 클로르디아제폭시드, 시나제팜, 시놀라제팜, 클로나제팜, 클로니프라제팜, 클로라제페이트, 사이프라제팜, 델로라제팜, 데모목세팜, 데스메틸플루니트라제팜, 데바제피드, 디아제제팜, 디클라제팜, 디플루디아제팜, 독세파제팜, 엘파제팜, 에틸 카플루제페이트, 에틸 디라제페이트, 에틸 로플라제페이트, 플루브로마제팜, 플레타제팜, 플루디아제팜, 플루니트라제팜, 플루라제팜, 플루테마제팜, 플루토프라제팜, 포사제팜, 기다제팜, 할라제팜, 아이클라제팜, 이라제핀, 케나제핀, 케타졸람, 로라제팜, 로르메타제팜, 루푸라돔, 메클로나제팜, 메다제팜, 메니트라제팜, 메타클라제팜, 모트라제팜, N-데스알킬플루라제팜, 니폭시팜, 니메타제팜, 니테마제팜, 니트라제팜, 니트라제페이트, 노르다제팜, 노르테트라제팜, 옥사제팜, 페나제팜, 피나제팜, 피복사제팜, 프라제팜, 프로플라제팜, 쿠아제팜, QH-II-66, 레클라제팜, RO4491533, Ro5-4864, SH-I-048A, 술라제팜, 테마제팜, 테트라제팜, 티플루아돔, 톨루파제팜, 트리플루노르다제팜, 투클라제팜, 울다제팜, 아르펜다잠, 클로바잠, CP 1414S, 로펜다잠, 트리플루바잠, 기리소팜, GYKI-52466, GYKI-52895, 네리소팜, 탈람파넬, 토피소팜, 아디나졸람, 알프라졸람, 브로마졸람, 클로나졸람, 에스타졸람, 플루알프라졸람, 플루브로마졸람, 플루니트라졸람, 니트라졸람, 피라졸람, 트리아졸람, 브레타제닐, 클리마졸람, EVT-201, FG-8205, 플루마제닐, GL-II-73, 이미다제닐, ¹²³I-이오마제닐, L-655,708, 로프라졸람, 미다졸람, PWZ-029, 레미마졸람, Ro15-4513, Ro48-6791, Ro48-8684, Ro4938581, 사르마제닐, SH-053-R-CH3_-2'F, 클록사졸람, 플루타졸람, 할록사졸람, 멕사졸람, 옥사졸람, 벤타제팜, 클로티아제팜, 브로티졸람, 시클로티졸람, 데스클로로에티졸람, 에티졸람, 플루클로티졸람, 이스라파판트, JQ1, 메티졸람, 올란자핀, 텔렌제핀, 로피라제팜, 자피졸람, 라조바잠, 리파제팜, 졸라제팜, 조메바잠, 조메타핀, 프레마제팜, 클라졸람, 안트라마이신, 아비자폰, 릴마자폰 등;

iv. 항대사물질, 예컨대, 예로서:

· 아미노프테린, 메토트렉세이트, 페메트렉시드, 프랄라트렉세이트, 프테로프테린, 랄티트렉시드, 데노프테린, 트리메트렉세이트, 페메트렉시드 등을 포함한 항엽산제;

· 펜토스타틴, 클라드리빈, 클로파라빈, 플루다라빈, 넬라라빈, 티오구아닌, 메르캅토퓨린 등을 포함한 퓨린 유사체;

· 플루오로우라실(5-FU), 카페시타빈, 독시플루리딘, 테가푸르, 테가푸르/기메라실/오테라실, 카르모푸르, 플록수리딘, 시타라빈, 젬시타빈, 아자시티딘, 데시타빈 등을 포함하는 피리미딘 유사체; 및

· 히드록시카르바미드;

v. 예컨대, 예로서, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤 등과 같은 안드로겐;

vi. 예컨대, 예로서, 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스테인 등과 같은 항부신제;

vii. 예컨대, 예로서, 프롤린산 등과 같은 엽산 보충제;

viii. 예컨대, 예로서, 메이탄신, 안사미토신 등과 같은 메이탄시노이드;

ix. 예컨대, 예로서, 백금, 카르보플라틴, 시스플라틴, 디시클로플라틴, 네다플라틴, 옥살리플라틴, 사트라플라틴 등과 같은 백금 유사체;

x. 항호르몬제, 예컨대, 예로서:

· 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 토레미펜 등을 포함한 항에스트로겐제;

· 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드, 고세렐린 등을 포함한 항안드로겐제;

xi. 예컨대, 예로서, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘A, 안구이딘 등과 같은 트리코테센;

xii. 예컨대, 예로서, 카바지탁셀, 도세탁셀, 라로탁셀, 오르타탁셀, 파클리탁셀, 테세탁셀 등과 같은 톡소이드;

xiii. 기타, 예컨대, 예로서, 캄프토테신 (이의 유도체: 벨로테칸, 코시테칸, 에티리노테칸, 페골, 엑사테칸, 기마테칸, 이리노테칸, 루르토테칸, 루비테칸, 실라테칸, SN-38(7-에틸-10-히드록시-캄프토테신) 및 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토피신(크립토피신 1 및 크립토피신 8 포함); 돌라스타틴; 듀오카마이신(이의 합성 유사체: KW-2189 및 CBI-TMI 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕틴; 스폰지스타틴; 아클라시노마이신; 아우트라마이신; 아자세린; 블레오마이신; 칵티노마이신; 카라비신; 칸니노마이신; 카르지노필린; 크로모마이신; 닥티노마이신; 다우노루비신; 데토루비신; 6-디아조-5-옥소-L-노르류신; 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 데옥시독소루비신 등 포함); 에피루비신; 에소루비신; 이다르비신; 마르셀로마이신; 마이코페놀산; 노갈라니신; 올리보마이신; 페플로마이신; 포트피로마이신; 퓨로마이신; 쿠엘라마이신; 로도루비신; 스트렙토그린; 스트렙토조신; 투베르시딘; 유베니멕스; 지노스타틴; 조루비신; 아세글라톤; 알도포스파르니드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지콘; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트크린; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; PSK^®; 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게나늄; 테누아존산; 2,2',2''-트리클로로트리에틸아르닌; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브롬톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드; 6-티오구아닌; 빈블라스틴; 에토포시드; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나블빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 토포이소머라제 I 억제제 SN38; 디플루오로메틸오르니틴; 레티노산 등.

단백질, 특히, 스트레스 단백질의 맥락에서 본원에서 사용되는 바와 같이 "검출가능한 수준"은 상기 단백질이 당업자가 단백질을 검출하는 데 고전적으로 사용되는 수단 및 방법에 의해 검출될 수 있는 양 또는 농도로 해당 조성물에 존재한다는 것을 의미한다. 상기 수단 및 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고, 하기 실시예 3-5에 상세히 설명된 바와 같이, 제한 없이, 질량 분석법, 예컨대, 탠덤 질량 분석법에 커플링된 액체 크로마토그래피 (LC-MS/MS)를 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "합텐"은 예컨대, 단백질과 같은 큰 캐리어에 부착된 경우에만 면역 반응을 유도하는 소분자를 지칭한다. 일단 환자가 합텐-캐리어 접합체에 대한 항체를 생성하고 나면, 합텐이 항체에 결합할 수 있지만, 일반적으로 면역 반응을 개시하지는 못할 것이며; 일반적으로 합텐-캐리어 접합체만이 이를 수행할 수 있다. 합텐의 예로는 2,4-디니트로페닐 (DNP); 2,4-디니트로플루오로벤젠; 술파닐산; N-아이오도아세틸-N'-(5-술포닐-나프틸)에틸렌 디아민; 아닐린; p-아미노 벤조산; 비오틴; 플루오레세인 및 이의 유도체 (FITC, TAMRA, 및 텍사스 레드 포함); 디곡시게닌; 5-니트로-3-피라졸카르바미드; 4,5-디메톡시-2-니트로신나미드; 2-(3,4-디메톡시페닐)-퀴놀린-4-카르바미드; 2,1,3-벤족사디아졸-5-카르바미드; 3-히드록시-2-퀴녹살린카르바미드, 4-(디메틸아미노)아조벤젠-4'-술폰아미드 (DABSYL); 로테논 이소옥사졸린; (E)-2-(2-(2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[b][1,4]디아제핀-4-일)페녹시)아세트아미드; 7-(디에틸아미노)-2-옥소-2H-크로멘-3-카르복실산; 2-아세트아미도-4-메틸-5-티아졸술폰아미드; 및 p-메톡시페닐피라조포도필아미드를포함하나, 이에 제한되지 않는다.

"과다발현" 및 이의 편차는 본원에서 참조 세포 또는 참조 세포 집단과 비교하여 대상체 세포 또는 대상체 세포 집단에서 적어도 10% 더 높은, 바람직하게, 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 그 초과로 더 높은 마커 또는 단백질의 상대적 또는 절대적 발현 및/또는 존재비를 지칭한다. 대안적으로 또는 추가로, 과다발현은 또한 참조 세포 또는 참조 세포 집단과 비교하여 대상체 세포 또는 대상체 세포 집단에서 적어도 10% 더 높은, 바람직하게, 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 그 초과로 더 높은 평균 형광 강도 (MFI)를 지칭한다. 특히, 참조 세포 (또는 참조 세포 집단은 상기 세포를 포함하거나, 또는 바람직하게, 이로 구성되는 집단이다)는 대상체 세포와 동일한 세포주로부터의 세포이되, 본원에 기술된 조성물 또는 중간 조성물 제조 방법을 거치지 않은 세포; 특히, 대상체 세포와 동일한 세포주로부터의 세포로서, 고전적 조건하에서, 예컨대, 예로서, 10% FBS에서 배양되고, 이하 기술되는 바와 같이 시험관내에서 가해지는 대사 스트레스, 방사선, 열 스트레스 및/또는 화학적 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 세포 (또는 상기 세포를 포함하거나, 또는 바람직하게, 이로 구성되는 집단); 또는 대안적으로, 고갈된 배지 (예컨대, 암 세포의 성장 및/또는 생존에 유용하거나 또는 심지어는 필수적인 하나 또는 수개의 물질이 부분적으로 또는 완전히 결여된 배지) 중, 저산소 상태하에, 또는 낮은 pH (예컨대, pH 6.5 미만)에서 배양되되 (즉, 대사 스트레스를 받되), 이하 기술되는 바와 같이 시험관내에서 가해지는 방사선, 열 스트레스 및/또는 화학적 스트레스 중 어느 다른 스트레스도 받지 않은 세포이다.

"과소발현" 및 이의 편차는 본원에서 참조 세포 또는 참조 세포 집단과 비교하여 대상체 세포 또는 대상체 세포 집단에서 적어도 10% 더 낮은, 바람직하게, 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 그 초과로 더 낮은 마커 또는 단백질의 상대적 또는 절대적 발현 및/또는 존재비를 지칭한다. 대안적으로 또는 추가로, 과다발현은 또한 참조 세포 또는 참조 세포 집단과 비교하여 대상체 세포 또는 대상체 세포 집단에서 적어도 10% 더 낮은, 바람직하게, 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 그 초과로 더 낮은 평균 형광 강도 (MFI)를 지칭한다. 특히, 참조 세포 (또는 참조 세포 집단은 상기 세포를 포함하거나, 또는 바람직하게, 이로 구성되는 집단이다)는 대상체 세포와 동일한 세포주로부터의 세포이되, 본원에 기술된 조성물 또는 중간 조성물 제조 방법을 거치지 않은 세포; 특히, 대상체 세포와 동일한 세포주로부터의 세포로서, 고전적 조건하에서, 예컨대, 예로서, 10% FBS에서 배양되고, 이하 기술되는 바와 같이 시험관내에서 가해지는 대사 스트레스, 방사선, 열 스트레스 및/또는 화학적 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 세포 (또는 상기 세포를 포함하거나, 또는 바람직하게, 이로 구성되는 집단); 또는 대안적으로, 고갈된 배지 (예컨대, 암 세포의 성장 및/또는 생존에 유용하거나 또는 심지어는 필수적인 하나 또는 수개의 물질이 부분적으로 또는 완전히 결여된 배지) 중, 저산소 상태하에, 또는 낮은 pH (예컨대, pH 6.5 미만)에서 배양되되 (즉, 대사 스트레스를 받되), 이하 기술되는 바와 같이 시험관내에서 가해지는 방사선, 열 스트레스 및/또는 화학적 스트레스 중 어느 다른 스트레스도 받지 않은 세포이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "백신 조성물"은 제약상 허용되는 부형제 중 적어도 하나의 항원 또는 면역원 (예컨대, 예로서, 면역원성 스트레스 및/또는 저항성 단백질) 및 임의적으로, 애주번트(adjuvant)를 포함하고, 투여시 환자에서 면역 반응을 유도하는 데 유용한 조성물을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "애주번트"는 투여시 대상체에서 항원 (예컨대, 예로서, 면역원성 스트레스 및/또는 저항성 단백질)에 대한 면역 반응을 강화, 증가 및/또는 강화시키는 물질을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "제약상 허용되는 부형제"는 활성 성분이 아니고 (즉, 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포도, 면역원성 스트레스 및/또는 저항성 단백질도 아니고), 환자에게 투여되었을 때, 유해성, 알레르기성 또는 기타 불리한 반응을 일으키지 않는, 약제학적 조성물 또는 백신 조성물의 고체, 반고체 또는 액체 성분을 지칭한다. 상기 제약상 허용되는 부형제들은 대부분은 예컨대, 문헌 [Allen (Ed.), 2017. Ansel's pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems (11^th ed.). Philadelphia, PA: Wolters Kluwer]; [Remington, Allen & Adeboye (Eds.), 2013. Remington: The science and practice of pharmacy (22^nd ed.). London: Pharmaceutical Press]; 및 [Sheskey, Cook & Cable (Eds.), 2017. Handbook of pharmaceutical excipients (8^th ed.). London: Pharmaceutical Press]에 상세하게 기술되어 있다.

상세한 설명

약물 생성물 (DP/ STC -1010)

본 발명은 (i) 스트레스성 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포 중 적어도 하나, 및 (ii) 스트레스 및/또는 저항성 단백질이 시험관내에서 가해진 스트레스에 반응하여 상기 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포 중 적어도 하나에 의해 생산된 것인 면역원성 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성되는 조성물에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 조성물은 (i) 스트레스성 HT-29 세포, 및 (ii) 스트레스 및/또는 저항성 단백질이 시험관내에서 가해진 스트레스에 반응하여 상기 HT-29 세포에 의해 생산된 것인 면역원성 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

한 실시양태에서, 조성물은 (i) 스트레스성 HCT-116 세포, 및 (ii) 스트레스 및/또는 저항성 단백질이 시험관내에서 가해진 스트레스에 반응하여 상기 HCT-116 세포에 의해 생산된 것인 면역원성 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

한 실시양태에서, 조성물은 (i) 스트레스성 LoVo 세포, 및 (ii) 스트레스 및/또는 저항성 단백질이 시험관내에서 가해진 스트레스에 반응하여 상기 LoVo 세포에 의해 생산된 것인 면역원성 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

한 실시양태에서, 조성물은 (i) 스트레스성 HT-29 및 HCT-116 세포, 및 (ii) 스트레스 및/또는 저항성 단백질이 시험관내에서 가해진 스트레스에 반응하여 상기 HT-29 및 HCT-116 세포에 의해 생산된 것인 면역원성 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

한 실시양태에서, 조성물은 (i) 스트레스성 HT-29 및 LoVo 세포, 및 (ii) 스트레스 및/또는 저항성 단백질이 시험관내에서 가해진 스트레스에 반응하여 상기 HT-29 및 LoVo 세포에 의해 생산된 것인 면역원성 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

한 실시양태에서, 조성물은 (i) 스트레스성 HCT-116 및 LoVo 세포, 및 (ii) 스트레스 및/또는 저항성 단백질이 시험관내에서 가해진 스트레스에 반응하여 상기 HCT-116 및 LoVo 세포에 의해 생산된 것인 면역원성 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

한 실시양태에서, 조성물은 (i) 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포, 및 (ii) 스트레스 및/또는 저항성 단백질이 시험관내에서 가해진 스트레스에 반응하여 상기 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포에 의해 생산된 것인 면역원성 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

하기에서, HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포를 포함하는 조성물에 대한 언급은 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포 중 1, 2, 또는 3개를 포함하는 조성물을 포함하는 것으로 의도된다.

본 발명에 따라, 조성물은 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포를 포함한다. "스트레스성"이란, 세포가 시험관내에서 가해진 스트레스[들]에 반응하여 저항성 기전[들]을 발생시켰다는 것을 의미한다. 결과적으로, 상기 세포는 조성물의 일부를 형성하는 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 생산하였다.

한 실시양태에서, 스트레스는 방사선, 열 스트레스, 화학적 스트레스, 대사 스트레스 및 이의 임의의 조합을 포함하거나 또는 이로 구성된 군으로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 스트레스는 동시든 또는 연속적이든, 방사선, 열 스트레스, 화학적 스트레스, 및 대사 스트레스 중 2, 3개 또는 그 초과의 조합을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은

- 스트레스성 HT-29 세포, 및 시험관내에서 가해진 (i) 대사 스트레스, (ii) 방사선 및 (iii) 열 스트레스에 반응하여 상기 HT-29 세포에 의해 생산된 스트레스 및/또는 저항성 단백질;

- 스트레스성 HCT-116 세포, 및 시험관내에서 가해진 (i) 대사 스트레스, (ii) 방사선 및 (iii) 열 스트레스에 반응하여 상기 HCT-116 세포에 의해 생산된 스트레스 및/또는 저항성 단백질; 및

- 스트레스성 LoVo 세포, 및 시험관내에서 가해진 (i) 대사 스트레스, (ii) 방사선 및 (iii) 열 스트레스에 반응하여 상기 LoVo 세포에 의해 생산된 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은

- 스트레스성 HT-29 세포, 및 시험관내에서 가해진 (i) 대사 스트레스, 및 (ii) 화학적 스트레스에 반응하여 상기 HT-29 세포에 의해 생산된 스트레스 및/또는 저항성 단백질;

- 스트레스성 HCT-116 세포, 및 시험관내에서 가해진 (i) 대사 스트레스, 및 (ii) 화학적 스트레스에 반응하여 상기 HCT-116 세포에 의해 생산된 스트레스 및/또는 저항성 단백질; 및

- 스트레스성 LoVo 세포, 및 시험관내에서 가해진 (i) 대사 스트레스, 및 (ii) 화학적 스트레스에 반응하여 상기 LoVo 세포에 의해 생산된 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은

- 스트레스성 HCT-116 세포, 및 시험관내에서 가해진 (i) 대사 스트레스, (ii) 방사선 및 (iii) 열 스트레스에 반응하여 상기 HCT-116 세포에 의해 생산된 스트레스 및/또는 저항성 단백질;

- 스트레스성 LoVo 세포, 및 시험관내에서 가해진 (i) 대사 스트레스, (ii) 방사선 및 (iii) 열 스트레스에 반응하여 상기 LoVo 세포에 의해 생산된 스트레스 및/또는 저항성 단백질;

한 실시양태에서, 스트레스는 방사선이다. 방사선은 바람직하게, 세포를 사멸시키거나, 또는 불활성화시키지 않을 정도로 충분히 낮지만, 스트레스 및/또는 저항성 단백질 생산을 유도할 정도로 충분히 높은 선량의 것이다. 한 실시양태에서, 방사선은 약 0.25 내지 약 25 Gy, 바람직하게, 약 1 내지 약 15 Gy 범위의 총 선량으로, 예컨대, 예로서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 Gy의 총 선량으로 세포에 방사선을 조사하는 것을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 한 실시양태에서, 방사선 조사 기간은 약 1 내지 약 20분, 예컨대, 예로서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20분, 바람직하게, 약 1 내지 약 5분 범위이다. 한 실시양태에서, 방사선은 10 Gy의 총 선량으로 약 1.5 내지 2분의 기간 동안, 즉, 약 5 내지 약 6.6 Gy/분의 선량으로 세포에 방사선을 조사하는 것을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 한 실시양태에서, 방사선은 10 Gy의 총 선량으로 약 5분 동안, 즉, 약 2 Gy/분의 선량으로 세포에 방사선을 조사하는 것을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

한 실시양태에서, 스트레스는 열 스트레스이다. 열 스트레스는 바람직하게, 세포를 사멸시키거나, 또는 불활성화시키지 않을 정도로 충분히 낮지만, 스트레스 및/또는 저항성 단백질 생산을 유도할 정도로 충분히 높은 온도의 것이다. 한 실시양태에서, 열 스트레스는 37℃ 초과, 바람직하게, 약 38℃ 내지 약 45℃ 범위의 온도에서, 예컨대, 예로서, 약 38℃, 39℃, 40℃, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃, 또는 45℃의 온도에서 세포를 배양하는 것을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 한 실시양태에서, 열 스트레스는 약 15분 내지 약 4시간, 바람직하게, 약 30분 내지 약 2시간 범위의 기간 동안, 예컨대, 예로서, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 또는 120분 동안 세포에 가해진다. 한 실시양태에서, 열 스트레스는 약 42℃에서 약 60분의 기간 동안 세포를 배양하는 것을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

한 실시양태에서, 스트레스는 화학적 스트레스이다. 화학적 스트레스는 세포를 바람직하게, 세포를 사멸시키거나, 또는 불활성화시키지 않을 정도로 충분히 낮지만, 스트레스 및/또는 저항성 단백질 생산을 유도할 정도로 충분히 높은 용량의 적어도 하나 또는 수개의 화학적 작용제에 노출시킴으로써 수행된다. 한 실시양태에서, 화학적 스트레스는 세포를 적어도 하나 또는 수개의 화학요법제 및/또는 알콜에 노출시키는 것을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 한 실시양태에서, 화학적 스트레스는 약 6시간 내지 약 120시간, 바람직하게, 약 24시간 내지 약 96시간 범위의 기간 동안, 예컨대, 예로서, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 또는 96시간 동안 세포에 가해진다. 한 실시양태에서, 화학적 스트레스는 세포, 바람직하게, HT-29 세포를 바람직하게, 약 1 μM 내지 약 20 μM 범위, 예컨대, 예로서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 μM 농도의, 더욱 바람직하게, 약 13 μM 농도의 옥살리플라틴에 약 60시간 내지 약 84시간의 기간 동안, 바람직하게, 약 72시간의 기간 동안 노출시키는 것을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 한 실시양태에서, 화학적 스트레스는 세포, 바람직하게, HCT-116 세포를 바람직하게, 약 20 nM 내지 약 400 nM 범위, 예컨대, 예로서, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 또는 400 nM 농도의, 더욱 바람직하게, 약 31.5 nM, 100 nM 또는 315 nM 농도의 SN-38 (7-에틸-10-히드록시-캄프토테신)에 약 36시간 내지 약 60시간의 기간 동안, 바람직하게, 약 48시간의 기간 동안 노출시키는 것을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 한 실시양태에서, 화학적 스트레스를 세포, 바람직하게, LoVo 세포를 바람직하게, 약 0.5 μM 내지 약 15 μM 범위, 예컨대, 예로서, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, 14.0, 14.5, 또는 15 μM 농도의, 더욱 바람직하게, 약 5 μM 농도의 플루오로우라실 (5-FU)에 약 36시간 내지 약 60시간의 기간 동안, 바람직하게, 약 48시간의 기간 동안 노출시키는 것을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

한 실시양태에서, 스트레스는 대사 스트레스이다. 대사 스트레스는 세포를 사멸시키거나, 또는 불활성화시키지 않지만, 스트레스 및/또는 저항성 단백질 생산을 유도하는 비-생리학적 세포 배양 배지 중에서 세포를 배양함으로써 수행된다. 한 실시양태에서, 대사 스트레스는 세포를 고갈된 배지 (예컨대, 암 세포의 성장 및/또는 생존에 유용하거나 또는 심지어는 필수적인 하나 또는 수개의 물질이 부분적으로 또는 완전히 결여된 배지) 중, 저산소 상태하에, 또는 낮은 pH (예컨대, pH 6.5 미만)에서 배양하는 것을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 한 실시양태에서, 대사 스트레스는 세포를 저혈청 배양 조건에서 예컨대, 예로서, (고전적으로 사용되는 바와 같은 10% FBS 배양 배지 대신) 2% FBS 배양 배지 중에서 배양하는 것을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은

- 스트레스성 HT-29 세포, 및 (i) 2% FBS 배양 배지 중 저혈청 배양 조건에서의 시험관내 배양, (ii) 약 1 내지 약 5분의 기간 동안 10 Gy의 총 선량의 시험관내 방사선, 및 (iii) 약 60분의 기간 동안 약 42℃ 온도에서의 시험관내 열 충격에 반응하여 상기 HT-29 세포에 의해 생산되는 스트레스 및/또는 저항성 단백질

- 스트레스성 HCT-116 세포, 및 (i) 2% FBS 배양 배지 중 저혈청 배양 조건에서의 시험관내 배양, (ii) 약 1 내지 약 5분의 기간 동안 10 Gy의 총 선량의 시험관내 방사선, 및 (iii) 약 60분의 기간 동안 약 42℃ 온도에서의 시험관내 열 충격에 반응하여 상기 HCT-116 세포에 의해 생산되는 스트레스 및/또는 저항성 단백질;

- 스트레스성 LoVo 세포, 및 (i) 2% FBS 배양 배지 중 저혈청 배양 조건에서의 시험관내 배양, (ii) 약 1 내지 약 5분의 기간 동안 10 Gy의 총 선량의 시험관내 방사선, 및 (iii) 약 60분의 기간 동안 약 42℃ 온도에서의 시험관내 열 충격에 반응하여 상기 LoVo 세포에 의해 생산되는 스트레스 및/또는 저항성 단백질;

- 스트레스성 HT-29 세포, 및 (i) 2% FBS 배양 배지 중 저혈청 배양 조건에서의 시험관내 배양, 및 (ii) 약 72시간의 기간 동안 약 13 μM 옥살리플라틴에의 시험관내 노출에 반응하여 상기 HT-29 세포에 의해 생산되는 스트레스 및/또는 저항성 단백질;

- 스트레스성 HCT-116 세포, 및 (i) 2% FBS 배양 배지 중 저혈청 배양 조건에서의 시험관내 배양, 및 (ii) 약 48시간의 기간 동안 약 31.5 nM, 100 nM 또는 315 nM SN-38 (7-에틸-10-히드록시-캄프토테신)에의 시험관내 노출에 반응하여 상기 HCT-116 세포에 의해 생산되는 스트레스 및/또는 저항성 단백질; 및

- 스트레스성 LoVo 세포, 및 (i) 2% FBS 배양 배지 중 저혈청 배양 조건에서의 시험관내 배양, 및 (ii) 약 48시간의 기간 동안 약 5 μM 플루오로우라실 (5-FU)에의 시험관내 노출에 반응하여 상기 LoVo 세포에 의해 생산되는 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

한 실시양태에서, 조성물은 비증식성인 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포를 포함한다. "비증식성" 또는 "불활성"이란, 이들 세포가 세포 증식, 즉, 세포가 성장하고, 분열하여 2개의 딸세포를 생성하는 프로세스를 수행할 수 없다는 것을 의미한다.

당업자는 세포를 비증식성으로 만드는 수단 및 방법을 잘 알고 있다. 예로서, 세포를 사멸시키거나, 불활성화시키기에 충분히 높은 선량의 방사선에 의해 세포를 비증식성으로 만들 수 있다. 한 실시양태에서, 세포를 비증식성으로 만들기 위한 방사선은 25 Gy 이상의 총 선량으로 세포에 방사선을 조사하는 것을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 대안적으로 또는 추가로, 예컨대, 약 10% v/v 내지 약 50% v/v의 에탄올을 사용하여 에탄올 고정에 의해 세포를 비증식성으로 만들 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 적어도 1회의 냉동-해동 사이클에 의해 세포를 비증식성으로 만들 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 면역원성을 부여할 수 있는 수단에의 연결에 의해 또는 이와의 복합체 형성에 의해, 예컨대, 예로서, 합텐화에 의해 세포를 비증식성으로 만들 수 있다.

당업자는 또한 예컨대, (전체 증식 결함을 평가하기 위해) 세포 배양에 의해 및/또는 (살아 있는 세포와 죽은 세포를 구별하는) 프로피디움 아이오다이드에 의해 생존능(viability) 시험을 수행함으로써 세포가 비증식성인지 여부를 확인하는 수단 및 방법에 대해서도 잘 알고 있다.

한 실시양태에서, 비증식성 세포는 구조상 무손상이고, 즉, 무손상 원형질막을 나타낸다. 한 실시양태에서, 비증식성 세포는 구조상 무손상이 아니며. 즉, 무손상 원형질막을 나타내지 않는다. 후자의 경우, 세포는 막 단편, 소기관 및 다른 세포질 성분의 형태로 조성물에 존재한다.

한 실시양태에서, 세포는 시험관내에서 가해진 스트레스[들]에 반응하여 이의 저항성 기전[들]을 발생시킨 후, 및 따라서, 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 생산한 후에, 비증식성이 된다. 한 실시양태에서, 세포는 스트레스를 받은 후 몇 시간이 경과한 후에, 바람직하게, 스트레스를 받은 후 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96시간 또는 그 초과의 시간이 경과한 후에 비증식성이 된다.

한 실시양태에서, 조성물은 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3 또는 4개의 하기 마커: Cmhsp70.1 (HSP70), CD227 (MUC1), CD95 (FAS 수용체) 및/또는 CD243 (MDR-1)을 과다발현하는 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포를 포함한다.

한 실시양태에서, 조성물은 고전적 조건하에서, 예컨대, 예로서, 10% FBS에서 배양되고, 시험관내에서 가해지는 (i) 대사 스트레스, (ii) 방사선, (iii) 열 스트레스 및 (iv) 화학적 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 HT-29, HCT-116 및/또는 LoVo 세포와 비교하여, 및/또는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 (i) 방사선, (ii) 열 스트레스 및 (iii) 화학적 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 HT-29, HCT-116 및/또는 LoVo 세포와 비교하여, 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3 또는 4개의 하기 마커: Cmhsp70.1 (HSP70), CD227 (MUC1), CD95 (FAS 수용체) 및/또는 CD243 (MDR-1)을 적어도 10% 더 많이, 바람직하게, 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 그 초과로 발현하는 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포를 포함한다. 추가로 또는 대안적으로, 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3 또는 4개의 마커 Cmhsp70.1 (HSP70), CD227 (MUC1), CD95 (FAS 수용체) 및/또는 CD243 (MDR-1)은 고전적 조건하에서, 예컨대, 예로서, 10% FBS에서 배양되고, 시험관내에서 가해지는 (i) 대사 스트레스, (ii) 방사선, (iii) 열 스트레스 및 (iv) 화학적 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 HT-29, HCT-116 및/또는 LoVo 세포 집단에서보다; 및/또는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 (i) 방사선, (ii) 열 스트레스 및 (iii) 화학적 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 HT-29, HCT-116 및/또는 LoVo 세포 집단에서보다 조성물 중 세포에서 적어도 10% 더 많이, 바람직하게, 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 그 초과로 더 많이 발현된다. 추가로 또는 대안적으로, 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3 또는 4개의 마커 Cmhsp70.1 (HSP70), CD227 (MUC1), CD95 (FAS 수용체) 및/또는 CD243 (MDR-1)에 대한 평균 형광 강도 (MFI)가 고전적 조건하에서, 예컨대, 예로서, 10% FBS에서 배양되고, 시험관내에서 가해지는 (i) 대사 스트레스, (ii) 방사선, (iii) 열 스트레스 및 (iv) 화학적 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 HT-29, HCT-116 및/또는 LoVo 세포 집단에서보다; 및/또는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 (i) 방사선, (ii) 열 스트레스 및 (iii) 화학적 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 HT-29, HCT-116 및/또는 LoVo 세포 집단에서보다 조성물 중에서 적어도 2배 더 높거나, 바람직하게, 적어도 3배, 4배, 5배, 6배 또는 그 초과로 더 높다.

본 발명에 따라, 조성물은 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함한다.

한 실시양태에서, 상기 스트레스 및/또는 저항성 단백질은 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포의 막과 회합되어 있고, 즉, 외부 표면이든 내부 표면이든, HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포의 표면에 노출되고/거나; HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포 내에 함유되어 있고, 즉, 이의 세포질 또는 이의 임의의 세포소기관 내에 함유되어 있고/거나; 조성물 중 유리 상태로 존재하고, 즉, HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포의 막과 회합되어 있지도 않고, 상기 세포 내에 함유되어 있지도 않으며, 이는 예컨대, 상기 세포에 의해 분비되었기 때문이다.

본 발명에 따라, 조성물은 면역원성인 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함한다. "면역원성" 또는 "면역적격"이란, 스트레스 및/또는 저항성 단백질이 환자에게 투여되었을 때, 환자에서 면역 반응 (예컨대, 항체 생성)을 유도할 수 있다는 것을 의미한다.

한 실시양태에서, 스트레스 및/또는 저항성 단백질은 이들을 면역원성으로 만들 수 있는 분자의 존재하에서 또는 그러한 프로세스에 의해 면역원성이 될 수 있다. 한 실시양태에서, 스트레스 및/또는 저항성 단백질은 면역원성을 부여할 수 있는 수단에의 연결에 의해 또는 이와의 복합체 형성에 의해 면역원성이 될 수 있다.

면역원성을 부여할 수 있는 수단 및 프로세스는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 한 실시양태에서, 면역원성을 부여할 수 있는 수단은 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포에 또는 이의 환경에 자연적으로는 존재하지 않는 하나 또는 수개의 분자[들]를 포함하거나 또는 이로 구성된다. 상기 수단으로 일반적으로 "항원"으로 지칭된다. 일부 항원은 체액성 또는 세포 매개 면역 반응을 스스로 유발할 수 있고, 이에 "면역원"으로 간주된다. 상기 항원의 일부 예로는 애주번트를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 당업자는 스트레스 및/또는 저항성 단백질과 함께 복합체를 형성하였을 때, 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 면역원성으로 만드는 암 백신에 사용하기에 적합한 애주번트에 대해 잘 알고 있다. 예컨대, 문헌 [Dubensky & Reed, 2010 (Semin Immunol. 22(3):155-61)] 또는 [Cuzzubbo et al., 2021 (Front Immunol. 11:615240)]을 참조한다.

그러나 일부 항원은 스스로 면역 반응을 개시할 수 없으며, 면역원성이 되기 위해서는 캐리어, 예컨대, 스트레스 및/또는 저항성 단백질에 미리 접합되어야 한다. 후자 항원은 때때로 "불완전한 항원"으로 지칭되며, 합텐을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

합텐의 일부 예로는 2,4-디니트로페닐 (DNP); 2,4-디니트로플루오로벤젠; 술파닐산; N-아이오도아세틸-N'-(5-술포닐-나프틸)에틸렌 디아민; 아닐린; p-아미노 벤조산; 비오틴; 플루오레세인 및 이의 유도체 (FITC, TAMRA, 및 텍사스 레드 포함); 디곡시게닌; 5-니트로-3-피라졸카르바미드; 4,5-디메톡시-2-니트로신나미드; 2-(3,4-디메톡시페닐)-퀴놀린-4-카르바미드; 2,1,3-벤족사디아졸-5-카르바미드; 3-히드록시-2-퀴녹살린카르바미드, 4-(디메틸아미노)아조벤젠-4'-술폰아미드 (DABSYL); 로테논 이소옥사졸린; (E)-2-(2-(2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[b][1,4]디아제핀-4-일)페녹시)아세트아미드; 7-(디에틸아미노)-2-옥소-2H-크로멘-3-카르복실산; 2-아세트아미도-4-메틸-5-티아졸술폰아미드; 및 p-메톡시페닐피라조포도필아미드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

한 실시양태에서, 스트레스 및/또는 저항성 단백질은 합텐화된다. 한 실시양태에서, 스트레스 및/또는 저항성 단백질은 2,4-디니트로페닐화된다 (DNP).

당업자는 단백질, 예컨대, 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 합텐화하는 수단 및 방법에 대해 잘 알고 있다.

면역원성을 부여할 수 있는 또 다른 수단으로는 옵소닌을 스트레스 및/또는 저항성 단백질에 결합시키는 것을 포함하는 널리 공지된 프로세스인 옵소닌화를 포함한다.

한 실시양태에서, 스트레스 및/또는 저항성 단백질은 방사선 저항성 단백질, 열 스트레스 저항성 단백질, 화학적 스트레스 저항성 단백질, 대사 스트레스 저항성 단백질, 및 이의 조합을 포함하거나 또는 이로 구성된 군으로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 조성물은 구체적으로 고전적 조건하에서, 예컨대, 예로서, 10% FBS에서 배양되고, 시험관내에서 가해지는 (i) 대사 스트레스, (ii) 방사선 (iii) 열 스트레스 및 (iv) 화학적 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포 중 임의의 것과 비교하여; 및/또는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 (i) 방사선, (ii) 열 스트레스 및 (iii) 화학적 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포 중 임의의 것과 비교하여 검출가능한 수준으로 적어도 하나 또는 수개의 하기 단백질을 포함한다: 티로신-단백질 키나제 HCK, 폴리피리미딘 관 결합 단백질 3, E3 유비퀴틴-단백질 리가제 RNF213, 세린/아르기닌이 풍부한 스플라이싱 인자 8, EH 도메인 함유 단백질 4, LIM 도메인 단독 단백질 7, DNA-유도 RNA 폴리머라제 I 서브유닛 RPA2, 2'-5'-올리고아데닐레이트 신타제 3, WD 반복부 및 HMG-박스 DNA-결합 단백질 1, 베타-2-당단백질 1, 세린/트레오닌-단백질 포스파타제 PP1-감마 촉매성 서브유닛, 아닐린, 독특한 미오신-Ib, AP-2 복합체 서브유닛 알파-2, 사이클린-의존성 키나제 2, 신호 전달인자 및 전사 활성인자 1-알파/베타, 푸밀리오 호몰로그 1, ATP-결합 카세트 서브패밀리 F 구성원 1, Rac GTPase-활성화 단백질 1, 신굴린, 신탁신-결합 단백질 3, 미토콘드리아 카르니틴/아실카르니틴 캐리어 단백질, 임포틴 서브유닛 알파-7, 리보솜 단백질 S6 키나제 알파-4, Ras-관련 단백질 Rab-5A, 리보뉴클레오시드-디포스페이트 리덕타제 큰 서브유닛, 저분자량 포스포티로신 단백질 포스파타제, 리보뉴클레오시드-디포스페이트 리덕타제 서브유닛 M2, ADP-리보실화 인자-유사 단백질 1, 다이나민-2, Ras-관련 단백질 Rab-13, IST1 호몰로그, 포크헤드 박스 단백질 K1, 소르비톨 데히드로게나제, Bcl-2-유사 단백질 1, 3부 모티프-함유 단백질 29, 키네신-유사 단백질 KIF22, 메틸스테롤 모노옥시게나제 1, 포낭 연관 단백질 1, BRCA1 연관 ATM 활성인자 1, 단백질 FAM83H, 단백질 O-만노실-트랜스퍼라제 TMTC3, 핵 인자 카파-B 키나제-상호작용 단백질의 억제제, 아연 핑거 CCCH-타입 항바이러스 단백질 1, 핵소체 단백질 9, 류신 지퍼 단백질 1, 폴리호메오틱-유사 단백질 2, 텐신-4, LEM 도메인 함유 단백질 2, 임포틴-4, Rho 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 1, PDZ 및 LIM 도메인 단백질 5, UAP56-상호작용 인자, MMS19 뉴클레오티드 절제 수복 단백질 호몰로그, 키네신-유사 단백질 KIF2C, ADP-리보스 글리코히드롤라제 MACROD1, 키네신-유사 단백질 KIFC1, ATP-의존성 RNA 헬리카제 DHX33, 극피 미세소관 연관 단백질-유사 4, 판코니 빈혈 I 군 단백질, EH 도메인 함유 단백질 3, 오피오이드 성장 인자 수용체, 감마-어듀신, DNA dC-dU-편집 효소 APOBEC-3B, 뉴로플라스틴, 아연 수송체 1, 글루타레독신-3, 시토졸 티미딘 키나제, 미리스토일화된 알라닌이 풍부한 C-키나제 기질, UMP-CMP 키나제, 대식세포-캡핑 단백질, 고 이동군 단백질 HMGI-C, 스무텔린, 혈소판-활성화 인자 아세틸히드롤라제 IB 서브유닛 감마, 전사 개시 인자 TFIID 서브유닛 9, 불활성 히드록시스테로이드 데히드로게나제-유사 단백질 1, 보레알린, la-관련 단백질 4, NADH 데히드로게나제 [유비퀴논] 1 알파 서브컴플렉스 어셈블리 인자 2, 오로라 키나제 B, 골지 연관 식물 병인-관련 단백질 1, ATP-결합 카세트 서브패밀리 F 구성원 2, 아르마딜로 반복부-함유 X-연관 단백질 3, 라귤레이터 복합체 단백질 LAMTOR3, 유망 ATP-의존성 RNA 헬리카제 DDX20, V형 양성자 ATPase 서브유닛 H, 및 칼슘-결합 단백질 39.

한 실시양태에서, 조성물은 고전적 조건하에서, 예컨대, 예로서, 10% FBS에서 배양되고, 시험관내에서 가해지는 (i) 대사 스트레스, (ii) 방사선 (iii) 열 스트레스 및 (iv) 화학적 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포 중 임의의 것과 비교하여; 및/또는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 (i) 방사선, (ii) 열 스트레스 및 (iii) 화학적 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포 중 임의의 것과 비교하여 적어도 하나 또는 수개의 하기 단백질을 과다발현한다: HLA 클래스 I 조직적합성 항원 B 알파 쇄, HLA 클래스 I 조직적합성 항원 A 알파 쇄, HLA 클래스 I 조직적합성 항원 C 알파 쇄, CD9 항원, 핵 자기항원 Sp-100, ATP-결합 카세트 서브패밀리 D 구성원 3, ATP-결합 카세트 서브패밀리 E 구성원 1, ATP-결합 카세트 서브패밀리 F 구성원 1, ATP-결합 카세트 서브패밀리 F 구성원 2, Bcl-2-유사 단백질 1, Bcl-2 연관 전사 인자 1, 시토크롬 c 옥시다제 서브유닛 2, 미토콘드리아 시토크롬 c 옥시다제 서브유닛 4 이소폼 1, 미토콘드리아 시토크롬 c 옥시다제 서브유닛 5A, 퍼옥시솜 아실-코엔자임 A 옥시다제 1, 열 충격 단백질 베타-1, 열 충격 단백질 HSP 90-베타, 열 충격 동족 71 kDa 단백질, 열 충격 70 kDa 단백질 6, 열 충격 70 kDa 단백질 4, 리보뉴클레아제 억제제, 핵 인자 카파-B 키나제-상호작용 단백질의 억제제, Ras-관련 단백질 Rab-5A, Ras-관련 단백질 Rab-6A, Ras-관련 단백질 Rab-5C, Ras-관련 단백질 Rab-7a, Ras-관련 단백질 Rab-13, Ras-관련 단백질 Rab-25, Ras-관련 단백질 Rab-15, Ras-관련 단백질 Rab-8A, Ras-관련 단백질 Rab-10, Ras-관련 단백질 Rap-1b, Ras-관련 단백질 Rab-1A, Ras-관련 단백질 Rap-1A, Ras-관련 C3 보툴리눔 독소 기질 1, Ras-관련 단백질 Rab-8B, Ras-관련 단백질 Rab-18, Ras-관련 단백질 Rap-2c, X선 수복 상호-보완 단백질 6, DNA 미스매치 수복 단백질 Msh6, MMS19 뉴클레오티드 절제 수복 단백질 호몰로그, 단백질 수송 단백질 Sec16A, 나트륨/칼륨-수송 ATPase 서브유닛 알파-1, 촉진 글루코스 수송체 구성원 1 용질 캐리어 패밀리 2, 미토콘드리아 트리카르복실레이트 수송 단백질, 모노카르복실레이트 수송체 1, 단백질 수송 단백질 Sec61 서브유닛 베타, 단백질 수송 단백질 Sec61 서브유닛 알파 이소폼 1, 수송 및 골지 조직 단백질 1 호몰로그, 아데노신 3'-포스포 5'-포스포술페이트 수송체 1, 트랜스포틴-1, 및 아연 수송체 1.

한 실시양태에서, 조성물은 고전적 조건하에서, 예컨대, 예로서, 10% FBS에서 배양되고, 시험관내에서 가해지는 (i) 대사 스트레스, (ii) 방사선 (iii) 열 스트레스 및 (iv) 화학적 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포 중 임의의 것과 비교하여; 및/또는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 (i) 방사선, (ii) 열 스트레스 및 (iii) 화학적 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포 중 임의의 것과 비교하여 적어도 하나 또는 수개의 하기 막 단백질을 과다발현한다: HLA 클래스 I 조직적합성 항원 B 알파 쇄, HLA 클래스 I 조직적합성 항원 A 알파 쇄, HLA 클래스 I 조직적합성 항원 C 알파 쇄, CD9 항원, ATP-결합 카세트 서브패밀리 D 구성원 3, Bcl-2-유사 단백질 1, 시토크롬 c 옥시다제 서브유닛 2, 미토콘드리아 시토크롬 c 옥시다제 서브유닛 4 이소폼 1, 핵 인자 카파-B 키나제-상호작용 단백질의 억제제, 나트륨/칼륨-수송 ATPase 서브유닛 알파-1, 촉진 글루코스 수송체 구성원 1 용질 캐리어 패밀리 2, 미토콘드리아 트리카르복실레이트 수송 단백질, 모노카르복실레이트 수송체 1, 단백질 수송 단백질 Sec61 서브유닛 베타, 단백질 수송 단백질 Sec61 서브유닛 알파 이소폼 1, 수송 및 골지 조직 단백질 1 호몰로그, 아데노신 3'-포스포 5'-포스포술페이트 수송체 1, 및 아연 수송체 1.

한 실시양태에서, 조성물은 구체적으로 고전적 조건하에서, 예컨대, 예로서, 10% FBS에서 배양되고, 시험관내에서 가해지는 (i) 대사 스트레스, (ii) 방사선 (iii) 열 스트레스 및 (iv) 화학적 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포 중 임의의 것과 비교하여; 및/또는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 (i) 방사선, (ii) 열 스트레스 및 (iii) 화학적 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포 중 임의의 것과 비교하여 검출가능한 수준으로 적어도 하나 또는 수개의 하기 단백질을 포함한다: ATP-결합 카세트 서브패밀리 F 구성원 1, ATP-결합 카세트 서브패밀리 F 구성원 2, Bcl-2-유사 단백질 1, 핵 인자 카파-B 키나제-상호작용 단백질의 억제제, Ras-관련 단백질 Rab-5A, Ras-관련 단백질 Rab-13, MMS19 뉴클레오티드 절제 수복 단백질 호몰로그, 및 아연 수송체 1.

한 실시양태에서, 조성물은 구체적으로 고전적 조건하에서, 예컨대, 예로서, 10% FBS에서 배양되고, 시험관내에서 가해지는 (i) 대사 스트레스, (ii) 방사선 (iii) 열 스트레스 및 (iv) 화학적 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포 중 임의의 것과 비교하여; 및/또는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 (i) 방사선, (ii) 열 스트레스 및 (iii) 화학적 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포 중 임의의 것과 비교하여 검출가능한 수준으로 적어도 하나 또는 수개의 하기 막 단백질을 포함한다: Bcl-2-유사 단백질 1, 핵 인자 카파-B 키나제-상호작용 단백질의 억제제, 및 아연 수송체 1.

한 실시양태에서, 조성물은 추가로 종양 연관 항원 (TAA) 및/또는 종양-특이적 항원 (TSA)을 포함할 수 있다.

"종양 항원"이란, 암 세포가 생산하는 항원 물질 또는 분자를 의미한다. 종양 항원은 두 범주로 분류된다: 오직 암 세포에만 존재하고, 비-암 세포에는 존재하지 않는 "종양-특이적 항원" 또는 "TSA"; 및 암 세포와 비-암세포에 존재하는 "종양 연관 항원" 또는 "TAA."

일반적인 TSA 중에는 특히 신생항원이 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "신생항원"은 예컨대, 발암 동안 유전적 불안정성에 의해 유발되는 하나 또는 수개의 돌연변이를 포함하는 유전자에 의해 암 세포에서 코딩되는(encoding) 비정상적인 종양-특이적 항원을 지칭한다. 결과적으로, 이러한 돌연변이화된 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열은 그 자체가 정상 세포에서는 발견되지 않는 비정상적인 단백질의 생성을 초래하는 돌연변이를 포함할 수 있다. 이어서, 비-자기 단백질 또는 외래 단백질로 간주될 수 있는 이러한 돌연변이화된 단백질은 신생항원-특이적 T 세포 수용체에 의해 인식되어 면역계를 활성화시키고, 암 세포에 대한 면역계의 공격으로 이어질 수 있다. 신생항원은 또한 바이러스 감염, 선택적 스플라이싱 및/또는 유전자 재배열에 의해 생성될 수도 있다. 예컨대, 문헌 [Zhang et al. (2021. Front Immunol. 12:672356)] 또는 [Jiang et al. (2019. J Hematol Oncol. 12(1):93)]을 참조한다.

한 실시양태에서, TAA 및/또는 TSA는 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포에 특이적이다.

한 실시양태에서, TAA 및/또는 TSA는 자연적으로 면역원성이다. 한 실시양태에서, TAA 및/또는 TSA는 이들을 면역원성으로 만들 수 있는 분자 또는 프로세스에 의해 면역원성이 될 수 있거나, 이들의 면역원성이 증가될 수 있다.

면역원성을 부여할 수 있는 수단은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 상기에서 기술되었다. 이는 특히, 그러나, 제한 없이, 합텐을 포함한다.

한 실시양태에서, 상기 TAA 및/또는 TSA는 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포의 막과 회합되어 있고, 즉, 외부 표면이든 내부 표면이든, HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포의 표면에 노출되고/거나; HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포 내에 함유되어 있고, 즉, 이의 세포질 또는 이의 임의의 세포소기관 내에 함유되어 있고/거나; 조성물 중 유리 상태로 존재하고, 즉, HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포의 막과 회합되어 있지도 않고, 상기 세포 내에 함유되어 있지도 않으며, 이는 예컨대, 상기 세포에 의해 분비되었기 때문이다.

한 실시양태에서, 조성물은 약제학적 조성물 또는 백신 조성물이고, 추가로 적어도 하나의 제약상 허용되는 부형제를 포함한다.

제약상 허용되는 부형제는 물, 염수, 링거액, 덱스트로스 용액, 및 에탄올 용액, 글루코스, 수크로스, 덱스트란, 만노스, 만니톨, 소르비톨, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 포스페이트, 아세테이트, 젤라틴, 콜라겐, 카보폴(Carbopol)^®, 식물성 오일 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 적합한 보존제, 안정제, 항산화제, 항미생물제 및 완충화제, 예컨대, 예로서, BHA, BHT, 시트르산, 아스코르브산, 테트라사이클린 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 제약상 허용되는 부형제의 다른 예로는 이온 교환체, 알럼, 예컨대, 인산알루미늄 또는 수산화알루미늄, 알루미나, 스테아르산알루미늄, 레시틴, 혈청 단백질, 예컨대, 인간 혈청 알부민, 완충제 물질, 예컨대, 포스페이트, 글리신, 소르브산, 소르브산칼륨, 식물성 포화 지방산의 부분 글리세리드 혼합물, 물, 염또는 전해질, 예컨대, 황산 프로타민, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드 실리카, 삼규산 마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스 기반 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 폴리머, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모 지방을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

추가로, 일부 제약상 허용되는 부형제는 계면활성제 (예컨대, 히드록시프로필셀룰로스); 담체(carrier), 예컨대, 예로서, 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 및 분산 매질, 및 식물성 오일, 예컨대, 예로서, 땅콩유 및 참기름; 등장제, 예컨대, 예로서, 당 또는 염화나트륨; 코팅제, 예컨대, 예로서, 레시틴; 흡수 지연제, 예컨대, 예로서, 루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴; 보존제, 예컨대, 예로서, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 클로로부탄올, 티메로살 등; 완충제, 예컨대, 예로서, 붕산, 중탄산나트륨 및 중탄산칼륨, 붕산나트륨 및 붕산칼륨, 탄산나트륨 및 탄산칼륨, 아세트산나트륨, 이인산나트륨 등; 긴장제, 예컨대, 예로서, 덱스트란 40, 덱스트란 70, 덱스트로스, 글리세린, 염화칼륨, 프로필렌 글리콜, 염화나트륨; 항산화제 및 안정제, 예컨대, 예로서, 중아황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 티오황산나트륨, 티오우레아 등; 비이온성 습윤화제 또는 정화제, 예컨대, 예로서, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴록사머 282 및 틸록사폴; 점성 변형제, 예컨대, 예로서, 덱스트란 40, 덱스트란 70, 젤라틴, 글리세린, 히드록시에틸셀룰로스, 히드록시메틸프로필셀룰로스, 라놀린, 메틸셀룰로스, 바셀린, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시메틸셀룰로스 등을 포함할 수 있다.

애주번트의 예로는 애주번트의 예에는 헬퍼 펩티드, 알루미늄 염 (예컨대, 예로서, 수산화알루미늄 (이는 또한 알럼으로도 명명), 인산알루미늄 등), 프로인트 불완전 애주번트, 프로인트 완전 애주번트, 사포닌, 머크(Merck) 애주번트 65, 스미스-클라인 비첨(Smith-Kline Beecham) 애주번트 AS-2, 아퀼라(Aquilla) 애주번트 QS-21, MPL™ 면역자극제, 3d-MPL, LEIF, 칼슘 염, 철 염, 아연 염, 아실화 티로신, 아실화 당, 양이온으로 유도체화된 다당류, 음이온으로 유도체화된 다당류, 폴리포스파젠, 생분해성 미소구체, 모노포스포릴 지질 A, 무라밀 트리펩티드 포스파티딜 에탄올아르닌, 사이토카인 (예컨대, 예로서, 인터루킨-2, 인터루킨-12, 인터루킨-4, 인터루킨-7 등), CpG 함유 올리고뉴클레오티드, 및 이의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

한 실시양태에서, 조성물은 약 10⁵ 내지 약 10⁸개의 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포, 바람직하게, 약 10⁶ 내지 약 10⁷개의 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포, 예컨대, 약 1 x 10⁶, 2 x 10⁶, 3 x 10⁶, 4 x 10⁶, 5 x 10⁶, 6 x 10⁶, 7 x 10⁶, 8 x 10⁶, 9 x 10⁶, 또는 1 x 10⁷개의 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 약 3 x 10⁶개의 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포를 포함한다.

한 실시양태에서, 조성물은 조성물 1 mL당 약 10⁶ 내지 약 10⁹개의 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포, 바람직하게, 조성물 1 mL당 약 10⁷ 내지 약 10⁸개의 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포, 예컨대, 조성물 1 mL당 약 1 x 10⁷, 2 x 10⁷, 3 x 10⁷, 4 x 10⁷, 5 x 10⁷, 6 x 10⁷, 7 x 10⁷, 8 x 10⁷, 9 x 10⁷, 또는 1 x 10⁸개의 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 조성물 1 mL당 3 x 10⁷개의 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포를 포함한다.

한 실시양태에서, 조성물은 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포를 동일한 비 (즉, 약 1:1:1)로 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 스트레스성 HT-29를 스트레스성 HCT-116 또는 LoVo 세포보다 적어도 1.5, 2 또는 2.5배 더 많이 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 스트레스성 HCT-116을 스트레스성 HT-29 또는 LoVo 세포보다 적어도 1.5, 2 또는 2.5배 더 많이 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 스트레스성 LoVo를 스트레스성 HT-29 또는 HCT-116 세포보다 적어도 1.5, 2 또는 2.5배 더 많이 포함한다.

한 실시양태에서, 조성물은

- 약 10⁵ 내지 약 10⁸개의 스트레스성 HT-29 세포, 바람직하게, 약 10⁶ 내지 약 10⁷개의 스트레스성 HT-29 세포, 예컨대, 약 1 x 10⁶, 2 x 10⁶, 3 x 10⁶, 4 x 10⁶, 5 x 10⁶, 6 x 10⁶, 7 x 10⁶, 8 x 10⁶, 9 x 10⁶, 또는 1 x 10⁷개의 스트레스성 HT-29 세포,

- 약 10⁵ 내지 약 10⁸개의 스트레스성 HCT-116 세포, 바람직하게, 약 10⁶ 내지 약 10⁷개의 스트레스성 HCT-116 세포, 예컨대, 약 1 x 10⁶, 2 x 10⁶, 3 x 10⁶, 4 x 10⁶, 5 x 10⁶, 6 x 10⁶, 7 x 10⁶, 8 x 10⁶, 9 x 10⁶, 또는 1 x 10⁷개의 스트레스성 HCT-116 세포, 및

- 약 10⁵ 내지 약 10⁸개의 스트레스성 LoVo 세포, 바람직하게, 약 10⁶ 내지 약 10⁷개의 스트레스성 LoVo 세포, 예컨대, 약 1 x 10⁶, 2 x 10⁶, 3 x 10⁶, 4 x 10⁶, 5 x 10⁶, 6 x 10⁶, 7 x 10⁶, 8 x 10⁶, 9 x 10⁶, 또는 1 x 10⁷개의 스트레스성 LoVo 세포를 포함한다.

중간 생성물

본 발명은 또한 상기 기술된 조성물의 제조에 유용한 중간 조성물에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 중간 조성물은 상기 정의된 바와 같이 적어도 하나의 제약상 허용되는 부형제를 포함한다.

한 실시양태에서, 중간 조성물은 (i) 스트레스성 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포, 및 (ii) 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성되고, 여기서 스트레스 및/또는 저항성 단백질은 시험관내에서 가해진 (i) 대사 스트레스, (ii) 방사선 및 (iii) 열 스트레스에 대한 반응으로 상기 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포에 의해 생산된 것이다. 방사선, 열 스트레스 및 대사 스트레스는 상기에서 기술되었다.

한 실시양태에서, 스트레스 및/또는 저항성 단백질은 면역원성이다. 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 면역원성으로 만드는 수단 및 방법은 상기에서 기술되었다.

한 실시양태에서, 중간 조성물은 상기에서 기술된 바와 같이 종양 연관 항원 (TAA) 및/또는 종양-특이적 항원 (TSA)을 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, TAA 및/또는 TSA는 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포에 특이적이다. 한 실시양태에서, TAA 및/또는 TSA는 자연적으로 면역원성이다. 한 실시양태에서, TAA 및/또는 TSA는 면역원성을 부여할 수 있는 수단에의 연결에 의해, 또는 이와의 복합체 형성에 의해 면역원성이 될 수 있거나, 또는 이의 면원원성은 증가될 수 있다. 면역원성을 부여할 수 있는 수단은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 상기에서 기술되었다. 이는 특히, 그러나, 제한 없이, 합텐을 포함한다.

한 실시양태에서, 중간 조성물은 (i) 스트레스성 HT-29 세포, 및

(i) 고갈된 배지 (예컨대, 암 세포의 성장 및/또는 생존에 유용하거나 또는 심지어는 필수적인 하나 또는 수개의 물질이 부분적으로 또는 완전히 결여된 배지) 중, 저산소 상태하에, 및/또는 낮은 pH (예컨대, pH 6.5 미만)에서 시험관내 배양,

(ii) 약 0.25 내지 약 25 Gy, 바람직하게, 약 1 내지 약 15 Gy 범위의 총 선량, 예컨대, 예로서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 Gy의 총 선량의 시험관내 방사선. 한 실시양태에서, 방사선 조사 기간은 약 1 내지 약 20분 범위, 예컨대, 예로서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20분, 바람직하게, 약 1 내지 약 5분이고,

(iii) 약 15분 내지 약 4시간, 바람직하게, 약 30분 내지 약 2시간 범위의 기간 동안, 예컨대, 예로서, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 또는 120분 동안 세포에 가해지는 약 38℃ 내지 약 45℃ 범위의 온도, 예컨대, 예로서, 약 38℃, 39℃, 40℃, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃, 또는 45℃의 온도에서의 시험관내 열 충격에 반응하여 상기 HT-29 세포에 의해 생산되는 (ii) 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

(i) 2% FBS 배양 배지 중 저혈청 배양 조건에서의 시험관내 배양,

(ii) 약 1 내지 약 5분의 기간 동안 10 Gy의 총 선량의 시험관내 방사선, 및

(iii) 약 60분의 기간 동안 약 42℃ 온도에서의 시험관내 열 충격에 반응하여 상기 HT-29 세포에 의해 생산되는 (ii) 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

상기 중간 조성물은 본원에서 "HT-29 DS -A"로 지칭된다.

한 실시양태에서, HT-29 DS-A는 방사선 저항성 단백질, 열 스트레스 저항성 단백질, 대사 스트레스 저항성 단백질, 및 이의 조합을 포함하거나 또는 이로 구성된 군으로부터 선택되는 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함한다.

한 실시양태에서, HT-29 DS-A 세포는 적어도 1, 적어도 2, 또는 3개의 하기 마커: Cmhsp70.1 (HSP70), CD227 (MUC1) 및/또는 CD107 (LAMP-1)을 과다발현한다.

한 실시양태에서, HT-29 DS-A 세포는 고전적 조건하에서, 예컨대, 예로서, 10% FBS에서 배양되고, 시험관내에서 가해지는 (i) 대사 스트레스, (ii) 방사선 및 (iii) 열 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 HT-29 세포와 비교하여; 및/또는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 (i) 방사선 및 (ii) 열 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 HT-29 세포와 비교하여, 적어도 1, 적어도 2, 또는 3개의 하기 마커: Cmhsp70.1 (HSP70), CD227 (MUC1) 및/또는 CD107 (LAMP-1)을 적어도 10% 더 많이, 바람직하게, 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 그 초과로 발현한다. 추가로 또는 대안적으로, 적어도 1, 적어도 2, 또는 3개의 마커 Cmhsp70.1 (HSP70), CD227 (MUC1) 및 CD107 (LAMP-1)은 고전적 조건하에서, 예컨대, 예로서, 10% FBS에서 배양되고, 시험관내에서 가해지는 (i) 대사 스트레스, (ii) 방사선 및 (iii) 열 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 HT-29 세포 집단에서보다; 및/또는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 (i) 방사선 및 (ii) 열 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 HT-29 세포 집단에서보다 HT-29 DS-A 세포 집단 중 적어도 10% 더 많은, 바람직하게, 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 그 초과의 세포에서 발현된다. 추가로 또는 대안적으로, 적어도 1, 적어도 2, 또는 3개의 마커 Cmhsp70.1 (HSP70), CD227 (MUC1) 및/또는 CD107 (LAMP-1)에 대한 평균 형광 강도 (MFI)는 고전적 조건하에서, 예컨대, 예로서, 10% FBS에서 배양되고, 시험관내에서 가해지는 (i) 대사 스트레스, (ii) 방사선 및 (iii) 열 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 HT-29 세포 집단에서보다; 및/또는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 (i) 방사선 및 (ii) 열 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 HT-29 세포 집단에서보다 HT-29 DS-A 세포 집단에서 적어도 2배 더 높거나, 바람직하게, 적어도 3배, 4배, 5배, 6배 또는 그 초과로 더 높다.

한 실시양태에서, HT-29 DS-A 세포는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 (i) 방사선 및 (ii) 열 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 HT-29 세포와 비교하여 적어도 하나 또는 수개의 하기 단백질을 과다발현한다: 폴리(rC)-결합 단백질 2, rho 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 1, 골진 서브패밀리 B 구성원 1, 베타-2-당단백질 1, 플라코필린-3, 단백질 FAM83H, 단백질 수송 단백질 Sec16A, 역 포르민-2, 아닐린, 단백질 ECT2, 플렉틴, 에피플라킨, 증식 마커 단백질 Ki-67, 소포 내재성-막 단백질 VIP36, 및 리소솜 연관 막 당단백질 1.

한 실시양태에서, HT-29 DS-A 세포는 구체적으로 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 (i) 방사선 및 (ii) 열 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 HT-29 세포와 비교하여 검출가능한 수준으로 적어도 하나 또는 수개의 하기 단백질을 발현한다: 폴리(rC)-결합 단백질 2, rho 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 1, 골진 서브패밀리 B 구성원 1, 베타-2-당단백질 1, 플라코필린-3, 단백질 FAM83H, 단백질 수송 단백질 Sec16A, 역 포르민-2, 아닐린, 및 단백질 ECT2.

한 실시양태에서, HT-29 DS-A 세포는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 (i) 방사선 및 (ii) 열 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 HT-29 세포와 비교하여 적어도 하나 또는 수개의 하기 막 및/또는 세포 표면 단백질을 과다발현한다: 소포 내재성-막 단백질 VIP36, 리소솜 연관 막 당단백질 1, 리보솜-결합 단백질 1, 쿠니츠-타입(Kunitz-타입) 프로테아제 억제제 2, 리소인지질 아실트랜스퍼라제 5, 에머린, 단백질 LYRIC, 초장쇄 지방산 단백질 신장 1, 및 단백질 수송 단백질 Sec61 서브유닛 감마.

한 실시양태에서, HT-29 DS-A 세포는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 (i) 방사선 및 (ii) 열 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 HT-29 세포와 비교하여 적어도 하나 또는 수개의 하기 세포 표면 단백질을 과다발현한다: 열 충격-관련 70 kDa 단백질, 아넥신, 아녹타민-6, 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원 3, 세로트랜스페린, 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 10B, 클러스테린, 퓨린, HLA 클래스 II 조직적합성 항원 감마 쇄, CD109 항원, 클로라이드 세포내 채널 단백질 4, 프로토카드헤린 지방 1, 천연 저항성 연관 대식세포 단백질 2, 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 10A, 칼파인-5, MHC 클래스 I 폴리펩티드-관련 서열 A, 고 이동군 단백질 B1, 테트라스파닌-15, UL16-결합 단백질 2, 인테그린 베타-7, 소닉 헤지호그 단백질, 톨-유사 수용체 3, 베타-2-당단백질 1, 조직 인자, 프로단백질 컨버타제 섭틸리신/켁신 타입 6, 내피 단백질 C 수용체, 부피 조절 음이온 채널 서브유닛 LRRC8A, 카드헤린 EGF LAG 7-통과 G-타입 수용체 3, 아연 수송체 ZIP6, HLA 클래스 II 조직적합성 항원 DM 알파 쇄, 시스틴/글루타메이트 수송체, 리소포스파티드산 수용체 2, 신데칸-1, 히알루로니다제-2, 인테그린 알파-4, 히스티딘이 풍부한 당단백질, 형질전환 성장 인자 베타-1 프로단백질, 및 메탈로프로테이나제 억제제 2.

한 실시양태에서, 중간 조성물은 (i) 스트레스성 HCT-116 세포, 및

(iii) 약 15분 내지 약 4시간, 바람직하게, 약 30분 내지 약 2시간 범위의 기간 동안, 예컨대, 예로서, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 또는 120분 동안 세포에 가해지는 약 38℃ 내지 약 45℃ 범위의 온도, 예컨대, 예로서, 약 38℃, 39℃, 40℃, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃, 또는 45℃의 온도에서의 시험관내 열 충격에 반응하여 상기 HCT-116 세포에 의해 생산되는 (ii) 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

(iii) 약 60분의 기간 동안 약 42℃ 온도에서의 시험관내 열 충격에 반응하여 상기 HCT-116 세포에 의해 생산되는 (ii) 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

상기 중간 조성물은 본원에서 "HCT-116 DS -A"로 지칭된다.

한 실시양태에서, HCT-116 DS-A는 방사선 저항성 단백질, 열 스트레스 저항성 단백질, 대사 스트레스 저항성 단백질, 및 이의 조합을 포함하거나 또는 이로 구성된 군으로부터 선택되는 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함한다.

한 실시양태에서, HCT-116 DS-A 세포는 적어도 1 또는 적어도 2의 하기 마커: Cmhsp70.1 (HSP70) 및/또는 CD227 (MUC1)을 과다발현한다.

한 실시양태에서, HCT-116 DS-A 세포는 고전적 조건하에서, 예컨대, 예로서, 10% FBS에서 배양되고, 시험관내에서 가해지는 (i) 대사 스트레스, (ii) 방사선 및 (iii) 열 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 HCT-116 세포와 비교하여; 및/또는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 (i) 방사선 및 (ii) 열 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 HCT-116 세포와 비교하여, 적어도 1, 또는 2개의 하기 마커: Cmhsp70.1 (HSP70) 및/또는 CD227 (MUC1)을 적어도 10% 더 많이, 바람직하게, 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 그 초과로 발현한다. 추가로 또는 대안적으로, 적어도 1, 또는 2개의 마커 Cmhsp70.1 (HSP70) 및 CD227 (MUC1)은 고전적 조건하에서, 예컨대, 예로서, 10% FBS에서 배양되고, 시험관내에서 가해지는 (i) 대사 스트레스, (ii) 방사선 및 (iii) 열 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 HCT-116 세포 집단에서보다; 및/또는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 (i) 방사선 및 (ii) 열 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 HCT-116 세포 집단에서보다 HCT-116 DS-A 세포 집단 중 적어도 10% 더 많은, 바람직하게, 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 그 초과의 세포에서 발현된다. 추가로 또는 대안적으로, 적어도 1, 또는 2개의 마커 Cmhsp70.1 (HSP70) 및 CD227 (MUC1)에 대한 평균 형광 강도 (MFI)는 고전적 조건하에서, 예컨대, 예로서, 10% FBS에서 배양되고, 시험관내에서 가해지는 (i) 대사 스트레스, (ii) 방사선 및 (iii) 열 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 HCT-116 세포 집단에서보다; 및/또는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 (i) 방사선 및 (ii) 열 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 HCT-116 세포 집단에서보다 HCT-116 DS-A 세포 집단에서 적어도 2배 더 높거나, 바람직하게, 적어도 3배, 4배, 5배, 6배 또는 그 초과로 더 높다.

한 실시양태에서, HCT-116 DS-A 세포는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 (i) 방사선 및 (ii) 열 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 HCT-116 세포와 비교하여 적어도 하나 또는 수개의 하기 단백질을 과다발현한다: 폴리(rC)-결합 단백질 2, rho 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 1, 골진 서브패밀리 B 구성원 1, 베타-2-당단백질 1, 플라코필린-3, 단백질 FAM83H, 단백질 수송 단백질 Sec16A, 역 포르민-2, 아닐린, 단백질 ECT2, 플렉틴, 에피플라킨, 증식 마커 단백질 Ki-67, 소포 내재성-막 단백질 VIP36, 및 리소솜 연관 막 당단백질 1.

한 실시양태에서, HCT-116 DS-A 세포는 구체적으로 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 (i) 방사선 및 (ii) 열 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 HCT-116 세포와 비교하여 검출가능한 수준으로 적어도 하나 또는 수개의 하기 단백질을 발현한다: 폴리(rC)-결합 단백질 2, rho 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 1, 골진 서브패밀리 B 구성원 1, 베타-2-당단백질 1, 플라코필린-3, 단백질 FAM83H, 단백질 수송 단백질 Sec16A, 역 포르민-2, 아닐린, 및 단백질 ECT2.

한 실시양태에서, HCT-116 DS-A 세포는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 (i) 방사선 및 (ii) 열 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 HCT-116 세포와 비교하여 적어도 하나 또는 수개의 하기 막 및/또는 세포 표면 단백질을 과다발현한다: 인테그린 알파-6, 리소솜 연관 막 당단백질 1, 리보솜-결합 단백질 1, 델타(14)-스테롤 리덕타제 LBR, 미토콘드리아 양성자/칼슘 교환체 단백질, RRP12-유사 단백질, 확장된 시냅토타그민-1, 단백질 수송 단백질 Sec61 서브유닛 알파 이소폼 1, 용질 캐리어 패밀리 2, 촉진 글루코스 수송체 구성원 1, 데스모글레인-2, 키넥틴, 단백질 LYRIC, 스핑고신-1-포스페이트 리아제 1, 소포 연관 막 단백질 연관 단백질 A, 리소인지질 아실트랜스퍼라제 7, Sigl 인식 입자 수용체 서브유닛 베타, 토신-1A-상호작용 단백질 1, ER 막 단백질 복합체 서브유닛 1, 탈카르복실화 스테롤-4-알파-카르복실레이트 3-데히드로게제, 막 연관 프로게스테론 수용체 성분 1, CD44 항원, MICOS 복합체 서브유닛 MIC26, 막관통 emp24 도메인 함유 단백질 4, ORM1-유사 단백질 2, 돌리콜-포스페이트 만노실트랜스퍼라제 서브유닛 3, 세포골격 연관 단백질 4, 막관통 단백질 43, 레티놀 데히드로게제 11, Sigl 펩티다제 복합체 서브유닛 2, 세린 팔미토일트랜스퍼라제 2, 코일드 코일 도메인 함유 단백질 47, 초장쇄 에노일-CoA 리덕타제, 프로토카드헤린 지방 1, 막관통 emp24 도메인 함유 단백질 7, 카베올린-1, NF-X1-타입 아연 핑거 단백질 NFXL1, 수용체 발현 증강 단백질 6, 미토콘드리아 HIG1 도메인 패밀리 구성원 2A, 작은 내재성 막 단백질 20, DH 데히드로게제 [유비퀴논] 1 알파 서브컴플렉스 서브유닛 13, DH 데히드로게제 [유비퀴논] 1 베타 서브컴플렉스 서브유닛 3, 미토콘드리아 티아민 피로포스페이트 캐리어, 미토콘드리아 분열 1 단백질, 아민 옥시다제 [플라빈-함유] B, 미토콘드리아 내부 막 단백질 OXA1L, 2-히드록시아실-CoA 리아제 2, 니칼린, 원형질막 칼슘-수송 ATPase 1, 미오펠린, 및 양이온-비의존성 만노스-6-포스페이트 수용체.

한 실시양태에서, 중간 조성물은 (i) 스트레스성 LoVo 세포, 및

(iii) 약 15분 내지 약 4시간, 바람직하게, 약 30분 내지 약 2시간 범위의 기간 동안, 예컨대, 예로서, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 또는 120분 동안 세포에 가해지는 약 38℃ 내지 약 45℃ 범위의 온도, 예컨대, 예로서, 약 38℃, 39℃, 40℃, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃, 또는 45℃의 온도에서의 시험관내 열 충격에 반응하여 상기 LoVo 세포에 의해 생산되는 (ii) 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

(iii) 약 60분의 기간 동안 약 42℃ 온도에서의 시험관내 열 충격에 반응하여 상기 LoVo 세포에 의해 생산되는 (ii) 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

상기 중간 조성물은 본원에서 "LoVo DS -A"로 지칭된다.

한 실시양태에서, LoVo DS-A는 방사선 저항성 단백질, 열 스트레스 저항성 단백질, 대사 스트레스 저항성 단백질, 및 이의 조합을 포함하거나 또는 이로 구성된 군으로부터 선택되는 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함한다.

한 실시양태에서, LoVo DS-A 세포는 적어도 1, 적어도 2, 또는 3개의 하기 마커: Cmhsp70.1 (HSP70), CD227 (MUC1) 및/또는 CD107 (LAMP-1)을 과다발현한다.

한 실시양태에서, LoVo DS-A 세포는 고전적 조건하에서, 예컨대, 예로서, 10% FBS에서 배양되고, 시험관내에서 가해지는 (i) 대사 스트레스, (ii) 방사선 및 (iii) 열 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 LoVo 세포와 비교하여; 및/또는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 (i) 방사선 및 (ii) 열 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 LoVo 세포와 비교하여, 적어도 1, 적어도 2, 또는 3개의 하기 마커: Cmhsp70.1 (HSP70), CD227 (MUC1) 및/또는 CD107 (LAMP-1)을 적어도 10% 더 많이, 바람직하게, 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 그 초과로 발현한다. 추가로 또는 대안적으로, 적어도 1, 적어도 2, 또는 3개의 마커 Cmhsp70.1 (HSP70), CD227 (MUC1) 및 CD107 (LAMP-1)은 고전적 조건하에서, 예컨대, 예로서, 10% FBS에서 배양되고, 시험관내에서 가해지는 (i) 대사 스트레스, (ii) 방사선 및 (iii) 열 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 LoVo 세포 집단에서보다; 및/또는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 (i) 방사선 및 (ii) 열 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 LoVo 세포 집단에서보다 LoVo DS-A 세포 집단 중 적어도 10% 더 많은, 바람직하게, 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 그 초과의 세포에서 발현된다. 추가로 또는 대안적으로, 적어도 1, 적어도 2, 또는 3개의 마커 Cmhsp70.1 (HSP70), CD227 (MUC1) 및 CD107 (LAMP-1)에 대한 평균 형광 강도 (MFI)는 고전적 조건하에서, 예컨대, 예로서, 10% FBS에서 배양되고, 시험관내에서 가해지는 (i) 대사 스트레스, (ii) 방사선 및 (iii) 열 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 LoVo 세포 집단에서보다; 및/또는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 (i) 방사선 및 (ii) 열 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 LoVo 세포 집단에서보다 LoVo DS-A 세포 집단에서 적어도 2배 더 높거나, 바람직하게, 적어도 3배, 4배, 5배, 6배 또는 그 초과로 더 높다.

한 실시양태에서, LoVo DS-A 세포는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 (i) 방사선 및 (ii) 열 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 LoVo 세포와 비교하여 적어도 하나 또는 수개의 하기 단백질을 과다발현한다: 폴리(rC)-결합 단백질 2, rho 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 1, 골진 서브패밀리 B 구성원 1, 베타-2-당단백질 1, 플라코필린-3, 단백질 FAM83H, 단백질 수송 단백질 Sec16A, 역 포르민-2, 아닐린, 단백질 ECT2, 플렉틴, 에피플라킨, 증식 마커 단백질 Ki-67, 소포 내재성-막 단백질 VIP36, 및 리소솜 연관 막 당단백질 1.

한 실시양태에서, LoVo DS-A 세포는 구체적으로 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 (i) 방사선 및 (ii) 열 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 LoVo 세포와 비교하여 검출가능한 수준으로 적어도 하나 또는 수개의 하기 단백질을 발현한다: 폴리(rC)-결합 단백질 2, rho 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 1, 골진 서브패밀리 B 구성원 1, 베타-2-당단백질 1, 플라코필린-3, 단백질 FAM83H, 단백질 수송 단백질 Sec16A, 역 포르민-2, 아닐린, 및 단백질 ECT2.

한 실시양태에서, LoVo DS-A 세포는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 (i) 방사선 및 (ii) 열 스트레스 중 어느 것도 받지 않은 LoVo 세포와 비교하여 적어도 하나 또는 수개의 하기 막 및/또는 세포 표면 단백질을 과다발현한다: 소포 내재성-막 단백질 VIP36, 핵소체 복합체 단백질 4 호몰로그, Sigl 펩티다제 복합체 촉매성 서브유닛 SEC11A, Sigl 인식 입자 수용체 서브유닛 베타, 마이크로솜 글루타티온 S-트랜스퍼라제 1, DPH--시토크롬 P450 리덕타제, 초장쇄 (3R)-3-히드록시아실-CoA 데히드라타제 3, 만노실-올리고사카라이드 글루코시다제, 옥시스테롤-결합 단백질-관련 단백질 8, 수용체 발현 증강 단백질 5, MICOS 복합체 서브유닛 MIC26, 베타-1,3-갈락토실-O-글리코실-당단백질 베타-1,6-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 3, 미토콘드리아 ATP 신타제 막 서브유닛 DAPIT, 미토콘드리아 ATP 신타제 서브유닛 f, CDGSH 철-황 도메인 함유 단백질 2, 비타민 K 에폭시드 리덕타제 복합체 서브유닛 1-유사 단백질 1, 단백질 FAM162A, 에르린-1, 장쇄 지방산--CoA 리가제 1, CYB5B_인간 시토크롬 b5 타입 B, 레티놀 데히드로게제 11, 막관통 emp24 도메인 함유 단백질 2, 초장쇄 에노일-CoA 리덕타제, 3-베타-히드록시스테로이드-델타(8),델타(7)-이소머라제, 모노카르복실레이트 수송체 1, HLA 클래스 I 조직적합성 항원 B 알파 쇄, 에르린-2, CD9 항원, ATP 신타제 단백질 8, 미토콘드리아 분열 프로세스 단백질 1, 시토크롬 c 옥시다제 서브유닛 NDUFA4, DH 데히드로게제 [유비퀴논] 1 알파 서브컴플렉스 서브유닛 13, DH 데히드로게제 [유비퀴논] 1 베타 서브컴플렉스 서브유닛 4, DH 데히드로게제 [유비퀴논] 1 베타 서브컴플렉스 서브유닛 3, 미토콘드리아 분열 1 단백질, 및 BRI3-결합 단백질.

한 실시양태에서, 중간 조성물은 (i) 스트레스성 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포, 및 (ii) 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성되고, 여기서 스트레스 및/또는 저항성 단백질은 시험관내에서 가해진 (i) 대사 스트레스, 및 (ii) 화학적 스트레스에 대한 반응으로 상기 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포에 의해 생산된 것이다. 화학적 스트레스 및 대사 스트레스는 상기에서 기술되었다.

(ii) 약 6시간 내지 약 120시간, 바람직하게, 약 24시간 내지 약 96시간 범위의 기간 동안, 예컨대, 예로서, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 또는 96시간 동안 적어도 하나 또는 수개의 화학요법제 및/또는 알콜에의 시험관내 노출에 반응하여 상기 HT-29 세포에 의해 생산되는 (ii) 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

(i) 2% FBS 배양 배지 중 저혈청 배양 조건에서의 시험관내 배양, 및

(ii) 약 72시간의 기간 동안 약 13 μM 옥살리플라틴에의 시험관내 노출에 반응하여 상기 HT-29 세포에 의해 생산되는 (ii) 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

상기 중간 조성물은 본원에서 "HT-29 DS -B"로 지칭된다.

한 실시양태에서, HT-29 DS-B는 방사선 저항성 단백질, 열 스트레스 저항성 단백질, 대사 스트레스 저항성 단백질, 및 이의 조합을 포함하거나 또는 이로 구성된 군으로부터 선택되는 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함한다.

한 실시양태에서, HT-29 DS-B 세포는 적어도 1, 적어도 2, 또는 3개의 하기 마커: CD54 (ICAM-1), CD95 (FAS 수용체) 및/또는 CD107 (LAMP-1)을 과다발현한다.

한 실시양태에서, HT-29 DS-B 세포는 고전적 조건하에서, 예컨대, 예로서, 10% FBS에서 배양되고, 시험관내에서 가해지는 (i) 대사 스트레스, 및 (ii) 화학적 스트레스(예컨대, 약 72시간의 기간 동안 약 13 μM 옥살리플라틴에의 시험관내 노출) 중 어느 것도 받지 않은 HT-29 세포와 비교하여; 및/또는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 화학적 스트레스 (예컨대, 약 72시간의 기간 동안 약 13 μM 옥살리플라틴에의 시험관내 노출)를 받지 않은 HT-29 세포와 비교하여, 적어도 1, 적어도 2, 또는 3개의 하기 마커: CD54 (ICAM-1), CD95 (FAS 수용체) 및/또는 CD107 (LAMP-1)을 적어도 10% 더 많이, 바람직하게, 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 그 초과로 발현한다. 추가로 또는 대안적으로, 적어도 1, 적어도 2, 또는 3개의 마커 CD54 (ICAM-1), CD95 (FAS 수용체) 및/또는 CD107 (LAMP-1)은 고전적 조건하에서, 예컨대, 예로서, 10% FBS에서 배양되고, 시험관내에서 가해지는 (i) 대사 스트레스, 및 (ii) 화학적 스트레스(예컨대, 약 72시간의 기간 동안 약 13 μM 옥살리플라틴에의 시험관내 노출) 중 어느 것도 받지 않은 HT-29 세포 집단에서보다; 및/또는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 화학적 스트레스 (예컨대, 약 72시간의 기간 동안 약 13 μM 옥살리플라틴에의 시험관내 노출)를 받지 않은 HT-29 세포 집단에서보다 HT-29 DS-B 세포 집단 중 적어도 10% 더 많은, 바람직하게, 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 그 초과의 세포에서 발현된다. 추가로 또는 대안적으로, 적어도 1, 적어도 2, 또는 3개의 마커 CD54 (ICAM-1), CD95 (FAS 수용체) 및/또는 CD107 (LAMP-1)에 대한 평균 형광 강도 (MFI)는 고전적 조건하에서, 예컨대, 예로서, 10% FBS에서 배양되고, 시험관내에서 가해지는 (i) 대사 스트레스, 및 (ii) 화학적 스트레스(예컨대, 약 72시간의 기간 동안 약 13 μM 옥살리플라틴에의 시험관내 노출) 중 어느 것도 받지 않은 HT-29 세포 집단에서보다; 및/또는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 화학적 스트레스 (예컨대, 약 72시간의 기간 동안 약 13 μM 옥살리플라틴에의 시험관내 노출)를 받지 않은 HT-29 세포 집단에서보다 HT-29 DS-B 세포 집단에서 적어도 2배 더 높거나, 바람직하게, 적어도 3배, 4배, 5배, 6배 또는 그 초과로 더 높다.

한 실시양태에서, HT-29 DS-B 세포는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 화학적 스트레스를 받지 않은 HT-29 세포와 비교하여 적어도 하나 또는 수개의 하기 단백질을 과다발현한다: 베타-2-당단백질 1, 히스톤 H2A 타입 1, 폴리(rC)-결합 단백질 2, 키넥틴, 플렉틴, 및 NADH 데히드로게나제 [유비퀴논] 1 알파 서브컴플렉스 서브유닛 7.

한 실시양태에서, HT-29 DS-B 세포는 구체적으로 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 화학적 스트레스를 받지 않은 HT-29 세포와 비교하여 검출가능한 수준으로 적어도 하나 또는 수개의 하기 단백질을 발현한다: 베타-2-당단백질 1, 히스톤 H2A 타입 1, 및 폴리(rC)-결합 단백질 2.

한 실시양태에서, HT-29 DS-B 세포는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 화학적 스트레스를 받지 않은 HT-29 세포와 비교하여 적어도 하나 또는 수개의 하기 막 및/또는 세포 표면 단백질을 과다발현한다: 리보솜-결합 단백질 1, 및 NADPH--시토크롬 P450 리덕타제.

한 실시양태에서, HT-29 DS-B 세포는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 화학적 스트레스를 받지 않은 HT-29 세포와 비교하여 적어도 하나 또는 수개의 하기 세포 표면 단백질을 과다발현한다: CD109 항원, HLA 클래스 II 조직적합성 항원 감마 쇄, HLA 클래스 I 조직적합성 항원 알파 쇄 F, 히알루로난 매개 운동성 수용체, 인테그린 베타-8, 인테그린 베타-3, 프로단백질 컨버타제 섭틸리신/켁신 타입 6, 클러스테린, 세로트랜스페린, 천연 저항성 연관 대식세포 단백질 2, MHC 클래스 I 폴리펩티드-관련 서열 A, 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 10B, 내피 단백질 C 수용체, 카드헤린 EGF LAG 7-통과 G-타입 수용체 3, 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 10A, 시스틴/글루타메이트 수송체, 조직 인자, 형질전환 성장 인자 베타-1 프로단백질, 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원 3, 아녹타민-6, 메탈로프로테이나제 억제제 2, 톨-유사 수용체 3, 부피 조절 음이온 채널 서브유닛 LRRC8A, 테트라스파닌-15, 아연 수송체 ZIP6, 퓨린, 프로토카드헤린 지방 1, 히알루로니다제-2, 리소포스파티드산 수용체 2, 고 이동군 단백질 B1, 클로라이드 세포내 채널 단백질 4, UL16-결합 단백질 2, 칼파인-5, 아넥신 A9, 히스티딘이 풍부한 당단백질, 인테그린 알파-4, 및 열 충격-관련 70 kDa 단백질 2.

(ii) 약 6시간 내지 약 120시간, 바람직하게, 약 24시간 내지 약 96시간 범위의 기간 동안, 예컨대, 예로서, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 또는 96시간 동안 적어도 하나 또는 수개의 화학요법제 및/또는 알콜에의 시험관내 노출에 반응하여 상기 HCT-116 세포에 의해 생산되는 (ii) 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

(ii) 약 48시간의 기간 동안 약 31.5 nM, 100 nM 또는 315 nM SN-38 (7-에틸-10-히드록시-캄프토테신)에의 시험관내 노출에 반응하여 상기 HCT-116 세포에 의해 생산되는 (ii) 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

상기 중간 조성물은 본원에서 "HCT-116 DS -B"로 지칭된다.

한 실시양태에서, HCT-116 DS-B는 방사선 저항성 단백질, 열 스트레스 저항성 단백질, 대사 스트레스 저항성 단백질, 및 이의 조합을 포함하거나 또는 이로 구성된 군으로부터 선택되는 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함한다.

한 실시양태에서, HCT-116 DS-B 세포는 하기 마커: CD66 (CEA)을 과다발현한다.

한 실시양태에서, HCT-116 DS-B 세포는 고전적 조건하에서, 예컨대, 예로서, 10% FBS에서 배양되고, 시험관내에서 가해지는 (i) 대사 스트레스, 및 (ii) 화학적 스트레스(예컨대, 약 48시간의 기간 동안 약 31.5 nM, 100 nM 또는 315 nM SN-38 (7-에틸-10-히드록시-캄프토테신)에의 시험관내 노출) 중 어느 것도 받지 않은 HCT-116 세포와 비교하여; 및/또는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 화학적 스트레스 (예컨대, 약 48시간의 기간 동안 약 31.5 nM, 100 nM 또는 315 nM SN-38 (7-에틸-10-히드록시-캄프토테신)에의 시험관내 노출)를 받지 않은 HCT-116 세포와 비교하여 마커 CD66 (CEA)을 적어도 10% 더 많이, 바람직하게, 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 그 초과로 발현한다. 추가로 또는 대안적으로, 마커 CD66 (CEA)는 고전적 조건하에서, 예컨대, 예로서, 10% FBS에서 배양되고, 시험관내에서 가해지는 (i) 대사 스트레스, 및 (ii) 화학적 스트레스(예컨대, 약 48시간의 기간 동안 약 31.5 nM, 100 nM 또는 315 nM SN-38 (7-에틸-10-히드록시-캄프토테신)에의 시험관내 노출) 중 어느 것도 받지 않은 HCT-116 세포 집단에서보다; 및/또는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 화학적 스트레스 (예컨대, 약 48시간의 기간 동안 약 31.5 nM, 100 nM 또는 315 nM SN-38 (7-에틸-10-히드록시-캄프토테신)에의 시험관내 노출)를 받지 않은 HCT-116 세포 집단에서보다 HCT-116 DS-B 세포 집단 중 적어도 10% 더 많은, 바람직하게, 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 그 초과의 세포에서 발현된다. 추가로 또는 대안적으로, 마커 CD66 (CEA)의 평균 형광 강도 (MFI)는 고전적 조건하에서, 예컨대, 예로서, 10% FBS에서 배양되고, 시험관내에서 가해지는 (i) 대사 스트레스, 및 (ii) 화학적 스트레스(예컨대, 약 48시간의 기간 동안 약 31.5 nM, 100 nM 또는 315 nM SN-38 (7-에틸-10-히드록시-캄프토테신)에의 시험관내 노출) 중 어느 것도 받지 않은 HCT-116 세포 집단에서보다; 및/또는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 화학적 스트레스 (예컨대, 약 48시간의 기간 동안 약 31.5 nM, 100 nM 또는 315 nM SN-38 (7-에틸-10-히드록시-캄프토테신)에의 시험관내 노출)를 받지 않은 HCT-116 세포 집단에서보다 HCT-116 DS-B 세포 집단에서 적어도 2배 더 높거나, 바람직하게, 적어도 3배, 4배, 5배, 6배 또는 그 초과로 더 높다.

한 실시양태에서, HCT-116 DS-B 세포는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 화학적 스트레스를 받지 않은 HCT-116 세포와 비교하여 적어도 하나 또는 수개의 하기 단백질을 과다발현한다: 베타-2-당단백질 1, 히스톤 H2A 타입 1, 폴리(rC)-결합 단백질 2, 키넥틴, 플렉틴, 및 NADH 데히드로게나제 [유비퀴논] 1 알파 서브컴플렉스 서브유닛 7.

한 실시양태에서, HCT-116 DS-B 세포는 구체적으로 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 화학적 스트레스를 받지 않은 HCT-116 세포와 비교하여 검출가능한 수준으로 적어도 하나 또는 수개의 하기 단백질을 발현한다: 베타-2-당단백질 1, 히스톤 H2A 타입 1, 및 폴리(rC)-결합 단백질 2.

한 실시양태에서, HCT-116 DS-B 세포는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 화학적 스트레스를 받지 않은 HCT-116 세포와 비교하여 적어도 하나 또는 수개의 하기 막 및/또는 세포 표면 단백질을 과다발현한다: 미토콘드리아 포스페이트 캐리어 단백질, 인테그린 베타-4, 리소솜 연관 막 당단백질 1, CD44 항원, 리보솜-결합 단백질 1, 단백질 수송 단백질 Sec61 서브유닛 알파 이소폼 1, 키넥틴, HLA 클래스 I 조직적합성 항원 A 알파 쇄, 리소인지질 아실트랜스퍼라제 7, 막 연관 프로게스테론 수용체 성분 1, 마이크로솜 글루타티온 S-트랜스퍼라제 1, NADH 데히드로게나제 [유비퀴논] 1 베타 서브컴플렉스 서브유닛 4, 데스모글레인-2, 인테그린 알파-3, 토신-1A-상호작용 단백질 1, 원형질막 칼슘-수송 ATPase 1, 스핑고신-1-포스페이트 리아제 1, V형 양성자 ATPase 116 kDa 서브유닛 a1, 미토콘드리아 내부 막 단백질 OXA1L, 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제 [유비퀴논] 1 베타 서브컴플렉스 서브유닛 5, 막관통 단백질 43, 아민 옥시다제 [플라빈-함유] B, 단백질 수송 단백질 Sec61 서브유닛 베타, 분비성 캐리어 연관 막 단백질 3, 단백질 FAM162A, 레티놀 데히드로게나제 11, ADP-리보실화 인자-유사 단백질 8B, NADH 데히드로게나제 [유비퀴논] 1 베타 서브컴플렉스 서브유닛 3, 돌리콜-포스페이트 만노실트랜스퍼라제 서브유닛 3, 미토콘드리아 티아민 피로포스페이트 캐리어, 및 ORM1-유사 단백질 2.

(ii) 약 6시간 내지 약 120시간, 바람직하게, 약 24시간 내지 약 96시간 범위의 기간 동안, 예컨대, 예로서, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 또는 96시간 동안 적어도 하나 또는 수개의 화학요법제 및/또는 알콜에의 시험관내 노출에 반응하여 상기 LoVo 세포에 의해 생산되는 (ii) 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

(ii) 약 48시간의 기간 동안 약 5 μM 플루오로우라실 (5-FU)에의 시험관내 노출에 반응하여 상기 LoVo 세포에 의해 생산되는 (ii) 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

상기 중간 조성물은 본원에서 "LoVo DS-B"로 지칭된다.

한 실시양태에서, LoVo DS-B는 방사선 저항성 단백질, 열 스트레스 저항성 단백질, 대사 스트레스 저항성 단백질, 및 이의 조합을 포함하거나 또는 이로 구성된 군으로부터 선택되는 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함한다.

한 실시양태에서, LoVo DS-B 세포는 적어도 1, 또는 2개의 하기 마커: CD243 (MDR-1) 및 CD66 (CEA)을 과다발현하거나; 바람직하게, LoVo DS-B 세포는 CD243 (MDR-1)을 과다발현한다.

한 실시양태에서, LoVo DS-B 세포는 고전적 조건하에서, 예컨대, 예로서, 10% FBS에서 배양되고, 시험관내에서 가해지는 (i) 대사 스트레스, 및 (ii) 화학적 스트레스(예컨대, 약 48시간의 기간 동안 약 5 μM 플루오로우라실 (5-FU)에의 시험관내 노출) 중 어느 것도 받지 않은 LoVo 세포와 비교하여; 및/또는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 화학적 스트레스 (예컨대, 약 48시간의 기간 동안 약 5 μM 플루오로우라실 (5-FU)에의 시험관내 노출)를 받지 않은 LoVo 세포와 비교하여, 적어도 1, 또는 2개의 마커 CD243 (MDR-1) 및 CD66 (CEA) - 바람직하게, 마커 CD243 (MDR-1)을 적어도 10% 더 많이, 바람직하게, 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 그 초과로 발현한다. 추가로 또는 대안적으로, 적어도 1, 또는 2개의 마커 CD243 (MDR-1) 및 CD66 (CEA) - 바람직하게, 마커 CD243 (MDR-1)은 고전적 조건하에서, 예컨대, 예로서, 10% FBS에서 배양되고, 시험관내에서 가해지는 (i) 대사 스트레스, 및 (ii) 화학적 스트레스(예컨대, 약 48시간의 기간 동안 약 5 μM 플루오로우라실 (5-FU)에의 시험관내 노출) 중 어느 것도 받지 않은 LoVo 세포 집단에서보다; 및/또는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 화학적 스트레스 (예컨대, 약 48시간의 기간 동안 약 5 μM 플루오로우라실 (5-FU)에의 시험관내 노출)를 받지 않은 LoVo 세포 집단에서보다 LoVo DS-B 세포 집단 중 적어도 10% 더 많은, 바람직하게, 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 그 초과의 세포에서 발현된다. 추가로 또는 대안적으로, 적어도 1, 또는 2개의 마커 CD243 (MDR-1) 및 CD66 (CEA) - 바람직하게, 마커 CD243 (MDR-1)에 대한 평균 형광 강도 (MFI)는 고전적 조건하에서, 예컨대, 예로서, 10% FBS에서 배양되고, 시험관내에서 가해지는 (i) 대사 스트레스, 및 (ii) 화학적 스트레스(예컨대, 약 48시간의 기간 동안 약 5 μM 플루오로우라실 (5-FU)에의 시험관내 노출) 중 어느 것도 받지 않은 LoVo 세포 집단에서보다; 및/또는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 화학적 스트레스 (예컨대, 약 48시간의 기간 동안 약 5 μM 플루오로우라실 (5-FU)에의 시험관내 노출)를 받지 않은 LoVo 세포 집단에서보다 LoVo DS-B 세포 집단에서 적어도 2배 더 높거나, 바람직하게, 적어도 3배, 4배, 5배, 6배 또는 그 초과로 더 높다.

한 실시양태에서, LoVo DS-B 세포는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 화학적 스트레스를 받지 않은 LoVo 세포와 비교하여 적어도 하나 또는 수개의 하기 단백질을 과다발현한다: 베타-2-당단백질 1, 히스톤 H2A 타입 1, 폴리(rC)-결합 단백질 2, 키넥틴, 플렉틴, 및 NADH 데히드로게나제 [유비퀴논] 1 알파 서브컴플렉스 서브유닛 7.

한 실시양태에서, LoVo DS-B 세포는 구체적으로 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 화학적 스트레스를 받지 않은 LoVo 세포와 비교하여 검출가능한 수준으로 적어도 하나 또는 수개의 하기 단백질을 발현한다: 베타-2-당단백질 1, 히스톤 H2A 타입 1, 및 폴리(rC)-결합 단백질 2.

한 실시양태에서, LoVo DS-B 세포는 대사 스트레스를 받되, 예컨대, 2% FBS 중에서 배양되되, 시험관내에서 가해지는 화학적 스트레스를 받지 않은 LoVo 세포와 비교하여 적어도 하나 또는 수개의 하기 막 및/또는 세포 표면 단백질을 과다발현한다: 핵공 막 당단백질 210, 레티큘론-4, NADPH--시토크롬 P450 리덕타제, 장쇄 지방산--CoA 리가제 3, 장쇄 지방산--CoA 리가제 4, 소포 연관 막 단백질 연관 단백질 A, 미토콘드리아 트리카르복실레이트 수송 단백질, 키넥틴, 소포 연관 막 단백질 연관 단백질 B/C, 초장쇄 (3R)-3-히드록시아실-CoA 데히드라타제 3, 소포 내재성-막 단백질 VIP36, 초장쇄 에노일-CoA 리덕타제, 마이크로솜 글루타티온 S-트랜스퍼라제 1, 시토크롬 b5 타입 B, 미토콘드리아 ATP 신타제 막 서브유닛 DAPIT, 미토콘드리아 ATP 신타제 서브유닛 f, 시토크롬 c 옥시다제 서브유닛 2, 미토콘드리아 헴 단백질 시토크롬 c1, HLA 클래스 I 조직적합성 항원 B 알파 쇄, 단백질 LYRIC, 모노카르복실레이트 수송체 1, 시토크롬 c 옥시다제 서브유닛 NDUFA4, 만노실-올리고사카라이드 글루코시다제, 신호 펩티다제 복합체 촉매성 서브유닛 SEC11A, 단백질 FAM162A, 막관통 emp24 도메인 함유 단백질 2, 레티놀 데히드로게나제 11, 에르린-1, BRI3-결합 단백질, 3-베타-히드록시스테로이드-델타(8),델타(7)-이소머라제, 수용체 발현 증강 단백질 5, CDGSH 철-황 도메인 함유 단백질 2, CD9 항원, 확장된 시냅토타그민-2, 초장쇄 아실-CoA 신테타제, 쿠니츠-타입 프로테아제 억제제 2, CD166 항원, 장쇄 지방산--CoA 리가제 1, 백혈구 표면 항원 CD47, 타파신, 및 베타-1,3-갈락토실-O-글리코실-당단백질 베타-1,6-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 3.

제조 방법

본 발명은 또한 상기 기술된 중간 조성물 제조 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 상기 기술된 중간 조성물 제조 방법은 하기 단계:

b) 단계 a)에서 배양된 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포에 대해 시험관내에서 하나 또는 수개의 스트레스[들]를 가하는 단계로서, 여기서 상기 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포는 하나 또는 수개의 스트레스[들]에 반응하여 저항성 기전[들]을 발생시켜 스트레스 단백질을 생산하는 것인 단계, 및

c) 스트레스성 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포를, 단계 b)에서 상기 세포가 생산한 스트레스 및/또는 저항성 단백질과 함께 회수하는 단계를 포함한다.

한 실시양태에서, 단계 a)는 고갈된 배지 (예컨대, 암 세포의 성장 및/또는 생존에 유용하거나 또는 심지어는 필수적인 하나 또는 수개의 물질이 부분적으로 또는 완전히 결여된 배지) 중, 저산소 상태하에, 및/또는 낮은 pH (예컨대, pH 6.5 미만)에서 수행된다. 한 실시양태에서, 단계 a)는 2% FBS 배양 배지 중 저혈청 배양 조건하에서 수행된다. 한 실시양태에서, 상기 고갈된 배지 중에서의 배양은 단계 b) 동안 유지된다.

단계 b)에서 가해진 스트레스는 상기에서 기술되었다.

한 실시양태에서, 단계 c)는 단계 b)의 완료 후 적어도 몇 시간, 바람직하게, 단계 b)의 완료 후 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96시간 이상 초과의 시간이 경과한 후에 수행된다. 이를 통해 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포는 확실하게 하나 또는 수개의 스트레스[들]에 반응하여 이의 저항성 기전[들]을 발생할 충분한 시간을 갖게 되고, 이로써, 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 생산할 충분한 시간을 갖게 된다.

한 실시양태에서, 본 방법은 추가로 단계 c)에서 모두 함께 회수된, 스트레스성 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포, 및 상기 세포가 생산한 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 면역원성으로 만들 수 있는 분자로, 또는 그러한 수단에 의해 처리하는 단계를 포함한다.

한 실시양태에서, 단계 d)는 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 면역원성을 부여할 수 있는 수단에 연결하거나, 또는 이와 복합체를 형성하는 것을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

면역원성을 부여할 수 있는 수단은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 한 실시양태에서, 면역원성을 부여할 수 있는 수단은 자연적으로는 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포에, 또는 이의 환경에 존재하지 않는 하나 또는 수개의 분자[들]를 포함하거나 또는 이로 구성된다. 이러한 수단은 상기에서 상세하게 설명되었고, 합텐을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

합텐의 예로는 2,4-디니트로페닐 (DNP); 2,4-디니트로플루오로벤젠; 술파닐산; N-아이오도아세틸-N'-(5-술포닐-나프틸)에틸렌 디아민; 아닐린; p-아미노 벤조산; 비오틴; 플루오레세인 및 이의 유도체 (FITC, TAMRA, 및 텍사스 레드 포함); 디곡시게닌; 5-니트로-3-피라졸카르바미드; 4,5-디메톡시-2-니트로신나미드; 2-(3,4-디메톡시페닐)-퀴놀린-4-카르바미드; 2,1,3-벤족사디아졸-5-카르바미드; 3-히드록시-2-퀴녹살린카르바미드, 4-(디메틸아미노)아조벤젠-4'-술폰아미드 (DABSYL); 로테논 이소옥사졸린; (E)-2-(2-(2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[b][1,4]디아제핀-4-일)페녹시)아세트아미드; 7-(디에틸아미노)-2-옥소-2H-크로멘-3-카르복실산; 2-아세트아미도-4-메틸-5-티아졸술폰아미드; 및 p-메톡시페닐피라조포도필아미드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

한 실시양태에서, 단계 d)는 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 합텐화하는 것을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 한 실시양태에서, 단계 d)는 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 2,4-디니트로페닐화하는 것 (즉, 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 2,4-디니트로페닐로 합텐화하는 것)을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

당업자는 스트레스 및/또는 저항성 단백질과 같은 단백질을 합텐화하는 수단 및 방법을 잘 알고 있다.

중간 조성물이 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포에 특이적인 종양 연관 항원 (TAA) 및/또는 종양-특이적 항원 (TSA)을 추가로 포함하는 한 실시양태에서, 단계 d)는 또한 스트레스 및/또는 저항성 단백질에 대하여 상기 기술된 것과 동일한 조건하에서 상기 TAA 및/또는 TSA를 면역원성을 부여할 수 있는 수단에 연결하거나, 또는 이와 복합체를 형성하는 것을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 방법은 추가로 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포를 비증식성으로 만들기 위해 상기 세포를 불활성화시키는 단계를 포함한다. 적용될 경우, 이 단계는 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포가 시험관내에서 가해진 스트레스[들]에 반응하여 이의 저항성 기전[들]을 발생시킨 후, 이로써, HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포가 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 생산한 후 언제든지 진행된다. 한 실시양태에서, HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포를 불활성화시키는 단계는 단계 b)의 완료 후 적어도 몇 시간, 바람직하게, 단계 b)의 완료 후 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96시간 이상 초과의 시간이 경과한 후에 수행된다. 한 실시양태에서, HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포를 불활성화시키는 단계는 단계 c) 완료 후에 수행된다. 한 실시양태에서, HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포를 불활성화시키는 단계는 적용될 경우, 단계 d) 완료 후에 수행된다.

당업자는 세포를 비증식성으로 만드는 수단 및 방법을 잘 알고 있다. 예로서, 세포를 사멸시키거나, 또는 불활성화시키기에 충분히 높은 선량의 방사선에 의해 세포를 비증식성으로 만들 수 있다. 한 실시양태에서, 세포를 비증식성으로 만드는 방사선은 25 Gy 이상의 총 선량으로 세포에 방사선을 조사하는 것을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 대안적으로 또는 추가로, 예컨대, 약 10% v/v 내지 약 50% v/v의 에탄올을 사용하여 에탄올 고정에 의해 세포를 비증식성으로 만들 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 적어도 1회의 냉동-해동 사이클에 의해 세포를 비증식성으로 만들 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 면역원성을 부여할 수 있는 수단에의 연결에 의해 또는 이와의 복합체 형성에 의해, 예컨대, 예로서, 합텐화에 의해 세포를 비증식성으로 만들 수 있다.

당업자는 또한 예컨대, (전체 증식 결함을 평가하기 위해) 세포 배양에 의해 및/또는 (살아 있는 세포와 죽은 세포를 구별하는) 프로피디움 아이오다이드에 의해 생존능 시험을 수행함으로써 세포가 비증식성인지 여부를 확인하는 수단 및 방법에 대해서도 잘 알고 있다.

한 실시양태에서, 본 방법은 (i) 스트레스성 HT-29 세포, 및 (ii) 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성되고, 여기서 스트레스 및/또는 저항성 단백질은 시험관내에서 가해진 (i) 대사 스트레스, (ii) 방사선 및 (iii) 열 스트레스에 대한 반응으로 상기 HT-29 세포에 의해 생산된 것인 중간 조성물 "HT-29 DS-A"를 제조하기 위한 것이다.

본 실시양태에서, 본 방법의 단계 b)는 본 방법의 단계 a)에서 배양된 HT-29 세포에 대해 시험관내에서 하기 스트레스: 대사 스트레스, 방사선 및 열 스트레스를 가하는 것을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 방사선, 열 스트레스 및 대사 스트레스는 상기에서 기술되었다.

본 실시양태에서, 본 방법의 단계 b)는 본 방법의 단계 a)에서 배양된 HT-29 세포에 대해 시험관내에서 하기 스트레스:

(ii) 약 0.25 내지 약 25 Gy, 바람직하게, 약 1 내지 약 15 Gy 범위의 총 선량, 예컨대, 예로서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 Gy의 총 선량의 시험관내 방사선. 한 실시양태에서, 방사선 조사 기간은 약 1 내지 약 20분 범위, 예컨대, 예로서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20분, 바람직하게, 약 1 내지 약 5분이고;

(iii) 약 15분 내지 약 4시간, 바람직하게, 약 30분 내지 약 2시간 범위의 기간 동안, 예컨대, 예로서, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 또는 120분 동안 세포에 가해지는 약 38℃ 내지 약 45℃ 범위의 온도, 예컨대, 예로서, 약 38℃, 39℃, 40℃, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃, 또는 45℃의 온도에서의 시험관내 열 충격을 가하는 것을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

(iii) 약 60분의 기간 동안 약 42℃ 온도에서의 시험관내 열 충격을 가하는 것을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

한 실시양태에서, (i) 하의 스트레스는 단계 b)의 전기간에 걸쳐 가해진다. 한 실시양태에서, (iii) 하의 스트레스는 (i) 하의 스트레스를 유지하면서, (ii) 하의 스트레스 후 즉시 또는 직후, 예컨대, 예로서, (ii) 하의 스트레스 종료 후 10분, 20분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 또는 3시간 이내에 가해진다.

한 실시양태에서, 본 방법은 (i) 스트레스성 HCT-116 세포, 및 (ii) 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성되고, 여기서 스트레스 및/또는 저항성 단백질은 시험관내에서 가해진 (i) 대사 스트레스, (ii) 방사선 및 (iii) 열 스트레스에 대한 반응으로 상기 HCT-116 세포에 의해 생산된 것인 중간 조성물 "HCT-116 DS -A"를 제조하기 위한 것이다.

본 실시양태에서, 본 방법의 단계 b)는 본 방법의 단계 a)에서 배양된 HCT-116 세포에 대해 시험관내에서 하기 스트레스: 대사 스트레스, 방사선 및 열 스트레스를 가하는 것을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 방사선, 열 스트레스 및 대사 스트레스는 상기에서 기술되었다.

본 실시양태에서, 본 방법의 단계 b)는 본 방법의 단계 a)에서 배양된 HCT-116 세포에 대해 시험관내에서 하기 스트레스:

한 실시양태에서, 본 방법은 (i) 스트레스성 LoVo 세포, 및 (ii) 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성되고, 여기서 스트레스 및/또는 저항성 단백질은 시험관내에서 가해진 (i) 대사 스트레스, (ii) 방사선 및 (iii) 열 스트레스에 대한 반응으로 상기 LoVo 세포에 의해 생산된 것인 중간 조성물 "LoVo DS -A"를 제조하기 위한 것이다.

본 실시양태에서, 본 방법의 단계 b)는 본 방법의 단계 a)에서 배양된 LoVo 세포에 대해 시험관내에서 하기 스트레스: 대사 스트레스, 방사선 및 열 스트레스를 가하는 것을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 방사선, 열 스트레스 및 대사 스트레스는 상기에서 기술되었다.

본 실시양태에서, 본 방법의 단계 b)는 본 방법의 단계 a)에서 배양된 LoVo 세포에 대해 시험관내에서 하기 스트레스:

한 실시양태에서, 본 방법은 (i) 스트레스성 HT-29 세포, 및 (ii) 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성되고, 여기서 스트레스 및/또는 저항성 단백질은 시험관내에서 가해진 (i) 대사 스트레스, 및 (ii) 화학적 스트레스에 대한 반응으로 상기 HT-29 세포에 의해 생산된 것인 중간 조성물 "HT-29 DS -B"를 제조하기 위한 것이다.

본 실시양태에서, 본 방법의 단계 b)는 본 방법의 단계 a)에서 배양된 HT-29 세포에 대해 시험관내에서 하기 스트레스: 대사 스트레스 및 화학적 스트레스를 가하는 것을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 화학적 스트레스 및 대사 스트레스는 상기에서 기술되었다.

(ii) 약 6시간 내지 약 120시간, 바람직하게, 약 24시간 내지 약 96시간 범위의 기간 동안, 예컨대, 예로서, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 또는 96시간 동안 적어도 하나 또는 수개의 화학요법제 및/또는 알콜에의 시험관내 노출을 가하는 것을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

(ii) 약 72시간의 기간 동안 약 13 μM 옥살리플라틴에의 시험관내 노출을 가하는 것을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

한 실시양태에서, (i) 하의 스트레스는 단계 b)의 전기간에 걸쳐 가해진다. 한 실시양태에서, (ii) 하의 스트레스는 (i) 하의 스트레스를 유지하면서 가해진다.

한 실시양태에서, 본 방법은 (i) 스트레스성 HCT-116 세포, 및 (ii) 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성되고, 여기서 스트레스 및/또는 저항성 단백질은 시험관내에서 가해진 (i) 대사 스트레스, 및 (ii) 화학적 스트레스에 대한 반응으로 상기 HCT-116 세포에 의해 생산된 것인 중간 조성물 "HCT-116 DS -B"를 제조하기 위한 것이다.

본 실시양태에서, 본 방법의 단계 b)는 본 방법의 단계 a)에서 배양된 HCT-116 세포에 대해 시험관내에서 하기 스트레스: 대사 스트레스 및 화학적 스트레스를 가하는 것을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 화학적 스트레스 및 대사 스트레스는 상기에서 기술되었다.

(ii) 약 48시간의 기간 동안 약 31.5 nM, 100 nM 또는 315 nM SN-38 (7-에틸-10-히드록시-캄프토테신)에의 시험관내 노출을 가하는 것을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

한 실시양태에서, 본 방법은 (i) 스트레스성 LoVo 세포, 및 (ii) 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성되고, 여기서 스트레스 및/또는 저항성 단백질은 시험관내에서 가해진 (i) 대사 스트레스, 및 (ii) 화학적 스트레스에 대한 반응으로 상기 LoVo 세포에 의해 생산된 것인 중간 조성물 "LoVo DS-B"를 제조하기 위한 것이다.

본 실시양태에서, 본 방법의 단계 b)는 본 방법의 단계 a)에서 배양된 LoVo 세포에 대해 시험관내에서 하기 스트레스: 대사 스트레스 및 화학적 스트레스를 가하는 것을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 화학적 스트레스 및 대사 스트레스는 상기에서 기술되었다.

(ii) 약 48시간의 기간 동안 약 5 μM 플루오로우라실 (5-FU)에의 시험관내 노출을 가하는 것을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

본 발명은 또한 상기 기술된 바와 같은, (i) 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포, 및 (ii) 면역원성 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성되는 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 최종 조성물은 본원에서 "DP"로 지칭된다.

한 실시양태에서, 상기 기술된 바와 같은, (i) 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포, 및 (ii) 면역원성 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성되는 조성물을 제조하는 방법은 하기 단계:

a) 상기 기술된 중간 조성물 제조 방법을 사용하여 HT-29 DS-A, HCT-116 DS-A, LoVo DS-A, HT-29 DS-B, HCT-116 DS-B 및 LoVo DS-B 중간 조성물을 수득하는 단계; 및

b) HT-29 DS-A, HCT-116 DS-A, LoVo DS-A, HT-29 DS-B, HCT-116 DS-B 및 LoVo DS-B 중간 조성물을 함께 혼합하는 단계를 포함한다.

한 실시양태에서, 단계 b)는 6개의 중간 조성물을 조성물 1 mL당 약 10⁶ 내지 약 10⁹개의 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포, 바람직하게, 조성물 1 mL당 약 10⁷ 내지 약 10⁸개의 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포, 예컨대, 조성물 1 mL당 약 1 x 10⁷, 2 x 10⁷, 3 x 10⁷, 4 x 10⁷, 5 x 10⁷, 6 x 10⁷, 7 x 10⁷, 8 x 10⁷, 9 x 10⁷, 또는 1 x 10⁸개의 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포인 최종 농도로 혼합하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 단계 b)는 6개의 중간 조성물을 조성물 1 mL당 약 3 x 10⁷개의 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포인 최종 농도로 혼합하는 것을 포함한다.

한 실시양태에서, 단계 b)는 6개의 중간 조성물을 동일한 비의 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포 (즉, 약 1:1:1:1:1:1)로 혼합하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 단계 b)는 6개의 중간 조성물을, 스트레스성 HT-29가 스트레스성 HCT-116 또는 LoVo 세포보다 적어도 1.5, 2 또는 2.5배 더 많은 것을 포함하거나 또는 이로 구성되는 비로 혼합하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 단계 b)는 6개의 중간 조성물을, 스트레스성 HCT-116이 스트레스성 HT-29 또는 LoVo 세포보다 적어도 1.5, 2 또는 2.5배 더 많은 것을 포함하거나 또는 이로 구성되는 비로 혼합하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 단계 b)는 6개의 중간 조성물을, 스트레스성 LoVo가 스트레스성 HT-29 또는 HCT-116 세포보다 적어도 1.5, 2 또는 2.5배 더 많은 것을 포함하거나 또는 이로 구성되는 비로 혼합하는 것을 포함한다.

한 실시양태에서, 단계 b)는

- 약 10⁵ 내지 약 10⁸개의 스트레스성 HT-29 세포 (HT-29 DS-A 및 HT-29 DS-B로부터), 바람직하게, 약 10⁶ 내지 약 10⁷개의 스트레스성 HT-29 세포, 예컨대, 약 1 x 10⁶, 2 x 10⁶, 3 x 10⁶, 4 x 10⁶, 5 x 10⁶, 6 x 10⁶, 7 x 10⁶, 8 x 10⁶, 9 x 10⁶, 또는 1 x 10⁷개의 스트레스성 HT-29 세포,

- 약 10⁵ 내지 약 10⁸개의 스트레스성 HCT-116 세포 (HCT-116 DS-A 및 HCT-116 DS-B로부터), 바람직하게, 약 10⁶ 내지 약 10⁷개의 스트레스성 HCT-116 세포, 예컨대, 약 1 x 10⁶, 2 x 10⁶, 3 x 10⁶, 4 x 10⁶, 5 x 10⁶, 6 x 10⁶, 7 x 10⁶, 8 x 10⁶, 9 x 10⁶, 또는 1 x 10⁷개의 스트레스성 HCT-116 세포, 및

- 약 10⁵ 내지 약 10⁸개의 스트레스성 LoVo 세포 (LoVo DS-A 및 LoVo DS-B로부터), 바람직하게, 약 10⁶ 내지 약 10⁷개의 스트레스성 LoVo 세포, 예컨대, 약 1 x 10⁶, 2 x 10⁶, 3 x 10⁶, 4 x 10⁶, 5 x 10⁶, 6 x 10⁶, 7 x 10⁶, 8 x 10⁶, 9 x 10⁶, 또는 1 x 10⁷개의 스트레스성 LoVo 세포를 함께 혼합하는 것을 포함한다.

치료적 용도 및 방법

본 발명은 또한 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 본원 상기에서 정의된 바와 같은, (i) 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포, 및 (ii) 시험관내에서 가해진 스트레스에 반응하여 상기 세포에 의해 생산되는 면역원성 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성되는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 암 치료에서 사용하기 위한, 본원 상기에서 정의된 바와 같은, (i) 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포, 및 (ii) 시험관내에서 가해진 스트레스에 반응하여 상기 세포에 의해 생산되는 면역원성 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성되는 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 암의 치료를 위한, 본원 상기에서 정의된 바와 같은, (i) 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포, 및 (ii) 시험관내에서 가해진 스트레스에 반응하여 상기 세포에 의해 생산되는 면역원성 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성되는 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 암 치료용 의약 제조를 위한, 본원 상기에서 정의된 바와 같은, (i) 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포, 및 (ii) 시험관내에서 가해진 스트레스에 반응하여 상기 세포에 의해 생산되는 면역원성 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성되는 조성물의 용도에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 암 치료는 상기 암으로부터의 암 세포에 대한 면역 반응을 유도하는 것을 포함한다.

암의 예로는 질병 및 관련 건강 문제의 국제 통계 분류(International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems: ICD)의 제10차 개정판 챕터 II의 블록 C00부터 D48에 열거되어 있는 것을 포함한다.

암의 추가 예로는 재발성, 전이성 또는 다중 약물 내성 암을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

암의 추가 예로는 선섬유종(adenofibroma), 선종(adenoma), 원인 불명의 골수화생(agnogenic 골수양 metaplasia), AIDS 관련 악성종양, 법랑모세포종(ameloblastoma), 항문암, 혈관여포성 종격 림프절 증식증(angiofollicular mediastinal lymph node hyperplasia), 혈관각화종(angiokeratoma), 호산구증가증을 동반한 혈관림프성 증식증(angiolymphoid hyperplasia with eosinophilia), 혈관종증(angiomatosis), 무수성 외배엽 이형성증(anhidrotic ectodermal dysplasia), 안면 이형성증(anterofacial dysplasia), 아포크린 화생(apocrine metaplasia), 무음종(apudoma), 질식성 흉부 이형성증(asphyxiating thoracic dysplasia), 성상 세포종(astrocytoma) (예컨대, 소뇌 성상세포종 및 대뇌 성상세포종 포함), 심방수지 이형성증(atriodigital dysplasia), 비정형 멜라닌세포 증식증(atypical melanocytic hyperplasia), 비정형 화생(atypical metaplasia), 자가실질화생(autoparenchymatous metaplasia), 기저 세포 증식증(basal cell hyperplasia), 양성 거대 림프절 증식증(양성 giant lymph node hyperplasia), 담관암 (예컨대, 간외 담관암 포함), 방광암, 골암, 뇌종양 (예컨대, 뇌간 신경교종, 소뇌 성상세포종 신경교종, 악성 신경교종, 천막상 원시 신경외배엽 종양(supratentorial primitive neuroectodermal tumor), 시각 경로 및 시상하부 신경교종, 뇌실막종(ependymoma), 수모세포종(medulloblastoma), 임신 융모성 종양 신경교종(gestational trophoblastic tumor glioma) 및 부신경절종(paraganglioma) 포함), 브란키오니아(branchionia), 여성 유방 암, 남성 유방암, 기관지 선종/카르시노이드(carcinoid), 기관지폐 이형성증(bronchopulmonary dysplasia), 상피 세포의 암 성장, 상피 세포의 전암성 성장, 상피 세포의 전이성 성장, 카르시노이드 심장 질환, 카르시노이드 종양 (예컨대, 위장관 카르시노이드 종양 포함), 암종 (예컨대, 원발성 불명의 암종, 부신피질 암종, 섬 세포 암종, 선암종, 선피질 암종, 기저 세포 암종, 기저편평암종, 기관지 암종, 브라운 피어스 암종(Brown-Pearce carcinoma), 낭선암종, 유관 암종, 간암종, 크렙스 암종(Krebs carcinoma), 유두암종, 귀리 세포 암종, 소세포 폐암종, 비소세포 폐암종, 편평세포암종, 이행 세포 암종, 워커 암종(Walker carcinoma), 메르켈세포 암종(Merkel cell carcinoma), 피부 암종 포함), 시멘트종(cementoma), 시멘트질 증식증(cementum hyperplasia), 뇌 이형성증(cerebral dysplasia), 자궁경부암, 자궁경부 이형성증, 담관종(cholangioma), 진주종(cholesteatoma), 연골모세포종(chondroblastoma), 연골외배엽 이형성증(chondroectodermal dysplasia), 척색종(chordoma), 융모종(choristoma), 만성종(chrondroma), 경추두개 이형성증(cleidocranial dysplasia), 결장 선암종, 결장암, 결장 암종, 결장직장 선암종, 결장직장암, 결장직장 암종, 국소 전이된 결장직장암, 선천성 부신 증식증, 선천성 외배엽 이형성증, 선천성 피지선 증식증, 결합 조직 화생, 두개골 족근 이형성증(craniocarpotarsal dysplasia), 두개골간 이형성증(craniodiaphysial dysplasia), 두개골골간단형성이상(craniometaphysial dysplasia), 두개인두종(craniopharyngioma), 원통종(cylindroma), 낭선종(cystadenoma), 낭포성 증식증 (예컨대, 유방의 낭포성 증식증 포함), 엽상 낭육종(cystosarcoma phyllodes), 상아질 이형성증, 의치 증식증, 골간 이형성증, 관 증식증, 디스게니노마(dysgenninoma), 편측성 골단 이형성증(dysplasia epiphysialis hemimelia), 다발성 골단 이형성증(dysplasia epiphysialis multiplex), 점상 골단 이형성증(dysplasia epiphysialis punctate), 외배엽 이형성증(ectodermal dysplasia), 에를리히 종양(Ehrlich tumor), 에나멜 이형성증(enamel dysplasia), 뇌안구 이형성증(encephaloophthalmic dysplasia), 자궁내막암 (예컨대, 뇌실막종 및 자궁내막 증식증 포함), 뇌실막종, 상피암, 상피 이형성증, 상피 화생, 식도암, 유잉 계열 종양 (예컨대, 유잉 육종 포함), 간외 담관암, 안구암 (예컨대, 안내 흑색종 및 망막모세포종 포함), 안면수지생식기 이형성증(faciodigitogenital dysplasia), 턱의 가족성 섬유성 이형성증, 가족성 백색 굴곡 이형성증(familial white folded dysplasia), 섬유종, 섬유근 이형성증, 섬유근 증식증, 뼈의 섬유성 이형성증, 불화골성 이형성증(florid osseous dysplasia), 국소 상피 증식증, 담낭암, 신경절신경종, 위암 (예컨대, 위암 포함), 위장관 카르시노이드 종양, 위장관암, 위장관 종양, 고셔병(Gaucher's disease), 생식 세포 종양 (예컨대, 두개외 생식 세포 종양, 생식선외 생식 세포 종양 및 난소 생식 세포 종양 포함), 거대 세포 종양, 치은 증식증(gingival hyperplasia), 교모세포종, 사구체종, 과립막 세포 종양, 부인과모세포종, 과오종(hamartoma), 두부경부암, 혈관내피종, 혈관종, 혈관주위세포종, 간세포암, 간종양, 유전성 신장-망막 이형성증, 발한성 외배엽 이형성증(hidrotic ectodermal dysplasia), 조직구긴장증, 조직구증가증, 고감마글로불린혈증, 저한증성 외배엽 이형성증, 하인두암, 염증성 섬유 증식증, 염증성 유두상 증식증, 장암, 장상 화생, 장 폴립, 안구내 흑색종, 혈관내 유두상 내피 증식증, 신장암, 후두암, 평활근종, 백혈병 (예컨대, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수양 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 급성 모발 세포 백혈병, 급성 B 세포 백혈병, 급성 T 세포 백혈병, 급성 HTLV 백혈병, 만성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수양 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 모발 세포 백혈병, 만성 B 세포 백혈병, 만성 T 세포 백혈병, 및 만성 HTLV 백혈병 포함), 레이디히 세포 종양(Leydig cell tumor), 입술 및 구강암, 지방종, 간암, 폐암 (예컨대, 소세포 폐암 및 비소세포 폐암 포함), 림프관근종(lymphangiomyoma), 림프관종(lymphaugioma), 림프종 (예컨대, AIDS 관련 림프종, 중추신경계 림프종, 원발성 중추신경계 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 임신 중 호지킨 림프종, 임신 중 비-호지킨 림프종, 비만세포 림프종, B 세포 림프종, 선림프종, 버킷 림프종, 피부 T 세포 림프종, 대세포 림프종, 소세포 림프종), 림프구 감소성 흉선 이형성증(lymphopenic thymic dysplasia), 림프증식성 장애, 거대글로불린혈증 (예컨대, 발덴스트롬 거대글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia) 포함), 악성 카르시노이드 증후군, 악성 중피종, 악성 흉선종, 유방 이형성증, 하악 안면 이형성증(mandibulofacial dysplasia), 수모세포종(medulloblastoma), 수막종(meningioma), 간엽종(mesenchymoma), 중신종(mesonephroma), 중피종(mesothelioma) (예컨대, 악성 중피종 포함), 골간단 이형성증(metaphysial dysplasia), 화생성 빈혈, 화생성 골화, 화생성 폴립, 전이성 편평 경부암 (예컨대, 잠복 원발성을 동반한 전이성 편평 경부암), 몬디니 이형성증(Mondini dysplasia), 단골 섬유성 이형성증, 점막상피 이형성증, 다발 내분비 신생물 증후군, 다발성 골단 이형성증, 다발성 골수종/형질 세포 신생물, 균상식육종(mycosis fungoides), 골수이형성 증후군, 골수양 화생, 골수증식성 장애, 만성 골수증식성 장애, 근모세포종, 근종, 점액종, 비강 및 부비동암, 비인두암, 전립선 신생물, 결장 신생물, 복부 신생물, 뼈 신생물, 유방 신생물, 소화계 신생물, 간 신생물, 췌장 신생물, 복막 신생물, 내분비선 신생물 (예컨대, 부신 신생물, 부갑상선 신생물, 뇌하수체 신생물, 고환 신생물, 난소 신생물, 흉선 신생물 및 갑상선 신생물 포함), 눈 신생물, 두부경부 신생물, 신경계 신생물 (예컨대, 중추신경계 신생물 및 말초신경계 신생물 포함), 림프계 신생물, 골반 신생물, 피부 신생물, 연조직 신생물, 비장 신생물, 흉부 신생물, 비뇨생식기 종양, 신경종양, 신경모세포종, 신경상피종, 신경섬유종, 신경섬유종증, 신경종, 전립선의 결절성 증식증, 결절성 재생 증식증, 안구척추이형성증(oculoauriculovertebral dysplasia), 눈치아수지 이형성증(oculodentodigital dysplasia), 눈척추 이형성증(oculovertebral dysplasia), 치성 이형성증(odontogenic dysplasia), 치아종(odontoma), 눈하악골 이형성증(opthalmomandibulomelic dysplasia), 구인두암, 골종, 난소암 (예컨대, 난소 상피암 및 난소 저악성 잠재성 종양 포함), 췌장암 (예컨대, 섬 세포 췌장암 및 외분비 췌장암), 유두종, 부신경절종(paraganglioma), 비크로마핀 부신경절종(nonchromaffin paraganglioma), 부비동 및 비강암, 부단백혈증, 부갑상선암, 근첨부 시멘트질 이형성증(periapical cemental dysplasia), 크롬친화세포종(pheochromocytoma) (예컨대, 음경암 포함), 송과체 및 천막상 원시 신경외배엽 종양(pineal and supratentorial primitive neuroectodermal tumor), 송과체종(pinealoma), 뇌하수체 종양, 형질 세포 신생물/다발성 골수종, 형질세포종, 흉막폐 모세포종, 다골 섬유성 이형성증, 폴립, 임신암, 전-신생물성 장애 (예컨대, 양성 증식부전(dysproliferative) 장애, 예컨대, 양성 종양, 섬유낭성 병태, 조직 비대, 장 폴립, 결장 폴립, 식도 이형성증, 백반증, 각화증, 보웬병(Bowen's disease), 농부 피부(Farmer's skin), 일광 구순염(solar cheilitis), 및 일광 각화증 포함), 원발성 간세포암, 원발성 간암, 원발성 골수양 화생, 전립선암, 가성연골형성 척추골단층 이형성증(pseudoachondroplastic spondyloepiphysial dysplasia), 가성상피종 증식증(pseudoepitheliomatous hyperplasia), 자반증, 직장암, 신장암 (예컨대, 신장암, 신우암, 요관암, 신우 및 요관의 이행세포 암 포함), 세망내피증, 망막 이형성증, 망막모세포종, 타액선암, 육종 (예컨대, 자궁 육종, 연조직 육종, 암육종, 연골육종, 섬유육종, 혈관육종, 카포시 육종, 평활근육종, 지방육종, 림프관육종, 근육종, 점액육종, 횡문근육종, 유육종증 육종, 골육종, 유잉육종, 뼈의 악성 섬유성 조직구종, 건초의 투명 세포 육종(clear cell sarcoma of tendon sheaths)), 경화혈관종(sclerosing angioma), 이차성 골수양 화생, 노인성 피지과다증, 패혈증 이형성증, 세르톨리 세포 종양(Sertoli cell tumor), 세자리 증후군(Sezary syndrome), 피부암 (예컨대, 흑색종 피부암 및 비-흑색종 피부암 포함), 소장암, 척추 골단 이형성증(spondyloepiphysial dysplasia), 편평 상피화생(squamous metaplasia) (예컨대, 양막의 편평 상피화생 포함), 위암, 천막상 원시 신경외배엽(supratentorial primitive neuroectodermal) 및 송과체 종양, 천막상 원시 신경외배엽 종양, 증상성 골수양 화생, 기형종(teratoma), 고환암, 난포막 세포 종양, 흉선종 (예컨대, 악성 흉선종 포함), 갑상선암, 융모성 종양 (예컨대, 임신 융모성 종양 포함), 요관암, 요도암, 자궁암, 질암, 심실방사선 이형성증(ventriculoradial dysplasia), 사마귀 증식증(verrucous hyperplasia), 외음부암, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia) 및 윌름스 종양(Wilms' tumor)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다

한 실시양태에서, 암은 신장암, 간암, 췌장암, 자궁내막암, 결장직장암, 난소암, 유방암, 폐암, 두부경부암, 자궁경부암, 흑색종 및 신경교종을 포함하거나 또는 이로 구성된 군으로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 암은 결장 선암종, 결장암, 결장 암종, 결장직장 선암종, 결장직장암, 및 결장직장 암종을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 결장암 및 결장직장암을 포함하거나 또는 이로 구성된 군으로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 조성물은 1회 투여되거나 또는 투여될 것이다. 한 실시양태에서, 조성물은 수회, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15회 또는 그 초과로; 또는 암이 치료될 때까지 무기한으로 투여되거나 또는 투여될 것이다.

한 실시양태에서, 조성물은 매주, 2주마다, 3주마다, 매월, 2개월마다, 3개월마다, 6개월마다, 매년 투여되거나 또는 투여될 것이다.

한 실시양태에서, 조성물은 유도 또는 볼루스 요법으로 처음 몇 주 동안, 예컨대, 처음 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10주 또는 그 초과의 기간 동안, 바람직하게, 처음 6 내지 8주 동안 매주, 2주마다, 3주마다, 매월, 바람직하게, 매주 투여되거나 또는 투여될 것이다.

한 실시양태에서, 조성물은 부스트 요법으로서 유도 또는 볼루스 요법 후 매월, 2개월마다, 3개월마다, 6개월마다, 매년 투여되거나 또는 투여될 것이다.

한 실시양태에서, 조성물은 처음 6 내지 8주 동안 매주; 이어서, 약 1개월 후; 이어서, 약 3개월 후; 이어서, 암이 치료될 때까지 매 6개월마다 투여되거나 또는 투여될 것이다.

한 실시양태에서, 조성물은 약 10⁵ 내지 약 10⁸개의 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포, 바람직하게, 약 10⁶ 내지 약 10⁷개의 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포 범위의 총 용량, 예컨대, 약 1 x 10⁶, 2 x 10⁶, 3 x 10⁶, 4 x 10⁶, 5 x 10⁶, 6 x 10⁶, 7 x 10⁶, 8 x 10⁶, 9 x 10⁶, 또는 1 x 10⁷개의 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포의 총 용량으로 투여되거나 또는 투여될 것이다.

한 실시양태에서, 조성물은 단일 용량으로 투여되거나 또는 투여될 것이다.

한 실시양태에서, 조성물은 적어도 2회 용량, 예컨대, 2, 3, 4, 5회 또는 그 초과의 용량으로 투여되거나 또는 투여될 것이다.

한 실시양태에서, 조성물은 약 3 x 10⁶개의 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포의 총 용량으로 투여되거나 또는 투여될 것이다. 한 실시양태에서, 조성물은 약 6 x 10⁶개의 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포의 총 용량으로 투여되거나 또는 투여될 것이다. 한 실시양태에서, 조성물은 6 x 10⁶개의 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포의 단일 용량으로, 또는 3 x 10⁶개의 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포의 2회 용량으로 투여되거나 또는 투여될 것이다.

한 실시양태에서, 조성물은 약 10 ㎕ 내지 약 1 mL 범위의 부피로, 예컨대, 약 10 ㎕, 50 ㎕, 100 ㎕, 200 ㎕, 300 ㎕, 400 ㎕, 500 ㎕, 600 ㎕, 700 ㎕, 800 ㎕, 900 ㎕, 또는 1 mL의 부피로, 바람직하게, 약 100 ㎕의 부피로 투여되거나 또는 투여될 것이다.

한 실시양태에서, 조성물은 전신 투여되거나 또는 투여될 것이다. 한 실시양태에서, 조성물은 주사에 의해, 바람직하게, 전신 주사에 의해 투여되거나 또는 투여될 것이다.

전신 주사의 예로는 정맥내 (iv), 피하 (sq), 진피내 (id), 근육내 (im), 동맥내, 비경구내, 결절내, 림프내, 복강내 (ip), 두개내, 심장내, 병변내, 전립선 내, 질내, 직장내, 척수강내, 비내, 종양내 (it), 소포내 및 관류를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

한 실시양태에서, 조성물은 진피내, 피하, 종양내 또는 정맥내로 투여되거나 또는 투여될 것이다.

한 실시양태에서, 조성물은 진피내로 투여되거나 또는 투여될 것이다.

본 발명에서는 다른 적합한 투여 경로 또한 고려되며, 투여 모드는 궁극적으로 타당한 의학적 판단의 범주 내에서 주치의에 의해 결정될 것이라는 것을 이해할 것이다.

한 실시양태에서, 조성물은 대상체에게 적어도 하나의 추가 요법 전, 이와 동시에, 또는 그 후에 투여되거나 또는 투여될 것이다.

적합한 추가 요법의 예로는 상기 정의된 화학요법제, 방사선 요법 및 면역자극제를 포함한다.

방사선 요법의 적합한 예로는 외부 빔 방사선 요법 (예컨대, 예로서, 표면 X선 요법, 직교전압 X선 요법, 메가전압 X선 요법, 방사선수술, 정위 방사선 요법, 코발트 요법, 전자 요법, 고속 중성자 요법, 중성자 포획 요법, 양성자 요법 등); 근접치료; 비밀봉선원 방사선요법; 토모테라피를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

면역자극제의 적합한 예로는 해부 치료 화학 분류 체계(Anatomical Therapeutic Chemical Classification System)의 서브그룹 L03 하에 기술된 것을 포함한다. 면역자극제의 추가 예로는 사이토카인 (예컨대, 예로서, 필그라스팀, 페그필그라스팀, 레노그라스팀, 몰그라모스팀, 사르그라모스팀, 안세스팀, 알빈터페론, 인터페론 알파 천연, 인터페론 알파 2a, 페그인터페론 알파-2a, 인터페론 알파 2b, 페그인터페론 알파-2b, 인터페론 알파 n1, 인터페론 알파콘-1, 인터페론 알파-n3, 인터페론 베타 천연, 인터페론 베타 1a, 인터페론 베타 1b, 인터페론 감마, 알데스루킨, 오프레베킨 등); 면역 체크포인트 억제제 (예컨대, 예로서, 알데스루킨, 오프레베킨 등); 면역 체크포인트 억제제의 억제제, 및/또는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, AMP-224, MPDL3280A, MDX-1105, MEDI-4736, 아레루맙, 이필리무맙, 트레멜리무맙, 피딜리주맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우레루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 바릴루맙, 아벨루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360 등을 비롯한 IDO); 톨-유사 수용체 효능제 (예컨대, 예로서, 부프레노르핀, 카르바마제핀, 에탄올, 펜타닐, GS-9620, 이미퀴모드, 레피톨리모드, 레보르파놀, 메타돈, 모르핀, (+)-모르핀, 모르핀-3-글루쿠로니드, 옥스카르바제핀, 옥시코돈, 페티딘, 레시퀴모드, SD-101, 타펜타돌, 틸소톨리모드, VTX-2337, 크립토코커스(Cryptococcus)의 글루쿠론옥시로만난, 마이코플라스마(Mycoplasma)로부터의 MALP-2, 마이코플라스마의 MALP 404, 보렐리아(Borrelia)로부터의 OspA, 네이세리아(Neisseria) 또는 헤모필루스(Haemophilus)로부터의 포린, hsp60, 헤마글루티닌, 예르시니아(Yersinia)로부터의 LcrV, 박테리아 플라젤린, 지질다당류, 리포테이코산, 마이코박테리움(Mycobacterium)으로부터의 리포만난, 글리코실포스파티딜이노시톨, 리소포스파티딜세린, 리슈마니아(Leishmania)로부터의 리포포스포글리칸, 사카로마이세스(Saccharomyces)로부터의 자이모산, Pam2CGDPKHPKSF, Pam3CSK4, CpG 올리고데옥시뉴클레오티드, 폴리(I:C) 핵산 서열, 폴리(A:U) 핵산 서열, 이중 가닥 바이러스 RNA 등); STING 수용체 효능제 (예컨대, 예로서, WO2017100305의 §0240에 기술되어 있는 것, 바디메잔, CL656, ADU-S100, 3'3'-cGAMP, 2'3'-cGAMP, ML RR-S2 CDG, ML RR-S2 cGAMP, 사이클릭 디-GMP, DMXAA, DiABZI 등); CD1 리간드; 성장 호르몬; 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF); 면역시아닌; 페가데마제; 프로락틴; 타소네르민; 여성 성 스테로이드; 히스타민 디히드로클로라이드; 폴리ICLC; 비타민 D; 렌티난; 플레릭사포; 로퀴니멕스; 미파무르티드; 글라티라머 아세테이트; 티모펜틴; 티모신 α1; 티뮬린; 폴리이노신산:폴리시티딜산; 피도티모드; 바실러스 칼메트 게랭(Bacillus Calmette-Guerin); 흑색종 백신; 시푸류셀-T 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

한 실시양태에서, 조성물은 화학요법제, 예컨대, 예로서, 시클로포스파미드의 투여 후에 대상체에게 투여될 수 있다.

추가로 또는 대안적으로, 조성물은 면역자극제, 예컨대, 예로서, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM CSF)의 투여와 동시에 대상체에게 투여될 수 있다.

부품들의 키트

본 발명은 또한 부품 키트에 관한 것이다.

"패키지," "상업적 패키지," 또는 "제약 패키지"로도 또한 명명되는 "부품들의 키트"라는 용어는 개별 보관 및/또는 사용을 목적으로 하지만, 서로 기능적으로 관련이 있는, 물리적으로 분리되어 있는 성분의 엔티티를 포함하여야 한다. 특히, "부품들의 키트"라는 용어는 전형적으로 반드시 그러한 것은 아니지만, 수 시간에서 수일, 수주 또는 그 초과의 범위로 주어진 시간 간격을 두고 별개로 임의의 순서로; 또는 동시에 즉석 제제로서 또는 개별적으로 수 초에서 수 분 또는 수 시간 범위의 시간 간격 이내에 임의의 순서로 사용되거나 투여되는 물리적으로 분리되어 있는 성분의 엔티티를 포함한다.

한 실시양태에서, 부품들의 키트는

- 상기 정의된 바와 같은 "HT-29 DS -A"로 명명되는 중간 조성물;

- 상기 정의된 바와 같은 "HCT-116 DS -A"로 명명되는 중간 조성물; 및

- 상기 정의된 바와 같은 "LoVo DS -A"로 명명되는 중간 조성물을 포함한다.

한 실시양태에서, 부품들의 키트는

- 상기 정의된 바와 같은 "HT-29 DS -B"로 명명되는 중간 조성물;

- 상기 정의된 바와 같은 "HCT-116 DS -B"로 명명되는 중간 조성물; 및

- 상기 정의된 바와 같은 "LoVo DS -B"로 명명되는 중간 조성물을 포함한다.

한 실시양태에서, 부품들의 키트는

- 상기 정의된 바와 같은 "HCT-116 DS -A"로 명명되는 중간 조성물;

- 상기 정의된 바와 같은 "LoVo DS -A"로 명명되는 중간 조성물

- 상기 정의된 바와 같은 "HT-29 DS-B"로 명명되는 중간 조성물;

한 실시양태에서, 부품들의 키트는 상기 기술된 바와 같은 "DP"로 명명되는, (i) 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포, 및 (ii) 면역원성 스트레스 및/또는 저항성 단백질을 포함하거나 또는 이로 구성되는 조성물을 제조하는 방법에 따라 중간 조성물을 혼합하기 위한 지침서를 추가로 포함한다.

한 실시양태에서, 부품들의 키트는 상기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 추가 치료제, 예컨대, 예로서, 적어도 하나의 화학요법제 및/또는 면역자극제를 추가로 포함한다.

한 실시양태에서, 부품들의 키트는

- 상기 정의된 바와 같은 "DP"로 명명되는 조성물;

- 상기 정의된 바와 같은, 적어도 하나의 추가 치료제, 예컨대, 예로서, 적어도 하나의 화학요법제 및/또는 면역자극제를 포함한다.

<도면의 간단한 설명>

도 1a-b는 비처리된 샘플에 대한 3개의 각 인간 세포주 (HT-29, HCT-116 및 LoVo)에서 확인된 단백질의 개수를 비교하는 2개의 벤 다이어그램이다.

도 1a: RCB 샘플.

도 1b: MCB 샘플.

도 2는 고전적 조건 (10% FBS 포함)하에서 배양된 초기의 HCT-116 RCB와 비교함으로써 HCT-116 MCB, DS-A, DS-B에서, 및 상기 기술된 6개의 DS를 모두 포함하는 (따라서, HCT-116 DS-A 및 DS-B 포함) 최종 생성물 (DP)에서 발현된 단백질의 차등적 개수를 보여주는 그래프이다. "+"는 새로 발현된 단백질을 나타내고, "-"는 더 이상 발현되지 않는 단백질의 개수를 나타낸다.

도 3은 고전적 조건 (10% FBS 포함)하에서 배양된 초기의 HCT-116 RCB와 비교함으로써 HCT-116 MCB, DS-A 및 DS-B에서, 과다발현 및 과소발현된 단백질의 개수를 보여주는 그래프이다.

도 4는 고전적 조건 (10% FBS 포함)하에서 배양된 초기의 HT-29 RCB와 비교함으로써 HT-29 MCB, DS-A, DS-B에서, 및 상기 기술된 6개의 DS를 모두 포함하는 (따라서, HT-29 DS-A 및 DS-B 포함) 최종 생성물 (DP)에서 발현된 단백질의 차등적 개수를 보여주는 그래프이다. "+"는 새로 발현된 단백질을 나타내고, "-"는 더 이상 발현되지 않는 단백질의 개수를 나타낸다.

도 5는 고전적 조건 (10% FBS 포함)하에서 배양된 초기의 HT-29 RCB와 비교함으로써 HT-29 MCB, DS-A 및 DS-B에서, 과다발현 및 과소발현된 단백질의 개수를 보여주는 그래프이다.

도 6은 고전적 조건 (10% FBS 포함)하에서 배양된 초기의 LoVo RCB와 비교함으로써 LoVo MCB, DS-A, DS-B에서, 및 상기 기술된 6개의 DS를 모두 포함하는 (따라서, LoVo DS-A 및 DS-B 포함) 최종 생성물 (DP)에서 발현된 단백질의 차등적 개수를 보여주는 그래프이다. "+"는 새로 발현된 단백질을 나타내고, "-"는 더 이상 발현되지 않는 단백질의 개수를 나타낸다.

도 7은 고전적 조건 (10% FBS 포함)하에서 배양된 초기의 LoVo RCB와 비교함으로써 LoVo MCB, DS-A 및 DS-B에서, 과다발현 및 과소발현된 단백질의 개수를 보여주는 그래프이다.

도 8은 막 및/또는 세포 표면 단백질이든 또는 다른 단백질 (즉, (써모 프로테인 센터(Thermo Protein Center) 데이터베이스의 "세포 성분" 필드에서 "막" 또는 "세포 표면"이라는 용어가 주석으로 기록되어 있지 않은 임의의 다른 단백질)이든, HT-29 세포의 여러 조성물: HT-29 MCB, HT-29 DS-A, 및 HT-29 DS-B에서 뿐만 아니라; HT-29 DS-A, HT-29 DS-B, HCT-116 DS-A, HCT-116 DS-B, LoVo DS-A 및 LoVo DS-B의 믹스를 포함하는 약물 생성물 (DP)에서 확인된 단백질의 개수 (y-축)를 보여주는 그래프이다. 실험은 삼중으로 수행되었고, 이는 "#1," "#2" 및 "#3"으로 표시되었다.

도 9a-d는 HT-29 DS-A 대 HT-29 MCB (도 9a), HT-29 DS-B 대 HT-29 MCB (도 9b), HT-29 DS-A 대 HT-29 DS-B (도 9c), 및 DP 대 HT-29 MCB (도 9d) 사이의 p-값 및 변화 배수에 따른 단백질 분포를 보여주는 파이 차트이다.

도 10은 HT-29 DS-A 대 HT-29 MCB, HT-29 DS-B 대 HT-29 MCB, HT-29 DS-A 대 HT-29 DS-B, 및 DP 대 HT-29 MCB 사이에 통계상 유의적으로 과소발현되거나 (즉, p-값 ≤ 0.05 및 존재비 ≤0.5) 또는 과다발현된 (즉, p-값 ≤ 0.05 및 존재비 ≥2) 막 및/또는 세포 표면 단백질의 개수 (y-축)를 보여주는 그래프이다. 과소발현된 단백질의 개수는 음수로 표시되어 있다.

도 11a-c는 수지상 세포로부터의 IL-8 또는 IL-12 (pg/mL 단위로 표시)를 보여주는 3개의 그래프이다. 도 11a: CD40L 부재하의 IL-8 분비; 도 11b: 0.6 ㎍/mL CD40L 존재하의 IL-8 분비; 도 11c: 0.6 ㎍/mL CD40L 존재하의 IL-12 분비.

도 12는 다양한 비의 STC-1010으로 처리된 mDC 및 자가 CD8⁺ T 세포의 공동 배양물로부터 수집된 상청액 중의 IFNγ 방출을 보여주는 그래프이다. 해시 라인은 IFNγ의 검출 한계를 나타낸다.

도 13a-c는 다양한 용량의 STC-1010으로의 처리시 RT-qPCR로 평가된 DC 활성화 마커 CD40, CD83 및 CD86의 발현을 보여주는 3개의 그래프이다. 데이터는 닭 GAPDH의 발현으로 정규화된 상대적인 정량으로 표시된다. 도 13a: CD40의 발현; 도 13b: CD83의 발현; 도 13c: CD86의 발현.

실시예

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다.

실시예 1

인간 결장직장암 백신을 위한 세포주 선택

본 발명자들은 시험관내에서 암 세포주에서 인공적으로 저항성 기전을 발생시키고, 이를 면역원성으로 만들어 암 세포 저항성 기전을 스스로 바꾸는 항암 치료법을 개발하는 것을 목표로 하였다.

수개의 결장직장 인간 세포주를 인간 결장직장암 백신 개발에 적합한 후보로 선택하였다.

초기의 세포주 선택은 임상 유형 분류 체계의 가장 큰 패널을 포괄하기 위해 생물학적 및 유전적 특징을 기반으로 이루어졌다: 미소부수체 안정성 (MSS 대 MSI 상태); 돌연변이 대 야생형 BRAF, KRAS, PIK3CA, PTEN 및 TP53 유전자; 일반적인 항암 치료 (플루오로우라실 [5-FU], 옥살리플라틴, SN-38(7-에틸-10-하이드록시-캄프토테신), 항-VEGF 항체)에 대한 알려진 저항성.

문헌 및 데이터베이스(SelTARbase, Cellosaurus 및 GDSC 데이터베이스)에 기초하여 하기 세포주를 선택하였다:

- LS 174T (ATCC^® 레퍼런스: CL-188™),

- SW620 (ATCC^® 레퍼런스: CCL-227™),

- SW480 (ATCC^® 레퍼런스: CCL-228™),

- LoVo (ATCC^® 레퍼런스: CCL-229™),

- SW48 (ATCC^® 레퍼런스: CCL-231™),

- HCT-116 (ATCC^® 레퍼런스: CCL-247™), 및

- HT-29 (ATCC^® 레퍼런스: HTB-38™),

사전-연구 세포 은행 ( RCB ): 상기 세포주를 ATCC로부터 획득하고, 10% FBS를 이용하여 배양하여 7개의 RCB를 수득하였지만, 이 7개 중 6개만이 예상되는 성장 프로필을 가졌고, 냉동-해동 사이클 후에 생존가능하였다: 이 단계에서 SW620이 폐기되었다 (표 1).

사전- RCB 2%: 예상되는 성장 프로필을 가진 상기 6개의 RCB를 항-VEGF 항체에서 관찰되는 영양분 고갈 작용을 모방하기 위해 낮은 혈청 배양 조건 (10% FBS → 5% FBS → 2% FBS)에 적응시켰다.

단 4개의 세포주만이 저혈청 배양 조건에서 성장할 수 있었고, 냉동-해동 사이클 후에 생존가능하였다(HCT-116, HT-29, LoVo 및 SW480) (표 2).

이어서, 상기 4개의 세포주를 추가의 두 유형의 스트레스에 노출시켜 "DS-A" 및 "DS-B"를 수득하였다.

DS -A: 열 충격 단백질 HSP70 발현을 유도하기 위해 (1) 5분 동안 저선량 이온화 방사선 (10 Gy), 및 (2) 열 스트레스 (42℃에서 1시간)의 조합을 포함하는 물리적 스트레스에 세포를 노출시켰다.

DS -B: 결장직장암에 일반적으로 사용되는 화학요법제: 5-FU (시그마(Sigma), F6627), 옥살리플라틴 (시그마, Y0000271) 또는 SN-38 (7-에틸-10-히드록시-캄프토테신) (시그마, H0165)을 사용하여 화학적 자극을 포함하는 화학적 스트레스에 세포를 노출시켰다. 특히, 각 세포주와 화학요법제의 연관성은 문헌상 가정 (표 3) 및 추가로 각 화학요법제에 대한 세포주의 저항성 정도에 기초하였다. 각 세포주에 대해, 각 화학요법제에 대한 이러한 저항성 수준은 세포독성 검정법에서 최대 억제 농도의 절반 (IC₅₀)을 측정함으로써 평가하였다. IC₅₀은 표 4에 제시되어 있다.

물리적이든 화학적이든, 그러한 스트레스에 노출된 후, 세포를 합텐화하였고, 즉, 면역원성을 부여할 수 있는 캐리어 분자를, 본 스트레스 단백질이 유리 상태이든, 암 세포의 표면에 또는 이의 내부에 결합되어 있든, 스트레스에 대한 반응으로 저항성 기전으로 발현되는 스트레스 단백질에 결합시킴으로써 면역원성으로 만들었다. 캐리어 분자는 디니트로페닐이다.

마지막으로, 스트레스 노출 후 혈청이 감소된 (2% FBS) 배양 배지에서 가장 우수한 증식 능력을 보이는 3개의 세포주인 LoVo, HCT-116 및 HT-29를 선택하였다.

마스터 세포 은행 ( MCB ): 상기 선택된 3개의 세포주를 대사 스트레스 (항-VEGF 항체를 사용한 치료 요법에서 관찰되는 영양 고갈)를 모방하면서, 저혈청 배양 조건 (2% FBS)에서 배양하여 마스터 세포 은행 (MCB)을 수득하였다.

실시예 2

인간 결장직장암 백신 제조 프로세스

실시예 1에서 얻은 예비 결과에 기초하여, 본 발명자들은 다중 스트레스성의 합텐화되고, 비증식성인 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포를 포함하는 백신 조성물을 제조하였다.

각 세포주별로 MCB를 시작으로 DS-A 및 DS-B를 제조하였다.

DS-A의 경우, 각 세포주의 MCB를 해동하고 (냉동된 경우), 시험관내에서 배양하였다. 성장기 또는 이의 정체기 동안, 열 스트레스 (42℃에서 1시간)와 함께 5분 동안 저선량의 이온화 방사선 (10 Gy)을 포함하는 물리적 스트레스를 가하였다. 이어서, 상기 스트레스에 대한 반응으로 발현된 스트레스 단백질을 디니트로페닐로 합텐화하였다. 3,000만 개의 세포/mL로 제제화하고, 보관 목적으로 냉동시킨 후, (합텐화된 스트레스 분자를 포함하는) 상기 세포를 불활성화시키고, 즉, 세포 구조를 무손상 상태로 유지시키면서, 높은 이온화 방사선 (25 Gy)을 사용하여 비증식성이 되게 하여 세포 증식을 억제시켰다.

DS-B의 경우, 각 세포주의 MCB를 해동하고 (냉동된 경우), 시험관내에서 배양하였다. 성장기 또는 이의 정체기 동안, 화학요법제를 사용한 화학적 자극을 포함하는 화학적 스트레스를 가하였다: HT-29 세포의 경우, 13 μM 옥살리플라틴을 72시간 동안 적용시켰고; HCT-116 세포의 경우, 315 nM SN-38 (7-에틸-10-히드록시-캄프토테신)을 48시간 동안 적용시켰고 (또는 가장 최근 실험에서는 100 nM SN-38을 이용한 경우에도 유사한 최종 결과를 얻었다); LoVo 세포의 경우, 5 μM 5-FU를 48시간 동안 적용시켰다. 이어서, 상기 스트레스에 대한 반응으로 발현된 스트레스 단백질을 디니트로페닐로 합텐화하였다. 3,000만 개의 세포/mL로 제제화하고, 보관 목적으로 냉동시킨 후, (합텐화된 스트레스 분자를 포함하는) 상기 세포를 불활성화시키고, 즉, 세포 구조를 무손상 상태로 유지시키면서, 높은 이온화 방사선 (25 Gy)을 사용하여 비증식성이 되게 하여 세포 증식을 억제시켰다.

마커 발현을 비교하여 DS-A 및 DS-B를 검증하였다.

3개의 DS-A의 경우, 3개의 세포주에 가해진 방사선 및 열 스트레스는 3개의 모든 DS-A에서 동일한 표현형 변화를 유도하였으며, 여기서, 스트레스를 받지 않은 세포와 비교하여 HSP70 및 CD227을 과다발현하였다 (표 5). 본 데이터는 유사하게 처리된 여러 다른 셀 배치에서 수행된 실험을 통해 확인되었고, 이를 통해 모두 방사선 및 열 스트레스 후 HSP70 및 CD227의 과다발현이 확인되었다.

DS-B의 경우, 옥살리플라틴으로 HT-29 세포를 처리하였을 때, 스트레스를 받지 않은 세포와 비교하여 CD95, CD107 및 CD54 마커가 과다발현되었고; SN-38 (7-에틸-10-히드록시-캄프토테신)로 HCT-116 세포를 처리 또는 5-FU로 LoVo 세포를 처리하였을 때, 스트레스를 받지 않은 세포와 비교하여 CD66 마커가 과다발현되었고, 5FU로 처리된 LoVo에서 CD243이 과다발현되었다 (표 6). 본 데이터는 유사하게 처리된 여러 다른 셀 배치에서 수행된 실험을 통해 확인되었고, 이를 통해 모두

- (T25 셀스택스(CellStacks)에서든 또는 T225 셀스택스에서든 상관 없이) 예비 세포 배양 조건에 관계없이 SN-38 처리 후 HCT-116 세포에서 CD66의 과다발현;

- 옥살리플라틴 처리 후 HT-29 세포에서 CD54, CD95 및 CD107의 과다발현; 및

- 5-FU 처리 후 LoVo 세포에서 CD243의 과다발현 (및 보다 적은 정도로 CD66 과다발현)이 확인되었다.

마지막으로, (각각 300만 개의 세포를 포함하는) 100 ㎕ 용량 중 6개의 DC 모두 (3개의 DS-A - 각 세포주당 하나씩; 및 3개의 DS-B - 각 세포주당 하나씩) 풀링하여 백신 조성물 (DP 또는 "STC 1010")을 제제화할 수 있다. FACS 분석 결과, (전체 세포수 중 마커를 발현하는 세포의 비율(%) 및 평균 형광 강도로 평가된 바) 상기 최종 생성물 중 HSP70, CD227, CD95 및 CD243이 고도로 발현된 것으로 나타났다 (표 7).

실시예 3

6개의 중간 조성물에서의 단백질의 LC-MS/MS 확인 및 상대적 정량화

본 연구 동안, 시험관내에서 방사선, 열 스트레스, 화학적 스트레스, 대사 스트레스 또는 이의 조합을 받거나, 또는 받지 않은 다양한 분류 체계의 상이한 세포주를 분석하였다.

특정 데이터베이스에서 발현된 단백질을 확인하였다. 단백질 검출을 개선시키기 위해 적합화된 샘플 제조를 수행하였다.

검출된 단백질의 개별적인 양을 평가하였다.

각 단백질에 대해 얻은 정규화된 신호를 다른 단백질과 비교하였다.

물질 및 방법

제조하는 동안, 상이한 스트레스 (방사선, 열 스트레스, 화학적 스트레스, 대사 스트레스 또는 이의 조합)에의 노출 후 유전자 발현에 따라 세포를 수집하여야 한다. 상기 상이한 스트레스는 항원의 과다발현을 유도하였다. 표면 단백질을 합텐으로 화학적으로 마킹함으로써 면역원성도 증진되었다. 상이한 스트레스에의 노출 후 다양한 세포 샘플 간의 단백질 발현을 비교하였다. 본 연구에서 분석된 상이한 조성물에 대한 요약이 표 8에 제시되어 있다.

샘플 제조 프로세스

단백질을 검출하기 위해 세포 펠릿에 적용되는 샘플 제조 프로세스는 세포의 화학적 용해, 이어서, 단백질 분해를 포함하였다. 생성된 각 펩티드를 고해상도 질량 분석기에 커플링된 나노플로우 크로마토그래피 시스템 (나노LC MS/MS(NanoLC MS/MS))을 사용하여 물리화학적 특성에 따라 분리하였다. 이 기술을 사용하는 주요 이점은 기기의 감도를 개선시키고, 확인된 단백질의 개수를 증가시킨다는 것이다.

분석 방법

샷건 프로테오믹스 또는 펩티드 매핑으로도 불리는 데이터 의존적 분석(Data Dependent Analysis: DDA) 모드로 나노LC-MS/MS 분석을 수행하였다. 본 분석 도구에 의해 전체 크로마토그래피 분리를 통해 수천 개의 펩티에 대한 MS 및 MS/MS 스펙트럼을 획득할 수 있다.

단백질 확인

일단 실험적 MS 및 MS/MS 스펙트럼이 획득되고 나면, 질량 분석법 데이터를 사용하는 소프트웨어 검색 엔진을 사용하여 데이터 프로세스를 수행하여 프로테옴 데이터베이스로부터 단백질을 확인하였다. 이 경우, 단백질 확인을 위해 전체 인간 프로테옴 (SWISS Prot 데이터베이스)과 실험 데이터의 상관관계를 보여 주었다.

확인된 단백질을 검증하기 위해, 특이성을 보장하고, 위양성을 제거하기 위해 일부 확인 파라미터를 구현하였다. 확인된 단백질에 대해 매우 엄격하게 하기 위해 적어도 하나의 단백질 특이적 펩티드를 포함하는 2개의 펩티드를 사용하여 단백질 확인을 수행하였다. 확인된 단백질은 더 많은 양으로 존재하는 단백질이었다. 또한, 확인 프로세스를 위해, 예컨대, 메티오닌 산화 또는 글루타민으로부터의 피로글루탐산 형성과 같이 자주 관찰되는 일부 펩티드 변형을 검색 엔진에 추가하였다.

단백질 양 정규화 또한 수행하였다.

개별 정량화 평가

이 전략법은 레디비즈(Readybeads)™ 기술 (아나콴트(AnaQuant: 프랑스 빌뢰르반))의 도움을 통해 정확하게 보정된 합성 펩티드의 범용 보정 곡선을 스파이크하는 것을 포함하였다. 이 보정 곡선을 통해 확인된 모든 단백질의 정량에 따른 펩티드 신호를 변환할 수 있었다. 보정 곡선에 사용된 펩티드는 이의 특이성에 대해 선택되었고; 이들의 서열은 바이오프로세스에 사용되는 세포주의 프로테옴과 일치하지 않았다.

상기 표준은 임의의 단백질의 양을 정량화하도록 적합화된 정확한 보정 곡선을 나타낸다. 레디비즈™ 기술의 도움으로 상기 보정 곡선의 재현성과 안정성이 보장된다. 확인된 모든 펩티드 및 단백질 모두 이 보정 곡선을 사용하여 정규화될 수 있다. 정규화된 신호를 통해 배치간 비교를 할 수 있었다.

결과

13개의 샘플을 동시에 처리하고, 분석하였다. 일부 펠릿 샘플은 용해가 어려웠으며, 동일한 주입된 단백질 정량을 비교하기 위해, 분해 전 피어스™ BCA 단백질 검정 키트(Pierce™ BCA Protein 검정법 Kit)를 사용하여 단백질을 정량화하였다. 이러한 정량화 단계에도 불구하고, 샘플 분석 후에도 주입된 단백질의 정량은 샘플 간에 매우 상이한 것으로 보였다.

이러한 차이는 주입된 단백질 정량 차이로 인해, 또는 샘플의 단백질 동적 범위의 차이로 인해 발생할 수 있다.

이러한 가설을 평가하기 위해 샘플에 첨가된 AQT비즈(AQTBeads)를 품질 관리로 사용하였다. 레디비즈™ 품질 관리는 기울기 및 r² > 0.9에서 우수한 선형성을 보여주었고, 주입된 단백질 정량은 1 내지 500 fmol 범위에서 정량화되었다. LC-MS 주입 후에 펩티드 분해물 또한 정량화하였다. 결과는 표 9에 보고되어 있다.

전체 단백질 비교

비처리된 세포

RCB (연구 세포 은행) 샘플은 10% FBS 배지 중의 비처리된 샘플이었다.

MCB (마스터 세포 은행) 샘플은 배지 적응 (2% FBS)이 이루어진 RCB로부터 얻은 것이다.

3개의 인간 세포주 (HT-29, HCT-116 및 LoVo)에서 확인된 단백질을 비교하였다 (도 1a 및 1b).

확인된 단백질 중 거의 50%가 비처리된 3개의 인간 세포주 모두에서 공통적으로 확인되었다. 이러한 결과는 이들 3개의 세포주가 결장 또는 결장직장 암종으로부터 유래되었기 때문에 예상된 결과였다.

DS -A 처리

DS-A 처리는 열 스트레스 (42℃에서 1시간)와 함께 5분 동안 저선량의 이온화 방사선 (10 Gy)에 세포를 노출시키는 것을 포함한다. 이들 세포에 대사 스트레스 (즉, RCB와 MCB 사이에서 10%에서 2% FBS로의 배지 적응) 또한 가하였다.

상기 DS-A 처리 후, 일부 단백질은 3개의 세포주 모두에서 과다발현되는 것으로 나타났다 (전체 단백질 정량 대비 DS-A 샘플과 MCB 샘플 간의 단백질 비율 비 > 2.5). 이들 단백질은 표 10에 보고되어 있다.

MCB 샘플이 아닌, 오직 DS-A 샘플에서만 확인되는 상기 10개의 단백질은 DS-A 처리로 인해 세포가 저항성 기전을 발생시켰고, 이로써, 상기 세포는 스트레스 단백질을 생산하였다는 것을 반영한다.

DS -B 처리

DS-B 처리는 세포를 화학요법제에 노출시키는 것, 즉, HT-29 세포에 72시간 동안 13 μM 옥살리플라틴을 적용하고; HCT-116 세포에 48시간 동안 315 nM SN-38 (7-에틸-10-히드록시-캄프토테신)을 적용하고; LoVo 세포에 48시간 동안 5 μM 5-FU를 적용하는 것을 포함한다. 이들 세포에 대사 스트레스 (즉, RCB와 MCB 사이에서 10%에서 2% FBS로의 배지 적응) 또한 가하였다.

상기 DS-B 처리 후, 일부 단백질은 과다발현되는 것으로 나타났다 (전체 단백질 정량 대비 DS-B 샘플과 MCB 샘플 간의 단백질 비율 비 > 2.5). 이들 단백질은 표 11에 보고되어 있다.

과다발현된 단백질은 주로 DNA 수복과 관련이 있는 것으로 보였다. 결과를 더 심층 분석하기 위해, 본 발명자들은 막 단백질을 중점적으로 다루기로 결정하였다.

막 단백질을 중점적으로 분석

비처리된 세포

표 12 내지 14는 2개의 다른 세포주와 비교하여 하나의 인간 세포주 (비처리된 RCB 및 MCB)에서 과다발현된 (전체 단백질 정량 대비 단백질 비율 비 > 2.5) 막 단백질을 제시하고 있다.

DS -A 처리

막 단백질은 과소발현되기보다는 주로 과다발현되는 것으로 나타났다.

표 15 내지 17에는 이의 상응하는 MCB 샘플과 비교하여 각 인간 세포주 (DS-A 샘플)에서 과다발현된 (전체 단백질 정량 대비 단백질 비율 비 > 2.5) 막 단백질이 기술되어 있다.

DS-B 처리

표 18 내지 20에는 이의 상응하는 MCB 샘플과 비교하여 각 인간 세포주 (DS-B 샘플)에서 과다발현된 (전체 단백질 양에 대해 단백질 비율 > 2.5) 막 단백질이 기술되어 있다.

실시예 4

최종 조성물에서의 단백질의 LC-MS/MS 확인 및 상대적 정량화

본 연구는 최종 백신 조성물 (DP, 상기 기술된 6개의 DS를 모두 포함하고, 함께 풀링: 3개의 DS-A - 각 세포주당 하나씩; 및 3개의 DS-B - 각 세포주당 하나씩)에서 차등적으로 발현된 단백질을 확인하는 것을 목표로 하였다.

도 2는 고전적 조건 (10% FBS 포함)하에서 배양된 초기의 HCT-116 RCB와 비교함으로써 HCT-116 MCB, DS-A, DS-B에서, 및 상기 기술된 6개의 DS를 모두 포함하는 (따라서, HCT-116 DS-A 및 DS-B 포함) 최종 생성물 (DP)에서 발현된 단백질의 차등적 개수를 보여준다. "+"는 새로 발현된 단백질을 나타내고, "-"는 더 이상 발현되지 않는 단백질의 개수를 나타낸다.

도 3은 고전적 조건 (10% FBS 포함)하에서 배양된 초기의 HCT-116 RCB와 비교함으로써 HCT-116 MCB, DS-A 및 DS-B에서, 과다발현 및 과소발현된 단백질의 개수를 보여준다.

도 4는 고전적 조건 (10% FBS 포함)하에서 배양된 초기의 HT-29 RCB와 비교함으로써 HT-29 MCB, DS-A, DS-B에서, 및 상기 기술된 6개의 DS를 모두 포함하는 (따라서, HT-29 DS-A 및 DS-B 포함) 최종 생성물 (DP)에서 발현된 단백질의 차등적 개수를 보여준다. "+"는 새로 발현된 단백질을 나타내고, "-"는 더 이상 발현되지 않는 단백질의 개수를 나타낸다.

도 5는 고전적 조건 (10% FBS 포함)하에서 배양된 초기의 HT-29 RCB와 비교함으로써 HT-29 MCB, DS-A 및 DS-B에서, 과다발현 및 과소발현된 단백질의 개수를 보여준다.

도 6은 고전적 조건 (10% FBS 포함)하에서 배양된 초기의 LoVo RCB와 비교함으로써 LoVo MCB, DS-A, DS-B에서, 및 상기 기술된 6개의 DS를 모두 포함하는 (따라서, LoVo DS-A 및 DS-B 포함) 최종 생성물 (DP)에서 발현된 단백질의 차등적 개수를 보여준다. "+"는 새로 발현된 단백질을 나타내고, "-"는 더 이상 발현되지 않는 단백질의 개수를 나타낸다.

도 7은 고전적 조건 (10% FBS 포함)하에서 배양된 초기의 LoVo RCB와 비교함으로써 LoVo MCB, DS-A 및 DS-B에서, 과다발현 및 과소발현된 단백질의 개수를 보여준다.

전적으로 최종 조성물 (DP)에만 존재하는 (즉, RCB 단계에서 3개의 세포주 중 어느 것에서도 확인되지 않는) 단백질의 개수 및 비율(%), (RCB 단계의 3개 세포주와 비교하여) 최종 조성물 (DP)에서 과다발현된 단백질의 개수 및 비율(%), 및 (RCB 단계의 3개 세포주와 비교하여) 최종 조성물 (DP)에서 유사하게, 또는 더 적게 발현된 단백질의 개수 및 비율(%)을 나타내는, 이러한 LC/MS 데이터의 비교가 표 21에 제공되어 있다.

표 22는 전적으로 최종 조성물(DP)에서만 발견되고, RCB에서는 발견되지 않는 단백질의 목록을 보여준다. 따라서, 이러한 단백질 중 어느 하나의 존재는 상기 설명한 모든 상이한 처리가 수행된 최종 조성물의 특징이다.

최종 조성물 (DP)에서 확인된 1556개의 단백질에 대한 추가 분석에서는 이들 중 97개가 특히 관심 대상이며 생물학적, 임상적 및 암 예후 값을 기준으로 12개 슈퍼패밀리로 분류될 수 있는 것으로 나타났다. 이들 97개 단백질 중 52개는 RCB 단계의 3개 세포주와 비교하여 전적으로 최종 조성물(DP)에서만 발견되고, RCB에서는 발견되지 않는다. 표 23에는 이들 12개의 각 슈퍼패밀리에서의 단백질 개수가 요약되어 있다.

"부착"은 CAM 단백질 (세포 부착 분자)에 상응하며, 이는 IgCAM (예컨대, ICAM1), 카드헤린, 인테그린, 및 셀렉틴을 포함한다.

"ATP 결합 카세트"는 약물 내성 현상과 연관된 수송 시스템 슈퍼패밀리의 막관통 단백질에 상응한다.

"BCL"은 아폽토시스유발성 (예컨대, BAX, BAK1/Bcl-2 동종성 길항제 살해진자, 및 Bcl-2 연관 사멸 프로모터) 또는 항-아폽토시스성 (예컨대, Bcl-2, 및 Bcl-xL)인, 세포 사멸을 조절하는 단백질에 상응한다.

"COX"는 미토콘드리아 호흡 사슬의 말단 성분으로부터의 단백질인 시토크롬 C 옥시다제 단백질 (이는 또한 "복합체 IV"로도 명명)에 상응한다. 시토크롬 C 옥시다제의 돌연변이는 암에 관여한다 (특히, 시토크롬 C 옥시다제 서브유닛에서).

"EGFR"은 상이한 암종 유형의 발병 및 진행에 관여하는 표피 성장 인자에 상응한다.

"HSP"는 광범위한 인간 암에서 과다발현되고, 종양 세포 증식, 분화, 침입, 전이, 사멸 및 면역계에 의한 인식과 관련된 단백질 부류인 열 충격 단백질에 상응한다.

"억제제"는 암 증식 유발성 또는 항암 증식과 연관된 단백질에 상응한다.

"MUC"는 매우 많이 글리코실화된 단백질인 뮤신 단백질에 상응한다. 특히, MUC13은 위암, 결장직장암, 난소암을 비롯한 다양한 상피 암종에서 빈번하고, 비정상적으로 발현된다.

"RAS-관련"은 작은 GTPase 타입인 Rap GTP-결합 단백질에 상응한다. 95%의 췌장암 및 45%의 결장직장암을 포함하여 모든 인간 암의 30% 초과는RAS 패밀리의 유전자의 돌연변이에 의해 유도된다.

"수복"은 종양 진행과 연관된 단백질에 상응한다.

"수송체"는 약물 내성에서 작용하는 막관통 단백질에 상응한다.

표 24에서는 RCB와 비교하여 최종 조성물 (DP)에서 과다발현된 상기 52개의 단백질로, 이중 8개는 전적으로 최종 조성물 (DP)에서만 발현되는 단백질이 확인된다.

표 25는 다양한 유형의 암에서 생물학적, 임상적 및 암 예후 값 기준의 상기 97개의 단백질의 의미를 보여주는 것이다. 제시된 바와 같이, 최종 조성물 (DP)은 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포가 결장직장 세포주라는 점을 고려하면 예상할 수 있는 결장직장암 뿐만 아니라, 다른 유형의 암과도 연관이 있는 마커를 발현한다. 이는 본원에 기술된 조성물이 결장직장암 뿐만 아니라, 매우 다양한 다른 암을 치료하는 데 유용할 수 있다는 것을 시사한다.

실시예 5

2개의 중간 조성물에서 및 최종 생성물에서의 표면 단백질의 LC-MS/MS 확인 및 상대적 정량화

본 연구의 목표는 상이한 제조 단계에서 종양 세포의 표면 프로테옴을 특징화하고, 최종적으로는 출발 물질 중 하나 (HT-29 MCB)에서, 2개의 상응하는 중간 조성물 (HT-29 DS-A 및 HT-29 DS-B)에서, 및 상기 기술된 6개의 DS를 모두 포함하는 (따라서, HT-29 DS-A 및 HT-29 DS-B를 포함하는) 최종 생성물 (DP)에서의 차등적으로 발현된 표면 단백질을 확인하는 것이었다.

물질 및 방법

이전 실시예 3 & 4에서 설명한 것과 유사한 유형의 생성물 (DS/DP)을 분석하였다. 동일한 단계가 상이한 스트레스 (방사선, 열 스트레스, 화학적 스트레스, 대사 스트레스 또는 이의 조합)에 대한 노출에 구체적으로 적용되었다. 이러한 상이한 스트레스는 항원의 과다발현을 유도하였다. 표면 단백질을 합텐으로 화학적으로 마킹함으로써 면역원성도 증진시켰다. 상이한 스트레스에의 노출 후 상이한 세포 샘플 간의 단백질 발현을 비교하였다. 본 연구에서 분석된 상이한 조성물에 관한 요약이 표 26에 제공되어 있다.

샘플 처리

가능하다면, 6 x 10⁶개의 세포 (그렇지 않으면, 전체 샘플을 사용)를 PBS로 부드럽게 세척한 후, 피어스™ 세포 표면 단백질 비오티닐화(Pierce™ Cell Surface Protein Biotinylation)를 사용하여 비오티닐화하였다. 이어서, 세포를 용해시키고 피어스™ 세포 표면 단백질 비오티닐화 및 단리 키트(Pierce™ Cell Surface Protein Biotinylation and Isolation Kit) (써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 카탈로그 번호 A44390)를 사용하여 단백질을 단리시켰다. 두 제조 단계 모두 제조업체의 지침에 따라 수행하였다.

이어서, 단백질을 메탄올 클로로포름으로 침전시키고, 침전물을 메탄올로 세척하고, 건조시키고, 마이크로-캐비테이션 (바이오럽터 피코(Bioruptor Pico), 다이아게노드(Diagenode))을 통해 iST LYSE (프리오믹스 게엠베하(PreOmics Gmbh)) 완충제 중에 용해시켰다.

LysC 및 트립신을 사용하여 단백질을 분해시켰다. 혼합 모드 역상 양이온 교환체 SPE 칼럼 (프리오믹스 게엠베하)을 사용하여 펩티드를 정제하고, 건조시키고, 100 ㎕의 3% 아세토니트릴 0.1% 포름산 수용액에 용해시켰다.

BCA 방법을 사용하여 펩티드 농도를 측정하였다 (표 27). 측정된 펩티드 농도가 낮음에도 불구하고, 그 양은 이 타당성 조사에 충분하였다.

분석 방법

LC-MS/MS

250 ng의 펩티드를 각 샘플당 삼중으로 주입하였다.

프리칼럼 상에서의 3분 포획 후, 300 nL/분의 유속으로 2.5% → 35% 아세토니트릴 120분 구배를 적용하여 PepMap100 C18 (75 ㎛ x 50 cm, 2 ㎛ 물질) 칼럼을 사용하여 얼티메이트 3000 (디오넥스(Dionex)) 장비를 이용하여 크로마토그래피를 수행하였다.

표 28에 기술된 실험 설정을 사용하여 Q-Exactive(써모) 질량 분석기를 사용하여 데이터를 획득하였다. MS/MS 스캔은 각 사이클의 가장 강도가 높은 10개 이온에 대해 수행되었으며, 6545 사이클이 수행되었고, 이로써, 크로마토그래피 피크당 평균 17 사이클이 수행되었다.

단백질 확인

데이터를 Proteome Discoverer 2.4로 프로세싱하였다.

NeXtProt로부터 마이닝된 인간 참조 프로테옴을 수집하는 데이터베이스 및 인간 단백질이 고갈된 cRAP 오염물질 데이터베이스에 대해 SEQUEST-HT 알고리즘을 사용하여 단백질을 확인하였다.

검색 파라미터는 하기와 같았다:

- 효소 = 트립신 (전체);

- 허용 오절단 = 2;

- 전구체 오차 허용 = 10 ppm;

- 단편 오차 허용 = 0.02 Da;

- 동적 변형 = 산화 (M), 탈아미드화 (N/Q), CAM티오프로파노일 (K);

- 단백질 말단 변형 = 아세틸화, CAM티오프로파노일;

- 정적 변형 = 카르바미도메트I(C).

Percolator 알고리즘을 사용하여 거짓 발견율 (FDR)을 결정하였다.

SEQUEST-HT에 의해 신뢰도가 높지 않고 낮은 것으로 보고된 모든 스펙트럼, 즉, 확인되지 않은 것으로 간주된 모든 스펙트럼은 두 번째에는 상기와 동일한 데이터베이스에 대해 동일한 알고리즘에 의해, 단, 변형된 설정을 이용하여 프로세싱하였다:

- 효소 = 트립신_R (semi);

- 허용 오절단 = 2;

- 전구체 오차 허용 = 10 ppm;

- 단편 오차 허용 = 0.02 Da;

- 단백질 말단 변형 = 아세틸화, CAM티오프로파노일;

- 정적 변형 = 카르바미도메트I(C).

써모 프로테인 센터 데이터베이스의 "세포 성분" 필드에서 "막" 또는 "세포 표면"이라는 키워드가 주석으로 기록되어 있을 때, 단백질을 "막" 또는 "세포 표면"의 일부로서 간주하였다. 동일한 단백질에 대해 세포 성분이 보고될 수 있다는 점에 유의하여야 한다. 추가로, "막"이라는 용어는 원형질막 이외의 막 (예컨대, 핵막, 소기관막, 소포막 등)을 지칭할 수 있다.

단백질 정량화

데이터는 Proteome Discoverer 2.4 소프트웨어용 Minora 및 피처 매퍼(feature mapper)를 사용하여 프로세싱하였다.

피크 적분 파라미터 하기와 같았다:

- 획득 후 재보정 = 참(true) (파인(fine) 파라미터);

- 최소 트레이스 길이 = 5;

- 동위원소에 대한 최대 델타 RT = 0.2분;

- 적분에 대한 PSM 신뢰 수준 = 높음.

크로마토그래피 정렬 파라미터 하기와 같았다.

- RT 정렬 = 참;

- 파라미터 튜닝 = 파인;

- 최대 RT 시프트 = 5분;

- 질량 허용오차 = 10 ppm.

피처 매핑 파라미터는 하기와 같았다:.

- RT 허용오차 = 자동;

- 질량 허용오차 = 자동;

- S/N 임계값 = 2.

Proteome Discoverer 2.4 소프트웨어용 전구체 이온(Precursors Ions) 정량자 노드를 사용하여 통계 분석을 수행하였다.

일반적인 정량화 설정은 하기와 같았다:.

- 사용할 펩티드 = 고유 + RAZOR (고유는 다른 단백질 또는 단백질 그룹에 의해 공유되지 않는 펩티드를 의미; RAZOR는 다중 단백질 그룹에 의해서는 공유되지만, 가장 많은 개수의 고유 펩티드 및 가장 긴 아미노산 서열을 사용하여 단백질을 정량화하는 데만 사용되는 펩티드를 의미);

- 펩티드 고유성에 대한 단백질 그룹 고려 = 참;

- 채널이 결측된 Quan 결과 거부 = 거짓.

전구체 정량화 설정은 하기와 같았다:

- 전구체 존재비의 기반이 된 것 = 면적;

- 최소 반복 횟수 피처 = 50% (정량화에 사용하려면 한 그룹 샘플의 적어도 50%에서 펩티드가 검출되어야 한다).

정규화 설정은 하기와 같았다:

- 정규화 모드 = 전체 펩티드 양 (확인된 모든 펩티드 대비 각 주입에 대한 존재비 값의 총합 계산, 총 존재비가 가장 높은 주입은 주입당 상수 인자에 의해 다른 모든 주입의 존재비 값을 보정하기 위한 참조로 사용되며. 결국 총 존재비는 모든 주입에 대해 동일하다).

Quan 롤업 가설 테스팅 설정은 하기와 같았다:

- 비 계산 = 쌍별 비 기반 (펩티드 비는 선택된 연구 인자에 대한 모든 복제물로부터의 모든 조합 비의 기하 중앙값으로 계산된다. 이후 단백질 비는 펩티드 그룹 비의 기하 중앙값으로 계산된다);

- 대치 모드 = 복제 기반 리샘플링 (결측 값은 검출된 (기술적, 생물학적) 복제 값의 중앙값을 중심으로 분포에서 샘플링된 무작위 값으로 대체된다);

- 가설 검정 = t-검정 (배경 기반).

p-값을 제공하는 가설 검정은 t-배경 검정 (또는 ANOVA 배경)이다. 상기 검정은 프로테오믹스에서 대부분의 단백질 존재비가 자극에 반응하여 변하지 않는다는 가정에 기반을 두고 있다. 본 방법은 이러한 일정한 모집단의 중앙값 및 분산에 대해 각 단백질 존재비를 검정하기 전에 조건 간에 주로 일정한 것으로 간주되는 단백질 비의 순위를 결정한다. 상기 검정은 결측 값이 있는 연구에 유용하며, 수백 개의 단백질이 확인된 경우에만 사용할 수 있다. 기술적 복제가 필요하지 않다.

결과

단백질 검출 개수

각 샘플에서 확인된 단백질 및 펩티드의 개수는 표 29와 도 8에 제시되어 있다.

단백질의 상대적 정량화

- HT-29 DS-A와 HT-29 DS-B,

- HT-29 DS-A와 HT-29 MCB,

- HT-29 DS-B와 HT-29 MCB, 및

- HT-29 MCB와 DP를 비교하기 위해 4번위 비교를 수행하였다.

노트 1: 생물학적 또는 기술적 변동 및/또는 미량 데이터의 질량 분석 획득의 확률론적 성질에 기인하여 일부 단백질 존재비 값이 손실될 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 정량화 가능한 펩티드가 어느 그룹에서든 주입 중 적어도 50%에 존재하는 단백질을 정량화 가능한 것으로 간주한다.

노트 2: 일부 단백질 또는 펩티드의 경우, 존재비는 1000 또는 0.001이다. 상기 값은 임의 값이다. 첫 번째 경우에는 이 단백질 또는 펩티드가 분자 조건에서만 정량화되었다는 것을 의미하고; 두 번째 경우에는 분모 조건에서만 정량화되었다는 것을 의미한다.

노트 3: 단백질의 펩티드의 MS/MS 단편화 스펙트럼을 기반으로 확인되지 않은 단백질은 여전히 "실행 간 매치"를 통해 정량화될 수 있다. 이 정량화는 해당 펩티드의 XIC (MS1) 크로마토그래피 특징 (정확한 질량, 머무름 시간)과 동일한 실험의 적어도 하나의 획득에서 확인된 펩티드의 유사성을 기반으로 한다.

노트 4: 관련 p-값이 0.05 이하이고, 존재비가 0.5 이하이거나, 또는 2 이상인 경우, 단백질 존재비는 통계상 유의적으로 상이한 것으로 간주된다.

도 9a-d는 4개의 각 비교에서 p-값 및 변화 배수에 따른 단백질 분포를 보여준다.

도 10은 4개의 각 비교에서 통계상 유의적으로 상이한 막 및/또는 세포 표면으로부터의 단백질의 개수를 보여준다.

모든 주입에서 확인된 단백질 중 65% 초과는 써모 프로테인 센터 데이터베이스의 "세포 성분" 필드의 "막" 또는 "세포 표면"이라는 용어와 연관되어 있다 (도 8). 이에 비해, 비오티닐화되지 않은 HeLa 세포에서는 더 낮은 비율의 확인된 단백질 (51%, 즉, 3562개 중 816개의 단백질)이 동일한 데이터베이스에서 "막" 또는 "세포 표면"이라는 용어와 연관되어 있다. 이는 4개 샘플 모두에서 표면 프로테옴이 성공적으로 강화되었음을 나타내는 경향이 있다.

샘플 간의 상대적 정량화 및 비교 결과, 스트레스성/합텐화된 세포 (DS-A 또는 DS-B) 또는 약물 생성물 (DP)을 비처리 세포 (MCB)와 비교하였을 때, 단백질의 존재비는 약 29% 내지 34%로 유의적으로 달라지는 것으로 나타났다 (각각 도 9a-c). 스트레스성/합텐화된 세포 샘플 (DS-A 및 DS-B), 둘 모두 서로 비교하였을 때, 더 낮은 비율 (15%)이 관찰된다 (도 9d).

유의적으로 과다발현 또는 과소발현된 단백질 중 절반을 초과하는 단백질이 막 및 세포 표면 단백질로 주석이 달린다 (도 10).

비교 결과

HT-29 DS -A/HT-29 MCB

원시 데이터를 기반으로, 방사선 및 열 충격에 의한 스트레스 후, 이어서, 합텐화 후 과다발현된 막 또는 세포 표면 단백질을 분류하기 위해 존재비 DS-A/MCB가 ≥ 1000인 것을 선택하였다.

세포막 단백질을 고려하면, 존재비 ≥ 1000하에 MCB와 비교하여 455개의 단백질이 DS-A에서 과다발현된 것으로 확인되었다.

특정 세포 표면 단백질을 고려하면, 존재비 ≥ 2하에 MCB와 비교하여 DS-A에서 127개의 단백질이 과다발현되고, 존재비 1000하에 그 중 38개가 과다발현되는 것으로 확인되었다 (표 30).

HT-29 DS -A/HT-29 MCB

원시 데이터를 기반으로, 화학적 충격 후, 이어서, 합텐화 후 과다발현된 막 또는 세포 표면 단백질을 분류하기 위해 존재비 DS-B/MCB가 ≥ 1000인 것을 선택하였다.

세포막 단백질을 고려하면, 존재비 ≥ 1000하에 MCB와 비교하여 430개의 단백질이 DS-B에서 과다발현된 것으로 확인되었다.

특정 세포 표면 단백질을 고려하면, 존재비 ≥ 2하에 MCB와 비교하여 DS-B에서 127개의 단백질이 과다발현되고, 존재비 1000하에 그 중 37개가 과다발현되는 것으로 확인되었다 (표 31).

DP/HT-29 MCB

노트: DP 조성물에는 HT-29 DS-A 및 HT-29 DS-B 뿐만 아니라, HCT-116 DS-A, HCT-116 DS-B, LoVo DS-A 및 LoVo DS-B가 함께 모여 있기 때문에 상기 비교는 실제 단백질 과다발현을 나타내는 것은 아니며; 따라서, MCB 비교를 위해서는 희석 인자가 고려되어야 할 필요가 있을 것이다.

원시 데이터를 기반으로, 과다발현된 막 또는 세포 표면 단백질을 분류하기 위해 존재비 DP/MCB가 ≥ 1000인 것을 선택하였다.

세포막 단백질을 고려하면, 존재비 ≥ 1000하에 MCB와 비교하여 343개의 단백질이 DP에서 과다발현된 것으로 확인되었다.

특정 세포 표면 단백질을 고려하면, 존재비 ≥ 2하에 MCB와 비교하여 DP에서 112개의 단백질이 과다발현되고, 존재비 1000하에 그 중 34개가 과다발현되는 것으로 확인되었다 (표 32).

약물 생성물 (DP)에서의 프로테옴 확인

표 33에는 HT-29 DS-A, HT-29 DS-B, HCT-116 DS-A, HCT-116 DS-B, LoVo DS-A 및 LoVo DS-B의 믹스를 포함하는 DP의 3회 삼중으로 확인된 132개의 세포 표면 단백질이 기술되어 있다.

실시예 6

혼합 림프구 반응 검정법을 통한 STC -1010의 기능적 활성에 대한 시험관내 평가

본 목표는 단독으로 또는 (생체내에 자연적으로 존재하는) CD40L과 함께 적용될 때, 인간 단핵구 유래 수지상 세포 (DC)의 면역원성 프로파일을 유도할 수 있는 가능성에 대해 최종 생성물 (DP 또는 "STC-1010")을 시험관내에서 평가하고, 혼합 림프구 반응 (MLR) 검정법에서 수지상 세포에 의해 매개되는 T 세포 활성화를 평가하는 것이었다. 본 연구는 HLA 매칭된 단핵구 유래 mDC 및 CD8⁺ T 세포의 공동 배양물에 대해 수행되었으며, 본 시스템에서, i) 배양 상청액에 방출된 사이토카인의 정량을 통해 DC의 사이토카인 (IL-12 및 IL-8 포함) 프로필을 측정하였고, ii) 특정 균질 시간 분해 형광 (HTRF) 기반 검출 키트를 사용하여 방출된 IFNγ의 정량화 평균에 의한 MLR 반응 평가를 통해 DC 매개 T 세포 활성화를 측정하였다.

물질 및 방법

i) 분화/성숙 프로토콜을 통해 성숙한 DC를 얻는 데 사용된 단핵구, 및 ii) CD8⁺ 림프구를 새로 단리시키기 위해 건강한 기증자로부터의 인간 PBMC를 본 연구에서 사용하였다.

간략하면, 인간 단핵구를 PBMC로부터 새로 단리시키고, GM-CSF 및 IL-4의 존재에서의 배양하에 DC로 분화시켰다. 분화 과정 종료시, DC를 0.6 ㎍/mL CD40L의 존재 및 부재하에서 STC-1010을 함유하는 3개의 상이한 비의 LPS 및 IFNγ의 존재하에서 (1:1, 3:1 및 10:1, 음성 대조군으로서 STC-1010 부재인 조건) 특정 칵테일에서 DC를 성숙화시켰다.

성숙시, mDC는 CD209⁺ CD1a⁺ CD80⁺ CD83⁺CD86⁺인 것으로 확인되었고, HTRF에 의해 IL-12 및 IL-8을 정량화하기 위해 세포 배양물 상청액을 회수하였다.

이어서, DC를 동일한 기증자로부터 단리된 CD8⁺ T 세포와 함께 1:4의 적절한 자극인자:반응자 비로 공동 배양하였다. 대조군 조건 (비처리) 뿐만 아니라, T 세포 단독 및 mDC 단독인 것도 본 실험에 포함하였다. 공동 배양 72시간 후, 상청액을 수집하고, T 세포 활성화의 중요한 대표 대용체로서 사용된 방출된 IFNγ 수준의 정량화를 통해 CD8⁺ T 세포 활성화에 대한 STC-1010의 효과를 평가하였다. 사이토카인 수준 정량화는 HTRF에 의해 수행하였다.

결과

STC -1010이 mDC 사이토카인에 미치는 효과

STC-1010은 CD40L의 부재 및 존재하, 둘 모두에서 mDC에 의한 IL-8의 분비를 비에 의존하는 방식으로 제한할 수 있었다 (각각 도 11a 및 11b). STC-1010은 또한 CD40L의 존재하에서 mDC에 의한 IL-12의 분비를 비에 의존하는 방식으로 증진시킬 수 있었다 (도 11c). 이러한 비에 의존하는 반응을 통해 DC의 성숙에 대한 STC-1010의 작용을 확인할 수 있다.

2개의 다른 사이토카인 (IL-10 및 TNFα) 또한 본 연구 과정에서 평가하였다: STC-1010은 CD40L 존재하에 IL-10 분비를 제한하는 경향을 보인 반면; TNFα 분비는 CD40L 부재 또는 존재하, 둘 모두에서 STC-1010 노출시 약간 감소하였고, 효과는최고 비에서 최고조에 달하였다 (데이터는 표시되지 않음).

IFNγ 정량화를 통한 MLR 반응에 대한 STC -1010의 효과

자가 자가 CD8⁺ T 세포와 함께 공동 배양된 mDC는 성숙화 기간 동안 이전에 CD40L에 노출되었을 때 효과적인 MLR 반응을 보였다. 이러한 효과는 공동 배양물로부터 수집된 상청액에서의 IFNγ 방출의 평가를 통해 입증되었으며, 이는 대조군 및 비히클과 비교하여 유의적인 상향조절을 보였다 (도 12).

결론

이러한 데이터에 비추어 STC-1010은 STC-1010의 면역원성 및 비 의존적 활성과 함께 사이토카인 프로필을 통해 입증된 바와 같이 DC 성숙화를 조절하는 능력을 입증하였다.

이 면역원성 프로파일은 MLR을 통해 STC-1010-프라이밍된 DC와 함께 공동 배양된 CD8⁺ T 세포가 증진된 기능적 활성을 갖는 것으로 확인되었다.

실시예 7

융모요막 분석을 통한 STC -1010의 기능적 활성에 대한 난내(in ovo) 평가

목표는 최종 생성물 (DP 또는 "STC-1010")을 난내에서 융모요막 막 (CAM) 검정법에서 면역 반응을 유도할 수 있는 이의 가능성을 평가하는 것이었다.

물질 및 방법

닭 배아 제조

백색 레그혼(White Leghorn) 수정란을 37.5℃, 상대습도 50%에서 9일 동안 인큐베이션시켰다. 그 때(E9), 달걀 껍질을 통해 기낭에 작은 구멍을 뚫어 CAM을 떨어뜨렸고, CAM 위의 달걀 껍질에 1 ㎠의 창을 잘라냈다. 각 연구군에 대해 최소 20개의 난을 오픈하였다(그러나, 난각 오프닝은 침습적 수술 행위이기 때문에, 오픈 후 처음 몇 시간 동안 일부는 사망할 수 있는 바, 군당 15-20개의 난을 이용하여 데이터를 수집하였다).

처리

처리 전, 각 난의 생존능을 체크하고, 생존 난을 군으로 무작위화하였다. 군의 모든 난을 하기 3개 시험 조건하에 100 ㎕ 부피의 STC-1010으로 처리하였다:

- 시험 조건 "STC1010 [1]": 10⁵개의 세포/mL, 즉, 10⁴개의 세포/배아;

- 시험 조건 "STC1010 [2]": 5 x 10⁵개의 세포/mL, 즉, 5 x 10⁴개의 세포/배아; 및

- 시험 조건 "STC1010 [3]": 10⁶개의 세포/mL, 즉, 10⁵개의 세포/배아.

음성 대조군 ("Neg Ctrl")은 STC-1010 부재하에서 동시에 수행하였다.

닭 면역 세포의 정량적 평가

E18일에 말초 혈액을 수집하고, 혈액 응고를 방지하기 위해 헤파린으로 처리하였다.

수지상 세포 (DC) 평가를 위해, 100 ㎕의 개별 샘플 (군당 n = 8)을 회수하고, 이로부터 RNA를 추출하고, 역전사하고, 사전 증폭시키고, 닭 CD40, CD83 및 CD86 서열에 대한 특정 프라이머를 사용하여 qPCR에 의해 분석하였다. qPCR에서 수행된 모든 지점에 대해 닭 GAPDH의 발현도 참조 유전자 발현으로 분석하였고, 샘플 간의 면역 바이오마커 발현을 정규화하는 데 사용하였다. 각 샘플에 대한 C_q, 각 군에 대한 평균 C_q 및 면역 세포의 상대적인 양 계산은 바이로-래드(Bio Rad)^® CFX Maestro 소프트웨어로 직접 관리하였다.

T 림프구 평가를 위해 나머지 혈액 샘플을 군 내에서 풀링하였다. 이어서, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 단리를 위해 혈액 샘플을 하이파크-피콜(Hypaque-Ficoll: HF) 분리로 프로세싱하였다. 그 후, 유세포 분석을 통해 T 림프구를 평가하기 위해 정제된 PBMC를 항-닭 CD45 (써모피셔(Thermofisher), 참조: MA5 28679), 항-닭 CD3 (써던 바이오테크(Southern Biotech), 참조: 8200-26), 항-닭 CD4 (써모 피셔, 참조: MA5-28686) 및 항-닭 CD8 (써모 피셔, 참조: MA5-28686)로 표지하였다.

면역 사이토카인의 정량적 평가

E18일에 말초 혈액을 개별적으로 수집하고 (군당 n =5), 혈액 응고를 방지하기 위해 헤파린으로 처리하였다. 이어서, 혈장 수집을 위해 혈액 샘플을 원심분리한 후, IL-12 및 IFNγ 발현에 대해 ELISA 분석을 수행하였고, 각 혈장 샘플을 3개의 희석률로 평가하였다. 모든 ELISA 키트는 쿠사바이오(Cusabio)에서 주문하였다 (닭 IL-12 Elisa 키트, 참조: CSB-E12836C; 닭 IFN ELISA 키트, 참조: CSB-E08550Ch).

통계적 분석 및 유의도

모든 정량적 데이터에 대해 이상치 확인 및 일원 ANOVA (각 군 커플 간의 사후 검정과 함께)를 프리즘(Prism)^® (GraphPad 소프트웨어)을 사용하여 수행하였다.

결과

FACS에 의한 닭 면역 세포의 정량적 평가

E18에 정제된 PBMC 중 CD45⁺, CD3⁺, CD4⁺ 및 CD8⁺ 세포의 FACS 정량화에 의해 "Neg Ctrl" 및 "STC-1010 [3]" 군에서 백혈구 활성화를 평가하였다. 표 34에는 말초 백혈구에 포함된 이들 상이한 세포 하위세트의 FACS 분석 데이터 (말초 CD45⁺백혈구 중의 비율(%)로서)가 제시되어 있다.

이들 데이터는 CD4⁺ 및 CD8⁺ 백혈구의 증가, 특히, CD3^-/CD4⁺ 백혈구가 고도로 증가하였다는 것을 보여준다.

면역 사이토카인의 정량적 평가

E18에 모든 군에서 말초 혈액 중 IL-12 및 IFNγ 발현 수준을 추정하였다. 사이토카인 분비를 적절하게 평가하기 위해, 각 혈장 샘플을 ½1/2, 1/10 및 1/50의 3개의 희석률로 평가하였다.

표 35는 말초 IL12 분비의 데이터 분석을 보여준다.

이들 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 음성 대조군과 비교하여 STC-1010에 의해 유도된 IL-12 분비의 순 증가는 3개의 샘플 희석률 모두에서 관찰되었다. 그러나, STC-1010 처리 후에는 IFNγ의 유의적인 증가가 관찰되지 않았다 (데이터는 제시되지 않음).

RT- qPCR에 의한 닭 면역 세포의 정량적 평가

3개의 DC 활성화 마커 (CD40, CD83, CD86)의 발현을 RT-qPCR에 의해 평가하였다. 그 결과, STC-1010에 의해 유도된 이들 마커는 구체적으로, CD40 및 CD86의 경우, 최고 용량에서, 및 CD83의 경우, 모든 용량에서 및 최저 용량에서는 더욱 유의적으로 상향조절된 것으로 나타났다 (도 13a-c).

결론

배아 중 대다수가 본 연구 전기간 동안 생존하였으며, 이를 통해 STC-1010은 독성이 없는 것으로 확인되었다:

- 음성 대조군: n = 50, 배아 3개 사망 (6% 치사율);

- "STC1010 [1]" 군: n = 48, 배아 2개 사망 (4.17% 치사율);

- "STC1010 [2]" 군: n = 33, 0개의 배아 사망 (0% 치사율);

- "STC1010 [3]" 군: n = 29, 1개의 배아 사망 (3.45% 치사율).

본 CAM 검정법을 사용한 결과, STC-1010은 면역계를 부스팅하고, 선천 및/또는 적응 면역 반응을 활성화시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.

이러한 유망한 결과에 기초하여, 인간 결장직장 선암종 이식 닭 배아에 대한 STC-1010의 난내 효능을 평가하기 위한 새로운 연구가 수행될 것이다.

Claims

(i) 스트레스성(stressed) HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포, 및 (ii) 시험관내에서 가해진 스트레스에 반응하여 상기 세포에 의해 생산되는 면역원성 스트레스 단백질을 포함하는 조성물.
제1항에 있어서, 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포가 시험관내에서 가해진, 방사선, 열 스트레스, 화학적 스트레스, 대사 스트레스 및 이의 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 또는 수개의 스트레스[들]에 반응하여 저항성 기전(resistance mechanism)을 발생시켜 스트레스 단백질을 생산하는 것인 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포가 비증식성(non-proliferative)인 것인 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 스트레스 단백질이
바람직하게, 2,4-디니트로페닐 (DNP); 2,4-디니트로플루오로벤젠; 술파닐산; N-아이오도아세틸-N'-(5-술포닐-나프틸)에틸렌 디아민; 아닐린; p-아미노 벤조산; 비오틴; 플루오레세인 및 이의 유도체 (FITC, TAMRA, 및 텍사스 레드(Texas Red) 포함); 디곡시게닌; 5-니트로-3-피라졸카르바미드; 4,5-디메톡시-2-니트로신나미드; 2-(3,4-디메톡시페닐)-퀴놀린-4-카르바미드; 2,1,3-벤족사디아졸-5-카르바미드; 3-히드록시-2-퀴녹살린카르바미드, 4-(디메틸아미노)아조벤젠-4'-술폰아미드 (DABSYL); 로테논 이소옥사졸린I(E)-2-(2-(2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[b][1,4]디아제핀-4-일)페녹시)아세트아미드; 7-(디에틸아미노)-2-옥소-2H-크로멘-3-카르복실산; 2-아세트아미도-4-메틸-5-티아졸술폰아미드; 및 p-메톡시페닐피라조포도필아미드를 포함하는 군으로부터 선택되는 합텐으로;
더욱 바람직하게, 2,4-디니트로페닐 (DNP)로 합텐화되는 것인 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물 또는 백신 조성물이고, 적어도 하나의 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 약 10⁵ 내지 약 10⁸개의 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포를 포함하는 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 암의 치료에서 사용하기 위한 조성물.
(i) 스트레스성 HT-29 세포, 스트레스성 HCT-116 세포 및 스트레스성 LoVo 세포 중 하나, 및 (ii) 스트레스 단백질을 포함하는 중간 조성물(intermediate compostion)로서,
여기서 스트레스성 HT-29 세포, 스트레스성 HCT-116 세포 또는 스트레스성 LoVo 세포 중 하나는 시험관내에서 가해진 (i) 대사 스트레스, (ii) 방사선 및 (iii) 열 스트레스에 반응하여 저항성 기전을 발생시켜 스트레스 단백질을 생산하는 것인 중간 조성물.
(i) 스트레스성 HT-29 세포, 스트레스성 HCT-116 세포 또는 스트레스성 LoVo 세포 중 하나, 및 (ii) 스트레스 단백질을 포함하는 중간 조성물로서,
여기서 스트레스성 HT-29 세포, 스트레스성 HCT-116 세포 또는 스트레스성 LoVo 세포 중 하나는 시험관내에서 가해진 (i) 대사 스트레스, 및 (ii) 화학적 스트레스에 반응하여 저항성 기전을 발생시켜 스트레스 단백질을 생산하는 것인 중간 조성물.
하기 단계:
a) 적합한 배양 배지 중에서 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포를 배양하는 단계;
b) 단계 a)에서 배양된 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포에 대해 시험관내에서 하나 또는 수개의 스트레스[들]를 가하는 단계로서, 여기서 상기 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포는 하나 또는 수개의 스트레스[들]에 반응하여 저항성 기전을 발생시킴으로써 스트레스 단백질을 생산하는 것인 단계,
c) 스트레스성 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포를, 단계 b)에서 상기 세포가 생산한 스트레스 단백질과 함께 회수하는 단계, 및
d) 단계 c)에서 회수된 스트레스성 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포 및 상기 세포가 생산한 스트레스 단백질을 모두 함께, 스트레스 단백질을 면역원성으로 만들 수 있는 분자로, 또는 그러한 프로세스에 의해 처리하는 단계를 포함하는,
제8항 또는 제9항에 따른 중간 조성물을 제조하는 방법.
제10항에 있어서, 단계 c)가 단계 b)의 완료 후 적어도 몇 시간, 바람직하게, 단계 b)의 완료 후 적어도 12시간 이상 후에 수행되는 것인 방법.
제10항 또는 제11항에 있어서, 단계 d)가 면역원성을 부여할 수 있는 수단에 스트레스 단백질을 연결시키거나, 또는 상기 수단과 스트레스 단백질의 복합체를 형성(complexing)하는 것을 포함하는 것인 방법.
제12항에 있어서, 면역원성을 부여할 수 있는 수단이 합텐이고;
바람직하게, 합텐이 2,4-디니트로페닐 (DNP); 2,4-디니트로플루오로벤젠; 술파닐산; N-아이오도아세틸-N'-(5-술포닐-나프틸)에틸렌 디아민; 아닐린; p-아미노 벤조산; 비오틴; 플루오레세인 및 이의 유도체 (FITC, TAMRA, 및 텍사스 레드 포함); 디곡시게닌; 5-니트로-3-피라졸카르바미드; 4,5-디메톡시-2-니트로신나미드; 2-(3,4-디메톡시페닐)-퀴놀린-4-카르바미드; 2,1,3-벤족사디아졸-5-카르바미드; 3-히드록시-2-퀴녹살린카르바미드, 4-(디메틸아미노)아조벤젠-4'-술폰아미드 (DABSYL); 로테논 이소옥사졸린; (E)-2-(2-(2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[b][1,4]디아제핀-4-일)페녹시)아세트아미드; 7-(디에틸아미노)-2-옥소-2H-크로멘-3-카르복실산; 2-아세트아미도-4-메틸-5-티아졸술폰아미드; 및 p-메톡시페닐피라조포도필아미드를 포함하는 군으로부터 선택되고,
더욱 바람직하게, 합텐이 2,4-디니트로페닐 (DNP)인 것인 방법.
제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)가 단계 a)에서 배양된 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포에 대해 시험관내에서 하기 스트레스:
(i) 저산소 상태하에, 및/또는 낮은 pH에서, 고갈된 배지에서의 시험관내 배양;
바람직하게, 2% FBS 배양 배지 중 저혈청 배양 조건에서의 시험관내 배양,
(ii) 바람직하게, 약 1 내지 약 20분 범위의 기간 동안 약 0.25 내지 약 25 Gy, 바람직하게, 약 1 내지 약 15 Gy 범위의 총 선량(total dose)의 시험관내 방사선;
바람직하게, 약 1 내지 약 5분의 기간 동안 10 Gy의 총 선량의 시험관내 방사선, 및
(iii) 약 38℃ 내지 약 45℃ 범위의 온도에서 약 15분 내지 약 4시간 범위의 기간 동안 세포에 가해지는 시험관내 열 충격(in vitro thermic choc);
바람직하게, 약 60분의 기간 동안 약 42℃ 온도에서의 시험관내 열 충격을 동시에 또는 연속적으로 가하는 것을 포함하는,
제8항에 따른 중간 조성물을 제조하기 위한 것인 방법.
제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)가 단계 a)에서 배양된 HT-29, HCT-116 또는 LoVo 세포에 대해 시험관내에서 하기 스트레스:
(i) 저산소 상태하에, 및/또는 낮은 pH에서, 고갈된 배지에서의 시험관내 배양;
바람직하게, 2% FBS 배양 배지 중 저혈청 배양 조건에서의 시험관내 배양,
(ii) 약 6시간 내지 약 120시간 범위의 기간 동안, 적어도 하나 또는 수개의 화학요법제 및/또는 알콜에의 시험관내 노출을 동시에 또는 연속적으로 가하는 것을 포함하는,
제9항에 따른 중간 조성물을 제조하기 위한 것인 방법.
제15항에 있어서,
- 세포가 HT-29 세포이고, (ii)에서의 시험관내 노출이 약 72시간의 기간 동안 약 13 μM 옥살리플라틴에의 노출이거나; 또는
- 세포가 HCT-116 세포이고, (ii)에서의 시험관내 노출이 약 48시간의 기간 동안 약 315 nM SN-38 (7-에틸-10-히드록시-캄프토테신)에의 시험관내 노출이거나; 또는
- 세포가 LoVo 세포이고, (ii)에서의 시험관내 노출은 약 48시간의 기간 동안 약 5 μM 플루오로우라실 (5-FU)에의 시험관내 노출인 것인 방법.
하기 단계:
a. 제8항 또는 제9항에 따른 6개의 중간 조성물을 수득하는 단계로서,
여기서 6개의 중간 조성물은
1) 스트레스성 HT-29 세포 및 스트레스 단백질을 포함하는 제8항에 따른 중간 조성물,
2) 스트레스성 HCT-116 세포 및 스트레스 단백질을 포함하는 제8항에 따른 중간 조성물,
3) 스트레스성 LoVo 세포 및 스트레스 단백질을 포함하는 제8항에 따른 중간 조성물,
4) 스트레스성 HT-29 세포 및 스트레스 단백질을 포함하는 제9항에 따른 중간 조성물,
5) 스트레스성 HCT-116 세포 및 스트레스 단백질을 포함하는 제9항에 따른 중간 조성물,
6) 스트레스성 LoVo 세포 및 스트레스 단백질을 포함하는 제9항에 따른 중간 조성물인 것인 단계,
b. 상기 6개의 중간 조성물을 함께 혼합하는 단계로서;
바람직하게, 여기서 상기 6개의 중간 조성물은 스트레스성 HT-29, HCT-116 및 LoVo 세포가 동일한 비로 함께 혼합되는 것인 단계를 포함하는,
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 제조하는 방법.