KR20230152035A - 표적 단백질 분해 시스템 및 이의 응용 - Google Patents

표적 단백질 분해 시스템 및 이의 응용 Download PDF

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Abstract

소포체를 기반 표적 단백질 분해에 기초한 키메라 단백질 구조체 및 이의 응용에 관한 것이며, 예를 들어, 암, 바이러스 감염성 질병, 자가면역 질병, 신경 퇴행성 질병 등을 치료하는 데 응용된다. 상기 키메라 단백질 구조체는 소포체 관련 분해 메커니즘에 기반한 단백질 결합 도메인 및 표적 도메인을 포함한다. 키메라 단백질 구조체의 ERAD 메커니즘 단백질 결합 도메인은 바이러스 소포체 상주 단백질의 막횡단 도메인 또는 이의 기능적 변이체 및 소포체 상주 도메인 또는 이의 기능적 변이체일 수 있다. 키메라 단백질 구조체의 표적 도메인은 임의의 관심 있는 표적 단백질(target protein)을 표적할 수 있으며, 표적 단백질의 천연 리간드, 표적 단백질을 특이적으로 인식하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 키메라 단백질 구조체의 표적 도메인은 또한 항체에 의해 특이적으로 인식될 수 있는 항원일 수 있다.

Description

표적 단백질 분해 시스템 및 이의 응용
본 발명은 표적 단백질 분해 시스템 및 이의 응용에 관한 것이다. 특히 질병(암, 바이러스 감염성 질병, 자가면역 질병, 신경 퇴행성 질병을 포함하지만 이에 제한되지 않음) 치료에서의 응용에 관한 것이다.
표적성 단백질 제거는 적어도 다음과 같은 이유에서 필요하다. 1) 기초 연구에서 특정 단백질의 기능을 확정; 2) 치료성 표적점을 검증; 3) 병원성 단백질(예를 들면, 종양 단백질 혹은 신경성 퇴화를 일으키는 단백질)을 차단하는 작용; 4) 노화 과정에서 축적된 단백질 분해를 강화; 5) 세포 치료의 부작용을 감소(예를 들면, 면역원성 단백질의 발현 차단). 그러나 기존의 표적성 단백질 제거 기술은 모두 각자의 고유의 기술적 문제가 존재한다.
유전자 편집 기술(예를 들면, CRISPR 기술)은 유전자 차원에서 어떠한 표적 단백질 유전자의 인코딩을 표적 녹아웃하지만 표적 이탈 문제가 있고, 원하는 DNA 위치를 인식하고 절단하는 특이성이 낮고 염색체 불안정 등의 부작용이 쉽게 발생한다.
소간섭RNA(siRNA)는 RNA 측면에서 표적 단백질 합성을 차단할 수 있다. 그러나 siRNA는 잠재적인 표적 이탈 효과도 있다. 예를 들어, siRNA의 센스 가닥은 상동 유전자의 발현 침묵을 매개하여 센스 가닥에 의해 매개되는 표적 이탈 효과를 일으킬 수 있다. 그 외, 소핵산 서열상의 작은 불일치로 인해 다른 유전자가 침묵되어 표적 이탈 효과와 독성 부작용이 발생할 수도 있다.
단백질 분해 표적 키메라 기술 (PROTAC)은 단백질 측면에서 표적 단백질을 분해할 수 있으며, 주로 생화학적 시약으로 세포에 첨가하거나 동물이나 인체에게 투여하여 세포 내 표적 단백질의 분해를 유도한다. 초기 PROTAC은 E3 리가제의 결합을 기반으로 하는 폴리펩타이드 리간드 분자이지만 폴리펩타이드 리간드 분자를 사용하여 제조된 PROTAC의 세포 투과성이 낮고 불안정하여 분해 효율이 낮았다. E3 리가제 리간드로 소분자를 이용한 PROTAC은 현저한 유효성을 나타냈지만, 그들의 막 투과성과 생물학적 이용성이 낮았다.
따라서 표적 단백질의 표적성 제거를 위한 다양한 종래기술에 존재하는 적어도 하나의 문제점을 극복하기 위해 새로운 표적 단백질 분해 시스템이 절실히 요구된다.
한 방면으로, 본 출원은 소포체 관련 분해(ER-associated degradation，ERAD) 메커니즘을 통해 표적 단백질을 분해하는 키메라 단백질 구조체(chimeric protein construct)를 제공하고, 이는 ERAD 메커니즘 단백질 결합 도메인과 표적 도메인(targeting domain)을 포함한다. 일부 실시예에서 본 출원은 표적 단백질을 분해하는 일반적인 어셈블리를 제공하고, 이는 ERAD 메커니즘을 하이재킹하여 ER에서 표적 단백질의 수송을 방지하고 세포질로의 전위를 촉진하며, 유비퀴틴-프로테아좀 기반 UPS메커니즘을 통해 표적 단백질은 프로테아좀에 의해 유비퀴틴화하 및 분해되고, 및/또는 자가포식 리소좀의 ALP 메커니즘을 통해 표적 단백질은 리소좀에 의해 세포내이입 및 분해된다. 이 디자인은 내인성 또는 외인성 단백질을 포함한 모든 단백질을 대상으로 삼아 치료 목적으로 발현을 효과적으로 억제하고 빠르게 분해할 수 있다. 본 출원은 바이러스 요소를 재설계함으로써 다양한 내인성 표적 단백질 또는 외인성 표적 단백질을 표적화하여 소포체에서 표적 단백질의 유지 및 방향성 분해를 달성한다.
다른 한 방면으로, 본 출원은 ERAD 메커니즘 및 유비퀴틴화 메커니즘을 통해 표적 단백질을 협동 분해하는 키메라 단백질 구조체를 제공하고, 이는 ERAD 메커니즘 단백질 결합 도메인, 표적 도메인 및 추가의 단백질 분해 경로 구성원 결합 도메인을 포함한다. 이 디자인은 표적 단백질의 분해 효율을 크게 향상시킬 수 있으며, PROTAC 기술로 분해할 수 없는 많은 표적점에 적합하다.
상기 두 키메라 단백질 구조체는 본 출원에서 TPD(Targeted Protein Degradation) 키메라 단백질 구조체로도 불린다. 본 출원은 또한 상기 키메라 단백질 구조체를 인코딩하는 핵산, 핵산 벡터, 종양 용해 바이러스 및 상기 키메라 단백질 구조체를 발현하는 세포를 제공하고, 및 질병 치료를 위한 이들의 용도를 제공한다.
실시예1. 소포체 관련 분해(ER-associated degradation, ERAD) 메커니즘 단백질 결합 도메인과 표적 도메인을 포함하는 키메라 단백질 구조체.
실시예2. 실시예1의 상기 키메라 단백질 구조체에 있어서, 상기 ERAD 메커니즘 단백질 결합 도메인은 바이러스 소포체 상주 단백질의 막횡단 도메인 또는 이의 기능적 변이체 및 소포체 상주 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
실시예3. 실시예1 또는 실시예2의 상기 키메라 단백질 구조체에 있어서, 상기 바이러스 소포체 상주 단백질은 아데노바이러스 E3-19K이다.
실시예4. 실시예1 또는 실시예2의 상기 키메라 단백질 구조체에 있어서, 상기 바이러스 소포체 상주 단백질은 아데노바이러스 E3-19K가 아니다.
실시예5. 실시예4의 상기 키메라 단백질 구조체에 있어서, 상기 바이러스 소포체 상주 단백질은 다음 중 적어도 하나로부터 선택된다: HCMV 당단백질 US2, US11, US3, US10, US6, HSV ICP47, CPXV12, BHV UL49.5, EBV BNFL2a, HCMV UL16, UL141, UL142, HIV Nef, HIV Vpu, HHV-7 U21, HHV-8 KK3, HHV-8 KK5, MHV-68 MK3, HTLV-1 p12, Cowpox Virus단백질CPXV203.
실시예6. 상기 실시예 중 어느 하나에 따른 상기 키메라 단백질 구조체는 단백질 분해 경로 구성원(예를 들어, E3 유비퀴틴 리가제, 프로테아좀, 리소좀) 결합 도메인을 더 포함하고，선택적으로, 상기 단백질 분해 경로 구성원 결합 도메인은 상기 ERAD 메커니즘 단백질 결합 도메인에 연결된다.
실시예7. 상기 실시예 중 어느 하나에 따른 상기 키메라 단백질 구조체에 있어서, 상기 표적 도메인은 표적 단백질을 특이적으로 표적하는 항체 및 이의 기능성 단편(예를 들어, Fd, Fv, Fab, Fab', F(ab')2, Fv(scFv), 단일 사슬 항체(scFv), 나노바디(nanobody), 디아바디(diabody), 트라이바디 및 테라바디)을 포함한다.
실시예8. 실시예7의 상기 키메라 단백질 구조체에 있어서, 상기 표적 단백질은 병원성 단백질이고, 선택적으로, 상기 병원성 단백질은 종양 관련 단백질, 바이러스 관련 단백질, 면역 기능 관련 단백질(면역 억제 단백질 및 면역 활성화 단백질을 포함), 자가항원 단백질, 또는 신경 퇴행성 질병 관련 단백질이다.
실시예9. 실시예8의 상기 키메라 단백질 구조체에 있어서, 상기 자가항원 단백질은 다음과 같이 구성된 그룹에서 선택된다: I형 당뇨병과 관련된 자가항원, 예를 들어, 섬세포항원(ICA), 인슐린(IAA), 글루타메이트 탈탄산효소65(GAD65), 인슐린종항원-2(IA-2); 류마티스 관절염(RA) 관련 자가항원(autoantigen), 예를 들어, 시트룰린화 단백질/펩티드 항체, 이종리보핵단백질(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1), 알돌라아제(aldolase), 알파-에놀라아제(alpha-enolase), 칼레티쿨린(calreticulin), 열활성단백질(HSP60), BiP, PGK1, 스트레스 유발 인산 단백질 (stress-induced phosphoprotein 1), FUSE-BP1/2: 전신 홍반 루푸스(SLE)와 관련된 자가항원, 예를 들어, 디옥시리보핵단백질, SmD1, SmD3, Clq, 부스럼항응고물(LA), 카디오리핀(CL), β2당단백질I(β2GPI), 프로트롬빈(PT) 및 포스파티딜세린(PS); 전신성 경화증(Systemic Sclerosis, SSc)/경피증(scleroderma, SD)과 관련된 자가항원, 예를 들어, Scl-70, SSA, Ro52； 자가면역성 간 질병과 관련된 항원, 예를 들어, 미토콘드리아 항원, Spl00, PML, gp210, p62; 중증 근무력증과 관련된 자가항원, 예를 들어, 아세틸콜린 수용체; 중추 신경계 자가면역 질병(변연 뇌염, 뇌척수염, 소뇌 운동 실조증)과 관련된 자가항원, 예를 들어, 전압-게이트 칼륨 채널(VGKC) 복합체, 전압-게이트 칼슘 채널 수용체, α-아미노-3-하이드록시-5-메틸이소옥사졸-4-프로피온산(AMPA) 수용체, γ-아미노부티르산-B(GABAB) 수용체, 글리신 수용체; 다발성 경화증과 관련된 자가항원, 예를 들어, 미엘린 알칼리성 단백질(MBP), 미엘린 올리고덴드론사이트 당단백질(MOG); 다발성 근염(PM) 및 피부근염(DM)과 관련된 자가항원, 예를 들어, Jo-1, Mi-2, PM-Scl, Ro-52；글루텐 민감성 장질병 관련 자가항원, 예를 들어, 근내막 항체(EMA), 조직 트랜스글루타미나제(tTG); 항-NMDAR 항체 뇌염과 관련된 자가항원, 예를 들어, N-메틸-D-아스파르트산 수용체; 시신경척수염(NMO)과 관련된 자가항원, 예를 들어, 아쿠아포린 4(AQP4); 생식과 관련된 자가항원, 예를 들어, 난소 항원, 정자 항원.
실시예10. 실시예9의 상기 키메라 단백질 구조체에 있어서, 상기 종양 관련 단백질은 다음과 같이 구성된 그룹에서 선택된 발암 유전자에 의해 인코딩 된다: BCL-2, c-MYC, Ras, HER2, BCR/ABL, ABL1/BCR, TGFB1, TLX1, P53, WNT1, WNT2, WT1, αv-β3, PKCa, ABL, BCL1, CD24, CDK4, EGFR/ERBB-1, HSTF1, INT1/WNT1, INT2, MDM2, MET, MYB, MYC, MYCN, MYCL1, RAFI, NRAS, REL, AKT2, APC, BCL2-ALPHA, BCL2-BETA, BCL3, BCR, BRCA1, BRCA2, CBL, CCND1, CDKN1A, CDKN1C, CDKN2A, CDKN2B, CRK, CRK-II, CSF1R/FMS, DBL, DDOST, PMS-2, PRAD-1, RAF, RHOM-1, RHOM-2, SIS, TAL2, TANI, TIAM1, TSC2, TRK, TSC1, STK11, PTCH, MEN1, MEN2, P57/KIP2, PTEN, HPC1, ATM, XPA/XPG, BCL6, DEK, AKAP13, CDH1, BLM, EWSR1/FLI1, FES, FGF3, FER, FGR, FLI1/ERGB2, FOS, FPS/FES, FRA1, FRA2, FYN, HCK, HEK, HER3/ERBB-2, ERBB-3, HER4/ERBB-4, HST2, INK4A, INK4B, JUN, JUNB, JUND, KIP2, KIT, KRAS2A, KRAS2B, LCK, LYN, MAS, MAX, MCC, MLH1, MOS, MSH2, MYBA, MYBB, NF1, NF2, P53, PDGFB, PIM1, PTC, RBI, RET, ROS1, SKI, SRC1, TALI, TGFBR2, THRA1, THRB, TIAM1, TRK, VAV, VHL, WAF1, WNT2, WT1, YES1, ALK/NPM1, AMI1, AXL, FMS, GIP, GLI, GSP, HOX11, HST, IL3, INT2, KS3, K-SAM, LBC, DCC, DPC4/SMAD4, E-CAD, E2F1/RBAP, ELK1, ELK3, EPH, EPHA1, E2F1, EPHA3, ERG, ETS1, ETS2, LMO-1, LMO-2, L-MYC, LYL1, LYT-10, MDM-2, MLH1, MLL, MLM, N-MYC, OST, PAX-5, PMS-1, FGF4, FGF6, FANCA, FLI1/ERGB2, FOSL1, FOSL2, GLI, HRAS1, HRX/MLLT1, HRX/MLLT2, KRAS2, MADH4, MASI, MCF2, MLLT1/MLL, MLLT2/HRX, MTG8/RUNX1, MYCLK1, MYH11/CBFB, NFKB2, NOTCH1, NPM1/ALK, NRG/REL, NTRK1, PBX1/TCF3, PML/RARA, PRCA1, RUNX1, RUNX1/CBFA2T1, SET, SHP2, TCF3/PBX1, TNFa, Clusterin, Survivin, ΤΟΕβ, c-fos, c-SRC, 에스트로겐 수용체 유전자 (estrogen receptor ER-α), 안드로겐 수용체 유전자 (Androgen receptor，AR) 및 INT-1，선택적으로, 상기 종양 관련 단백질은 다음과 같이 구성된 그룹에서 선택된다: Bcl-2가족구성원(예: Bcl-2, Bcl-xL과Bcl-w), VEGF/VEGFR, PDGFRβ, EGFR, EGFR돌연변이체, IGF-1R, HDACs, HER2, MYC, KRAS, AFP, CEA, CA199, 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor ER-α), 안드로겐 수용체 (Androgen receptor，AR), 타이로신 키나아제 (c-ABL, BCR-ABL, BTK, FAK, PTK6, Wee1, TRK 막횡단 수용체), 세린/트레오닌 산 키나아제 수용체(IRAK4, LRRK2, B-Raf, RIPK2, CDK4/6, CDK7, CDK8, CDK8/19, CDK9, TBK1), 단백질키나아제Ⅱ(CK2), 후성유전학적 관련 단백질(BRD2, BRD3, BRD4, BRDT, TRIM24, BRD9, PBRM1, SMARCA2, SMARCA4, EP300, EZH2, WDR5), 부신 수질 호르몬(ADM), DPP3.
실시예11. 실시예8의 상기 키메라 단백질 구조체에 있어서, 상기 병원성 단백질은 바이러스 관련 단백질이고 다음과 같은 구성 그룹에서 선택된다: HBV 표면 항원, HBV 캡시드 당단백질, HBeAg, HBV DNA폴리메라아제, HBV인코딩된X단백질(HBx), HIV Gag단백질, HIV Env단백질, HIV gp120, HIV-1역전사 효소, HIV gp120, HCV NS3-4A프로테아제, HCV RNA폴리메라아제, HCV외피(envelope)단백질, EBV DNA폴리메라아제, EBV EBNA1, 코로나바이러스 RNA 합성 효소, 코로나바이러스 스파이크 단백질, 코로나바이러스 외피 단백질, 코로나바이러스 막 단백질, 코로나바이러스 뉴클레오캡시드 단백질, RNA의존성RNA폴리메라아제(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)，예를 들어, 신종 코로나바이러스 RNA의존성RNA폴리메라아제, 헤르페스 바이러스(Herpesviruses)DNA과RNA폴리메라아제, 헤르페스 바이러스 캡시드 당단백질, CMV DNA폴리메라아제, CMV캡스드 당단백질, RSV외피 단백질, RSV캡시드 단백질, RSV RNA폴리메라이제, 인플루엔자 바이러스 RNA폴리메라아제, 인플루엔자 바이러스 외피(envelope)단백질, HPV DNA폴리메라아제, HP캡스드 단백질.
실시예12. 실시예7의 상기 키메라 단백질 구조체에 있어서, 상기 표적 단백질은 면역 기능과 관련된 단백질이고 다음과 같은 구성 그룹에서 선택된다: 항원 제시 분자(예를 들어, MHC 글래스 I분자, MHC 글래스 II분자, MICA/B분자 등), 항원 인식 분자(예를 들어, TCR, CD123, NKG2D 등), 면역 체크포인트 분자(예를 들어, PD-1, PD-L1, CTLA4, TIM3, TIGIT, LAG3, A2AR, BTLA, IDO1, IDO2, TDO, KIR, NOX2, VISTA, SIGLEC7, PVR 등), 면역 자극/공동 자극 분자(예를 들어, CD3, CD80/86, CD28 등).
실시예13. 실시예7의 상기 키메라 단백질 구조체에 있어서, 상기 표적 단백질은 신경계 질병과 관련된 표적 단백질이고 다음과 같은 구성 그룹에서 선택된다: Tau, β-아밀로이드 단백질(amyloid-β(Aβ)), α시뉴클레인, 돌연변이 헌팅틴(mutant huntingtin，mHTT), α-시뉴클레인, TAR RNA결합 단백질(TARDBP)과 FUS RNA결합단백질(FUS).
실시예14. 실시예2, 실시예 4 또는 실시예 5의 상기 키메라 단백질 구조체에 있어서, 상기 표적 도메인은 TCR에 특이적으로 결합하지 않는다.
실시예15. 실시예14의 상기 키메라 단백질 구조체에 있어서, 상기 표적 도메인은 MHC I, MHC II, MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5 및/또는 ULBP6에 특이적으로 결합하고; 바람직하게는, MHC I는 HLA I이고; 바람직하게는, MHC II는 HLA II이다.
실시예16. 실시예4의 상기 키메라 단백질 구조체에 있어서, 상기 표적 도메인은 TCR에 특이적으로 결합한다.
실시예17. 실시예16의 상기 키메라 단백질 구조체에 있어서, 상기 바이러스 소포체 상주 단백질은 다음 중 적어도 하나로부터 선택된다: HCMV당단백질US2, US11, US3, US10, US6, HSV ICP47, CPXV12, BHV UL49.5, EBV BNFL2a, HCMV UL16, UL141, UL142, HIV Nef, HIV Vpu, HHV-7 U21, HHV-8 KK3, HHV-8 KK5, MHV-68 MK3, HTLV-1 p12, Cowpox Virus단백질CPXV203.
실시예18. 상기 실시예 중 어느 하나에 따른 상기 키메라 단백질 구조체는 적어도 하나의 공동 발현 부분과 연결된다.
실시예19. 실시예18의 상기 키메라 단백질 구조체에 있어서, 상기 적어도 하나의 공동 발현 부분은, 완전한 바이러스 ER 상주 당단백질(예: HCMV US2, US3, US11, US10, 아데노바이러스E3-Kl 9, HCMV US6, HSV ICP47), 키메라 항원 수용체(CAR), 기능성T세포수용체(TCR), 케모카인 수용체, 및 NK 세포 활성화 수용체에서 독립적으로 선택된다.
실시예20. 실시예19의 상기 키메라 단백질 구조체에 있어서, 상기 케모카인 수용체는, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR9, CCR2b, CXCR1, CXCR2 및 CXCR에서 선택된다.
실시예21. 실시예20의 상기 키메라 단백질 구조체에 있어서, 상기 NK세포 활성화 수용체는 다음을 포함한다: (a)NK세포 활성화 수용체 세포 외 도메인(ED) 또는 그 기능적 변이체，(b)NK세포 활성화 수용체의 막횡단 도메인(TMD) 또는 그 기능적 변이체，및 (c)NK세포 활성화 수용체 세포내 도메인(ICD) 또는 그 기능적 변이체；선택적으로, 힌지 또는 링커는 상기 NK세포 활성화 세포 외 도메인 또는 그 기능적 변이체, 상기 NK세포 활성화 수용체 막횡단 도메인 또는 그 기능적 변이체 및/또는 상기 NK세포 활성화 수용체의 세포내 도메인 또는 그 기능적 변이체 사이에 포함된다.
실시예22. 실시예21의 상기 키메라 단백질 구조체에 있어서, 상기 NK세포 활성화 수용체는 NKG2D, NKG2C, NKG2E, NKG2F, NKG2H, CD94, KIR2DL4, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR3DS1，천연 세포 독성 수용체, TRAIL, DNAM-1, CD16a, 2B4, NTB-A, CRACC 및 NKp80에서 선택된다.
실시예23. 실시예21 또는 실시예 22의 상기 키메라 단백질 구조체에 있어서, 상기 NK세포 활성화 수용체는 CNK 신호 전달 구성 요소와 복합체를 형성한다.
실시예24. 실시예18-23 중 어느 하나에 따른 상기 키메라 단백질 구조체에 있어서, 상기 적어도 하나의 공동 발현한 부분은 절단 가능한 링커를 통해 상기 키메라 단백질 구조체에 연결된다.
실시예25. 실시예 1-24 중 어느 하나에 따른 상기 키메라 단백질 구조체를 인코딩하는 핵산분자.
실시예26. 실시예25의 상기 핵산 분자는, 디옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA)(예: mRNA, 원형 RNA, ccRNA), 트레오스 핵산(TNA), 글리콜 핵산(GNA), 펩타이드 핵산(PNA), 잠긴 핵산(LNA, β-D-리보스 구성을 갖는 LNA, α-L-리보스 구성을 갖는 α-LNA(LNA의 비대칭 이성질체가 포함), 2'-아미노 기능화된 2'-아미노-LNA 및 2'-아미노 기능화된 2'-아미노-α-LNA를 포함), 에틸렌 핵산(ENA), 시클로헥세닐 핵산(CeNA) 및/또는 이들의 키메라 및/또는 조합이다.
실시예27. 실시예25 또는 실시예 26의 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터에 있어서, 상기 핵산 분자는 상기 핵산 분자에 의해 인코딩된 키메라 단백질 구조체를 발현하기 위해 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 조절 요소에 작동 가능하게 연결할 수 있다.
실시예28. 실시예27의 상기 벡터에 있어서, 상기 벡터는 다음과 같이 구성된 그룹에서 선택된다: 플라스미드, 나노 플라스미드, 코스미드, 바이러스 벡터(예: 종양 용해성 바이러스 벡터), 미니서클, RNA 벡터 또는 선형 또는 원형 DNA(예: 트랜스포존 DNA) 또는 RNA 분자.
실시예29. 실시예28의 상기 벡터에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터이고 다음과 같이 구성된 그룹에서 선택된다: 레트로바이러스, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스, 파보바이러스(예: 아데노 연관 바이러스), 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터, 코로나바이러스, 음성 가닥 RNA 바이러스 예를 들어 오르코믹소바이러스(예: 인플루엔자 바이러스), 라브도바이러스(예: 광견병 및 수포성 구내염 바이러스), 파라믹소바이러스(예: 홍역 및 센다이), 양성 가닥 RNA 바이러스(예를 들어, 피코르나바이러스), 알파바이러스 및 이중 가닥 DNA 바이러스. 상기 이중 가닥 DNA 바이러스는 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스(예: 단순 헤르페스 바이러스 유형 I 및 II, 엡스타인-바 바이러스, 거대세포바이러스) 및 폭스 바이러스(예: 우두, 계두, 카나리아폭스), 노워크바이러스, 토가바이러스, 플라비바이러스, 레오바이러스, 파포바이러스, 헤파드나바이러스, 바큘로바이러스 및 간염 바이러스, 바이러스 유사 입자(VLP)를 포함한다.
실시예30. 실시예29의 상기 벡터에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다.
실시예31. 실시예30의 상기 벡터에 있어서, 상기 레트로바이러스 벡터는 조류 백혈구 증식 육종, 포유류 C형, B형 바이러스, D형 바이러스, HTLV-BLV 수집, 렌티바이러스, 버블 바이러스로부터 선택된다.
실시예32. 실시예29의 상기 벡터에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
실시예33. 실시예32의 상기 벡터에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터는 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV 또는 양의 탈수초성 뇌백질염 렌티바이러스로부터 선택된다.
실시예34. 실시예27-33 중 어느 하나에 따른 상기 벡터는, 다른 벡터와 더 결합할 수 있으며, 상기 다른 벡터는 다른 핵산 분자를 포함할 수 있으며, 상기 다른 핵산 분자는 적어도 하나의 공동 발현 부분을 인코딩한다.
실시예35. 실시예1-25 중 어느 하나에 따른 상기 키메라 단백질 구조체를 발현하거나, 실시예 26의 상기 핵산 분자를 포함하거나, 실시예27-33 중 어느 하나에 따른 상기 벡터를 포함하는 조작된 세포(engineered cell).
실시예36. 실시예35의 상기 조작된 세포는 실시예1-18 중 어느 하나에 따른 상기 키메라 단백질 구조체, 및 공동 발현 부분을 발현한다.
실시예37. 실시예35 또는 실시예 36의 상기 조작된 세포에 있어서, 상기 세포는 면역 세포이고, T세포, 자연 살해(NK)세포, B세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포, 호중구 또는 γδT세포에서 선택된다.
실시예38. 실시예37의 상기 조작된 세포에 있어서, 상기 T세포는 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 세포 독성 T 세포, 말단 이펙터 T 세포, 기억 T 세포, 순진 T 세포, 조절 T 세포로 구성된 세포 집단, 자연 살해 T 세포, 감마-델타 T 세포, 사이토카인 유도 살해(CIK) T 세포, 종양 침윤 림프구에서 선택된다.
실시예39. 실시예35-38 중 어느 하나에 따른 상기 조작된 세포를 생산하는 방법은, 실시예 25 또는 실시예 26의 상기 핵산 분자를 발현하기에 적합한 조건하에서, 실시예 27-34 중 어느 하나에 따른 상기 벡터를 개시 세포에 도입하는 것을 포함한다.
실시예40. 실시예39의 상기 방법에 있어서, 상기 개시 세포는 줄기 세포 또는 줄기 세포로부터 분화된 세포이다.
실시예41. 실시예38의 상기 방법에 있어서, 상기 줄기 세포는 조혈 전구 세포(예를 들어, T 세포 전구 세포, NK 세포 전구 세포, 대식세포 전구 세포), 조혈 줄기 세포(HSC), CD34+ 세포, 배아 세포주 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포 또는 iPSC 세포이다.
실시예42. 실시예37의 상기 방법에 있어서, 상기 세포는 면역 세포이다.
실시예43. 실시예40의 상기 방법에 있어서, 상기 면역 세포는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, B 세포, 대식세포, 단핵구, 또는 수지상 세포이다.
실시예44. 실시예41의 상기 방법에 있어서, 상기 T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 세포 독성 T 세포, 말단 이펙터 T 세포, 기억 T 세포, 순진 T 세포, 조절 T 세포로 구성된 세포 집단, 자연 살해 T 세포, 감마-델타 T 세포, 사이토카인 유도 살해(CIK) T 세포, 종양 침윤 림프구에서 선택된다.
실시예45. 실시예39-44 중 어느 하나에 따른 상기 방법에 의해 생체외에서 생성되는 세포 집단.
실시예46. 약물 조성물 또는 키트에 있어서, (i) 실시예1-24 중 어느 하나에 따른 상기 키메라 단백질 구조체 또는 실시예25 또는 실시예26의 상기 핵산 분자 또는 실시예27-34 중 어느 하나에 따른 상기 벡터 또는 실시예35-38 중 어느 하나에 따른 상기 조작된 세포 또는 실시예 45의 상기 세포 집단, 및 (ii) 약학적으로 허용되는 비히클을 포함한다.
실시예47. 실시예27-34 중 어느 하나에 따른 상기 벡터를 표적 단백질을 발현하는 세포로 전달하는 것을 포함하는 표적 단백질을 분해하는 방법.
실시예48. 실시예47의 상기 방법에 있어서, 상기 세포는 종양 세포, 바이러스 감염 세포, 신경 세포, 이식된 세포, 면역 세포에서 선택된다.
실시예49. 실시예47 또는 실시예 48의 상기 방법에 있어서, 상기 전달은 바이러스 벡터(예를 들어, 종양 용해 바이러스)를 통해 전달되는 것을 포함한다.
실시예50. 실시예49의 상기 방법에 있어서, 상기 벡터는 상기 세포 내에서 실시예1-24 중 어느 하나에 따른 상기 키메라 단백질 구조체를 발현한다.
실시예51. 실시예50의 상기 방법에 있어서, 상기 키메라 단백질 구조체는 표적 단백질과 ERAD 메커니즘 단백질에 동시에 결합하여 상기 표적 단백질을 분해할 수 있다.
실시예52. 치료가 필요한 대상체의 상태 또는 질병을 치료하는 방법으로서,
상기 대상체에게 치료 유효량의 실시예46의 상기 약물 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
실시예53. 실시예50의 상기 방법에 있어서, 상기 질병은 다양한 고형 종양 및 혈액학 종양, 바이러스 감염성 질병, 자가면역 질병 및 신경 및 퇴행성 질병(예: 알츠하이머 질병), 대사성 질병(예: 당뇨병(예: II형 당뇨병), 지질 대사 관련 질병(예: 종양 지질 대사, 비알코올 지방간), 죽상경화증(Atherosclerosis, AS), 종양 포도당 대사)을 포함한다.
바람직하게는, 상기 고형 종양은 신경계 종양, 두경부 종양, 흉부 종양, 소화기 계통 종양, 비뇨생식 계통 종양, 연조직 및 피부 종양, 골종양 등에서 선택된다.
바람직하게는, 신경계 종양은 확산성 신경교종, 확산성 성상세포종 및 역형성 성상세포종, 교모세포종, 희소돌기아교세포종, 핍지교성상세포종, 확산성 신경교종, 기타 성상세포종, 죄질피복세포종, 신경세포와 혼합 신경아교종, 수모세포종, 기타 배아성 종양, 신경초종, 수막종, 고립성 섬유종 및 혈관주위세포종 등을 포함한다.
바람직하게는, 두경부 종양은 비강의 내강과 부비동의 악성 종양, 비인두암, 구강암, 후두암, 침샘 종양, 두개 내 종양, 갑상선암, 설암 등을 포함한다.
바람직하게는, 흉부 종양은 폐암, 식도암, 분문암, 유방암, 종격막 종양 등을 포함한다.
바람직하게는, 소화기 계통 종양은 위암, S상 결장암 및 직장암, 간암, 췌장암과 팽대부주위암, 담도암, 소장의 악성종양 등을 포함한다.
바람직하게는, 비뇨생식 계통 종양은 신장암, 전립선암, 방광암, 고환암, 음경암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암 등을 포함한다.
바람직하게는, 연조직 및 피부 종양은 악성 섬유 조직 세포종, 횡문근육종, 활막육종, 피부의 악성 흑색종 등을 포함한다.
바람직하게는, 골종양은 골육종, 유잉육종 등을 포함한다.
바람직하게는, 상기 결장암은 결장선종이다.
바람직하게는, 상기 유방암은 삼중 음성 유방암 세포이다.
바람직하게는, 상기 간암은 간세포 암종이다.
바람직하게는, 상기 질병은 백혈병, 림프종(HL), 다발성 골수종(MM), 골수이형성성증후군(MDS) 등에서 선택되는 혈액 종양이다.
바람직하게는, 상기 백혈병은 B세포 급성림프구성백혈병, T세포 급성림프구성백혈병, 급성골수성백혈병 등이다.
바람직하게는, 바이러스 감염성 질병은 호흡기 바이러스성 질병, 위장 바이러스성 질병, 간 바이러스성 질병, 피부 및 점막 바이러스성 질병, 안구 바이러스성 질병, 중추신경계 바이러스성 질병, 림프구성 바이러스성 질병, 곤충 매개 바이러스성 질병, 렌티바이러스 감염 질병 등이 포함된다.
바람직하게는, 호흡기 바이러스성 질병은 라이노 바이러스, 아데노 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 파라 인플루엔자 바이러스, 코로나바이러스, 인플루엔자, 유행성 이하선염의 감염 등이 포함된다.
바람직하게는, 위장 바이러스성 질병은 소아마비, 쿡사키 바이러스 감염, ECHO 바이러스 감염, 바이러스성 위장염이 포함되고, 로타 바이러스 위장염은 노르워크 바이러스 위장염, 아데노 바이러스 위장염, 아스트로 바이러스 위장염, 코로나 바이러스 위장염, 칼리시 바이러스 위장염 등이 포함된다.
바람직하게는, 간 바이러스성 질병에는 바이러스성 A형 간염, 바이러스성 B형 간염, 바이러스성 C형 간염, 바이러스성 D형 간염, 바이러스성 E형 간염, 엡스타인-바 바이러스성 간염, 거대 세포 바이러스 간염 등이 포함된다.
바람직하게는, 피부 및 점막 바이러스성 질병은 홍역, 풍진, 영아 급성 발진, 수두 및 대상 포진, 천연두, 단순 포진 바이러스 감염, 광견병 및 구제역 등이 포함된다.
바람직하게는, 안구 바이러스성 질병은 유행성 각결막염, 여포성 결막염, 헤르페스성 각결막염 등이 포함된다.
바람직하게는, 중추신경계 바이러스성 질병은 일본뇌염, 서부말뇌염, 동부말뇌염, 세인트루이스뇌염, 베네수엘라말뇌염, 머레이밸리뇌염, 캘리포니아뇌염, 산림뇌염 및 림프구성 맥락막총수막염 등이 포함된다.
바람직하게는, 림프구성 바이러스성 질병은 전염성 단핵증, 거대 세포 바이러스 감염 및 후천성 면역 결핍 증후군 등이 포함된다.
바람직하게는, 곤충 매개 바이러스성 질병은 유행성 출혈열이 포함되고, 황열, 크림-콩고 출혈열, 리프트밸리열, 아르헨티나 출혈열, 볼리비아 출혈열, 라싸열, 오무스크럽 출혈열, 마르부르크병, 에볼라 출혈열 등이 포함되며, 뎅기열 및 뎅기출혈열, 웨스트나일열, 콜로라도 진드기 열전달병, 모래파리열 등이 포함된다.
바람직하게는, 렌티바이러스 감염 질병은 아급성 경화범뇌염, 쿠루병, 진행성 다초점 백색질뇌증, 아급성 해면상 뇌병증(피질선조체 척수 변성) 등이 포함된다.
바람직하게는, 자가면역 질병은 장기 특이적 자가면역 질병과 전신성 자가면역 질병이 포함된다.
바람직하게는, 장기 특이적 자가면역 질병은 만성 림프구 갑상선염, 갑상선 기능 항진증, 인슐린 의존성 당뇨병, 중증 근무력증, 궤양성 대장염, 만성 위축성 위염을 동반한 악성빈혈, 폐출혈성 신염 증후군, 심상성천포창, 유천포창, 원발성 담도성 간경변, 다발성 경화증, 급성 특발성 다발 신경염 등이 포함된다.
바람직하게는, 전신성 자가면역 질병은 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 전신 혈관염, 경피증, 천포창, 피부근염, 혼합 결합 조직 질병, 자가면역 용혈성 빈혈, 갑상선 자가면역 질병, 궤양성 대장염 등이 포함된다.
바람직하게는, 신경 질병은 신경계 질병, 삼차 신경통과 같은 말초 신경 질병, 안면 마비, 반안면 경련, 전정 신경염, 설인 신경통, 단신경 질병, 상완 신경총 신경통, 다발성 단신경 병증, 다발성 신경 병증, 급성 염증성 탈수초성 다발성 신경 병증, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경 병증이 포함된다.
척수질병은 척수염, 압박성 척수증, 아급성 복합 척수변성, 척수공동증, 척수혈관병증, 척수지주막염 등이다.
뇌혈관질병은 일과성 허혈성 발작, 뇌경색, 뇌출혈, 지주막하출혈, 두개내정맥계 혈전증 등이다.
중추신경계 감염성 질병은 바이러스, 박테리아, 곰팡이 또는 기생충 등의 감염으로 인한 뇌수막염, 뇌염 등, 및 렌티바이러스 감염으로 인한 렌티바이러스성 뇌염 등이다.
중추신경계 탈수축성 질병은 다발성 경화증, 시신경척수염, 급성 파종성 뇌척수염, 대뇌백질이영양증 등이다.
운동장애질병은 파킨슨병, 무도병, 간렌즈핵변성, 근긴장이상증, 본태성 진전, 지연성운동장애 등이다.
뇌전증;
두통은 편두통, 긴장성 두통, 군발성 두통 등이다.
신경계 변성 질활은 운동뉴런질병, 알츠하이머병, 루이소체치매, 전측두엽 치매, 다계통 위축증 등이다.
신경계 유전성 질병은 유전성 운동 실조, 유전성 강직성 하반신 마비, 샤르코-마리-투스병, 신경섬유종증, 결절성 경화증, 뇌혈관종양증 등이다.
신경계 발달 장애 질병은 선천성 수두증, 뇌성마비, 두개저함입증, 소뇌 편도하 질병 등이다.
신경근 접합부과 근육 질병은 중증근무력증, 주기성마비, 다발성근염, 진행성근영양증, 근강직성근병증(근긴장성이영양증, 선천성근강직증), 대사성근병증(미토콘드리아근병증, 지질축적근병증, 당원축적증) 등이다.
자율 신경계 질병은 레이노병, 지단홍통증, 반안면 위축증, 전신성 자율 기능 부전, 자발적 다한증, 진행성 지방 이영양증 등이다.
신경계 종양은 신경교종, 림프종, 수막종 등이다.
신경계 부종양증후군은 부종양 소뇌변성, 부종양 뇌척수염, 아급성 괴사성 척수증, 아급성 운동신경질병, 부종양 감각신경질병 등이다.
바람직하게는, 대사성 질병은 당뇨병, 고지혈증, 통풍 등이다.
실시예54. 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법으로서, 상기 방법은 대상체에게 치료 유효량의 실시예46의 상기 약물 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
도 1은 소포체를 기반 표적 단백질 분해 기술의 키메라 단백질 구조체를 나타내고, 그 중 도 1A는 기본 ER-TPD 키메라 단백질 구조체 TBD-TMD-ERD의 선형 및 구조 개략도 이고, 도 1B는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체 TBD-TMD-ERD의 작동 구조 원리를 나타낸다.
도 2는 E3 유비퀴틴 리가제 리간드 도메인을 갖는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체 TBD-TMD-ERD-E3L을 나타내고, 그 중 도 2A는 선형 개략도 이고, 도 2B는 구조 개략도 이며, 도 2C는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체 TBD-TMD-ERD-E3L의 작동 구조적 원리를 나타낸다.
도 3은 E2 유비퀴틴 결합 효소 리간드 도메인을 갖는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체 TBD-TMD-ERD-E2L을 나타내고, 그 중 3A는 선형 개략도 이고, 도 3B는 구조 개략도 이며, 도 3C는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체 TBD-TMD-ERD-E3L의 작동 구조 원리를 나타낸다.
도 4는 리소좀 리간드 도메인을 갖은 ER-TPD 키메라 단백질 구조체 TBD-TMD-ERD-LL을 나타내고, 그 중 도 4A는 선형 개략도 이고, 도 4B는 구조 개략도 이며, 도 4C는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체 TBD-TMD-ERD-LL의 작동 구조 원리를 나타낸다.
도 5는 E3 유비퀴틴화 리가제 리간드와 리소좀 리간드 조합의 ER-TPD 키메라 단백질 구조체 TBD-TMD-ERD-E3L-LL을 나타내고, 그 중 5A는 선형 개략도 이고, 도 5B는 구조 개략도 이며, 도 5C는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체 TBD-TMD-ERD-E3L-LL의 작동 구조 원리를 나타낸다.
도 6은 TCR을 표적으로 하여 ER-TPD 키메라 핵산 구조 TCR-ER-TPD를 나타내고, 그 중 도 6A는 키메라 핵산 구조 TCR-TPD1을 나타내며; 도 6B는 키메라 핵산 구조 TCR -TPD2를 나타낸다.
도 7은 48시간(A), 96시간(B) 및 6일째(C)에 TCR ER-TPD Jurkat 세포의 세포 표현형 검출 결과를 나타낸다.
도 8은 단일 렌티바이러스 발현 벡터와 EF1α 프로모터를 프로모터로 사용하여 설계된 발현 벡터를 나타내고, 그 중 도 8A는 CNK 발현 벡터를 나타내며; 도 8B는 키메라 단백질 구조체 HLA-ER-TPD를 나타내며; 도 8C는 키메라 단백질 구조체 CNK-HLA-ER-TPD를 나타낸다.
도 9는 CNK 발현 벡터와 결합된 HLA-abc를 표적으로 하여 ER-TPD 키메라 핵산 구조체에 감염된 293개 세포의 세포 표현형에 대한 48h 유세포분석 결과를 나타낸다.
도 10은 CD123을 표적으로 하는 ER-TPD 키메라 핵산 구조체를 나타내고, 도 10A는 CNK 발현 벡터를 나타내며, 도 10B는 키메라 단백질 구조체 HLA-TPD를 나타낸다.
도 11은 CD123을 표적으로 하는 scFv TPD 키메라 핵산 구조체로 형질감염된 급성 골수성 백혈병 세포주 THP1의 세포 표현형의 48h 유세포분석 결과를 나타낸다.
도 12는 CD123을 표적으로 하는 ER-TPD-CD123 CAR-T 세포의 적용을 나타내고, 그 중도 12A1은 CD123 CAR를 나타내며, 도 12B1은 활성화된 T세포에서의 CD123의 발현을 나타내며, 도 12C1은 CAR-T 세포 표적으로 하는 CD123은 종양세포의 활성화, 배양 및 사멸 과정에서 자기살해 효과를 낼 수 있는 것을 나타낸다; 도 12A2는 CD123 CAR-T2A-CD123 ER-TPD 키메라 단백질 구조체를 나타내고, 도 12B2는 키메라 단백질 구조체의 발현이 자기발현 CD123을 분해할 수 있는 것을 나타내며, 도 12C2는 키메라 단백질 구조체의 발현 후 종양세포에서의 사멸 효과를 나타낸다.
도 13은 자가면역 질병 치료에서 자가항체를 표적으로 하는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체의 적용을 나타내고, 그 중 도 13A는 I형 당뇨병 환자의 형질세포에서 인슐린 항체의 발현 및 방출을 나타내고 이 항체의 결합 인슐린은 말초혈액에서 인슐린을 제거하여 환자의 인슐린 사용량이 심각하게 감소시키며; 그 중 도 13B는 세포 내 표적 형질세포를 표적으로 하는 리포좀을 사용하여 인슐린 항체를 표적으로 하는 ER-TPD 트랜스포손 DNA가 혈질세포로 전달되고, IAA ER-TPD 키메라 단백질 구조체의 통합 및 장기 발현을 달성하는 것을 나타낸다.
도 14는 하나 이상의 막간 및 세포질 도메인이 TCRαβ 또는 HLA 분자 결합 분자 및 바이러스 ER-거주 단백질을 포함하는 예시적인 키메라 융합 단백질을 설명한다. 그 중 도 14A는 UT 키메라 다중 도메인의 개략도 및 구성이다. 루미날 도메인(LD), 막횡단 도메인(TMD) 및 세포질 기능 도메인으로 구성된 바이러스 ER 상주 당단백질(VEP)의 광범위한 구조이고; UT 키메라 다중 도메인은 TCR 또는 HLA 결합 도메인, 힌지/스페이서, VEP 막횡단 도메인 및 세포질 도메인으로 구성된다. 도 4B는 UT 키메라 다중 도메인의 개략도와 구성이다. 다른 바이러스 ER 상주 당단백질(VEP)의 광범위한 구조는 다른 루미날 도메인(LD), 막횡단 도메인(TMD) 및 세포질 기능 도메인으로 구성되고; UT 키메라 다중 도메인은 VEP 막횡단 및 세포질 도메인과 달리 TCR 또는 HLA 결합 도메인, 힌지/스페이서로 구성된다. 도 14C는 UT 키메라 다중 구조의 개략도와 구성이다. 다른 바이러스 ER 상주 당단백질(VEP)의 광범위한 구조는 다른 루미날 도메인(LD), 막횡단 도메인(TMD) 및 세포질 기능 도메인으로 구성되고; UT 키메라 다중 도메인은 TCR 또는 HLA 결합 도메인, 힌지/스페이서로 구성되며 다른 VEP 막횡단 및 키메라 세포질 도메인은 다른 VEP에서 유래한다.
도 15는 UT 요소의 강제 발현이 Jurkat 세포에서 TCR 발현을 효과적으로 억제할 수 있음을 보여준다. 절단된 EGFR를 갖은 렌티바이러스 벡터를 구성하고, 이런 벡터는 다른 바이러스 ER 상주 단백질, HCMV US2, US3, US11, 아데노바이러스 E19 TM/CT 도메인에 대한 anti-TCR scFv의 융합을 인코딩하는 동시에 US2 및 아데노바이러스 E19 TM/CT에 대한 anti-TCR scFv의 융합을 인코딩하는 렌티바이러스 벡터를 구성한다. 이 렌티바이러스로 Jurkat 세포를 형질도입하고, 형질도입되지 않은 Jurkat 세포를 대조군으로 사용한다. 형질도입 48시간 후, 세포를 유세포 분석기로 보내 형질도입 세포(EGFR+ 세포)에서 TCRαβ의 발현을 검출한다. 결과는 모든 EGFR(+)의 Jurkat는 TCRαβ 발현이 현저한 하향 조절을 나타낸다; 그리고 결합된 UT 성분(US2/E19)으로 형질도입된 세포는 TCRαβ의 발현을 효과적으로 차단할 수 있다. 테스트한 모든 UT 키메라 요소(US2, US3, US11, E19)는 TCRαβ의 발현을 차단할 수 있었다. UT 요소(US2 및 E19)의 조합은 Jurkat 세포 표면에서 TCRαβ 발현에 대한 억제 효과를 현저히 향상시킬 수 있다.
도 16은 UT 요소의 강제 발현이 인간 T 세포에서 TCR 발현을 효과적으로 억제할 수 있음을 나타낸다. 그 중 도 16A는 UT 요소의 강제 발현이 인간 T 세포에서 TCR 발현을 효과적으로 억제할 수 있음을 나타낸다. 절단된 EGFR을 포함하는 발현 카세트가 있는 렌티바이러스 벡터는 HCMV US3 TM/CT 도메인과 융합된 anti-TCR scFv(anti-TCR-US2 TM/CT-T2A-EGFRt)를 인코딩한다. 인간 T 세포에 이 렌티바이러스로 자극 및 형질도입 하고, 형질도입되지 않은 T 세포는 대조군으로 사용된다. 형질도입 5일 후, 세포를 유세포 분석기로 보내 형질도입된 T 세포(EGFR+ 세포)에서 TCRαβ의 발현을 검출한다. 결과는 EGFR(+)T가 형질도입되지 않은 T 세포와 비교할 때 TCRαβ 발현이 현저히 하향 조절을 나타낸다. 이것은 anti-TCR-US3 TM/CT를 포함하는 US 요소가 인간 T 세포에서 TCRαβ의 발현을 효과적으로 억제할 수 있음을 나타낸다. 도 16B는 UT 요소의 강제 발현이 인간 T 세포에서 TCR의 발현을 효과적으로 억제할 수 있음을 보여준다. 절단된 EGFR을 포함하는 발현 카세트가 있는 렌티바이러스 벡터는 HCMVE19 TM/CT 도메인에 융합된 anti-TCR scFv(anti-TCR-E19 TM/CT-T2A-EGFRt)를 인코딩한다. 인간 T 세포에 이 렌티바이러스로 자극 및 형질도입 하고, 형질도입되지 않은 T 세포는 대조군으로 사용된다. 형질도입 5일 후, 세포를 유세포 분석기로 보내 형질도입된 T 세포(EGFR+ 세포)에서 TCRαβ의 발현을 검출한다. 결과는 EGFR(+)T가 형질도입되지 않은 T 세포와 비교할 때 TCRαβ 발현이 현저히 하향 조절을 나타낸다. 증가된 바이러스 형질도입은 T 세포 표면의 TCRαβ 발현 억제를 더욱 향상시킬 수 있다. 이것은 anti-TCR-US3 TM/CT를 포함하는 US 요소가 인간 T 세포에서 TCRαβ의 발현을 효과적으로 억제할 수 있음을 나타낸다.
도 17은 UT 요소가 있는 CNK-T 세포가 CD8/CD4 세포에서 TCR 발현을 하향 조절하는 것을 나타낸다. 렌티바이러스 벡터는 키메라 NK 수용체 및 E19 TM/CT 도메인에 융합된 anti-TCR scFv를 인코딩하는 발현 카세트(CNK-UT-E19)를 포함한다. 이 렌티바이러스로 인간 T 세포를 형질도입 한다. 형질도입 5일 후, 세포를 유세포 분석기로 보내 세포를 형질도입 세포(NKG2D+ 세포), 기존의 키메라 NK 수용체에 의해 형질도입된 T 세포 및 형질도입되지 않은 T 세포에서 TCRαβ 발현을 검출한다. 결과는 CNK 발현 카세트에 UT 요소를 도입한 키메라 NK 수용체의 발현에 영향을 미치지 않음을 나타낸다. 그 외에 CD8+ 및 CD4+ CNK-T 세포에서 TCR의 발현을 현저하게 억제할 수 있다.
도 18은 UT 요소를 갖은 CNK-T 세포가 일반 CNK-T 세포와 유사하게 종양 세포에 대해 강력한 세포 독성을 나타낸다. 비형질진환 T 세포, CNK-T 세포 및 CNK-UT(E19) 세포와 HepG2 세포를 E:T = 1:5 비율로 공동 배양했다. 24시간의 배양 후, 세포를 수확하여 유세포 분석법으로 종양 용해 및 T 세포 활성화를 감지했다. 데이터에 따르면 CNK-UT 세포가 HepG2 세포에 대해 일반 CNK-T 세포와 유사한 강력한 세포 독성을 나타냈다. 24시간의 공동 배양 결과, CD45(-) 종양 세포는 CNK-T와 CNK-UT의 공동 배양에서 모두 현저하게 감소했다. 그 외에 CD8 및 CD4 CNK-UT 세포는 HepG2 세포와 공동 배양 후 CD25 및 CD137을 상향 조절할 수 있었다.
도 19는 네 가지 구조의 CNK-UT 다기능 복합체(multi-functional complex)를 나타내고, 그 중 도 19A는 기본 CNK-UT 다기능 복합체이다; 도 19B는 표적 MHCI 결합 단백질의 분자 도메인을 증가시키는 CNK-UT 다기능 복합체이다. 도 19C는 MHCI를 표적으로 하는 결합 단백질 분자 도메인과 복합형 어댑터를 증가시키는 CNK-UT 다기능 복합체이다; 도 19D는 MHCI를 표적으로 하는 결합 단백질 분자 도메인과 CAR 또는 TCR과 같은 표적 종양 세포 사멸 수용체를 증가시키는 CNK-UT 다기능 복합체이다.
도 20은 CNK-UT 다기능 복합체를 발현하는 네 가지 CNK-UT 요소의 구조를 나타낸다, 그 중 도 20A와 같이 단일 렌티바이러스 EF1α 프로모터 발현 벡터는 CNK-UT 요소의 조합 중 하나인 DAP10-DAP12 ICD-T2A-NKG2D-p2A-anti-TCR-AdE3 ERAD의 발현을 시작한다; 도 20B와 같이 단일 렌티바이러스 EF1α 프로모터 발현 벡터는 CNK-UT 요소의 조합 중 하나인 DAP10-DAP12 ICD-T2A-NKG2D-p2A-anti-TCR-US2 ERAD를 발현을 시작한다; 도 20C와 같이 단일 렌티바이러스 발현 벡터는 EF1α과 CMV 프로모터를 사용하여 DAP10-CD3ζ-T2A-NKG2D-p2A-ant-TAA scFv-DAP10과 anti-TCR-AdE3 ERAD-E2A-AdE3의 다중 유전자의 발현을 각각 조절하여 단일 벡터에서 다중 CNK-UT 기능 요소의 발현을 실현한다; 도 20D바와 같이 두 개의 서로 다른 렌티바이러스 발현 벡터는 anti-TAA scFv-CD28/4-1BB-CD3ζ-T2A-CD3ζ-p2A-NKG2D과 anti-TCR-AdE3 ERAD-T2A-AdE3의 발현을 각각 조절하고 T 세포를 공동 형질감염시킨 후 동일한 T 세포에서 CNK-UT의 다중 기능 요소를 발현을 실현한다.
도 21은 CNK-UT (DAP10-CD3ζ-T2A-NKG2D-p2A-anti-TCR scFv-AdE3)세포의 기본 표현형에 대한 유세포 분석 검출 결과를 나타낸다.
도 22는 인간 결장 선종 세포주 HT29에 대한 CNK-UT 세포의 인식 및 특이적 사멸 결과를 나타내고, 도 22A는 인간 결정 선종 세포주 HT29에서 다양한 NK 표적점 단백질의 발현을 나타내며; 도 22B는 CNK-UT 세포가 HT29에서 효율적인 사멸 및 활성화 기능을 갖는 것을 나타낸다.
도 23은 CNK-UT 세포에 의한 MDA-MB453의 인식 및 특이적 사멸을 나타내고, 그 중 도 23A는 삼중 음성 유방암 세포주 MDA-MB453의 서로 다른 NK 표적점 단백질의 발현을 나타내며; 도 23B는 CNK-UT 세포에 의한 THP1의 효율적인 사멸 및 활성화 기능을 나타낸다.
도 24는 GPC3 CAR/CNK-UT 세포가 GPC3 CAR-T 세포보다 마우스에서 더 효율적인 종양 제거 능력을 가지고 있음을 나타낸다.
도 25는 GPC3 CAR/CNK-UT 세포가 GPC3 CAR-T보다 더 효율적인 종양 제거 능력을 가지고 있음을 나타낸다.
본 공개를 보다 상세하게 설명하기 전에, 본 공개는 설명된 특정 실시예에 제한되지 않으며, 따라서 당연히 달라질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어는 특정 실시예를 설명하기 위한 목적일 뿐이고, 제한적인 것으로 의도되지 않으며, 따라서 본 공개의 범위는 첨부된 청구범위에서만 제한된다는 것을 이해해야 한다.
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I. 정의
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본 명세서에서 사용된 바와 같이 문맥상 명백하게 다르게 지시하지 않는 한, 단수 형태 '1(a/an)' 및 '상기'에는 여러 지표물이 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '약'은 양, 지속적인 시간 등과 같은 측정 가능한 값을 의미하며 지정된 값으로부터 ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, ±0.5% 또는 ±0.1%의 편차를 포함한다.
"항원"은 항체에 의해 특이적으로 인식되고 결합될 수 있는 분자를 뜻한다. 일부 실시예에서 본 명세서에 상기 항원은 면역 반응을 일으키는 분자일 수 있다. 이러한 면역 반응은 체액 반응, 또는 세포 매개 반응 또는 둘 다일 수 있다. 이 분야의 기술자는 모든 단백질 또는 펩타이드를 포함한 모든 거대 분자가항원으로 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 분명한 것은, 본 공개된 항원에는 면역 반응을 유도할 수 있는 치료 항체가 포함된다.
“항체”는 항원과 결합하는 면역글로불린(Ig) 계열의 폴리펩타이드를 뜻한다. 예를 들어, 자연적으로 발생하는 IgG 유형의 “항체"는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 최소 두개의 중쇄(H) 사슬과 두개의 경쇄(L) 사슬을 포함하는 사합체이다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서 VH로 약칭)과 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 세개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 명세서에서 VL로 약칭)과 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 도메인(본 명세서에서 CL로 약칭)으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 상보적 결정 영역(CDR)이라고 하는 초변이성 영역(경쇄 CDR에는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3, 중쇄 CDR에는 HCDR1, HCDR2, HCDR3)으로 더 세분화될 수 있고, 프레임워크 지역(FR)이라고 하는 보다 보전된 지역이 산재되어 있다. 본 명세서에 공개된 항체의 CDR 경계는 Kabat, IMGT, Chothia 또는 Al-Lazikani의 관례에 따라 정의되거나 식별될 수 있다(Al-Lazikani,B.,Chothia,C.,Lesk,A.M.,《분자생물학저널》(J.Mol.Biol.), 273(4),927(1997)；Chothia,C.외, 《분자생물학저널》,12월5일；186(3):651-63(1985)；Chothia,C.와 Lesk,A.M.,《분자생물학저널》,196,901(1987)；Chothia,C.외, 《네이처》(Nature),12월21-28일; 342(6252):877-83(1989)；Kabat E.A.외, 미국 국립보건원(National Institutes of Health),Bethesda,Md.(1991)；Marie-Paule Lefranc외, 《발달 및 비교 면역학》(Developmental and Comparative Immunology),27:55-77(2003)；Marie-Paule Lefranc외, 《면역군 연구》(Immunome Research),1(3),(2005)；Marie-Paule Lefranc,《B세포 분자 생물학》(Molecular Biology of B cells)(제2판), 제26장, 481-514,(2015)). 각 VH와 VL은 세개의 CDR과 세개의 FR로 구성되고, 아미노 말단에서 카르복실 말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR3, FR4의 순서로 배열된다. 중쇄와 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함되어 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 항체의 "기능적 단편"은 "항원 결합 단편"과 상호 교환적으로 사용되고, 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체의 단편 또는 항원에 결합하지만 완전한 네이티브 항체 구조를 포함하지 않고 항원에 결합하는 임의의 다른 항체 부분에 의해 형성된 항체 단편을 뜻한다. 항원 결합 단편의 예로는 디아바디, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv 단편, 이황화 결합이 안정적인 Fv 단편(dsFv), (dsFv)2, 이중 특이성 dsFv(dsFv-dsFv'), 이황화 결합이 안정적인 디아바디(ds 디아바디), 단일 사슬 항체 분자(scFv), scFv 이량체(이가 디아바디), 다중 특이성 항체, 낙타화 단일 구조 도메인 항체, 나노바디, 도메인 항체 및 이가 도메인 항체가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 항원 결합 단편은 모 항체에 결합된 동일한 항원에 결합할 수 있다. 일부 실시예에서 항원 결합 단편은 특정 모 항체로 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다.
항체에 관한 “Fab”은 이황화 결합에 의해 가변 영역에 결합된 단일 경쇄(가변 영역 및 불변 영역 모두)와 단일 중쇄의 첫 번째 불변 영역으로 구성된 항체의 일가 항원 결합 단편을 뜻한다. Fab은 힌지 영역에 제일 가까운 중쇄 사이의 이황화 결합의 N-말단 잔기에서 항체를 파파인 분해하여 얻을 수 있다.
"Fab′"은 힌지 영역에 제일 가까운 중쇄 사이의 이황화 결합의 C-말단 근위 잔기에서 항체의 펩신 분해에 의해 얻어질 수 있는 힌지 영역의 일부를 포함하는 Fab 조각을 말하며, 따라서 힌지 영역의 소수의 잔기(하나 이상의 시스테인 포함)를 갖는 Fab과 다르다.
"F(ab)2"는 두 개의 경쇄와 두 개의 중쇄의 일부를 포함하는 Fab′의 이량체를 뜻한다.
항체에 관한 “Fv”는 완전한 항원 결합 부위를 가진 가장 작은 항체 단편을 뜻한다. Fv 단편은 단일 중쇄의 가변 영역에 결합된 단일 경쇄의 가변 영역으로 구성된다. “dsFv”는 단일 경쇄의 가변 영역과 단일 중쇄의 가변 영역 사이의 결합이 이황화 결합인 이황화 안정적인 Fv 단편을 뜻한다.
"단일 사슬 Fv 항체" 또는 "scFv"는 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역이 직접 또는 펩타이드 링커 서열을 통해 서로 연결된 엔지니어링 항체를 뜻한다((Huston JS외 《미국 국립과학원회보(Proc Natl Acad Sci USA)》, 85:5879(1988)). "scFv 이량체"는 두 개의 중쇄 가변 영역과 링커가 있는 두 개의 경쇄 가변 영역을 포함 하는 단일 사슬을 뜻한다. 특정 실시예에서, "scFv 이량체"는 이가 이중 기능 항체 또는 이가 scFv(BsFv)이고, 그 중 VH-VL(펩티드 링커로 연결됨)과 다른 VH-VL 부분이 이합체되어 한 부분의 VH가 다른 부분의 VL과 배위되고 동일한 항원(또는 에피토프) 또는 다른 항원(또는 에피토프)을 표적으로 하는 두 개의 결합 부위를 형성한다. 다른 실시예에서, "scFv 이량체"는 이중 특이적 디아바디이고, 그 중 VH1-VL2(펩타이드 링커에 의해 연결됨)와 VL1-VH2(또한 펩타이드 링커에 의해 연결)가 결합하여 VH1 및 VL1이 좌표화되고, VH2 및 VL2가 좌표화되며, 각 좌표화 쌍은 서로 다른 항원 특이성을 가지고 있다.
"단일 사슬 Fv-Fc 항체" 또는 "scFv-Fc"는 항체의 Fc 영역에 연결된 scFv로 구성된 엔지니어링 항체를 뜻한다.
“낙타화된 다일 도메인 항체”, “ 중쇄 항체”, “나노 항체” 또는 “HCAb”는 두개의 VH도메인을 포함하고 경쇄를 포함하지 않는 항체를 뜻한다(Riechmann L.과 Muyldermans S.,《면역학적 방법론 저널(J Immunol Methods)》.12월10일；231(1-2):25-38(1999)；Muyldermans S.,《바이오테크놀로지 저널(J Biotechnol)》.6월；74(4):277-302(2001)；WO94/04678；WO94/25591；미국 특허 제6,005,079호). 중쇄 항체는 원래 낙타과(Camelidae)(낙타, 단봉낙타, 라마)에서 얻는다. 경쇄를 포함하지 않지만 낙타화된 항체는 실제 항원 결합 계통이다(Hamers-Casterman C. 외, 《네이처》.6월3일；363(6428):446-8(1993)；Nguyen VK.외,“낙타과의 중쇄 항체; 진화적 혁신의 사례(Heavy-chain antibodies in Camelidae；a case of evolutionary innovation),”《면역유전학(Immunogenetics)》.4월；54(1):39-47(2002)；Nguyen VK.외,《면역학(Immunology)》.5월；109(1):93-101(2003)). 중쇄 항체의 가변 도메인(VHH 도메인)은 적응 면역 반응에 의해 생성되는 알려진 가장 작은 항원 결합 단위(Koch-NolteF)를 나타낸다(Koch-Nolte F. 외, 《미국 실험생물학학회 연합회지(FASEB J.)》11월；21(13):3490-8.전자판2007년6월15일(2007)). “다이바디”는 두 개의 항원 결합 부위가 있는 작은 항체 단편이 포함되고, 그 중 상기 단일 폴리펩타이드 사슬에서 VL 도메인에 연결된 VH 도메인(VH-VL 또는 VL-VH)을 포함한다(VH-VL 또는 VL-VH)(참고 예: Holliger P. 외, 《미국 국립과학원회보》7월15일；90(14):6444-8(1993); EP404097; WO93/11161). 링커가 너무 짧기 때문에 동일한 사슬의 두 도메인이 쌍을 이룰 수 없으므로 이 도메인이 다른 사슬의 상보적인 도메인과 쌍을 이루도록 하여 두 개의 항원 결합 부위를 생성한다. 항원 결합 부위는 동일하거나 다른 항원(또는 에피토프)을 표적으로 할 수 있다.
“도메인 항체”는 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역만 포함하는 항체 단편을 뜻한다. 특정 실시예에서, 두개 이상의 VH 도메인이 펩타이드 링커를 통해 공유 접합되어 이가 또는 다가 도메인 항체를 형성한다. 이가 도메인 항체의 두개의 VH 도메인은 동일하거나 다른 항원을 표적으로 할 수 있다.
특정 실시예에서, “(dsFv)2”는 세개의 펩타이드 사슬을 포함되고, 두 개의 VH 부분이 펩타이드 링커를 통해 연결되고 이황화 브릿지에 의해 두 개의 VL 부분에 결합한다.
특정 실시예에서, "이중 특이적 ds 디아바디"는 VH1과 VL1 사이의 이황화물 브릿지를 통해 VL1-VH2(펩티드 링커에 의해 연결됨)에 결합된 VH1-VL2(펩티드 링커에 의해 연결됨)를 포함한다.
특정 실시예에서, "이중 특이적 dsFv" 또는 "dsFv-dsFv”는 세개의 펩타이드 사슬을 포함한다: VH1-VH2 부분은 중쇄가 펩타이드 링커(예를 들어, 긴 유연성 링커)에 의해 결합되고 이황화물 브릿지를 통해 각각 VL1 및 VL2 부분과 쌍을 이룬다. 각각의 이황화 결합 쌍을 이루는 중쇄와 경쇄는 서로 다른 항원 특이성을 가지고 있다.
"자가 세포"는 세포의 수용자에게 동일한 개체(즉, 수용자 자체)로부터 유래된 모든 세포를 뜻한다.
"동종 이계 세포"는 세포의 수용자에게 동일한 종의 다른 개체(즉, 수용자 본인이 아님) 로부터 유래된 모든 세포를 뜻한다.
본 명세서에서 사용하는 '구조체'와 '단백질 구조체'는 상호 교환될 수 있는 것은 단백질 또는 단백질 복합체를 뜻한다. “복합체”라는 용어는 하나 이상의 단백질(예: 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 단백질)의 집합체 또는 조립되어 형성된 집합체 또는 조립체를 뜻한다. 복합체는 단일 단백질이 수행할 수 없는 기능을 수행할 수 있는 것을 우선 선호한다. 복합체에서 구성 단백질 간에는 서로 접촉하거나 접촉하지 않을 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “키메라”는 구조체와 관련이 있을 때 구조체의 일부는 한 종에서 유래하고 구조체의 다른 부분은 다른 종에서 유래한다는 것을 뜻한다.
본 명세서에서 사용되는 "벡터"라는 용어는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 조작 가능하게 삽입하여 단백질의 발현을 유도할 수 있는 비히클을 뜻한다. 벡터는 숙주 세포를 변형, 형질 도입 또는 형질 감염되어 숙주 세포 내에서 운반하는 유전적 요소의 발현을 유도하는 데 사용될 수 있다. 벡터의 실예로는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 효모 인공염색체(YAC)와 같은 인공염색체, 박테리아 인공염색체(BAC) 또는 P1 유래 인공염색체(PAC), λ파지 또는 M13 파지와 같은 박테리오파지, 동물 바이러스 등이 있다. 벡터로 사용되는 동물 바이러스의 범주에는 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스바이러스(예: 단순포진바이러스), 폭스 바이러스, 바큘로바이러스, 유두종바이러스, 파포바이러스(예: SV40) 등이 있다. 벡터는 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선택 가능한 요소 및 리포터 유전자를 포함하여 발현을 제어하는 다양한 요소를 포함할 수 있다. 그 외에, 벡터는 복제의 기점을 포함할 수 있다. 벡터는 세포로의 진입을 돕는 물질을 포함하나 바이러스 입자, 리포솜 또는 단백질 코팅을 포함되는데 제한하지 않는다. 벡터는 발현 벡터 또는 클론벡터 이다. 본 공개에서 벡터(예: 발현 벡터)를 제공하고, 그 중 본 명세서에서 제공된 키메라 단백질 구조를 인코딩하는 핵산 서열, 상기 핵산 서열의 적어도 하나의 프로모터(예: SV40, CMV, EF-1α) 및/또는 적어도 하나의 선택 마커를 조작 가능하게 연결되는 것을 포함한다. 벡터의 실예로는 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스바이러스(예: 단순포진바이러스), 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 유두종바이러스, 파포바이러스(예: SV40), λ파지 및 M13 파지, 플라스미드 pcDNA3, pMD18-T, pOptivec, pCMV, pEGFP, pIRES, pQD-Hyg-GSeu, pALTER, pBAD, pcDNA, pCal, pL, pET, pGEMEX, pGEX, pCI, pEGFT, pSV2, pFUSE, pVITRO, pVIVO, pMAL, pMONO, pSELECT, pUNO, pDUO, Psg5L, pBABE, pWPXL, pBI, p15TV-L, pPro18, pTD, pRS10, pLexA, pACT2.2, pCMV-SCRIPT.RTM., pCDM8, pCDNA1.1/amp, pcDNA3.1, pRc/RSV, PCR 2.1, pEF-1, pFB, pSG5, pXT1, pCDEF3, pSVSPORT, pEF-Bos 등이 포함되는데 제한하지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 “숙주 세포”라는 문구는 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터가 도입되었거나 도입될 예정인 세포를 뜻한다.
본 명세서에서 사용된 "기능성 변이체" 용어는 모 폴리펩타이드/단백질과 70% 이상의 서열 동일성이 있는 모 폴리펩타이드/단백질의 기능을 유지하는 폴리펩타이드/단백질을 뜻한다. 변이체와 모 폴리펩타이드/단백질의 다른 점은 하나 이상의 아미노산 잔기에 있을 수 있다. 예를 들어, 기능적 변이체는 모 폴리펩타이드/단백질 중 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 추가, 결실, 삽입 또는 절단을 가질 수 있다.
본 출원에서는, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드의 "동일성" 또는 "서열 동일성"의 백분율은 비교 창에서 두 개의 가장 잘 정렬된 서열을 비교하여 결정되고, 그 중 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 서열의 부분에는 두 서열을 가장 잘 정렬하기 위해 참고 서열(추가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 추가 또는 결실(즉, 간격)이 포함할 수 있다. 백분율 계산은 다음과 같다: 두 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 나타나는 위치의 수를 결정하고, 일치하는 위치의 수를 얻고, 일치하는 위치의 수를 비교 범위의 총 위치 수로 나눈 다음 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 얻는다. 아미노산(또는 핵산) 서열 일관성 퍼센트를 결정하기 위한 비교는 공개적으로 이용 가능한 도구를 사용할 수 있는 예를 들 수 있다. 예를 들어, BLASTN, BLASTp(미국 국립생명공학정보센터(NCBI)의 웹사이트에서 이용 가능, 참고 항목 Altschul S.F.외, 《분자생물학 저널》, 215:403-410(1990)；Stephen F.외, 《핵산연구(Nucleic Acids Res.)》,25:3389-3402(1997)), ClustalW2(유럽 생물 정보 연구소(European Bioinformatics Institute)의 웹사이트에서 이용 가능, 참고 항목 Higgins D.G.외, 《효소학적 방법(Methods in Enzymology)》, 266:383-402(1996); Larkin M.A.외, 《생물정보학(Bioinformatics)》(영국 옥스퍼드(Oxford,England)),23(21):2947-8(2007))와 ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR)소프트웨어를 실현한다. 이 분야의 기술자는 상기 도구에 제공된 기본 매개변수를 사용하거나 예를 들어 적절한 알고리즘을 선택하여 정렬에 적합한 매개변수를 사용자 정의할 수 있다. 특정 실시예에서는, 다른 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 다를 수 있다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예: 전하 또는 소수성)의 측쇄(R 그룹)의 다른 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 일반적으로 보존적 아미노산 치환은 본질적으로 단백질의 기능적 특성을 변경하지 않는다. 두 개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 다른 경우에는 치환의 보존적 특성을 보정하기 위해 백분율 또는 유사성의 정도를 상향 조정할 수 있다. 이 조정을 수행하는 방법은 해당 분야의 기술자에게 잘 알려져 있다. 참고 예로 Pearson(1994)《분자생물학적 방법(Methods Mol.Biol.)》24:307-331, 이를 인용 방식으로 본 명세서에 통합한다.
“조작 가능하게 연결”은 두개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 간의 기능적 관계를 뜻한다. 융합 단백질(예: 공개된 CAR의 폴리펩타이드 사슬)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 맥락에서, 이 용어는 두 개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열이 결합되어, 두 개의 폴리뉴클레오티드가 동일한 발현 프레임 내에서 유지되어, 하나의 아미노산 서열을 번역할 수 있도록 하는 것을 뜻한다. 전사 또는 번역 조절의 맥락에서, 이 용어는 코딩 서열에 대한 조절 서열의 기능적 관계를 뜻한다. 예를 들어, 프로모터는 전사를 조절할 수 있도록 코딩 서열의 올바른 위치와 방향에 있어야 한다.
"폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 뉴클레오타이드 사슬을 뜻한다. 본 명세서에서 사용되는 폴리뉴클레오타이드는 이 분야에서 사용할 수 있는 모든 수단을 통해 얻은 모든 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 방법에는 재조합 수단 및 합성 수단이 포함되는데 제한하지 않는다.
"폴리펩타이드"와 "단백질"은 교환하여 사용할 수 있고, 펩타이드 결합에 의해 공유 결합된 아미노산 잔기의 사슬을 뜻한다. 폴리펩타이드는 천연 펩타이드, 재조합 펩타이드, 합성 펩타이드, 또는 이들의 조합을 포함한다.
"T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 MHC 분자에 결합된 펩타이드로의 항원 단편을 식별하는 역할을 하는 T 세포 표면의 단백질 복합체를 뜻한다.
"키메라 자연살해 수용체"(chimeric natural killer receptor，CNK수용체)라는 용어는 키메라 NK 활성화 수용체 구성 요소 및 키메라 NK 신호전달 구성 요소를 포함하는 조성물을 뜻한다.
"CNK T 세포"라는 용어는 CNK 구조를 포함하는 T 세포를 뜻한다.
"키메라 자연 살해 수용체-범용 T 세포”(chimeric natural killer receptor-Universal T cell，CNK-UT)라는 용어는 NK 활성화 수용체 구성 요소 구조체, CNK 신호 전달 구성 요소 구조체와 UT 구성 요소 구조체의 T 세포를 뜻한다.
"CAR/CNK-UT"라는 용어는 키메라 항원 수용체 및 키메라 자연 살해 수용체에 대한 범용 T 세포(chimeric antigen receptor & chimeric natural killer receptor-Universal Tcell, CNK-UT)이고, 특정 종양 항원의 CAR 구조, NK 활성화 수용체 구성요소 구조체, CNK 신호 전달 구성요소 구조체와 UT 구성 요소 구조체를 표적으로 하는 T 세포를 뜻한다.
본 명세서에서 사용되는 "공동 자극 리간드"라는 용어는 항원 제시 세포(예: APC, 수지상 세포, B 세포 및 기타 면역 세포)의 분자를 포함하고, T 세포의 관련 공동 자극 분자에 특이적으로 결합하여 신호를 제공하며, 이 신호는 TCR/CD3 복합체와 펩티드가 적재된 MHC 분자에 결합하여 제공하는 일차 신호 외의 예뿐만 아니라 T세포 반응도 매개하며 증식, 활성화, 분화 등을 포함하는데 제한하지 않는다. 공동자극 리간드에는 CD7, B7-1(CD80), B7-2(CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, 유도성 공동자극 리간드(ICOS-L), 세포간 접착 분자(ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, 림프독소β수용체 3/TR6, ILT3, ILT4, HVEM 및 Toll 리간드 수용체에 결합하는 작용제 또는 항체와 BH7-3에 특이적으로 결합하는 리간드가 포함하는데 제한하지 않는다. 공동 자극 리간드에는 T 세포에 존재하는 공동 자극 분자에 특이적으로 결합하는 항체도 포함되고, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7LIGHT, NKG2C, B7-H3 및 CD83에 특이적으로 결합된 리간드에만 제한하지 않는다.
"공동 자극 분자" 또는 "공동 자극 수용체"는 공동 자극 리간드와 특이적으로 결합하는 T 세포의 파트너를 뜻하고, 공동 자극 리간드와 특이적으로 결합하여 T 세포의 공동 자극 반응을 매개하나, 증식과 같은 예를 제한하지 않는다. 공동 자극 분자에는 MHC 클래스 I분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체가 포함되는데 제한하지 않는다. 공동 자극 분자에는 비자연적으로 조작된 단백질도 포함된다. 공동 자극 분자는 MHC 클래스 I 분자, 톨 리간드 수용체인 BTLA를 포함하되 이에 제한되지 않는다. 공동 자극 분자에는 비자연적으로 조작된 단백질도 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 “공동 자극 신호”는 TCR/CD3와 같은 일차 신호와 연결 결합하는 것을 뜻하고, T 세포 증식 및/또는 주요 분자의 상향 조절 또는 하향 조절을 이루는 신호이다.
"자극"이라는 용어는 자극성 분자(예: TCR/CD3 복합체)와 관련 리간드의 결합을 통해 유도되는 일차 반응을 뜻하고, 따라서 신호 전달 이벤트를 매개하며, TCR/CD3 복합체를 통한 신호 전달에만 제한하지 않는다. 자극은 TGF-B의 하향 조절 및/또는 세포골격 구조의 재조합 등과 같은 특정 분자의 변경된 발현을 매개할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "자극 분자"라는 용어는 항원 제시 세포에 존재하는 관련 자극 리간드에 특이적으로 결합하는 T 세포의 분자를 뜻한다.
본 명세서에서 사용되는 "자극 리간드"는 항원 제시 세포(예: APC, 수지상 세포, B 세포 등)에 존재할 때 T 세포의 관련 결합 파트너(본 명세서에서 "자극 분자"라고 함)와 특이적으로 결합하여 활성화, 면역 반응의 개시, 증식 등을 포함하되 이에 제한되지 않는 T 세포의 일차 반응을 매개할 수 있는 리간드를 뜻한다. 자극 리간드는 이 분야에서 잘 알려져 있으며, 특히 펩타이드가 적재된 MHC 클래스 I 분자, 항-CD3 항체, 초작용제 항-CD28 항체 및 초작용제 항-CD2 항체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "활성화"는 검출 가능한 세포 증식을 유도하기에 충분한 자극을 받은 T 세포의 상태를 나타내는 것을 뜻한다. 활성화는 유도된 사이토카인 생성 및 검출 가능한 이펙터 기능과 관련될 수 있다. “활성화된 T 세포”라는 용어는 특히 세포 분열이 진행 중인 T 세포를 뜻한다.
"유효량" 또는 "치료적 유효량"은 필요한 생물학적 결과를 효과적으로 달성하는데 설명된 세포, 조성물, 제제 또는 임의의 재료의 양을 뜻한다. 이러한 결과에는 특정 B 세포 수용체(BCR)를 발현하는 B 세포과 그로부터 생성되는 항체의 제거가 포함될 수 있지만 제한하지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 "대상체"는 인간 또는 다른 동물과 같은 포유류이며 일반적으로 인간을 말한다. 일부 실시예에서 세포, 세포 집단 또는 조성물이 투여되는 대상체는 포유류와 같은 환자이며, 일반적으로 인간과 같은 영장류이다. 일부 실시예에서 영장류는 원숭이 또는 유인원이다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있고, 유아, 청소년, 청소년, 성인 및 노인 대상체를 포함하여 임의의 적절한 연령일 수 있다. 일부 실시예에서 대상체는 설치류와 같은 비영장류 포유류이다.
본 명세서에서 사용되는 "치료"("치료하다" 또는 "치료하다"와 같은 문법적 변형)는 질병, 상태 또는 장애, 또는 이와 관련된 증상, 부작용 또는 결과, 또는 표현형을 완전히 또는 부분적으로 개선 또는 감소시키는 것을 뜻한다. 치료의 바람직한 효과에는 질병의 발생 또는 재발 방지, 증상 완화, 질병의 직간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질병 진행 속도 감소, 질병 상태의 개선 또는 완화 및 예후 완화 또는 개선 등이 포함되나 그에 제한하지 않는다. 이러한 용어는 질병의 완전한 완치 또는 모든 증상이나 결과에 대한 영향이 완전한 제거를 의미하지는 않는다.
본 명세서에서 사용되는 "예방"은 질병에 취약하지만 아직 질병 진단을 받지 않은 대상체에서 질병의 발생 또는 재발에 대한 예방을 제공하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 제공된 세포 및 조성물은 질병의 발생을 지연시키거나 질병의 진행을 늦추기 위해 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 "억제"기능 또는 활성은 동일한 조건(관심 있는 조건 또는 매개변수 제외) 또는 다른 조건과 비교할 때 기능 또는 활성이 감소하는 것을 뜻한다. 예를 들어, 종양 성장을 억제하는 세포와 이 세포가 없는 종양의 성장률에 비해 종양의 성장률을 감소시킨다.
적용된 맥락에서 시약(예: 키메라 항원 수용체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 약물 제제, 세포 또는 조성물)의 '유효량'은 필요한 용량/용량 및 기간 동안 치료 또는 예방 결과와 같은 원하는 결과에 효과적으로 도달하는 양을 나타내는 것을 뜻한다.
시약(예: 약물 제제 또는 세포)의 “치료 유효량”은 필효한 용량 및 기간 동안에서 기대 치료 효과(예: 질병, 질병 또는 장애의 치료 및/또는 치료에 사용되는 약동학 또는 약력학적 효과)를 효과적으로 도달하는 것을 뜻한다. 치료 유효량은 질병 상태, 대상체의 연령, 성별 및 체중, 적용된 세포 집단과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 일부 실시예에서 제공된 방법에는 치료 유효량과 같은 유효량으로 세포 및/또는 조성물의 적용하는 것을 포함한다.
"예방적 유효량"은 필요한 용량 및 기간 동안 원하는 예방 결과를 효과적으로 달성할 수 있는 양을 뜻한다. 일반적이나 반드시 그런 것은 아니지만, 예방 용량은 질병 전이나 초기에 대상체에게 사용되기 때문에 예방 유효량은 치료 유효량보다 적을 것이다. 종양 부담이 낮은 경우, 일부 면에서는 예방 효과가 치료 효과보다 높을 것이다.
II. 표적 단백질 분해 (Target Protein Degradation, TPD)
본 발명은 특정 단백질(즉 표적 단백질)을 표적으로 하여 발현(예: 표면 발현)을 차단하고 소포체 관련 분해(ER-associated degradation, ERAD) 메커니즘을 통해 유비퀴틴화 매개 분해를 가속화하는 데 사용되는 새로운 표적 단백질 분해 시스템을 제공한다.
소포체 관련 단백질 분해(ERAD)는 소포체의 잘못 접힌 단백질을 표적으로 하는 유비퀴틴화된 후 프로테아좀에 의해 후속적으로 분해되는 세포 경로를 나타내는 것을 뜻한다. ERAD의 과정은 세 단계로 구성된다: (1) 소포체에서 잘못 접히거나 돌연변이된 단백질의 식별; (2) 식별된 잘못 접히거나 돌연변이된 단백질을 소포체에서 세포질로 역전송하는 단계로, 말단에서 잘못 접힌 단백질은 소포체에서 유비퀴틴-프로테아좀 시스템(ubiquitin-proteasome system, UPS)이 포함된 세포질로 다시 수송되어야 하며; (3) 프로테아좀을 사용하여 식별된 잘못 접히거나 돌연변이된 단백질을 유비퀴틴 의존적으로 분해한다(Annamaria et al.,ER-associated degradation:Protein quality control and beyond.J.Cell Biol.Vol.204 No.6 869-879 참고).
본 출원은 표적 도메인(예: 특이적 단백질 표적 항체 단편(ScFv))을 ERAD 기능 모티브(예: 바이러스 ER 상주 단백질 TMD 및 ED 복귀 신호 도메인)와 융합시키는 새로운 키메라 전략을 제공하고, 이 전략은 특정 단백질의 발현(예: 세포 표면의 특정 단백질 발현)을 효과적으로 억제할 수 있음을 입증했다.
본 출원에서 제공하는 ER-TPD 기술 플랫폼은 기존의 단백질 분해/제거 기술(예: PROTAC, CRISPR 등)에 비해 다음과 같은 장점이 있다. 1. ER-TPD 키메라 단백질 구조체는 벡터(예: 리포좀, 나노입자, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 종양용해바이러스 등)를 통해 세포 내로 전달되어 안정적인 발현과 기능을 발휘하며, PROTAC에 비해 세포 투과성이 낮고 반감기가 짧아 분해 효율이 떨어지는 문제가 존재하지 않는다. 2. 소포체의 ERAD 원리를 기반으로 한 ER-TPD 기술은 소포체 단백질의 합성과 조립 과정에서 단백질 합성에 직접적으로 개입하여 효율적인 분해를 이루기 때문에 외인성 PROTAC 기술보다 높은 분해 효율을 가지고 있다. 3. 외인성 PROTAC은 막 단백질 및 분비 단백질을 효과적으로 분해 할 수 없지만, ER-TPD는 소포체 단백질의 합성 및 조립 과정에서 막 단백질 및 분비 단백질을 직접 표적하고 분해를 달성 할 수 있으므로 기존 TPD 기술로 표적화 할 수 없었던 중요한 질병 제공과 관련된 다수의 표적 단백질을 표적으로 할 수 있어 질병 치료를 위한 새로운 신약 개발 접근 방식을 제공한다. 4. ER-TPD의 설계 방식에서 표적 결합 도메인은 다양한 단일 사슬 항체 구조 또는 인공 친화성 리간드 구조를 채택하여 표적 단백질에 대한 특이적 정밀 인식 능력과 결합 능력을 크게 향상시킬 수 있으나, 기존의 PROTAC 기술은 표적 구조의 특이성을 보장하기 어려운 소분자의 화학 구조를 채택하여 따라서 ER-TPD 기술이 표적 정확도와 특이성에서 강력한 우세를 가지고 있다. 5. ER-TPD 기술은 유비퀴틴 프로테아좀 기반의 UPS 메커니즘과 자가포식 리소좀의 ALP 메커니즘을 포함하여 다운스트림 분해 유도 리간드 구조를 통해 표적 단백질 분해의 다중 경로 메커니즘을 실현할 수 있고, 다운스트림 분해 유도 리간드 구조 설계는 유전 공학 방법을 통해 세포 내 분해 시스템을 유연하게 연결하여 효율적인 표적 분해를 달성하는 반면, 기존의 PROTAC 기술은 E3 리가제을 표적으로 해야만 분해를 달성할 수 있다. 6. ER-TPD 기술은 단백질 수준에서 표적 단백질을 분해하며, 유전자 수준에서 표적 단백질의 발현을 차단하는 기술(예: CRISPR 기술)에 비해 표적 이탈 효과나 유전자 편집 과정으로 인한 염색체 불안정성 등 독성 부작용이 존재하지 않는다. 7. ER-TPD 기술은 유전자 및 세포 치료 기술과 완벽하게 결합되어 현재 유전자 및 세포 치료의 임상 적응증을 크게 확장하고 임상 효과를 향상시킬 수 있다. 8. ER-TPD 기술을 기반으로 한 표적 분해 약물 개발은 실현 가능성이 높고 주기가 짧으며, ER-TPD 기술 기반으로 한 핵산과 세포 약물은 대규모 및 산업화 생산이 용이하며 신약 개발을 위한 중요한 기본 플랫폼 기술이다.
한 측면에서, 본 공개는 소포체 기반 표적 단백질 분해 기술(Endoplasmic Reticulum-based Targeted Protein Degradation，ER-TPD) 의 키메라 단백질 구조체(chimeric protein construct)를 제공하며, 이는 소포체 관련 분해(ER-associated degradation，ERAD) 메커니즘 단백질 결합 도메인 및 표적 도메인을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 키메라 단백질 구조체는 단백질 분해 경로 구성원(예: 유비퀴틴-프로테아좀 시스템 경로 구성원, 엔도좀-리소좀 경로 구성원, 자가포식 경로 구성원) 결합 도메인을 더 포함한다. 상기 단백질 분해 경로 구성원 결합 도메인은 임의의 적절한 방식으로 상기 키메라 단백질 구조체의 구성 요소에 연결될 수 있으며, 예를 들어, ERAD 메커니즘 단백질 결합 도메인에 연결될 수 있다.
다른 측면에서, 본 공개는 조성물 라이브러리를 제공하는데, 그 중 각 조성물에는 바이러스 단백질 또는 이를 인코딩하는 핵산 분자가 포함되고, 이는 ERAD 메커니즘을 납치하여 ER 내에서 프로테아좀 매개 분해를 억제하고 가속화할 수 있는 기능적 모티프와 특정 단백질을 표적으로 하는 친화 부분을 포함하며, 세포 표현형 수정, 세포 기능 개선, 또는 세포 사멸을 유도 또는 바이러스 복제를 억제하기 위한 치료 목적으로 사용한다.
1.ERAD 메커니즘 단백질 결합 도메인
본 명세서에서 사용되는 "ERAD 메커니즘 단백질"이라는 용어는 ERAD 메커니즘 또는 경로에 관여하는 단백질을 뜻한다. "ERAD 메커니즘 단백질 결합 도메인"이라는 용어는 "ERAD 분해 도메인"이라고도 하고, ERAD 메커니즘 단백질을 결합 및/또는 사용할 수 있는 부분 또는 도메인을 나타낸다. 예를 들어, 바이러스 소포체(ER) 상주 당 단백질의 막횡단 도메인(또는 이의 기능적 변이체) 및 세포질 도메인(또는 이의 기능적 변이체)은 "소포체 상주 도메인" 또는 "ER 상주 도메인"이라고도 한다.
일부 실시예에서, 상기 메커니즘 단백질 결합 도메인은 바이러스 소포체 상주 단백질 또는 이의 기능적 변이체의 막횡단 도메인 및 소포체 상주 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 실시예에서, 바이러스의 ER 상주 당 단백질은 ERAD 메커니즘을 납치하고 표적 단백질의 유비퀴틴화 및 프로테아좀 매개 분해를 촉진할 수 있는 임의의 바이러스 ER 상주 단백질일 수 있다.
i. 아데노바이러스 E3-19K에서 유래한 ERAD 메커니즘 단백질 결합 도메인
일부 실시예에서, 상기 바이러스 소포체 상주 단백질은 아데노바이러스 E3-19K이다. 아데노바이러스 E3-19K("E19"라고도 함)는 세 가지 기능 모듈을 포함한다. MHC-I 및 MICA/B 분자와의 상호 작용하는 루메날 도메인, 막횡단 도메인 및 소포체 상주 도메인, 여기서 소포체 상주 도메인은 세포질 꼬리의 디라이신 모티프를 포함하며, 이 모티프는 골지체를 소포체로 복귀시킬 수 있어 "ER 복귀 신호 모티브"이라고도 한다. 연구에 따르면 효율적인 ER 위치화, 조직적합성 복합체 클래스 I(MHC-I) 및 MHC-I 관련 사슬 A 및 B(MICA/B 분자)의 수송 억제와 프로테아좀 분해를 보장하기 위해 막횡단 도메인과 ER 복귀 신호 모티브가 필요하다. 따라서 아데노바이러스 E3-19K는 분비 경로에서 MHC 클래스 I 분자(예: MHC-I 및 MICA/B 분자)에 상주하여 항원 제시를 방해할 수 있다. 본 공개에 의해 제공되는 키메라 단백질 구조체는 아데노바이러스 E3-19K의 막 통과 도메인 및 소포체 상주 도메인(즉, ERAD 분해 도메인)을 이용하여 표적 단백질 결합 도메인과 융합함으로써 표적 단백질을 분해하는 목적을 실현한다.
일부 실시예에서 바람직하게는, 상기 아데노바이러스 E3-19K의 ERAD 분해 도메인은 서열 SEQ ID NO.60로 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 아데노바이러스 E3-19K의 EARD 분해 도메인은 세 포질 꼬리에 디라이신 모티프가 있고, 골지체를 소포체로 되돌릴 수 있다. 일부 바람직한 실시예에서, 상기 아데노바이러스 E3-19K의 ERAD 분해 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.60에 표시된 바와 같다.
ii. 다른 바이러스 당단백질에서 유래된 ERAD 메커니즘 단백질 결합 도메인
일부 실시예에서, 상기 바이러스 소포체 상주 단백질은 아데노바이러스 E3-19K가 아니다.
일부 실시예에서, 상기 바이러스 소포체 상주 단백질은 다음 중 적어도 하나로부터 선택된다: HCMV 당단백질 US2, US11, US3, US10, US6, HSV ICP47, CPXV12, BHV UL49.5, EBV BNFL2a, HCMV UL16, UL141, UL142, HIV Nef, HIV Vpu, HHV-7 U21, HHV-8 KK3, HHV-8 KK5, MHV-68 MK3, HTLV-1 p12 및 Cowpox Virus 단백질 CPXV203. 일부 실시예에서, 상기 바이러스 소포체 상주 단백질은 HCMV 당단백질 US2과 US11를 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 바이러스 소포체 상주 단백질은 E3-19K와 다음 중 적어도 하나로부터 선택되는 것을 포함한다: HCMV 당단백질US2, US11, US3, US10, US6, HSV ICP47, CPXV12, BHV UL49.5, EBV BNFL2a, HCMV UL16, UL141, UL142, HIV Nef, HIV Vpu, HHV-7 U21, HHV-8 KK3, HHV-8 KK5, MHV-68 MK3, HTLV-1 p12 및 Cowpox Virus 단백질 CPXV203.
HIV-1 바이러스의 Vpu 단백질은 ER 막에 있는 단백질이며 소포체에서 새로 생성된 CD4를 표적으로 하여 세포질 내 프로테아좀에 의해 분해된다. Vpu 단백질은 주로 SCFβ-TrCP 의존적 유비퀴틴화 및 막횡단 도메인(TMD) 상호작용을 통해 ER에 CD4를 유지한다.
a) HCMV US2와 US11
HCMV US2와 US11 단백질은 모두 ER에 상주하는 I형 통합막 당단백질이고, 이 ERAD 경로를 공동 선택해 MHC I형 중쇄의 분해를 촉진함으로써 MHC I형 항원 제시를 억제한다. 두 단백질 중 하나를 발현하면 새로 합성된 MHC 클래스 I 중쇄가 빠르게 분해된다. US2와 US11은 루미날 도메인을 통해 MHC 클래스 I 중쇄에 결합하고 중쇄의 세포질 꼬리를 "풀링" 소포체 망막에서 폴리펩타이드를 추출하는 숙주 세포 단백질을 모집한다. MHC 클래스 I 분자는 세포질로 전위된 후 프로테아좀에 의해 유비퀴틴화되고 분해된다.
US2는 클래스 I 분자 외에도 클래스 II 경로에서 두 단백질 DR-α 및 DM-α 및 HFE(철분 조절에 관여하는 비전형 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 단백질)의 분해를 유발한다.
US2의 루미날 도메인은 MHC 클래스 I 및 II 분자의 결합을 담당하고, 막횡단 도메인(TM)과 세포질 도메인(CT)은 ERAD 메커니즘 또는 경로의 세포 성분과 상호 작용하며, MHC 클래스 I 및 클래스 II 단백질의 전위 및 효소 분해 촉진을 촉진한다(Chevalier M S et al., 2002, 2003). US2의 세포질 꼬리는 신호 펩타이드 펩티다제(SPP)와 상호 작용하기에 충분하며, SPP는 US2 의존성 MHCI 전위 복합(US2-dependent MHC I dislocation complex)의 필수 성분이며(Loureiro J et al.,2006), US2 의존성 MHC 중쇄 전위에 필요하다(참고 Joana et al.,Signal peptide peptidase is required for dislocation from the endoplasmic reticulum.Nature volume 441,pages 894-897(2006)). 뿐만 아니라, US2는 TM 도메인을 통해 소포체 상주 RING 유형 E3 리가제 TRC8과 상호 작용하여 US2 꼬리 고정 MHCI 및 II 분자의 유비퀴틴화 및 프로테아좀 분해에 기여한다(Stagg H R et al.,2009).
대조적으로, US11에 의해 유도된 MHC-I 분자의 분해에는 SPP가 아닌 Derlin-1이 필요하다. US11의 ER 루미날 도메인은 MHC-I 중쇄의 루미날 도메인과 상호작용하는 반면, US11의 TM 도메인은 Derlin-1과 결합한다. 따라서 US11의 주요 기능은 MHC-I 분자를 Derlin-1로 전달한 다음(Lilley B N et al.,2004；Cho S et al.,2013), 프로테아좀 분해를 위해 세포질로의 전위를 유도하는 것일 수 있다. 뿐만 아니라, US11은 펼쳐진 단백질을 활성화한다. Derlin-1을 통해 US11은 ERAD RING E3 리가제로서 TMEM129와 결합하고 Ube2J2를 모집하여 US11에 의해 분해되기 전에 MHC-I을 유비퀴틴화 한다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 HCMV 당단백질 US2의 ERAD 분해 도메인은 서열 SEQ ID NO.48에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 소포체 상주 기능을 갖고 있다. 일부 실시예에서, 상기 HCMV 당단백질 US2의 ERAD 분해 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.48에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 US2의 ERAD 분해 도메인은 서열 SEQ ID NO.76에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 소포체 상주 기능을 갖고 있다. 일부 실시예에서, 상기 US2의 ERAD 분해 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.76에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 HCMV 당단백질 US11의 ERAD 분해 도메인은 서열 SEQ ID NO.54에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 소포체 상주 기능을 갖고 있다. 일부 실시예에서, 상기 HCMV 당단백질 US11의 ERAD 분해 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.54에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 US11의 ERAD 분해 도메인은 서열 SEQ ID NO.82에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 소포체 상주 기능을 갖고 있다. 일부 실시예에서, 상기 US11의 ERAD 분해 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.82에 표시된 바와 같다.
b) HCMV US3
HCMV US3 당단백질은 MHC 단백질의 분해를 촉진하는 것이 아니라 펩타이드가 적재된 MHCI 클래스 I 이종이량체에 물리적으로 결합하여 클래스 I 복합체가 ER에 남아 있고 ER에서 클래스 II DR-αβ 이량체에 대한 불변 사슬의 결합을 억제하여 클래스 II 복합체의 잘못된 국소화와 감소된 펩타이드 부하를 초래한다. 따라서, HCMV 감염의 초기 단계에서 US3는 MHCI 클래스 I 분자의 세포내 수송 및 성숙을 방해할 수 있다. US3는 소포체 상주 막 단백질이다. 도메인 교환 실험은 US3의 루미날 도메인이 US3 자체를 소포체로 유지하기에 충분한 반면, 루미날 도메인과 막횡단 도메인은 소포체에서 클래스 I MHC 분자를 유지하는데 필요하다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 HCMV 당단백질 US3의 ERAD 분해 도메인은 서열 SEQ ID NO.51에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 소포체 상주 기능을 갖고 있다. 일부 실시예에서, 상기 HCMV 당단백질 US3의 ERAD 분해 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.51에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 US3의 ERAD 분해 도메인은 서열 SEQ ID NO.79에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 소포체 상주 기능을 갖고 있다. 일부 실시예에서, 상기 US3의 ERAD 분해 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.79에 표시된 바와 같다.
c) HCMV　US10
HCMV US10 당단백질은 또한 MHC 클래스 I 항원에 의해 제시된 성분과 상호 작용한다. US10은 유리 클래스 I 중쇄에 결합하고 ER에서 수송을 지연시킨다. 그러나 US10은 US2 또는 US11에는 영향을 미치지 않는다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 HCMV 당단백질 US10의 ERAD 분해 도메인은 서열 SEQ ID NO.57에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 소포체 상주 기능을 갖고 있다. 일부 실시예에서, 상기 HCMV 당단백질 US10의 ERAD 분해 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.57에 표시된 바와 같다.
d) HCMV US6, HSV ICP47, CPXV012, EBV BNFL2a, BHV UL49.5
US2, US3, US10, US11과 다르게, HCMV L 단백질 US6는 완전히 다른 전략을 통해 항원 제시에 영향을 미친다. 자유 클래스 I 중쇄 또는 완전히 조립된 클래스 I 복합체와 상호 작용하는 반면, US6는 TAP 복합체(TAP1/2)를 통해 세포질 펩타이드의 전위를 억제한다. US6는 TAP1의 ER 루미날 쪽에 결합하여 ATP 결합을 방지하는 형태 변화를 일으킨다. US6의 ER-루미날 도메인에 있는 잔기 89-108은 US6와 TAP의 결합에 도움이 있고 이러한 억제에 충분히 필요한 조건이다. 이러한 TAP 활성의 억제는 전형 MHCI 유사 대립유전자의 발현뿐 만 아니라 태아 세포 영양층 세포에서 비전형 대립유전자 HLA-C 및 HLA-G의 발현에도 영향을 미친다.
HCMV US6 단백질로서 HSV ICP47은 감염 주기 초기에 발현되어 체외 복제는 있어도 되고 없어도 되며, 동일한 전략을 적용하여 클래스 I 분자 조립을 방지한다. ICP47은 TAP 매개 펩타이드 수송을 차단하고 TAP1-TAP2 복합체에 단단히 결합한다. ICP47이 TAP 메커니즘을 차단하는 한 단서는 높은 종 선택성을 보여준다. HSV1과 HSV2I CP47은 모두 유인원, 원숭이, 돼지, 개와 소의 TAP를 억제하고 마우스, 쥐, 기니피그 또는 토끼의 TAP에는 거의 영향을 미치지 않았다. ICP47은 마우스 TAP에 비해 인간 TAP에 대한 친화력이 약 100배 더 높다. ICP47은 TAP에 대한 펩타이드 결합을 억제하지만 ATP 결합에는 영향을 미치지 않는다. ICP47은 대부분의 펩타이드 보다 TAP에 대한 친화력이 10-1000배 높고, 펩타이드가 TAP에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 역할을 하며, 펩타이드 결합 부위에 직접 결합하는 것으로 여긴다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 HHV-7 US6의 TAP 결합 도메인은 서열 SEQ ID NO.65에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 소포체 상주 기능을 갖고 있다. 일부 실시예에서, 상기 HHV-7 US6의 TAP 결합 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.65에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 HSV ICP47의 TAP 결합 도메인은 서열 SEQ ID NO.67에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 소포체 상주 기능을 갖고 있다. 일부 실시예에서, 상기 HSV ICP47의 TAP 결합 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.67에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 CPXV012의 TAP 결합 도메인은 서열 SEQ ID NO.69에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 소포체 상주 기능을 갖고 있다. 상기 CPXV012의 TAP 결합 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.69에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 CPXV012의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.68에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 CPXV012의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.68에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 EBV BNFL2a의 TAP 결합 도메인은 서열 SEQ ID NO.71에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 소포체 상주 기능을 갖고 있다. 상기 EBV BNFL2a의 TAP 결합 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.71에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 EBV BNFL2a의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.70에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 EBV BNFL2a의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.70에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 BHV UL49.5의 TAP 결합 도메인은 서열 SEQ ID NO.73에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 소포체 상주 기능을 갖고 있다. 일부 실시예에서, 상기 BHV UL49.5의 TAP 결합 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.73에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 BHV UL49.5의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.72에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 BHV UL49.5의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.72에 표시된 바와 같다.
e) 기타
일부 바람직한 실시예에서, 상기 HHV-7 US21의 ERAD 분해 도메인은 서열 SEQ ID NO.63에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 소포체 상주 기능을 갖고 있다. 일부 실시예에서, 상기 HHV-7 US21의 ERAD 분해 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.63에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 HHV-7 US21의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.61에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 HHV-7 US21의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.61에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 HCMV UL16의 ERAD 분해 도메인은 서열 SEQ ID NO.85에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 소포체 상주 기능을 갖고 있다. 일부 실시예에서, 상기 HCMV UL16의 ERAD 분해 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.85에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 HCMV UL16의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.83에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 HCMV UL16의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.83에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 HCMV UL141의 ERAD 분해 도메인은 서열 SEQ ID NO.88에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 소포체 상주 기능을 갖고 있다. 일부 실시예에서, 상기 HCMV UL141의 ERAD 분해 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.88에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 HCMV UL141의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.86에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 HCMV UL141의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.86에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 HCMV UL142의 골지 상주 도메인은 서열 SEQ ID NO.91에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 소포체 상주 기능을 갖고 있다. 일부 실시예에서, 상기 HCMV UL142의 골지 상주 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.91에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 HIV Nef은 서열 SEQ ID NO.92에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 소포체 상주 기능을 갖고 있다. 일부 실시예에서, 상기 HIV Nef의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.92에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 HCMV UL142의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.89에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 HCMV UL142의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.89에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 HIV Vpu은 서열 SEQ ID NO.93에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 소포체 상주 기능을 갖고 있다. 일부 실시예에서, 상기 HIV Vpu의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.93에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 HHV-8 KK3은 서열 SEQ ID NO.94에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 소포체 상주 기능을 갖고 있다. 일부 실시예에서, 상기 HHV-8 KK3의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.94에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 HHV-8 KK5은 서열 SEQ ID NO.95에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 소포체 상주 기능을 갖고 있다. 일부 실시예에서, 상기 HHV-8 KK5의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.95에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 MHV-68 MK3은 서열 SEQ ID NO.96에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 소포체 상주 기능을 갖고 있다. 일부 실시예에서, 상기 MHV-68 MK3의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.96에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 HTLV-1 p12은 서열 SEQ ID NO.97에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 소포체 상주 기능을 갖고 있다. 일부 실시예에서, 상기 HTLV-1 p12의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.97에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 우두 바이러스 단백질 CPXV203의 KDEL 수용체 결합 도메인은 서열 SEQ ID NO.100에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 소포체 상주 기능을 갖고 있다. 일부 실시예에서, 상기 우두 바이러스 단백질 CPXV203의 KDEL 수용체 결합 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.100에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 우두 바이러스 단백질 CPXV203의 KDEL 수용체 결합 도메인은 서열 SEQ ID NO.103에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 소포체 상주 기능을 갖고 있다. 일부 실시예에서, 상기 우두 바이러스 단백질 CPXV203의 KDEL 수용체 결합 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.103에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 우두 바이러스 단백질 CPXV203의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.98에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 우두 바이러스 단백질 CPXV203의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.98에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 우두 바이러스 단백질 CPXV203의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.101에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 우두 바이러스 단백질 CPXV203의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.101에 표시된 바와 같다.
2. 표적 결합 도메인
본 공개에 제공된 키메라 단백질 구조체의 표적 결합 도메인(target binding domain)은 표적 단백질을 인식하고 결합하는 임의의 구조일 수 있다. 예를 들어, 항체, 항체 단편, 천연 단백질로부터 유래된 기능 모티브(예: 천연 리간드), 인공적으로 합성된 표적 단백질에 친화력을 갖는 폴리펩티드 또는 단백질, 또는 상기 분자의 돌연변이체, 융합체, 절단체 및 기타 다양한 변이체 형식일 수 있다. 예를 들어, 표적 결합 도메인은 표적 단백질의 천연 리간드, 표적 단백질을 특이적으로 인식하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항체에 의해 특이적으로 인식될 수 있는 항원일 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 표적 결합 도메인은 표적 단백질을 특이적으로 표적으로 하는 항체 또는 이의 기능적 단편, 예를 들어 디아바디, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv 단편, 이황화물 안정화된 Fv 단편(dsFv), (dsFv)2, 이중특이적 dsFv(dsFv-dsFv'), 이황화물 결합 안정화된 디아바디(dsdiabody), 단일 사슬 항체 분자(scFv), scFv 이량체(이가의 디아바디), Fv(scFv), 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 낙타화된 단일 도메인 항체(예를 들어, VHH), 나노바디, 도메인 항체, 이가의 도메인 항체, 디아바디, 삼중항체 및 사중항체를 포함한다. 상기 표적 결합 단백질 도메인은 리간드, 수용체에서 리간드 결합의 일부, 바이러스 단백질에서 숙주 단백질 결합의 일부 등을 포함하되 이에 제한되지 않는 표적 단백질에 결합할 수 있는 임의의 결합 리간드를 포함할 수 있다.
표적 단백질은 수준 또는 활성이 조절될 것으로 예상되는 모든 단백질일 수 있다. 예를 들어, ERAD 메커니즘을 통해 활성을 변경하여 ER의 단백질을 차단하고 프로테아좀 매개 분해를 가속화하고, 그 분해는 세포의 표현형을 변화시키고, 세포 기능을 개선하고, 세포 사멸을 유발하고/또는 바이러스 복제를 억제하여 치료적 목적(예: 치료 효과 향상, 부작용 감소 등)을 달성할 수 있다. 일부 실시예에서, 표적 단백질은 세포 주기, 세포 사멸, 신호 전달, 세포 분화, 세포 탈분화, 세포 성장, 사이토카인 또는 생체 조절제의 생산, 사이토카인 또는 생체 조절제의 생산, 조절 또는 기능성 단백질의 생산, 전염증 신호 전달 또는 포도당 조절 경로에 관여하는 단백질일 수 있다.
다른 실시예에서, 표적 단백질은 질병 관련 단백질("병원성 단백질"이라고도 함)이고, 본 명세서에 상기 "질병 관련 단백질" 또는 "병원성 단백질"은 기능 또는 활성이 질병의 발생으로 이어질 수 있는 어떠한 변화, 또는 질병의 발생에 더 중요한 기능을 갖는 단백질을 의미하며, 예시적인 병원성 단백질은 발암성 단백질, 바이러스 단백질, 자가면역 질병 단백질(예: 혈장 세포에서 생성되는 항체)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 실시예에서, 상기 표적 단백질은 면역 기능 관련 표적 단백질, 신경계 질병 관련 표적 단백질, 감염성 질병 관련 표적 단백질(예: 바이러스 감염 관련 표적 단백질), 자가항원 관련 표적 단백질 또는 종양 관련 표적 단백질(또는 발암성 단백질), 대사 질병 관련 표적 단백질에서 선택된다.
일부 실시예에서, 상기 병원성 단백질은 발암성 단백질이다. 상기 발암성 단백질은 발암성 유전자에 의해 인코드 될 수 있고, 여기에는 BCL2, c-MYC, Ras, HER2, BCR/ABL, ABL1/BCR, TGFB1, TLX1, P53, WNT1, WNT2, WT1, αv-β3, PKCa, ABL, BCL1, CD24, CDK4, EGFR/ERBB-1, HSTF1, INT1/WNT1, INT2, MDM2, MET, MYB, MYC, MYCN, MYCL1, RAFI, NRAS, REL, AKT2, APC, BCL2-ALPHA, BCL2-BETA, BCL3, BCR, BRCA1, BRCA2, CBL, CCND1, CDKN1A, CDKN1C, CDKN2A, CDKN2B, CRK, CRK-II, CSF1R/FMS, DBL, DDOST, PMS-2, PRAD-1, RAF, RHOM-1, RHOM-2, SIS, TAL2, TANI, TIAM1, TSC2, TRK, TSC1, STK11, PTCH, MEN1, MEN2, P57/KIP2, PTEN, HPC1, ATM, XPA/XPG, BCL6, DEK, AKAP13, CDH1, BLM, EWSR1/FLI1, FES, FGF3, FER, FGR, FLI1/ERGB2, FOS, FPS/FES, FRA1, FRA2, FYN, HCK, HEK, HER3/ERBB-2, ERBB-3, HER4/ERBB-4, HST2, INK4A, INK4B, JUN, JUNB, JUND, KIP2, KIT, KRAS2A, KRAS2B, LCK, LYN, MAS, MAX, MCC, MLH1, MOS, MSH2, MYBA, MYBB, NF1, NF2, P53, PDGFB, PIM1, PTC, RBI, RET, ROS1, SKI, SRC1, TALI, TGFBR2, THRA1, THRB, TIAM1, TRK, VAV, VHL, WAF1, WNT2, WT1, YES1, ALK/NPM1, AMI1, AXL, FMS, GIP, GLI, GSP, HOX11, HST, IL3, INT2, KS3, K-SAM, LBC, DCC, DPC4/SMAD4, E-CAD, E2F1/RBAP, ELK1, ELK3, EPH, EPHA1, E2F1, EPHA3, ERG, ETS1, ETS2, LMO-1, LMO-2, L-MYC, LYL1, LYT-10, MDM-2, MLH1, MLL, MLM, N-MYC, OST, PAX-5, PMS-1, FGF4, FGF6, FANCA, FLI1/ERGB2, FOSL1, FOSL2, GLI, HRAS1, HRX/MLLT1, HRX/MLLT2, KRAS2, MADH4, MASI, MCF2, MLLT1/MLL, MLLT2/HRX, MTG8/RUNX1, MYCLK1, MYH11/CBFB, NFKB2, NOTCH1, NPM1/ALK, NRG/REL, NTRK1, PBX1/TCF3, PML/RARA, PRCA1, RUNX1, RUNX1/CBFA2T1, SET, SHP2, TCF3/PBX1, TNFa, Clusterin, Survivin, ΤΟΕβ, c-fos,c-SRC과 INT-1이 포함하되 이에 제한되지 않는다. 일부 실시예에서, 상기 발암성 단백질은 Bcl-2 계열의 구성원의 일원(예: Bcl-2,Bcl-xL and Bcl-w), VEGF/VEGFR, PDGFRβ, EGFR, EGFR 돌연변이체, IGF-1R, HDACs, HER2, MYC, KRAS, AFP,CEA,CA199, 에스트로겐 수용체(estrogen receptor ER-α), 안드로겐 수용체(Androgen receptor,AR), 타이로신 키나아제(c-ABL, BCR-ABL, BTK, FAK, PTK6, Wee1, TRK 막횡단 수용체), 세린/트레오닌 산 키나아제 수용체(IRAK4, LRRK2, B-Raf, RIPK2, CDK4/6, CDK7, CDK8, CDK8/19, CDK9, TBK1), 단백질키나아제Ⅱ(CK2), 후성유전학적 관련 단백질(BRD2, BRD3, BRD4, BRDT, TRIM24, BRD9, PBRM1, SMARCA2, SMARCA4, EP300, EZH2, WDR5), 부신 수질 호르몬(ADM), DPP일 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 표적 단백질은 면역 기능 관련 단백질을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 "면역 기능 관련 단백질"이라는 용어는 신체의 면역 과정에 관여하는 기능성 단백질을 뜻한다. 예를 들어, 항원 제시 분자(예: MHC 클래스 I 분자, MHC 클래스 II 분자, HLA 등), 항원 인식 분자(예: TCR, CD123, NKG2D 등), 면역 체크포인트 분자(예: PD-1, PD-L1, CTLA4, TIM3, TIGIT, LAG3, A2AR, BTLA, IDO1, IDO2, TDO, KIR, NOX2, VISTA , SIGLEC7, PVR 등), 면역 자극/공동 자극 분자(예:, CD3, CD80/86, CD28 등) 및 선천성 또는 적응성 면역에 관여하는 기타 분자일 수 있다. 일부 실시예에서, 면역 기능 관련 표적 단백질에는, 예를 들어, CD123, CD7, CD5, MHC 클래스 I 분자, MHC 클래스 II 분자, 비고전적 MHC 분자(예를 들어, HLA-G, HLA-E), MICA/B, ULBP1-6, IL6, IL6 수용체, IL1 수용체, RANKL, TGF-β1, PD1, PD-L1, CTLA4, Tim3, LAG3, Siglec-15, TIGIT, CD47, IL4RA, CD94/NKG2A, CXCR1/2, CXCL8, CCR2/CCR5, CCR4, CXCR4, c-Rel, CCL2, CCL5, CCL20, CCL22, CSF-1, CCL2, CCL2, CCL5 인돌아민-2,3-다이옥시게나제(IDO) 또는 아르기나제 1(ARG1)가 포함된다.
일부 실시예에서, 상기 표적 단백질은 신경계 질병 관련 표적 단백질을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 "신경계 질병 관련"이라는 용어는 신경계 질병에 관여하는 단백질, 특히 신경 퇴행성 질병에서 단백질을 뜻한다. 일부 실시예에서, 상기 신경계 질병 관련 표적 단백질은, 예를 들어 Tau, β-아밀로이드 단백질(amyloid-β(Aβ)), α시뉴클레인, 돌연변이 헌팅틴(mutant huntingtin，mHTT), α-시뉴클레인, TAR RNA결합 단백질(TARDBP)과FUS RNA결합단백질(FUS)을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 표적 단백질은 바이러스 감염과 관련된 표적 단백질을 포함한다. 상기 바이러스 감염과 관련된 표적 단백질은, 예를 들어, HBV 인코딩된 X 단백질(HBx), HBV DNA 폴리메라아제, HBV 캡시드 당단백질, HIV-1 역전사 효소, HIV gp120, HCV NS3-4A 프로테아제, HCV RNA 폴리메라아제, HCV외피(envelope)단백질, EBV DNA 폴리메라아제, EBV EBNA1, 코로나바이러스 RNA 합성 효소, 코로나바이러스 스파이크 단백질, 코로나바이러스 외피 단백질, 코로나바이러스 막 단백질, 코로나바이러스 뉴클레오캡시드 단백질, RNA의존성RNA폴리메라아제(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)，예를 들어, 신종 코로나바이러스 RNA의존성RNA폴리메라아제, 헤르페스 바이러스(Herpesviruses)DNA과 RNA 폴리메라아제, 헤르페스 바이러스 캡시드 당단백질, CMV DNA 폴리메라아제, CMV캡스드 당단백질, RSV외피 단백질, RSV캡시드 단백질, RSV RNA 폴리메라이제, 인플루엔자 바이러스 RNA폴리메라아제, 인플루엔자 바이러스 외피(envelope)단백질, HPV DNA폴리메라아제, HP캡스드 단백질을 포함한다. 다른 실시예에서, 표적 단백질은 HBV 표면 항원, HBeAg, HBV 폴리메라이제 단백질, HIV Gag 단백질, HIV Env 단백질 등과 같은 바이러스 단백질로, 이들의 기능은 바이러스 복제 증폭 및 기능 및 바이러스성 질병의 진행에 중요한 것으로 여겨진다.
일부 실시예에서, 상기 표적 단백질은 자가항원 관련 단백질을 포함한다. 자가면역 질병과 관련된 다양한 자가항원이 이 분야에 알려져 있다. I형 당뇨병과 관련된 자가항원, 예를 들어, 섬세포항원(ICA), 인슐린(IAA), 글루타메이트 탈탄산효소65(GAD65), 인슐린종항원-2(IA-2); 류마티스 관절염(RA) 관련 자가항원(autoantigen), 예를 들어, 시트룰린화 단백질/펩티드 항체, 이종리보핵단백질(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1), 알돌라아제(aldolase), 알파-에놀라아제(alpha-enolase), 칼레티쿨린(calreticulin), 열활성단백질(HSP60), BiP, PGK1, 스트레스 유발 인산 단백질 (stress-induced phosphoprotein 1), FUSE-BP1/2: 전신 홍반 루푸스(SLE)와 관련된 자가항원, 예를 들어, 디옥시리보핵단백질, SmD1, SmD3, Clq, 부스럼항응고물(LA), 카디오리핀(CL), β2당단백질I(β2GPI), 프로트롬빈(PT) 및 포스파티딜세린(PS); 전신성 경화증(Systemic Sclerosis, SSc)/경피증(scleroderma, SD)과 관련된 자가항원, 예를 들어, Scl-70, SSA, Ro52； 자가면역성 간 질병과 관련된 항원, 예를 들어, 미토콘드리아 항원, Spl00, PML, gp210, p62; 중증 근무력증과 관련된 자가항원, 예를 들어, 아세틸콜린 수용체; 중추 신경계 자가면역 질병(변연 뇌염, 뇌척수염, 소뇌 운동 실조증)과 관련된 자가항원, 예를 들어, 전압-게이트 칼륨 채널(VGKC) 복합체, 전압-게이트 칼슘 채널 수용체, α-아미노-3-하이드록시-5-메틸이소옥사졸-4-프로피온산(AMPA) 수용체, γ-아미노부티르산-B(GABAB) 수용체, 글리신 수용체; 다발성 경화증과 관련된 자가항원, 예를 들어, 미엘린 알칼리성 단백질(MBP), 미엘린 올리고덴드론사이트 당단백질(MOG); 다발성 근염(PM) 및 피부근염(DM)과 관련된 자가항원, 예를 들어, Jo-1, Mi-2, PM-Scl, Ro-52；글루텐 민감성 장질병 관련 자가항원, 예를 들어, 근내막 항체(EMA), 조직 트랜스글루타미나제(tTG); 항-NMDAR 항체 뇌염과 관련된 자가항원, 예를 들어, N-메틸-D-아스파르트산 수용체; 시신경척수염(NMO)과 관련된 자가항원, 예를 들어, 아쿠아포린 4(AQP4); 생식과 관련된 자가항원, 예를 들어, 난소 항원, 정자 항원이다.
일부 실시예에서, 상기 병원성 단백질은 대사 질병과 관련된 표적 단백질이다. 상기 대사 질병과 관련된 표적 단백질은, 예를 들어, CD36, 저밀도 지단백질 수용체(LDLR), ChemR23(CMKLR1), 미토콘드리아 탈수소효소(mitochondrial dehydrogenase) ALDH4A1(표적 단백질)을 포함하되 이에 제한하지 않는 죽상경화증(Atherosclerosis, AS)에 대한 표적 단백질; RalGAPα1, 디펩티딜 펩티다제 IV(DPP4)를 포함하되 이에 제한하지 않는 제2형 당뇨병 표적 단백질; TMEM16A, VAMP3을 포함하되 이에 제한되지 않는 비알코올성 지방간 질병 표적 단백질; 헥소키나제(hexokinase, HK), 포도당 수송체 1(glucosetransporter, GLUT1), 포도당 수송체 4(glucose transporter, GLUT4), 포스포글리세레이트 탈수소효소, 젖산 탈수소효소를 포함하되 이에 제한하지 않는 종양 포도당 대사를 위한 표적 단백질; ATP 시트레이트 리아제(ATP citrate lyase, ACLY), 지방산 합성 효소(fatty acid synthase, FASN), 아세틸-CoA 아세틸 트랜스퍼라제 1(acetyl-CoA acetyltransferase 1, ACAT1)을 포함하되 이에 제한하지 않는 종양 지질 대사를 위한 표적 단백질이다.
일부 실시예에서, 표적 결합 도메인은 TCR, HLA-I, MICA 및 MICB를 제외한 다른 표적 단백질을 특이적으로 표적하고, 상기 바이러스 소포체 상주 단백질은 본 공개에 기술된 임의의 바이러스 소포체 상주 단백질이다.
일부 실시예에서, 표적 결합 도메인은 TCR, HLA-I, MICA, MICB와 같은 최소 2개의 표적 단백질을 특이적으로 표적하고, 상기 바이러스 소포체 상주 단백질은 본 공개에 기술된 임의의 바이러스 소포체 상주 단백질이다.
일부 실시예에서, 표적 결합 도메인은 TCR, HLA-I, MICA 또는 MICB를 특이적으로 표적하고 상기 바이러스 소포체 상주 단백질은 아데노바이러스 E3-K19가 아니다.
일부 실시예에서, 상기 키메라 단백질 구조체의 표적 결합 도메인은 힌지 또는 링커를 통해 ERAD 메커니즘 단백질 결합 도메인에 연결된다. 일부 실시예에서, 상기 힌지는 SEQ ID NO.123(IgG4 힌지) 또는 SEQ ID NO.133((Gly4Ser)2)으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 HCMV 당단백질 US2의 HLA 결합 도메인은 서열 SEQ ID NO.47에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 HCMV 당단백질 US2의 HLA 결합 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.47에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 US2의 HLA 결합 도메인은 서열 SEQ ID NO.75에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 US2의 HLA 결합 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.75에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 HCMV 당단백질 US11의 MHC 결합 도메인은 서열 SEQ ID NO.53에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 HCMV 당단백질 US11의 MHC 결합 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.53에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 US11의 HLA 결합 도메인은 서열 SEQ ID NO.81에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 US11의 HLA 결합 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.81에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 HCMV 당단백질 US3의 HLA 결합 도메인은 서열 SEQ ID NO.50에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 HCMV 당단백질 US3의 HLA 결합 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.50에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 US3의 HLA 결합 도메인은 서열 SEQ ID NO.78에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 US3의 HLA 결합 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.78에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 HCMV 당단백질 US10의 HLA 결합 도메인은 서열 SEQ ID NO.56에 표시된 아미노산 서열과 80% 이상 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 HCMV 당단백질 US10의 HLA 결합 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.56에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 MHC I 및/또는 MHC II 를 표적으로 하는 결합 단백질 분자 도메인 또는 이의 기능적 변이체는 MHC 및/또는 MHC II 분자를 분해하는 바이러스 당단백질로부터 유래되고, 바람직하게는, 상기 바이러스 당단백질은 HCMV 당단백질 US2, US3, US11 또는 US10, 아데노바이러스 E3-19K 또는 HHV-7 US21으로부터 선택된다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 MHC I 및/또는 MHC II 를 표적으로 하는 결합 단백질 분자 도메인 또는 이의 기능적 변이체는 MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5 또는 ULBP6의 NK 표적점 단백질을 특이적으로 억제하거나 분해하는 바이러스 단백질을 더 포함하며, 바람직하게는, 상기 바이러스 단백질은 HCMV UL16, UL141, UL142 또는 아데노바이러스 E3-19K 으로부터 선택된다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 MHC I 및/또는 MHC II 를 표적으로 하는 결합 단백질 분자 도메인 또는 이의 기능적 변이체는 분해를 위해 MHC I 분자를 골지체에서 리소좀으로 운반하는 바이러스 단백질을 더 포함하며, 바람직하게는, 상기 바이러스 단백질은 HIV Nef, HIV Vpu, HHV-7 U21, HHV-8 KK3, HHV-8 KK5, MHV-68 MK3 및 HTLV-1 p12 으로부터 선택된다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 MHC I 및/또는 MHC II 를 표적으로 하는 결합 단백질 분자 도메인 또는 이의 기능적 변이체는 골지체로부터 소포체로의 MHC- 폴리펩티드 분자의 복귀를 매개하고 이들의 분해를 촉진하는 바이러스 단백질을 더 포함하고, 바람직하게는, 상기 바이러스 단백질은 MHC 결합 구조 및 KDEL 수용체 결합 도메인을 포함하며, 바람직하게는, 상기 바이러스 단백질은 Cowpox Virus 단백질 CPXV203이다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 HHV-7 US21의 MHC 결합 도메인은 서열 SEQ ID NO.62에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 HHV-7 US21의 MHC 결합 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.62에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 HCMV UL16의 NK 표적점 단백질 결합 도메인은 서열 SEQ ID NO.84에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 HCMV UL16의 NK 표적점 단백질 결합 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.84에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 HCMV UL141의 NK 표적점 단백질 결합 도메인은 서열 SEQ ID NO.87에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 HCMV UL141의 NK 표적점 단백질 결합 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.87에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 HCMV UL142의 MICA, ULBP3 결합 도메인은 서열 SEQ ID NO.90에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 HCMV UL142의 MICA, ULBP3 결합 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.90에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 우두 바이러스 단백질 CPXV203의 MHC 결합 도메인은 서열 SEQ ID NO.99에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 우두 바이러스 단백질 CPXV203의 MHC 결합 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.99에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 우두 바이러스 단백질 CPXV203의 MHC 결합 도메인은 서열 SEQ ID NO.102에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 우두 바이러스 단백질 CPXV203의 MHC 결합 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.102에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 아데노바이러스 E3-19K의 MHC 결합 도메인은 서열 SEQ ID NO.59에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 아데노바이러스 E3-19K의 MHC 결합 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.59에 표시된 바와 같다.
3. 단백질 분해 경로 구성원 결합 도메인
본 공개에서 제공된 키메라 단백질 구조체는 단백질 분해 경로 구성원 결합 도메인을 더 포함할 수 있다. 본 명세서에 상기 "단백질 분해 경로 구성원 결합 도메인"은 단백질 분해 경로의 구성원에 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있는 임의의 부분을 뜻한다.
단백질 분해 경로는 세포 내에서 단백질의 분해를 매개하는 모든 경로일 수 있다. 알려진 단백질 분해 경로에는 유비퀴틴화-프로테아좀 경로, 엔도솜-리소좀 경로, 그리고 자가포식 분해 경로 등이 포함되지만 이에 제한하지 않는다.
유비퀴틴화-프로테아좀 경로 구성원에는, 예를 들어, E1 유비퀴틴 활성화 효소, E2 유비퀴틴 결합 효소, E3 유비퀴틴 리가제 및 프로테아좀이 포함된다.
E1 유비퀴틴 활성화 효소의 예로는 UBA1, UBA2, UBA3, UBA5, UBA6, UBA7, ATG7, NAE1 및 SAE1 등이 있다.
E2 유비퀴틴 결합 효소의 예로는 hCdc34，Ubc-Uev1A, UBE2A, UBE2B, UBE2C, UBE2D1, UBE2D2, UBE2D3, UBE2D4, UBE2E1, UBE2E2, UBE2E3, UBE2F, UBE2G1, UBE2G2, UBE2H, UBE2I, UBE2J1, UBE2J2, UBE2K, UBE2L3, UBE2L6, UBE2M, UBE2N, UBE2O, UBE2Q1, UBE2Q2, UBE2R1(CDC34), UBE2R2, UBE2S, UBE2T, UBE2U, UBE2V1, UBE2V2, UBE2W, UBE2Z, ATG3, BIRC6과 UFC1이 있다.
E3 유비퀴틴 리가제 예로는 폰 히펠-린다우(von Hippel-Lindau，VHL), Cereblon(CRBN), 세포사멸 저해 단백질(inhibitor of apoptosis protein, IAP), 켈치 유사 ECH 관련 단백질 1(Kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1), RNF4, RNF114, MDM2, LUBAC, FBW7, Met30, HECT, SKP2, beta TRCP1，HUWEI，TRAF6，SMURF1과 E6AP 등이 있다. 일부 실시예에서, E3 유비퀴틴 리가제 예로는 E3A, mdm2, Anaphase-promoting complex(APC), UBR5(EDD1), SOCS/BC-box/eloBC/CUL5/RING, LNXp80, CBX4, CBLL1, HACE1, HECTD1, HECTD2, HECTD3, HECTD4, HECW1, HECW2, HERC1, HERC2, HERC3, HERC4, HERC5, HERC6, HUWE1, ITCH, NEDD4, NEDD4L, PPIL2, PRPF19, PIAS1, PIAS2, PIAS3, PIAS4, RANBP2, RNF4, RBX1, SMURF1, SMURF2, STUB1, TOPORS, TRIP12, UBE3A, UBE3B, UBE3C, UBE3D, UBE4A, UBE4B, UBOX5, UBR5, VHL, WWP1, WWP2, Parkin 및 MKRN1이 포함된다.
엔도솜-리소좀 경로 구성원의 예로는 AP-1, AP-2, AP-3, 엔도솜, 리소좀, HOPS, ESCRT, GASP, BLOC-1, ESCRT, Retromer, ESCRT, sortingnexin, Dapper2, SNX4, Pincher, Rap1-PDZ-GEF1, clathrin, C3G/CrkL/Shp2/Gab2등이 포함된다.
자가포식 분해 경로 구성원의 예로는 샤프론 매개 자가포식(chaperone-mediated autophagy，CMA), USP10, G3BP1, ULK1, ATG16L1, TRIM16, FBXO27VDAC, RHOT1, MFN1/2, BNIP3L, FUNDC1, BNIP3, AMBRA1, BCL2LI3, FKBP8, CHDH, DISC1, PHB2, Cardiolipin, SEC62, RTN3, PEX5, PEX14, ABCD3, NUFIP1등이 포함된다.
일부 실시예에서, 상기 단백질 분해 경로 구성원 결합 도메인은 VHL 결합 도메인이다. 일부 실시예에서, 상기 VHL 결합 도메인은 SEQ ID NO.119(DRHDSGLDSM) 또는 SEQ ID NO.120(ALAPYIP)과 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 단백질 분해 경로 구성원 결합 도메인은 Keap1 결합 도메인이다. 일부 실시예에서, 상기 Keap1 결합 도메인은, 예를 들어, SEQ ID NO.121(LDPETGEYL)과 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 단백질 분해 경로 구성원 결합 도메인은 E3 유비퀴틴 리가제 결합 도메인이고, 이는 SEQ ID NO.119 (DRHDSGLDSM)와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 단백질 분해 경로 구성원 결합 도메인은 CMA 결합 도메인이다. 일부 실시예에서, 상기 CMA 결합 도메인은 SEQ ID NO.122(KFERQ)와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 CMA 결합 도메인은 SEQ ID NO.123 (KFERQKILDQRFFE)과 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 단백질 분해 경로 구성원 결합 도메인은 프로테아좀 결합 도메인이다. 일부 실시예에서, 상기 프로테아좀 결합 도메인은 효모 Rad23(예: S.cerevisiae Rad23), 인간 Rad23b(hHR23b) 유비퀴틴 유사(ubiquitin-like, UbL) 도메인, HPV E7, 안키린 단백질의 프로테아좀 결합 도메인 중에서 선택된다. 일부 실시예에서, 상기 프로테아좀 결합 도메인은 효모 Rad23의 1-77번째 아미노산을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 프로테아좀 결합 도메인은 인간 Rad23의 1-83번째 아미노산을 포함한다.
본 출원 발명자는 기본 TPD 설계(Targeted protein binding domain-Transmembrane domain-ER retention domain，TBD-TMD-ERD)와 비교하여 단백질 분해 경로 구성원 결합 도메인(ligand for E3 Ligase(E3L)，ligand for E2 Ubiquitin-conjugating enzyme(E2L) 또는 ligand for lysosome(LL))(예: 상기 기술한 것과 같은 것들)을 포함하는 키메라 단백질 구조체가 표적 단백질의 분해 효과를 크게 향상시킬 수 있다는 것을 발견했다. 바이러스 ER 상주 단백질의 기능적 구조와 ERAD 역 수송기 복합체의 결합 능력이 다르고, 천연 구조와 ER 상주 E3ligase와의 상호작용에도 차이가 있으며, 동시에 소포체 내의 정상적인 잘못 접힌 단백질 ERAD 메커니즘 분해 경로와 경쟁해야 한다. 따라서, 천연 TMD-ERD의 도메인은 표적 단백질의 유비퀴틴화 및 분해 능력에 차이점과 한계가 있으며, 표적 단백질의 분해 효율을 더욱 향상시키기 위해 유비퀴틴-프로테아제 시스템(UPS) 리간드 도메인 및/또는 자가포식-리간체 경로(ALP) 리간드 도메인을 도입하면 세포질로 수송된 표적 단백질의 유비퀴틴화와 프로테아좀의 분해 또는 리소좀으로의 수송을 더욱 촉진하여 표적 단백질의 효율적인 가수분해를 실현할 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 키메라 단백질 구조체의 표적 결합 도메인 또는 ERAD 메커니즘 단백질 결합 도메인은 힌지 또는 링커를 통해 단백질 분해 경로 구성원 결합 도메인에 연결된다. 힌지 또는 링커는 하나 이상의 분자 서열 구조(Glyx Sery)n일 수 있으며, 여기서 n은 1부터 10까지의 숫자이고, 그 중 x, y는 각각 0부터 10까지의 숫자이지만, x, y는 동시에 0이 될 수 없다. 일부 실시예에서, 상기 힌지는 SEQ ID NO.172(IgG4 힌지) 또는 SEQ ID NO.173((Gly4Ser)2)로 표시된 아미노산 서열을 포함한다.
4. TPD 키메라 단백질 구조체
일부 실시예에서, 본 공개에 의해 제공되는 키메라 단백질 구조체는 TCR을 표적으로 하는 표적 단백질 결합 도메인과 아데노바이러스 E3-19K 및 상기 기재된 하나 이상의 단백질 분해 경로 구성원 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 공개에 의해 제공되는 키메라 단백질 구조체는 TCR을 표적으로 하는 표적 단백질 결합 도메인과 아데노바이러스 E3-19K 및 E3 유비퀴틴 리가제 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 E3 유비퀴틴 리가제 결합 도메인은 SEQ ID NO.147(DRHDSGLDSMGSGSGALAPYIP)에 도시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 본 공개에 의해 제공되는 키메라 단백질 구조체는 TCR을 표적으로 하는 표적 단백질 결합 도메인 및 아데노바이러스 E3-19K 이외의 바이러스 소포체 상주 단백질의 막횡단 도메인 또는 이의 기능적 변이체 및 소포체 상주 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 상기 바이러스 소포체 상주 단백질은 HCMV 당단백질 US2, US11, US3, US10, US6, HSV ICP47, CPXV12, BHV UL49.5, EBV BNFL2a, HCMV UL16, UL141, UL142, HIV Nef, HIV Vpu, HHV-7 U21, HHV-8 KK3, HHV-8 KK5, MHV-68 MK3, HTLV-1 p12 및 우두 바이러스 단백질 CPXV203 중 에서 적어도 하나로부터 선택될 수 있다.
일부 실시예에서, 본 공개에 의해 제공되는 키메라 단백질 구조체는 상기 표적 단백질(예를 들어, TCR)을 표적으로 하는 표적 단백질 결합 도메인과 HCMV US2 및/또는 US11의 막횡단 도메인 또는 이의 기능적 변이체와 소포체 상주 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
일부 실시예에서, 본 공개에 의해 제공되는 키메라 단백질 구조체는 상기 표적 단백질(예를 들어, TCR)을 표적으로 하는 표적 단백질 결합 도메인과 HCMV US3의 막횡단 도메인 또는 이의 기능적 변이체와 소포체 상주 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
일부 실시예에서, 본 공개에 의해 제공되는 키메라 단백질 구조체는 상기 표적 단백질(예를 들어, TCR)을 표적으로 하는 표적 단백질 결합 도메인과 HCMV US10의 막횡단 도메인 또는 이의 기능적 변이체와 소포체 상주 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
일부 실시예에서, 본 공개에 의해 제공되는 키메라 단백질 구조체는 상기 표적 단백질(예를 들어, TCR)을 표적으로 하는 표적 단백질 결합 도메인과 HCMV US6, HSV ICP47, CPXV012, EBV BNFL2a 및/또는 BHV UL49.5의 막횡단 도메인 또는 이의 기능적 변이체와 소포체 상주 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
일부 실시예에서, 본 공개에 의해 제공되는 키메라 단백질 구조체는 상기 표적 단백질(예를 들어, TCR)을 표적으로 하는 표적 단백질 결합 도메인과 HHV-7 US21의 막횡단 도메인 또는 이의 기능적 변이체와 소포체 상주 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
일부 실시예에서, 본 공개에 의해 제공되는 키메라 단백질 구조체는 상기 표적 단백질(예를 들어, TCR)을 표적으로 하는 표적 단백질 결합 도메인과 HCMV UL16, UL141및/또는 UL142의 막횡단 도메인 또는 이의 기능적 변이체와 소포체 상주 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
일부 실시예에서, 본 공개에 의해 제공되는 키메라 단백질 구조체는 상기 표적 단백질(예를 들어, TCR)을 표적으로 하는 표적 단백질 결합 도메인과 HIV Nef, HIV Vpu, HHV-7 U21, HHV-8 KK3, HHV-8 KK5, MHV-68 MK3 및/또는 HTLV-1 p12의 막횡단 도메인 또는 이의 기능적 변이체와 소포체 상주 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
일부 실시예에서, 본 공개에 의해 제공되는 키메라 단백질 구조체는 상기 표적 단백질(예를 들어, TCR)을 표적으로 하는 표적 단백질 결합 도메인과 Cowpox Virus 단백질 CPXV203의 막횡단 도메인 또는 이의 기능적 변이체와 소포체 상주 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
일부 실시예에서, 본 공개에 의해 제공되는 키메라 단백질 구조체는 TCR을 표적으로 하지 않는 표적 단백질 결합 도메인과 아데노바이러스 E3-19K를 포함한다. 일부 실시예에서, 본 공개에 의해 제공되는 키메라 단백질 구조체는 CD123을 표적으로 하는 표적 단백질 결합 도메인과 아데노바이러스 E3-19K를 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 키메라 단백질 구조체는 상기 기재된 하나 이상의 단백질 분해 경로 구성원 결합 도메인을 더 포함한다.
5. 공동 발현 부분
일부 실시예에서, 본 공개에 의해 제공되는 키메라 단백질 구조체는 적어도 하나의 공동 발현 부분과 공동 발현된다. 공동 발현에 적용되는 임의의 방식 모두 사용될 수 있다. 예를 들어, 키메라 단백질 구조(또는 그 일부)와 적어도 하나의 공동 발현 부분은 절단 가능한 링커에 의해 연결될 수 있으며, 링커가 절단되면, 키메라 단백질 구조체와 상기 공동 발현 부분은 공동 발현될 수 있다.
일부 실시예에서, 본 공개에 의해 제공되는 키메라 단백질 구조체는 적어도 하나의 공동 발현 부분과 연결된다. 예를 들어, 자가 절단 가능한 링키지(self-cleavable linkage)를 통해 연결을 진행한다. 일부 실시예에서, 상기 자가 절단 가능한 링키지는 절단 가능한 펩타이드, 예를 들어, T2A 펩타이드, GSG-T2A 펩타이드, E2A 펩타이드, GSG-E2A 펩타이드, F2A 펩타이드, GSG-F2A 펩타이드, P2A 펩타이드 또는 GSG-P2A 펩타이드이다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 T2A는 서열 SEQ ID NO.108에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 T2A의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.108에 표시된 바와 같다.
일부 실시예에서, GSG-T2A 펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.109에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 P2A는 서열 SEQ ID NO.110에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 P2A의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.110에 표시된 바와 같다.
일부 실시예에서, GSG-P2A 펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.111에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 E2A는 서열 SEQ ID NO.112에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 E2A의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.112에 표시된 바와 같다.
일부 실시예에서, GSG-E2A 펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.113에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 F2A는 서열 SEQ ID NO.114에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 F2A의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.114에 표시된 바와 같다.
일부 실시예에서, GSG-F2A 펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.115에 표시된 바와 같다.
본 출원에 의해 제공되는 공동 발현 부분은 생물학적 기능을 갖는 임의의 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 실현하는 것을 기대하는 생물학적 기능에 따르면, 적절한 공동 발현 부분을 선택할 수 있다. 예를 들어, 세포의 면역원성 또는 항원 제시를 감소시키기 위해, MHC 클래스 I 또는 II 분자를 분해하거나 감소시킬 수 있는 단백질이 공동 발현 부분으로 선택할 수 있다. 또 다른 예로서, 세포가 표적 단백질을 인식하기 위해, 표적 단백질을 인식하거나 결합하는 결합 도메인(예를 들어, 케모카인 수용체 또는 키메라 항원 수용체 CAR)이 공동 발현 부분으로 선택할 수 있다. 또 다른 예로서, 면역 자극 활성을 증가시키기 위해, 면역 자극 분자를 공동 발현 부분으로 선택할 수 있다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 공동 발현 부분의 예로는 완전한 바이러스 ER 상주 당단백질(예를 들어, HCMV US2, US3, US11, US10, 아데노바이러스 E3-Kl 9, HCMV US6, HSV ICP47), 키메라 항원 수용체 (CAR), 기능성T세포수용체(TCR), 케모카인 수용체(예: CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR9, CCR2b, CXCR1, CXCR2 및 CXCR4), NK 세포 활성화 수용체(예:NKG2D, NKG2C, NKG2E, NKG2F, NKG2H, CD94, KIR2DL4, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR3DS1，천연 세포 독성 수용체, TRAIL, DNAM-1, CD16a, 2B4, NTB-A, CRACC以及NKp80), CNK 신호 전달 구성 요소, 사이토카인, CD7, 면역 자극 분자(예:TNF-a, IFN-β, IFN-γ, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL- 18과 과립구 대식세포 집락 자극 인자 중 하나 이상)등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
i) 완전한 바이러스 ER 상주 당단백질
일부 실시예에서, 상기 공동 발현 부분은 완전한 바이러스 ER 상주 당단백질이며, HCMV US2, US3, US11, US10, 아데노바이러스 E3-Kl9, HCMVUS6 및 HSV ICP47을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 HCMV 당단백질 US2의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.46에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 MHC I 류 또는 MHC II 류 분자를 분해하는 활성을 갖는다. 일부 바람직한 실시예에서, 상기 HCMV 당단백질 US2의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.46에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 US2의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.74에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 MHC I 류 또는 MHC II 류 분자를 분해하는 활성을 갖는다. 일부 바람직한 실시예에서, 상기 US2의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.74에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 HCMV 당단백질 US3의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.49에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 MHC I 류 또는 MHC II 류 분자를 분해하는 활성을 갖는다. 일부 바람직한 실시예에서, 상기 HCMV 당단백질 US3의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.49에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 US3의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.77에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 MHC I 류 또는 MHC II 류 분자를 분해하는 활성을 갖는다. 일부 바람직한 실시예에서, 상기 US3의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.77에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 HCMV 당단백질 US11의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.52에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 MHC I 류 또는 MHC II 류 분자를 분해하는 활성을 갖는다. 일부 바람직한 실시예에서, 상기 HCMV 당단백질 US11의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.52에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 US11의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.80에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 MHC I 류 또는 MHC II 류 분자를 분해하는 활성을 갖는다. 일부 바람직한 실시예에서, 상기 US11의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.80에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 HCMV 당단백질 US10의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.55에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 MHC I 류 또는 MHC II 류 분자를 분해하는 활성을 갖는다. 일부 바람직한 실시예에서, 상기 HCMV 당단백질 US10의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.55에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 아데노바이러스 E3-19K의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.58에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 MHC I 류 또는 MHC II 류 분자를 분해하는 활성을 갖는다. 일부 바람직한 실시예에서, 상기 아데노바이러스 E3-19K의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.58에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 HCMV US6의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.64에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 MHC I 류 또는 MHC II 류 분자를 분해하는 활성을 갖는다. 일부 바람직한 실시예에서, 상기 HCMV US6의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.64에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 HSV ICP47의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.66에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 MHC I 류 또는 MHC II 류 분자를 분해하는 활성을 갖는다. 바람직한 실시예에서, 상기 HSV ICP47의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.66에 표시된 바와 같다.
ii) 키메라 항원 수용체(CAR)
일부 실시예에서, 상기 공동 발현 부분은 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 상기 CAR은 표적 단백질 결합 도메인(예를 들어, 종양을 표적으로 하는 세포 외 인식 도메인), 막횡단 도메인, 및 면역 수용체 활성화 신호 전달 도메인(ITAM)("세포 내 신호 전달 도메인"이라고도 함)을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 CAR은 공동 자극 도메인을 더 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 종양을 표적으로 하는 세포 외 인식 도메인, 막횡단 도메인 및/또는 세포 내 신호 전달 도메인 사이에는 힌지 또는 링커를 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 종양을 표적으로 하는 세포 외 인식 도메인은, 종양 항원 특이적 결합 도메인, 종양 미세 환경 표적 항원 결합 도메인 및/또는 종양 미세 환경을 표적으로 하는 케모카인 수용체 중에서 선택된다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 종양을 표적으로 하는 세포 외 인식 도메인은, 종양 관련 항원을 표적화하고 인식하는 항체 또는 이의 기능적 단편, TCR 또는 이들의 조합에서 선택된다. 상기 항체의 기능 단편은 Fd, Fv, Fab, Fab', F(ab')2, Fv(scFv), 단일 사슬 항체(scFv) 또는 나노바디, 디아바디, 트리아바디 및 테라바디에서 선택된다.
일부 바람직한 실시예에서, 본 명세서에 상기 CAR의 막횡단 도메인은 임의의 막결합 단백질 또는 막횡단 단백질에서 유래될 수 있고, BAFFR, BLAME(SLAMF8), CD2, CD3ε, CD4, CD5, CD8, CD9, CD11a(CD18, ITGAL, LFA-l), CD11b, CD11c, CD11d, CD16, CD19, CD22, CD27, CD28, CD29, CD33, CD37, CD40, CD45, CD49a, CD49d, CD49f, CD64, CD80, CD84, CD86, CD96(Tactile), CD100(SEMA4D), CD103, CD134, CD137(4-1BB), CD150(IPO-3, SLAMF1, SLAM), CD154, CD160(BY55), CD162(SELPLG), CD226(DNAM1), CD229(Ly9), CD244(2B4, SLAMF4), CD278(ICOS), CEACAM1, CRT AM, GITR, HYEM(LIGHTR), IA4, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7R a, ITGA1, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAM, ITGAX, ITGB1, ITGB2, ITGB7, KIR, LTBR, OX40, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80(KLRF1), PAG/Cbp, PSGL1, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAMF7, T 세포 수용체의 α, β 및 ζ사슬, TNFR2, VLA1 및 VLA-6을 포함하되 이에 제한되지 않는다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 CAR의 막횡단 도메인은 NK 세포 활성화 수용체 막횡단 도메인, DAP10 막횡단 도메인, DAP12 막횡단 도메인, CD8 막횡단 도메인, CD28 막횡단 도메인, CD4 막횡단 도메인, 4-1BBB 막횡단 도메인, OX40 막횡단 도메인, ICOS 막횡단 도메인, CTLA-4 막횡단 도메인, PD-1 막횡단 도메인, LAG-3 막횡단 도메인, 2B4 막횡단 도메인 및 BTLA 막횡단 도메인 및 이들의 조합에서 선택된다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 CAR의 막횡단 도메인은 CD8막횡단 도메인, T 세포 수용체의 α, β 및 ζ사슬 막횡단 도메인, CD28막횡단 도메인, CD3ε막횡단 도메인, CD45막횡단 도메인, CD4막횡단 도메인, CD5막횡단 도메인, CD8막횡단 도메인, CD9막횡단 도메인, CD16막횡단 도메인, CD22막횡단 도메인, CD33막횡단 도메인, CD37막횡단 도메인, CD64막횡단 도메인, CD80막횡단 도메인, CD86막횡단 도메인, CD134막횡단 도메인, CD137막횡단 도메인, CD154막횡단 도메인, GITR막횡단 도메인 및 이들의 조합에서 선택된다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 면역 수용체 활성화 신호 전달 도메인(ITAM)은 면역 수용체의 세포 내 활성화 신호 전달 도메인에서 유래된다. 바람직하게는, 상기 면역 수용체는 TCRζ, CD2, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD5, CD22, FcRγ, CD66d, FcαRI, FcγRI, FcγRII, FcγRIII, Dectin-1, CLEC-1, CD72, CD79A, CD79B 중에서 선택되고, 바람직하게는, 상기 면역 수용체 활성화 신호 전달 도메인(ITAM)은 NK 세포 신호 전달 어댑터 또는 이의 기능적 변이체와 융합되며, 바람직하게는, 상기 면역 수용체는 CD3ζ이다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 면역 수용체 활성화 신호 전달 도메인(ITAM)은 CD3ζ, 공동 FcRγ(FCER1G), FcγRIIa, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278(“ICOS”), FcεRI CD66d, DAP10 및 DAP12 등 세포 내 신호 도메인으로부터 유래된다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 CAR의 세포 내 신호 전달 도메인은 NK 세포 활성화 수용체의 세포 내 신호 도메인 및/또는 공동 자극 신호 전달 도메인을 포함한다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 T 세포 공동 자극 신호 전달 도메인은 공동 자극 분자의 세포 내 신호 도메인에서 유래된다. 바람직하게는, 상기 공동 자극 분자는 MHC I 분자, TNF 수용체 단백질, 면역 글로불린 유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린 단백질, 림프구 활성화 신호 전달 분자(SLAM 단백질), 활성화된 NK 세포 수용체, BTLA, Toll 리산드 수용체, OX40, CD2, CD7, CD16, CD27, CD28, CD30, CD40, CD38, CD35, CD79A, CD79B, CDS, ICAM-1, LFA-1, (CD11a/CD18), 4-1BB(CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS(CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM(LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8α, CD8β, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, NCR, DAP10, DAP12, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83과 특이적으로 결합한 리간드, CARD11, FcRa, FcRp, FcRy, Fyn, HVEM, ICOS, Lck, LAG3, LAT, LRP, NOTCH1, Wnt, OX40, ROR2, Ryk, SLAMF1, Slp76, pTa, TCRa, TCRp, TRIM, ZAP70, PTCH2에서 선택된다. 더 바람직하게는, 상기 공동 자극 신호 전달 도메인은 NKG2D 세포 내 신호 도메인, DAP10 세포 내 신호 도메인, DAP12 세포 내 신호 도메인, NCR 세포 내 신호 도메인, CD28 세포 내 신호 도메인, 4-1BB 세포 내 신호 도메인, OX40 세포 내 신호 도메인, 및 ICOS 세포 내 신호 도메인 중에서 선택될 수 있다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 상기 CAR의 힌지 및/또는 막횡단 도메인은 CAR의 세포 외 도메인의 세포 표면 제시를 제공한다. 본 명세서에서 상기 CAR의 힌지는 임의의 막결합 단백질 또는 모든 막횡단 단백질로부터 유래될 수 있고, 여기에는 BAFFR, BLAME(SLAMF8), CD2, CD3ε, CD4, CD5, CD8, CD9, CD11a(CD18, ITGAL, LFA-l), CD11b, CD11c, CD11d, CD16, CD19, CD22, CD27, CD28, CD29, CD33, CD37, CD40, CD45, CD49a, CD49d, CD49f, CD64, CD80, CD84, CD86, CD96(Tactile), CD100(SEMA4D), CD103, CD134, CD137(4-1BB), CD150(IPO-3, SLAMF1, SLAM), CD154, CD160(BY55), CD162(SELPLG), CD226(DNAM1), CD229(Ly9), CD244(2B4, SLAMF4), CD278(ICOS), CEACAM1, CRT AM, GITR, HYEM(LIGHTR), IA4, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Ra, ITGA1, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAM, ITGAX, ITGB1, ITGB2, ITGB7, KIR, LTBR, OX40, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80(KLRF1), PAG/Cbp, PSGL1, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAMF7, T 세포 수용체의 α, β 및 ζ사슬, TNFR2, VLA1 및 VLA-6이 포함되나 이에 제한하지 않는다. 일부 실시예에서, 본 명세서에서 상기 CAR의 힌지는 CD8α의 힌지 영역, 인간 면역글로불린(Ig)의 힌지 영역 또는 글리신-세린이 풍부한 서열을 포함한다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 링커는 유연성 링커이고, 바람직하게는, 상기 유연성 링커는 (Gly(x)Ser(y))n으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 n은 1내지 10사이의 정수이고, x 및 y는 x 및 y가 모두 0이 아닌 경우에 독립적으로 0내지 10사이의 정수이며, 더 바람직하게는, 상기 링커는 SEQ ID NO.104에 표시되는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO.105에 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 힌지는 IgG1 힌지 또는 IgG4 힌지이다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 IgG1 힌지는 서열 SEQ ID NO.106에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 서열을 포함한다. 일부 바람직한 실시예에서, 상기 IgG1 힌지의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.106에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 IgG4 힌지는 서열 SEQ ID NO.107에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다 바람직한 실시예에서, 상기 IgG4 힌지의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.107에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 NK 활성화 수용체 구성 요소, CNK 신호 전달 구성 요소 및/또는 UT 구성 요소 사이에는 절단 가능한 펩타이드가 포함되며, 예를 들어 T2A 펩타이드, GSG-T2A 펩타이드, E2A 펩타이드, GSG-E2A 펩타이드, F2A 펩타이드, GSG-F2A 펩타이드, P2A 펩타이드 또는 GSG-P2A 펩타이드이다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 T2A는 서열 SEQ ID NO.108에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 바람직한 실시예에서, 상기 T2A의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.108에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, GSG-F2A 펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.109에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 P2A는 서열 SEQ ID NO.110에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 바람직한 실시예에서, 상기 P2A의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.110에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, GSG-P2A 펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.111에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 E2A는 서열 SEQ ID NO.112에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 바람직한 실시예에서, 상기 E2A의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.112에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, GSG-E2A 펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.113에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 F2A는 서열 SEQ ID NO.114에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 바람직한 실시예에서, 상기 F2A의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.114에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, GSG-F2A펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.115에 표시된 바와 같다.
iii) CNK 수용체
일부 실시예에서, 상기 공동 발현 부분은 CNK 수용체이다. 상기 CNK 수용체는 키메라 NK 활성화 수용체 구성 요소와 키메라 NK 신호 전달 구성 요소(“CNK 신호 전달 구성 요소”라고도 함)를 포함한다. 상기 키메라 NK 활성화 수용체 구성 요소는 적어도 NK 세포 활성화 수용체 또는 이의 기능적 변이체를 포함할 수 있다.
NK 세포 활성화 수용체
일부 실시예에서, 상기 NK-세포 활성화 수용체는 (a) NK 세포 활성화 수용체 세포 외 도메인(ED) 또는 이의 기능적 변이체, (b) NK 세포 활성화 수용체 막횡단 도메인(TMD) 또는 이의 기능적 변이체, 및 (c) NK 세포 활성화 수용체 세포 내 도메인(ICD) 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 임의적으로, 상기 NK 세포 활성화 수용체 세포 외 도메인 또는 이의 기능적 변이체, 상기 NK 세포 활성화 수용체 막횡단 도메인 또는 이의 기능적 변이체 및/또는 상기 NK 세포 활성화 수용체 세포내 도메인 또는 이의 기능적 변이체 사이에는 힌지 또는 링커가 포함된다. NK 세포 활성화 수용체 및 CNK 신호 전달 구성 요소에 대한 자세한 설명은 예를 들어 US 2020/0308248Al을 참고할 수 있으며, 그 전체 내용은 인용하는 방식으로 본 명세서에 통합된다.
상기 NK 세포 활성화 수용체는 NKG2D, NKG2C, NKG2E, NKG2F, NKG2H, CD94, KIR2DL4, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR3DS1，천연 세포 독성 수용체(Natural Cytotoxicity Receptors，NCR), TRAIL, DNAM-1, 신호 림프구 활성화 분자(signaling lymphocytic activation molecule，SLAM)계열 분자2B4(CD244라고도 함), DNAX부착 분자1(DNAM-1，CD226라고도 함), CD16a, 2B4, NTB-A, CRACC(CS1) 및 NKp80 중에서 선택된다. 여기서, 상기 천연 세포 독성 수용체는 NKp46(NCR1 또는 CD335라고도 함), NKp44(NCR2 또는 CD336라고도 함)과 NKp30(NCR3 또는 CD337라고도 함)을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 천연 세포 독성 수용체는 NKp46, NKp44 및 NKp30 중에서 선택된다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 NK 세포 활성화 수용체는 포유류에서 유래된 NK 세포 활성화 수용체이고, 바람직하게는, 상기 포유류는 인간, 영장류, 쥐, 말, 소, 양, 염소, 고양이, 돼지, 개, 라마, 알파카, 코끼리, 다람쥐, 기니피그에서 선택된다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 NK 세포 활성화 수용체는 다양한 출처의 NK 세포 활성화 수용체 도메인을 포함하는 재조합 NK-세포 활성화 수용체이다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 NK 세포 활성화 수용체는 인간 유래 NK 세포 활성화 수용체이고, 바람직하게는, 상기 NK 세포 활성화 수용체는 다양한 인간 유래 NK 세포 활성화 수용체 도메인을 포함하는 재조합 NK 세포 활성화 수용체이다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 NK 세포 활성화 수용체는 쥐 유래 NK 세포 활성화 수용체이고, 바람직하게는, 상기 NK 세포 활성화 수용체는 다양한 쥐 유래 NK 세포 활성화 수용체 도메인을 포함하는 재조합 NK 세포 활성화 수용체이다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 NK 세포 활성화 수용체는 인간 유래 및 쥐 유래 NK 세포 활성화 수용체 도메인을 포함하는 재조합 NK-세포 활성화 수용체이다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 NK 세포 활성화 수용체의 세포 외 도메인은 인간 또는 쥐의 NK 세포 활성화 수용체의 세포 외 도메인이다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 NK 세포 활성화 수용체의 막횡단 도메인은 인간 또는 쥐의 NK 세포 활성화 수용체의 막횡단 도메인이다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 NK 세포 활성화 수용체의 세포 내 도메인은 인간 또는 쥐의 NK 세포 활성화 수용체의 세포 내 도메인이다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 NK 세포 활성화 수용체는 인간의 NK 세포 활성화 수용체의 세포 외 도메인, 쥐의 NK 세포 활성화 수용체의 막횡단 도메인 및 인간의 NK 세포 활성화 수용체의 세포 내 도메인을 포함한다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 NK 세포 활성화 기능 변이체는 NK 세포 활성화 수용체의 돌연변이체, 야생형 융합 단백질, 또는 야생형과 돌연변이형의 융합 단백질에서 선택된다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 NKG2D의 세포 외 도메인은 서열 SEQ ID NO.1에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 NKG2D의 세포 외 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.1에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 NKG2D의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.2에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 NKG2D의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.2에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 쥐 NKG2D의 세포 외 도메인은 서열 SEQ ID NO.3에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 쥐 NKG2D의 세포 외 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.3에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 쥐 NKG2D의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.4에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 쥐 NKG2D의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.4에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 쥐 재조합 NKG2D의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.5에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 쥐 재조합 NKG2D의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.5에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 NKG2C의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.6에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 NKG2C의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.6에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 NKG2E의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.7에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 NKG2E의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.7에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 NKG2F의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.8에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 NKG2F의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.8에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 CD94의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.9에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 CD94의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.9에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 KIR2DL4의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.10에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 KIR2DL4의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.10에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 KIR2DS1의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.11에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 KIR2DS1의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.11에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 KIR2DS2의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.12에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 KIR2DS2의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.12에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 KIR2DS4의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.13에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 KIR2DS4의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.13에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 KIR3DS1의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.14에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 KIR3DS1의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.14에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 NKp46의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.15에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 NKp46의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.15에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 NKp44의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.16에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 NKp44의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.16에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 NKp30의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.17에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 NKp30의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.17에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 DNAM1의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.18에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 DNAM1의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.18에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 TRAIL의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.19에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 TRAIL의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.19에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 CD16a의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.20에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 CD16a의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.20에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 2B4의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.21에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 2B4의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.21에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 NTB-A의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.22에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 NTB-A의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.22에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 CRACC의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.23에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 CRACC의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.23에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 NKp80의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.24에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 NKp80의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.24에 표시된 바와 같다.
CNK 신호 전달 구성 요소
일부 실시예에서, 상기 CNK 신호 전달 구성 요소는 적어도 (i) NK 세포 신호 어댑터(adaptor)(예: DAP10 또는 DAP12) 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 NK 세포 신호 어댑터는, (a) NK 세포 신호 어댑터의 세포 외 도메인(ED) 또는 이의 기능적 변이체, (b) NK 세포 신호 어댑터의 막횡단 도메인(TMD) 또는 이의 기능적 변이체, 및 (c) NK 세포 신호 어댑터의 세포 내 도메인(ICD) 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 임의적으로, 상기 NK 세포 신호 어댑터의 세포 외 도메인 또는 이의 기능적 변이체, 상기 NK 세포 신호 어댑터의 막횡단 도메인 또는 이의 기능적 변이체 및/또는 상기 NK 세포 신호 어댑터의 세포 내 도메인 또는 이의 기능적 변이체 사이에 힌지 또는 링커를 포함한다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 NK 세포 신호 어댑터는 포유류에서 유래된 NK 세포 신호 어댑터이고, 바람직하게는, 상기 포유류는 인간, 영장류, 쥐, 말, 소, 양, 염소, 고양이, 돼지, 개, 라마, 알파카, 코끼리, 다람쥐, 기니피그에서 선택된다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 NK 세포 신호 어댑터는 다양한 출처의 NK 세포 신호 어댑터 도메인을 포함하는 재조합 NK-세포 신호 어댑터이다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 NK 세포 신호 어댑터는 인간 유래 NK 세포 신호 어댑터이고, 바람직하게는 상기 NK 세포 신호 어댑터는 다양한 인간 유래 NK 세포 신호 어댑터 도메인을 포함하는 재조합 NK 세포 신호 어댑터이다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 NK 세포 신호 어댑터는 쥐 유래 NK 세포 신호 어댑터이고, 바람직하게는 상기 NK 세포 신호 어댑터는 다양한 쥐 유래 NK 세포 신호 어댑터 도메인을 포함하는 재조합 NK 세포 신호 어댑터이다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 NK 세포 신호 어댑터는 인간 유래 및 쥐 유래 NK 세포 신호 어댑터 도메인을 포함하는 재조합 NK 세포 신호 어댑터이다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 NK 세포 신호 어댑터의 세포 외 도메인은 인간 또는 쥐 NK 세포 신호 어댑터의 세포 외 도메인이다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 NK 세포 신호 어댑터의 막횡단 도메인은 인간 또는 쥐 NK 세포 신호 어댑터의 막횡단 도메인이다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 NK 세포 신호 어댑터의 세포 내 도메인은 인간 또는 쥐 NK 세포 신호 어댑터의 세포 내 도메인이다.
상기 CNK 신호 전달 구성 요소의 상기 NK 세포 신호 어댑터는 DAP10 또는 DAP12이다.
일부 바람직한 실시예에서에서, 상기 CNK 세포 신호 어댑터의 기능적 변이체는 DAP10 또는 DAP12의 돌연변이체, 또는 DAP10과 DAP12의 융합 단백질, 또는 야생형 DAP10 또는 DAP12와 돌연변이형 DAP10 또는 DAP12의 융합 단백질 중에서 선택된다.
일부 바람직한 실시예에서에서, 상기 CNK 신호 전달 구성 요소는 (ii) 면역 수용체 활성화 신호 전달 도메인(ITAM) 및/또는 (iii) T 세포 공동 자극 신호 전달 도메인을 더 포함한다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 NK 세포 신호 어댑터 또는 이의 기능성 변이체, 상기 면역 수용체 활성화 신호 전달 도메인(ITAM) 및/또는 상기 T 세포 공동 자극 신호 전달 도메인 사이에 힌지 또는 링커를 포함하고, 바람직하게는, 상기 NK 세포 신호 어댑터 또는 이의 기능성 변이체는 상기 면역 수용체 활성화 신호 전달 도메인(ITAM)과 융합된다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 면역 수용체 활성화 신호 전달 도메인(ITAM)은 면역 수용체의 세포 내 활성화 신호 전달 도메인에서 유래된다. 바람직하게는, 상기 면역 수용체는 TCRζ, CD2, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD5, CD22, FcRγ, CD66d, FcαRI, FcγRI, FcγRII, FcγRIII, Dectin-1, CLEC-1, CD72, CD79A, CD79B에서 선택되고, 바람직하게는, 상기 면역 수용체 활성화 신호 전달 도메인(ITAM)은 NK 세포 신호 전달 어댑터 또는 이의 기능성 변이체와 융합되며, 바람직하게는, 상기 면역 수용체는 CD3γ이다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 T 세포 공동 자극 신호 전달 도메인은 공동 자극 분자의 세포 내 신호 전달 도메인으로부터 유래된다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP10의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.25에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP10의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.25에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP10의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.26에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP10의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.26에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP10의 막횡단 도메인은 서열 SEQ ID NO.27에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP10의 막횡단 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.27에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP12의 전체 길이의 서열은 서열 SEQ ID NO.28에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP12의 전체 길이의 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.28에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP12의 막횡단 도메인은 서열 SEQ ID NO.29에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP12의 막횡단 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.29에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP10 및 인간 DAP12의 막횡단 도메인 융합 단백질은 서열 SEQ ID NO.30에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP10 및 인간 DAP12의 막횡단 도메인 융합 단백질의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.30에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP10-DAP12 융합 단백질은 서열 SEQ ID NO.31에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP10-DAP12 융합 단백질의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.31에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 CD3zeta 세포 내 신호 전달 도메인은 서열 SEQ ID NO.32에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 CD3zeta 세포 내 신호 전달 도메인 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.32에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP10-CD3zeta 서열은 서열 SEQ ID NO.33에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP10-CD3zeta 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.33에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP12-CD3zeta 서열은 서열 SEQ ID NO.34에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP12-CD3zeta 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.34에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP10-DAP12-CD3zeta 서열은 서열 SEQ ID NO.35에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP10-DAP12-CD3zeta 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.35에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 41BB 세포 내 신호 전달 도메인 서열은 서열 SEQ ID NO.36에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 41BB 세포 내 신호 전달 도메인 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.36에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP10-41BB 서열은 서열 SEQ ID NO.37에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP10-41BB 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.37에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP10-41BB-CD3zeta 서열은 서열 SEQ ID NO.38에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP10-41BB-CD3zeta 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.38에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 CD28 세포 내 신호 전달 도메인 서열은 서열 SEQ ID NO.39에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 CD28 세포 내 신호 전달 도메인 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.39에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP10-CD28 서열은 서열 SEQ ID NO.40에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP10-CD28 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.40에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP10-CD28-CD3zeta 서열은 서열 SEQ ID NO.41에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP10-CD28-CD3zeta 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.41에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP12-41BB 서열은 서열 SEQ ID NO.42에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP12-41BB 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.42에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP12-41BB-CD3zeta 서열은 서열 SEQ ID NO.43에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP12-41BB-CD3zeta 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.43에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP12-CD28 서열은 서열 SEQ ID NO.44에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP12-CD28 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.44에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP12-CD28-CD3zeta 서열은 서열 SEQ ID NO.45에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 인간 DAP12-CD28-CD3zeta 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.45에 표시된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, CNK 신호 전달 구성 요소는 SEQ ID NO.25~45로 표시된 아미노산 서열에서 선택된다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 키메라 단백질 구조체와 NK 세포 활성화 수용체 및 CNK 신호 전달 구성 요소는 다기능 복합체를 형성하고, 여기서 상기 다기능 복합체는 SEQ ID NO.117에 표시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 바람직한 실시예에서, 상기 다기능 복합체은 서열 SEQ ID NO.117에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 일부 바람직한 실시예에서, 상기 다기능 복합체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.117에 표시된 바와 같다.
6. 핵산 분자
다른 한 방면에서, 본 공개는 본 출원에 기술된 임의의 키메라 단백질 구조체를 인코딩하는 키메라 핵산 구조체(chimeric nucleic acid construct)를 더 제공한다.
상기 핵산 분자는 디옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 트레오스 핵산(TNA), 글리콜 핵산(GNA), 펩타이드 핵산(PNA), 잠긴 핵산(LNA, β-D-리보스 구성을 갖는 LNA, α-L-리보스 구성을 갖는 α-LNA(LNA의 비대칭 이성질체가 포함), 2'-아미노 기능화된 2'-아미노-LNA 및 2'-아미노 기능화된 2'-아미노-α-LNA가 포함), 에틸렌 핵산(ENA), 시클로헥세닐 핵산(CeNA) 및/또는 이들의 키메라 및/또는 조합을 포함한다. 예시적 DNA에는 플라스미드 DNA(pDNA)) 등이 포함되지만 이에 제한하지 않는다. 예시적 RNA에는 mRNA, 원형 RNA, ccRNA가 포함되지만 이에 제한하지 않는다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 핵산 분자는 mRNA이다. mRNA는 적어도 하나의 단백질을 암호화하는 임의의 RNA이며 체외, 체내, 제자리 또는 생체 외에서 암호화한 단백질을 생산할 수 있다. 이 분야의 기술자는 달리 명시되지 않는 한 본 출원에 기재된 핵산 서열은 대표적인 DNA 서열에서 "T"를 열거할 수 있지만, RNA(예: mRNA)를 나타내는 서열의 경우에는 "T"는 "U"로 대체된다. 따라서 본 명세서에서 특정 서열 식별 번호를 통해 공개되고 식별되는 임의의 DNA는 DNA에 상보적인 해당 RNA(예: mRNA) 서열도 공개하며, 여기서 DNA 서열의 각 'T'는 'U'로 대체된다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO.118에 표시된 뉴클레오티드 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO.160에 표시된 뉴클레오티드 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 바람직한 실시예에서, 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO.162에 표시된 뉴클레오티드 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 바람직한 실시예에서, 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO.165에 표시된 뉴클레오티드 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 더 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 핵산 분자는 체외에서 합성된 mRNA이다. 일부 바람직한 실시예에서, 상기 체외에서 합성된 mRNA는 변형을 가지며, 선택적으로, 5' UTR, 5' UTR, 폴리A 꼬리, 5' 캡핑에서 선택되는 하나 이상의 변형을 포함하고, 및 코딩 영역에 하나 이상의 변형이 있는 뉴클레오티드를 포함한다.
i) 핵산 분자(예: mRNA)의 변형
자연적으로 존재하는 진핵 세포 mRNA 분자는 안정 요소를 포함할 수 있고, 5'-말단(UTR) (5'UTR) 및/또는 3'-말단 UTR (3'UTR)의 번역되지 않은 영역(UTR)과 5'-캡 구조 및 3'-폴리A 꼬리와 같은 기타 구조적 특징을 포함하되 이에 제한하지 않는다. 5' UTR과 3' UTR은 모두 일반적으로 게놈 DNA에서 전사되며 조기 mRNA(premature mRNA)의 일부이다. 성숙한 mRNA의 특징적인 구조(예: 5'-캡 구조 및 3'- 폴리A 꼬리)는 일반적으로 mRNA 처리 중에 전사된 (조기) mRNA에 추가된다.
"5' UTR"은 폴리펩타이드를 인코딩하지 않는 개시 코돈(즉, 리보솜으로 번역된 mRNA 전사의 첫 번째 코돈)의 상류(즉, 5')에 있는 mRNA의 영역을 뜻한다. RNA 전사체를 생성할 때 5' UTR에는 프로모터 서열이 포함될 수 있다. 이러한 프로모터 서열은 이 분야에서 알려져 있다. 이러한 프로모터 서열은 본 공개의 핵산 분자에 존재하지 않는 것으로 이해해야 한다.
"3'UTR"은 폴리펩타이드를 인코딩하지 않는 정지 코돈(즉, 번역 종료를 나타내는 mRNA 전사체의 코돈)의 하류(즉, 3')에 있는 mRNA의 영역을 뜻한다.
"폴리A-꼬리"은 mRNA의 하류 영역, 예를 들어, 3' UTR의 직접적인 하류(즉, 3')이고 여러 개의 연속적인 아데노신 모노포스페이트를 포함한다. 폴리A 꼬리는 10~300개의 아데노신 모노포스페이트를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리A-꼬리는 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 및 300 아데노신 모노포스페이트를 포함할 수 있다. 일부 바람직한 실시예에서, 폴리A-꼬리에는 50내지 250개의 아데노신 모노포스페이트를 포함한다. 관련된 생물학적 환경(예: 세포 또는 생체 내)에서 폴리A 꼬리의 역할은 mRNA를 효소 분해(예: 세포질에서 효소 분해)로부터 보호하고 전사 종결 및/또는 핵으로부터의 mRNA 출력과 번역을 도와준다. 3'-폴리A 꼬리는 일반적으로 전사된 mRNA의 3'-말단에 추가되는 아데닌 뉴클레오티드이다. 어떤 경우에는 최대 약 400개의 아데닌 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 3'-폴리A 꼬리의 길이는 mRNA 분자 자체의 안정성에 영향을 미칠 수 있다.
폴리뉴클레오타이드의 5'-캡핑은 체외 전사 반응 동안 동시에 완성할 수 있으며, 제조업체의 프로토콜에 따라 다음과 같은 화학적 RNA 캡 유사체에 의해 5'-구아노신 캡 구조가 생성될 수 있다. 3'-O-Me-m7G(5') ppp(5')G[ARCA 캡], G(5')ppp(5')A, G(5') ppp(5') G, m7G(5') ppp(5') A, m7G(5') ppp(5') G(New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts). 변형된 RNA의 5'-캡핑은 전사한 후 우두 바이러스 캡핑 효소를 사용하여 완성할 수 있으며, "Cap 0" 구조를 생성한다: m7G(5')ppp(5')G (New England Biolab, Ipswich, MA). Cap1 구조는 우두 바이러스 캡핑 효소와 2'-O 메틸트랜스퍼라제를 사용하여 생성할 수 있다: m7G(5')ppp(5')G-2'-O-methyl. Cap2 구조는 Cap1 구조로부터 생성된 후, 2'-O 메틸트랜스퍼라제를 사용하여 5'-하위 세 번째(the 5'-antepenultimate) 뉴클레오티드를 2'-O 메틸화 할 수 있다. Cap3 구조는 Cap2 구조로부터 생성된 후, 2'-O 메틸트랜스퍼라제를 사용하여 5'-하위 네 번째(the 5'-preantepenultimate) 뉴클레오티드를 2'-O 메틸화 할 수 있다. 효소는 재조합 공급원에서 유래할 수 있다.
상기 안정 요소 중 적어도 하나를 포함하는 mRNA 분자는 인코딩한 단백질의 발현을 현저히 증가시킬 수 있으며, 상기 안정 요소를 2개 이상을 사용할 경우에 단일 안정 요소의 mRNA를 사용할 때보다 단백질 발현에 시너지 효과를 나타낸다.
일부 실시예에서, 본 공개에 기술된 mRNA는 하나 이상의 AU가 풍부한 서열을 제거되어 있다. AURES라고도 알려진 AU가 풍부한 서열은 3' UTR에서 발견되는 불안정성 서열이다.
일부 실시예에서, 본 공개에 기술된 mRNA는 신호 펩타이드를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함한다. 상기 신호 펩타이드는 단백질의 N-말단에 15-60번째 아미노산을 포함할 수 있는데, 이는 일반적으로 분비 경로를 통한 막 수송에 필요하며, 따라서 일반적으로 대부분의 단백질의 진핵생물 및 원핵생물로 진입하는 분비 경로를 제어한다. 상기 신호 펩타이드의 길이는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59개 아미노산일 수 있다.
"오픈 리딩 프레임"은 개시 코돈(예: 메티오닌(ATG))으로 시작하고 정지 코돈(예: TAA, TAG 또는 TGA)으로 끝나고 폴리펩타이드를 인코딩하는 연속적인 DNA 조각이다.
이종 유전자로부터 유래된 신호 펩타이드는 이 분야에서 알려져 있으며, 원하는 특성에 대해 테스트한 후 본 공개의 핵산에 통합될 수 있다. 일부 실시예에서, 신호 펩타이드는 다음 서열 중 하나를 포함할 수 있다. MDSKGSSQKGSRLLLLLVVSNLLLPQGVVG(SEQ ID NO.148), MDWTWILFLVAAATRVHS(SEQ ID NO.149), METPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO.150), MLGSNSGQRVVFTILLVAPAYS(SEQ ID NO.151), MKCLLYLAFLFIGVNCA(SEQ ID NO.152), MWLVSLAIVTACAGA(SEQ ID NO.153) 및 MFVFLVLLPLVSSQC(SEQ ID NO.154).
본 출원에 의해 제공되는 핵산 분자는 고체상 기술 합성, 액체상 화학 합성, 효소 결합 및 이들의 조합에 의해 합성될 수 있다. 합성된 핵산 분자는 정제 및 정량화할 수 있다. 자세한 내용은 WO2021222304를 참고할 수 있고, 그 전체 내용은 인용하는 방식으로 본 명세서에 통합되어 있다.
7. 벡터
다른 한 방면에서, 본 공개는 또한 본 공개에 의해 제공된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공하며, 상기 핵산 분자는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 조절 요소(예: 프로모터)에 작동 가능하게 연결되어 상기 핵산 분자에 의해 인코딩된 키메라 단백질 구조체를 발현한다.
일부 실시예에서, 상기 벡터는 플라스미드, 나노 플라스미드, 코스미드, 바이러스 벡터, 미니서클, RNA 벡터, 또는 선형 또는 원형 DNA(예: 트랜스포손 DNA) 또는 RNA 분자 중에서 선택된다.
일부 실시예에서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스, 파보바이러스(예: 아데노 연관 바이러스), 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터, 코로나바이러스, 음성 가닥 RNA 바이러스 예를 들어 오르코믹소바이러스(예: 인플루엔자 바이러스), 라브도바이러스(예: 광견병 및 수포성 구내염 바이러스), 파라믹소바이러스(예: 홍역 및 센다이), 피코르나바이러스 같은 양성 가닥 RNA 바이러스, 알파바이러스 및 이중 가닥 DNA 바이러스에서 선택된다. 상기 이중 가닥 DNA 바이러스는 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스(예: 단순 헤르페스 바이러스 유형 I 및 II, 엡스타인-바 바이러스, 사이토메갈로바이러스) 및 폭스 바이러스(예: 우두, 계두, 카나리아폭스), 노워크바이러스, 토가바이러스, 플라비바이러스, 레오바이러스, 파포바이러스, 헤파드나바이러스, 바큘로바이러스 및 간염 바이러스, 바이러스 유사 입자(VLP)을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다
일부 실시예에서, 상기 레트로바이러스 벡터는 조류 백혈구 증식-육종, 포유류 C형, B형 바이러스, D형 바이러스, HTLV-BLV 수집, 렌티바이러스, 버블 바이러스에서 선택된다.
일부 실시예에서, 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시예에서, 상기 바이러스 벡터는 종양 용해성 바이러스 벡터이다. 종양 용해성 바이러스 벡터는 외인성 핵산 서열이 삽입될 수 있는 종양 용해성 바이러스 기반의 바이러스 벡터를 뜻한다.
일부 실시예에서, 상기 렌티바이러스 벡터는 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV 또는 양의 탈수초성 뇌백질염 렌티바이러스 중에서 선택된다.
일부 실시예에서, 상기 벡터는 트랜스포손 기반 발현 벡터이다. 트랜스포손은 게놈 내에서 그 위치를 변경할 수 있는 DNA 서열이다. 트랜스포손 시스템에서, 본 명세서에 제공된 키메라 단백질 구조체를 인코딩하는 핵산 분자 측면은 트랜스포손 이동을 매개하는 트랜스포사제에 의해 인식되는 말단 반복 서열이다. 트랜스포사제는 단백질 공동 전달되거나, 키메라 단백질 구조체와 동일한 벡터에 인코딩되거나, 또는 별도의 벡터에 인코딩할 수 있다. 트랜스포손 시스템의 비제한적인 예로는 Sleeping Beauty, Piggyback, Frog Prince 및 Prince Charming을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 본 공개에 의해 제공되는 벡터는 기타 벡터와 결합될 수 있으며, 상기 기타 벡터는 적어도 하나의 공동 발현 부분을 인코딩하는 기타 핵산 분자를 포함할 수 있다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 벡터는 프로모터를 포함하고; 바람직하게는, 상기 프로모터는 EF1α 프로모터 또는 CMV 프로모터이다.
일부 바람직한 실시예에서, 본 공개에 의해 제공되는 키메라 단백질 구조체는 공동 발현 부분과 동일한 벡터 및 동일한 프로모터, 또는 다른 프로모터에서 발현을 조절할 수 있으며, 또는 다양한 벡터에서 발현될 수 있다.
8. 세포
다른 한 방면에서, 본 공개는 또한 본 공개에서 제공된 키메라 단백질 구조체를 발현하거나, 또는 본 공개에서 제공된 키메라 핵산 구조체 또는 벡터를 포함하는 조작된 세포를 제공한다.
일부 실시예에서, 상기 조작된 세포는 본 공개에 의해 제공되는 키메라 단백질 구조체와 상기 공동 발현 부분을 동시에 발현한다. 상기 공동 발현 부분과 상기 키메라 단백질 구조체의 표적 단백질 결합 도메인은 특정 목적을 달성하기 위해 결합될 수 있다. 예를 들어, 표적 단백질 결합 도메인이 면역 배제를 유발할 수 있는 면역 세포에 발현된 단백질을 특이적으로 인식하는 경우, 공동 발현 부분은 면역 배제를 더욱 억제하는 단백질(예: 바이러스의 ER 상주 당단백질 등), 종양 미세 환경을 표적으로 하는 단백질(예: 케모카인 수용체 등), 면역 활성을 자극하는 단백질(예: 사이토카인, 면역 세포주 단백질 CD7, CD5 등)이 될 수 있으며, 이로 인해 생성된 세포는 인체에 이식될 때 감소된 면역원성(또는 면역 거부) 및/또는 향상된 면역 활성을 가질 수 있다. 이것은 세포 면역 요법 및 기타 치료적 세포 이식에 유용하다. 따라서, 상기 세포는 면역 세포(예: T 세포), 줄기 세포, 신장 세포, 섬 세포 및 심근 세포 등이 될 수 있습니다.
일부 실시예에서, 상기 세포는 면역 세포이고, T세포, 자연 살해(NK)세포, B세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포, 호중구 또는 γδT세포 중에서 선택된다. 상기 T세포는 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 세포 독성 T 세포, 말단 이펙터 T 세포, 기억 T 세포, 순진 T 세포, 조절 T 세포로 구성된 세포 집단, 자연 살해 T 세포, 감마-델타 T 세포, 사이토카인 유도 살해(CIK) T 세포로 구성된 세포 집단, 종양 침윤 림프구에서 선택된다.
일부 실시예에서, 상기 조작된 세포는 T 세포이다. 상기 기술된 키메라 단백질 구조체와 공동 발현 부분이 발현되어 감소된 면역원성 및/또는 향상된 면역 활성을 갖는 T 세포를 얻는 경우, 상기 T 세포는 종양 관련 마커를 특이적으로 표적화할 수 있는 수용체를 더 발현할 수도 있으며, CAR, TCR, NK 세포 활성화 수용체 구성 요소 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 실시예에서, 상기 조작된 세포는 T 세포이고, 이는 본 공개에 의해 제공된 키메라 단백질 구조체와 아데노바이러스 E3-K19, CAR, NK 세포 활성화 수용체 및 CNK 신호 전달 구성 요소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 동시에 발현한다.
일부 실시예에서, 상기 조작된 세포는 T 세포이고, 이는 본 공개에 의해 제공된 키메라 단백질 구조체와 NK 세포 활성화 수용체 및 선택적 CNK 신호 전달 구성 요소를 동시에 발현한다.
일부 실시예에서, 상기 조작된 세포는 T 세포이고, 이는 본 공개에 의해 제공된 키메라 단백질 구조체, 아데노바이러스 E3-K19 및 CAR을 동시에 발현한다.
다른 한 방면으로, 본 공개는 또한 본 명세서에 기술된 조작된 세포(예: T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 이 방법은 본 명세서에 기술된 핵산 분자를 발현하기에 적합한 조건하에 본 명세서에 기술된 벡터를 개시 세포에 도입하는 것을 포함한다.
이 분야에서 알려진 CAR-T 세포 생산 방법은 본 명세서에 기술된 조작된 세포의 생산에도 적용될 수 있다. 예를 들어, Zhang 외，Engineering CAR-T cells，Biomarker Research(2017)5:22는 CAR-T 세포를 생성하는 방법을 설명한다. 본 명세서에 제공된 방법은 개시 세포를 얻는 것, 개시 세포를 배양하는 것(확장 포함, 선택적으로 활성화 포함), 및 세포를 유전적으로 변형하는 것으로부터 선택되는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. 개시 세포는 줄기 세포일 수 있으며, 상기 줄기 세포는 조혈 전구 세포(예를 들어 T 세포 전구 세포, NK 세포 전구 세포, 대식세포 전구 세포), 조혈 줄기 세포(HSC), CD34+ 세포, 배아 세포주, 중간엽 줄기 세포 또는 iPSC 세포인 경우, 줄기 세포는 조혈 전구 세포이다. 개시 세포는 상기 면역 세포와 같은 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화된 세포이다.
개시 세포는 대상체(예: 인간 대상체)로부터 분리된 면역 세포(예: T 세포)와 같은 모든 출처에서 얻을 수 있다. 일부 실시예에서, 면역 세포는 관심있는 대상체에게서 얻게 된다. 예를 들어 특정 질병 또는 상태를 감염을 의심되는 대상체, 특정 질병 또는 상태에 대한 감수성을 갖는 것으로 의심되는 대상, 특정 질병 또는 상태를 경험할 예정이거나, 현재 경험 중인 대상체, 및 특정 질병 또는 질병에 대한 치료를 받은 대상체이며, 대상체는 건강한 자원자이거나 건강한 기증자일 수 있다. 면역 세포는 또한 혈액 은행으로부터 얻을 수 있다. 상기 면역 세포는 관심 대상체의 자가 또는 동종 면역 세포일 수 있다. 상기 면역 세포는 혈액, 제대혈, 비장, 흉선, 림프절, 흉막 삼출액, 비장 조직, 종양 및 골수를 포함하되 제한하지 않는 대상체의 모든 부위에서 채취할 수 있다. 분리된 면역 세포는 바로 사용하거나 냉동 등 일정 기간 동안 보관할 수 있다.
면역 세포의 활성화 및/또는 증폭은 면역 세포 기능의 주요 단계 중 하나이다. 일부 실시예에서, 면역 세포는 유전자 변형 동시, 전 및/또는 후에 활성화 및/또는 증폭된다. 일부 실시예에서, 면역 세포는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 활성화 및/또는 증폭된다. 면역 세포를 활성화 및 증폭시키는 방법은 이 분야에서 설명되어 있으며, 본 명세서에 설명된 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 CD3/TCR 복합체 자극과 관련된 신호에 부착된 약제와 T 세포 표면의 공동 자극 분자를 자극하는 리간드와의 표면 접촉을 통해 활성화와 증폭될 수 있다. 특히, T 세포 집단은 항-CD3 항체 또는 그 항원 결합 단편 또는 표면에 고정된 항-CD2 항체와 접촉하거나 단백질 키나아제 C 활성화제(예: 브리오스타틴) 및 칼슘운반체와 접촉함으로써 자극을 받을 수 있다. T 세포 표면의 보조 분자를 공동 자극하기 위해 보조 분자에 결합된 리간드가 사용된다. 예를 들어, T 세포 증식을 자극하기에 적합한 조건에서 T 세포 집단은 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉할 수 있다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증식을 자극하기 위해, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체를 사용할 수 있다. 일부 실시예에서, T 세포의 일차 자극 신호 및 공동 자극 신호는 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다.
세포를 유전적으로 변형하는 것은, 본 명세서에 제공된 키메라 단백질 구조를 인코딩하는 핵산 분자로 본질적으로 균질한 개시 세포를 형질도입함으로써 달성될 수 있다. 일부 실시예에서는, 렌티바이러스 벡터와 같은 레트로바이러스 벡터를 사용하여 본 명세서에 제공된 핵산 분자를 개시 세포에 도입한다. 예를 들어, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 렌티바이러스 벡터에 클로닝될 수 있으며, 발현은 이의 내인성 프로모터, 렌티바이러스의 긴 말단 반복 서열 또는 관심 표적 세포 유형에 특이적인 프로모터로부터 구동될 수 있다. 바이러스 벡터를 전달하는 데 사용되는 일반적인 전달 방법에는 전기천공, 미세주입, 유전자총 및 자기 형질감염이 포함되지만 이에 제한하지 않는다.
세포를 유전적으로 변형하는 것은, 또한 LNP로 핵산 분자를 전달함으로써 얻을 수 있으며, 자세한 내용은 위의 "6. 핵산 분자" 섹션에 설명된 내용을 참고할 수 있다. 핵산 전달을 위한 다른 비바이러스적 방법으로는 인산칼슘, DEAE 덱스트란, 전기천공 및 원형질체 융합을 이용한 체외 감염이 있다. 또한, 트랜스포사제 또는 표적 뉴클레아제(예: 아연 핑거 뉴클레아제, 대규모 메가뉴클레아제(meganucleases), TALE 뉴클레아제, CRISPR)를 사용하여 개시 세포의 유전적 변형을 달성할 수 있으며, 이로써 본 명세서에 기술된 조작된 세포를 얻을 수 있다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 제공된 조작된 세포는 투여 전에 본 명세서에 제공된 키메라 단백질 구조체를 인코딩하는 핵산 분자를 개시 세포에 형질전환 시킴으로써 제조된다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 제공된 조작된 세포는 본 명세서에 제공된 키메라 단백질 구조체를 인코딩하는 핵산 분자로 바이러스 벡터를 통해 면역 세포에 감염 시킴으로써 제조될 수 있다. 본 명세서에 제공된 조작된 세포는 세포 표면에서 감소된 면역원성 분자(예를 들어, TCR, HLA 등) 의 발현 및/또는 면역억제 분자(예를 들어, PD-1 등)의 발현 및/또는 향상된 종양 표적 수용체(예: CAR, 조작된 TCR, CNK 수용체 등)의 발현을 나타난다.
다른 한 방면에서, 본 공개는 또한 상기 방법에 의해 생체 외에서 생산된 세포 집단을 제공한다. 일부 실시예에서, 세포 집단의 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%가 검출가능한 수준의 본 명세서에 제공된 발현 마커 폴리펩타이드(예를 들어, 본 명세서에 기술된 키메라 단백질 구조체에 절단 가능하게 연결된 EGFR 절단체(EGFRt))를 발현한다. EGFR 절단체의 발현 수준은 본 명세서에 기술된 키메라 단백질 구조체의 세포 집단에서 발현 수준을 나타낼 수 있다.
9. 약물 조성물, 키트
다른 한 방면에서, 본 공개는 또한 약물 조성물 또는 키트를 제공하고, 이는 (i) 본 명세서에 기술된 키메라 단백질 구조체, 핵산 분자, 벡터 또는 세포 집단, 및 (ii) 약학적으로 허용되는 비히클을 포함한다. "약학적으로 허용되는 비히클"이라는 용어는 본 명세서에 제공된 키메라 단백질 구조체, 핵산 분자, 발현 벡터 및/또는 세포 집단의 저장 및 적용을 촉진하고 모든 용매, 분산 매체, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등삼투제 및 흡수 지연제 등을 뜻하며, 약학적으로 허용되는 비히클은 식염수, 리포솜, 중합 부형제, 콜로이드 또는 운반체 입자와 같은 임의의 적합한 성분을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 비히클은 본 공개에 의해 제공되는 키메라 단백질 구조체, 핵산 분자, 발현 벡터 및/또는 세포 집단을 용해 또는 분산시킬 수 있는 식염수이다. 식염수의 예시적인 예로는 완충 식염수, 자당 용액, 생리 식염수, 아세테이트 완충액, 인산염 완충액, 구연산염 완충액, 중탄산염 완충액, 식염수 용액 및 폴리소르베이트 용액이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
i) 핵산 약물 조성물
일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 비히클은 리포솜이다. 리포솜은 단층 또는 다층 소포이고, 친유성 물질로 막과 내부 수성 부분은 형성된다. 본 문에서 제공되는 핵산 분자 및/또는 벡터는 리포솜의 수성 부분에 캡슐화될 수 있다. 예시적인 예로는 리포솜은 3[N-(N', N'-디메틸아미노에탄) 카르바모일] 콜레스테롤(DC-Chlo)을 기반 리포솜, N-(2,3-디올레옥시) 프로필-N, N, N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA) 및 1,2-디올레옥시-3-트리메틸프로판(DOTAP) 기반의 리포솜을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 리포솜을 제조하고 리포솜에 핵산 분자 및/또는 벡터를 캡슐화하는 방법은 이 분야에서 잘 알려져 있다(참고, 예: D.D.Lasic et al, Liposomes in gene delivery, published by CRC Press, 1997).
일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 비히클은 마이크로스피어, 마이크로캡슐, 중합 미셀 및 수지상 중합체를 포함하되 이에 제한하지 않는 중합 부형제이다. 본 공개에 의해 제공되는 핵산 분자 및/또는 벡터는 이 분야에서 알려진 방법에 의해 중합체 기반의 구성 요소에 캡슐화, 부착 또는 코팅될 수 있다(참고, 예: W. Heiser, Nonviral gene transfer techniques, published by Humana Press, 2004; U.S. patent 6025337; Advanced Drug Delivery Reviews, 57(15):2177-2202(2005)).
일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 비히클은 콜로이드 또는 운반체 입자이고, 예를 들어, 금 콜로이드, 금 나노 입자, 실리카 나노 입자 및 다중 세그먼트 나노 막대이다. 본 공개에 제공된 핵산 분자 및/또는 벡터는 이 분야에서 알려진 임의의 적합한 방식으로 벡터에 코팅, 부착 또는 결합될 수 있다(참고, 예: M. Sullivan et al., Gene Therapy, 10:1882-1890 (2003), C. Mclntosh et al., J.Am. Chem.Soc., 123(31): 7626-7629 (2001), D. Luo et al., Nature Biotechnology,18:893-895(2000),and A.Salem et al.,Nature Materials,2:668-671(2003)).).
일부 실시예에서, 약물 조성물은 안정제, 방부제 및 약물의 세포 흡수에 기여하는 감염 촉진제를 포함하되 이에 제한되지 않는 첨가제를 더 포함할 수 있다. 적합한 안정제는 글루타민산 나트륨, 글리신, EDTA 및 알부민을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 적합한 방부제에는 2-페녹시에탄올, 벤조산나트륨, 소르빈산칼륨, 메틸 하이드록시벤조에이트, 페놀, 티메로살 및 항생제가 포함될 수 있지만 제한되지 않는다. 적합한 감염 촉진제에는 칼슘 이온이 포함될 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 제공된 약물 조성물은 비경구, 경구, 장내, 볼, 비강, 국소, 직장, 질, 근육 내, 비강 내, 경점막, 표피, 경피, 피부, 눈, 폐 및 피하 약물 투여 경로를 포함하되 이에 제한되지 않는 이 분야에 알려진 임의의 적합한 경로로 적용될 수 있다. 본 명세서에 제공된 약물 조성물은 각 투여 경로에 적합한 제제 또는 제제의 형태로 대상체에게 적용될 수 있다. 약물 조성물의 투여에 적합한 제제는 용액, 분산체, 에멀젼, 분말, 현탁액, 에어로졸, 스프레이, 점비액, 리포좀 기반 제제, 패치, 임플란트 및 좌약을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
제제는 단위 제형으로 편리하게 존재할 수 있으며, 약학 분야에서 잘 알려진 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 이러한 제제 또는 약물 조성물의 제조 방법은 본 공개에 의해 설명된 핵산 분자를 하나 이상의 약학적으로 허용되는 비히클 및 임의적으로 하나 이상의 첨가제에 제공하는 단계를 포함한다. 이런 제제를 제조하는 방법은 Remington's Pharmaceutical Sciences(Remington:The Science and Practice of Pharmacy,19th ed.,A.R.Gennaro(ed),Mack Publishing Co.,N.J.,1995；R.Stribling et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:11277-11281(1992)；A.Barnes et al.,Current Opinion in Molecular Therapeutics 2000 2:87-93(2000)；T.W.Kim et al.,The Journal of Gene Medicine,7(6):749-758(2005); S.F.Jia et al.,Clinical Cancer Research,9:3462(2003); A.Shahiwala et al.,Recent patents on drug delivery and formulation,1:1-9(2007)과 같은 예를 참고하고; 이 참고문헌은 전체가 인용되어 본 명세서에 포함된다.
일부 실시예에서, 상기 핵산 분자(예: mRNA)는 물리적 방법, 생물학적 방법 또는 화학적 방법으로 전달될 수 있다(참고, 예: S. Guan, J. Rosenecker, Gene Ther. 2017, 24, 133.).
물리적 방법에는 유전자 총(예: Au-입자의 유전자 총을 사용), 전기 천공, 음향 천공 등에 의한 전달이 포함되지만 이에 제한되지 않는다(참고, 예: Kutzler et al., (2008) DNA vaccines: Ready for prime time? Nat Rev Genet 9:776-788; Geall et al., Nonviral delivery of self-amplifying RNA vaccines. Proc Natl Acad Sci US A.Sep.4,2012; 109(36):14604-9.).
생물학적 방법에는 바이러스 벡터(예: 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터)에 의한 전달이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
화학적 방법에는 천연 단백질/글리칸, 폴리머, 지질을 통한 전달이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 예시적인 천연 단백질/글리칸에는 프로타민과 키토산이 포함된다(참고, 예: A.E.et al.,Cancer Immunol.Immunother.2015,64,1461；U.S.Kumar et al.ACS Nano 2021,11,17582). 예시적인 중합체는 폴리에틸렌이민(PEI)(예: 선형 PEI, 분지 PEI 및 수지상 PEI), 폴리(β- 아미노에스테르)(PBAE)를 포함한다(참고, 예: K.Singha et al.,Nucleic Acid Ther.2011,21,133；A.A.Eltoukhy et al.,Biomaterials 2012,33,3594).
예시적인 지질에는 양이온성 지질이 포함하고, 예를 들어, 1,2-diocta-decenyl-3-trimethy lammonium-propane(DOTMA)과 1,2-dioleoyl-3-trimethylammo niumpropane(DOTAP)(참고, 예: X.Hou et al.,Nat.Rev.Mater.2021,10,1078.), DOTMA, DOTAP 및 DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,보조 지질)로 형성된 리보솜은 mRNA와 자체 조립하여 콜로이드적으로 안정한 나노입자를 형성할 수 있다(참고, 예: L.M.Kranz et al.,Nature 2016,534,396.).
예시적인 지질은 이온화 가능한 지질일 수도 있다. 이온화 가능한 지질(pKa 6.5-6.9)은 생리학적 pH에서는 중성이지만 산성 환경에서 유리 아민의 양성자화에 의해 양전하를 띠는 대체 지질 물질이다(참고, 예: S.C.Semple et al.,Nat.Biotechnol.2010,28,172). 세포 내재화 후, 이온화 가능한 지질에 의해 형성된 나노 입자는 엔도솜(endosome)에 캡슐화된다. 그 후, 엔도솜과 리소좀 pH의 지속적인 감소로 인해 이온화된 지질은 이온화를 위한 양성자를 얻을 수 있으므로 지질 나노 입자 (lipid nanoparticle，LNP)와 엔도솜 막의 융합을 촉진하여 궁극적으로 지질 나노 입자에 로드된 mRNA가 세포질로 방출 될 수 있다(참고, 예: L.Miao et al.,Mol.Cancer 2021,20,41.).
이온화 가능한 지질은 콜레스테롤, 보조 지질 및 폴리에틸렌 글리콜화 지질(즉, PEG화된 지질)로 지질 나노입자 제제을 형성할 수 있다. 콜레스테롤은 지질 나노입자의 구조와 안정성을 유지하는 자연적인 강성과 소수성인 지질이다. 또한, 로드된 mRNA의 지질 나노입자(즉, mRNA 나노입자)와 소포체 막의 융합을 촉진할 수 있다. 보조 지질(예: 양성 이온성 지질 DOPE, 1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphocholine(DSPC)와 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DOPC)는 세포막 침투와 엔더솜막 탈출은 촉진하는데 광범위하게 사용된다(참고, 예: N.Chaudhary et al.,Nat.Rev.Drug Discovery 2021,20,817.). PEG화된 지질은 PEG와 앵커리지 지질로 구성된다. 친수성 PEG는 주로 mRNA 복합체 표면에 분포하는 반면 소수성 영역은 지질 이중층 내부에 매립되여 있다. PEG화된 지질의 도입은 지질 나노 입자의 반감기를 증가시킬 뿐만 아니라 PEG 사슬의 분자량을 변화시켜 입자 크기를 조정한다. 일반적으로 분자량과 지질 꼬리 길이는 각각 350~3000 Da 및 10~18 탄소 범위일 수 있다(참고, 예: N.Chaudhary et al.,Nat.Rev.Drug Discovery 2021,20,817.).
지난 수십 년 동안 연구자들은 mRNA 전달을 위한 이온화 가능한 지질의 대규모 라이브러리를 개발했고, 여기에는 DLin-MC3-DMA, SM-102, TT3, C12-200, 306O i10, ALC-0315가 포함되여 있다(참고, 예: M.Yanez Arteta et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2018,115,E3351；R.Verbeke et al.,Controlled Release 2021,333,511；B.Li et al.,Nano Lett.2015,15,8099；K.A.Hajj et al.,Nano Lett.2020,20,5167；K.A.Hajj et al.,Small 2019,15,1805097；A.B.Vogel et al.,Nature 2021,592,283). 여기서 일부는 임상 적용에서 상당한 성과를 거두었다. 대표적인 예로 DLin-MC3-DMA가 있는데 이는 미국 식품의약국(FDA)에서 siRNA 전달을 위해 승인한 Onpattro의 핵심 구성 요소이다(참고, 예: A.Akinc et al.,Nat.Nanotechnol.2019,14,1084). DLin-MC3-DMA는 단백질 및 펩타이드 대체, 유전자 편집 및 항바이러스 감염을 포함한 mRNA 전달에도 광범히 사용된다(참고, 예: R.S.Riley et al.,Sci.Adv.2021,7,eaba1028.). 두 가지 "스타 분자"인 SM-102와 ALC-0315는 각각 COVID-19 예방을 위한 BNT162b 및 mRNA-1273 백신의 핵심 구성 요소로 FDA의 승인을 받았다(참고, 예: X.Hou et al.,Nat.Rev.Mater.2021,10,1078.).
이상적인 지질 기반 mRNA 벡터는 다음 조건을 충족해야 한다. 1) 노출된 mRNA는 안정억인 복합체를 형성하여 mRNA가 분해되지 않도록 보호할 수 있다; 2) 4가지 주요 구성 요소(이온화 가능한 지질, 콜레스테롤, 보조 지질, 폴리에틸렌 글리콜화 지질)를 추가하여 mRNA 복합체를 안정화해야 한다; 3) 지질 나노 입자의 성분은 막 불안정성을 유발하고 mRNA 복합체의 엔도솜 탈출을 촉진하기 위해 양성자화되어야 한다; 그리고 4) 모든 지질 물질은 생분해성이며 환자에게 해를 끼치지 않는다.
지질 기반 전달 플랫폼을 최적화할 때는 다음 사항을 고려해야 한다. 1) 이온화 가능한 지질의 분해 능력: 지질의 골격 구조는 지질 꼬리에 알킨 및 에스테르 그룹을 도입하여 지질 제거를 촉진하고 독성을 감소시킨다; 2) 지질 나노입자의 면역원성: 지질 나노입자 내의 헤테로사이클릭 지질은 수지상세포(DC)의 인터페론 유전자 자극제(STING) 경로를 활성화하여 mRNA 백신의 효율성을 향상시킬 수 있다(참고, 예: L.Miao et al.,Nat.Biotechnol.2019,37,1174.); 3) 지질 나노 입자의 안정성: pKa 최적화, 부형제 도입, mRNA 변형 등을 포함한 일부 유망한 전략이 mRNA 백신의 안정성을 개선할 것으로 예상된다.
지질 나노입자는 이 분야에서 알려진 성분, 조성물 및 방법을 사용하여 제조할 수 있고, 참고 예로 PCT/US2016/052352, PCT/US2016/068300, PCT/US2017/037551, PCT/US2015/027400, PCT/US2016/047406, PCT/US2016/000129, PCT/US2016/014280, PCT/US2016/014280, PCT/US2017/038426, PCT/US2014/027077, PCT/US2014/055394, PCT/US2016/052117, PCT/US2012/069610, PCT/US2017/027492, CT/US2016/059575 및 PCT/US2016/069491, 그 전체 내용은 인용방식으로 본 명세서에 통합되어 있다.
ii) 종양 용해 바이러스 및 이의 약물 조성물
일부 실시예에서, 본 출원은 본 출원에서 기술한 키메라 단백질 구조체를 발현할 수 있는 종양 용해 바이러스를 제공한다. 본 출원에서, "종양 용해 바이러스"는 종양 세포를 감염시키고, 종양 세포에서 복제하며, 종양 세포를 용해시킬 수 있는 임의의 바이러스를 뜻한다. 일부 실시예에서, 종양 용해 바이러스는 연속적인 복제 주기를 통해 기타 종양 세포로 더 확산될 수 있다.
종양 용해 바이러스는 다양한 바이러스에서 유래할 수 있으며, 비제한적인 실예에는 백시니아 바이러스, 아데노 바이러스, 단순포진 바이러스 1(HSV1), 단순포진 바이러스 2(HSV2), 믹소 바이러스, 레오 바이러스, 폴리오 바이러스, 수포성 구내염 바이러스(VSV), 홍역 바이러스(MV), 라사 바이러스(LASV), 뉴캐슬병 바이러스(NDV) 및 이러한 바이러스의 변이체 등이 있다.
일부 실시예에서, 본 출원은 종양 용해 바이러스를 제공하고, 이는 본 출원에서 제공된 핵산 분자를 포함하며, 상기 핵산 분자는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 조절 요소(예를 들어, 프로모터)에 작동 가능하게 연결되어 상기 핵산 분자에 의해 인코딩된 키메라 단백질 구조체를 발현한다.
일부 실시예에서, 본 출원에 기술된 종양 용해 바이러스는 실질적으로 모든 세포 유형을 감염시킬 수 있다. 일부 실시예에서, 종양 용해 바이러스는 복제 선택적일 수 있다. 복제 선택적 종양 용해 바이러스는 비종양 세포보다 종양 세포에서 더 많이 복제한다.
만약 바이러스 복제가 유전자 발현 조절자의 통제 하에 있는 경우에는, 예를 들어 알부민 유전자의 5'측에서 유래된 인핸서/프로모터 영역은 종양 용해 바이러스가 복제 선택적성을 갖도록 할 수 있다(참고, 예: Miyatake 외，1997，J.Virol.71：5124-5132).
일부 실시예에서, 종양 용해 바이러스는 게놈에 종양 세포 특이적 프로모터 또는 종양 세포 특이적 전사 조절 서열을 가질 수 있다. 프로모터 또는 전사 조절 서열에 대한 "종양 세포 특이적"은 일반적으로 정상 세포보다 높은 수준으로 표적 종양 세포에 존재한다는 것을 뜻한다. 이러한 방식으로 종양 세포 특이성은 종양 용해성 바이러스 강화 수준으로 부여된다.
예를 들어, HSV 유전자를 TGF-β 프로모터에 조작 가능하게 연결함으로써 HSV의 주요 전사 단위를 종양 성장 인자-β(TGF-β) 프로모터의 전사 제어하에 놓을 수 있다. 특정 종양 세포는 동일한 유형의 비종양 세포에 비해 TGF-β를 과발현하는 것으로 알려져 있다. 따라서, TGF-β 프로모터의 전사에 의해 복제가 제어되는 종양 용해 바이러스는 동일한 유형의 비종양 세포보다 일부 종양 세포에서 더 잘 복제되기 때문에 복제 선택적이다. 감염된 세포에서 선택적으로 과발현을 유발하는 것으로 알려진 유전자 발현 조절제를 사용하여 유사한 복제 선택적 종양 용해 바이러스를 제조할 수 있다. 복제 선택적 종양 용해 바이러스는 예를 들어 HSV-1 돌연변이가 될 수 있으며, 여기서 ICP34.5를 인코딩하는 유전자가 돌연변이되거나 누락된다. 종양 용해 바이러스는 또한 게놈에 기타 변형을 추가 포함할 수도 있다. 예를 들어, 종양 용해 바이러스는 UL44 유전자에 추가 DNA를 삽입할 수 있다. 이 삽입은 UL44 유전자의 기능적 비활성화와 그에 따른 절단 표현형을 생성하거나 이미 비활성화된 유전자에 삽입되거나 누락된 유전자를 대체할 수 있다.
일부 실시예에서, 종양 용해 바이러스는 본 출원에 기술된 키메라 단백질 구조체를 인코딩하는 핵산 서열을 종양 세포 특이적 프로모터의 제어하에 두도록 조작된다.
일부 실시예에서, 종양 용해 바이러스는 바이러스 복제에 필요한 적어도 하나의 단백질을 인코딩하는 유전자를 종양 세포 특이적 프로모터의 제어하에 두도록 조작된다.
일부 실시예에서, 상기 종양 용해 바이러스 벡터는 본 출원에 기술된 키메라 단백질 구조체를 발현할 수 있고, 상기 키메라 단백질 구조체의 표적 도메인은 종양 단백질을 인식하고 이에 결합할 수 있다. 종양 단백질은 종양 세포에서 고도로 발현되는 단백질(예: c-Myc, Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, KRAS), 종양 세포 성장을 촉진하는 종양 세포에서 발현되는 단백질(예: 에스트로겐 수용체, 안드로겐 수용체, Her2, VEGF, VEGFR, PDGFRβ, EGFR, EGFR 돌연변이체) 또는 종양 세포가 정상적인 면역 반응으로부터 탈출하도록 촉진하는 단백질(예: PD-L1, TGF-β1) 일 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 키메라 단백질 구조체의 표적 도메인은 Bcl-2에 결합할 수 있다. BCL-2에 표적 결합할 수 있는 임의의 표적 도메인을 모두 사용할 수 있다. 예를 들어, 이에 제한되지 않지만, Bcl-2 항세포사멸 패밀리 구성원 단백질의 고도로 보존되고 상동성인 BH1, BH2 모티프를 표적으로 하는 나노항체 서열을 표적 도메인으로 사용하고, Bcl-2 패밀리 단백질을 표적으로 하는 ER-TPD 요소를 구축하고, 이를 종양 용해 바이러스의 강력한 프로모터에 클로닝한 후, 종양 세포를 특이적으로 감염시킨 후, 종양 용해 바이러스가 대량으로 증폭되고, Bcl-2 패밀리 단백질의 ER-TPD 요소를 발현하여, 세포 내 Bcl-2 항세포사멸 구성원 단백질의 분해를 달성하여 종양 세포 사멸을 직접적으로 유발할 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 키메라 단백질 구조체의 표적 도메인은 VEGFR에 결합할 수 있다. VEGFR을 표적으로 결합할 수 있는 임의의 표적 도메인이 사용될 수 있다. 예를 들어, 이에 제한되지 않지만, VEGFR 항체(anti-VEGF-A 항체 Bevacizumab and anti-VEGFR2 항체 Ramucizumab)의 중쇄 및 경쇄 재조합 scFv는 ER-TPD 요소를 직렬로 연결하여 VEGFRER-TPD 요소를 표적화하고, 종양 용해 바이러스의 강력한 프로모터에 클로닝 로딩한 후, 종양 세포를 특이적으로 감염시킨 후, 종양 용해 바이러스가 대량으로 증폭되고 VEGFRER-TPD 요소를 발현하여, 종양 세포에서 VEGFR의 발현을 직접 억제하여, 충분한 영양소 부족으로 인한 종양 세포의 성장 억제 및 세포 사멸을 초래할 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 키메라 단백질 구조체의 표적 도메인은 TGF-β1 및 PD-L1에 결합할 수 있다. BCL-2를 표적으로 결합할 수 있는 모든 표적 도메인이 사용될 수 있다. 예를 들어, 이에 제한되지 않지만, TGF-β1 및 PD-L1 항체의 중쇄 및 경쇄 재조합 scFv 직렬 ER-TPD 요소를 사용하여, 표적 TGF-β1 및 PD-L1ER-TPD 요소를 구성하고, 종양 용해 바이러스의 강력한 프로모터에 로딩된 후, 종양 세포에 특이적으로 감염된 후, 종양 용해 바이러스가 대량으로 증폭되고, TGF-β1과 PD-L1ER-TPD 요소를 발현하여, 종양 세포에서 TGF-β1 및 PD-L1의 발현을 직접 억제 및 분해하고, 종양 면역 억제 미세 환경을 파괴하여 종양 치료 효과를 달성한다.
이론에 의해 제한되지 않지만, 본 출원의 키메라 단백질 구조체는 종양 용해 바이러스 벡터를 통해 종양 세포에서 발현될 때 독특한 이점을 갖는 것으로 여겨진다. 한편, 본 출원의 키메라 단백질 구조체는 종양 세포가 성장하거나 면역을 벗어나거나 세포사멸에 저항하도록 돕는 종양 세포 내 단백질을 표적화하고 분해함으로써 종양 세포의 세포 사멸 또는 사멸을 촉진할 수 있다. 다른 한편, 종양 용해 바이러스 벡터는 종양 세포에서 특이적으로 복제할 수 있고, 바이러스 복제 및 용해을 통해 종양 세포 용해를 촉진하고, 두 가지 다른 종양 사멸 방법을 종양 용해 바이러스 벡터에 통합하여 동일한 약물 형태에서 시너지 사멸 효과를 달성할 수 있다.
다른 한 방면에서, 본 공개는 또한 약물 조성물을 제공하고, 이는 본 공개에 의해 제공되는 종양 용해 바이러스 및 약학적으로 허용되는 비히클을 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 비히클에는 임의의 및 모든 운반 매질, 용매, 희석제, 부형제, 보조제, 분산 매체, 코팅제, 항균 및 항진균제, 흡수제 등이 포함된다. 이러한 물질은 포유류 및 특히 인간 대상체에 투여하기에 적합한 물질이다.
일부 실시예에서, 본 출원에 기술된 종양 용해 바이러스 또는 이의 약물 조성물은 정맥 내 또는 종양 내 투여를 위해 사용한다. 일부 실시예에서, 종양 용해 바이러스 또는 이의 약물 조성물은 인간 또는 동물 용도에 적합한 용매 또는 희석제에 배치될 수 있다. 상기 용매 또는 희석제는 바람직하게 등삼투, 저삼투 또는 약삼투인 것이며, 상대적으로 낮은 이온 강도를 갖는다. 대표적인 예로는 멸균수, 식염수(예: 염화나트륨), 링거 용액(Ringer’s solution), 포도당, 트레할로스 또는 녹당 용액, Hank’s 용액 및 기타 생리적으로 균형 잡힌 수용성 염 용액 등이 있다.
일 실시예에서, 본 출원에 기술된 종양 용해 바이러스 또는 이의 약물 조성물은 완충제를 포함할 수 있다. 적합한 완충제는 인산염 완충제(예: PBS), 중탄산염 완충제 및/또는 생리학적 또는 약알칼리성 pH(예를 들어, 약 pH 7 에서 약 pH 9)를 유지할 수 있는 Tris 완충제를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일 실시예에서, 본 발명의 종양 용해 바이러스 조성물은 안정성, 특히 생산 조건에서의 안정성 및 장기간(즉, 최소 6개월, 바람직하게는 최소 2년) 냉동(예를 들어, -70°C, 또는 -20°C) 보관, 냉장 보관(예를 들어, 4°C) 또는 실온 환경 보관에 대한 안정성을 향상시키도록 제조될 수 있다. 이 분야에 존재하는 다양한 바이러스 제제는 동결 액체 형태 또는 동결 건조 형태이다(예: WO98/02522 및 WO2008/114021 등). 고체(예: 건조 분말 또는 동결 건조) 조성물은 진공 건조 및 동결 건조를 포함하는 단계에 의해 얻어질 수 있다. 설명을 위해, NaCl과 설탕을 추가한 완충제는 바이러스 보존에 특히 적합하다.
iii) 세포 약물 조성물
다른 측면에서, 본 공개는 또한 세포 약물 조성물을 제공하고, 이는 본 공개가 제공하는 조작된 세포 또는 세포 집단 및 약학적으로 허용되는 비히클을 포함한다. 예시적인 비히클에는 중성 완충 식염수, 인산 완충 식염수 등과 같은 완충제, 포도당, 만노스, 자당 또는 덱스트란, 만니톨과 같은 탄수화물, 단백질, 글리신과 같은 펩티드 또는 아미노산, 항산화제, EDTA 또는 글루타치온과 같은 킬레이트제, 보조제(예: 수산화 알루미늄) 및 방부제가 포함될 수 있다. 한 측면에서, 본 발명의 세포 약물 조성물은 정맥 내 투여용으로 제제화된다.
III.TPD의 응용
한 방면에서, 본 공개는 또한 치료를 위한 세포를 제조하는데 있어서 본 출원에 기술된 키메라 단백질 구조체, 핵산 분자 또는 벡터의 용도를 제공한다. 한 방면에서, 본 공개는 또한 질병 치료에 있어서 본 출원에 기술된 키메라 단백질 구조체, 핵산 분자 또는 벡터의 용도를 제공한다. 한 방면에서, 본 공개는 또한 질병 치료에 있어서 본 출원에 기술된 키메라 단백질 구조체, 핵산 분자 또는 벡터를 발현하는 세포의 용도를 제공한다.
1. 세포 이식
한 방면에서, 본 공개는 또한 이식될 세포(예: 동종 이계 세포 이식)를 제조하는 데 있어서 본 출원에 기술된 키메라 단백질 구조체, 핵산 분자 또는 벡터의 용도를 제공한다.
일부 실시예에서, 상기 이식될 세포는 면역 세포(예: T 세포), 줄기 세포(및 이들의 분화로부터 유래된 세포), 신장 세포, 섬 세포, 심근 세포 등 이다. 일부 실시예에서, 상기 이식될 세포는 자가 세포 또는 동종 이계 세포일 수 있다.
한 방면에서, 본 출원은 또한 상기 기술된 키메라 단백질 구조체, 핵산 분자 또는 벡터를 발현하는 이식될 세포를 제공하며, 여기서 본 출원에 기술된 키메라 단백질 구조체를 발현한다. 여기서 상기 키메라 단백질 구조체는 ERAD 메커니즘 단백질 결합 도메인 및 표적 도메인을 포함하고, 상기 표적 도메인은 표적 단백질을 특이적으로 표적하거나 결합하는 도메인을 포함하고, 상기 표적 단백질은 이식 거부 관련 단백질이다. 일부 실시예에서, 상기 키메라 단백질 구조체는 본 출원에 기술된 단백질 분해 경로 구성원(예: E3 유비퀴틴 리가제, 프로테아좀, 리소좀) 결합 도메인을 더 포함한다. 본 출원에 기술된 임의의 단백질 분해 경로 구성원 결합 도메인을 사용할 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 이식 거부 관련 단백질은 항원 제시 분자(예: MHC I 분자, MHC II 분자, MICA/B 분자 등), 항원 인식 분자, (예: TCR, CD123, NKG2D 등), 면역 체크포인트 분자(예: PD-1, PD-L1, CTLA4, TIM3, TIGIT, LAG3, A2AR, BTLA, IDO1, IDO2, TDO, KIR, NOX2, VISTA, SIGLEC7, PVR 등) 등이 포함된다.
일부 실시예에서, 상기 이식 거부 관련 단백질은 면역원성 단백질(예: HLA(HLA α/β), TCR(αβTCR), NKG2D(자연 살해 세포 구성원 2-member D) 리간드 등)을 포함한다.
본 공개는 상기 이식될 세포 및 그 치료 방법을 제공하고, 기존의 세포 이식 및 세포 치료에서 직면하고 있는 맞춤형 이식 세포 및 치료 세포의 유래 문제, 표준화 및 규모화 생산의 불가능, 낮은 치료 효율의 문제점을 극복할 수 있다.
면역 체계는 강한 가소성과 침입하는 바이러스, 박테리아, 이종 세포 및 병든 세포를 감지하는 거의 무한한 능력을 가지고 있다. 면역학적 감시를 위한 이 놀라운 능력은 주로 체액성 면역과 세포성 면역에 의해 이루어지며, 여기에는 면역글로불린과 T세포 수용체(TCR)라는 두 가지 중요한 분자 구조가 포함되어 있다. T세포의 핵심 구조인 TCR은 이황화 결합으로 연결된 α와 β 사슬 또는 δ와 γ 사슬로 구성된 막횡단 이종질체이다. 이러한 사슬 사이에서 상보 결정 영역(CDR)은 TCR이 결합할 항원을 결정한다. TCR에서 TCRα 및 TCRβ 서브유닛(또는 γδ T 세포의 TCRγ 및 TCRδ)은 주요 조직적합성 복합체(MHC)/항원 리간드 인식을 담당한다.
인간 MHC I 유전자 영역은 고전적인 I 항원(분자)인 HLA-A 항원, B 항원, C 항원 등을 인코딩하는 HLA-A, B, C 부위의 대립 유전자로 구성되며, HLA-A, HLA-B, HLA-C로 알려져 있다. 이러한 항원 분자는 모든 체세포 표면에 존재하며 세포 내 단백질 에피토프 펩티드에 결합하여 면역 체계에서 인식한다. 세포가 돌연변이 단백질을 생성하거나 외부 박테리아 또는 바이러스가 침입하는 경우에는 세포가 이러한 돌연변이 단백질 또는 이종 단백질 에피토프를 제시하고 면역 세포를 인식하여 면역 공격과 사멸을 수행하여 병든 세포, 박테리아 및 세포에 침입한 바이러스를 제거한다.
α/βT 림프구는 αβ T 세포 항원 수용체(TCR)CD3 복합체라고 하는 다합체 단백질 집합을을 통해 펩타이드-MHC 리간드를 인식한다. 이 구조는 항원과 결합하는 가변 αβ TCR 이합체와 TCR.CD3 표면 수송, 안정화 및 신호 전달에 관여하는 세 개의 불변 이합체(CD3γε, δε 및 ζζ)로 구성된다. αβT 세포 수용체(αβTCR)는 T 세포의 대부분(약 95%)에서 발현되며 주요 조직적합성 복합체(MHC) 고정 항원 인식을 통해 T 세포 활성화에 중요한 역할을 한다. 따라서, TCR 매개 T세포 활성화는 동종 조혈모세포 이식(allo-HCT) 및 동종 CAR-T 세포 치료 중 이식편대숙주질병(GVHD)의 발병 기전의 핵심 단계이다.
인간 백혈구 항원(HLA) 시스템 또는 복합체는 인간의 주요 조직적합성 복합체(MHC) 유전자 복합체에 의해 인코딩되는 관련 단백질 그룹이다. 이러한 세포 표면 단백질은 면역 체계의 조절을 담당한다. 치료성 이식 환경에서 동종이식의 기증자 HLA가 수혜자와 다를 때 "HLA 불일치"가 발생한다. HLA 불일치는 동종 반응성 T 세포의 활성화로 이어져 이식 후 6개월 이내에 급성 세포 거부 반응(ACR)을 일으킬 수 있다. 불일치 기증자 HLA 항원은 또한 급성 및 만성 이식 세포(예: T 세포) 거부 반응에서 증가하는 역할을 하는 새로운 기증자 특이적 HLA 항체(dnDSA)에 의해 개발된 표적이다. 따라서, 안전한 동종 주입 및 치료 목적의 범용 이식 세포(예: T세포)를 생성하기 위해서는 TCR을 유전적으로 파괴하여 이식편대숙주질병(GVHD)을 효과적으로 차단하는 것이 바람직하다. 뿐만 아니라, 동종 이계 세포(예: T 세포)의 HLA 발현을 억제하여 동종 T 세포의 TCRαβ 및/또는 동종 T 세포의 HLA I에 대한 수혜자 면역계의 거부반응을 감소시킬 필요가 있다.
일부 실시예에서, 상기 기술한 키메라 단백질 구조체, 핵산 분자 또는 벡터를 발현하는 이식될 세포는 감소된 면역원성을 갖는다.
일부 실시예에서, 본 출원에 기술된 감소된 면역원성(또는 높은 수준의 호환성을 갖는) 이식될 세포는 T세포이고, 이가 발현한 TPD 키메라 단백질 구조체는 TCR 및/또는 HLA를 특이적으로 인식하는 scFv, 및 HCMV 당단백질 US2 및/또는 US11의 막횡단 도메인 또는 이의 기능적 변이체, 및 소포체 상주 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
상기 ERAD 메커니즘 단백질 결합 도메인은 SEQ ID NO.76 또는 SEQ ID NO.82에 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 최소 80% (예: 최소 85%, 최소 90%, 최소 95% 또는 최소 99%)의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 감소된 면역원성을 갖는 이식될 세포는 T 세포이고, 이가 발현한 TPD 키메라 단백질 구조체는 TCR를 특이적으로 인식하는 scFv, 및 아데노바이러스 E3-K19의 막횡단 도메인 또는 이의 기능적 변이체 및 소포체 상주 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 감소된 면역원성을 갖는 이식될 세포는 T 세포이고, 이는 표적 단백질 결합 도메인 및 ERAD 메커니즘 단백질 결합 도메인을 포함하는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체를 발현하며, 상기 표적 단백질 결합 도메인은 SEQ ID NO.116에 표시된 아미노산 서열 또는 이와 최소 80%( 예: 최소 85%, 최소 90%, 최소 95% 또는 최소 99%)의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 6개의 CDR을 포함한다. 상기 ERAD 메커니즘 단백질 결합 도메인은 SEQ ID NO.60에 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 최소 80% (예: 최소 85%, 최소 90%, 최소 95% 또는 최소 99%)의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 감소된 면역원성을 갖는 T 세포에 의해 발현되는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체는, 단백질 분해 경로 구성원(예: E3 유비퀴틴 리가제, 프로테아좀) 결합 도메인을 더 포함하며, 선택적으로, 상기 단백질 분해 경로 구성원 결합 도메인은 상기 ERAD 메커니즘 단백질 결합 도메인에 연결된다. 일부 실시예에서, 상기 감소된 면역원성을 갖는 T 세포에 의해 발현되는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체는 SEQ ID NO.147에 표시되는 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 E3 유비퀴틴 리가제 결합 도메인을 더 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 감소된 면역원성을 갖는 이식될 세포(예: T 세포)는 또한 상기 기술한 바와 같은 공동 발현 부분을 발현한다.
예를 들어, 세포의 면역원성 또는 항원 제시를 감소시키기 위해, MHC I 또는 MHC II 분자를 분해하거나 감소시킬 수 있는 단백질은 상기 감소된 면역원성을 갖는 이식할 세포(예: T 세포)에서 공동 발현 부분으로 발현될 수 있다(예: 완전한 바이러스 ER 상주 당단백질는 HCMV US2, US3, US11, US10, 아데노바이러스 E3-K19, HCMV US6 및 HSV ICP47을 포함하되 이에 제한되지 않음). TCR의 효과적인 하향 조절은 TCR 매개 면역 공격을 크게 억제하고 T 세포의 이계 주입 시 GVHD를 감소시킬 것이다. 천연 바이러스 ER 상주 당단백질은 MHC 분자를 추가로 억제하여 펩타이드가 수용자 CD8+ T 세포에 제시되는 것을 방지하고 이계 T 세포에 의한 면역 인식을 억제할 수 있다. 따라서, 상기 기술한 높은 수준의 호환성을 갖는 T 세포는 "자체 보편적인 T 세포(Universal T cell, UT)" 또는 "보편적인 범용 T 세포(Universal T cell, UT)"라고도 하고, 이계 수혈 치료 목적을 달성할 수 있으며, 이계 T 세포의 호환성 및 주입 후 장기 지속성을 향상시킬 수 있다.
다른 한 방면에서, 본 공개는 세포 이식에 대한 대상체의 면역 반응을 감소시키는 방법을 제공하는데, 상기 기술한 감소된 면역원성을 갖는 이식될 세포의 치료 유효량을 대상체에게 투여함으로써 이식물이나 변형된 세포에 대한 대상체의 면역 반응을 감소시킬 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 이식될 세포는 세포 내에서 본 명세서에 기술된 TPD 키메라 단백질 구조체를 발현하는데, 여기서 상기 TPD 키메라 단백질 구조체는 면역원성 단백질(예: HLA(HLAα/β), TCR(αβTCR), NKG2D(자연 살해 세포 구성원 2-member D) 리간드 등)을 표적하는 도메인 및 상기 기술한 ERAD 메커니즘 단백질 결합 도메인, 및 선택적으로, 단백질 분해 경로 구성원 결합 도메인을 포함한다.
2. 세포 치료
세포 치료는 유전 공학 기술을 통해 종양 관련 항원을 제시하거나 질병 세포를 특이적으로 인식하는 수용체를 발현할 수 있도록 세포(예: 면역세포)를 변형시킨 다음 시험관 내에서 기하급수적으로 증폭시킨 후 환자에게 주입하여 생체 내 면역체계를 활성화하여 종양 세포를 공격하거나 질병 세포를 직접 특이적으로 인식하여 사멸시키는 치료법이다. 2012년 CD19 표적 CAR-T 세포는 인류 의학 역사상 최초로 B세포 백혈병 환자의 종양 세포를 표적으로 제거하는 데 성공하며 골수 줄기세포 이식 치료 기술에 이어 백혈병을 완치할 수 있는 또 하나의 치료 기술로 정밀의학 세포치료의 새 시대를 열었다. 이 기술은 다양한 혈액 종양 및 고형 종양 치료에 응용될 것으로 기대된다. 그러나 현재 고형 종양 치료에 있어 기존 CAR-T의 임상 효능은 좋지 않는데 그 이유는 다음과 같다. (1) CAR-T의 살상 기능은 CAR 구조에 의한 종양 관련 항원 (TAA)의 인식에 크게 의존하지만, 고형 종양의 이질성으로 인해 종양 세포 표면의 표적점 단백질의 발현에는 큰 차이가 있으며, 현재 단일 표적 CAR-T는 모든 종양 세포를 완전히 인식하고 죽일 수 없어 종양의 면역 회피 및 재발 전이를 초래한다; (2) 고형 종양의 직접적인 면역 억제 효과가 있으며, PD-L1, B3H7 등을 발현하여 T 세포의 활성화를 직접 억제한다; (3) 고형 종양의 면역 억제 미세 환경에는 TAM, Treg, MDSC과 같은 많은 수의 면역 억제 세포가 있으며, 전통적인 CAR-T의 설계는 종양 내부의 면역 억제 세포의 한계를 돌파하기 어렵다; (4) 전통적인 CAR-T는 개성적 세포 치료법으로 T 세포는 환자 자체에서 유래하는데 환자가 이미 다량의 방사선 화학요법을 받은 경우 면역체계 기능이 손상되어 환자의 말초혈액에서 충분한 양의 T세포를 분리하기 어렵고, 분리하여 변형해도 된다고 해도 T 세포의 증식 및 사멸 기능이 여전히 약하여 치료 효과를 발휘하기 어렵다.
본 출원에 제공하는 이식될 세포(예: T 세포)는 기존 세포 치료에서 직면한 종양 표적 가변성, 종양 면역 억제 환경, 맞춤형 치료 세포 공급원 등의 문제를 극복할 수 있다.
세포 치료의 목적을 위해, 감소된 면역원성을 갖는 이식될 세포(예: T 세포, 더 나아가 TCRαβ 및 MHC 분자 표면 발현에 결함이 있는 보편적인 T 세포)를 추가적으로 유전적으로 조작할수 있다. 예를 들어, 상기 기술한 공동 발현 부분을 발현하여 치료 목적을 달성할 수 있다.
예를 들어, 이식될 세포(예: T 세포)가 질병 관련 표적 단백질 또는 질병 관련 표적 단백질을 발현하는 세포에 특이적으로 작용할 수 있도록 하기 위해, 상기 감소된 면역원성을 갖는 이식될 세포(예: T 세포)에 질병 관련 표적 단백질을 인식하거나 결합하는 결합 도메인 또는 분자가 발현될 수 있으며, 예를 들어, 키메라 항원 수용체 CAR, 조작된 TCR 또는 본 출원에 의해 제공되는 CNK 수용체 또는 항바이러스 단백질 결합 도메인 등이 있다.
일부 실시예에서, 상기 감소된 면역원성을 갖는 이식될 세포(예: T 세포)에서 이식 대상 질병의 질병 미세 환경으로의 이동을 매개할 수 있는 분자(예: 케모카인 수용체 또는 사이토카인 수용체)를 발현할 수도 있다.
또 다른 예로서, 이식될 세포(예: T 세포)가 증가된 면역 자극 활성을 갖도록 하기 위해, 상기 감소된 면역원성을 갖는 이식될 세포(예: T 세포)에서 면역 자극 분자를 발현할 수 있다.
또 다른 방면에서는, 본 출원는 또한 본 출원에 의해 제공되는 이식될 세포(예: UT 세포)에 NK 요소, 특히 최적화된 재조합 NK 요소를 도입하여, T 세포가 NK 세포처럼 모든 바이러스 감염 세포 및 종양 세포를 효율적으로 인식할 수 있도록 하며, 선택적으로, 전달 요소를 최적화하여 CNK-T 세포가 종양 세포를 효율적으로 활성화 및 사멸시킬 수 있도록 한다. MICA, MICB, ULBP1-6 등 가족 구성원 단백질을 포함한 NK 표적점은 다양한 종양 세포에서 광범위하게 발현되고 종양 진행 단계에 따라 달라질 수 있기 때문에 CNK 기술은 단일 CAR-T의 표적 이탈 효과를 효과적으로 해결하고 종양 면역 탈출 가능성을 제거할 수 있다. 동시에 CNK가 설계에 도입한 키메라 어댑터(Chimeric Adaptor)는 NK 신호를 효과적으로 전달 및 증폭하고, PD1 신호와 같은 면역 체크포인트의 한계를 뛰어넘어, T 세포를 효율적으로 활성화하고 종양 세포를 사멸을 실현할 수 있다. 키메라 어댑터(Chimeric Adaptor)는 CNK-T 세포 신호를 증폭하고 종양 환경에서 면역 억제에 저항하며 T 세포의 활성화를 실현하며 종양 세포의 사멸을 실현할 수 있으며; 또한 CNK-T 세포는 NK를 통해 표적점을 인식하고 MDSC와 같은 면역 억제 세포를 제거할 수 있다. 바이러스가 세포를 감염시키고 특정 기능 단백질을 발현하여 MHCI의 조립 또는 수송 또는 MHCI 분자의 방향성 분해를 직접 촉진하여 바이러스 항원 에피토프의 제시를 억제하고 면역 탈출을 생성한다.
한 방면에서, 본 공개는 CNK 수용체 및 선택적으로 CAR를 발현하는 UT 세포를 제공하고, 이런 UT 세포는 "CNKT-UT"로고도 한다. 본 출원에서는 CNK-UT가 광범위한 종양 식별 및 사멸 능력을 가지고 있음이 확인되였다. 본 출원은 화합물 특정 표적점 CAR/CNK-UT 제품을 추가로 설계하여, CAR/CNK-UT 제품이 기존 CAR-T보다 종양 세포에 대해 더 강력한 사멸 및 활성화 기능을 가지고 있음을 입증했다. 동물 실험에서 CAR/CNK-UT 제품도 더욱 효율적인 종양 제거 능력을 가지고 있다. UT 기술은 이계 보편적인 개조를 실현하고, T 세포는 건강한 기증자로부터 공급받아 CNK-UT 제품의 표준화와 규모화 생산을 실현하여 미리 준비 할 수 있으며, 종양 세포에 대한 T 세포의 사멸 및 활성화 기능을 보장한다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 CNKT-UT는 핵산 분자를 포함하고, 이는 SEQ ID NO.117에 표시된 아미노산 서열과 80% 또는 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하고, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩한다. 일부 바람직한 실시예에서, 상기 CNKT-UT는 핵산 분자를 포함하고, 이는 SEQ ID NO.117에 표시된 아미노산 서열을 인코딩한다. 다른 한 방면에서, 본 공개는 또한 질병 치료를 위한 약물의 제조에 있어서 CNKT-UT의 용도를 제공한다.
한 방면에서, 본 공개는 또한 본 출원에 기술된 키메라 단백질 구조체, 이를 인코딩하는 핵산 분자 또는 벡터를 포함하거나 발현하는 면역 세포를 제공하며, 여기서 상기 키메라 단백질 구조체는 ERAD 메커니즘 단백질 결합 도메인 및 표적 도메인을 포함하고, 상기 표적 도메인은 표적 단백질을 특이적으로 표적하거나 표적 단백질에 결합하는 도메인을 포함하며, 상기 표적 단백질은 상기 면역 세포 및 표적 세포에서 모두 발현된다. 일부 실시예에서, 상기 면역 세포는, 상기 표적 단백질을 표적으로 하는 결합 도메인 또는 분자(예: CAR), 이를 인코딩하는 핵산 분자 또는 벡터를 추가로 포함하거나 발현한다. 일부 실시예에서, 이러한 표적 단백질의 예로는, CD123, CD5, CD7, CD38 또는 CD4가 포함된다.
이론에 의해 제한되지 않지만, 일부 표적 단백질은 암세포 또는 바이러스 감염 세포와 같은 표적 세포에서 발현되고, 치료에 사용되는 면역 세포에서도 발현된다. 이러한 표적점은 일반적으로 세포 치료로 치료하기 어려운 경우가 많으므로, 치료에 사용되는 면역 세포에서 이러한 표적점을 표적으로하는 CAR를 발현하면, CAR가 면역 세포 자체에서 발현 된 동일한 표적점을 인식하여 면역 세포의 자가 포식을 유발하여 정상적으로 확장 할 수 없거나 표적 세포에 대한 사멸 효과가 제한 될 수 있다. 본 출원에서 제공하는 키메라 단백질 구조체를 통해 면역 세포 자체에 의해 발현되는 표적 단백질이 분해될 수 있으며, 이로써 표적 세포에 대한 특이적 사멸 효과를 유지하면서 자가 포식을 피할 수 있다. 본 출원의 키메라 단백질 구조체를 사용하는 또 다른 장점은, 표적점을 표적으로 하는 키메라 단백질 구조체와 표적을 표적으로 하는 결합 도메인(예: CAR, TCR 등)을 동시에 발현시킴으로써, 기존의 유전자 녹아웃 및 기타 방법보다 더 간단하고 효과적이다.
일부 실시예에서, 상기 키메라 단백질 구조체는 본 출원에 기술된 단백질 분해 경로 구성원(예: E3 유비퀴틴 리가제, 프로테아좀, 리소좀) 결합 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 본 출원에 기술된 임의의 단백질 분해 경로 구성원 결합 도메인을 사용할 수 있다.
입양 세포 치료를 위한 세포 투여 방법은 알려져 있으며, 제공된 방법 및 조성물과 결합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 입양 T 세포 치료 방법은 예를 들어 Gruenberg 등의 미국 특허 출원 공개 번호 2003/0170238; Rosenberg의 미국 특허 번호 4,690,915；Rosenberg(2011)Nat Rev Clin Oncol.8(10):577-85)에 설명되어 있다. 참고 예에는 Themeli 등 (2013)Nat Biotechnol.31(10):928-933；Tsukahara 등 (2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila 등 (2013)PLoS ONE 8(4):e61338이 있다.
일부 실시예에서, 세포 또는 세포의 개체 집단 또는 아형은 약 100만에서 약 1000억 개의 세포 범위에서 대상체에게 투여된다. 예를 들어, 100만에서 약 500억 개의 세포(예: 약 500만 개의 세포, 약 2500만 개의 세포, 약 5억 개의 세포, 약 10억 개의 세포, 약 50억 개의 세포, 약 200억 개의 세포, 약 300억 개의 세포, 약 400억 개의 세포, 또는 임의의 상기 두 값으로 정의된 범위)，예를 들어, 약 1000만에서 약 1000억 개의 세포(예: 약 2000만 개의 세포, 약 3000만 개의 세포, 약 4000만 개의 세포, 약6000만 개의 세포, 약 7000만 개의 세포, 약8000만 개의 세포, 약 9000만 개의 세포, 약 100억 개의 세포, 약 250억 개의 세포, 약 500억 개의 세포, 약 750억 개의 세포, 약 900억 개의 세포，또는 임의의 상기 두 값으로 정의된 범위)，및 어떤 경우에는，약 1억 개의 세포에서 약 500억 개의 세포(예: 약 1.2억 개의 세포, 약 2.5억 개의 세포, 약 3.5억 개의 세포, 약4.5억 개의 세포, 약 6.5억 개의 세포, 약 8억 개의 세포, 약 9억 개의 세포, 약 30억 개의 세포, 약 300억 개의 세포, 약 450억 개의 세포) 또는 이들 범위 사이의 임의의 값이다.
일부 실시예에서, 전체 세포의 용량 및/또는 세포의 개별 하위집단의 용량은 약 104개 세포/천키로(kg) 체중 내지 약 109 개 세포/천키로(kg) 체중 사이의 범위 내에 있다. 예를 들어, 105와 106개의 세포/kg 체중 사이에 있고, 예를 들어, 적어도 또는 적어도 약 또는 약 1×105개의 세포/kg, 1.5×105개의 세포/kg，2×105개의 세포/kg 또는 1×106개의 세포/kg 체중이다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 세포는 약 104 또는 약 109개의 T세포/천키로(kg) 체중 사이 또는 일정 오차 범위 내에서 투여된다. 예를 들어, 105 및 106개의 T세포/kg체중 사이, 예를 들어 적어도 또는 적어도 약 또는 약 1×105개의 T세포/kg, 1.5×105개의 T세포/kg，2×105개의 T세포/kg, 또는 1×106개의 T세포/kg 체중이다.
세포는 임의의 적합한 방식으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 볼러스, 주입으로, 예를 들어, 정맥 또는 피하 주입, 안구 내 주입, 안구 주위 주입, 망막하 주입, 유리체 내 주입, 경격막 주입, 공막하 주입, 맥락막 내 주입, 전방 내 주입, 회음하 주입, 결막하 주입, 안구근막낭하(sub-Tenon) 주입, 교후부 주입, 안구 주위 주입, 또는 후부 공막 주입(posterior juxtascleral)를 통해 전달된다. 일부 실시예에서, 이들은 비경구, 폐내 및 비강 내로 투여되고 국소 치료가 요망되는 경우, 병변 내 투여에 의해 투여된다. 비경구 주입은 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하에 투여를 포함한다. 일부 실시예에서, 주어진 용량은 단일 볼루스로 세포를 투여함으로써 투여된다. 일부 실시예에서, 세포를 다중 볼루스로 투여함으로써 투여된다. 예를 들어, 세포는 3일 이하의 기간에 걸쳐 투여되거나 연속 주입에 의해 투여될 수 있다.
일부 실시예에서, 반복 투여 방법을 제공하며, 여기서 세포의 1차 용량을 투여한 후 1회 이상의 2차 연속 용량을 투여한다. 대상체에게 입양 치료 방법을 적용하는 경우, 일반적으로 세포의 다중 용량의 시기 및 크기는 항원을 발현하는 T 세포(예: CAR의 발현 T 세포)의 효능 및/또는 활성 및/또는 기능을 증가시키도록 설계된다. 일부 실시예에서, 반복 투여는 PD-1 및/또는 PD-L1과 같은 억제성 면역 분자가 CAR 발현 T 세포와 같은 항원 발현에서 상향 조절될 때 발생할 수 있는 하향 조절 또는 활성 억제를 감소시킨다. 방법에는 1차 용량을 투여한 후 일반적으로 용량 사이에 지정된 시간 범위를 두고 1회 이상의 연속 용량을 투여하는 것이 포함된다.
입양 세포 요법의 맥락에서, 주어진 "용량"의 투여는 단일 조성물 및/또는 단일 무중단 투여(예: 단일 주사 또는 연속 주입)로서 주어진 정량 또는 수량의 세포를 투여하는 것을 포함하며, 또한 지정된 기간(3일 이내) 내에, 주어진 정양 또는 수량의 세포 수는 분할 용량으로 다중 개별 조성물 또는 주입으로 투여된다. 따라서, 일부 경우에, 1차 또는 연속 용량이 단일 시점에 제공되거나 개시된 특정 수량의 세포에 대해 단일 또는 연속 투여한다. 그러나, 일부 경우에는, 1차 또는 연속 용량은 3일을 초과하지 않는 기간 동안 여러 번 주사 또는 주입(예: 3일 또는 이틀에 한 번, 하루에 한 번 또는 하루 동안 여러 번 주입)으로 투여된다.
3. 병원성 단백질의 표적 분해
다른 한 방면에서, 본 공개는 또한 체내 또는 체외에서 표적 단백질을 분해하는 방법을 제공하는데, 이는 본 명세서에 기술된 핵산 분자 및/또는 벡터를 표적 단백질을 발현하는 세포 또는 대상체에 전달하는 것을 포함하며, 상기 핵산 분자 및/또는 상기 벡터는 상기 세포 또는 대상체에서 발현되어 본 명세서에 기술된 키메라 단백질 구조체를 생성할 수 있다. 상기 키메라 단백질 구조체의 표적 단백질 결합 도메인은 표적 단백질에 결합할 수 있고, 상기 키메라 단백질 구조체의 ERAD 메커니즘 단백질 결합 도메인은 ERAD 경로를 활용하여 유비퀴틴-프로테아좀 시스템(UPS)의 공간적 근접성을 유도함으로써 UPS의 프로테아좀을 활용하여 표적 단백질을 분해할 수 있다. 상기 키메라 단백질 구조체가 단백질 분해 경로 구성원 결합 도메인을 추가로 포함하는 경우, 상기 방법은 추가적인 분해 시스템을 표적 단백질에 근접하도록 유도하여 분해 효과를 크게 향상시킬 수 있다.
다른 한 방면에서, 본 공개는 또한 치료가 필요한 대상체의 상태　또는　질병을　치료 및/또는 이의 재발을 방지하는 방법을 제공하며, 상기 기술한 약물 조성물(예를 들어, mRNA, 바이러스 벡터, 종양 용해 바이러스, 키메라 단백질 구조체 등과 같은 본 출원에 기술된 핵산 분자를 포함함)의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 방법은 본 출원에 기술된 키메라 단백질 구조체를 인코딩하는 핵산 분자(예: mRNA) 또는 벡터(예: 바이러스 벡터)를 필요한 개체에 도입함으로써 상기 핵산 분자 또는 벡터가 상기 개체의 세포에서 상기 키메라 단백질 구체조를 발현하도록 하는 것을 포함한다.
본 발명의 맥락에서는 비경구, 국소 또는 점막 경로를 포함하여 임의의 전통적인 투여 경로 모두 적용 가능하다. 비경구 경로는 주사 또는 주입이며, 전신 경로뿐만 아니라 국소 경로도 포함한다. 일반적인 비경구 주사 유형은 정맥 내(정맥으로 진입), 동맥 내(동맥으로 진입), 피내(진피로 진입), 피하(표피 아래), 근육 내(근육으로 진입) 및 종양 내(종양 또는 그 근접부위로 진입)이다. 전형적인 주입은 정맥 경로를 통해 이뤄진다. 점막 투여에는 경구/식도, 비강 내, 기관 내, 폐내, 질 내 또는 직장 내 경로가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 국소 투여는 피부를 투과하는 수단(예: 패치 등과 이와 유사한것)으로 완성할 수도 있다. 전통적인 주사기 및 바늘 투여 또는 기존 기술을 사용하여 대상자에게 활성 제제의 전달을 촉진하거나 향상시키는 화합물 또는 장치를 사용할 수 있다.
개인이 치료해야 하는 질병과 분해해야 하는 병원성 단백질에 따라 적절한 키메라 단백질 구조체와 이의 핵산 분자 및 벡터를 선택할 수 있다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 질병은 다양한 고형 종양 및 혈액 종양, 감염성 질병(예: 바이러스 감염), 자가면역 질병, 신경 퇴행성 질병, 대사성 질병을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 질병은 종양 또는 암이고, 상기 키메라 단백질 구조체의 표적 도메인은 특이적 표적화 종양 관련 표적점 또는 면역 기능 관련 표적점을 포함한다. 상기 종양 관련 표적점 또는 면역 기능 관련 표적점은 본 출원의 앞부분에서 설명한 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 고형 종양은 신경계 종양, 두경부 종양, 흉부 종양, 소화계 종양, 비뇨생식계 종양, 연조직 및 피부 종양, 골 종양 등에서 선택된다.
일부 바람직한 실시예에서, 신경계 종양에는 확산성 신경교종, 확산성 성상세포종 및 역형성 성상세포종, 교모세포종, 희소돌기아교세포종, 핍지교성상세포종, 확산성 신경교종, 기타 성상세포종, 죄질피복세포종, 신경세포와 혼합 신경아교종, 수모세포종, 기타 배아성 종양, 신경초종, 수막종, 고립성 섬유종 및 혈관주위세포종 등을 포함한다.
일부 바람직한 실시예에서, 두경부 종양에는 비강의 내강과 부비동의 악성 종양, 비인두암, 구강암, 후두암, 침샘 종양, 두개 내 종양, 갑상선암, 설암 등을 포함한다.
일부 바람직한 실시예에서, 흉부 종양에는 폐암, 식도암, 분문암, 유방암, 종격막 종양 등을 포함한다.
일부 바람직한 실시예에서, 소화계 종양에는 위암, S상 결장암 및 직장암, 간암, 췌장암과 팽대부주위암, 담도암, 소장의 악성종양 등을 포함한다.
일부 바람직한 실시예에서, 비뇨생식계 종양에는 신장암, 전립선암, 방광암, 고환암, 음경암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암 등을 포함한다.
일부 바람직한 실시예에서, 연조직 및 피부 종양에는 악성 섬유 조직 세포종, 횡문근육종, 활막육종, 피부의 악성 흑색종 등을 포함한다.
일부 바람직한 실시예에서, 골 종양에는 골육종, 유잉육종 등을 포함한다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 결장암은 결장선종이다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 유방암은 삼중 음성 유방암 세포이다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 간암은 간세포 암종이다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 질병은 백혈병, 림프종(HL), 다발성 골수종(MM), 골수이형성성증후군(MDS) 등에서 선택되는 혈액 종양이다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 백혈병은 B세포 급성림프구성백혈병, T세포 급성림프구성백혈병, 급성골수성백혈병 등이다.
다른 한 방면에서, 본 공개는 또한 필요한 대상체의 종양 또는 암을 치료하는 방법을 제공하며, 본 출원에서 기술한 종양 용해 바이러스 또는 종양 용해 바이러스 약물 조성물의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 종양 용해 바이러스 또는 조성물은 대상자에게 단일 용량 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다. 다중 용량을 투여하는 경우, 동일하거나 다른 경로를 통해 투여할 수 있으며, 동일한 부위 또는 다른 부위에 투여할 수 있다. 또한 휴식 기간 후에 반복하여 연속 주기로 투여할 수도 있다. 각 투여 간격은 몇 시간에서 1년(예: 24시간, 48시간, 72시간, 매주, 격주, 매월 또는 매년)일 수 있다. 간격이 불규칙할 수도 있다(예: 종양 발전 이후). 각 투여의 용량은 상기 범위 내에서 달라질 수 있다. 특정 실시예에서, 종양 용해 바이러스의 투여 경로는 정맥 내 및 종양 내 경로를 포함할 수 있다.
본 발명의 경우, 종양 용해 바이러스는 적합한 용량(예: 107 내지 5x109pfu )으로 1회 또는 여러 회 투여될 수 있다. 각각의 바이러스 투여 사이의 간격은 약 1일에서 약 8주까지 다양할 수 있다. 또 다른 바람직한 치료 방안은 약 1주 또는 2주 간격으로 IO8 또는 IO9Pfu 종양 용해 바이러스를 2~5회(예를 들어, 3회) 정맥 또는 종양 내 투여하는 것을 포함하며, 이는 실제 상황에 따라 의사가 선택할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 상기에서 기술한 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 종양 용해 바이러스 벡터를 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 대상체는 암을 갖고 있다. 상기 약물 조성물 또는 상기에서 기술한 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 종양 용해 바이러스 벡터는 병원성 단백질, 예를 들어, 발암성 단백질, 바이러스 단백질, 면역 관련 단백질 등을 표적화된 방식으로 분해할 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 질병은 감염성 질병이고, 상기 키메라 단백질 구조체의 표적 도메인은 특정 표적 감염성 질병 관련 표적점을 포함한다. 상기 감염성 질병 관련 표적점은 본 출원의 앞부분에서 기술된 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 바이러스 감염성 질병에는 호흡기 바이러스성 질병, 위장 바이러스성 질병, 간 바이러스성 질병, 피부 및 점막 바이러스성 질병, 안구 바이러스성 질병, 중추신경계 바이러스성 질병, 림프구성 바이러스성 질병, 곤충 매개 바이러스성 질병, 렌티바이러스 감염 질병 등이 포함된다.
일부 바람직한 실시예에서, 호흡기 바이러스성 질병에는 라이노 바이러스, 아데노 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 파라 인플루엔자 바이러스, 코로나바이러스, 인플루엔자, 유행성 이하선염의 감염 등이 포함된다.
일부 바람직한 실시예에서, 위장 바이러스성 질병에는 소아마비, 쿡사키 바이러스 감염, ECHO 바이러스 감염, 바이러스성 위장염이 포함되고, 로타 바이러스 위장염은 노르워크 바이러스 위장염, 아데노 바이러스 위장염, 아스트로 바이러스 위장염, 코로나 바이러스 위장염, 칼리시 바이러스 위장염 등이 포함된다.
일부 바람직한 실시예에서, 간 바이러스성 질병에는 바이러스성 A형 간염, 바이러스성 B형 간염, 바이러스성 C형 간염, 바이러스성 D형 간염, 바이러스성 E형 간염, 엡스타인-바 바이러스성 간염, 거대 세포 바이러스 간염 등이 포함된다.
일부 바람직한 실시예에서, 피부 및 점막 바이러스성 질병에는 홍역, 풍진, 영아 급성 발진, 수두 및 대상 포진, 천연두, 단순 포진 바이러스 감염, 광견병 및 구제역 등이 포함된다.
일부 바람직한 실시예에서, 안구 바이러스성 질병에는 유행성 각결막염, 여포성 결막염, 헤르페스성 각결막염 등이 포함된다.
일부 바람직한 실시예에서, 중추신경계 바이러스성 질병에는 일본뇌염, 서부말뇌염, 동부말뇌염, 세인트루이스뇌염, 베네수엘라말뇌염, 머레이밸리뇌염, 캘리포니아뇌염, 산림뇌염 및 림프구성 맥락막총수막염 등이 포함된다.
일부 바람직한실시예에서, 림프구성 바이러스성 질병에는 전염성 단핵증, 거대 세포 바이러스 감염 및 후천성 면역 결핍 증후군 등이 포함된다.
일부 바람직한 실시예에서, 곤충 매개 바이러스성 질병에는 유행성 출혈열이 포함되고, 황열, 크림-콩고 출혈열, 리프트밸리열, 아르헨티나 출혈열, 볼리비아 출혈열, 라싸열, 오무스크럽 출혈열, 마르부르크병, 에볼라 출혈열 등이 포함되며, 뎅기열 및 뎅기출혈열, 웨스트나일열, 콜로라도 진드기 열전달병, 모래파리열 등이 포함된다.
일부 바람직한 실시예에서, 렌티바이러스 감염 질병에는 아급성 경화범뇌염, 쿠루병, 진행성 다초점 백색질뇌증, 아급성 해면상 뇌병증(피질선조체 척수 변성) 등이 포함된다.
일부 실시예에서, 상기 질병은 자가면역 질병이고, 상기 키메라 단백질 구조체의 표적 도메인은 자가항원 관련 표적점을 포함한다. 상기 자가항원 관련 표적점은 본 출원에서 앞서 설명한 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 자가면역 질병에는 장기 특이적 자가면역 질병과 전신성 자가면역 질병이 포함된다.
바람직하게는, 장기 특이적 자가면역 질병에는 만성 림프구 갑상선염, 갑상선 기능 항진증, 인슐린 의존성 당뇨병, 중증 근무력증, 궤양성 대장염, 만성 위축성 위염을 동반한 악성빈혈, 폐출혈성 신염 증후군, 심상성천포창, 유천포창, 원발성 담도성 간경변, 다발성 경화증, 급성 특발성 다발 신경염 등이 포함된다.
일부 바람직한 실시예에서, 전신성 자가면역 질병에는 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 전신 혈관염, 경피증, 천포창, 피부근염, 혼합 결합 조직 질병, 자가면역 용혈성 빈혈, 갑상선 자가면역 질병, 궤양성 대장염 등이 포함된다.
일부 실시예에서, 상기 질병은 신경학적 또는 퇴행성 질병이고, 상기 키메라 단백질 구조체의 표적 도메인은 신경계 질병 관련 표적점을 특이적으로 표적하는 표적점을 포함한다. 상기 신경계 질병 관련 표적점은 본 출원에서 앞서 설명한 바와 같다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 신경학적 질병에는, 신경계 질병, 삼차 신경통과 같은 말초 신경 질병, 안면 마비, 반안면 경련, 전정 신경염, 설인 신경통, 단신경 질병, 상완 신경총 신경통, 다발성 단신경 병증, 다발성 신경 병증, 급성 염증성 탈수초성 다발성 신경 병증, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경 병증;
척수염, 압박척수병, 압박성 척수증, 척수의 아급성 복합 변성, 척수공동증, 척수 혈관 질병, 척수 지주막염과 같은 척수 질병;
일과성 허혈성 발작, 뇌경색, 뇌출혈, 지주막하출혈, 두개내정맥계 혈전증 등과 같은 뇌혈관 질병;
바이러스, 박테리아, 곰팡이 또는 기생충 등의 감염으로 인한 뇌수막염, 뇌염 등, 및 렌티바이러스 감염으로 인한 렌티바이러스성 뇌염 등과 같은 중추신경계 감염성 질병;
다발성 경화증, 시신경척수염, 급성 파종성 뇌척수염, 대뇌백질이영양증 등과 같은 중추신경계 탈수축성 질병;
파킨슨병, 무도병, 간렌즈핵변성, 근긴장이상증, 본태성 진전, 지연성 운동장애 등과 같은 운동장애 질병;
뇌전증;
편두통, 긴장성 두통, 군발성 두통 등과 같은 두통;
운동뉴런질병, 알츠하이머병, 루이소체치매, 전측두엽 치매, 다계통 위축증 등과 같은 신경계 변성질병;
유전성 운동 실조, 유전성 강직성 하반신 마비, 샤르코-마리-투스병, 신경섬유종증, 결절성 경화증, 뇌혈관종양증 등과 같은 신경계 유전성 질병;
선천성 수두증, 뇌성마비, 두개저함입증, 소뇌 편도하 질병 등과 같은 신경발달 장애;
중증근무력증, 주기성마비, 다발성근염, 진행성근영양증, 근강직성근병증(근긴장성이영양증, 선천성근강직증), 대사성근병증(미토콘드리아근병증, 지질축적근병증, 당원축적증) 등과 같은 신경근 접합부과 근육 질병;
레이노병, 지단홍통증, 반안면 위축증, 전신성 자율 기능 부전, 자발적 다한증, 진행성 지방 이영양증 등과 같은 자율 신경계 질병;
신경교종, 림프종, 수막종 등과 같은 신경계 종양;
부종양 소뇌변성, 부종양 뇌척수염, 아급성 괴사성 척수증, 아급성 운동신경질병, 부종양 감각신경질병 등과 같은 신경계 부종양증후군;이 포함된다.
일부 바람직한 실시예에서, 신경 퇴행성 질병은 신경 세포 사멸 및 신경 교세포 균형을 포함하여 신경 세포 구조 및 기능의 점진적인 상실을 초래하여 치매와 같은 인지 장애를 유발한다. 예시적인 신경 퇴행성 질병으로는 알츠하이머병, 파킨슨병(PD), 헌팅턴병, 초기 AD 또는 PD, 근위축성 측삭경화증(ALS) 등이 있다.
일부 실시예에서, 상기 질병은 당뇨병, 고지혈증, 통풍 등과 같은 대사성 질병이다. 상기 대사성 질병과 관련된 표적점은 본 출원에서 앞서 설명한 바와 같다.
실시예
실시예 1: ER-TPD 키메라 단백질 구조체의 설계
본 실시예는 소포체 기반 표적 단백질 분해 기술(Endoplasmic Reticulum-based Targeted Protein Degradation, ER-TPD)을 기반으로 한 키메라 단백질 구조체(chimeric　protein　construct)의 5가지 구조를 설계했다. 여기서, 첫 번째 구조는 기본 ER-TPD 키메라 단백질 구조체이며, 나머지 네 가지 구조는 첫 번째 구조에 E3 유비퀴틴 리가제 리간드, E2 유비퀴틴 결합 효소 리간드 또는 리소좀 리간드 또는 이들의 조합을 추가하여 형성된 기능이 더 강력한 ER-TPD 키메라 단백질 구조체이다. ER-TPD 키메라 단백질 구조체는 표적 단백질에 결합하여 표적 분해를 유도하는 재조합 단백질 분자의 다기능 통합 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
1.1 기본 ER-TPD 키메라 단백질 구조체
일부 실시예에서, 기본 ER-TPD 키메라 단백질 구조체 TBD-TMD-ERD가 사용되며, 이의 선형 개략도 및 구조 개략도는 도 1A와 같으며, 다음의 세 개의 도메인을 포함한다. (1) 표적 단백질 결합 도메인(targeted protein binding domain，TBD) 또는 이의 기능적 변이체, 이는 표적 친화성 리간드 단백질 분자 또는 이의 기능적 변이체(항체 단편, 폴리펩타이드, 천연 수용체, 리간드 또는 표적 단백질에 친화성을 갖는 인공 재조합 단백질 또는 이의 결합 도메인일 수 있음)일 수 있다; (2) 바이러스 소포체(ER) 상주 당단백질의 막횡단 도메인(transmembrane domain，TMD) 또는 이의 기능적 변이체; 및 (3) 바이러스 소포체 상주 당단백질의 세포질 도메인(ER retention domain，ERD) 또는 이의 기능적 변이체이다. 선택적으로, 상기 표적 단백질 결합 도메인 또는 이의 기능적 변이체, 바이러스 소포체 상주 당단백질의 막횡단 도메인 또는 이의 기능적 변이체, 및 바이러스 소포체 상주 당단백질의 세포질 도메인 또는 이의 기능적 변이체 간에는 힌지 또는 링커를 통해 연결된다.
도 1B에서 표시된 바와 같이, ER-TPD 키메라 단백질 구조체 TBD-TMD-ERD의 작동 메커니즘은 다음과 같다. [1] 특이적 결합 및 체류: 키메라 단백질 구조체가 발현된 후, TBD-TMD-ERD가 소포체에 상주하고, 표적 도메인을 통해 표적 단백질과 결합하며, 표적 단백질은 소포체에 체류하여 합성된 표적 단백질이 골지체로 수송되는 것을 방지한다. [2] 역전 수송: 키메라 단백질 구조체가 표적 단백질에 결합한 후, ERAD 메커니즘의 역전 수송기를 통해, 키메라 단백질 구조체와 표적 단백질에 의해 형성된 복합체를 소포체에서 세포질로 수송한다. 대표적인 역전 수송기로는 Derlin, E3 리가제 Hrd1, 샤페론 단백질 Sel1L이 포함되며, 이들은 세포질에서 ATPase p97을 모집할 수 있다. Derlin은 6개의 막횡단 도메인을 가지고 있으며, 여기서 N-말단과 C-말단은 모두 세포질에 존재하여 수송 채널을 형성하며, 역전 수송 과정에는 모두 ATPase p97의 참여가 필요하다(Byun H et al.ERAD and how viruses exploit it.Front Microbiol.2014 Jul 3；5:330). [3] 유비퀴틴화 및 프로테아좀 분해: 역전 수송기는 소포체 고유의 E3 유비퀴틴 리가제와 상호작용하여 표적 단백질의 유비퀴틴화를 촉진할 수 있으며, 유비퀴틴화된 표적 단백질은 역전 수송기를 통해 세포질로 수송되고 프로테아좀에 의해 인식 및 분해된다.
1.2 E3 유비퀴틴 리가제 리간드 도메인을 갖는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체
일부 실시예에서, E3 유비퀴틴 리가제 리간드 도메인을 갖는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체 TBD-TMD-ERD-E3L이 사용되며, 이의 선형 개략도 및 구조 개략도는 각각 도 2A 및 도 2B에 도시되어 있고, 이는 4개의 도메인을 포함한다. (1) 표적 단백질 결합 도메인(TBD) 또는 이의 기능적 변이체, 이는 표적 친화성 리간드 단백질 분자 또는 이의 기능적 변이체(항체 단편, 폴리펩티드, 천연 수용체, 리간드 또는 표적 단백질에 친화성을 갖는 인공 재조합 단백질 도메인일 수 있음)일 수 있다; (2) 바이러스 소포체 상주 당단백질의 막횡단 도메인 또는 이의 기능적 변이체; (3) 바이러스 소포체 상주 당단백질의 세포질 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (4) E3 유비퀴틴 리가제 리간드(ligand for E3ligase，E3L) 또는 이의 기능적 변이체, 해당 E3 유비퀴틴 리가제 리간드는 소포체 외부의 다수량의 E3 유비퀴틴 리가제와 연결하기 위한 폴리펩티드 또는 재조합 단백질일 수 있다. 선택적으로, 상기 표적 단백질 결합 도메인 또는 이의 기능적 변이체, 바이러스 소포체 상주 당단백질의 막횡단 도메인 또는 이의 기능적 변이체, 바이러스 소포체 상주 당단백질의 세포질 도메인 또는 이의 기능적 변이체, 및 E3 유비퀴틴 리가제 리간드 도메인 또는 이의 기능적 변이체 간에는 힌지 또는 링커에 의해 연결된다. 소포체 고유의 E3 유비퀴틴 리가제의 수가 제한되어 있고, 소포체에서 잘못 접힌 단백질의 ERAD 경로가 E3 유비퀴틴 리가제와 경쟁하기 때문에, 소포체 외부의 유비퀴틴화된 프로테아좀 분해 경로를 증가시키지 않으면 표적 단백질의 효율적인 분해를 달성할 수 없다. 이를 토대로, 본 출원의 발명자들은 E3 유비퀴틴 리가제 리간드를 외인성적으로 증가시킴으로써 표적 단백질의 효율적인 유비퀴틴화 및 분해를 달성할 수 있음을 발견했다.
도 2C에서 표시된 바와 같이, ER-TPD 키메라 단백질 구조체 TBD-TMD-ERD-E3L의 작동 메커니즘은 다음과 같다. [1] 특이적 결합 및 체류: 키메라 단백질 구조체가 발현된 후 TBD-TMD-ERD-E3L가 소포체에 상주하고, 표적 도메인을 통해 표적 단백질에 결합하고 표적 단백질이 소포체에 체류하여 합성된 표적 단백질이 골지체로 수송되는 것을 방지한다. [2] 역전 수송: 키메라 단백질 구조체가 표적 단백질에 결합한 후, ERAD 메커니즘의 역전 수송기를 통해, 키메라 단백질 구조체와 표적 단백질에 의해 형성된 복합체를 소포체에서 세포질로 수송한다. 대표적인 역전 수송기로는 Derlin, E3 리가제 Hrd1, 샤페론 단백질 Sel1L이 포함되며, 이들은 세포질에서 ATPase p97을 모집할 수 있다. Derlin은 6개의 막횡단 도메인을 가지고 있으며, 여기서 N-말단과 C-말단은 세포질에 존재하여 수송 채널을 형성하며, 역전　수송　과정에는　모두　ATPase p97의 참여가 필요하다. [3] 유비퀴틴화 및 프로테아좀 분해: 키메라 단백질 구조체의 E3 리가제 리간드는 E3 리가제 복합체에 결합하고, 복합체 내의 E2 유비퀴틴 결합 효소를 통해 표적 단백질을 유비퀴틴화한 후 프로테아좀으로 수송하여 분해하며, 여기서 E3 리가제 복합체를 표적으로 하는 리간드는 인위적으로 스크리닝되고 구축된 단백질 서열일 수도 있고, 자연적으로 존재하는 단백질 서열 또는 이들의 재조합 서열일 수도 있는데, 예를 들어, IκBα에서 유래한 포스포펩타이드(DRHDSGLDSM, SEQ ID NO.119)일 수 있으며, 해당 포스포펩타이드는 E3 유비퀴틴 리가제 복합체에서 SCFβ-TRCP를 모집하여 표적 단백질의 유비퀴틴화 분해 경로를 매개할 수 있다(Sakamoto KM et al.Protacs:chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation.Proc Natl Acad Sci U S A.2001；98:8554-9). 또한 해당 포스포펩타이드는 HIF-1α에서 유래한 E3 리가제 인식 펩타이드(ALAPYIP, SEQ ID NO.120)를 포함할 수 있으며, 해당 인식 펩타이드를 통해 E3 리가제 VHL을 결합하여 유비퀴틴화 분해 경로를 실현한다(Ivan M et al.HIFalpha targeted for VHL-mediated destruction by proline hydroxylation:implications for O2 sensing.Science.2001；292:464-8).
1.3 E2 유비퀴틴 결합 효소 리간드 도메인을 갖는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체
일부 실시예에서, E2 유비퀴틴 결합 효소 리간드 도메인을 갖는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체 TBD-TMD-ERD-E2L이 사용되며, 이의 선형 개략도 및 구조 개략도는 각각 도 3A 및 도 3B에 도시되어 있고, 이는 4개의 도메인을 포함한다. (1) 표적 단백질 결합 도메인(TBD) 또는 이의 기능적 변이체, 이는 표적 친화성 리간드 단백질 분자 또는 이의 기능적 변이체(항체 단편, 폴리펩티드, 천연 수용체, 리간드 또는 표적 단백질에 친화성을 갖는 인공 재조합 단백질 도메인일 수 있음)일 수 있다; (2) 바이러스 소포체 상주 당단백질의 막횡단 도메인 또는 이의 기능적 변이체; (3) 바이러스 소포체 상주 당단백질의 세포질 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (4) E2 유비퀴틴 결합 효소 리간드 도메인 또는 이의 기능적 변이체, 해당 E2 유비퀴틴 결합 효소 리간드는 폴리펩티드 또는 재조합 단백질일 수 있다. 선택적으로, 상기 표적 단백질 결합 도메인 또는 이의 기능적 변이체, 바이러스 소포체 상주 당단백질의 막횡단 도메인 또는 이의 기능적 변이체, 바이러스 소포체 상주 당단백질의 세포질 도메인 또는 이의 기능적 변이체, 및 E2 유비퀴틴 결합 효소 리간드 도메인 또는 이의 기능적 변이체 간에는 힌지 또는 링커에 의해 연결된다.
도 3C에서 표시된 바와 같이, ER-TPD 키메라 단백질 구조체 TBD-TMD-ERD-E2L의 작동 메커니즘은 다음과 같다. [1] 특이적 결합 및 체류: 키메라 단백질 구조체가 발현된 후 TBD-TMD-ERD-E2L가 소포체에 상주하고, 표적　도메인을　통해　표적　단백질에　결합하고 표적 단백질이 소포체에 체류하여 합성된　표적　단백질이 골지체로 수송되는 것을 방지한다. [2] 역전 수송: 키메라 단백질 구조체가 표적 단백질에 결합한 후, ERAD　메커니즘의　역전　수송기를　통해,　키메라　단백질　구조체와　표적　단백질에　의해　형성된　복합체를 소포체에서 세포질로 수송한다. 대표적인 역전 수송기로는 Derlin, E3 리가제 Hrd1, 샤페론 단백질 Sel1L이 포함되며, 이들은 세포질에서 ATPase p97을 모집할 수 있다. Derlin은 6개의 막횡단 도메인을 가지고 있으며, 여기서 N-말단과 C-말단은 세포질에 존재하여 수송 채널을 형성하며, 역전　수송　과정에는　모두 ATPase p97의 참여가 필요하다. [3] 유비퀴틴화 및 프로테아좀 분해: 키메라 단백질 구조체는 E2 유비퀴틴 결합 효소 리간드 도메인에 의해 E2 유비퀴틴 결합 효소에 직접 결합하고, E2 유비퀴틴 결합 효소에 의해 표적 단백질의 유비퀴틴화를 실현하고, 이를 프로테아좀으로 수송하여 분해한다. E2 유비퀴틴 결합 효소 리간드 도메인은 IAP 계열 단백질에서 유래한 RING 아연 핑거 도메인을 통해 E2 유비퀴틴 결합 효소의 UBC 구조에 결합하여 표적 단백질의 유비퀴틴화 및 프로테아좀 분해를 달성할 수 있다. 여기서, E2 유비퀴틴 결합 효소를 표적으로 하는 리간드는 IAP 계열 단백질에서 유래한 RING 아연 핑거 도메인 또는 RING 아연 핑거 도메인을 갖는 재조합 단백질 서열일 수 있다. IAP(inhibitor of apoptosis proteins)는 세포사멸 억제 단백질 계열로, IAP는 세포사멸 촉진 단백질(예: Caspases, SMAC, ARTS)에 대한 E3 리가제 역할을 할 수 있으며, 이는 세포사멸 촉진 단백질의 유비퀴틴화 및 분해를 달성함으로써 세포사멸을 억제할 수 있다. 또한 RIPK2(receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 2)의 유비퀴틴화를 통해 NOD 신호 전달 및 면역 반응을 조절할 수 있다. IAP의 다섯 개 가족 구성원(XIAP, cIAP1, cIAP2, Livin 및 ILP2)은 모두 RING 아연 핑거 도메인을 가지며, 유비퀴틴화 결합 효소 E2 및 Apollon 단백질에 결합할 수 있다(Mikihiko Naito et al.SNIPERs-Hijacking IAP activity to induce protein degradation.Drug Discov Today Technol.2019Apr；31:35-42). 따라서, IAP 가족 구성원에서 유래한 RING 아연 핑거 도메인을 사용하여 키메라 단백질 구조체와 유비퀴틴 결합 효소 E2를 연결하여 보다 효율적인 표적 단백질의 유비퀴틴화 및 프로테아좀 매개 분해를 달성할 수 있다. E2 리간드를 설계하기 위한 서열로 다음 서열을 사용할 수 있다.
XIAP에서 유래한 RING 도메인: CKICMDRNIAIVFVPCGHLVTCKQCAEAVDKCPMCY(SEQ ID NO.155)；
cIAP1에서 유래한 RING 도메인: CKVCMDKEVSVVFIPCGHLVVCQECAPSLRKCPICR(SEQ ID NO.156)；
cIAP2에서 유래한 RING 도메인: CKVCMDKEVSVVFIPCGHLVVCQECAPSLRKCPICR(SEQ ID NO.157)；
Livin에서 유래한 RING 도메인: CKVCLDRAVSIVFVPCGHLVCAECAPGLQLCPICR(SEQ ID NO.158)；
ILP-2에서 유래한 RING 도메인: CKICMDRHIAVVFIPCGHLVTCKQCAEAVDRCPMCS(EQ ID NO.159).
1.4 리소좀 리간드 도메인을 갖는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체
일부 실시예에서, 리소좀 리간드 도메인을 갖는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체 TBD-TMD-ERD-LL이 사용되며, 이의 선형 개략도 및 구조 개략도는 각각 도 4A 및 도 4B에 도시되어 있고, 이는 4개의 도메인을 포함한다. (1) 표적 단백질 결합 도메인 또는 이의 기능적 변이체, 이는 표적 친화성 리간드 단백질 분자 또는 이의 기능적 변이체(항체 단편, 폴리펩티드, 천연 수용체, 리간드 또는 표적 단백질에 친화성을 갖는 인공 재조합 단백질 도메인일 수 있음)일 수 있다; (2) 바이러스 소포체 상주 당단백질의 막횡단 도메인 또는 이의 기능적 변이체; (3) 바이러스 소포체 상주 당단백질의 세포질 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (4) 리소좀 리간드 도메인 또는 이의 기능적 변이체, 해당 리소좀 리간드는 폴리펩티드 또는 재조합 단백질일 수 있다. 선택적으로, 상기 표적 단백질 결합 도메인 또는 이의 기능적 변이체, 바이러스 소포체 상주 당단백질의 막횡단 도메인 또는 이의 기능적 변이체, 바이러스 소포체 상주 당단백질의 세포질 도메인 또는 이의 기능적 변이체, 및 리소좀 리간드 도메인 또는 이의 기능적 변이체 간에는 힌지 또는 링커에 의해 연결된다.
도 4C에서 표시된 바와 같이, ER-TPD 키메라 단백질 구조체 TBD-TMD-ERD-LL의 작동 메커니즘은 다음과 같다. [1] 특이적 결합 및 체류: TBD-TMD-ERD-LL 발현은 소포체 내막에 상주하고 표적 단백질 리간드를 표적으로 하여 표적 단백질과 결합하고 소포체에 체류하여 합성된 표적 단백질이 골지체로 수송되는 것을 방지한다. [2] 역전 수송: 키메라 단백질 구조체가 표적 단백질에 결합한 후, ERAD 메커니즘의 역전 수송기를 통해, 키메라 단백질 구조체와 표적 단백질에 의해 형성된 복합체를 소포체에서 세포질로 수송한다. [3] 리소좀 엔도시토시스 및 가수분해: 키메라 단백질 구조체는 리소좀 리간드 도메인을 통해 리소좀 분자 샤페론에 직접 결합하고 분자 샤프론을 통해 리소좀으로 수송되며, 리소좀에서는 다양한 가수분해 효소가 표적 단백질을 분해한다.
리소좀 리간드 도메인은 KFERQ 유사 모티프이거나 KFERQ 유사 모티프를 갖는 재조합 단백질 서열일 수 있고, KFERQ 유사 모티프는 분자 샤페론 Hsc70에 의해 특이적으로 인식되고 결합될 수 있으며, 분자 샤페론 매개 자가포식(Chaperone mediated Autophagy，CMA) 메커니즘을 통해 표적 단백질 ER-TPD 복합체가 리소좀으로 수송되어 다양한 가수분해 효소에 의해 분해되도록 한다.
분자 샤페론 매개 자가포식(Chaperone mediated Autophagy)은 선택적 단백질 자가포식 및 리소좀 분해 과정이다. 분자 샤페론 Hsc70은 표적 단백질의 KFERQ 유사 모티프를 인식하여 표적으로 하고, 리소좀 막의 수용체 단백질 LAMP2A를 인식하여 표적 단백질을 리소좀으로 수송하여 분해한다. 여기서, KFERQ 유사 모티프는, RNaseA에서 유래된 KFERQ일 수 있고(Backer J et al.Regulation of catabolism of microinjected ribonuclease A requires the amino-terminal 20 amino acids.Proc Natl Acad Sci.1983；80:2166-2170)；Hsc70에서 유래한 QKILD(SEQ ID NO.124) 및 QRDKV(SEQ ID NO.125) 일 수 있고(Cuervo AM et al.Unique properties of lamp2a compared to other lamp2 isoforms.J Cell Sci.2000；113(Pt 24):4441-4450)；hemoglobin에서 유래한 QRFFE(SEQ ID NO.126)일 수 있고(Slot LA et al.Intracellular protein degradation in serum-deprived human fibroblasts.Journal of Biochemistry.1986；237:491-498)；알돌라제B에서 유래한 QKKEL(SEQ ID NO.127), QFREL(SEQ ID NO.128) 및 IKLDQ(SEQ ID NO.129)일 수 있고；Annexin I에서 유래한 EFLKQ(SEQ ID NO.130) 일 수 있고；Annexin II에서 유래한 QKVFD(SEQ ID NO.131) 일 수 있고；Annexin IV에서 유래한 QELLR(SEQ ID NO.132) 일 수 있고；Annexin VI에서 유래한 QEFIK(SEQ ID NO.133) 일 수 있고； 아스파르트산아미노기전달효소에서 유래한 RKVEQ(SEQ ID NO.134) 일 수 있고；c-fos에서 유래한 NLLKE 일 수 있고；GAPDH에서 유래한 NRVVD(SEQ ID NO.135) 일 수 있고；글루타티온전달효소에서 유래한 NKKFE(SEQ ID NO.136) 일 수 있고；IκB에서 유래한 VKELQ(SEQ ID NO.137) 일 수 있고 ；α-2-마이크로글로불린에서 유래한 VDKLN(SEQ ID NO.138) 및 RIKEN(SEQ ID NO.139) 일 수 있고；Pax-2에서 유래한 DVVRQ(SEQ ID NO.140), QRIVE(SEQ ID NO.141) 및 QLLRE(SEQ ID NO.142) 일 수 있고；26S proteasome(C8)에서 유래한 IEKLQ(SEQ ID NO.143) 일 수 있고；19S프로테아좀(PA28)에서 유래한 QEKVF(SEQ ID NO.144) 일 수 있고；피루브산키나아제에서 유래한 QDLKF(SEQ ID NO.145) 일 수 있고；α-synuclein에서 유래한 VKKDQ(SEQ ID NO.146) 일 수 있다(Massey AC.et al.Chaperone-Mediated Autophagy in Aging and Disease.Current Topics in Developmental Biology,2006；73:205-235).
1.5 E3 유비퀴틴 리가제 및 리소좀 리간드 도메인을 갖는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체
일부 실시예에서, E3 유비퀴틴 리가제 리간드 및 리소좀 리간드 조합을 갖는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체 TBD-TMD-ERD-E3L-LL이 사용되며, 이의 선형 개략도 및 구조 개략도는 각각 도 5A 및 도 5B에 도시되어 있고, 이는 5개의 도메인을 포함한다. (1) 표적 단백질 결합 도메인 또는 이의 기능적 변이체, 이는 표적 친화성 리간드 단백질 분자 또는 이의 기능적 변이체(항체 단편, 폴리펩티드, 천연 수용체, 리간드 또는 표적 단백질에 친화성을 갖는 인공 재조합 단백질 도메인일 수 있음)일 수 있다; (2) 바이러스 소포체 상주 당단백질의 막횡단 도메인 또는 이의 기능적 변이체; (3) 바이러스 소포체 상주 당단백질의 세포질 도메인 또는 이의 기능적 변이체; (4) E3 유비퀴틴 리가제 리간드 또는 이의 기능적 변이체(ligand for E3ligase，E3L) 및 (5) 리소좀 리간드 또는 그 기능적 변이체(Ligand for lysosome)이다. 선택적으로, 상기 표적 단백질 결합 도메인 또는 이의 기능적 변이체, 바이러스 소포체 상주 당단백질의 막횡단 도메인 또는 이의 기능적 변이체, 바이러스 소포체 상주 당단백질의 세포질 도메인 또는 이의 기능적 변이체, 및 E3 유비퀴틴 리가제 리간드 도메인 또는 이의 기능적 변이체 간에는 힌지 또는 링커에 의해 연결된다.
도 5C에서 표시된 바와 같이, ER-TPD 키메라 단백질 구조체 TBD-TMD-ERD-E3L-LL의 작동 메커니즘은 다음과 같다. [1] 특이적 결합 및 체류: 키메라 단백질 구조체가 발현된 후 TBD-TMD-ERD-E3L-LL가 소포체에 상주하고, 표적　도메인을　통해　표적　단백질에　결합하고　표적　단백질이　소포체에　체류하여　합성된　표적　단백질이　골지체로　수송되는　것을　방지한다. [2] 역전 수송: 키메라 단백질 구조체가 표적 단백질에 결합한 후, ERAD 메커니즘의 역전 수송기를 통해, 키메라 단백질 구조체와 표적 단백질에 의해 형성된 복합체를 소포체에서 세포질로 수송한다. [3] 리소좀 엔도시토시스 및 효소 분해, 및 유비퀴틴화/프로테아좀 분해: 키메라 단백질 구조체는 소포체 외부로 수송되고 리소좀 리간드 도메인을 통해 리소좀 분자 샤페론에 직접 결합하고, 분자 샤페론을 통해 리소좀으로 수송되며, 리소좀에서 다양한 가수분해효소가 표적 단백질을 분해한다. 동시에, 키메라 단백질의 일부가 소포체 외부로 수송되고, 키메라 단백질 구조체의 E3 리가제 리간드는 E3 리가제 복합체에 결합하고, 복합체의 E2 유비퀴틴 결합 효소를 통해 표적 단백질을 유비퀴틴화한 다음 분해를 위해 프로테아좀으로 수송할 수 있다.
실시예 2: TCR을 표적으로 하는 ER-TPD 키메라 핵산 구조체의 설계
본 실시예에서는 TCR을 표적으로 하는 두 가지 ER-TPD 키메라 핵산 구조체 TCR-ER-TPD를 설계했다.
일부 실시예에서, 도 6에 표시된 바와 같이, 단일 렌티바이러스 발현 벡터와 EF1α 프로모터를 사용하여 TCR을 표적으로 하는 두 가지 ER-TPD 키메라 단백질 구조체 TCR-ER-TPD를 설계했다.
(A)TCR-TPD1：anti-TCR-E3/19K TMD-ERD-P2A-EGFRt(도6A)
(B)TCR-TPD2：anti-TCR-E3/19K TMD-ERD-G4S-E3L-P2A-EGFRt(도6B)。
실시예 3: TCR을 표적으로 하는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체의 발현 플라스미드의 제조
실시예 2에서 설계된 TCR을 표적으로 하는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체 TCR-ER-TPD(TCR-TPD1 및 TCR-TPD2)의 인코딩 뉴클레오티드 서열의 전체 유전자 합성, 여기서 TCR-TPD1의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.160에 표시된 바와 같고, 이의 인코딩된 단백질은 SEQ ID NO.161에 표시되어 있으며, TCR-TPD2의 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO.162에 표시된 바와 같고, 이의 인코딩된 단백질은 SEQ ID NO.163에 표시되어 있다. 분자 클로닝을 통해 TCR-TPD1의 뉴클레오티드 서열과 TCR-TPD2의 뉴클레오티드 서열을 각각 렌티바이러스 벡터 pCDH-CMV-MCS-EF1α-Puro(유바오 바이오텍에서 구매)에 연결하여 TCR-ER-TPD 렌티바이러스 표적 벡터를 구축하고, 시퀀싱을 통해 정확한지 확인 후, DH5α 컴피턴트 세포(Thermo Fisher)를 플라스미드로 형질전환하고, 단일 콜로니를 골라 대규모로 배양 후, 플라스미드 추출 키트 PureLinkTM HiPure Plasmid Maxiprep Kit(Thermo Fisher)를 이용하여 플라스미드 생산 및 정제하여, TCR-ER-TPD 렌티바이러스 플라스미드, 즉 TCR-TPD1 렌티바이러스 플라스미드 및 TCR-TPD2 렌티바이러스 플라스미드를 얻는다.
실시예 4: TCR을 표적으로 하는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체의 바이러스 제조
실시예 3에서 얻는 TCR-ER-TPD 렌티바이러스 플라스미드와 패키징 플라스미드 psPAX2및 pMD2.G(Addgene에서 구입, Cat# 12259&12260)에 1.64pmol: 1.3pmol: 0.72pmol의 비율로 폴리에틸렌이민 형질감염 시약(408727, 시그마)를 사용하여 DNA: μg PEI=1:3의 비율로 형질감염시켜, 공동 형질감염된 293T 세포(ATCC 제공, Cat# CRL3216TM)를 얻는다. 상세한 패키징 플라스미드 제조 방법은 PureLink™ HiPure Plasmid Maxiprep Kit (K210006, Thermo)의 설명서를 참고하고; 상세한 형질감염 작업 절차는 Sigma 형질감염 설명서를 참고한다. 형질감염 16시간 후, 배양 배지를 완전 배지로 교체한다(Life Technologies에서 구입, Cat# 11995-065). 24시간, 48시간 및 72시간 배양 후, 렌티바이러스가 포함된 상청액을 수집하고, 결합 및 -80℃, 3000rpm에서 10-15분간 원심분리한 후 0.45μm 필터막을 통해 여과하고 마지막으로 25000rpm, 4°C에서 2~3시간 동안 초원심분리하여 바이러스를 농축시켜 렌티바이러스 농축액을 수집한다. TCR-ER-TPD 렌티바이러스(TCR-TPD1 렌티바이러스 또는 TCR-TPD2 렌티바이러스)의 농축액을 수집하여 -80°C에서 보관한다.
실시예 5: TCRER-TPD Jurkat 세포의 제조
회복된 Jurkat 세포를 5% FBS가 보충된 RMPI 1640 배지에서 배양하고, 37°C 및 5% CO2 인큐베이터에서 배양하고, 2~3일마다 용액을 교체하고, 세포 밀도를 1×106 단일 세포/ml로 유지한 후 세포 상태가 회복되면, 실시예 4에서 제조된 TCR-ER-TPD 렌티바이러스 플라스미드를 적재한 렌티바이러스로 회복된 세포를 형질감염시킨다. 구체적인 단계는 다음과 같다: Jurkat 세포를 0.5×106 단일 세포/ml 농도로 희석하고 24웰 플레이트에 펼쳐 놓고, 실시예 4에서 제조한 TCR-TPD1 렌티바이러스 및 TCR-TPD2 렌티바이러스 농축액을 취하여 MOI=1의 값에 따라 세포에 바이러스 용액을 추가하고, Polybrene 5μg/ml를 추가하고 평각 원심분리기에 넣은 다음 저속(500g-1000g/min)으로 30~60분 동안 원심분리하고, 37°C의 인큐베이터에서 배양하고, 감염 후 48시간 후에 TCRER-TPD를 발현하는Jurkat 세포(TCRER-TPD Jurkat 세포)를 얻은 다음 유세포 분석법으로 세포 표현형을 측정한다. 표현형 측정과 세포 기능 실험은 각각 96시간과 6일간 추가 배양한 후 수행할 수 있다.
실시예 6: ER-TPD 형질감염된 세포의 표현형 측정
유세포 분석은 실시예 5에서 제조된 TCR ER-TPD Jurkat 세포에 대해 수행된다. 도 7은 48h(A), 96h(B) 및 6일(C)에서 TCRER-TPD Jurkat 세포의 세포 표현형 측정 결과를 보여준다. 세포 배양 및 유세포 분석 과정에서 형질감염되지 않은 Jurkat 세포 5 x 105 개와 TCR-ER-TPD 렌티바이러스 형질감염 벡터가 형질감염된 Jurkat 세포를 각각 배양하고 항체 CD8-Pacific Blue, CD4-APC, EGFR-PE, TCR-αβ-APC-Cy7 (모든 항체는 Biolegend에서 구입)로 처리하여 염색 한 후 유세포 분석기 (BD FACSCanto II)로 세포 표현형을 측정을 한다. 그 결과, (A) 48시간 배양 후, 형질감염되지 않은 Jurkat 세포는 TCR-αβ를 발현했지만 EGFR은 발현하지 않았고; TCR-TPD1 렌티바이러스 형질감염으로 변형된 Jurkat 세포에서는 EGFR이 높게 발현되었고; 세포막에서 발현 수준이 감소하면서 TCR-αβ가 분해되기 시작했다; TCR-TPD2 렌티바이러스 형질감염에 의해 변형된 Jurkat 세포에서 EGFR은 고도로 발현되었고, 세포막에서 TCR-αβ의 발현 수준 감소는 TCR-TPD1 렌티바이러스를 감염시킨 세포보다 유의하게 높았다; (B) 96시간 배양 후, TPD 바이러스를 형질감염시킨 두 Jurkat 세포 모두에서 세포 표면의 TCR이 감소하였고, TCR-TPD2의 경우 TCR 발현 수준의 감소는 TCR-TPD1 렌티 바이러스를 형질감염시킨 세포보다 유의하게 낮았다; (C) 배양 6일 후, TPD 바이러스를 형질감염시킨 두 Jurkat 세포 모두에서 세포 표면의 TCR이 감소했으며, TCR-TPD2의 경우 TCR-TPD1 렌티바이러스를 형질감염시킨 세포에 비해 TCR 발현 수준의 감소가 현저히 낮았다.
실시예 7: HLA를 표적으로 하는 ER-TPD 키메라 핵산 구조체의 설계
본 실시예에서는 HLA를 표적으로 하는 ER-TPD 키메라 핵산 구조체를 설계하였다.
일부 실시예에서, 도 6과 같이 단일 렌티바이러스 발현 벡터와 EF1α 프로모터를 사용하여 3종의 발현 벡터를 설계했다:
(A)CNK：DAP10-CD3ζ-T2A-NKG2D(도 8A)；
(B)HLA-TPD：E3/19K-E3L(도 8B)；
(C)CNK-HLA-TPD：DAP10-CD3ζ-T2A-NKG2D-p2A-E3/19K-E3L(도 8C).
여기서, HLA-TPD는 HLA를 표적으로 하는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체 HLA-ER-TPD이고 CNK-HLA-TPD는 HLA를 표적으로 하는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체 CNK-HLA-ER-TPD이다.
실시예 8: HLA를 표적으로 하는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체의 발현 플라스미드 제조
실시예 7에서 설계된 HLA를 표적으로 하는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체의 인코딩 뉴클레오티드 서열(E3/19K-E3L의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.164에 표시되어 있고, 이의 인코딩된 단백질은 SEQ ID NO.165에 표시되어 있으며, DAP10-CD3ζ-T2A-NKG2D-p2A-E3/19K-E3L의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.166에 표시되어 있으며, 이의 인코딩된 단백질은 SEQ ID NO.167에 표시되어 있다)의 전체 유전자 합성, 실시예 7에서 설계된 CNK의 뉴클레오티드 서열(이의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.168에 표시되어 있고, 인코딩된 단백질은 SEQ ID NO.169에 표시되어 있다)의 전체 유전자 합성. HLA 을 표적으로 하는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체의 인코딩 뉴클레오티드 서열과 CNK의 뉴클레오티드 서열을 각각 분자 클로닝을 통해 렌티바이러스 벡터 pCDH-CMV-MCS-EF1α-Puro(유바오 바이오테크에서 구입)에 연결하여 HLA-TPD 렌티바이러스 표적 벡터, CNK-HLA-TPD 렌티바이러스 표적 벡터 및 CNK 렌티바이러스 표적 벡터를 구축한다. 시퀀싱을 통해 정확한지 확인 후, DH5α 컴피턴트 세포(Thermo Fisher)를 플라스미드로 형질전환하고, 단일 콜로니를 선택하고 대규모로 배양 후, 플라스미드 추출 키트 PureLinkTM HiPure Plasmid Maxiprep Kit(Thermo Fisher)를 이용하여 플라스미드 생산 및 정제시켜, TCR-ER-TPD 렌티바이러스 플라스미드(HLA-TPD 렌티바이러스 플라스미드, CNK-HLA-TPD 렌티바이러스 플라스미드) 및 CNK 렌티바이러스 플라스미드를 얻는다.
실시예 9: HLA를 표적으로 하는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체의 바이러스 제조
실시예 8에서 얻는 TCR-ER-TPD 렌티바이러스 플라스미드 및 CNK 렌티바이러스 플라스미드와 패키징 플라스미드 psPAX2및 pMD2.G(Addgene에서 구입, Cat# 12259&12260)에 1.64pmol: 1.3pmol: 0.72pmol의 비율로 폴리에틸렌이민 형질감염　시약(408727, Sigma)을 사용하여 DNA: μg PEI=1:3의 비율로 형질감염시켜, 공동 형질감염된 293T 세포(ATCC 제공, Cat# CRL3216TM)를 얻는다. 상세한 패키징 플라스미드 제조 방법은 PureLink™ HiPure Plasmid Maxiprep Kit (K210006, Thermo)의 설명서를 참고하고; 상세한 형질감염 작업 절차는 Sigma형질감염 설명서를 참고한다. 형질감염 16시간 후, 배양 배지를 완전 배지로 교체한다(Life Technologies에서 구입, Cat# 11995-065). 24시간, 48시간 및 72시간 배양 후, 렌티바이러스가 포함된 상청액을 수집하고, 결합 및 -80℃, 3000rpm에서 10~15분간 원심분리한 후 0.45μm 필터막을 통해 여과하고 마지막으로 25000rpm, 4°C에서 2~3시간 동안 초원심분리하여 렌티바이러스 농축액을 수집한다. HLA-TPD 렌티바이러스, CNK-HLA-TPD 렌티바이러스 및 CNK 렌티바이러스의 농축액을 수집하고 수집한 렌티바이러스를 -80°C에서 보관한다.
실시예 10: HLAER-TPD293 세포의 제조
회복된 293 세포를 5% FBS가 보충된 DMEM 배지에서 배양하고, 37°C 및 5% CO2 인큐베이터에서 배양하고, 2~3일마다 용액을 교체하고, 세포 밀도를 80% 유지한 후 세포 상태가 회복되면, 실시예 9에서 제조된 렌티바이러스로 회복된 세포를 형질감염시킨다. 구체적인 단계는 다음과 같다: 298T 세포를 0.5×106 단일 세포/ml 농도로 희석하고 24웰 플레이트에 펼쳐 놓고, 실시예 9에서 제조한 렌티바이러스 농축액을 취하여 MOI=1의 값에 따라 세포에 바이러스 용액을 추가하고, Polybrene 5μg/ml를 추가하고 평각 원심분리기에 넣은 다음 저속(500g-1000g/min)으로 30~60분 동안 원심분리하고, 37°C의 인큐베이터에서 배양하고, 감염 후 48시간 후에 CNK, HLA-TPD 및 CNK-HLA-TPD를 발현하는 293T 세포를 얻은 다음 유세포 분석법으로 세포 표현형을 측정한다.
도 9는 CNK 발현 벡터와 결합된 HLA-abc 를 표적으로 하는 ER-TPD 키메라 핵산 구조체로 형질감염된 293 세포의 세포 표현형 분석에 대한 48시간 유세포 분석 결과를 보여준다. 배양된 293T 세포를 각각 바이러스로 형질감염시킨다: (1) CNK 렌티바이러스(DAP10-CD3ζ-T2A-NKG2D); (2) HLA-TPD 렌티바이러스(E3/19K-E3L); 및 (3) CNK-HLA-TPD 렌티바이러스(DAP10-CD3ζ-T2A-NKG2D-p2A-E3/19K-E3L)를 형질감염시켰고 형질감염되지 않은 세포는 대조군으로 사용한다. 바이러스 형질감염 48시간 후, 5 x 105개의 형질감염 되지 않은 세포와 바이러스 형질감염 세포를 항체 HLA-abc-FITC, NKG2D-PE-Cy7(모든 항체는 Biolegend에서 구입)로 처리하여 염색한 후 유세포 분석기(BD FACSCanto II)로 세포 표현형을 분석을 진행한다. 그 결과, 형질감염되지 않은 293 세포는 HLA-abc를 발현하지만 NKG2D를 발현하지 않는 것으로 나타난다. (1) CNK 렌티바이러스로 형질감염된 293T 세포는 동시에 HLA-abc와 NKG2D를 모두 발현한다; (2) HLA-TPD 렌티바이러스로 형질감염된 293T 세포는 HLA-abc와 NKG2D를 모두 발현하지 않는다; (3) CNK-HLA-TPD 렌티바이러스로 형질감염된 293T 세포는 HLA-abc를 발현하지 않지만 NKG2D를 발현한다.
실시예 11: CD123을 표적으로 하는 ER-TPD 키메라 핵산 구조체의 설계
본 실시예는 CD123을 표적으로 하는 ER-TPD 키메라 핵산 구조체를 설계했다.
일부 실시예에서는 도 10과 같이 단일 렌티바이러스 발현 벡터와 EF1α 프로모터를 사용하여 CD123을 표적으로 하는 anti-CD123scFv-E3L을 발현하는 ER-TPD 키메라 핵산 구조체를 설계했다.
실시예 12: CD123을 표적으로 하는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체의 발현 플라스미드의 제조
실시예 11에서 설계된 CD123을 표적으로 하는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체의 인코딩 뉴클레오티드 서열(anti-CD123scFv-E3L의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.170에 표시되고, 이의 인코딩된 단백질은 SEQ ID NO.171에 표시되어 있다)의 전체 유전자 분석, 분자 클로닝에 의해 렌티바이러스 벡터 pCDH-CMV-MCS-EF1α-Puro(유바오 생물에서 구입)에 연결하여 CD123-ER-TPD 렌티바이러스 표적 벡터를 구축하고, 시퀀싱을 통해 정확한지 확인 후, DH5α 컴피턴트 세포(Thermo Fisher)를 플라스미드로 형질전환하고, 단일 클론 콜로니를 선택하고 대규모 배양 후 플라스미드 추출 키트 PureLinkTM HiPure Plasmid Maxiprep Kit(Thermo Fisher)를 이용하여 플라스미드 생산 및 정제하여 CD 123R-PD를 렌티바이러스 플라스미드를 얻는다.
실시예 13: CD123을 표적으로 하는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체의 바이러스 제조
실시예 12에서 얻는 CD123 ER-TPD 렌티바이러스와 패키징 플라스미드 psPAX2및 pMD2.G(Addgene에서 구입, Cat# 12259&12260)에 1.64pmol: 1.3pmol: 0.72pmol의 비율로 폴리에틸렌이민 형질감염 시약(408727, Sigma)을 사용하여 DNA: μg PEI=1:3의 비율로 형질감염시켜, 공동 형질감염된 293T 세포(ATCC 제공, Cat# CRL3216TM)를 얻는다. 상세한 패키징 플라스미드 제조 방법은 PureLink™ HiPure Plasmid Maxiprep Kit (K210006, Thermo)의 설명서를 참고하고; 상세한 형질감염 작업 절차는 Sigma형질감염 설명서를 참고한다. 형질감염 16시간 후, 배양 배지를 완전 배지로 교체한다(Life Technologies에서 구입, Cat# 11995-065). 24시간, 48시간 및 72시간 배양 후, 렌티바이러스가 포함된 상청액을 수집하고, 결합 및 -80℃, 3000rpm에서 10~15분간 원심분리한 후 0.45μm 필터막을 통해 여과하고 마지막으로 25000rpm, 4°C에서 2~3시간 동안 초원심분리하여 렌티바이러스 농축액을 수집한다. CD123-ER-TPD 렌티바이러스의 농축액을 수집하고 수집한 렌티바이러스를 -80°C에서 보관한다.
실시예 14: CD123을 표적으로 하는 ER-TPD THP1 세포의 제조
회복된 THP1 세포를 5% FBS가 보충된 RMPI1640 배지에서 배양하고, 37°C 및 5% CO2 인큐베이터에서 배양하고, 2~3일마다 용액을 교체하고, 세포 밀도를 1×106 단일 세포/ml로 유지한 후 세포 상태가 회복되면, 실시예 4에서 제조된 CD123-ER-TPD 렌티바이러스로 회복된 세포를 형질감염시킨다. 구체적인 단계는 다음과 같다: THP1 세포를 0.5×106 단일 세포/ml 농도로 희석하고 24웰 플레이트에 펼쳐 놓고, 실시예 13에서 제조한 렌티바이러스 농축액을 취하여 MOI=0.5 또는 1의 값에 따라 세포에 바이러스 용액을 추가하고, Polybrene 5μg/ml를 추가하고 평각 원심분리기에 넣은 다음 저속(500g-1000g/min)으로 30~60분 동안 원심분리하고, 37°C의 인큐베이터에서 배양하고, 감염 후 48시간 후에 CD123 ER-TPD THP1 세포를 발현한 후 유세포 분석법으로 세포 표현형을 측정한다.
도 11은 실시예 13에서 CD123를 표적으로 하는 scFv TPD 렌티바이러스에 대한 급성 골수성 백혈병 세포주 THP1 세포의 48시간 표현형 유세포분석 결과를 보여준다. RPMI 배지에서 배양된 THP1 세포를 바이러스 (1) anti-CD123 ERD-E3L MOI=0.5; (2) anti-CD123 ERD-E3L MOI=1; 로 형질감염시키고, 바이러스를 형질감염시키지 않은 세포를 대조군으로 사용한다. 바이러스 형질감염 48시간 후, 형질감염되지 않은 바이러스 벡터의 THP1 세포 5×105개를 채취하여 항체 CD14-FITC, CD33-APC-Cy7, CD123-PE-Cy7(모든 항체는 Biolegend에서 구입)으로 염색한 후 유세포 분석기(BDFACS Canto II)를 사용하여 세포 표현형을 분석한다. 그 결과는 형질감염되지 않은 THP1 세포가 CD14, CD33 및 CD123을 높게 발현하고, (1) anti-CD123 ERD-E3L MOI=0.5로 형질감염시킨 THP1 세포의 CD14 및 CD33의 발현은 변하지 않았고, CD123의 발현은 현저하게 감소했으며, (2) anti-CD123 ERD-E3L MOI=1로 형질감염시킨 THP1 세포의 CD14 및 CD33의 발현은 변하지 않았고 CD123의 발현은 현저하게 감소되였다.
실시예 15: CD123을 표적으로 하는 ER-TPD-CD123 CAR-T 세포의 응용
CD123은 급성 골수성 백혈병 AML의 매우 중요한 표적으로 CD123 CAR-T 세포를 표적으로 삼을 수 있지만(도 12A1) CD123은 활성화된 T 세포에서도 발현되므로(도 12B1) 표적 CD123 CAR-T 세포는 활성화세포의 배양 및 종양 세포 사멸을 하는 과정에서 자살 효과(도 12C1)를 일으켜 세포 증식이 어렵고 임상 치료 효과가 좋지 않게 된다.
CD123 CAR-T-T2A-CD123 ER-TPD 키메라 단백질 구조체(도 12A2)는 본 공개의 ER-TPD 기술을 통해 설계될 수 있으며, 자체로 발현된 CD123을 효율적으로 분해할 수 있어(도 12B2), 양호한 세포 증식을 보장하고 보다 정밀한 종양 세포 사멸을 달성할 수 있다(도 12C2). T세포의 자가항원을 표적으로 하는 CAR-T와 ER-TPD 기술을 결합하여 자가항원의 방향성 분해를 실현하고, 동일한 항원을 표적으로 하는 CAR과 ER-TPD는 동일한 벡터에 구성하여 T세포를 한번에 변형시킬 수 있으며, 동시에 자가항원의 분해와 CAR의 표적기능을 완성할 수 있으며, 형질감염된 세포는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체를 통해 항원을 방향성 분해하고 형질감염 되지 않는 세포는 이 항원을 발현하기 때문에 형질감염된 CAR-T 세포는 형질감염되지 않은 세포의 특이적 제거를 실현하고, 배양 과정에서 세포의 순도를 자연적으로 향상시킬 수 있으며 우속 정제 및 스크리닝 작업을 피할수 있으며 대규모 생생의 효율을 크게 향상시킨다. 또한 ER-TPD 기술은 기존의 Crispr/cas9 기술에 비해 비용이 저렴하고 효율이 높으며 대규모 제조가 가능하며 염색체의 불안정성이나 표적 이탈 효과로 인한 유전자 편집의 부작용이 없으므로 CAR/ER-TPD-T 세포의 기능과 활력이 더 유리하다. 이 결합된 CAR/ER-TPD 기술은 임상적 문제를 잘 해결할 수 있으며, 자살 효과를 유발하지 않으면서도 CAR-T가 T 세포에서 특이적으로 발현되는 표적(예: CD4, CD5, CD7, CD38, CD123)에 적용될 수 있도록 한다. 예를 들어, T 림프모구 백혈병(예: 급성 T 림프모구 백혈병(T-ALL) 또는 만성 T 림프모구 백혈병(T-CLL), T 과립구 백혈병(T-PLL), 거대 과립구 백혈병(LGLL), 골수성 백혈병(급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML))), HIV 감염, 바이러스에 감염된 CD4 T 세포 제거를 위해 사용할 수 있다.
실시예 16: 신경퇴행성 질병인 알츠하이머병에서 Tau/Aβ를 표적으로 하는 ER-TPD mRNA의 응용
세포에 축적된 Tau, β-아밀로이드(Aβ)는 알츠하이머병(AD) 및 관련 타우병의 상징적인 병리학적 특성이므로 Tau를 표적으로 하면 약물 개발을 촉진할 수 있다. 과인산화된 Tau(p-tau)의 세포내 축적과 β-아밀로이드(Aβ)의 세포외 침전은 알츠하이머병(AD) 뇌의 대표적인 병리학적 특징이다. 지난 수십 년 동안 AD 약물 개발은 주로 Aβ에 초점을 맞추었다. 따라서, β-/γ-분비효소 억제제에 의한 Aβ 생성 감소, Aβ 분해 촉진 또는 항체 제거와 같은 다양한 표적 Aβ 치료법이 개발 및 테스트되었다. 안타깝게도 지금까지 Aβ를 표적으로 하는 이러한 전략의 임상 효과는 모두 만족하지 않았다. 따라서 Tau를 표적으로 하는 것은 AD 치료를 위한 중요한 전략이다. 현재 뇌 세포에서 Tau를 표적 분해하는 약물은 PROTAC 기술을 기반으로 개발되었지만 분자가 세포에 효과적으로 진입할 수 없는 경우가 많기 때문에 임상 효과가 분명하지 않다. 그러나, 본 공개의 ER-TPD 기술을 사용하여 Tau 및 β-아밀로이드(Aβ)를 표적으로 하는 ER-TPD 키메라 단백질 구조제를 인코딩하는 mRNA oreRNA(endless cyclic RNA)를 개발하고, 신경세포를 표적으로 하는 리포솜(LNP) 또는 나노입자(NP)를 사용하여 신경세포로 전달하고, Tau 및/또는 β-아밀로이드 단백질을 표적으로 하는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체를 안정적으로 발현하고, Tau 및 β-아밀로이드 단백질의 효율적인 분해를 실현하여 신경 세포의 퇴행성 변성을 효과적으로 보호하고 알츠하이머병의 진행을 제어한다.
실시예 17: HBV 만성간염 치료에서 HBx를 표적으로 하는 ER-TPD DNA의 응용
간세포암종(HCC)은 현대 세계에서 암으로 인한 사망의 주요 원인 중 하나이며 대부분의 경우 만성 B형 간염 바이러스(HBV) 감염과 관련이 있다. HBV 인코딩 X 단백질(HBx)은 바이러스성 HCC의 발병기전에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. HBx는 세포 생존, 세포 주기 진행, DNA 복구, 침입 및 단백질 분해와 관련된 다양한 세포 및 바이러스 유전자의 발현을 조절하고 다양한 신호 경로(예: Ras/Raf/MAPK, PI3K/Akt, NF-κB 및 JNK)를 조절하는 다기능 단백질이다. 본 공개의 ER-TPD 기술을 이용하여 HBxER-TPD 키메라 단백질 구조체를 표적으로 하는 트랜스포존 DNA를 설계하고, 간세포를 표적으로 하는 리포솜 또는 나노입자를 이용하여 간세포로 전달하고, 통합을 실현하고, HBxER-TPD 키메라 단백질 구조체를 장기간 발현하여 HBV 발암성 기능 단백질 HBx의 장기 분해를 실현하여 HBV의 증폭을 효과적으로 방지하고, HBx로 인한 세포병변 및 진행성 암의 과정을 제거할 수 있다.
실시예 18: HBV 만성 간염 치료에서 HBV DNA Polymerase를 표적으로 하는 ER-TPD DNA의 응용
HBV DNA 폴리메라아제: B형 간염 바이러스(HBV) 폴리메라아제는 RNA 의존성 및 DNA 의존성 폴리메라아제 기능과 리보뉴클레아제 H 기능을 갖는 다기능 효소이다. HBV pre-게놈 RNA(pgRNA)에 작용하여 역전사하여 새로운 캡시드 내에서 새로운 rcDNA 분자를 형성한다. B형 간염 바이러스 DNA 폴리메라아제는 HBV 바이러스 캡시드의 핵심 구성 요소이다. ER-TPD 기술을 기반으로 HBV DNA Polymerase -표적 ER-TPD 키메라 단백질 구조체의 트랜스포존 DNA를 설계할 수 있으며, 간세포를 표적으로 하는 리포솜 또는 나노입자를 사용하여 간세포로 전달하고 통합을 실현하고, HBV DNA Polymerase -표적 ER-TPD 키메라 단백질 구조체를 장기간 발현하여 HBV DNA Polymerase의 효율적인 분해를 실현하여 HBV 감염 통합 게놈의 복제를 직접 억제하고, HBV 구축 및 포장을 차단하여 HBV 유전자를 완전히 침묵시킨다.
실시예 19: HIV 감염 치료에서 HIV RNA 역전사 효소를 표적으로 하는 ER-TPD DNA의 응용
HIV는 숙주 세포를 감염시키기 위해 단일 가닥 RNA 게놈을 역전사 효소에 의해 이중 가닥 DNA 사본으로 역전사하고 이 사본을 숙주 염색체에 통합해야 하는 단일 가닥 RNA 바이러스이다. 따라서, HIV RNA 역전사 효소를 표적으로 하는 것은 활성 HIV의 포장 및 통합을 효과적으로 제어할 수 있다. 본 공개의 ER-TPD 기술을 기반으로 HIV-1 역전사 효소를 표적으로 하는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체의 트랜스포존 DNA를 설계하고, CD4+ 세포를 표적으로 하는 리포솜 또는 나노입자를 사용하여 CD4+ 세포로 전달하고, 통합을 실현하고, HIV-1 역전사 효소-표적 ER-TPD 키메라 단백질 구조체를 장기간 발현하여 HIV-1 역전사 효소의 방향성 분해를 달성하여 HIV 감염 통합 게놈 후 바이러스 조립을 직접 억제하여 HIV 유전자의 침묵을 직접 실현한다.
실시예 20: 종양 치료에서 Bcl-2를 표적으로 하는 ER-TPD DNA의 응용
세포 자멸사는 종양의 발생, 발달 및 약물 내성 생성에 중요한 역할을 한다. Bcl-2 계열의 발현 및 조절은 종양 세포의 세포 자멸사에 더 큰 영향을 미치며 원암 유전자 ras의 작용과 협력하여 세포를 악성 변형시켜 종양 성장을 촉진할 수 있다. 위장 종양, 림프종, 신경모세포종 및 방광암과 같은 많은 인간 종양은 Bcl-2 및(또는) Bcl-xL의 과발현을 가지고 있다. Bcl-2의 높은 발현은 세포 사멸을 억제하고 세포 성장을 가속화하며 악성 종양을 유발할 수 있다.
Bcl-2 단백질의 과발현은 또한 비고형 종양에서 더 일반적이다. Bcl-2는 만성 림프구성 백혈병(CLL), 여포형 림프종(FL), 외투세포 림프종(MCL) 및 발덴스트룀 마크로글로불린혈증(WM)에서 모두 높은 발현을 나타난다. 따라서 항-세포사멸 단백질 Bcl-2는 종양 치료 분야에서 새로운 약물 표적이 된다. Bcl-2 항-세포사멸 구성원은 보존적이고 상동성이 높은 BH1 및 BH2 모티프를 갖는 Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w를 포함하는 Bcl-2 항-세포사멸 가족 구성원에 대한 광범위한 결합 항체 서열을 스크리닝할 수 있으며 ER-TPD 기술을 기반으로 하는 ER-TPD 키메라 핵산 구조체를 설계한다. 이 키메라 핵산 구조체를 종양 용해 바이러스에 로딩하여 Bcl-2를 표적으로 하는 ER-TPD 키메라 핵산 구조체를 로딩하는 종양 용해 바이러스를 얻는다. 종양 용해 바이러스는 종양 세포를 특이적으로 감염시키고 CMV와 같은 종양 용해 바이러스의 강력한 프로모터를 사용하여 Bcl-2 항세포자멸사 단백질을 표적으로 하는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체를 개시하여 Bcl-2 계열의 항세포자멸사 단백질의 효율적인 방향성 분해를 실현하고, 종양 항세포자멸사 메커니즘을 해제하고, 종양 세포자멸사를 직접 유발하며, 종양 용해 바이러스의 더 빠른 용해 세포 및 확산을 촉진하여 종양 세포를 죽이고 제거한다.
동일한 원리로 종양 용해 바이러스와와 결합하면 암 촉진 유전자 단백질의 ER-TPD를 직접 표적화 할 수 있으며, 예를 들어, 돌연변이 Kras 단백질 ER-TPD를 표적으로 하여 암 촉진 유전자 단백질을 분해할 수 있다.
실시예 21: 자가면역 질병 치료에서 자가항체를 표적으로 하는 ER-TPD 키메라 단백질 구조체의 응용
I형 당뇨병의 beta 세포 자가면역 마커에는 4가지 자가항체(autoantibody)가 포함한다. 섬세포 항체(ICA), 글루타메이트 탈탄산효소 항체(GAD-65), 인슐린 항체(IAA) 및 티로신 임산염 항체(IA-2A)가 포함되며 질병의 진단 마커이며 질병의 진행에 직접적인 영향을 미친다. 인슐린 항체는 일반적으로 소아 I형 당뇨병의 초기 위험 표지자로 소아 환자의 70%가 진단 시 인슐린 항체를 가지고 있으며 환자의 85%는 GAD65에 대한 항체를 가지고 있다. 임상적으로 이러한 자가항체를 개입하고 제거하는 것은 어렵다. ER-TPD 기술을 기반으로 인슐린 자가항체(IAA)를 표적으로 하는 ER-TPD 트랜스포존 DNA를 설계할 수 있으며, 혈장 세포를 표적으로 하는 리포솜 또는 나노 입자를 사용하여 혈장 세포로 전달하고 통합을 실현하고, IAAER-TPD 키메라 단백질 구조체를 장기간 발현하여 인슐린 항체의 장기 분해를 달성하고 말초 혈액에서 인슐린의 사용률을 증가시켜 당뇨병 과정을 효과적으로 예방할 수 있다. 도 13A와 같이 I형 당뇨병 환자의 형질 세포에서 인슐린 항체가 발현되어 인슐린에 결합하고 말초 혈액에서 인슐린을 제거하여 환자의 인슐린 사용률을 현저하게 감소시킨다; 도 13B는 인슐린 자가항체를 표적으로 하는 ER-TPD 트랜스포존 DNA, 형질세포를 표적으로 하는 리포솜을 이용하여 형질세포로 전달하고 통합을 실현하여 IAAER-TPD 키메라 단백질 구조체를 장기간 발현하고 소포체에서 섬세포 항체를 방향성 결합 및 분해하여 말초 혈액에서 인슐린의 정상적인 기능을 보장할 수 있다.
실시예 22: UT 요소 및 이의 유도체
TCRαβ 또는 HLA 분자 결합 분자, 바이러스 ER 상주 단백질의 하나 이상의 막횡단 및 세포질 도메인을 포함하는 예시적인 키메라 융합 단백질은 도 14에 설명되어 있다. 예를 들어, 도 14A에서 키메라 융합 단백질은 anti-TCRαβHLA 항체 단편 scFv, Hinge/linker(예: SEQ ID NO.172 IgG4 힌지; 및 SEQ ID NO.173 (Gly4Ser)2를 포함하며 HCMV US2(SEQ ID NO.174 및 SEQ ID NO.175)와 같은 ER 상주 당단백질의 막횡단 도메인 및 세포질 도메인과 융합된다. 예를 들어, 도 14B에서 키메라 융합 단백질에는 anti-TCRαβ 또는 HLA 항체 단편 scFv, Hinge/linker(예: SEQ ID NO.5.IgG4 힌지 및 SEQ ID NO.73(Gly4Ser) 2는 HCMV US2(SEQ ID NO.174 및 SEQ ID NO.175) 및 HCMV US3(SEQ ID NO.175 및 SEQ ID NO.176)와 같은 ER 상주 당단백질의 두 개 이상의 막횡단 도메인 및 세포질 도메인과 융합된다. 예를 들어, 도 14C에서 키메라 융합 단백질에는 anti-TCRαβ 또는 HLA 항체 단편 scFv, Hinge/linker(예: SEQ ID NO.5.IgG4 힌지 및 SEQ ID NO.73(Gly4Ser) 2는 HCMV US2(SEQ ID NO.174 및 SEQ ID NO.175) 및 HCMV US11(SEQ ID NO.174, NO.175, NO.177, NO.178)과 같은 다양한 ER 상주 당단백질의 막횡단 도메인 및 세포질 도메인의 재조합 모티프와 융합된다.
해당 UT 요소를 인코딩하는 핵/산 분자는 렌티바이러스 벡터에 클로닝된 다음 Jurkat 세포 또는 인간 T 세포에 형질도입한다.
실시예 23: 형질도입된 UT 요소는 Jurkat 세포에서 TCRαβ의 발현을 효과적으로 억제
UT 요소를 인코딩하는 예시적인 렌티바이러스 구조체를 설계하고, 이 구조체에는 HCMV US2 또는 HCMV US11 또는/및 아데노바이러스 E19의 막횡단 및 세포질 도메인에 융합된 anti-TCRαβ, T2A 자가분열 펩티드, 절단된 EGFR(anti-TCR-US2TM/CT-T2A-EGFRt；anti-TCR-1US1TM/CT-T2A-EGFRt；anti-TCR-E19 TM/CT-T2A-EGFRt；anti-TCR-US2-TM/CT-T2A-anti-TCR-E19 TM/CT-T2A-EGFRt로 명명됨)이 포함된다. DNA를 합성하고 pLentiCMV GFP-puro와 같은 렌티바이러스 벡터에 클로닝하고 psPAX 및 pMD2G와 같은 포장 벡터를 사용하여 293T 세포에서 렌티바이러스를 생성한다. Jurkat 세포를 RPMI, 10% 인간 혈청, 2mM L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(CTL 배지)에서 배양한 다음 0.8μg/mL 폴리브렌(Millipore, Bedford, Mass.)으로 보충된 렌티바이러스 상청액(도에서 표시한것과 같음)(MOI=3)으로 형질도입하고 세포를 유세포 분석기에 제출하여 Jurkat 세포에서 절단된 EGFR 및 TCRαβ의 발현을 점검한다(그림 15). 다음은 CD4-APC, CD8-퍼시픽 블루, TCR-ab-APC-Cy7, EGFR-PE(Biolegend) 등 유세포 계측 및 분석에 사용되는 복합의 항체이다. 프로피디움 요오드화물(PI, BD Biosciences)로 염색하고 제조업체의 지시에 따라 살아있는/죽은 세포를 구별한다. 흐름 분석은 FACS Canto II에서 수행되었고 분류 정제는 FACS Ariall(Becton Dickinson, Franklin Lakes, N.J.)에서 진행하고 FlowJo 소프트웨어(Treestar, Ashland, Oreg.)를 사용하여 데이터 분석한다. 결과를 보면 형질도입된 세포가 절단된 EGFR, CD8+ 및 CD4+ T 세포에서 TCRαβ를 유의하게 하향 조절한 반면, 비형질도입된 Jurkat 세포는 절단된 EGFR이 없을 때 높은 수준의 TCRαβ를 발현한다.
실시예 24: UT 요소의 강제 발현은 인간 T 세포에서 TCR의 발현을 효과적으로 억제
도 16A에서, UT 요소를 인코딩하는 예시적인 렌티바이러스 구조체는 HCMV US2에 융합된 막횡단 및 세포질 구조에 대한 anti-TCRαβ를 포함한다. anti-TCR-US2 TM/CT-T2A-EGFRt로 구성된 UT 요소를 설계하고 pLentiCMV GFP-puro와 같은 렌티바이러스 벡터에 클로닝하고 포장 벡터(psPAX 및 pMD2G와 같음)를 사용하여 293T 세포에서 렌티바이러스를 생산한다. 인간 CD8+ 및 CD4+는 CD3+ T 세포 분리 키트(Miltenyi Biotec)를 사용하여 정상 기증자의 PBMC에서 분리되었으며 제조업체의 지침에 따라 항-CD3/CD28 비드(Life Technologies)로 활성화하며, 0.8μg/mL 폴리벤젠(Millipore, Bedford, Mass)으로 보충된 렌티바이러스 상청액(실시예에 표시된 것과 같음)(MOI=3)을 사용하여 32°C에서 45분 동안 원심분리하여 활성화한 후 3일째에 RPMI, 10% 인간 혈청, 2mML-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(CTL 배지)에서 T 세포를 증폭하고 48시간마다 재조합 인간(rh) IL-2를 최종 농도 50U/mL로 보충한다. 증폭 12일 후, 각 형질도입된 T 세포주를 CD8- Pacific Blue, CD4-APC, TCR-ab-APC-Cy7, EGFR-PE(Biolegend)로 등분 염색한 다음 유세포 분석에 제출한다.
결과를 보면, 형질도입되지 않은 T 세포와 비교하여 형질도입된 T 세포(EGFR+)가 CD8+ 및 CD4+ 세포 표면 모두에서 TCRαβ 발현을 유의하게 하향 조절하는 것을 나타난다. 결국, anti-TCR-US2 TM/CT를 포함하는 US 요소는 인간 T 세포에서 TCRαβ의 발현을 효과적으로 억제할 수 있으며, 이는 다른 수용체에 주입된 후 생체 내 TCR 매개 GVHD를 억제할 수 있다.
도 16B에서, 아데노바이러스 E19에 융합된 막횡단 및 세포질 도메인에 융합된 anti-TCRαβ, T2A 자가분해 펩타이드 및 절단된 EGFRt로 구성된 UT 요소를 인코딩하는 예시적인 렌티바이러스 구조체(anti-TCR-E19 TM/CT-T2A-EGFRt를 명명함)를 벡터(예: pLenti CMV GFP-puro)에 클로닝하고 293T 세포에서 렌티바이러스를 생성하도록 설계한다. 인간 CD8+ 및 CD4+는 두 용량의 렌티바이러스 상청액(1x, 2x)으로 형질도입되었고 재조합 인간(rh) IL-2로 보충된 CTL 배지에서 증폭되었으며, 증폭 12일 후, 각 형질도입된 T 세포주를 CD8- Pacific Blue, CD4-APC, TCR-ab-APC-Cy7, EGFR-PE(Biolegend)로 등분 염색한 다음 유세포 분석에 제출한다.
결과를 보면, UT(E19) 형질도입된 T 세포(EGFR+)가 형질도입되지 않은 T 세포와 비교하여 CD8+ 및 CD4+ 세포 표면에서 TCRαβ의 발현을 효과적으로 차단할 수 있음을 나타난다. 형질도입된 바이러스의 용량을 증가시키면 TCRαβ 발현의 억제가 형질도입 효율과 세포에서 UT 요소의 복제 수가 증가함에 따라 크게 개선될 수 있다. 결국, anti-TCR-E19 TM/CT를 포함하는 US 요소는 인간 T 세포에서 TCRαβ의 발현을 효과적으로 억제할 수 있으며, 이는 또한 부동한 수용체에 주입된 후 생체 내 TCR 매개 GVHD를 억제할 수 있다.
실시예 25: UT 요소를 발현하는 CNK-T 세포의 표현형
도 17에서 CNK 서열, T2A 서열 및 아데노바이러스 E19에 융합된 anti-TCRαβ의 TM 및 CT 도메인으로 구성된 UT 요소를 인코딩하는 예시적인 렌티바이러스 구조체(CNK-UT-E19로 명명)를 설계하고, 이를 pLentiCMV GFP-puro와 같은 렌티바이러스 벡터에 클로닝하고 293T 세포에서 렌티바이러스를 생성한다. 인간 CD8+ 및 CD4+는 2개의 렌티바이러스 상청액으로 형질도입되었고 IL-2로 보충된 CTL 배지에서 증폭된다. 증폭 12일 후, 각 형질도입된 T 세포주를 CD8-Pacific Blue, CD4-APC, TCR-ab-APC-Cy7, NKG2D-PE-Cy7(Biolegend)로 등분 염색한 다음 유세포 분석에 제출한다. 결과를 보면 CNK-T 세포에 UT 요소를 추가하면 CD8+ 및 CD4+ T 세포에서 NKG2D의 발현을 방해하지 않고 CNK-T 세포에서 TCRαβ의 발현을 유의하게 억제할 수 있음을 나타난다.
실시예 26: UT 요소를 발현하는 CNK-T 세포의 세포 독성
CNK 또는 CNK-UT를 발현하는 CD3+ 벌크 T 세포의 시험관 내 이펙터 기능과 형질도입되지 않은 T 세포를 HCC 세포주 HepG2 세포와의 공동 배양 분석에서 각각 비교한다. 간단히 말해서, 공동 배양 24시간 전에 0.5 x 106 HepG2 세포를 24웰 플레이트에 파종한다. HepG2 세포를 l×105 이펙터 세포(E:T=1:5)와 함께 첨가하고 분석 전 37°C에서 추가로 24시간 동안 배양한다. 공동 배양 후 세포를 수확하고 CD8-Pacific Blue, CD4-APC, CD45-PerCP-Cy5.5, CD25-APC-Cy7 및 CD137-PE-Cy7(Biolegend)으로 염색한 다음 유세포 분석을 수행한다. 결과를 보면(도 18), CNK-T 및 CNK-UT(E19)가 형질전환되지 않은 T 세포와 비교하여 공동 배양 분석에서 HepG2를 효과적으로 제거할 수 있음을 나타난다. 또한, 일반적인 CNK-T와 마찬가지로 CNK-UT 세포는 T 세포 활성화 마커 CD25 및 CD137을 유의하게 상향 조절한다. 결국, UT 요소의 추가는 종양 세포에 대한 세포 독성과 같은 T 세포의 기능을 방해하지 않는다.
실시예 27: CNK-UT 다기능 복합체의 설계
본 실시예에서는 4가지 구조의 CNK-UT 다기능 복합체(multi-functional complex)를 설계했다. 그 중 첫 번째 구조는 기본 CNK-UT 다기능 복합체이고 나머지 세 가지 구조는 첫 번째 구조를 기반으로 다른 구성 요소(module)를 추가로 추가하여 더 많은 기능을 가진 CNK-UT 다기능 복합체를 형성한다.
3.1 기본 CNK-UT 다기능 복합체
일부 실시예에서 기본 CNK-UT 다기능 복합체가 사용되며 개략도는 도 19A에 나와 있으며 (1) NK 활성화 수용체 구성 요소, (2) CNK 신호 전달 구성 요소 및 (3) UT 구성 요소의 세 가지 구성 요소로 구성된다. 선택적으로, 상기 NK 활성화 수용체 구성 요소, CNK 신호 전달 구성 요소 및/또는 UT 구성 요소 사이에는 힌지 또는 링커가 포함된다.
여기서,
(1)NK 세포 활성화 수용체 또는 그 기능적 변이체를 적어도 포함하는 NK 활성화 수용체 구성 요소이고 상기 NK세포 활성화 수용체는 (a)NK세포 활성화 수용체 세포외 도메인(ED) 또는 그 기능 변이체, (b)NK세포 활성화 수용체 막횡단 도메인(TMD) 또는 그 기능 변이체, (c)NK세포 활성화 수용체 세포내 도메인(ICD) 또는 그 기능 변이체를 포함한다. 선택적으로, 상기 NK세포 활성화 수용체 세포외 도메인 또는 그 기능 변이체, 상기 NK세포 활성화 수용체 막횡단 도메인 및/또는 그 기능 변이체 사이에 힌지 또는 링커를 포함한다.
일부 바람직한 실시예에서, CNK 다기능 복합체는 SEQ ID NO.1～24에 표시된 아미노산 서열에서 선택된다.
(2)CNK 신호 전달 구성 요소는 적어도 (i)NK 세포 신호 어댑터(adaptor) 또는 그 기능적 변이체를 포함한다. 상기 NK 세포 신호 어댑터는 (a) NK 세포 신호 어댑터의 세포 외 도메인(ED) 또는 그 기능적 변이체, (b) NK 세포 신호 어댑터의 막횡단 도메인(TMD) 또는 그 기능적 변이체, 및 (c) NK 세포 신호 어댑터의 세포 내 도메인(ICD) 또는 그 기능적 변이체를 포함할 수 있다; 임의로, 상기 NK 세포 신호 어댑터의 세포 외 도메인 또는 그 기능적 변이체, 상기 NK 세포 신호 어댑터의 막횡단 도메인 또는 그 기능적 변이체 및/또는 상기 NK 세포 신호 어댑터의 세포 내 도메인 또는 그 기능적 변이체 사이에 힌지 또는 링커를 포함한다.
(3) UT 구성 요소는 적어도 (i) TCR을 표적 분해하는 재조합 단백질 분자 또는 그 기능적 변이체를 포함한다. 상기 TCR 분해를 표적으로 하는 재조합 단백질 분자는 (a) TCR을 표적으로 하는 결합 단백질 분자 도메인 또는 그 기능적 변이체, (b) 바이러스 소포체(ER) 상주 당단백질의 막횡단 구조 도메인 또는 그 기능적 변이체, (c) 바이러스 소포체 상주 당단백질의 세포질 구조 도메인 또는 그 기능적 변이체를 포함한다; 바이러스 소포체 상주 당단백질의 막횡단 도메인 또는 그 기능적 변이체와 바이러스 소포체 상주 당단백질의 세포질 도메인 또는 그 기능적 변이체는 ERAD 분해 도메인을 형성한다; 선택적으로, TCR을 표적으로 하는 결합 단백질 분자 도메인 또는 그 기능적 변이체, 바이러스 소포체 상주 당단백질의 막횡단 구조 도메인 또는 그 기능적 변이체 및/또는 바이러스 소포체 상주 당단백질의 세포질 도메인 또는 그 기능적 변이체 사이에 힌지 또는 링커가 포함된다.
상기 TCR을 분해하는 재조합 단백질 분자를 표적으로 하는 UT 구성 요소의 경우, 상기 TCR을 표적으로 하는 결합 단백질 분자 도메인 또는 이의 기능적 변이체는 TCR 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 이들의 조합에서 생성한다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 항체는 TCRα항체, TCRβ항체, TCRαβ항체, TCRγ항체, TCRγδ항체, TCRVδ2항체, TCRCβ1항체에서 선택되고; 상기 항체의 기능적 단편은 Fd, Fv, Fab', F(ab')2, Fv(scFv), 단일 사슬 항체(scFv) 또는 나노바디(nanobody), 디아바디, 트라이바디 및 테라바디에서 선택된다. 일부 바람직한실시예에서, 상기 TCR을 표적으로 하는 결합 단백질 분자는 TCRαβ 항체이다. 일부 바람직한실시예에서, 상기 TCR 단일 사슬 항체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.113에 표시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 UT 구성 요소의 ERAD 분해 도메인은 HCMV 당단백질 US2, US3, US11 또는 US10, 아데노바이러스 E3-19K 또는 HHV-7 US21에서 유래된다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 UT 구성 요소의 ERAD 분해 도메인은 SEQ ID NO.46~63으로 표시된 아미노산 서열을 포함한다.
기본 CNK-UT 다기능 복합체의 여러 구성 요소를 발현하는 유전자 요소 단편은 유전자 합성 기술에 의해 합성될 수 있다. 폴리시스트론 발현 방식을 사용하여 자가 전단된 폴리펩타이드 2A(self-cleaving 2Appeptide, 2A:T2A, p2A, E2A, F2A) 및 기타 요소를 사용하여 서로 다른 구성 요소의 유전자 요소 단편을 연결하여 기본 CNK-UT 다기능 복합체 유전자 단편을 얻는다; 합성된 기본 CNK-UT 다기능 복합체 유전자 단편을 분자 클로닝 기술을 통해 렌티바이러스 벡터에 클로닝하고, T 세포를 형질감염시켜 여러 다른 요소의 동시 발현을 실현하여 T 세포의 NK 표적에 대한 특이적 인식 및 사멸을 실현하고, 동시에 UT 요소의 도움으로 TCR을 효과적으로 억제 및 분해한다. 또는，동일한 렌티바이러스 벡터의 다른 프로모터 아래에 다른 기능 요소를 배치하고 T 세포를 형질감염시켜 여러 CNK-UT 요소의 동시 발현을 실현할 수 있다; 또는, 두 개의 렌티바이러스 벡터에 다른 기능 요소를 배치하고 동시에 T 세포를 형질감염시킬 수 있으며 여러 CNK-UT 요소의 동시 발현도 달성할 수 있다.
3.2 표적 MHCI 결합 단백질 분자 도메인을 증가시키는 CNK-UT 다기능 복합체
일부 실시예에서, TCR 및 MHC I 및/또는 MHC II를 동시에 분해 또는 억제하는 CNK-UT 다기능 복합체가 사용되는데, 그 개략도는 도 19B에 도시되어 있으며 (1) NK 활성화 수용체 구성 요소, (2) CNK 신호 전달 구성 요소 및 (3) TCR의 표적 분해를 위한 재조합 단백질 분자 도메인 또는 이의 기능적 변이체 및 MHC I 및/또는 MHC II 또는 이의 기능적 변이체를 표적하는 결합 단백질 분자 도메인을 모두 포함하는 UT 구성 요소의 세 개 구성 요소를 더 포함한다는 점에서, CNK-UT 다기능성 복합체와 다르다. 이는 (3) UT 구성 요소가 MHC I 및/또는 MHC II 또는 이의 기능적 변이체를 표적으로 하는 결합 단백질 분자 도메인을 더 포함한다는 점에서 기본 CNK-UT 다기능 복합체와 다르다. 선택적으로, 힌지 또는 링커가 NK 활성화 수용체 구성 요소, CNK 신호 전달 구성 요소 및 UT 구성 요소 사이에 포함될 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 MHC I 및/또는 MHC II를 표적으로 하는 결합 단백질 분자 도메인 또는 이의 기능적 변이체는 HLA를 표적으로 하는 결합 단백질 분자 도메인 또는 이의 기능적 변이체이다.
일부 실시예에서, MHC I을 표적으로 하는 결합 단백질 분자 도메인은 MHC I 분자를 억제하는 바이러스 소포체 단백질로부터 유래된다. 일부 실시예에서, 상기 MHC I 분자를 억제하는 바이러스 소포체 당단백질은 인간 거대세포 바이러스(human cytomegalovirus，HCMV)US6, 단순 헤르페스 바이러스(herpes simplex virus，HSV)ICP47, 우두 바이러스(cowpox virus, CPXV)CPXV12, 소 헤르페스 바이러스(bovine herpesvirus，BHV)UL49.5 또는 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr virus，EBV)NFBir2 등에서 선택된다. 상기 언급된 바이러스 소포체 단백질은 항원 처리와 관련된 수송체(transporter associated with antigen processing，TAP)에 결합하여, TAP 매개 폴리펩타이드가 소포체로 수송되는 것을 방지하고 MHC 분자의 성분을 억제함으로써, MHC I 발현의 억제를 달성할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 MHC I 및/또는 MHC II를 표적으로 하는 결합 단백질 분자 도메인 또는 이의 기능적 변이체는 TAP 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 TAP 결합 도메인은 SEQ ID NO.64～73중에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 MHC I을 표적으로 하는 결합 단백질 분자 도메인은 MHC I 분자를 분해하는 바이러스 당단백질로부터 유래될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 바이러스 당단백질은 HCMV 당단백질 US2, US3, US11, US10, 아데노바이러스 E19 등으로부터 선택된다. 일부 바람직한 실시예에서, 상기 결합 단백질 분자 도메인은 MHC I 및/또는 MHC II 또는 이의 기능적 변이체를 표적으로 하는 MHC 결합 도메인을 포함한다. 일부 바람직한 실시예에서, 상기 MHC 결합 도메인은 SEQ ID NO.74-82로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 MHC I을 표적으로 하는 결합 단백질 분자 도메인은 MICA, MICB, ULBP1-6 등과 같은 NK 표적 단백질을 표적으로 억제하거나 분해하는 바이러스 단백질로부터 유래될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 바이러스 단백질은 HCMV UL16, UL141, UL142, 아데노바이러스 E3-19K9 등으로부터 선택된다. 일부 바람직한실시예에서, 상기 바이러스 단백질의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.83-91에 의해 규정된 아미노산 서열이다.
일부 실시예에서, 상기 MHC I을 표적으로 하는 결합 단백질 분자 도메인은 분해를 위해 골지체에서 리소좀으로 MHC I 분자를 수송하는 바이러스 단백질로부터 유래될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 바이러스 단백질은 HIV Nef, HIV Vpu, HHV-7U21, HHV-8 KK3, HHV-8 KK5, MHV-68 MK3, HTLV-1 p12 등으로부터 선택된다. 일부 바람직한실시예에서, 상기 바이러스 단백질은 SEQ ID NO.92-97에 표시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 MHC I 및/또는 MHC II를 표적으로 하는 결합 단백질 분자 도메인 또는 이의 기능적 변이체는 골지체로부터 소포체로 MHC-폴리펩티드 분자의 복귀를 매개하고 분자의 분해를 촉진하는 바이러스 단백질을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 바이러스 단백질은 MHC 결합 도메인 및 KDEL 수용체 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 바이러스 단백질은 Cowpox Virus 단백질 CPXV203이다. 일부 바람직한 실시예에서, 상기 바이러스 단백질은 SEQ ID NO.98-103에 표시된 아미노산 서열을 포함한다.
기본 CNK-UT 다기능 복합체 유전자 단편을 얻는 것과 동일한 방식으로 표적 MHC I 결합 단백질의 분자 도메인을 증가시키는 CNK-UT 다기능 복합체 유전자 단편을 얻는다. 합성된 CNK-UT 다기능 복합체 유전자 단편을 분자 클로닝 기술을 통해 렌티바이러스 벡터에 클로닝하고 T 세포를 형질감염시켜 여러 다른 요소의 동시 발현을 실현하여 NK 표적에 대한 T 세포의 특이적 인식 및 사멸을 실현하고 UT 요소의 도움으로 TCR 및 MHCI의 발현을 효과적으로 억제 및 분해한다.
3.3 MHC I를 표적으로 하는 결합 단백질 분자 도메인과 복합형 어댑터를 증가하는 CNK-UT 다기능 복합체
일부 실시예에서, TCR 및 MHC I의 동시 분해 및 CNK-T 세포의 종양 항원 특이적 인식 및 활성화를 달성할 수 있는 다기능 복합체가 사용되는데, 그 개략도는 도 19C에 도시되어 있으며, (1) NK 활성화 수용체 구성 요소, (2) CNK 신호 전달 구성 요소, (3) UT 구성 용소 및 (4) 키메라 어댑터(Chimeric adaptor) 구성 요소의 네 가지 구성 요소를 포함한다. MHC I 결합 단백질 분자 도메인을 표적으로 하는 CNK-UT 다기능 복합체와 비교하여 (4) 복합형 어댑터 구성 요소가 증가한다는 점에서 다르다. 선택적으로, NK 활성화 수용체 구성 요소, CNK 신호 전달 구성 요소, UT 구성 요소 및/또는 키메라 어댑터 구성 요소 사이에는 힌지 또는 링커로 연결된다.
상기 (4) 복합형 어댑터에는 (i) 종양을 표적으로 하는 세포외 인식 도메인; (ii) 막횡단 도메인; 및 (iii) 세포내 신호 전달 도메인이 포함되어 있으며; 선택적으로 종양을 표적으로 하는 세포외 인식 도메인, 막횡단 도메인 및/또는 세포내 신호 도메인 사이에 힌지 또는 링커가 포함된다.
일부 실시예에서, 상기 복합형 어댑터 구성 요소의 종양을 표적으로 하는 세포 외 인식 도메인은 종양 항원 특이적 결합 도메인, 종양 미세 환경 표적 항원 결합 도메인 및/또는 종양 미세 환경을 표적으로 하는 케모카인 수용체 중에서 선택된다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 종양을 표적으로 하는 세포 외 인식 도메인은 종양 관련 항원을 인식하는 항체 또는 그 기능적 단편, TCR 또는 이들의 조합에서 선택한다. 상기 항체의 기능 단편은 Fd, Fv, Fab, Fab', F(ab')2, Fv(scFv), 단일 사슬 항체(scFv) 또는 나노바디(nanobody), 디아바디, 트리아바디 및 테라바디에서 선택한다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 복합형 어댑터 구성 요소의 막횡단 도메인은 NK 세포 활성화 수용체 막횡단 도메인, DAP10 막횡단 도메인, DAP12 막횡단 도메인, CD8 막횡단 도메인, CD28 막횡단 도메인, CD4 막횡단 도메인, 4-1BBB 막횡단 도메인, OX40 막횡단 도메인, ICOS 막횡단 도메인, CTLA-4 막횡단 도메인, PD-1 막횡단 도메인, LAG-3 막횡단 도메인, 2B4 막횡단 도메인 및 BTLA 막횡단 도메인 및 이들의 조합에서 선택된다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 복합형 어댑터 구성 요소의 세포 내 신호 전달 도메인은 NK-세포 활성화 수용체의 세포 내 신호 전달 도메인 및/또는 공동 자극 신호 전달 도메인을 포함한다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 세포 내 신호 전달 도메인은 세포 내 신호 전달 도메인은 포함한다; 바람직하게는, 상기 세포 내 신호 전달 도메인은 T 세포 공동 자극 신호 전달 도메인에서 선택한다; MHC 클래스 I 분자에서 유래됨, TNF 수용체 단백질, 면역 글로불린 유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린 단백질, 림프구 활성화 신호 전달 분자(SLAM 단백질), 활성화된 NK 세포 수용체, BTLA, Toll 리산드 수용체, OX40, CD2, CD7, CD16, CD27, CD28, CD30, CD40, CD38, CD35, CD79A, CD79B, CDS, ICAM-1, LFA-1，(CD11a/CD18), 4-1BB(CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS(CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM(LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8α, CD8β, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, NCR, DAP10, DAP12, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a 및 CD83 과 특이적으로 결합한 리간드，CARD11, FcRa, FcRp, FcRy, Fyn, HVEM, ICOS, Lck, LAG3, LAT, LRP, NOTCH1, Wnt, OX40, ROR2, Ryk, SLAMF1, Slp76, pTa, TCRa, TCRp, TRIM, ZAP70, PTCH2 등을 포함하는 세포 내 신호 전달 도메인이지만 이에 제한하지 않는다; 더 바람직게는, 상기 공동 자극 신호 전달 도메인은 NKG2D 세포 내 신호 전달 도메인, DAP10 세포 내 신호 전달 도메인, DAP12 세포 내 신호 전달 도메인, NCR 세포 내 신호 전달 도메인, CD28 세포 내 신호 전달 도메인, 4-1BB 세포 내 신호 전달 도메인, OX40 세포 내 신호 전달 도메인, 및 ICOS 세포 내 신호 전달 도메인 중에서 선택될 수 있다.
기본 CNK-UT 다기능 복합체 유전자 단편을 얻는 것과 동일한 방식으로 표적 MHC I 결합 단백질의 분자 도메인을 증가시키는 CNK-UT 다기능 복합체 유전자 단편을 얻는다. 합성된 CNK-UT 다기능 복합체 유전자 단편을 분자 클로닝 기술을 통해 렌티바이러스 벡터에 클로닝하고 T 세포를 형질감염시켜 4개 다른 요소의 동시 발현을 실현하여 NK 표적에 대한 T 세포의 특이적 인식 및 사멸을 실현하고 UT 요소의 도움으로 TCR 및 MHC I의 발현을 효과적으로 억제 및 분해하고; 복합형 어댑터에서 종양 항원 특이성에 대한 CNK-T 세포의 인식 및 활성화를 실현한다.
3.4 MHC I를 표적으로 하는 결합 단백질 분자 도메인과 종양 세포를 표적으로 삼아 죽이는 CAR 또는 TCR와 같은 수용체를 증가한 CNK-UT 다기능 복합체
일부 실시예에서, TCR 및 MHC I의 동시 분해하고 종양 항원 특이적 인식 및 활성화를 달성할 수 있는 다기능 복합체가 사용되고, 도 19D의 개략도에 도시되어 있는 것과 같다. 이는 네 가지 구성 요소를 포함한다: (1) NK 활성화 수용체 구성 요소, (2) CNK 신호 전달 구성 요소, (3) UT 구성 요소 및 (4) 표적 살상 종양 세포 수용체 구성 요소이며, MHC I 표적으로 하는 결합 단백질 분자 도메인을 증가하는 CNK-UT 다기능 복합체와 비교하여 (4) 표적 살상 종양 세포 수용체 구성 요소를 증가하는데서 다르다. 선택적으로, 상기 NK 활성화 수용체 구성요소, CNK 신호 전달 구성 요소, UT 구성 요소 및/또는 표적 사멸 종양 세포 수용체 구성 요소 사이를 힌지 또는 링커를 통해 연결한다.
상기 (4) 표적 살상 종양 세포 수용체 구성 요소는 (i) 표적 종양 항원의 세포외 인식 도메인, (ii) 막횡단 도메인 및 (iii) 세포내 공동 자극 신호 전달 도메인, (iv) T 세포 활성화 신호 전달 도메인(ITAM)을 포함하고; 선택적으로, 상기 종양 항원을 표적으로 하는 세포외 인식 도메인, 막횡단 도메인, 세포내 공동 자극 신호 전달 도메인 및/또는 T 세포 활성화 신호 전달 도메인(ITAM) 사이에는 힌지 또는 링커가 포함된다.
상기 표적 살상 종양 세포 수용체 구성 요소의 막횡단 도메인은 CD8막횡단 도메인, T 세포 수용체의 α, β 및 ζ사슬 막횡단 도메인, CD28막횡단 도메인, CD3ε막횡단 도메인, CD45막횡단 도메인, CD4막횡단 도메인, CD5막횡단 도메인, CD8막횡단 도메인, CD9막횡단 도메인, CD16막횡단 도메인, CD22막횡단 도메인, CD33막횡단 도메인, CD37막횡단 도메인, CD64막횡단 도메인, CD80막횡단 도메인, CD86막횡단 도메인, CD134막횡단 도메인, CD137막횡단 도메인, CD154막횡단 도메인, GITR막횡단 도메인 및 이들의 조합에서 선택된다.
상기 T세포 활성화 신호 전달 도메인은 CD3ζ, 공동 FcRγ(FCER1G), FcγRIIa, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278(“ICOS”), FcεRI CD66d, DAP10과 DAP12 등 세포 내 신호 전달 도메인으로부터 유래된다.
일부 바람직한 실시예에서, 상기 (4) 표적 살상 종양 세포 수용체 구성 요소는 CAR 또는 TCR 표적 사멸 종양 세포 수용체이다.
기본 CNK-UT 다기능 복합체 유전자 단편을 얻는 것과 동일한 방식으로 표적 MHC I 결합 단백질의 분자 도메인과 CAR 또는 TCR 등을 증가하는 종양 세포를 사해하는 수용체를 표적으로 하는 CNK-UT 다기능 복합체 유전자 단편을 얻는다. 합성된 CNK-UT 다기능 복합체 유전자 단편을 분자 클로닝 기술을 통해 렌티바이러스 벡터에 클로닝하고 T 세포를 형질감염시켜 4개 다른 요소의 동시 발현을 실현하여 NK 표적에 대한 T 세포의 특이적 인식 및 사멸을 실현하고 UT 요소의 도움으로 TCR 및 MHC I의 발현을 효과적으로 억제 및 분해하고; 복합형 어댑터에서 종양 항원 특이성에 대한 CNK-T 세포의 인식 및 활성화를 실현하며; CAR 또는 TCR의 구조를 통해 종양 세포에 대한 특이적 인식 및 사멸 효과를 실현하고 CNK 요소와 협력하여 종양 세포를 보다 효율적으로 제거한다.
실시예 28: CNK-UT 다기능 복합체를 발현하는 CNK-UT 요소의 설계
본 실시예에서는 CNK-UT 다기능 복합체를 발현하는 4개의 CNK-UT 요소를 설계했다.
4.1 CNK-UT 요소 설계 구조 1
일부 실시예에서, 도 20A에 도시된 바와 같이, 단일 렌티바이러스 EF1α 프로모터를 사용하여 벡터를 발현하고 자가 절단 폴리펩타이드 2A 등 요소를 사용하여 CNK-UT 요소 중 하나를 연결하는데 DAP10-DAP12ICD-T2A-NKG2D-p2A-anti-TCR-AdE3 ERAD는 단일 벡터에 여러 기능 요소를 발현한다.
4.2 CNK-UT 요소 설계 구조 2
일부 실시예에서, 도 20B에 도시된 바와 같이, 단일 렌티바이러스 EF1α 프로모터를 사용하여 벡터를 발현하고 자가 절단 폴리펩타이드 2A 등 요소를 사용하여 CNK-UT 요소 중 하나를 연결하는데 DAP10-DAP12 ICD-T2A-NKG2D-p2A-anti-TCR-US2 ERAD는 단일 벡터에 여러 기능 요소를 발현한다.
4.3 CNK-UT 요소 설계 구조 3
일부 실시예에서, 도 20C와 같이 단일 렌티바이러스 발현 벡터를 이용하고 이중 프로모터 및 폴리시스트론 발현 방식을 사용하며, EF1α과 CMV 프로모터를 사용하여 DAP10-CD3ζ-T2A-NKG2D-p2A-anti-TAA scFv-DAP10과 anti-TCR-AdE3 ERAD-E2A-AdE3의 다중 유전자의 발현을 각각 조절하여 단일 벡터에서 다중 CNK-UT 기능 요소의 발현을 실현한다.
4.4 CNK-UT 요소 설계 구조 4
일부 실시예에서, 도 20D바와 같이 두 개의 서로 다른 렌티바이러스 발현 벡터는 anti-TAA scFv-CD28/4-1BB-CD3ζ-T2A-CD3ζ-p2A-NKG2D과 anti-TCR-AdE3 ERAD-T2A-AdE3의 발현을 각각 조절하고 서로 다른 렌티바이러스를 제조한 후 T 세포를 공동 형질감염시킨 후 동일한 T 세포에서 CNK-UT의 다중 기능 요소를 발현을 실현한다.
실시예 29: NKG2DL을 표적으로 하는 특이적 키메라 항원 수용체의 발현 플라스미드 제조
CNK-UT의 인코딩 뉴클레오티드 서열(이의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.118에 표시되어 있고, 인코딩된 단백질은 SEQ ID NO.117에 표시되어 있다)의 전체 유전자 합성, 분자 클로닝을 통해 렌티바이러스 벡터 pCDH-CMV-MCS-EF1α-Puro(유바오 바이오텍에서 구매)에 연결하여 CNK-UT 렌티바이러스 표적 벡터를 구축하고, 시퀀싱을 통해 정확한지 확인 후, DH5α 컴피턴트 세포(Thermo Fisher)를 플라스미드로 형질전환하고, 단일 콜로니를 선택하고 대규모로 배양 후, 플라스미드 추출 키트 PureLinkTM HiPure Plasmid Maxiprep Kit(Thermo Fisher)를 이용하여 플라스미드 생산 및 정제 시켜, CNK 렌티바이러스 플라스미드를 얻는다.
실시예 30: CNK-UT의 바이러스 제조
실시예 3에서 얻는 CNK-UT 렌티바이러스 플라스미드와 패키징 플라스미드 psPAX2및 pMD2.G(Addgene에서 구입, Cat# 12259&12260)에 1.64pmol: 1.3pmol: 0.72pmol의 비율로 폴리에틸렌이민 형질감염 시약(408727, 시그마)을 사용하여 DNA: μg PEI=1:3의 비율로 형질감염시켜, 공동 형질감염된 293T 세포(ATCC 제공, Cat# CRL3216TM)를 얻는다. 상세한 패키징 플라스미드 제조 방법은 PureLink™ HiPure Plasmid Maxiprep Kit (K210006, Thermo)의 설명서를 참고하고; 상세한 형질감염 작업 절차는 Sigma형질감염 설명서를 참고한다. 형질감염 16시간 후, 배양 배지를 완전 배지로 교체한다(Life Technologies에서 구입, Cat# 11995-065). 24시간, 48시간 및 72시간 배양 후, 렌티바이러스가 포함된 상청액을 수집하고, 결합 및 -80℃, 3000rpm에서 10-15분간 원심분리한 후 0.45μm 필터막을 통해 여과하고 마지막으로 25000rpm, 4°C에서 2~3시간 동안 초원심분리하여 바이러스를 농축시켜 렌티바이러스 농축액을 수집한다. 렌티바이러스의 농축액을 수집하여 -80°C에서 보관한다.
실시예 31: CNK-UT 세포의 제조
건강한 기증자의 신선한 말초혈액을 채취하여, PBS+EDTA를 1:1로 추가한 후, Ficoll 밀도 구배 원심분리를 통해 신선한 말초혈액 단핵구를 분리한다; 그런 다음 CD3 분류 마그네틱 비드, MS 분리 컬럼 및 MiniMACS™ 분리 장치(Miltenyi Biotec)를 사용하여 CD3+ T 세포를 양성으로 분류하고 용출한다. 분리된 CD3+ T 세포를 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체를 결합한 자기 비드(Human T-Activator CD3/CD28, Invitrogen, Cat# 11161D)에 의해 자극 배양되고 상세한 절차는 다음과 같다: 말초혈액 단핵구를 1 x 106 단일 세포/ml의 농도로 희석하여 24웰 플레이트에 펼치고 자기 비드를 1:1 비율로 세포에 추가하고 규일하게 혼합한다. 배양 배지(OpTmizerTM T-Cell Expansion SFM, A1048503, Life Technologies)에 재현탁하고 IL250U/ml 및 IL155ng/ml를 첨가하고 CNK-UT 요소를 로딩한 실시예 4에서 제조된 렌티바이러스 형질감염을 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 1일 동안 배양한 후 수행한다. 상세한 절차는 다음과 같다. 실시예 4에서 제조한 렌티바이러스 농축액을 취하여, MOI=3-5의 값에 따라 세포에 바이러스 용액을 첨가하고, Polybrene 10μg/ml를 첨가하여, 평각 원심분리기에 넣은 후 저속(500g-1000g/min)으로 30~60분간 원심분리한 후, 37℃ 인큐베이터에 넣어 배양하고 감염 후 48시간 후에 발현 CNK-UT 세포를 얻어, 세포 표현형을 유동적으로 측정할 수 있으며, 8일 동안 계속 배양한 후 다음 표현형 측정 및 세포 기능 실험을 수행할 수 있다.
실시예 32: CNK-UT 세포의 표현형 측정
도 21은 CNK-UT(DAP10-CD3-T2A-NKG2D-p2A-anti-TCR scFv-AdE3)(뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.118에 에 표시되고 단백질을 인코딩하는 것은 SEQ ID NO.117에 표시됨) 세포의 기본 표현형에 대한 유세포 분석 측정 결과이다. 제조예 2에서 10일 동안 배양한 세포를 각각 5×105 형질감염되지 않은 T세포와 CNK-UT 바이러스 벡터로 형질감염된 T세포를 채취하여, 항체 CD8-Pacific Blue, CD4-APC, NKG2D-PE-Cy7, TCR-α-APC-Cy7(모든 항체는 Biolegend에서 구입)으로 염색한 후, 유세포분석기(BD FACS Canto II)를 사용하여 세포 표현형을 확인한다. 결과를 보면, 형질감염되지 않은 T세포, CD8은 NKG2D를 발현하고 TCR-αβ를 발현하며, CD4는 NKG2D를 발현하지 않고 TCR-αβ를 높게 발현하며; 형질감염된 CNK-UT, CD8 및 CD4 T세포는 모두 NKG2D를 높게 발현하고 TCR-αβ는 발현하지 않는 것으로 나타난다.
실시예 33: CNK-UT 세포의 광범위한 종양 사멸 기능 검측
본 실시예는 실시예 5에서 제조된 CNK-UT 세포의 광범위한 종양 사멸 기능을 연구한다. 여기서 인간 결장 선종 세포주 HT29는 Procell(CL-0118)에서 구입하였고, 삼중 음성 유방암 세포 MDA-MB453은 Procell(CL-0152)에서 구입하였고, 급성 골수계 백혈병 세포주 THP1은 Procell(CL-0233)에서 구입하였고, 간세포암(HCC) HepG2는 Procell(CL-0103) 구입 하였으며, 간세포암(HCC) PLC는 Procell(CL-0415)에서 구입하였다.
33.1 CNK-UT 세포에 의한 인간 결장 선종 세포주 HT29에 대한 인식 및 특이적 사멸
본 실험에 사용된 CNK-UT 세포는 실시예 5에서 제조된 세포이다.
도 22는 인간 결장 선종 세포주 HT29에 대한 CNK-UT 세포의 인식 및 특이적 사멸을 나타낸다. 여기서,
A: 인간 결장 선종 세포주 HT29에서 다양한 NK 표적점 단백질의 발현 상황
인간 결장 선종 세포주 HT29 0.5×106 세포를 트립신으로 소화시키고 MICA-APC, MICB-APC, ULBP1-APC, ULBP2-APC, ULBP3-APC로 염색하고 IgG 동형(IgG isotype) 항체를 대조군(R&D Systems에서 구입)으로 사용한 다음 유세포 분석기(BD FACS Canto II)를 사용하여 세포 표현형을 측정한다. 결과를 보면, HT29 세포가 ULBP2를 높게 발현하고 MICA, MICB, ULBP1 및 ULBP3을 약하게 발현한다는 것을 나타난다.
B: CNK-UT 세포는 HT29에 대한 효율적인 살상 및 활성화 기능을 갖는다
T 세포와 종양 세포의 공동 배양 실험은 24웰 플레이트를 취하여 인간 결장 선종 세포주 HT29 0.5×106 세포/웰을 계수하여 펼치고, 종양 세포의 성장밀도가 80% 이상에 도달하면 유효표적비 1:5에 따라 형질감염되지 않은 T세포와 CNK-UT세포(DAP10-CD3ζ-T2A-NKG2D-p2A-ant-TCR scFv-AdE3)를 각각 첨가하고 24시간 후 모든 세포를 소화 및 수확한 후 CD45-PerCP-Cy5.5, CD8-Pacific Blue, CD4-APC, NKG2D-PE-Cy7, CD25-APC-Cy7(Biolegend에서 구입)로 염색한 다음 유세포분석기 기술로 측정한다. 분석 결과 CD45(-) 종양 세포와 CD45(+) T 세포를 구별하고 CD8, CD4 T 세포 표면에서 NKG2D 및 활성화 마커 CD25의 발현을 추가로 분석했다. 실험 데이터에 따르면 HT-29 세포의 59.0%가 MICA의 발현을 상향 조절하고, 40.1%의 세포는 MICB의 발현을 상향 조절하고, 56.1%의 세포는 ULBP1의 발현을 상향 조절하고, 84.4%의 세포는 ULBP2의 발현을 상향 조절하며(도 22A), CNK-UT 세포의 HT29 세포에 대한 우수한 사멸 기능을 가지고 있으며, 대조군의 공동 배양 시스템의 69.5%는 종양 세포인 반면 T 세포는 CD25를 나타내지 않는다; CNK-UT 세포의 공동 배양 시스템에서 FSC/SSC 그래프에서 대부분의 종양 세포가 제거되었으며 T 세포의 비율이 84.1% 유의하게 증가했으며 CD8+T 세포의 36.345%가 CD25 발현을 상향 조절하고 CD4+T 세포의 19.08%가 CD25 발현을 상향 조절함을 알 수 있다(도 22B).
33.2 CNK-UT 세포에 의한 MDA-MB453의 인식 및 특이적 사멸
본 실험에 사용된 CNK-UT 세포는 실시예 5에서 제조된 세포이다.
도 23은 CNK-UT 세포에 의한 MDA-MB453의 인식 및 특이적 사멸을 나타난다.
A: 삼중 음성 유방암 세포주 MDA-MB453 서로 다른 NK 표적점 단백질의 발현 상황
MDA-MB453 0.5×106 세포를 트립신으로 소화시키고 MICA-APC, MICB-APC, ULBP1-APC, ULBP2-APC, ULBP3-APC로 염색하고 IgG 동형 항체를 대조군(R&D Systems에서 구입)으로 사용한 다음 유세포 분석기(BD FACS Canto II)를 사용하여 세포 표현형을 측정한다. 결과를 보면, MDA-MB453 세포가 MICA, ULBP2를 높게 발현하고 MICB, ULBP1 및 ULBP3을 약하게 발현한다는 것을 나타난다.
B: CNK-UT 세포는 MDA-MB453에 대한 효율적인 살상 및 활성화 기능을 갖는다
T 세포와 종양 세포의 공동 배양 실험은 24웰 플레이트를 취하여 유방암 세포주 MDA-MB453 0.5×106 세포/웰을 계수하여 펼치고, 종양 세포의 성장밀도가 80% 이상에 도달하면 유효표적비 1:5에 따라 형질감염되지 않은 T세포와 CNK-UT세포(DAP10-CD3ζ-T2A-NKG2D-p2A-ant-TCR scFv-AdE3)를 각각 첨가하고 24시간 후 모든 세포를 소화 및 수확한 후 CD45-PerCP-Cy5.5, CD8-Pacific Blue, CD4-APC, NKG2D-PE-Cy7, CD25-APC-Cy7(Biolegend에서 구입)로 염색한 다음 유세포분석기 기술로 측정한다. 실험 데이터에 따르면 MDA-MB453 세포의 83.7%가 MICA 발현을 상향 조절하고, 33.6%의 세포가 MICB 발현을 상향 조절하며, 31.2%의 세포는 ULBP1 발현을 상향 조절하고 95.0%의 세포는 ULBP2 발현을 상향 조절하며(도 23A), CNK-UT 세포의 경우 MDA-MB453 세포에 대한 우수한 사멸 기능을 가지고 있으며, 대조군의 공동 배양 시스템의 48.9%는 종양 세포인 반면 T 세포는 CD25를 발현하지 않는다. 실험 결과는 CNK-UT 세포가 MDA-MB453 세포에 대한 우수한 사멸 기능을 가지며 특정 활성화를 달성함을 나타난다.
실시예 34: CNK-UT 세포의 종양 모델 기능 검측
본 실시예에서는 면역 결핍 마우스(NSG 마우스)(Jiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co., Ltd., Cat# T001475에서 구입)의 종양 모델을 사용하여 생체 내 약력학 연구를 수행한다.
8.1 간암 세포주 HepG2 동물 모델에 대한 CNK-UT세포의 치료 효과
실험 동물은 다음 세 그룹으로 나눈다:
음성 대조군: 대조군 T 세포, 동일한 기증자에서 유래된 T 세포, 자기 비드 자극에 의해 증폭된 형질감염되지 않은 T 세포;
동형 대조군: 기존 GPC3 CAR-T 세포에 투여: GPC3CAR-T 세포를 준비하고 anti-GPC341BB-CD3基因 유전자를 합성하여 렌티바이러스 벡터 pCDH-CMV-MCS-EF1α-Puro에 클로닝하고, 플라스미드 및 렌티바이러스를 제조한 후 T세포를 형질감염시켜 기존의 GPC3CAR-T 세포를 얻었으며, 상세한 제조 방법은 CNK-UT 세포 제조와 동일하다.
CNK-UT군: GPC3 CAR/CNK-U세포 투여
GPC3CAR/CNK-UT 세포를 준비하고 anti-GPC341BB-Z-T2A-DAP10-CD3--T2A-NKG2D-p2A-ant-TCR scFv -AdE3 유전자를 렌티바이러스 벡터 pCDH -CMV -MCS -EF1α -Puro에 클로닝하여 플라스미드 및 느린 바이러스를 제조한 후, T세포를 형질감염시키고 증폭 및 배양하여 GPC3CAR/CNK-UT 세포를 얻었으며, 상세한 제조 방법은 CNKU 세포와 동일하다.
실험동물을 그룹으로 나눈 후, 대조군 T 세포, 기존 GPC3 CAR-T 세포 및 GPC3 CAR/CNK-UT를 각각 투여한 후 동물 체중을 측정한다. 15마리의 NSG 마우스에 오른쪽 겨드랑이에 HepG2 세포 3×106/마리를 접종하고 모델링 당일을 0일로 기록한다. 7일 후 마우스의 성공적인 모델링이 관찰되었으며 마우스를 3개의 그룹으로 나누어 정상 T 세포(대조군 T 세포), 기존 GPC3-CAR-T 세포, GPC3 CAR/CNK-UT 세포를 각각 투여하고 다양한 세포의 종양 형광 제거 효과를 관찰한다. 3종 세포 모두 2×106/마리, 연속 3회(7일, 9일, 11일)의 용량으로 꼬리 정맥 주사 방식으로 투여되었으며 투여 날짜는 7일로 기록되었고 형광은 7일마다 관찰한다.
도 24는 GPC3 CAR/CNK-UT 세포가 GPC3 CAR-T 세포보다 마우스에서 더 효율적인 종양 제거 능력을 가지고 있음을 나타낸다.
간암 세포주 HepG2-FFluc 모델링 후 2×106 형질감염되지 않은 T세포(왼쪽), GPC3CAR-T(가운데) 및 GPC3CAR/CNK-UT(오른쪽), 그리고 종양 성장을 모니터링하기 위해 매주 IVIS 동물 형광 영상 시스템을 수행한다. 실험 결과 대조군 T세포 집단의 형광은 지속적으로 증가하였고, GPC3CAR-T 형광은 천천히 증가하였으나, CNK-T001군의 종양 형광은 사라질 때까지 계속 약화되어, GPC3CAR/CNK-UT 세포가 마우스 모델에서 기존 CART 세포보다 더 강력한 항종양 효과가 있음을 확인했다.
도 25는 GPC3 CAR/CNK-UT 세포가 GPC3 CAR-T보다 효율적인 종양 제거 능력을 가지고 있음을 나타낸다.
도 25의 형광 영상을 정량화한 후 종양 형광 곡선을 그리면, 대조군 T 세포(파란색)와 GPC3 CAR-T(빨간색)가 종양 성장을 완전히 억제할 수 없는 반면 (녹색)은 종양 성장을 유의하게 억제할 수 있으며, 종양 형광이 사라질 때까지 계속 약화되어, 마우스 모델에서 GPC3 CAR/CNK-UT 세포의 항종양 효과를 확인했다.
위의 실험 결과, 음성 대조군 마우스의 종양이 점차 증가하여 28~42일 사이에 첫 번째 쥐가 사망하고 42일 후에 모두 사망하는 것으로 나타났다. 동형 대조군 GPC3CAR/CAR-T 세포를 투여한 동형 대조군은 14일째에 종양의 성장을 억제하는 것으로 나타났으나, 종양을 완전히 제거할 수 없었고, 21일째에는 종양 증가가 관찰되었으며, 28일 후에는 음성 대조군과 거의 차이가 없었으며, 전체 그룹의 마우스는 42일에서 56일 사이에 차례로 사망했으며, 이는 단일 표적 GPC3 CAR-T가 종양을 부분적으로만 억제할 수 있지만, 완전히 제거할 수는 없고, 재발을 예방할 수는 없음을 나타난다. 14일째에 GPC3 CAR/CNK-UT 세포를 투여한 CNK-UT 그룹은 마우스의 종양 형광 신호를 유의하게 감소시켰고, 21일째에 신호가 완전히 사라졌으며, 관찰 마감 시간(56일째)까지 마우스는 모두 생존했으며 종양 재발은 없었다. GPC3CAR/CNK-UT 세포는 체내에서 우수한 항종양 활성을 가지며, 그 활성은 GPC3CAR-T보다 훨씬 우수하며, 종양을 제거한 후, 최소 56일 동안 항종양 효과를 유지할 수 있음을 설명한다.
또한, 다른 세포 주입한 후 마우스의 체중 변화도 연구 하였다. 그 중 CNK-UT 세포를 주입한 CNK-UT 그룹의 실험 동물의 체중은 D0에 비해 약간 증가한 반면, GPC3-CAR-T를 주입한 동형 대조군과 대조군 T세포 음성 대조군 동물의 체중은 실험 시간이 길어질수록 점차 감소되였다.
종합적으로 위의 실험 결과를 보면, 위의 결과에서 실험동물에 다양한 방법으로 치료한 후에도 대조군 T세포와 GPC3CAR-T세포를 주사한 마우스의 종양은 여전히 성장했지만, GPC3CAR/CNK-UT 세포는 GPC3CAR-T 세포보다 더 강한 치사력을 가지며, 주입 후 21일 후에 재발 없이 종양 세포를 제거할 수 있었다. 또한, GPC3CAR/CNK-UT 주입은 세포 독성이 없고, 동물의 생존기간이 연장되며 동물의 생활상태가 개선되고 체중이 증가했다.
SEQUENCE LISTING <110> ST PHI THERAPEUTICS CO., LTD. <120> TARGETED PROTEIN DEGRADATION SYSTEM AND USE THEREOF <160> 178 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 144 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln 1 5 10 15 Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile 20 25 30 Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp 35 40 45 Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys 50 55 60 Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr 65 70 75 80 His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp 85 90 95 Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met 100 105 110 Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile 115 120 125 Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val 130 135 140 <210> 2 <211> 216 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gly Trp Ile Arg Gly Arg Arg Ser Arg His Ser Trp Glu Met Ser 1 5 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agaagggaga ctgtgcactc 1260 tatgcctcga gctttaaagg ctatatagaa aactgttcaa ctccaaatac gtacatctgc 1320 atgcaaagga ctgtgggcag cggcgccaca aatttctctc tgctgaagca agccggcgac 1380 gtggaggaga atcccggacc catgagatac atgattctgg gactgctggc tctggctgct 1440 gtgtgtagcg ccgccaaaaa ggtggaattc aaggagcccg cttgcaacgt gacctttaag 1500 tccgaggcca acgagtgcac cacactgatc aagtgcacca ccgagcacga gaagctgatc 1560 attagacaca aggacaagat cggaagatac gccgtgtacg ccatctggca gcccggcgac 1620 accaacgact acaacgtcac cgtgttccaa ggcgagaata gaaagacctt catgtataag 1680 ttccccttct acgagatgtg cgacatcacc atgtacatga gcaagcagta caagctgtgg 1740 ccccctcaga agtgtctgga gaacaccggc accttctgta gcacagctct gctgatcaca 1800 gctctggctc tggtgtgcac actgctctat ctgaagtaca agtctagaag gagcttcatc 1860 gacgagaaga agatgcccgg gggcgggggc tccgacagac atgatagcgg cctggacagc 1920 atgggcagcg gcagcggggc cctggccccc tacatcccc 1959 <210> 167 <211> 653 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 167 Met Ile His Leu Gly His Ile Leu Phe Leu Leu Leu Leu Pro Val Ala 1 5 10 15 Ala 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Gly Trp Ile Arg Gly Arg Arg Ser Arg His 225 230 235 240 Ser Trp Glu Met Ser Glu Phe His Asn Tyr Asn Leu Asp Leu Lys Lys 245 250 255 Ser Asp Phe Ser Thr Arg Trp Gln Lys Gln Arg Cys Pro Val Val Lys 260 265 270 Ser Lys Cys Arg Glu Asn Ala Ser Pro Phe Phe Phe Cys Cys Phe Ile 275 280 285 Ala Val Ala Met Gly Ile Arg Phe Ile Ile Met Val Thr Ile Trp Ser 290 295 300 Ala Val Phe Leu Asn Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu 305 310 315 320 Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys 325 330 335 Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser 340 345 350 Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser 355 360 365 Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met 370 375 380 Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly 385 390 395 400 Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly 405 410 415 Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys 420 425 430 Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Gly Ser Gly 435 440 445 Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn 450 455 460 Pro Gly Pro Met Arg Tyr Met Ile Leu Gly Leu Leu Ala Leu Ala Ala 465 470 475 480 Val Cys Ser Ala Ala Lys Lys Val Glu Phe Lys Glu Pro Ala Cys Asn 485 490 495 Val Thr Phe Lys Ser Glu Ala Asn Glu Cys Thr Thr Leu Ile Lys Cys 500 505 510 Thr Thr Glu His Glu Lys Leu Ile Ile Arg His Lys Asp Lys Ile Gly 515 520 525 Lys Tyr Ala Val Tyr Ala Ile Trp Gln Pro Gly Asp Thr Asn Asp Tyr 530 535 540 Asn Val Thr Val Phe Gln Gly Glu Asn Arg Lys Thr Phe Met Tyr Lys 545 550 555 560 Phe Pro Phe Tyr Glu Met Cys Asp Ile Thr Met Tyr Met Ser Lys Gln 565 570 575 Tyr Lys Leu Trp Pro Pro Gln Lys Cys Leu Glu Asn Thr Gly Thr Phe 580 585 590 Cys Ser Thr Ala Leu Leu Ile Thr Ala Leu Ala Leu Val Cys Thr Leu 595 600 605 Leu Tyr Leu Lys Tyr Lys Ser Arg Arg Ser Phe Ile Asp Glu Lys Lys 610 615 620 Met Pro Gly Gly Gly Gly Ser Asp Arg His Asp Ser Gly Leu Asp Ser 625 630 635 640 Met Gly Ser Gly Ser Gly Ala Leu Ala Pro Tyr Ile Pro 645 650 <210> 168 <211> 1335 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 168 atgattcatc tgggccacat tctgtttctg ctgctgctgc ccgtggccgc cgctcaaaca 60 acccccggcg agagaagctc tctgcccgct ttctatcccg gcacctccgg cagctgttcc 120 ggctgtggat ctctgtccct ccctctgctg gctggactgg tggctgccga tgctgtggcc 180 tctctgctga ttgtgggagc cgtgtttctg tgcgccagac ccagaagaag ccccgcccaa 240 gacggcaagg tgtacatcaa catgcccggc agaggcggag gaggcagcag agtcaagttc 300 tctagaagcg ctgatgcccc cgcttaccag caaggccaga accagctgta caacgaactg 360 aatctgggaa gaagagagga gtacgatgtg ctggacaaga ggagaggaag agaccccgag 420 atgggcggca aacctaggag gaagaaccct caagagggac tgtacaacga gctgcagaag 480 gataagatgg ccgaggccta ctccgagatc ggaatgaagg gcgagagaag aagaggcaaa 540 ggacacgatg gactgtacca aggactgagc accgccacaa aggacacata cgacgctctg 600 cacatgcaag ctctgcctcc cagaggaagc ggcgaaggaa gaggctctct gctgacatgc 660 ggagatgtgg aagagaatcc cggccccatg gggtggattc gtggtcggag gtctcgacac 720 agctgggaga tgagtgaatt tcataattat aacttggatc tgaagaagag tgatttttca 780 acacgatggc aaaagcaaag atgtccagta gtcaaaagca aatgtagaga aaatgcatct 840 ccattttttt tctgctgctt catcgctgta gccatgggaa tccgtttcat tattatggta 900 acaatatgga gtgctgtatt cctaaactca ttattcaacc aagaagttca aattcccttg 960 accgaaagtt actgtggccc atgtcctaaa aactggatat gttacaaaaa taactgctac 1020 caattttttg atgagagtaa aaactggtat gagagccagg cttcttgtat gtctcaaaat 1080 gccagccttc tgaaagtata cagcaaagag gaccaggatt tacttaaact ggtgaagtca 1140 tatcattgga tgggactagt acacattcca acaaatggat cttggcagtg ggaagatggc 1200 tccattctct cacccaacct actaacaata attgaaatgc agaagggaga ctgtgcactc 1260 tatgcctcga gctttaaagg ctatatagaa aactgttcaa ctccaaatac gtacatctgc 1320 atgcaaagga ctgtg 1335 <210> 169 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 169 Met Ile His Leu Gly His Ile Leu Phe Leu Leu Leu Leu Pro Val Ala 1 5 10 15 Ala Ala Gln Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr 20 25 30 Pro Gly Thr Ser Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro 35 40 45 Leu Leu Ala Gly Leu Val Ala Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile 50 55 60 Val Gly Ala Val Phe Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln 65 70 75 80 Asp Gly Lys Val Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly Gly Gly Gly Ser 85 90 95 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 100 105 110 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 115 120 125 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 130 135 140 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 145 150 155 160 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 165 170 175 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 180 185 190 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 195 200 205 Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu 210 215 220 Glu Asn Pro Gly Pro Met Gly Trp Ile Arg Gly Arg Arg Ser Arg His 225 230 235 240 Ser Trp Glu Met Ser Glu Phe His Asn Tyr Asn Leu Asp Leu Lys Lys 245 250 255 Ser Asp Phe Ser Thr Arg Trp Gln Lys Gln Arg Cys Pro Val Val Lys 260 265 270 Ser Lys Cys Arg Glu Asn Ala Ser Pro Phe Phe Phe Cys Cys Phe Ile 275 280 285 Ala Val Ala Met Gly Ile Arg Phe Ile Ile Met Val Thr Ile Trp Ser 290 295 300 Ala Val Phe Leu Asn Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu 305 310 315 320 Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys 325 330 335 Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser 340 345 350 Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser 355 360 365 Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met 370 375 380 Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly 385 390 395 400 Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly 405 410 415 Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys 420 425 430 Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val 435 440 445 <210> 170 <211> 1044 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 170 atgctgctgc tcgtgaccag cctgctgctg tgcgaactgc cccaccctgc ctttctgctg 60 atccccgaca tcgtgatgac ccagagccct agcagcctgg ccgtgtccgt gggcgagaaa 120 gtgaccatga gctgcaagag cagccagagc ctgctgttca gcagcaacca gaagaactac 180 ctggcctggt atcagcagaa gcccggccag agccccaagc tgctgatcta ctgggccagc 240 accagagaaa gcggcgtgcc cgatagattc accggctctg gcagcggcac cgacttcacc 300 ctgacaatca gcagcgtgaa ggccgaggac ctggctgtgt actactgcca gcagttctac 360 agcttccccc ggacctttgg cggaggcacc aagctggaaa tcaagagagg cggcggagga 420 agcggaggcg gaggatctgg cggagggggc tccggagggg gaggctctga agtgcagctg 480 gtggaaagtg gcggcggact cgtgaagcct ggcggctctc tgaagctgag ctgtgccgcc 540 agcggcttca ccttcagcag ctacgccatg tcctgggtgc gccagacccc cgagaagaga 600 ctggaatggg tggccacagt gtcctacggc ggcagctaca ccttctaccc cgacaatgtg 660 aagggccggt tcaccatcag ccgggacaac gccaagaaca acctgtacct gcagatgagc 720 cacctgaagt ccgaggatac cgccatgtac tattgcgcca gagactacga ctacgatttc 780 ttcgacagct ggggccaggg caccaccgtg acagtgtcca gcgagtctaa gtacggaccg 840 ccctgccccc cctgccccgg cgggggcggc agctgcctgg agaacaccgg caccttctgc 900 agcaccgccc tgctgatcac cgccctggcc ctggtgtgca ccctgctgta cctgaagtac 960 aagagcagaa gaagcttcat cgacgagaag aagatgcccg gcgggggcgg cagcgacaga 1020 cacgacagcg gcctggacag catg 1044 <210> 171 <211> 348 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 171 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ala Val Ser Val Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser 35 40 45 Gln Ser Leu Leu Phe Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr 50 55 60 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser 65 70 75 80 Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly 85 90 95 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Tyr Ser Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly 115 120 125 Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu 145 150 155 160 Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu 165 170 175 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp 180 185 190 Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Val Ser 195 200 205 Tyr Gly Gly Ser Tyr Thr Phe Tyr Pro Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe 210 215 220 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr Leu Gln Met Ser 225 230 235 240 His Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr 245 250 255 Asp Tyr Asp Phe Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 260 265 270 Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gly 275 280 285 Gly Gly Ser Cys Leu Glu Asn Thr Gly Thr Phe Cys Ser Thr Ala Leu 290 295 300 Leu Ile Thr Ala Leu Ala Leu Val Cys Thr Leu Leu Tyr Leu Lys Tyr 305 310 315 320 Lys Ser Arg Arg Ser Phe Ile Asp Glu Lys Lys Met Pro Gly Gly Gly 325 330 335 Gly Ser Asp Arg His Asp Ser Gly Leu Asp Ser Met 340 345 <210> 172 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 172 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 173 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 173 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 174 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 174 Val Thr Val Asp Cys Asn Leu Ser Met Met Trp Met Arg Phe Phe Val 1 5 10 15 Cys <210> 175 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 175 Thr Leu Leu Val Tyr Leu Phe Ser Leu Val Val Leu Val Leu Leu Thr 1 5 10 15 Val Gly Val Ser Ala 20 <210> 176 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 176 Arg Leu Arg Phe Ile 1 5 <210> 177 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 177 Tyr Thr Leu Met Met Val Ala Val Ile Gln Val Phe Trp Gly Leu Tyr 1 5 10 15 Val Lys Gly Trp Leu 20 <210> 178 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 178 His Arg His Phe Pro Trp Met Phe Ser Asp Gln Trp 1 5 10

Claims (54)

  1. 소포체 관련 분해(ER-associated degradation, ERAD) 메커니즘 단백질 결합 도메인과 표적 도메인을 포함하는 키메라 단백질 구조체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 ERAD 메커니즘 단백질 결합 도메인은 바이러스 소포체 상주 단백질의 막횡단 도메인 또는 이의 기능적 변이체 및 소포체 상주 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는, 키메라 단백질 구조체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 바이러스 소포체 상주 단백질은 아데노바이러스 E3-19K인, 키메라 단백질 구조체.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 바이러스 소포체 상주 단백질은 아데노바이러스 E3-19K가 아닌, 키메라 단백질 구조체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 바이러스 소포체 상주 단백질은, HCMV 당단백질 US2, US11, US3, US10, US6, HSV ICP47, CPXV12, BHV UL49.5, EBV BNFL2a, HCMV UL16, UL141, UL142, HIV Nef, HIV Vpu, HHV-7 U21, HHV-8 KK3, HHV-8 KK5, MHV-68 MK3, HTLV-1 p12, Cowpox Virus 단백질 CPXV203 중 적어도 하나로부터 선택되는 것인, 키메라 단백질 구조체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 분해 경로 구성원(예를 들어, E3 유비퀴틴 리가제, 프로테아좀, 리소좀) 결합 도메인을 더 포함하고，선택적으로, 상기 단백질 분해 경로 구성원 결합 도메인은 상기 ERAD 메커니즘 단백질 결합 도메인에 연결되는 것인, 키메라 단백질 구조체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 도메인은 표적 단백질을 특이적으로 표적하는 항체 및 이의 기능성 단편(예를 들어, Fd, Fv, Fab, Fab', F(ab')2, Fv(scFv), 단일 사슬 항체(scFv), 나노바디(nanobody), 디아바디(diabody), 트라이바디 및 테라바디)을 포함하는 것인, 키메라 단백질 구조체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 표적 단백질은 병원성 단백질이고, 선택적으로, 상기 병원성 단백질은 종양 관련 단백질, 바이러스 관련 단백질, 면역 기능 관련 단백질(면역 억제 단백질 및 면역 활성화 단백질 포함), 자가항원 단백질, 또는 신경 퇴행성 질병 관련 단백질인, 키메라 단백질 구조체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 자가항원 단백질은, 제1형 당뇨병 관련 자가항원, 예를 들면, 섬세포항원(ICA), 인슐린(IAA), 글루타메이트 탈탄산효소65(GAD65), 인슐린종항원-2(IA-2); 류마티스 관절염(RA) 관련 자가항원(autoantigen), 예를 들면, 시트룰린화 단백질/펩티드 항체, 이종리보핵단백질(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1), 알돌라아제(aldolase), 알파-에놀라아제(alpha-enolase), 칼레티쿨린(calreticulin), 열활성단백질(HSP60), BiP, PGK1, 스트레스 유발 인산 단백질 (stress-induced phosphoprotein 1), FUSE-BP1/2; 전신성 홍반 루푸스(SLE) 관련 자가항원, 예를 들면, 디옥시리보핵단백질, SmD1, SmD3, Clq, 부스럼항응고물(LA), 카디오리핀(CL), β2당단백질I(β2GPI), 프로트롬빈(PT) 및 포스파티딜세린(PS); 전신성 경화증(Systemic Sclerosis, SSc)/경피증(scleroderma, SD) 관련 자가항원, 예를 들면, Scl-70, SSA, Ro52；자가면역성 간 질병 관련 항원, 예를 들면, 미토콘드리아 항원, Spl00, PML, gp210, p62; 중증 근무력증 관련 자가항원, 예를 들면, 아세틸콜린 수용체; 중추 신경계 자가면역 질병(변연 뇌염, 뇌척수염, 소뇌 운동 실조증) 관련 자가항원, 예를 들면, 전압-게이트 칼륨 채널(VGKC) 복합체, 전압-게이트 칼슘 채널 수용체, α-아미노-3-하이드록시-5-메틸이소옥사졸-4-프로피온산(AMPA) 수용체, γ-아미노부티르산-B(GABAB) 수용체, 글리신 수용체; 다발성 경화증 관련 자가항원, 예를 들면, 미엘린 알칼리성 단백질(MBP), 미엘린 올리고덴드론사이트 당단백질(MOG); 다발성 근염(PM) 및 피부근염(DM) 관련 자가항원, 예를 들면, Jo-1, Mi-2, PM-Scl, Ro-52；글루텐 민감성 장질병 관련 자가항원, 예를 들면, 근내막 항체(EMA), 조직 트랜스글루타미나제(tTG); 항-NMDAR 항체 뇌염 관련 자가항원, 예를 들면, N-메틸-D-아스파르트산 수용체; 시신경척수염(NMO) 관련 자가항원, 예를 들면, 아쿠아포린 4(AQP4); 생식 관련 자가항원, 예를 들면, 난소 항원, 정자 항원으로 구성된 그룹에서 선택되는 것인, 키메라 단백질 구조체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 종양 관련 단백질은, BCL-2, c-MYC, Ras, HER2, BCR/ABL, ABL1/BCR, TGFB1, TLX1, P53, WNT1, WNT2, WT1, αv-β3, PKCa, ABL, BCL1, CD24, CDK4, EGFR/ERBB-1, HSTF1, INT1/WNT1, INT2, MDM2, MET, MYB, MYC, MYCN, MYCL1, RAFI, NRAS, REL, AKT2, APC, BCL2-ALPHA, BCL2-BETA, BCL3, BCR, BRCA1, BRCA2, CBL, CCND1, CDKN1A, CDKN1C, CDKN2A, CDKN2B, CRK, CRK-II, CSF1R/FMS, DBL, DDOST, PMS-2, PRAD-1, RAF, RHOM-1, RHOM-2, SIS, TAL2, TANI, TIAM1, TSC2, TRK, TSC1, STK11, PTCH, MEN1, MEN2, P57/KIP2, PTEN, HPC1, ATM, XPA/XPG, BCL6, DEK, AKAP13, CDH1, BLM, EWSR1/FLI1, FES, FGF3, FER, FGR, FLI1/ERGB2, FOS, FPS/FES, FRA1, FRA2, FYN, HCK, HEK, HER3/ERBB-2, ERBB-3, HER4/ERBB-4, HST2, INK4A, INK4B, JUN, JUNB, JUND, KIP2, KIT, KRAS2A, KRAS2B, LCK, LYN, MAS, MAX, MCC, MLH1, MOS, MSH2, MYBA, MYBB, NF1, NF2, P53, PDGFB, PIM1, PTC, RBI, RET, ROS1, SKI, SRC1, TALI, TGFBR2, THRA1, THRB, TIAM1, TRK, VAV, VHL, WAF1, WNT2, WT1, YES1, ALK/NPM1, AMI1, AXL, FMS, GIP, GLI, GSP, HOX11, HST, IL3, INT2, KS3, K-SAM, LBC, DCC, DPC4/SMAD4, E-CAD, E2F1/RBAP, ELK1, ELK3, EPH, EPHA1, E2F1, EPHA3, ERG, ETS1, ETS2, LMO-1, LMO-2, L-MYC, LYL1, LYT-10, MDM-2, MLH1, MLL, MLM, N-MYC, OST, PAX-5, PMS-1, FGF4, FGF6, FANCA, FLI1/ERGB2, FOSL1, FOSL2, GLI, HRAS1, HRX/MLLT1, HRX/MLLT2, KRAS2, MADH4, MASI, MCF2, MLLT1/MLL, MLLT2/HRX, MTG8/RUNX1, MYCLK1, MYH11/CBFB, NFKB2, NOTCH1, NPM1/ALK, NRG/REL, NTRK1, PBX1/TCF3, PML/RARA, PRCA1, RUNX1, RUNX1/CBFA2T1, SET, SHP2, TCF3/PBX1, TNFa, Clusterin, Survivin, ΤΟΕβ, c-fos, c-SRC, 에스트로겐 수용체 유전자 (estrogen receptor ER-α), 안드로겐 수용체 유전자 (Androgen receptor，AR) 및 INT-1로 구성된 그룹에서 선택된 발암 유전자에 의해 인코딩되는 것이며, 선택적으로, 상기 종양 관련 단백질은, Bcl-2가족구성원(예를 들어, Bcl-2, Bcl-xL과Bcl-w), VEGF/VEGFR, PDGFRβ, EGFR, EGFR돌연변이체, IGF-1R, HDACs, HER2, MYC, KRAS, AFP, CEA, CA199, 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor ER-α), 안드로겐 수용체 (Androgen receptor，AR), 타이로신 키나아제 (c-ABL, BCR-ABL, BTK, FAK, PTK6, Wee1, TRK 막횡단 수용체), 세린/트레오닌 산 키나아제 수용체(IRAK4, LRRK2, B-Raf, RIPK2, CDK4/6, CDK7, CDK8, CDK8/19, CDK9, TBK1), 단백질키나아제Ⅱ(CK2), 후성유전학적 관련 단백질(BRD2, BRD3, BRD4, BRDT, TRIM24, BRD9, PBRM1, SMARCA2, SMARCA4, EP300, EZH2, WDR5), 부신 수질 호르몬(ADM), DPP3로 구성된 그룹에서 선택되는 것인, 키메라 단백질 구조체.
  11. 제8항에 있어서, 상기 병원성 단백질은 바이러스 관련 단백질이고, HBV 표면 항원, HBV 캡시드 당단백질, HBeAg, HBV DNA폴리메라아제, HBV인코딩된X단백질(HBx), HIV Gag단백질, HIV Env단백질, HIV gp120, HIV-1역전사 효소, HIV gp120, HCV NS3-4A프로테아제, HCV RNA폴리메라아제, HCV외피(envelope)단백질, EBV DNA폴리메라아제, EBV EBNA1, 코로나바이러스 RNA 합성 효소, 코로나바이러스 스파이크 단백질, 코로나바이러스 외피 단백질, 코로나바이러스 막 단백질, 코로나바이러스 뉴클레오캡시드 단백질, RNA의존성RNA폴리메라아제(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)，예를 들면 신종 코로나바이러스 RNA의존성RNA폴리메라아제, 헤르페스 바이러스(Herpesviruses)DNA과RNA폴리메라아제, 헤르페스 바이러스 캡시드 당단백질, CMV DNA폴리메라아제, CMV캡스드 당단백질, RSV외피 단백질, RSV캡시드 단백질, RSV RNA폴리메라이제, 인플루엔자 바이러스 RNA폴리메라아제, 인플루엔자 바이러스 외피(envelope)단백질, HPV DNA폴리메라아제, HP캡스드 단백질로 구성된 그룹에서 선택되는 것인, 키메라 단백질 구조체.
  12. 제7항에 있어서, 상기 표적 단백질은 면역 기능 관련 단백질이고, 항원 제시 분자(예를 들면, MHC I분자, MHC II분자, MICA/B분자 등), 항원 인식 분자(예를 들면, TCR, CD123, NKG2D 등), 면역 체크포인트 분자(예를 들면 PD-1, PD-L1, CTLA4, TIM3, TIGIT, LAG3, A2AR, BTLA, IDO1, IDO2, TDO, KIR, NOX2, VISTA, SIGLEC7, PVR 등), 면역 자극/공동 자극 분자(예를 들면, CD3, CD80/86, CD28 등)로 구성된 그룹에서 선택되는 것인, 키메라 단백질 구조체.
  13. 제7항에 있어서, 상기 표적 단백질은 신경계 질병 관련 표적 단백질이고, Tau, β-아밀로이드 단백질(amyloid-β(Aβ)), α시뉴클레인, 돌연변이 헌팅틴(mutant huntingtin，mHTT), α-시뉴클레인, TAR RNA 결합 단백질(TARDBP) 및 FUS RNA 결합 단백질(FUS)로 구성된 그룹에서 선택되는 것인, 키메라 단백질 구조체.
  14. 제2항, 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 표적 도메인은 TCR에 특이적으로 결합하지 않는 것인, 키메라 단백질 구조체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 표적 도메인은 MHC I, MHC II, MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5 및/또는 ULBP6에 특이적으로 결합하고, 바람직하게는, MHC I는 HLA I 이고, 바람직하게는, MHC II는 HLA II 인, 키메라 단백질 구조체.
  16. 제4항에 있어서, 상기 표적 도메인은 TCR에 특이적으로 결합하는 것인, 키메라 단백질 구조체.
  17. 제16항에 있어서, 상기 바이러스 소포체 상주 단백질은, HCMV 당단백질 US2, US11, US3, US10, US6, HSV ICP47, CPXV12, BHV UL49.5, EBV BNFL2a, HCMV UL16, UL141, UL142, HIV Nef, HIV Vpu, HHV-7 U21, HHV-8 KK3, HHV-8 KK5, MHV-68 MK3, HTLV-1 p12, Cowpox Virus 단백질 CPXV203로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나인, 키메라 단백질 구조체.
  18. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 공동 발현 부분에 연결된, 키메라 단백질 구조체.
  19. 제18항에 있어서, 상기 적어도 하나의 공동 발현 부분은, 완전한 바이러스 ER 상주 당단백질(예를 들어, HCMV US2, US3, US11, US10, 아데노바이러스 E3-Kl 9, HCMV US6, HSV ICP47), 키메라 항원 수용체(CAR), 기능성 T세포 수용체(TCR), 케모카인 수용체, 및 NK 세포 활성화 수용체로 구성된 군에서 독립적으로 선택되는 것인, 키메라 단백질 구조체.
  20. 제19항에 있어서, 상기 케모카인 수용체는 CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR9, CCR2b, CXCR1, CXCR2 및 CXCR로 구성된 군에서 선택되는 것인, 키메라 단백질 구조체.
  21. 제20항에 있어서, 상기 NK 세포 활성화 수용체는, (a)NK 세포 활성화 수용체 세포외 도메인(ED) 또는 이의 기능적 변이체，(b)NK 세포 활성화 수용체 막횡단 도메인(TMD) 또는 이의 기능적 변이체，및 (c)NK 세포 활성화 수용체 세포내 도메인(ICD) 또는 이의 기능적 변이체；를 포함하고, 선택적으로, 상기 NK세포 활성화 세포외 도메인 또는 이의 기능적 변이체, 상기 NK 세포 활성화 수용체 막횡단 도메인 또는 이의 기능적 변이체 및/또는 상기 NK세포 활성화 수용체 세포내 도메인 또는 이의 기능적 변이체 간에는 힌지 또는 링커를 포함하는 것인, 키메라 단백질 구조체.
  22. 제21항에 있어서, 상기 NK 세포 활성화 수용체는 NKG2D, NKG2C, NKG2E, NKG2F, NKG2H, CD94, KIR2DL4, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR3DS1，천연 세포 독성 수용체, TRAIL, DNAM-1, CD16a, 2B4, NTB-A, CRACC 및 NKp80로 구성된 그룹에서 선택되는 것인, 키메라 단백질 구조체.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 NK 세포 활성화 수용체는 CNK 신호 전달 구성 요소와 복합체를 형성하는 것인, 키메라 단백질 구조체.
  24. 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 공동 발현 부분은 절단 가능한 링커를 통해 상기 키메라 단백질 구조체에 연결되는 것인, 키메라 단백질 구조체.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 키메라 단백질 구조체를 인코딩하는 핵산 분자.
  26. 제25항에 있어서, 상기 핵산 분자는 디옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA)(예를 들어, mRNA, 원형 RNA, ccRNA), 트레오스 핵산(TNA), 글리콜 핵산(GNA), 펩타이드 핵산(PNA), 잠긴 핵산(LNA, β-D-리보스 구성을 갖는 LNA, α-L-리보스 구성을 갖는 α-LNA(LNA의 비대칭 이성질체), 2'-아미노 기능화된 2'-아미노-LNA 및 2'-아미노 기능화된 2'-아미노-α-LNA를 포함), 에틸렌 핵산(ENA), 시클로헥세닐 핵산(CeNA) 및/또는 이들의 키메라 및/또는 조합인 것인, 핵산 분자.
  27. 제25항 또는 제26항의 핵산 분자를 포함하고, 상기 핵산 분자는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 조절 요소에 작동 가능하게 연결되어 상기 핵산 분자에 의해 인코딩된 키메라 단백질 구조체를 발현하는 것인, 벡터.
  28. 제27항에 있어서, 상기 벡터는, 플라스미드, 나노 플라스미드, 코스미드, 바이러스 벡터(예를 들어, 종양 용해성 바이러스 벡터), 미니서클, RNA 벡터 또는 선형 또는 원형 DNA(예를 들어, 트랜스포존 DNA) 또는 RNA 분자로 구성된 군에서 선택되는 것인, 벡터.
  29. 제28항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터이고, 레트로바이러스, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스, 파보바이러스(예를 들어, 아데노 연관 바이러스), 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터, 코로나바이러스, 음성 가닥 RNA 바이러스 예를 들어 오르코믹소바이러스(예를 들어, 인플루엔자 바이러스), 라브도바이러스(예를 들어, 광견병 및 수포성 구내염 바이러스), 파라믹소바이러스(예를 들어, 홍역 및 센다이), 양성 가닥 RNA 바이러스(예를 들어, 피코르나바이러스), 알파바이러스 및 이중 가닥 DNA 바이러스로 구성된 그룹에서 선택되는 것이고, 상기 이중 가닥 DNA 바이러스는 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스(예를 들어, 단순 헤르페스 바이러스 유형 I 및 II, 엡스타인-바 바이러스, 거대세포바이러스) 및 폭스 바이러스(예를 들어, 우두, 계두, 카나리아폭스), 노워크바이러스, 토가바이러스, 플라비바이러스, 레오바이러스, 파포바이러스, 헤파드나바이러스, 바큘로바이러스 및 간염 바이러스, 바이러스 유사 입자(VLP)를 포함하는 것인, 벡터.
  30. 제29항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터인, 벡터.
  31. 제30항에 있어서, 상기 레트로바이러스 벡터는 조류 백혈구 증식 육종, 포유류 C형, B형 바이러스, D형 바이러스, HTLV-BLV 수집, 렌티바이러스, 버블 바이러스로 구성된 군에서 선택되는 것인, 벡터.
  32. 제29항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인, 벡터.
  33. 제32항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터는 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV 또는 양의 탈수초성 뇌백질염 렌티바이러스에서 선택되는 것인, 벡터.
  34. 제27항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 다른 벡터와 추가로 결합하고, 상기 다른 벡터는 다른 핵산 분자를 포함하며, 상기 다른 핵산 분자는 적어도 하나의 공동 발현 부분을 인코딩하는 것인, 벡터.
  35. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 키메라 단백질 구조체를 발현하거나, 제26항의 핵산 분자를 포함하거나, 제27항 내지 제33항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 조작된 세포.
  36. 제35항에 있어서, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 키메라 단백질 구조체 및 공동 발현 부분을 발현하는, 조작된 세포.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 세포는 면역 세포이고, T세포, 자연 살해(NK)세포, B세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포, 호중구 또는 γδT세포로 구성된 군에서 선택되는 것인, 조작된 세포.
  38. 제37항에 있어서, 상기 T세포는, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 세포 독성 T 세포, 말단 이펙터 T 세포, 기억 T 세포, 순진 T 세포, 조절 T 세포로 구성된 세포군, 자연 살해 T 세포, 감마-델타 T 세포, 사이토카인 유도 살해(CIK) T 세포 및 종양 침윤 림프구로 구성된 군에서 선택되는 것인, 조작된 세포.
  39. 제25항 또는 제26항의 핵산 분자를 발현하기에 적합한 조건하에서, 제27항 내지 제34항 중 어느 한 항의 벡터를 개시 세포에 도입하는 것을 포함하는, 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항의 조작된 세포를 생산하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 개시 세포는 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화된 세포인 것인, 조작된 세포를 생산하는 방법.
  41. 제38항에 있어서, 상기 줄기세포는 조혈 전구 세포(예를 들면 T 세포 전구 세포, NK 세포 전구 세포, 대식세포 전구 세포), 조혈 줄기 세포(HSC), CD34+ 세포, 배아 세포주, 중간엽 줄기 세포 또는 iPSC 세포인 것인, 조작된 세포를 생산하는 방법.
  42. 제37항에 있어서, 상기 세포는 면역 세포인 것인, 조작된 세포를 생산하는 방법.
  43. 제40항에 있어서, 상기 면역 세포는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, B 세포, 대식세포, 단핵구, 또는 수지상 세포인 것인, 조작된 세포를 생산하는 방법.
  44. 제41항에 있어서, 상기 T 세포는, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 세포 독성 T 세포, 말단 이펙터 T 세포, 기억 T 세포, 순진 T 세포, 조절 T 세포로 구성된 세포군, 자연 살해 T 세포, 감마-델타 T 세포, 사이토카인 유도 살해(CIK) T 세포, 및 종양 침윤 림프구로 구성된 군에서 선택되는 것인, 조작된 세포를 생산하는 방법.
  45. 제39항 내지 제44항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생체외에서 생산되 세포 집단.
  46. (i) 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 키메라 단백질 구조체 또는 제25항 또는 제26항의 핵산 분자 또는 제27항 내지 제34항 중 어느 한 항의 벡터 또는 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항의 조작된 세포 또는 제45항의 세포 집단, 및 (ii) 약학적으로 허용되는 비히클을 포함하는, 약물 조성물 또는 키트.
  47. 제27항 내지 제34항 중 어느 한 항의 벡터를 표적 단백질을 발현하는 세포내로 전달하는 것을 포함하는, 표적 단백질을 분해하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 세포는 종양 세포, 바이러스 감염 세포, 신경 세포, 이식된 세포, 면역 세포에서 선택되는 것인, 표적 단백질을 분해하는 방법.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 상기 전달은 바이러스 벡터(예를 들어, 종양 용해 바이러스)를 통해 전달하는 것을 포함하는, 표적 단백질을 분해하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 벡터는 세포내에서 제1항 내지 제24항 중 어느 하나 항의 키메라 단백질 구조체를 발현하는 것인, 표적 단백질을 분해하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 키메라 단백질 구조체는 표적 단백질과 ERAD 메커니즘 단백질에 동시에 결합함으로써 상기 표적 단백질을 분해하는 것인, 표적 단백질을 분해하는 방법.
  52. 치료 유효량의 제46항의 약물 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료가 필요한 대상체의 상태 또는 질병을 치료하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 질병에는, 다양한 고형 종양 및 혈액학 종양, 바이러스 감염성 질병, 자가면역 질병 및 신경 및 퇴행성 질병(예를 들어, 알츠하이머 질병), 대사성 질병(예를 들어, 당뇨병(예를 들어, II형 당뇨병), 지질 대사 관련 질병(예를 들어, 종양 지질 대사, 비알코올 지방간), 죽상경화증(Atherosclerosis, AS), 종양 포도당 대사)을 포함하고;
    바람직하게는, 상기 고형 종양은 신경계 종양, 두경부 종양, 흉부 종양, 소화기 계통 종양, 비뇨생식기계 종양, 연조직 및 피부 종양, 골종양 등에서 선택되고;
    바람직하게는, 신경계 종양에는 확산성 신경교종, 확산성 성상세포종 및 역형성 성상세포종, 교모세포종, 희소돌기아교세포종, 핍지교성상세포종, 확산성 신경교종, 기타 성상세포종, 죄질피복세포종, 신경세포와 혼합 신경아교종, 수모세포종, 기타 배아성 종양, 신경초종, 수막종, 고립성 섬유종 및 혈관주위세포종 등을 포함하고;
    바람직하게는, 두경부 종양에는 비강의 내강과 부비동의 악성 종양, 비인두암, 구강암, 후두암, 침샘 종양, 두개 내 종양, 갑상선암, 설암 등을 포함하고;
    바람직하게는, 흉부 종양에는 폐암, 식도암, 분문암, 유방암, 종격막 종양 등을 포함하고;
    바람직하게는, 소화기 계통 종양에는 위암, S상 결장암 및 직장암, 간암, 췌장암과 팽대부주위암, 담도암, 소장의 악성종양 등을 포함하고;
    바람직하게는, 비뇨생식기계 종양에는 신장암, 전립선암, 방광암, 고환암, 음경암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암 등을 포함하고;
    바람직하게는, 연조직 및 피부 종양에는 악성 섬유 조직 세포종, 횡문근육종, 활막육종, 피부의 악성 흑색종 등을 포함하고;
    바람직하게는, 골종양에는 골육종, 유잉육종 등을 포함하고;
    바람직하게는, 상기 결장암은 결장선종이고;
    바람직하게는, 상기 유방암은 삼중 음성 유방암 세포이고;
    바람직하게는, 상기 간암은 간세포 암종이고;
    바람직하게는, 상기 질병은 백혈병, 림프종(HL), 다발성 골수종(MM), 골수이형성성증후군(MDS) 등에서 선택되는 혈액 종양이고;
    바람직하게는, 상기 백혈병은 B세포 급성림프구성백혈병, T세포 급성림프구성백혈병, 급성골수성백혈병 등이고;
    바람직하게는, 바이러스 감염성 질병에는 호흡기 바이러스성 질병, 위장 바이러스성 질병, 간 바이러스성 질병, 피부 및 점막 바이러스성 질병, 안구 바이러스성 질병, 중추신경계 바이러스성 질병, 림프구성 바이러스성 질병, 곤충 매개 바이러스성 질병, 렌티바이러스 감염 질병 등이 포함되고;
    바람직하게는, 호흡기 바이러스성 질병에는 라이노 바이러스, 아데노 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 파라 인플루엔자 바이러스, 코로나바이러스, 인플루엔자, 유행성 이하선염의 감염 등이 포함되고;
    바람직하게는, 위장 바이러스성 질병에는 소아마비, 쿡사키 바이러스 감염, ECHO 바이러스 감염, 바이러스성 위장염이 포함되고, 로타 바이러스 위장염은 노르워크 바이러스 위장염, 아데노 바이러스 위장염, 아스트로 바이러스 위장염, 코로나 바이러스 위장염, 칼리시 바이러스 위장염 등이 포함되고;
    바람직하게는, 간 바이러스성 질병에는 바이러스성 A형 간염, 바이러스성 B형 간염, 바이러스성 C형 간염, 바이러스성 D형 간염, 바이러스성 E형 간염, 엡스타인-바 바이러스성 간염, 거대 세포 바이러스 간염 등이 포함되고;
    바람직하게는, 피부 및 점막 바이러스성 질병에는 홍역, 풍진, 영아 급성 발진, 수두 및 대상 포진, 천연두, 단순 포진 바이러스 감염, 광견병 및 구제역 등이 포함되고;
    바람직하게는, 안구 바이러스성 질병에는 유행성 각결막염, 여포성 결막염, 헤르페스성 각결막염 등이 포함되고;
    바람직하게는, 중추신경계 바이러스성 질병에는 일본뇌염, 서부말뇌염, 동부말뇌염, 세인트루이스뇌염, 베네수엘라말뇌염, 머레이밸리뇌염, 캘리포니아뇌염, 산림뇌염 및 림프구성 맥락막총수막염 등이 포함되고;
    바람직하게는, 림프구성 바이러스성 질병에는 전염성 단핵증, 거대 세포 바이러스 감염 및 후천성 면역 결핍 증후군 등이 포함되고;
    바람직하게는, 곤충 매개 바이러스성 질병에는 유행성 출혈열이 포함되고, 황열, 크림-콩고 출혈열, 리프트밸리열, 아르헨티나 출혈열, 볼리비아 출혈열, 라싸열, 오무스크럽 출혈열, 마르부르크병, 에볼라 출혈열 등이 포함되며, 뎅기열 및 뎅기출혈열, 웨스트나일열, 콜로라도 진드기 열전달병, 모래파리열 등이 포함되고;
    바람직하게는, 렌티바이러스 감염 질병에는 아급성 경화범뇌염, 쿠루병, 진행성 다초점 백색질뇌증, 아급성 해면상 뇌병증(피질선조체 척수 변성) 등이 포함되고;
    바람직하게는, 자가면역 질병에는 장기 특이적 자가면역 질병과 전신성 자가면역 질병이 포함되고;
    바람직하게는, 장기 특이적 자가면역 질병에는 만성 림프구 갑상선염, 갑상선 기능 항진증, 인슐린 의존성 당뇨병, 중증 근무력증, 궤양성 대장염, 만성 위축성 위염을 동반한 악성빈혈, 폐출혈성 신염 증후군, 심상성천포창, 유천포창, 원발성 담도성 간경변, 다발성 경화증, 급성 특발성 다발 신경염 등이 포함되고;
    바람직하게는, 전신성 자가면역 질병에는 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 전신 혈관염, 경피증, 천포창, 피부근염, 혼합 결합 조직 질병, 자가면역 용혈성 빈혈, 갑상선 자가면역 질병, 궤양성 대장염 등이 포함되고;
    바람직하게는, 신경 질병에는 신경계 질병, 삼차 신경통과 같은 말초 신경 질병, 안면 마비, 반안면 경련, 전정 신경염, 설인 신경통, 단신경 질병, 상완 신경총 신경통, 다발성 단신경 병증, 다발성 신경 병증, 급성 염증성 탈수초성 다발성 신경 병증, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경 병증이 포함되고;
    척수염, 압박척수병, 압박성 척수증, 척수의 아급성 복합 변성, 척수공동증, 척수 혈관 질병, 척수 지주막염과 같은 척수 질병;
    일과성 허혈성 발작, 뇌경색, 뇌출혈, 지주막하출혈, 두개내정맥계 혈전증 등과 같은 뇌혈관 질병;
    바이러스, 박테리아, 곰팡이 또는 기생충 등의 감염으로 인한 뇌수막염, 뇌염 등, 및 렌티바이러스 감염으로 인한 렌티바이러스성 뇌염 등과 같은 중추신경계 감염성 질병;
    다발성 경화증, 시신경척수염, 급성 파종성 뇌척수염, 대뇌백질이영양증 등과 같은 중추신경계 탈수축성 질병;
    파킨슨병, 무도병, 간렌즈핵변성, 근긴장이상증, 본태성 진전, 지연성운동장애 등과 같은 운동장애질병;
    뇌전증;
    편두통, 긴장성 두통, 군발성 두통 등과 같은 두통;
    운동뉴런질병, 알츠하이머병, 루이소체치매, 전측두엽 치매, 다계통 위축증 등과 같은 신경계 변성질병;
    유전성 운동 실조, 유전성 강직성 하반신 마비, 샤르코-마리-투스병, 신경섬유종증, 결절성 경화증, 뇌혈관종양증 등과 같은 신경계 유전성 질병;
    선천성 수두증, 뇌성마비, 두개저함입증, 소뇌 편도하 질병 등과 같은 신경발달 장애;
    중증근무력증, 주기성마비, 다발성근염, 진행성근영양증, 근강직성근병증(근긴장성이영양증, 선천성근강직증), 대사성근병증(미토콘드리아근병증, 지질축적근병증, 당원축적증) 등과 같은 신경근 접합부과 근육 질병;
    레이노병, 지단홍통증, 반안면 위축증, 전신성 자율 기능 부전, 자발적 다한증, 진행성 지방 이영양증 등과 같은 자율 신경계 질병;
    신경교종, 림프종, 수막종 등과 같은 신경계 종양;
    부종양 소뇌변성, 부종양 뇌척수염, 아급성 괴사성 척수증, 아급성 운동신경질병, 부종양 감각신경질병 등과 같은 신경계의 부종양증후군;
    바람직하게는, 당뇨병, 고지혈증, 통풍 등과 같은 대사성 질병;을 포함하는 것인, 치료가 필요한 대상체의 상태 또는 질병을 치료하는 방법.
  54. 제46항의 약물 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법.
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