KR20230151524A - 전통 한약 달임 연교-황기 추출물에서 유래한 마이크로 rna 및 이의 제조방법 및 용도 - Google Patents

전통 한약 달임 연교-황기 추출물에서 유래한 마이크로 rna 및 이의 제조방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 전통 한약 달임 연교-황기 추출물에서 유래한 마이크로 RNA 및 이의 제조방법 및 용도를 개시하며, 여기서 마이크로RNA는 서열번호 1 내지 15와 같은 뉴클레오티드 서열을 갖는 miRNA(마이크로 리보핵산)로부터 선택되고, 바람직하게는 인공적으로 합성된 QQ_159, 식물 QQ_159 및 전구체 형태의 QQ_159 또는 숙성된 형태의 QQ_159 중 하나이고, QQ_159의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.14이다. 본 발명은 전통 한약 달임 연교-황기 추출물에서 유래한 마이크로 RNA 또는 식물 마이크로 RNA를 개시하고, 전통 한약 달임 연교-황기 추출물에서 추출한 추출된 마이크로RNA QQ_159가 신종 코로나바이러스 감염으로 인한 바이러스성 인플루엔자 및 폐렴에 대한 일정한 억제효과 및 치료효과를 가짐을 입증하는 것을 목적으로 한다.

Description

전통 한약 달임 연교-황기 추출물에서 유래한 마이크로 RNA 및 이의 제조방법 및 용도
본 발명은 생물의약품 기술분야에 속하며, 구체적으로 전통 한약 달임 연교-황기 추출물에서 유래한 마이크로 RNA 및 이의 제조방법 및 용도에 관한 것이다.
인플루엔자(Flu)는 포유류와 가금류가 흔히 걸리는 급성 호흡기 질환으로, 인플루엔자 바이러스에 의해 발생하며, 감염성이 강하고 전파 속도가 빠르며, 일반적으로 기침, 발열, 근육통, 오한 또는 발한 및 기타 임상 증상을 포함한 단순 호흡기 감염을 유발하여 2일 ~ 8일까지 불편한 느낌을 지속될 수 있으며, 일반적으로 급속한 질병을 유발한다. 일부 환자들, 특히 노인, 어린 아이 및 기타 만성 질환을 가진 환자들은 바이러스성 또는 2차성 폐렴에 걸리기 쉽고, 심지어 호흡 곤란 및 다발성 장기 부전을 동반하기도 한다. 항인플루엔자 약물은 현재 인플루엔자에 저항하기 위한 일반적인 접근법이며, 처방은 일반적으로 환자의 감염 정도 및 환자의 신체 상태에 따라 결정된다. 인플루엔자 바이러스는 가장 깊이 연구된 병원체 중 하나이지만, 인플루엔자 바이러스의 극심한 변이성으로 인해 기존의 통제 및 치료 체계는 지속적으로 개선될 필요가 있으며, 바이러스 인플루엔자에 대한 신약 개발은 현재 사회와 시민 보건을 위해 필요하다.
신종 코로나바이러스(nCoV)는 최근 2년간 광범위하게 확산되는 신종 바이러스로, 주로 비말 형태의 호흡기 경로를 통해 전파되며, 최근에는 에어로졸 및 물품 접촉을 통해 신종 코로나바이러스가 전파되는 것으로 밝혀졌다. 신종 코로나바이러스는 감염성이 매우 강하고 확산 속도가 매우 빠르며, 임상 증상은 주로 다음과 같다. 발열, 피로감, 마른 기침, 후각 결손/장애, 중증의 경우 호흡 곤란, 빈맥성 및 저산소혈증을 동반한 중증 폐렴을 동반할 수 있으며, 다른 합병증을 유발할 수도 있다. 현재 신종 코로나바이러스를 목표로 하는 특정 치료약이 없기 때문에 코로나바이러스는 전 세계로 대규모 확산될 수 있다. 따라서 전염병 예방 및 통제를 위한 의약품 수요를 고려할 때, nCoV에 특화된 신약을 연구 개발하는 것은 nCoV에 대처하고 사람들의 생명 안전을 보장하는 중요한 수단이다.
마이크로RNA(miRNA)는 마이크로 내인성 비코딩 RNA이다. 일반적으로 miRNA 코딩 유전자는 RNA 폴리머라제Ⅱ(RNA Polymaerase)에 의해 전사되고, RNaseⅢ 엔도뉴클레아제(RNase Ⅲ endonuclease)인 드로샤(Drosha)와 다이서(Dicer)에 의해 약 21개의 뉴클레오티드의 마이크로RNA로 처리되는 1차 전사체를 생성한다. miRNA는 다양한 생리학적, 병리학적 과정에서 중요한 역할을 하는 표적 mRNA의 코딩 영역 또는 3' 및 5' 비번역 영역과의 결합을 통해 전사 후 유전자 침묵을 매개하며 의료 분야에서 광범위한 응용 가능성을 가지고 있다.
최근 식물 miRNA의 관련 연구가 급속도로 발전하고 있으며, 식물 miRNA의 생물학적 기능은 주로 상향조절/하향조절 전략을 통해 연구되고 있으며, 다수의 연구에서 식물 miRNA는 광합성, 영양 항상성, 성장 및 발달, 호르몬 신호 전달, 스트레스 반응 등의 측면에서 중요한 역할을 한다는 것을 보여주고 있으며, 또한 식물 miRNA는 동물의 유전자 발현을 내인성 miRNA로 조절하는 것으로 나타났다. 다수의 문헌에서 한의학이 인플루엔자 및 신종 코로나바이러스 폐렴의 예방 및 치료 과정에 적극적인 역할을 한다고 보고하고 있으나, 구체적인 활성 성분은 아직 불분명한 실정이다. 한의약품에 miRNA가 포함되어 있다는 문헌 보고는 있었지만, 아직까지 한의학 달임액에 어떤 안정적인 miRNA가 존재하는지, 이러한 miRNA가 동물의 체내에 들어갈 때 어떤 역할을 할 것인지에 대한 연구는 거의 없는 실정이다.
종래 기술의 미비점을 고려하여, 본 발명은 전통 한약 달임 연교-황기 추출물에서 유래한 마이크로 RNA 및 이의 제조방법 및 용도와 전통 한약 달임 연교-황기 추출물에서 유래한 마이크로 RNA를 함유하는 기능적 식물 마이크로 RNA 또는 추출물을 제공하고, 실험적 테스트를 통해 연교-황기 추출물에서 유래한 마이크로 RNA QQ_159가 새로운 코로나바이러스 감염으로 인한 바이러스성 인플루엔자 및 폐렴에 대해 특정 억제 효과와 치료 효과가 있음을 입증한다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 전통 한약 달임 연교-황기 추출물에서 유래한 마이크로 RNA에 있어서, 상기 마이크로 RNA는 novel_mir7, novel_mir33, novel_mir35, novel_mir10, novel_mir20, novel_mir5, novel_mir36, novel_mir28, novel_mir31, ppt-miR894, novel_mir32, novel_mir21, pab-miR3711, QQ_159 또는 bdi-miR159a-3p 중에서 선택되고, 상기 novel_mir7의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.1이고, 상기 novel_mir33의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.2이고, 상기 novel_mir35의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.3이고, 상기 novel_mir10의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.4이고, 상기 novel_mir20의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.5이고, 상기 novel_mir5의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.6이고, 상기 novel_mir36의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.7이고, 상기 novel_mir28의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.8이고, 상기 novel_mir31의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.9이고, 상기 ppt-miR894의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.10이고, 상기 novel_mir32의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.11이고, 상기 novel_mir21의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.12이고, 상기 pab-miR3711의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.13이고, 상기 QQ_159의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.14이고, 상기 bdi-miR159a-3p의 뉴클레오티드 SEQ ID NO.15이다.
상기 마이크로RNA는 인공적으로 합성된 QQ_159, 식물 QQ_159 및 전구체 형태의 QQ_159 또는 숙성된 형태의 QQ_159 중 하나의 QQ_159이다.
전통 한약 달임 연교-황기 추출물에서 유래한 마이크로 RNA 제조 방법은 아래의 단계를 포함한다.
단계 1) 전통 한약 달임 연교-황기 추출물 300ml 각각을 50ml 효소 제거 원심 분리 튜브에 나누어 채우고, 2000rpm으로 원심 분리하여 불순물을 제거하고, 각 튜브에서 상등액 10ml을 흡입하여 얼음 위에 두고, TRI졸 30ml을 달인양의 3배 비율로 첨가하고 힘있게 균일하게 흔들어 섞은 후 상온에서 10분 간 둔 후, 클로로포름 6ml를 첨가하여 힘있게 균일하게 흔들어 섞은 후 10분간 방치하고, 단계 2) 10000 g 및 4 ℃에서 10 분 동안 원심 분리하고 상등액을 채취하고, 단계 3) 혼합물과 동일한 부피의 이소프로판올을 첨가하여 -20℃에서 1시간 동안 침전시킨 후 12000 g에서 15분 동안 원심 분리하여 침전시키고, 단계 4) 상등액은 조심스럽게 제거하고 75% 에탄올 5 mL를 첨가하여 침전물을 세척한 후 12000 g에서 4℃에서 5분간 원심 분리하여 침전물을 세척하고, 단계 5) 원심 분리 후 에탄올을 조심스럽게 제거하고 침전물을 남기고 침전물을 건조한 후 65℃ DEPC 처리수 200 μL를 넣어 침전물을 녹인 후 RNA 농도를 결정하고, 단계 6) miRNA는 상업용 miRNA 분리 키트(100.μg의 RNA가 각 컬럼을 통과함)에 의해 정제되고 60 μL DEPC 처리된 물에 의해 각 튜브에 용해하고, 단계 7) miRNA의 농도를 결정하고 8시간 동결 건조하여 -80℃에서 보관한다.
전통 한약 달임 연교-황기 추출물에서 유래한 마이크로 RNA를 통해 인플루엔자 바이러스의 복제를 억제하기 위한 약제의 제조 방법.
전통 한약 달임 연교-황기 추출물에서 유래한 마이크로 RNA를 통해 인플루엔자 바이러스를 치료하기 위한 약제의 제조 방법.
상기 인플루엔자는 빅토리아 인플루엔자 B 또는 H5N1 조류 인플루엔자인 약제의 제조 방법.
전통 한약 달임 연교-황기 추출물에서 유래한 마이크로 RNA를 통해 SARS-CoV-2 바이러스 복제를 억제하기 위한 약제의 제조 방법.
전통 한약 달임 연교-황기 추출물에서 유래한 마이크로 RNA를 통해 SARS-CoV-2 바이러스에 의한 바이러스성 폐렴을 치료하기 위한 약제의 제조 방법.
마이크로RNAs QQ_159 및 이의 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 복제 억제 및/또는 인플루엔자 치료용 약학 조성물.
마이크로RNAs QQ_159 및 이의 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 SARS-CoV-2 바이러스의 복제 억제 및/또는 SARS-CoV-2 바이러스에 의한 바이러스성 폐렴 치료용 약학 조성물.
본 발명은 전통적인 한약용 약액으로부터 마이크로RNA를 추출하기 위한 실험적인 시험방법을 제공하고, 이를 통해 전통 한약 달임 연교-황기 추출물에 안정적으로 존재하는 15종의 마이크로RNA를 최초로 추출하고 확인하였다. 마이크로RNA QQ_159는 바이러스성 인플루엔자 및 신종 코로나바이러스 감염으로 인한 폐렴에 대해 특정 억제 효과와 치료 효과가 있음이 입증되었다. 본 발명은 한의학의 천연 항바이러스 유효성분을 얻을 뿐만 아니라, 신종 코로나바이러스 감염으로 인한 인플루엔자 또는 폐렴을 임상적으로 치료할 수 있는 핵산의약품을 제공한다.
도 1은 실시예 2에서 실시간 PCR에 의해 검사된 마이크로 RNA QQ_159가 인플루엔자 B 바이러스 부하에 미치는 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 3에서 조류인플루엔자 H5N1 바이러스에 감염된 쥐의 마이크로 RNA QQ_159가 체중에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 3에서 조류인플루엔자 H5N1 바이러스에 감염된 쥐의 생존율에 대한 마이크로 RNA QQ_159의 영향을 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 3에서 HE 염색시험을 통해 조류인플루엔자 H5N1에 감염된 쥐에서 폐 염증에 대한 마이크로 RNA QQ_159의 억제효과를 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 3에서 실시간 PCR에 의해 검사된 3일차(A) 및 5일차(B)에 조류 인플루엔자 H5N1에 감염된 쥐의 폐바이러스 부하에 대한 마이크로 RNA QQ_159의 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 4에서 HE 염색 검출을 통해 SARS-CoV-2 바이러스에 감염된 쥐에서 폐 염증에 대한 마이크로 RNA QQ_159의 억제 효과를 나타낸 것이다.
본 발명의 기술적 문제점, 기술적 해결방안 및 장점을 보다 명확하게 하기 위하여 첨부된 도면을 참조하여 이하의 상세한 설명 및 구체적인 실시예를 설명한다.
실시예 1: 전통 한약 달임 연교-황기 추출물에서 마이크로 RNA 추출
(1) 전통 한약 달임 연교-황기 추출물 300ml (금은화(Lonicerae Japonicae Flos), 연교(Forsythiae Fructus), 하수오(Scutellariae Radix), 개똥쑥(Artemisiae Annuae Herba), 생 황기(raw Astragali Radix), 초백출(roasted Atractylodis Macrocephalae Rhizoma), 배초향(Agastache rugosa), 방풍(Saposhnikoviae Radix), 소엽맥문동(Ophiopogon japonicus), 감초(Glycyrrhiza uralensis)) 각각을 50ml 효소 제거 원심 분리 튜브에 나누어 채우고, 2000rpm으로 원심 분리하여 불순물을 제거한다. 각 튜브에서 상등액 10ml을 흡입하여 얼음 위에 둔다. TRI졸 30ml을 달인양의 3배 비율로 첨가하고 힘있게 균일하게 흔들어 섞은 후 상온에서 10분 간 둔 후, 클로로포름 6ml를 첨가하여 힘있게 균일하게 흔들어 섞은 후 10분간 방치한다.
(2) 원심 분리는 10000 g, 4 ℃에서 10분간 실시하고 상등액을 채취한다.
(3) 혼합물과 동일한 부피의 이소프로판올을 첨가하여 1시간(-20℃) 동안 침전시킨 후 12000 g에서 15분 동안 원심 분리하여 침전시킨다.
(4) 상등액은 조심스럽게 제거하고 75% 에탄올 5 mL를 첨가하여 침전물을 세척한 후 12000 g에서 4℃에서 5분간 원심 분리하여 침전물을 세척한다.
(5) 원심 분리 후 에탄올을 조심스럽게 제거하고 침전물을 남기고 침전물을 건조한 후 65℃ DEPC 처리수 200 μL를 넣어 침전물을 녹인 후 RNA 농도를 결정한다.
(6) miRNA는 상업용 miRNA 분리 키트(100.μg의 RNA가 각 컬럼을 통과함)에 의해 정제되고 60 μL DEPC 처리된 물에 의해 각 튜브에 용해한다.
(7) miRNA의 농도를 결정하고 8시간 동결 건조하여 -80℃에서 보관한다.
(8) miRNA는 BGISEQ-500 기법으로 염기서열을 분석하였으며, 그 결과는 아래의 표 1과 같다.
표 1은 전통 한약 달임 연교-황기 추출물에서 유래한 마이크로RNA 서열 목록이다.
miRNA id SEQ ID Sequence（5'-3'）
novel_mir7 1 CCAGCACUAAUGCACCGGAUCCCAUCAG
novel_mir33 2 UGGGAAGUCCUCGUGUUGUACCCCU
novel_mir35 3 GCCUUCGAUGUCGGCUCUUCCUAUCAUU
novel_mir10 4 UCGUCCAGCGGUUAGGAUAUCUGGCUUUC
novel_mir20 5 GCGGAUCUUGGUGGUAGUAGCAAA
novel_mir5 6 CUCGGGAAAAGGAUUGGCUCUGAGGGCUGG
novel_mir36 7 ACACAUGCAAGUCGAACGUUGUUUU
novel_mir28 8 GUGUGCACCGGUCGUCUCGUCCCUUCUG
novel_mir31 9 UCUGGGUGGUGUAGUUGGUUAUCA
ppt-miR894 10 CGUUUCACGUCGGGUUCACC
novel_mir32 11 GUGGUUAGGACAUCGUCUUUUCA
novel_mir21 12 GUCUGUAGUUCGAUCCUGCAUGGGGG
pab-miR3711 13 UGGCGCUAGAAGGAGGGCCU
QQ_159 14 UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUA
bdi-miR159a-3p 15 CUUGGAUUGAAGGGAGCUCU
실시예 2: MDCK(Madin Darby dog kidney) 세포에서 QQ_159가 B형 인플루엔자 바이러스 부하에 미치는 영향의 결정
(1) MDCK 세포는 24-웰 배양 플레이트에서 배양된다.
(2) 10 nM, 50 nM 또는 100 nM QQ_159a는 상업적 형질 전환 시약인 riboFECTTM CP에 의해 각각 MDCK 세포에 형질 감염되는 반면, 동일한 농도의 넌센스 서열은 대조군으로서 MDCK 세포에 형질 감염된다.
(3) 상기 세포는 빅토리아 B 인플루엔자 바이러스에 감염된 세포이다.
(4) 24시간 동안 바이러스를 감염시킨 후, 상층액을 채취하여 원심 분리하고 세포를 병합하여 RNA를 추출한 후 실시간 PCR로 바이러스 부하를 검출한다.
그 결과는 도 1에 도시된 바와 같으며, 대조군과 비교하여 100 nM QQ _159는 MDCK 세포에서 빅토리아 B 인플루엔자 바이러스의 바이러스 부하를 유의하게 억제할 수 있다.
실시예 3: H5N1 아형 조류인플루엔자 바이러스에 감염된 쥐에 대한 QQ_159의 치료 효과 측정
(1) H5N1 아형 조류 바이러스에 감염된 지 2시간이 지난 생후 6주 된 BALB/C 암컷 쥐의 복강 내로 약제를 투여하며, 동물군 및 약제 용량은 아래 표 2와 같다.
표 2 QQ_159 동물성 조류인플루엔자 저항성 H5N1 동물실험시험군 및 치료제
Groups Dosages of virus attack Administration dosages Administration mode Administration times Number of mice
Group1 M-QQ_159 30 LD50/50μL 120 pmol/per mouse/day
0.1 mL		 Intraperitoneal injection (DEPC-treated waterdilution QQ_159) 5 16
Group2 H-QQ_159 30 LD50/50μL 360 pmol/per mouse/day0.1 mL Intraperitoneal injection (DEPC-treated waterdilution QQ_159) 5 16
Group3 Mixed RNAGroup 30 LD50/50μL 270 μg/per mouse/day0.1 mL Intraperitoneal injection (DEPC-treated waterdilution mixed RNA) 5 16
Group4 Infection Control Group 30 LD50/50μL DEPC-treated water0.1 mL Intraperitoneal injection (DEPC-treated water) 5 16
Group5 Normal control group DEPC-treated water 50μL DEPC-treated water0.1 mL Intraperitoneal injection (DEPC-treated water) 5 16
표 2에서, 혼합 RNA(Mixed RNA)는 전통 한약 달임 연교-황기 추출물에서 집합적으로 추출한 Mixed RNA이다.
(2) 5일간 투여를 계속하고 체중의 변화를 매일 관찰하여 기록(체중이 30% 이상 감소한 경우에는 안락사)한다.
(3) 폐조직은 바이러스 감염 후 3일째와 5일째에 각각 채취하고, HE염색으로 폐조직의 염증 상태를 검출한다.
(4) 폐조직 바이러스 부하는 실시간 PCR을 통해 검출된다.
(5) 10일까지 동물을 사육하고 생존율을 관찰한다.
그 결과, 도 2에 도시된 바와 같이, 체중의 변화에 있어서, 바이러스 감염 후 7일 째, 중간 농도 QQ_159 (120 pmol/per mouse/day, M-QQ_159), 고농도 QQ_159 (360 pmol/per mouse/day, H-QQ_159) 및 혼합 RNA군의 체중 변화(도 2에 도시된 D8)는 안정기에 진입하지만, 감염된 대조군은 여전히 감소하는 경향을 보이고, 고농도 QQ_159군의 체중 변화율이 혼합 RNA군과 중간 농도 QQ_159군에 비해 약간 높다. 도 3에 도시된 바와 같이, 생존율에 있어서, 중간 농도 QQ_159군과 혼합 RNA군의 생존율은 70%, 고농도 QQ_159군의 생존율은 50%, 감염된 군의 생존율은 30%에 불과하다. 도 4에 도시된 바와 같이, HE 결과는 혼합 RNA군과 중간 농도 QQ_159군의 쥐에서 폐 염증이 유의하게 감소하고, 감염 대조군에 비해 중간 농도 QQ_159군에서 더 우수한 억제 효과를 나타냄을 보여준다. 도 5a에 도시된 바와 같이, 중간 농도 QQ_159군, 고농도 QQ_159군 및 혼합 RNA군은 모두 감염 후 3일째에 바이러스 복제 억제 효과가 있고; 도 5b에 도시된 바와 같이, 중간 농도 QQ_159군은 감염 후 5일째에 바이러스 복제 억제 효과가 유의하게 감소한 반면, 고농도 QQ_159군과 혼합 RNA군은 여전히 더 우수한 바이러스 복제 억제 효과를 나타냄을 보여준다.
실험 결과, 인공적으로 합성된 QQ_159와 전통 한약 달임 연교-황기 추출물에서 추출한 Mixed RNA가 H5N1 조류인플루엔자 바이러스에 일정한 치료 효과가 있는 것으로 나타났다. H5N1 조류인플루엔자 바이러스는 체중 감소를 지연시키고, 사망률을 감소시키고, 폐염증을 감소시키는 것으로 대표된다.
실시예 4: SARS-CoV-2 바이러스에 의한 폐렴에 대한 QQ_159의 억제 효과 연구
(1) 생후 6~8주의 hACE2 쥐는 105TCID50/ml의 비강 형태로 SARS-CoV-2에 감염된다.
(2) 쥐는 복강내(ip)주사로 5일간 투여하며, 첫날 2시간 감염 후 투여하며, 실험 검사군 및 투여량은 아래 표 3과 같다.
표 3 hACE2 형질 전환 마우스의 SARS-CoV-2 감염 실험 시험
Group Administration dosages Administration volume Administration mode Time of virus attack Times
1 60 pmol/per mouse/day 100 μL/per mouse ip Administration after infection of 2h 5
2 120 pmol/per mouse /day 100 μL/per mouse ip Administration after infection of 2h 5
3 180 pmol/per mouse /day 100 μL/per mouse ip Administration after infection of 2h 5
Control Group - 100 μL/per mouse ip Virus attack at day 0 5
(3) 0일, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일에 체중과 증상을 관찰한다.
(4) 감염 후 5일째에 쥐를 희생시키고, 폐조직을 채취한다.
(5) HE염색으로 폐병리를 검출한다.
도 6에 도시된 바와 같이, QQ_159의 쥐 당 120 pmol/일 주사량은 SARS-CoV-2에 감염된 hACE2 형질 전환 쥐의 폐 조직 염증에 일정한 억제 효과를 나타내며, 이는 QQ_159가 SARS-CoV-2 감염으로 인한 쥐 폐렴에 일정한 억제 효과가 있음을 나타낸다.
상기는 단지 본 개시의 바람직한 실시예들일 뿐이며, 당업자를 위해, 본 개시의 원리를 벗어나지 않고 다수의 수정 및 적응이 이루어질 수 있으며, 이러한 수정 및 적응은 본 개시의 보호 범위 내에 있는 것으로 간주되어야 함을 유의해야 합니다.
사양의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 목록
서열 목록
<110> 난퉁대학교
<120> 전통 한약 달임 연교-황기 추출물에서 유래한 마이크로 RNA 및 이의 제조방법 및 용도{MICRORNAS FROM FORSYTHIAE FRUCTUS-ASTRAGALI RADIX COMPOUND TRADITIONAL CHINESE MEDICINE DECOCTION AS WELL AS PREPARATION METHOD AND USE THEREOF}Real-time braking distance measuring device and method of truck트럭의 실시간 제동거리 측정장치 및 방법
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ccagcacuaa ugcaccggau cccaucag 28
<210> 2
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ugggaagucc ucguguugua ccccu 25
<210> 3
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gccuucgaug ucggcucuuc cuaucauu 28
<210> 4
<211> 29
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gcggaucuug gugguaguag caaa 24
<210> 6
<211> 30
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
cucgggaaaa ggauuggcuc ugagggcugg 30
<210> 7
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
acacaugcaa gucgaacguu guuuu 25
<210> 8
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
gugugcaccg gucgucucgu cccuucug 28
<210> 9
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
ucuggguggu guaguugguu auca 24
<210> 10
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
cguuucacgu cggguucacc 20
<210> 11
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
gugguuagga caucgucuuu uca 23
<210> 12
<211> 26
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
gucuguaguu cgauccugca uggggg 26
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<211> 20
<212> RNA
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<400> 13
uggcgcuaga aggagggccu 20
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<213> Artificial Sequence
<400> 14
uuuggauuga agggagcucu a 21
<210> 15
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
cuuggauuga agggagcucu 20

Claims (10)

  1. 전통 한약 달임 연교-황기 추출물에서 유래한 마이크로 RNA에 있어서,
    상기 마이크로 RNA는 novel_mir7, novel_mir33, novel_mir35, novel_mir10, novel_mir20, novel_mir5, novel_mir36, novel_mir28, novel_mir31, ppt-miR894, novel_mir32, novel_mir21, pab-miR3711, QQ_159 또는 bdi-miR159a-3p 중에서 선택되고,
    상기 novel_mir7의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.1이고,
    상기 novel_mir33의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.2이고,
    상기 novel_mir35의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.3이고,
    상기 novel_mir10의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.4이고,
    상기 novel_mir20의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.5이고,
    상기 novel_mir5의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.6이고,
    상기 novel_mir36의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.7이고,
    상기 novel_mir28의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.8이고,
    상기 novel_mir31의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.9이고,
    상기 ppt-miR894의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.10이고,
    상기 novel_mir32의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.11이고,
    상기 novel_mir21의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.12이고,
    상기 pab-miR3711의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.13이고,
    상기 QQ_159의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.14이고,
    상기 bdi-miR159a-3p의 뉴클레오티드 SEQ ID NO.15인 전통 한약 달임 연교-황기 추출물에서 유래한 마이크로 RNA.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 마이크로RNA는 인공적으로 합성된 QQ_159, 식물 QQ_159 및 전구체 형태의 QQ_159 또는 숙성된 형태의 QQ_159 중 하나의 QQ_159인 전통 한약 달임 연교-황기 추출물에서 유래한 마이크로 RNA.
  3. 아래의 단계를 포함하는 전통 한약 달임 연교-황기 추출물에서 유래한 마이크로 RNA 제조 방법.
    단계 1) 전통 한약 달임 연교-황기 추출물 300ml 각각을 50ml 효소 제거 원심 분리 튜브에 나누어 채우고, 2000rpm으로 원심 분리하여 불순물을 제거하고, 각 튜브에서 상등액 10ml을 흡입하여 얼음 위에 두고, TRI졸 30ml을 달인양의 3배 비율로 첨가하고 힘있게 균일하게 흔들어 섞은 후 상온에서 10분 간 둔 후, 클로로포름 6ml를 첨가하여 힘있게 균일하게 흔들어 섞은 후 10분간 방치하고,
    단계 2) 10000 g 및 4 ℃에서 10 분 동안 원심 분리하고 상등액을 채취하고,
    단계 3) 혼합물과 동일한 부피의 이소프로판올을 첨가하여 -20℃에서 1시간 동안 침전시킨 후 12000 g에서 15분 동안 원심 분리하여 침전시키고,
    단계 4) 상등액은 조심스럽게 제거하고 75% 에탄올 5 mL를 첨가하여 침전물을 세척한 후 12000 g에서 4℃에서 5분간 원심 분리하여 침전물을 세척하고,
    단계 5) 원심 분리 후 에탄올을 조심스럽게 제거하고 침전물을 남기고 침전물을 건조한 후 65℃ DEPC 처리수 200 μL를 넣어 침전물을 녹인 후 RNA 농도를 결정하고,
    단계 6) miRNA는 상업용 miRNA 분리 키트(100.μg의 RNA가 각 컬럼을 통과함)에 의해 정제되고 60 μL DEPC 처리된 물에 의해 각 튜브에 용해하고,
    단계 7) miRNA의 농도를 결정하고 8시간 동결 건조하여 -80℃에서 보관한다.
  4. 제2항의 전통 한약 달임 연교-황기 추출물에서 유래한 마이크로 RNA를 통해 인플루엔자 바이러스의 복제를 억제하기 위한 약제의 제조 방법.
  5. 제2항의 전통 한약 달임 연교-황기 추출물에서 유래한 마이크로 RNA를 통해 인플루엔자 바이러스를 치료하기 위한 약제의 제조 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    상기 인플루엔자는 빅토리아 인플루엔자 B 또는 H5N1 조류 인플루엔자인 약제의 제조 방법.
  7. 제2항의 전통 한약 달임 연교-황기 추출물에서 유래한 마이크로 RNA를 통해 SARS-CoV-2 바이러스 복제를 억제하기 위한 약제의 제조 방법.
  8. 제2항의 전통 한약 달임 연교-황기 추출물에서 유래한 마이크로 RNA를 통해 SARS-CoV-2 바이러스에 의한 바이러스성 폐렴을 치료하기 위한 약제의 제조 방법.
  9. 제2항의 마이크로RNAs QQ_159 및 이의 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 복제 억제 및/또는 인플루엔자 치료용 약학 조성물.
  10. 제2항의 마이크로RNAs QQ_159 및 이의 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 SARS-CoV-2 바이러스의 복제 억제 및/또는 SARS-CoV-2 바이러스에 의한 바이러스성 폐렴 치료용 약학 조성물.
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