KR20230150813A - 치료 및 진단 제제와 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 US28 단백질에 대한 매우 특이적인 결합, 건강한(비감염된) 세포에 대한 매우 낮은 수준의 비특이적 결합, 및/또는 균주-불가지론적 결합 능력 중 하나 이상(바람직하게는 모두)을 갖는 결합 분자, 뿐만 아니라 상기 결합 분자를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 결합 분자는 서열번호: 5에 의해 정의된 바와 같은 US28 단백질 서열의 위치 167 내지 183에 상응하는, US28에 의해 제시된 4개의 세포외 도메인 중 3번째인, 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 US28 단백질의 세포외 도메인　3(ECD3)에 결합하도록 설계된다. 본 발명의 결합 분자는 유방암을 포함한 공격성 및/또는 전이성 HCMV-감염된 암에 대한 특정한 결합 특이성을 포함하는 뛰어난 결합 특성을 갖는 것으로 입증되었다. 특정 바람직한 구현예에서, 결합 분자는 항체(예를 들어, BiTE 항체 포함) 및 키메라 항원 수용체(CAR), 또는 이의 기능적 변이체, 단편, 융합 단백질, 및/또는 접합체로부터 선택된다. 또한 CAR-T 세포, CAR-NK 세포, 및 CAR-M 세포를 포함하는 CAR-발현 세포와 같은 상기 결합 분자를 발현하는 세포가 제공된다.

Description

치료 및 진단 제제와 이의 용도
본 발명은 바이러스학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)에 의해 암호화된 US28 단백질의 특이적 영역을 표적하는 치료제 및 진단제, 및 HCMV-감염된 암 및 잠복성 또는 용해성 HCMV 감염과 연관된 다른 병태를 포함하나 이에 제한되지 않는 것과 관련된 요법에 관한 것이다.
참조
본 명세서에서 명백하게 이전에 공개된 문서의 목록 또는 논의는 문서가 최신 기술의 일부이거나 통상의 일반적인 지식임을 인정하는 것으로 반드시 간주되지 않아야 한다. 개시된 참고문헌은 예시적인 절차 또는 본원에 제시된 것들을 보충하는 다른 세부사항을 제공하는 정도로 본원에 참조로 구체적으로 포함된다.
인간 헤르페스 바이러스 5(HHV-5)로도 알려진 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)는 전 세계 인구의 56-94%가 보유하는 아주 흔한 기회 감염성 DNA 바이러스이다(Geisler 등, Cancers, 2019, 11: 1842; Zuhair 등, Rev Med Virol, 2019. 29(3): p. e2034).
다부분의 면역적격 개체에서, HCMV 감염은 무증상이고, 진단되지 않은 채 남아있으며 바이러스 복제가 숙주 면역계에 의해 잘 제어되므로 무해한 것으로 간주되고 있다(Boeckh and Geballe, J Clin Invest, 2011. 121(5): p. 1673-80).
모든 헤르페스바이러스와 유사하게, 1차 감염 후, HCMV는 잠복성 감염으로서 평생 지속성을 확립한다. 잠복성 감염은 골수에 상주하는 CD34+ 조혈 전구체 세포 집단에서 주로 상주하는 바이러스 게놈으로 낮은 수준 또는 존재하지 않는 바이러스 복제를 특징으로 한다(Collins-McMillen 등, Viruses, 2018. 10(8)).
잠복성 HCMV는 숙주 면역계에 의해 지속적으로 제어되지 않는 한 확률적 방식으로 간헐적으로 재활성화할 수 있는 것으로 가정된다. 이러한 이유로, 바이러스는 특정 상황에서 합병증을 유발할 수 있으며, 예를 들어 면역력이 저하된 환자의 경우, 1차 HCMV 감염뿐만 아니라, 재감염 또는 재활성화가 유의한 이환율 및 사망률을 유발하는 많은 기관에 영향을 미치는 생명을 위협하는 질환을 유발할 수 있다(Boeckh and Geballe, 상기; Griffiths 등, J Pathol, 2015. 235(2): p. 288-97).
HCMV는 가장 흔한 선천성 바이러스 감염 중 하나이며 선천적 결손증의 가장 중요한 원인이다(Davis 등, Birth Defects Res, 2017. 109(5): p. 336-346). 일생에 걸쳐 HCMV 감염은 또한 아테롬성동맥경화증(atherosclerosis), 자가면역 질환, 및 여러 악성종양, 특히 다형성 교모세포종의 병인론에서 역할을 할 수 있음이 점점 더 분명해지고 있다(Soderberg-Naucler, J Intern Med, 2006, 259(3): p. 219-46; Cobbs, Curr Opin Virol, 2019. 39: p. 49-59). HCMV 혈청 상태는 화상, 외상, 및 패혈증의 임상 과정에 추가적으로 영향을 미칠 수 있다(Soderberg-Naucler, 2006, 상기; Limaye, 등, JAMA, 2008. 300(4): p. 413-22; Osawa & Singh, Crit Care, 2009. 13(3): p. R68).
잠복성 HCMV 감염은 전구체 세포가 단핵구/침윤성 대식세포 또는 수지상 세포(DC)로 분화될 때 염증 과정 동안 재활성화될 수 있고, 이들 세포는 바이러스를 말초 기관으로 퍼뜨릴 수 있다(Soderberg-Naucler 등, Cell, 1997, 91: 119-126). 이러한 염증 세포에 의해 운반되는 재활성화된 HCMV는 모든 신체 조직에 도달할 수 있고, 광범위한 수의 세포 유형에서 감염 및 복제할 수 있다(Ljungman 등, Infect. Dis. Clin. North. Am., 2010, 24: 319-337). 감염은 타액 및 모유를 포함하는 모든 체액에 의해 추가로 전달된다(Hamprecht 등, Lancet, 2001, 357: 513-518). HCMV 혈청 양성 여성의 모유 샘플의 90%는 바이러스를 함유하고 있으며, 1세 아동에서 약 30% HCMV 유병률을 초래한다. 따라서, 간호 및 부모 접촉은 초기 유아기 또는 아동기에서 HCMV 감염을 획득하는 중요한 경로를 구성한다(Hamprecht 등, 2001, 상기).
사이토메갈로바이러스 게놈 및 유전적 다양성:
Berg 등, 2019, PLoS ONE 14(9): e0222053에서 논의된 바와 같이, CMV 게놈은 단립형, 선형, 이중 가닥 DNA로 이루어지며 크기는 대략 235 kb이다. 750 개 초과의 번역된 ORF를 함유하며(Stern-Ginossar 등, Science, 2012, 338(6110):1088-93) 말단 및 내부 도립된 반복부에 의해 측면에 있는 고유한 긴 영역(UL) 및 고유한 짧은 영역(US)의 2개 영역으로 나눌 수 있다.
사이토메갈로바이러스는 면역 검출을 피하고 감염 전파를 용이하게 하기 위해 광범위한 전략을 채택하였다. 이러한 전략은 예를 들어 인간 면역계의 정상적인 기능에 중요한 수용체 및 리간드의 바이러스 암호화된 상동체의 발현에 의해 감염 동안 숙주의 면역 반응의 조작 및 조절에 기반한다. 다른 인간 헤르페스바이러스보다 2 내지 3-배 더 많은 수의 유전자 산물을 암호화함으로써, 그 중 많은 것이 인간 면역계와 상호작용하고 이를 조작하는 것으로 나타났으며(Mocarski, Trends Microbiol., 2002; 10(7):332-9), CMV는 숙주의 면역 반응을 변형하는 데 이용가능한 비교할 수 없는 수의 도구를 가지고 있다.
순환 CMV 균주 사이의 유전적 변이는 크고 최근 연구는 균주의 75%가 여러 유전자에서 분열성 돌연변이 및 다형성을 함유하고 있음을 보고하였다(Sijmons 등, J. Virol., 2015, 89(15): 7673-7695). 연속 계대로 인한 분열성 돌연변이를 제외하기 위해, 연구 저자들은 1-2회 계대된 균주만을 사용하였고 관찰된 돌연변이의 대부분을 임상 샘플로부터 직접 확인하였다. 유전자 UL40 및 UL111A의 경우, 기능적 녹아웃(knockout)을 유발하는 돌연변이가 조사된 균주의 각각 9.9% 및 5.5%에서 발견되었다(Sijmons 등, 2015, 상기). UL111A는 정상 면역 반응을 억제할 수 있는 기능적 인터류킨-10 상동체이다(Mocarski, 2002, 상기; Engel and Angulo, Adv Exp Med Biol., 2012, 738:256-76). UL40의 신호 펩티드는 자연 살해 세포 억제 수용체에 대한 리간드인 감염된 세포 상에서 HLA-E의 표면 발현을 용이하게 한다(Wilkinson 등, J Clin Virol., 2008; 41(3):206-12).
또한 매우 가변적인 다른 CMV 유전자는 14개의 별개의 유전자형이 식별된 케모카인 상동체 UL146(Dolan 등, J Gen Virol., 2004, 85(Pt 5):1301-12), 및 케모카인 소거 수용체(Kledal 등, FEBS Lett., 1998; 441(2):209-14) 및 수많은 N-말단 다형성이 보고된 G 단백질-결합된 수용체 US28(Goffard 등, Virus Genes, 2006; 33(2):175-81; Arav-Boger 등, J Infect Dis., 2002; 186(8):1057-64)이다.
Berg 등, 2019(상기)는 이러한 유전적 다양성 정도가 다른 인간 헤르페스바이러스에 대해 관찰되지 않음을 보고하고(Sijmons 등, 2015, 상기) 왜 CMV가 중요한 면역조절 유전자 중에서 이러한 가변성을 발휘하는지 그리고 어떻게 바이러스-숙주 상호작용에 영향을 미치는지에 대한 질문을 제기한다.
HCMV 병인론의 대부분은 바이러스 잠복기와 연관되며, 이는 다수의 메커니즘을 통해 체액 및 세포 숙주 면역 반응으로부터 탈출하는 바이러스 능력과 밀접하게 연결되어 있는 것으로 간주된다(Manandhar 등, Int J Mol Sci, 2019. 20(15)). 이러한 메커니즘 중 가장 중요한 하나는 HCMV의 이러한 높은 변화무쌍한 유전적 다양성을 포함한다. HCMV 게놈은 상이한 개체 사이에서 심지어 동일한 숙주 내에서 다양하다(Gorzer 등, J Virol, 2010, 84(14): 7195-7203; Renzette 등, PLoS Pathog, 2011, 7(5): e1001344; Renzette 등, Curr Opin Virol, 2014. 8: 109-15; Renzette 등, Proc Natl Acad Sci USA, 2015, 112(30): E4120-8; Renzette 등, J Virol, 2017, 91(5)). 새로운 숙주 감염은 각각의 감염된 개체에 대한 고유한 바이러스 균주를 일으키고 새로운 유전자형이 면역 반응의 선택압으로 인해 우세하게 되는 선택 이벤트를 생성한다(Renzette 등, 2011, 상기). 바이러스 및 숙주 인자 모두가 HCMV 감염 동안 바이러스의 유전적 부동을 조성하는 데 기여할 수 있음이 가능하다(Vabret 등, Trends Immunol, 2017, 38(1): 53-65; Christensen & Paludan, Cell Mol Immunol, 2017, 14(1): 4-13). 또한, 각 환자는 문헌에서 이전에 광범위하게 보고된 바와 같이 다중 CMV 균주에 감염될 가능성이 있다(Renzette 등, 2015, 상기). 동일한 개체에서 다중 균주의 존재는 상이한 HCMV 균주로부터 재조합을 가능하게 한다. 재조합은 HCMV 유전적 다양성의 주요 동인으로서 두드러지는 것으로 간주된다(Suarez 등, J Infect Dis, 2019, 220(5): 781-791; Sijmons 등, 2015, 상기; Lassalle 등, Virus Evol, 2016, 2(1): vew017; Cudini 등, Proc Natl Acad Sci USA, 2019, 116(12): 5693-5698). 매우 다양한 영역을 재분류하면 효율적인 면역 회피를 보장하기 위한 새로운 조합을 생성할 것이며, 이는 또한 바이러스의 병원성에 영향을 미칠 수 있다. 일관되게, 혼합 HCMV 감염은 여러 연구에서 면역력이 저하된 개체의 불량한 임상 결과와 연관되었다(Coaquette 등, Clin Infect Dis, 2004, 39(2): 155-161; Lisboa 등, Transpl Infect Dis, 2012, 14(2): 132-140; Houldcroft 등, Front Microbiol, 2016, 7: 1317).
더욱이 HCMV 다양성은 유전적 다형성에 의해 구동되며, 이는 게놈에 걸쳐 고르게 분포되지 않는다(Sijmons 등, 2015, 상기). 선택은 비리온 표면 상에 노출된 단백질 영역 및 세포외 도메인의 숙주 세포 막에서 발현되는 바이러스 단백질에 대해 더 강하다(Mozzi 등, PLoS Pathog, 2020, 16(5): e1008476). 숙주 면역계에 의해 가해진 선택압은 순환 HCMV 균주 중에서 유전적 다양성의 형성에 중요한 역할을 했을 가능성이 있다. 따라서, 양성 선택에 의해 표적된 여러 부위는 인간 항체에 의해 인식되는 에피토프 내에 또는 면역 반응에 관여하는 숙주 분자와 직접적으로 상호작용하는 단백질 영역에 위치한다(Sijmons 등, 2015, 상기; Mozzi 등, 2020, 상기). 이러한 특징은 HCMV와 인간 면역계 사이에서 진행중인 숨바꼭질 상호작용과 일치한다.
균주 가변성 및 지속적으로 돌연변이하는 바이러스는 바이러스 진단 및 백신과 약물 개발을 모두 HCMV에 대해 대응하게 만들고 현재 항바이러스 약물 치료에 대한 한계를 설정한다. HCMV에 대한 백신 개발은 수년에 걸쳐 의학계에서 높은 우선 순위에 있었지만, 지금까지 HCMV에 대해 승인된 효과적인 백신은 없다.
HCMV의 발암 특성
HCMV 암호화된 단백질은 다양한 발암 기능을 나타낸다(Geisler 등, 2019, 상기). 숙주 세포로 진입 시, pUL48과 같은 HCMV 비리온의 피막 단백질이 방출되어, 세포의 내재된 선천적 면역 반응을 손상시키고, 숙주 세포의 향상된 대사 활성을 촉진한다(Kumari 등, 세포 Death Dis., 2017, 8: e3078). 이러한 HCMV-암호화된 단백질은 세포가 G1-단계를 뛰어넘게 하여 빠른 세포 분열을 용이하게 할 수 있다(Kumari 등, 2017, 상기). 세포자멸사 방지(anti-apoptotic) 유전자의 상향조절 및 세포자멸사 촉진(pro-apoptotic) 유전자의 하향조절을 통해, 세포는 향상된 생존 상태에 들어간다.
바이러스 DNA가 세포 핵으로 진입한 후, 세포의 RNA 폴리머라제 I 및 II(Pol I 및 II)는 주요 즉시 초기 프로모터(MIEP)에 결합함으로써 바이러스 유전자를 전사하는 데 이용된다(Kostopoulou 등, Oncotarget, 2017, 8: 96536-96552). 발현되는 첫번째 유전자는 즉시 초기(IE) 유전자이다. 이러한 유전자로부터 유래된 IE 단백질은 초기 및 후기 바이러스 유전자 발현 및 직접 숙주 유전자 발현을 둘 다 제어하는 전사 인자로서 작용한다. 이러한 단백질은 용해성 감염을 확립하는 데 필요하고 잠복기로부터 바이러스 재활성화에 중요하다(Kumari 등, 2017, 상기; Tamrakar 등, J. Virol., 2005, 79: 15477-15493). 용해성 HCMV 감염은 세포 주기 조절 장애를 야기하고, IE 유전자 산물은 망막모세포종 단백질 패밀리(Rb), 사이클린, p53, Wnt, 포스파티딜이노시톨 3-키나제/Akt, 인간 텔로머라제 역 전사효소(hTERT), 및 NF-κB를 포함하는 핵산 세포 인자를 방해하여 감염된 세포의 불멸 특성을 증가시킨다(Moussawi 등, Sci. Rep., 2018, 8: 12574). 이러한 경로는 통상적으로 암 세포에서 활성화된다. Fos 및 Myc와 같은 원발암 유전자의해 전달된 유사분열 신호의 활성화는 HCMV 감염된 세포에서 IE 단백질에 의해 유도될 수 있다(Hagemeier 등, J. Virol., 1992, 66: 4452-4456). 더욱이, MYB 유전자는 HPV-관련 암종에서 향상된 MYB 유전자 발현과 유사한 HCMV 감염된 세포에서 유도된다(Moussawi 등, 2018, 상기). 유사분열 신호 외에도, HCMV 감염은 DNA 복구 경로의 악화를 통해 염색체 이상을 유발하여, 감염된 세포에서 유전적 불안정성을 초래한다(Straat 등, J. Natl. Cancer Inst., 2009, 101: 488-497; Siew 등, J. Biomed. Sci., 2009, 16: 107). 이것은 유전적 돌연변이의 개발을 추진한다.
US27, US28, UL33, 및 UL78을 포함한 다양한 HCMV-암호화된, G-단백질-결합된-수용체(GPCR)-유사 단백질은 중요한 발암 기능을 나타내는 것으로 보고되었다(Heukers 등, Oncogene, 2018, 37: 4110-4121). G-단백질은 cAMP 및 PI3K 신호전달 경로와 같은 대사성 및 발암성 핵심 신호전달 경로를 모두 활성화시키며, 이 중 후자는 상피 세포의 고정-독립적 성장 및 발암성 변형의 출현에 중요하다(Moussawi 등, 2018, 상기; Boroughs 등, Nat. Cell Biol., 2015, 17: 351-359). HCMV-2.7 초기 유전자 전사체는 미토콘드리아에서 호흡 쇄의 복합체 I과 직접적으로 상호작용하는 긴 비코딩(lnc) RNA이며, 카스파제 8에 결합함으로써 Fas-리간드 상호작용 및 그랜자임 B를 억제하여 미토콘드리아 유도된 세포 사멸을 방지하고, 산화 능력을 개선하고 감염된 세포에서 에너지 생산을 유지한다(Reeves 등, Science, 2007, 316: 1345-1348).
HCMV는 또한 선천성 및 적응성 면역 반응을 조작하여 면역 감시를 감소시키고 면역적격 숙주에서 생존 기회를 개선하는 여러 방식을 개발하였으며, 이는 HCMV-감염된 암 세포에서 중요한 면역 회피 메커니즘을 잘 설명할 수 있다. HCMV는 감염된 세포에서 NK 세포 인식을 조절하는 다중 단백질을 암호화하고(Fielding 등, PLoS Pathog., 2014, 10: e1004058), 바이러스 단백질에 대한 CD8+ T 세포 관용성을 증가시킨다. HCMV 암호화된 단백질은 DC의 미성숙 표현형의 발달을 자극할 수 있으며, 이는 CD4+ T 세포 반응의 활성화를 줄이고(Wagner 등, J. Leukoc Biol., 2008, 83: 56-63), 추가적으로, CD8+ 세포독성 T 세포에 의한 감염된 세포의 제거를 감소시킨다.
HCMV 치료적 표적:
현재, 이용가능한 HCMV의 유일한 항바이러스 요법은 간시클로비르(GCV) 및 발간시클로비르(VAL-GCV)와 같은 뉴클레오시드 유사체에 의존하며(Rawlinson 등, Lancet Infect Dis, 2017, 17(6): e177-e188; James & Kimberlin, Curr Opin Pediatr, 2016, 28(1): 81-85), 이는 불량한 생체이용률, 독성 부작용 및 약물 내성 발생 위험과 같은 여러 단점을 가지고 있다. 현재 결과는 2개의 매우 다형성 HCMV 유전자인 DNA 폴리머라제(UL54) 및 바이러스 포스포트랜스퍼라제(UL97)가 GCV에 대한 약물 내성에서 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다(Komatsu 등, Antiviral Res, 2014, 101: 12-25).
또한, 중요하게는, 기존 항바이러스제는 용해성 HCMV 감염을 치료하는 데만 사용될 수 있지만, 잠복성 바이러스는 제거할 수 없다. 잠복성 저장소를 박멸하거나 줄이는 것은 여러 환자 그룹에서 HCMV 관련된 질환의 부담을 줄이는 유리한 방식일 것이다.
간시클로비르(GCV), 포스카네트(FOS), 및 시도포비르(CDV)와 같은 이전에 개발된 항-HCMV 약물은 모두 UL54 바이러스 DNA 폴리머라제를 표적한다. 그런데도, 항바이러스 독성 및 HCMV 항바이러스 약물 내성은 이식 환경에서 증가하는 치료적 문제를 구성하므로 신규 바이러스 표적을 갖는 새로운 항-HCMV 약물이 매우 필요하다(Burrel 등, 2014, Lack of influence of human cytomegalovirus (HCMV) susceptibility to current antiviral drugs on HCMV-encoded US28 chemokine receptor polymorphism, 바르셀로나 ECCMID 2014에서 포스터 발표).
Burrel 등, 2014(상기)은 바이러스 전파 및 지속성 뿐만 아니라 평활근 세포 이동 및 종양 형성에서의 감재적인 역할로 인해, HCMV-암호화된 US28이 신규 항바이러스 요법에 대한 잠재적인 표적을 구성한다는 것을 교시하였다.
HCMV US28은 G-단백질 결합 수용체(GCPR)의 부류에 속하는 7개의 막관통 단백질이다. GCPR은 승인된 약물에 의해 표적화된 단백질의 가장 큰 패밀리를 구성하고(Sriram & Insel, Mol Pharmacol, 2018. 93(4): 251-258), 각각이 세포외 N-말단, 세포내 C-말단 및 3개의 세포외 루프(ECL1-3)에 의해 연결된 7개의 소수성 막관통 도메인(TM1-TM7)이 있는 단일 폴리펩티드로 이루어진 공통 구조를 공유한다(Alexander 등, Br J Pharmacol, 2019, 176 Suppl 1: S21-S141).
HCMV 균주 DB(수탁 번호 KT959235)에 의해 암호화된 바와 같은 US28의 전체 서열은 본 출원에서 서열번호: 5로서 제공되어 있으며, 여기서:
- N-말단 세포외 도메인(첫번째 세포외 도메인이므로 본원에서 ECD1로서도 언급됨)은 본원에서 서열번호: 1로서 제공되고 서열번호: 5의 위치 1-37에 상응하고,
- 제1 세포외 루프(ECL1; 두번째 세포외 도메인이므로 본원에서 ECD2로서도 언급됨)는 본원에서 서열번호: 2로서 제공되고 서열번호: 5의 위치 91-101에 상응하고,
- 제2 세포외 루프(ECL2; 세번째 세포외 도메인이므로 본원에서 ECD3으로서도 언급됨)는 본원에서 서열번호: 3으로서 제공되고 서열번호: 5의 위치 167-183에 상응하고;
- 제3 세포외 루프(ECL3; 네번째 세포외 도메인이므로 본원에서 ECD4로서도 언급됨)는 본원에서 서열번호: 4로서 제공되고 서열번호: 5의 250-273에 상응한다.
Burrel 등(상기)은 HCMV 임상 균주 중에서 US28 단백질의 다형성 수준을 평가하였고, 임상 균주 중에서 US28에 대한 다형성 수준이 UL97 포스포트랜스퍼라제 및 UL44 진행성 요인과 같은 다른 HCMV-암호화된 단백질에 대해 이전에 보고된 다형성 수준보다 더 높다고 결론내렸지만, 이 다형성은 현재 승인된 항바이러스 약물(즉, GCV, FOS, 및 CDV)에 대한 HCMV 민감성 또는 내성에 따라 유의하게 달라지지 않으므로, HCMV 암호화된 US28 케모카인 수용체가 특히 HCMV 내성의 경우 항-HCMV 약물에 대한 유망한 바이러스 표적을 구성할 수 있다는 생각을 뒷받침한다.
또한 동등한 저널 기사 De Groof 등, 2019, Mol. Pharmaceutics, 16: 3145-3156에 보고된 바와 같이, WO　2019/151865의 저자들은 US28에 초점을 맞춘 접근법을 취하였다. 저자들은 교모세포종(GBM) 조직에서 US28을 특이적으로 검출하고 리간드-의존적 및 구성적 US28 활성을 억제한다고 하는 VUN100(본 출원의 서열번호: 60)으로 언급되는 특정 VHH에 의해 예시된 단일 중쇄 가변 도메인 항체(VHH)를 생성하였음을 보고하였고, 저자들은 결과적으로 정위 이종이식 모델의 시험관내 및 생체내에서 US28-의존적 GBM 성장의 손상을 보고하였다.
VUN100은 US28의 N-말단 세포외 영역에서 다중 결합 위치(위치 1-37, 본원에서 ECD1로도 언급됨)를 포함하는 불연속 에피토프에 결합하는 것으로 나타났으며, WO 2019/151865(36페이지, 11-32 행)의 실시예 3 및 De Groof 등, 2019(상기)의 도 2에 대한 범례에 논의된 바와 같이, US28의 제3 세포외 루프(ECL3, 위치 250-273, 본원에서 ECD4로도 언급됨)의 존재에 의해 추가로 영향을 받았다.
VUN100 Ab의 US28-발현 HEK293T 막에 대한 결합과 mock 형질감염된 HEK293T 막에 대한 결합을 비교하는 검정은 mock 형질감염된 세포의 20%가 VUN100에 의해 결합되었고, US28-발현 HEK293T 막(De Groof 등, 2019(상기)의 지원 정보, 이의 도 S1.A, 및 본 출원의 표 2에서)에 대해 4의 상대 특이성 점수만아 달성되었다. 단지 약 4의 특이성 점수로, US28-발현과 US28-음성 세포 사이를 구별하는 명백한 능력은 잠재적으로 차선책이고, 건강한 세포에서 허용할 수 없는 수준의 표적외(off-target) 부작용을 피하면서 HCMV-감염된 세포에 대한 특이적으로 표적화된 효과를 제공하는 VUN100의 능력에 대한 우려를 제기한다. 또한 면역조직화학(IHC)에서 사용하기 위한 것과 같은 진단 검정을 포함한 검정에서 US28-발현 세포(특히, HCMV-감염된 세포)를 신뢰할 수 있게 식별하는 맥락에서 유용하게 되는 VUN100의 능력에 대한 우려를 제기한다. 또한, 추가 간행물에서, US28-표적화 나노바디(nanobody)의 효능이 바이러스 및 잠재적으로 생체내 환경에서 검증될 필요가 있음을 인정하였다(De Groof 등, 2021, Pharmacol Rev 73:828-846).
US28-발현 세포(특히, HCMV-감염된 세포)에 특이적으로 결합하고/하거나 US28를 발현하지 않는 세포(특히, HCMV 감염되지 않은 세포)에 대한 표적외 결합을 최소화하는 VUN100보다 실질적으로 더 큰 능력을 갖는 결합 분자의 제공은 생체내에서 및/또는 IHC를 포함하는 검정에서 사용될 때 모두 매우 바람직할 것이다.
더욱이, 상기 언급된 바와 같이, 임상 균주 중에서 US28에 대한 다형성 수준은 다른 HCMV-암호화된 단백질에 대해 이전에 보고된 다형성 수준보다 더 높고(Burrel 등, 상기) US28의 수많은 N-말단 다형성이 보고되었다(Goffard 등, 2006, 상기; Arav-Boger 등, 2002, 상기).
따라서 본 발명자는 VUN100에 의해 결합된 바와 같이, US28의 N-말단 영역에서 높은 수준의 다형성의 존재가 상이한 HCMV 균주에 지속적으로 결합할 수 없는 VUN100 VHH 분자를 제공할 수 있다는 가능성을 고려하였다. 실제로, 그러한 맥락에서 고려할 때, WO 2019/151865의 도 8d에서 상이한 HCMV 균주에 대한 VUN100의 결합과 관련한 결과는 HCMV의 VHL/E, Merlin 및 TB40/E 균주 사이의 결합에서 차이를 나타내며, 결합은 Merlin 균주에 대해 관찰된 결합 수준의 약 절반 정도로만 균주 TB40/E(B1 유형)에서 특히 감소되었다. 더욱이, VUN100의 추가 특성화는 De Groof 등, 2020에 의해 온라인에서 이용가능한 사전 인쇄된 기사에 보고되어 있으며(doi: https://doi.org/10.1101/2020.05.12.071860), 여기서 보충 데이터의 도 2는 VUN100에 의해 결합된 CD14+ 단핵구의 핵에서 % 유도된 IE 발현 결과를 제공한다. 테스트된 모든 세포는 HCMV 혈청 양성 개체로부터 유래되었고, HCMV로 잠복 감염된 것으로 확인되지만, 각각의 공여자를 감염시키는 HCMV의 균주(들)는 결정되지 않았다. 4명의 상이한 환자 각각으로부터의 이러한 HCMV-양성 CD14+ 세포에 대한 VUN100 결합에 의해 유도된 IE 발현 수준은 실질적으로 다양하였으며, 공여자 1-4로부터의 세포에 대해 보고된 수치는 각각 57%, 33%, 22% 및 4%(14-배 초과의 차이 범위)이다. 확인된 HCMV-양성 세포에 대한 VUN100의 결합에 따른 이러한 높은 수준의 반응 가변성은 상이한 HCMV 균주를 가진 공여자 각각의 감염 때문일 가능성이 가장 높은 것으로 보이며, 따라서 VUN100의 결합 능력은 HCMV의 상이한 균주 사이에서 상당히 달라질 것이라는 강력한 표시이다. 동일한 수치는 또한 공여자 1-4로부터의 HCMV-양성 세포의 동일한 그룹에 대한 VUN100의 2가 형태(본 출원의 서열번호: 63에 의해 나타낸 바와 같이 De Groof 등, 2020(상기)에 의해 VUN100b로 명명됨)의 결합에 따른 높은 수준의 반응 가변성(차이의 7-배 초과 수준)을 나타내며, 다시 균주-특이적 결합 민감성을 나타내는 결과를 제공한다.
US28을 치료적 표적으로서 사용하기 위해, 당업계에 알려진 VUN100 분자에 대해 보고된 상대적으로 높은 수준의 비특이적 결합 활성을 포함하는 상기 기재된 가장 중요한 장애물 중 하나 이상을 극복할 뿐만 아니라, 표적외 결합 활성을 최소화하고, 균주 다양성, 바이러스 돌연변이, 돌연변이성 부동 및 바이러스 잠복기 동안 바이러스가 면역계로부터 숨는 능력의 장애물을 극복하는 US28-결합 분자를 제공하는 것이 중요하다.
따라서 건강한 인간 세포에 대한 표적외 결합의 절대 수준이 훨씬 더 낮아야 하고/하거나 최소화하는 건강한 인간 세포와 비교하여, US28을 발현하는 생물학적 물질에 매우 특이적으로 결합할 수 있고/있거나 HCMV 감염에 대해 양성인 결합 분자를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 예를 들어, 결합 분자가 결합되는 세포에 세포독성 효과를 제공하거나 지시하는 결합 분자의 제공은 HCMV 감염 및 그와 연관된 병태를 퇴치(combat)하는 데 큰 관심이 있으며, 건강한 인간 세포에서 허용되지 않는(예를 들어 치료적으로 허용되지 않는) 수준의 표적외 세포독성 효과를 최소화하거나 피하는 방식으로 이들 효과를 표적할 수 있는 결합 분자를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 특히, US28을 발현하지 않고 HCMV 감염에 대해 양성이 아닌 생물학적 물질(예를 들어 동등한 세포)과 비교하여 US28을 발현하고/하거나 HCMV 감염에 대해 양성인 생물학적 물질(예를 들어 세포)에 대한 결합에서 특이성에 대해 평가할 때, WO 2019/151865 및 De Groof 등, 2019(상기)의 VUN100 Ab 및/또는 De Groof 등, 2020(상기)의 VUN100b 2가 분자보다 US28 및/또는 HCMV-감염된 세포에 대해 더 높은 수준의 특이성을 갖는 결합 분자를 제공하는 것이 본 발명의 목적 중 하나이다.
US28을 발현하는 생물학적 물질의 결합에 특이적이고/이거나 US28을 발현하지 않는 상응하는 생물학적 물질(예컨대 건강한 인간 세포)과 비교하여 HCMV 감염된 US28-발현 세포에 대해 양성이고/이거나, 상기 언급된 바와 같은 VUN100 Ab 분자보다 현저하게 낮은 건강한 인간 세포에 대한 표적외 결합의 절대 수준을 나타내는 US28에 대한 결합 분자를 제공하는 것이 본 발명의 또 다른 목적이다.
치료되는 개체(들) 내의 감염 균주(들)에서 하나 이상의 HCMV 돌연변이의 상승 가능성에도 불구하고, 균주 불가지론적(agnostic)이고, 따라서 이상적으로는 HCMV의 균주, 또는 균주 조합에 관계 없이 모든, 또는 실질적으로 모든 HCMV 감염을 표적할 수 있고/있거나 HCMV 감염의 치료 과정 동안 진행중인 효과를 제공할 수 있는 결합 분자를 제공하는 것이 본 발명의 추가 목적이다. 특히, VUN100 Ab보다 더 큰 균주 불가지론적 결합 정도를 나타내는 결합 특성을 갖는 US28에 대한 결합 분자가 특별한 관심 대상이다.
본 발명은 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 US28 단백질에 대한 매우 특이적인 결합, 건강한(비-감염된) 세포에 대한 매우 낮은 수준의 비특이적 결합, 및/또는 균주-불가지론적 결합 능력 중 하나 이상(바람직하게는 모두)을 갖는 결합 분자, 뿐만 아니라 상기 결합 분자를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 결합 분자는 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 US28 단백질의 세포외 도메인　3(ECD3) 내에서 결합하도록 설계된다.
본 발명의 결합 분자는 상기 기재된 것들을 포함하고, 본원에 추가로 기재된 바와 같이 뛰어난 결합 특성을 갖는 것으로 입증되었다. 예를 들어, 본 발명의 결합 분자는 또한 놀랍게도 유방암을 포함한 공격성 및/또는 전이성 HCMV-감염된 암에 대한 특히 유리한 결합 특이성을 제공하는 것으로 입증되었다.
특정 바람직한 구현예에서, 결합 분자는 항체(예를 들어, BiTE 항체 포함) 및 키메라 항원 수용체(CAR), 또는 이의 기능적 변이체, 단편, 융합 단백질, 및/또는 접합체, 뿐만 아니라 이를 암호화하는 핵산 분자로부터 선택된다. 상기 결합 분자는 예를 들어, 결합 분자에 의해 결합된 임의의 세포에 영향을 미치는(예컨대 억제하거나 사멸시키는) 능력을 갖는 세포독성 구성요소 또는 다른 효과기 구성요소를 포함하거나 이에 결합될 수 있다. 상기 결합 분자는 예를 들어, 모집된 제제가 결합 분자에 의해 결합된 세포에 영향을 미치는(예컨대 억제하거나 사멸시키는) 특이적으로 표적화된 능력을 갖는 방식으로 다른 제제(예를 들어 다른 단백질, 약물, 세포 또는 임의의 다른 선택 물질)를 모집할 수 있는 구성요소를 포함하거나 이에 결합될 수 있고; 따라서 비제한적인 예는 세포가 상기 BiTE에 의해 결합에서 작용하기 위해 T-세포를 모집하는 능력을 보유하는 BiTE 분자이다. 또한 결합 분자가 CAR인 예를 포함하여 상기 결합 분자를 발현하는 세포가 제공되고, 상기 세포는 CAR-T 세포, CAR-NK 세포, 및 CAR-M 세포를 포함하는 CAR-발현 세포일 수 있다.
본 발명의 이들 및 추가 개시내용은 하기 설명 및 첨부된 청구범위 및 도면에 의해 보다 상세하게 기재되어 있다.
따라서, 본 발명의 제1 측면은 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 US28 단백질의 세포외 도메인　3(ECD3) 내의 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는, 하나 이상의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 결합 분자를 제공한다. 본 발명에 따르면, US28 단백질의 ECD3은 서열번호: 5에 제시된 바와 같은 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 DB 균주에 의해 암호화된 US28 단백질의 위치 167 내지 183에 상응하는 위치에서 HCMV의 균주에 의해 암호화된 US28 단백질에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
예를 들어, 제한없이, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자는 항체 또는 키메라 항원 수용체(CAR)로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 제1 측면의 결합 분자는 예를 들어, HCMV의 US28 단백질의 세포외 도메인 3(ECD3) 내에 완전히 존재하는 에피토프에 대한 결합 특이성을 가질 수 있다.
본 발명의 제1 측면의 결합 분자는 예를 들어, US28 단백질의 ECD3 내의 선형 에피토프에 대한 결합 특이성을 가질 수 있다.
본 발명의 제1 측면의 결합 분자는 예를 들어, HCMV의 US28 단백질의 ECD3 내의 에피토프에 대한 균주 불가지론적 결합 특이성을 가질 수 있다. 예를 들어, 결합 분자는 HCMV의 US28 단백질의 ECD3 내의 에피토프에 대한 결합 특이성을 가질 수 있으며, 여기서 결합 특이성은 HCMV 균주 중 2 개 이상(예컨대 모두), 예를 들어 4D-변이체 균주 및 4N-변이체 균주(각각 본원에 추가로 기재된 바와 같음), 임의적으로 DB, Towne, AF1, VHL/E, AD169, BL, DAVIS, JP, Merlin, PH, TB40/E, Toledo, TR 및 VR1814(FIX)로 이루어진 군으로부터 선택된 2 개 이상(예컨대 모두)의 HCMV 균주에 대해 불가지론적이다.
따라서, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자는 예를 들어, US28 단백질의 ECD3이 4D-변이체 또는 4N-변이체의 서열을 포함하는지 여부와 관계없이, HCMV의 US28 단백질의 ECD3 내의 에피토프에 대한 결합 특이성을 가질 수 있다:
- 여기서 4D-변이체는 Towne, VR1814, TB40/E, Merlin, JP, Ad169, AF1, VHL/E, BL 및 DAVIS와 같은 HCMV 균주의 첫번째 그룹에 의해 암호화된 바와 같은 US28의 ECD3에서 발견된 TKKDNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 7)의 서열을 포함하고;
- 여기서 4N-변이체는 Toledo, TR 및 DB 균주와 같은 HCMV 균주의 두번째 그룹에 의해 암호화된 바와 같은 US28의 ECD3에서 발견된 TKKNNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 6)의 서열을 포함한다.
본원에 기재된 프로토콜을 사용함으로써, 출원인은 본원에서 다음 명칭으로 언급되는 항체(이의 서열이 또한 하기에 제공됨)를 포함하는, 상기 언급된 유익한 결합 특성 중 하나 이상을 갖는 수많은 항-ECD3 항체를 일관되고 반복적으로 생성하였다: US28-13-5G6-1D3; US28-13-1C10-1C10; US28-13-1H3-1A10; US28-14-2C2-1G4; US28-13-1C10-1G9; 및 US28-14-4E4-1E8.
하나의 구현예에서, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자는 각각 서열번호: 8, 9, 10, 14, 15 및 16에 의해 정의된 바와 같은 항체 13-5G6-1D3(일반적으로 본원에서 "1D3"으로 약칭됨)의 CDR 서열 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 모두에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 상보성 결정 영역(CDR), 및/또는 항체 1D3의 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체를 포함하고, 임의적으로 여기서 결합 분자는 항체 및 CAR로부터 선택된다.
임의적으로, 이 구현예에 따른 결합 분자는 (a) 각각 서열번호: 8, 9, 및 10에 의해 정의된 바와 같은 항체 1D3의 가변 중쇄(VH)의 CDR 1, 2, 및 3 서열 중 1, 2, 또는 3개 모두; 및/또는 (b) 각각 서열번호: 14, 15, 및 16에 의해 정의된 바와 같은 항체 1D3의 가변 경쇄(VL)의 CDR 1, 2, 및 3 서열 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함할 수 있다.
추가로, 또는 대안적으로, 추가의 옵션에서 이 구현예에 따른 결합 분자는 (a) 각각 서열번호: 8, 9, 및 10의 서열을 갖는 CDR 1, 2, 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드, 및 임의적으로 여기서 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드는 서열번호: 12의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것; 및/또는 (b) 각각 서열번호: 14, 15, 및 16의 서열을 갖는 CDR 1, 2 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드, 및 임의적으로 여기서 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드는 서열번호: 18의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것을 포함할 수 있다.
US28-13-5G6-1D3 항체의 하기 서열은 아래에 기재된 서열 식별 번호(서열번호)를 참조하여 본원에서 식별된다:
또 다른 구현예에서, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자는 각각 서열번호: 112, 113, 114, 117, 83 및 118에 의해 정의된 바와 같은 항체 13-1C10-1C10(일반적으로 본원에서 "1C10"으로 약칭됨)의 CDR 서열 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 모두에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR, 및/또는 항체 1C10의 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체를 포함하고, 임의적으로 여기서 결합 분자는 항체 및 CAR로부터 선택된다.
임의적으로, 이 구현예에 따른 결합 분자는 (a) 각각 서열번호: 112, 113, 및 114에 의해 정의된 바와 같은 항체 13-1C10-1C10의 VH의 CDR 1, 2, 및 3 서열 중 1, 2, 또는 3개 모두; 및/또는 (b) 각각 서열번호: 117, 83, 및 118에 의해 정의된 바와 같은 항체 13-1C10-1C10의 VL의 CDR 1, 2, 및 3 서열 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함할 수 있다.
추가로, 또는 대안적으로, 추가의 옵션에서 이 구현예에 따른 결합 분자는 (a) 각각 서열번호: 112, 113, 및 114의 서열을 갖는 CDR 1, 2, 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 VH 폴리펩티드, 및 임의적으로 여기서 서열번호: 104의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것; 및/또는 (b) 각각 서열번호: 117, 83, 및 118의 서열을 갖는 CDR 1, 2 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 VL 폴리펩티드, 및 임의적으로 여기서 VL 폴리펩티드는 서열번호: 108의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것을 포함할 수 있다.
US28-13-1C10-1C10 항체의 하기 서열은 아래에 기재된 서열 식별 번호(서열번호)를 참조하여 본원에서 식별된다:
또 다른 구현예에서, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자는 각각 서열번호: 112, 113, 114, 117, 83 및 118에 의해 정의된 바와 같은 항체 13-1H3-1A10(일반적으로 본원에서 "1A10"으로 약칭됨)의 CDR 서열 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 모두에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR, 및/또는 항체 1A10의 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체를 포함하고, 임의적으로 여기서 결합 분자는 항체 및 CAR로부터 선택된다.
임의적으로, 이 구현예에 따른 결합 분자는 (a) 각각 서열번호: 112, 113, 및 114에 의해 정의된 바와 같은 항체 13-1H3-1A10의 VH의 CDR 1, 2, 및 3 서열 중 1, 2, 또는 3개 모두; 및/또는 (b) 각각 서열번호: 117, 83, 및 118에 의해 정의된 바와 같은 항체 13-1H3-1A10의 VL의 CDR 1, 2, 및 3 서열 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함할 수 있다.
추가로, 또는 대안적으로, 추가의 옵션에서 이 구현예에 따른 결합 분자는 (a) 각각 서열번호: 112, 113, 및 114의 서열을 갖는 CDR 1, 2, 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 VH 폴리펩티드, 및 임의적으로 여기서 적어도 하나의 VH 폴리펩티드는 서열번호: 122의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것; 및/또는 (b) 각각 서열번호: 117, 83, 및 118의 서열을 갖는 CDR 1, 2 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 VL 폴리펩티드, 및 임의적으로 여기서 VL 폴리펩티드는 서열번호: 126의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것을 포함할 수 있다.
US28-13-1H3-1A10 항체의 하기 서열은 아래에 기재된 서열 식별 번호(서열번호)를 참조하여 본원에서 식별된다:
또 다른 구현예에서, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자는 각각 서열번호: 76, 77, 78, 82, 83 및 84에 의해 정의된 바와 같은 항체 13-1C10-1G9(일반적으로 본원에서 "1G9"로 약칭됨)의 CDR 서열 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 모두에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR, 및/또는 항체 1G9의 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체를 포함하고, 임의적으로 여기서 결합 분자는 항체 및 CAR로부터 선택된다.
임의적으로, 이 구현예에 따른 결합 분자는 (a) 각각 서열번호: 76, 77, 및 78에 의해 정의된 바와 같은 항체 13-1C10-1G9의 VH의 CDR 1, 2, 및 3 서열 중 1, 2, 또는 3개 모두; 및/또는 (b) 각각 서열번호: 82, 83, 및 84에 의해 정의된 바와 같은 항체 13-1C10-1G9의 VL의 CDR 1, 2, 및 3 서열 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함할 수 있다.
추가로, 또는 대안적으로, 추가의 옵션에서 이 구현예에 따른 결합 분자는 (a) 각각 서열번호: 76, 77, 및 78의 서열을 갖는 CDR 1, 2, 및 3 서열을 포함하ㄴ는 적어도 하나의 VH 폴리펩티드, 및 임의적으로 여기서 적어도 하나의 VH 폴리펩티드는 서열번호: 68의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것; 및/또는 (b) 각각 서열번호: 82, 83, 및 84의 서열을 갖는 CDR 1, 2 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 VL 폴리펩티드, 및 임의적으로 여기서 VL 폴리펩티드는 서열번호: 72의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것을 포함할 수 있다.
US28-13-1C10-1G9 항체의 하기 서열은 아래에 기재된 서열 식별 번호(서열번호)를 참조하여 본원에서 식별된다:
또 다른 구현예에서, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자는 각각 서열번호: 76, 95, 96, 82, 99 및 100에 의해 정의된 바와 같은 항체 14-4E4-1E8(일반적으로 본원에서 "1E8"로 약칭됨)의 CDR 서열 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 모두에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR, 및/또는 항체 1E8의 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체를 포함하고, 임의적으로 여기서 결합 분자는 항체 및 CAR로부터 선택된다.
임의적으로, 이 구현예에 따른 결합 분자는 (a) 각각 서열번호: 76, 95, 및 96에 의해 정의된 바와 같은 항체 14-4E4-1E8의 VH의 CDR 1, 2, 및 3 서열 중 1, 2, 또는 3개 모두; 및/또는 (b) 각각 서열번호: 82, 99, 및 100에 의해 정의된 바와 같은 항체 14-4E4-1E8의 VL의 CDR 1, 2, 및 3 서열 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함할 수 있다.
추가로, 또는 대안적으로, 추가의 옵션에서 이 구현예에 따른 결합 분자는 (a) 각각 서열번호: 76, 95, 및 96의 서열을 갖는 CDR 1, 2, 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 VH 폴리펩티드, 및 임의적으로 여기서 적어도 하나의 VH 폴리펩티드는 서열번호: 88의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것; 및/또는 (b) 각각 서열번호: 82, 99, 및 100의 서열을 갖는 CDR 1, 2 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 VL 폴리펩티드, 및 임의적으로 여기서 VL 폴리펩티드는 서열번호: 92의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것을 포함할 수 있다.
US28-14-4E4-1E8 항체의 하기 서열은 아래에 기재된 서열 식별 번호(서열번호)를 참조하여 본원에서 식별된다:
또 다른 구현예에서, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자는 다음 공통 CDR 서열 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 모두에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다(여기서 특정 위치에 대한 대체 아미노산은 괄호에 표시되고, *는 해당 위치에서 아미노산의 부재를 나타낸다):
(a) S(Y/H)A(M/L)S(서열번호: 167)에 상응하는 VH-CDR1;
(b) SISS(G/R)G(S/R)TYYPDSVKG(서열번호: 168)에 상응하는 VH-CDR2;
(c) GG(S/T)(T/R/H)(M/H/Y)(I/S)(T/Y)(T/G)(G/N)(L/*)GF(A/D)(Y/F)(서열번호: 169)에 상응하는 VH-CDR3;
(d) S(A/V)SSSVSYMH(서열번호: 170)에 상응하는 VL-CDR1;
(e) D(T/S)SKLAS(서열번호: 171)에 상응하는 VL-CDR2; 및/또는
(f) QQW(S/T/*)SN(*/N)PP(I/L)T(서열번호: 172)에 상응하는 VL-CDR3.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자는 다음 공통 CDR 서열 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 모두에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다(여기서 특정 위치에 대한 대체 아미노산은 괄호에 표시되고, *는 해당 위치에서 아미노산의 부재를 나타낸다):
(a) S(Y/H)A(M/L)S(서열번호: 167)에 상응하는 VH-CDR1;
(b) SISS(G/R)GRTYYPDSVKG(서열번호: 174)에 상응하는 VH-CDR2;
(c) GG(S/T)(T/R/H)(M/H/Y)(I/S)(T/Y)(T/G)(G/N)GF(A/D)(Y/F)(서열번호: 175)에 상응하는 VH-CDR3;
(d) S(A/V)SSSVSYMH(서열번호: 170)에 상응하는 VL-CDR1;
(e) D(T/S)SKLAS(서열번호: 171)에 상응하는 VL-CDR2; 및/또는
(f) QQW(T/*)SN(*/N)PPIT(서열번호: 176)에 상응하는 VL-CDR3.
항체 US28-13-5G6-1D3, 13-1C10-1C10, 13-1H3-1A10, 13-1C10-1G9, 14-4E4-1E8 중 임의의 것에 대해 상기 정의된 바와 같은 VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 및/또는 VL-CDR3 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체는 임의적으로 각각 VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 및/또는 VL-CDR3 서열에 대해 상기 제시된 바와 같은 공통 서열 중 하나를 포함할 수 있다.
상기 언급된 서열번호에 상응하는 서열은 본 출원의 실시예에 뒤따르는 "서열"이라는 제목의 본 출원의 섹션에 주어진다.
특정 구현예에서, 본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
(a) 2가 항체, 예컨대 IgG-scFv 항체(예를 들어, 여기서 제1 결합 도메인은 온전한 IgG이고 제2 결합 도메인은 IgG의 경쇄의 N-말단 및/또는 경쇄의 C-말단 및/또는 중쇄의 N-말단 및/또는 중쇄의 C-말단에서 제1 결합 도메인에 부착된 scFv이거나, 반대의 경우도 마찬가지임);
(b) 1가 항체, 예컨대 DuoBody ® 또는 '놉-인-홀(knob-in-hole)' 이중특이적 항체(예를 들어, scFv-KIH, scFv-KIHr, BiTE-KIH 또는 BiTE-KIHr;
(c) scFv2-Fc 항체;
(d) 이중특이적 항체, 예컨대 이중특이적 T-세포 관여(BiTE) 항체;
(e) 이중 가변 도메인(DVD)-Ig 항체;
(f) 이중-친화성 재표적화(DART)-기반 항체(예를 들어, DART2-Fc 또는 DART);
(g) 삼중특이적 항체, 예컨대 DNL-Fab3 항체;
(h) scFv-HSA-scFv 항체;
(i) 단일 도메인 항체;
(j) 중쇄-단독 IgG(hcIgG), 예컨대 낙타과 IgG(예를 들어 VHH 항체) 및 상어 면역글로불린 신규 항원 수용체(IgNAR), 및 이의 단일 쇄 항체; 및
(k) 본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 세포외 도메인, 예를 들어 이 목록의 옵션 (a) 내지 (h) 중 임의의 하나, 또는 이의 조합을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR).
추가로, 또는 대안적으로, 본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
(i) 이중특이적 면역 세포 관여 항체, 예를 들어, 이중특이적 T-세포 관여(BiTE), 및 임의적으로 여기서 BiTE 항체는 CD3-결합 도메인을 포함하는 것; 또는
(ii) 모노클로날 항체, 임의적으로 재조합 모노클로날 항체, 예를 들어, CHO 세포에 의해 재조합적으로 생산된 모노클로날 항체.
본 발명의 제1 측면은 또한 상기 정의된 바와 같은 결합 분자의 기능적 단편을 제공하며, 여기서 기능적 단편은
(a) Fv 단편(예컨대 단일 쇄 Fv 단편(scFv), 또는 이황화-결합된 Fv 단편), Fab-유사 단편(예컨대 Fab 단편, Fab' 단편 또는 F(ab)2 단편), 및 단일 도메인 항체(dAb-링커-dAb 및 나노바디와 같은 단일 및 이중 형식을 포함하는 dAb)로 이루어진 군으로부터 선택된 전술한 청구항 중 임의의 것에 정의된 바와 같은 결합 분자의 항원-결합 단편, 또는 이의 변이체, 융합체 또는 유도체를 포함하고/하거나;
(b) 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 제1 측면의 결합 분자의 결합 특성 중 하나 이상을 제공하고/하거나;
(c) 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 제1 측면의 결합 분자의 CDR 서열을 포함하고/하거나;
(d) 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 제1 측면의 결합 분자의 VH 및/또는 VL 서열을 포함한다.
본 발명의 제1 측면의 결합 분자의 융합이 또한 본원에 제공된다. 예를 들어, 상기 정의된 바와 같은 결합 분자, 또는 상기 정의된 바와 같은 상기 결합 분자의 기능적 단편이 제공되며 여기서 결합 분자 또는 이의 기능적 단편은 제2 아미노산 서열에 융합된 제1 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 아미노산 서열은 결합 분자 또는 이의 기능적 단편의 폴리펩티드 쇄 중 적어도 하나를 포함하거나 이로 이루어지고, 제2 아미노산 서열은 융합 파트너이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자는 키메라 항원 수용체(CAR)이거나 그 내에 포함된다. 따라서, 본 발명의 제1 측면은 또한
(i) 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 제1 측면의 결합 분자, 또는 본원에 정의된 바와 같은 상기 결합 분자의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진, 세포외 도메인;
(ii) 막관통 도메인; 및
(iii) 세포내 도메인;
을 포함하는 CAR을 제공하며:
여기서 CAR의 세포외 도메인은 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 US28 단백질의 세포외 도메인　3(ECD3) 내의 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖고,
여기서 US28 단백질의 ECD3은 서열번호: 5에 제시된 바와 같은 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)에 의해 암호화된 US28 단백질의 위치 167 내지 183에 상응하는 위치에서 US28 단백질에 제시된 아미노산 서열을 포함한다
임의적으로, 상기 CAR에서:
(a) CAR의 세포외 도메인은 HCMV의 US28 단백질의 세포외 도메인 3(ECD3) 내에 완전히 존재하는 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖고/갖거나;
(b) CAR의 세포외 도메인은 US28 단백질의 ECD3 내의 선형 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖고/갖거나;
(c) CAR의 세포외 도메인은 HCMV 균주 불가지론적인 HCMV의 US28 단백질의 ECD3 내의 에피토에 대한 결합 특이성, 예를 들어, DB, Towne, AD169, DAVIS, BL, JP, Merlin, PH, TB40/E, Toledo, TR, VHL/E 및 VR1814(FIX)로 이루어진 군으로부터 선택된 HCMV 균주 중 2 개 이상(예컨대 모두)에 대해 불가지론적인 HCMV의 US28 단백질의 ECD3 내의 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖고/갖거나;
(d) CAR의 세포외 도메인은 US28 단백질의 ECD3이 다음 서열을 포함하는지 여부와 관계없이, HCMV의 US28 단백질의 ECD3 내의 에피토프에 대한 특이성을 갖는다:
- 다수의 HCMV 균주에 의해 암호화된 바와 같은 US28의 ECD3에서 발견된 바와 같은 TKKDNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 7), 또는
- 소수의 HCMV 균주에 의해 암호화된 바와 같은 US28의 ECD3에서 발견된 바와 같은 TKKNNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 6).
특정 구현예에서, 본 발명의 제1 측면에 따른 CAR에서:
(a) CAR의 세포외 도메인은 각각 서열번호: 8, 9, 10, 14, 15 및 16에 의해 정의된 바와 같은 항체 1D3의 CDR 서열 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 모두에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 상보성 결정 영역(CDR), 및/또는 항체 1D3의 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체를 포함하고/하거나;
(b) CAR의 세포외 도메인은
(i) 각각 서열번호: 8, 9, 및 10에 의해 정의된 바와 같은 항체 1D3의 가변 중쇄(VH)의 CDR 1, 2, 및 3 서열 중 1, 2, 또는 3개 모두; 및/또는
(ii) 각각 서열번호: 14, 15, 및 16에 의해 정의된 바와 같은 항체 1D3의 가변 경쇄(VL)의 CDR 1, 2, 및 3 서열 중 1, 2, 또는 3개 모두
를 포함하고/하거나;
(c) CAR의 세포외 도메인은 (i) 각각 서열번호: 8, 9, 및 10의 서열을 갖는 CDR 1, 2, 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드 서열, 및 임의적으로 여기서 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드 서열은 서열번호: 12의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것; 및/또는 (ii) 각각 서열번호: 14, 15, 및 16의 서열을 갖는 CDR 1, 2 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드 서열, 및 임의적으로 여기서 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드는 서열번호: 18의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 제1 측면에 따른 CAR에서:
(a) CAR의 세포외 도메인은 각각 서열번호: 112, 113, 114, 117, 83 및 118에 의해 정의된 바와 같은 항체 1C10의 CDR 서열 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 모두에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 상보성 결정 영역(CDR), 및/또는 항체 1C10의 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체를 포함하고/하거나;
(b) CAR의 세포외 도메인은
(i) 각각 서열번호: 112, 113, 및 114에 의해 정의된 바와 같은 항체 1C10의 가변 중쇄(VH)의 CDR 1, 2, 및 3 서열 중 1, 2, 또는 3개 모두; 및/또는
(ii) 각각 서열번호: 117, 83, 및 118에 의해 정의된 바와 같은 항체 1C10의 가변 경쇄(VL)의 CDR 1, 2, 및 3 서열 중 1, 2, 또는 3개 모두
를 포함하고/하거나;
(c) CAR의 세포외 도메인은 (i) 각각 서열번호: 112, 113, 및 114의 서열을 갖는 CDR 1, 2, 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드 서열, 및 임의적으로 여기서 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드 서열은 서열번호: 104의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것; 및/또는 (ii) 각각 서열번호: 117, 83, 및 118의 서열을 갖는 CDR 1, 2 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드 서열, 및 임의적으로 여기서 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드는 서열번호: 108의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 제1 측면에 따른 CAR에서:
(a) CAR의 세포외 도메인은 각각 서열번호: 112, 113, 114, 117, 83 및 118에 의해 정의된 바와 같은 항체 1A10의 CDR 서열 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 모두에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 상보성 결정 영역(CDR), 및/또는 항체 1A10의 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체를 포함하고/하거나;
(b) CAR의 세포외 도메인은
(i) 각각 서열번호: 112, 113, 및 114에 의해 정의된 바와 같은 항체 1A10의 가변 중쇄(VH)의 CDR 1, 2, 및 3 서열 중 1, 2, 또는 3개 모두; 및/또는
(ii) 각각 서열번호: 117, 83, 및 118에 의해 정의된 바와 같은 항체 1A10의 가변 경쇄(VL)의 CDR 1, 2, 및 3 서열 중 1, 2, 또는 3개 모두
를 포함하고/하거나;
(c) CAR의 세포외 도메인은 (i) 각각 서열번호: 112, 113, 및 114의 서열을 갖는 CDR 1, 2, 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드 서열, 및 임의적으로 여기서 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드 서열은 서열번호: 122의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것; 및/또는 (ii) 각각 서열번호: 117, 83, 및 118의 서열을 갖는 CDR 1, 2 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드 서열, 및 임의적으로 여기서 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드는 서열번호: 126의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 제1 측면에 따른 CAR에서:
(a) CAR의 세포외 도메인은 각각 서열번호: 76, 77, 78, 82, 83 및 84에 의해 정의된 바와 같은 항체 1G9의 CDR 서열 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 모두에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 상보성 결정 영역(CDR), 및/또는 항체 1G9의 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체를 포함하고/하거나;
(b) CAR의 세포외 도메인은
(i) 각각 서열번호: 76, 77, 및 78에 의해 정의된 바와 같은 항체 1G9의 가변 중쇄(VH)의 CDR 1, 2, 및 3 서열 중 1, 2, 또는 3개 모두; 및/또는
(ii) 각각 서열번호: 82, 83, 및 84에 의해 정의된 바와 같은 항체 1G9의 가변 경쇄(VL)의 CDR 1, 2, 및 3 서열 중 1, 2, 또는 3개 모두
를 포함하고/하거나;
(c) CAR의 세포외 도메인은 (i) 각각 서열번호: 76, 77, 및 78의 서열을 갖는 CDR 1, 2, 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드 서열, 및 임의적으로 여기서 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드 서열은 서열번호: 68의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것; 및/또는 (ii) 각각 서열번호: 82, 83, 및 84의 서열을 갖는 CDR 1, 2 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드 서열, 및 임의적으로 여기서 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드는 서열번호: 72의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 제1 측면에 따른 CAR에서:
(a) CAR의 세포외 도메인은 각각 서열번호: 76, 95, 96, 82, 99 및 100에 의해 정의된 바와 같은 항체 1E8의 CDR 서열 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 모두에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 상보성 결정 영역(CDR), 및/또는 항체 1E8의 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체를 포함하고/하거나;
(b) CAR의 세포외 도메인은
(i) 각각 서열번호: 76, 95, 및 96에 의해 정의된 바와 같은 항체 1E8의 가변 중쇄(VH)의 CDR 1, 2, 및 3 서열 중 1, 2, 또는 3개 모두; 및/또는
(ii) 각각 서열번호: 82, 99, 및 100에 의해 정의된 바와 같은 항체 1E8의 가변 경쇄(VL)의 CDR 1, 2, 및 3 서열 중 1, 2, 또는 3개 모두
를 포함하고/하거나;
(c) CAR의 세포외 도메인은 (i) 각각 서열번호: 76, 95, 및 96의 서열을 갖는 CDR 1, 2, 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드 서열, 및 임의적으로 여기서 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드 서열은 서열번호: 88의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것; 및/또는 (ii) 각각 서열번호: 82, 99, 및 100의 서열을 갖는 CDR 1, 2 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드 서열, 및 임의적으로 여기서 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드는 서열번호: 92의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것을 포함한다.
임의적으로, 상기 CAR에서, 세포외 도메인은 항체, 예를 들어 단일 쇄 가변 단편(scFv)이다.
본 발명의 제1 측면에 따른 CAR의 막관통 도메인은 예를 들어, 단백질의 막관통 도메인, 예를 들어 막관통 수용체 단백질의 막관통 도메인을 포함할 수 있고, 임의적으로 여기서 막관통 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD8, CD45 및 CD4로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막관통 도메인을 포함한다.
본 발명의 제1 측면에 따른 CAR의 세포외 도메인은 예를 들어, 힌지 영역에 의해 막관통 도메인에 연결될 수 있다.
본 발명의 제1 측면에 따른 CAR의 세포내 도메인은 예를 들어, 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있으며, 예를 들어 여기서: (a) 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하고/하거나; (b) 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타, Fc 수용체 감마, Fc 수용체 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d의 신호전달 도메인을 포함한다.
본 발명의 제1 측면에 따른 CAR의 세포내 도메인은 예를 들어, 하나 이상의 공자극 도메인을 포함할 수 있으며, 예를 들어: (a) 여기서 하나 이상의 공자극 도메인은 CD28, 41BB, OX40, ICOS, CD27, 및 DAP10으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터 수득되는 하나 이상의 기능적 신호전달 도메인을 포함하고/하거나; (b) 여기서 세포내 도메인은 세포내 신호전달 도메인에 근접한 공자극 도메인을 혼입하고/하거나, (c) 여기서 세포내 도메인은 2개 이상의 공자극 도메인, 예를 들어 2개의 인라인(in-line) 공자극 도메인을 포함하고/하거나, (d) 여기서 세포내 도메인은 별도의 사이토카인 신호를 혼입한다.
본 발명의 제1 측면에 따른 CAR은 예를 들어, 리더 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 제2 측면은 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합을 제공하며, 여기서 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합은 집합적으로, 개별적으로 또는 조합하여 본 발명의 제1 측면의 결합 분자, 예를 들어 본 발명의 제1 측면에 따른 항체 또는 CAR을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 제3 측면은 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 또는 본 발명의 제2 측면에 따른 다수의 별개의 핵산 분자의 조합을 포함하는 벡터(또는 집합적으로 포함하는 다수의 별개의 벡터의 조합)를 제공한다. 본 발명의 제3 측면의 상기 또는 각각의 벡터는 예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 및 아데노바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
임의적으로 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합, 및/또는 본 발명의 제3 측면에 따른 벡터는 하나 이상의 추가 서열을 포함하며, 여기서 상기 또는 각각의 추가 서열은 하나 이상의 선택가능한 마커를 암호화한다.
본 발명의 제4 측면은 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합, 및/또는 본 발명의 제3 측면에 따른 벡터를 포함하는 세포, 또는 세포 집단(임의적으로 동종 또는 이종 세포 집단)을 제공하며, 임의적으로 여기서 세포는 본 발명의 제1 측면에 따른 하나 이상의 결합 분자(예컨대 하나 이상의 항체, 및/또는 하나 이상의 CAR)을 발현하며, 상기 하나 이상의 결합 분자 및/또는 CAR은 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합, 또는 본 발명의 제3 측면에 따른 벡터에 의해 암호화된다. 상기 세포는 임의적으로, 단리된 세포, 생체외 세포, 및 시험관내 세포로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 제4 측면에 따른 세포는 예를 들어 (a) 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합으로, 여기서 암호화된 결합 분자는 본 발명의 제1 측면에 따른 항체, 상기 항체의 기능적 단편, 또는 융합 폴리펩티드 서열을 포함하는 이의 기능적 단편의 항체인 것; 및/또는 (b) 이 단락의 옵션 (a)에 의해 정의된 바와 같은 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합을 포함하는, 본 발명의 제3 측면에 따른 벡터를 포함할 수 있다.
본 발명의 제4 측면에 따른 세포는 예를 들어 (a) 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합으로, 여기서 암호화된 결합 분자는 본 발명의 제1 측면에 따른 CAR인 것; 및/또는 (b) 이 단락의 (a) 부분에 의해 정의된 바와 같은 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합을 포함하는, 본 발명의 제3 측면에 따른 벡터를 포함할 수 있다. 제한없이, 상기 세포는 예를 들어, T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 및 대식세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 따라서, 세포는 임의적으로 CAR-T 세포, CAR-NK 세포 또는 CAR-대식세포일 수 있고, 임의적으로, 세포가 CAR-T 세포인 경우, 예를 들어 T-세포는 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 효과기 T 세포, 헬퍼 T 세포, 기억 T 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), EBV-특이적 T 세포 수용체(TCR) 또는 γδ-T 세포 하위유형으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 제4 측면은 또한 본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자 및/또는 상기 결합 분자를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 제공하며, 임의적으로 여기서 상기 핵산은 각각 본 발명의 제2 또는 제3 측면에 의해 정의된 바와 같은 핵산 또는 벡터이다. 예를 들어, 결합 분자는 본 발명의 제1 측면에 따른 항체, 본 발명의 제1 측면에 따른 상기 항체의 기능적 단편, 또는 본 발명의 제1 측면에 따른 융합 폴리펩티드 서열을 포함하는 이의 기능적 단편의 항체일 수 있고, 임의적으로 여기서 항체는 모노클로날 항체이고, 추가로 예를 들어 여기서 세포는 모노클로날 항체를 재조합적으로 발현하는 포유동물 세포, 예컨대 CHO 세포이다.
본 발명의 제4 측면은 또한 본 발명의 제1 측면에 따른 CAR 및/또는 상기 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 제공하며, 임의적으로 여기서 상기 핵산은 각각 본 발명의 제2 또는 제3 측면에 의해 정의된 바와 같은 핵산 또는 벡터이다. 제한없이, 상기 세포는 예를 들어, T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 및 대식세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 따라서, 세포는 임의적으로 CAR-T 세포, CAR-NK 세포 또는 CAR-대식세포일 수 있고, 임의적으로, 세포가 CAR-T 세포인 경우, 예를 들어 T-세포는 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 효과기 T 세포, 헬퍼 T 세포, 기억 T 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), EBV-특이적 T 세포 수용체(TCR) 또는 γδ-T 세포 하위유형으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 제5 측면은 세포, 보다 특히 재조합 세포, 또는 이러한 세포의 집단(임의적으로 동종 또는 이종 세포 집단)을 생산하는 방법을 제공하며, 방법은 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합, 및/또는 본 발명의 제3 측면에 따른 벡터를 세포로 도입하는 단계를 포함한다.
상기 방법은 임의적으로 본 발명의 제5 측면에 따라 세포를 선택하는 단계를 추가로 포함하며; 예를 들어 이종 세포 집단으로부터 상기 세포를 선택하여, 풍부화 및/또는 동종 세포 집단을 생성한다. 상기 선택 단계는 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합, 및/또는 본 발명의 제3 측면에 따른 벡터에 존재하는 하나 이상의 선택가능한 마커의 존재에 대해 선택하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 제6 측면은 본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자, 예를 들어 본 발명의 제1 측면에 따른 항체 또는 CAR을 생산하는 방법을 제공하며, 방법은 세포, 보다 특히 재조합 세포, 또는 이러한 세포의 집단(임의적으로 동종 또는 이종 세포 집단)에서 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합, 및/또는 본 발명의 제3 측면에 따른 벡터를 발현하는 단계를 포함한다. 임의적으로, 본 발명의 제6 측면의 방법은 또한 세포로부터 이렇게 생산된 결합 분자를 단리하는 단계를 포함할 수 있으며; 예를 들어, 여기서 결합 분자는 본 발명의 제1 측면에 따른 항체, 상기 항체의 기능적 단편, 또는 본 발명의 제1 측면에 따른 융합 폴리펩티드 서열을 포함하는 이의 기능적 단편의 항체이다. 상기 세포는 임의적으로, 단리된 세포, 생체외 세포, 및 시험관내 세포로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 제7 측면은 본 발명의 제6 측면의 방법에 의해 수득되거나, 수득가능한 단리된 결합 분자를 제공하며, 임의적으로, 여기서 단리된 결합 분자는 대상체에게 투여하기 위해 추가로 제형화된다.
본 발명의 제8 측면은 본 발명의 제1 측면에 의해 정의된 바와 같은 결합 분자, 또는 상기 결합 분자의 기능적 단편에 접합된 모이어티를 포함하는 접합체를 제공한다. 제한없이, 상기 모이어티는 예를 들어 치료적, 예방적, 진단적, 예후적, 또는 치료진단적 모이어티일 수 있다. 일부 구현예에서, 모이어티는 약물(예를 들어, 여기서 접합체는 항체-약물 접합체("ADC")임) 및/또는 방사성 모이어티(예를 들어, 여기서 접합체는 방사선면역요법("RIT")에 사용하기에 적합함)이다.
본 발명의 제9 측면은 본 발명의 제8 측면에 따른 접합체를 생산하는 방법을 제공하며, 방법은
(a) 본 발명의 제1 측면에 의해 정의된 바와 같은 결합 분자, 또는 상기 결합 분자의 기능적 단편을 제공하는 단계; 및
(b) 모이어티를 결합 분자, 또는 상기 결합 분자의 기능적 단편에 접합시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 제9 측면의 방법은 이렇게 생산된 접합체를 단리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 따라서 단리된 접합체는 단리된 형태, 예를 들어 결합 분자, 또는 상기 결합 분자의 기능적 단편의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 또는 실질적으로 100%(몰비 기준)가 접합체 형태로 존재하는 조성물의 형태로 제시될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 접합체의 단리된 형태는 모이어티의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 또는 실질적으로 100%(몰비 기준)가 접합체 형태로 존재하는 조성물일 수 있다. 본 발명의 제9 측면은 단리된 접합체, 또는 상기 단리된 접합체를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다.
본 발명의 제8 측면의 접합체, 또는 본 발명의 제9 측면의 방법의 특정 바람직한 구현예에서, 결합 분자는 본 발명의 제1 측면에 따른 항체, 상기 항체의 기능적 단편, 또는 본 발명의 제1 측면에 따른 융합 폴리펩티드 서열을 포함하는 이의 기능적 단편의 항체이다.
본 발명의 제10 측면은 본 발명의 제9 측면의 방법에 의해 수득되거나, 수득가능한 단리된 접합체를 제공하며, 임의적으로, 여기서 단리된 접합체는 대상체에게 투여하기 위해 추가로 제형화된다.
본 발명의 제11 측면은 HCMV 또는 HCMV와 연관된 질환 또는 병태를 퇴치하는 방법을 제공하며, 방법은 대상체, 또는 생체외 또는 시험관내 세포 물질에 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 제제를 투여하는 단계를 포함한다:
i. 본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자,
ii. 본 발명의 제1 측면에 따른 상기 결합 분자의 기능적 단편,
iii. 본 발명의 제7 측면에 따른 단리된 결합 분자,
iv. 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합,
v. 본 발명의 제3 측면에 따른 벡터,
vi. 본 발명의 제4 측면에 따른 세포,
vii. 본 발명의 제8 측면에 따른 접합체, 및
viii. 본 발명의 제10 측면에 따른 단리된 접합체.
다르게 말하면, 본 발명의 제11 측면은 대상체, 또는 생체외 또는 시험관내 세포 물질에서 HCMV와 연관된 질환 또는 병태를 퇴치하는 데 사용하기 위한 상기 제제 중 하나 이상을 제공한다.
추가로, 본 발명의 제11 측면은 대상체, 또는 생체외 또는 시험관내 세포 물질에서 HCMV와 연관된 질환 또는 병태를 퇴치하기 위한 약제의 제조에서 상기 제제 중 하나 이상의 용도를 제공한다.
본 발명의 제11 측면에 따라 퇴치될 HCMV와 연관된 질환 또는 병태는 HCMV 감염일 수 있거나 HCMV 감염과 연관될 수 있다. HCMV 감염은 하나의 구현예에서, 단일 균주 감염일 수 있다. 임의적으로, 대안적인 구현예에서, HCMV 감염은 다중 균주 HCMV 감염을 포함함며, 여기서 다중 균주 HCMV 감염은 HCMV의 하나 초과의 상이한 균주, 예를 들어 상이한 US28 단백질 서열을 암호화하는 2개 이상의 HCMV 균주로의 감염을 포함한다. 상기 2개 이상의 균주는 N-말단(ECD1) 영역, 제1 세포외 루프(ECD2) 영역, 제2 세포외 루프(ECD3) 영역, 및/또는 제3 세포외 루프(ECD4) 영역에서와 같은 세포외 영역 중 하나 이상에서 상이한 US28 단백질을 암호화할 수 있다. 하나의 관심 구현예에서, 다중 균주 HCMV 감염에서 2개 이상의 HCMV 균주는 각각 N-말단(ECD1) 영역의 적어도 하나 이상의 위치에서 다른 것과 상이한 US28 단백질을 암호화하며; 예를 들어 이들은 N-말단(ECD1) 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 상이할 수 있다. 추가로, 또는 대안적으로, 또 다른 관심 구현예에서, 다중 균주 HCMV 감염에서 2개 이상의 HCMV 균주는 각각 제2 세포외 루프(ECD3) 영역의 하나 이상의 위치에서 다른 것과 상이한 US28 단백질을 암호화하며, 예를 들어 다중 균주 HCMV 감염에서 HCMV 균주 중 하나 이상은 ECD3의 4N-변이체를 암호화하는 US28 단백질을 암호화할 수 있고, 다중 균주 HCMV 감염에서 다른 HCMV 균주 중 하나 이상은 ECD3의 4D-변이체를 암호화하는 US28 단백질을 암호화할 수 있다.
본 발명의 제11 측면에 따라 퇴치될 HCMV와 연관된 질환 또는 병태는 잠복성 HCMV 감염(예를 들어, 단일 또는 다중 균주 잠복성 HCMV 감염)일 수 있거나 잠복성 HCMV 감염(임의적으로 다중 균주 잠복성 HCMV 감염)과 연관될 수 있다.
본 발명의 제11 측면에 따라 퇴치될 HCMV와 연관된 질환 또는 병태는 용해성 HCMV 감염(임의적으로 다중 균주 용해성 HCMV 감염)일 수 있거나 용해성 HCMV 감염(임의적으로 다중 균주 용해성 HCMV 감염)과 연관될 수 있다.
본 발명의 제11 측면에 따라 퇴치될 HCMV와 연관된 질환 또는 병태는 선천성 HCMV 감염(예를 들어, 단일 또는 다중 균주 감염), 예컨대 잠복성 선천성 단일 또는 다중 균주 HCMV 감염 또는 용해성 선천성 단일 또는 다중 균주 HCMV 감염일 수 있다;
본 발명의 제11 측면에 따라 퇴치될 HCMV와 연관된 질환 또는 병태는 암, 예를 들어 HCMV-감염된 암(임의적으로 단일 균주, 또는 다중 균주, HCMV 감염된 암), 예컨대 잠복성 HCMV-감염된 암(임의적으로 단일 균주, 또는 다중 균주, 잠복성 HCMV 감염된 암)일 수 있다.
본 발명의 제11 측면에 따라 퇴치될 HCMV와 연관된 질환 또는 병태는 상피암일 수 있으며; 임의적으로 여기서 상피암은 유방암이고; 예를 들어, 여기서 유방암은 삼중 음성 유방암(TNBC), 또는 HER2-양성 유방암이다. HER2-양성 유방암은 예를 들어, HER2+ HR-(여기서 HR-는 호르몬 수용체-음성을 의미하고, 에스트로겐 수용체 음성(ER-) 및 프로게스테론 수용체 음성(PR-) 상태를 지칭함); 또는 HER2+ ER+ PR-; 또는 HER2+ ER- PR+; 또는 HER2+ ER+ PR+인 유방암의 삼중 양성 형태 "TPBC"일 수 있다. HER2+ HR-는 유방암의 특히 공격적 형태이며 본 발명에 따른 진단 치료에 대해 높은 관심이 있음에 주목한다. 상피암의 상기 형태는 임의적으로 HCMV 감염된 상피암의 단일 균주, 또는 다중 균주 형태, 예를 들어 상피암의 잠복성 HCMV-감염된 형태(임의적으로 단일 균주, 또는 다중 균주 잠복성 HCMV 감염된 암)일 수 있다.
본 발명의 제11 측면에 따라 퇴치될 HCMV와 연관된 질환 또는 병태는 암의 전이성 및/또는 공격성 형태일 수 있다. 상기 전이성 및/또는 공격성 암의 형태는 임의적으로 HCMV 감염된 전이성 및/또는 공격성 암의 단일 균주, 또는 다중 균주 형태, 예를 들어 전이성 및/또는 공격성 암의 잠복성 HCMV-감염된 형태(임의적으로 단일 균주, 또는 다중 균주 잠복성 HCMV 감염된 암)일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 제11 측면에 따라 퇴치될 HCMV와 연관된 질환 또는 병태는 교모세포종일 수 있다. 본원에 기재된 다른 구현예에서, 질환 또는 병태는 교모세포종이 아니고/아니거나 치료될 대상체는 교모세포종을 갖지 않고/않거나 갖는 것으로 진단되지 않았다.
일부 구현예에서, 본 발명의 제11 측면에 따라 치료될 대상체(또는 생체외 또는 시험관내 세포 물질)는 잠복성 HCMV-감염된 암 세포와 같은 HCMV-감염된 암 세포를 가질 수 있고/있거나, 이를 갖거나 보유하는 것으로 진단되었다.
일부 구현예에서, 본 발명의 제11 측면에 따라 치료될 대상체는 세포 생성물의 기증과 같은 세포 물질의 수용자일 수 있거나, 되도록 의도될 수 있다. 상기 세포 생성물은 예를 들어, 하나 이상의 유형의 생체외 세포; 하나 이상의 유형의 생체외 세포 배양물; 하나 이상의 유형의 생체외 조직; 하나 이상의 유형의 생체외 조직 배양물; 하나 이상의 유형의 생체외 기관; 및/또는 하나 이상의 유형의 생체외 기관 배양물을 포함하는 군으로부터 선택된 살아있는 생체외 세포 물질을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다. 임의적으로, 세포 생성물은 살아있는 공여자로부터 직접적으로 또는 간접적으로 유래될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 제11 측면에 따라 치료될 대상체는 세포 생성물의 공여자와 같은 세포 물질의 공여자일 수 있거나, 되도록 의도될 수 있다. 상기 세포 생성물은 상기 공여자로부터의 세포, 조직 또는 기관 중 임의의 하나 이상을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 제11 측면에 따라 치료될 생체외 또는 시험관내 세포 물질은 생체외 세포 생성물일 수 있다. 상기 생체외 세포 생성물은 예를 들어, 하나 이상의 유형의 생체외 세포; 하나 이상의 유형의 생체외 세포 배양물; 하나 이상의 유형의 생체외 조직; 하나 이상의 유형의 생체외 조직 배양물; 하나 이상의 유형의 생체외 기관; 및/또는 하나 이상의 유형의 생체외 기관 배양물을 포함하는 군으로부터 선택된 살아있는 생체외 세포 물질을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다. 임의적으로, 세포 생성물은 살아있는 공여자로부터 직접적으로 또는 간접적으로 유래될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 제11 측면에 따라 사용될 하나 이상의 제제는 예를 들어, 다음으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다(또는 하나 이상의 제제를 포함한다):
i. 본 발명의 제1 측면에 의해 정의된 바와 같은 치료적 항체,
ii. 본 발명의 제1 측면에 의해 정의된 바와 같은 상기 치료적 항체의 기능적 단편,
iii. 본 발명의 제1 측면에 의해 정의된 바와 같은 융합 폴리펩티드 서열을 포함하는 치료적 항체; 및
iv. 본 발명의 제1 측면에 의해 정의된 바와 같은 융합 폴리펩티드 서열을 포함하는 상기 치료적 항체의 기능적 단편.
예를 들어, 본 발명의 제11 측면에 따라 사용되는 하나 이상의 제제는 본 발명의 제1 측면에 의해 정의된 바와 같은 이중특이적 항체일 수 있다(또는 이로부터 선택된 하나 이상의 제제를 포함한다). 제한없이, 이것은 이중특이적 면역 세포 관여 항체일 수 있다. 이의 예시적인 구현예는 이중특이적 T-세포 관여(BiTE) 항체이며, 임의적으로 여기서, US28 단백질의 ECD3 영역에 대한 결합 특이성을 갖는 본 발명의 제1 측면의 결합 분자를 포함하는 영역 외에도, BiTE 항체는 CD3-결합 도메인과 같은 T-세포 관여 도메인을 추가로 포함한다.
추가의 구현예에서, 본 발명의 제11 측면에 따라 사용될 하나 이상의 제제는 예를 들어, 본 발명의 제8 측면 및/또는 본 발명의 제10 측면에 따른 따른 접합체, 예컨대 항체-약물 접합체("ADC")인 접합체, 또는 방사성 모이어티를 포함하는 접합체, 예컨대 방사선면역요법("RIT")에 사용하기에 적합한 접합체일 수 있다(또는 포함한다).
또 다른 구현예에서, 본 발명의 제11 측면에 따라 사용될 하나 이상의 제제는 예를 들어, 세포(또는 세포 집단, 예를 들어 동종 세포 집단)일 수 있으며(또는 포함하며) 여기서 상기 또는 각각의 세포는 본 발명의 제4 측면에 따른 CAR을 포함한다. 상기 세포 또는 세포 집단은 전형적으로 대상체에게 투여하기 위해 단리 및/또는 제형화된다. 상기 또는 각각의 세포는 예를 들어, 본 발명의 제1 측면에 따른 CAR 및/또는 상기 CAR을 암호화하는 핵산을 포함할 수 있으며, 임의적으로 여기서 상기 핵산은 각각 본 발명의 제2 또는 제3 측면에 의해 정의된 바와 같은 핵산 또는 벡터이다. 상기 또는 각각의 세포는 예를 들어, 본 발명의 제4 측면에 따른 세포일 수 있다. 제한없이, 상기 세포 또는 세포들은 예를 들어, T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 및 대식세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 따라서, 세포는 임의적으로 CAR-T 세포, CAR-NK 세포 또는 CAR-대식세포일 수 있고, 임의적으로, 세포가 CAR-T 세포인 경우, 예를 들어 T-세포는 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 효과기 T 세포, 헬퍼 T 세포, 기억 T 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), EBV-특이적 T 세포 수용체(TCR) 또는 γδ-T 세포 하위유형으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
임의적으로, 본 발명의 제11 측면에 따르면, 대상체는 추가의 치료적, 예방적, 진단적, 예후적, 또는 치료진단적 물질과 같은 추가의 물질을 투여받을 수 있고, 임의적으로 여기서 추가의 물질은 상기 또는 각각의 하나 이상의 제제와 개별적으로, 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다.
따라서, 본 발명의 제11 측면은 또한 치료적, 예방적, 진단적, 예후적, 또는 치료진단적 물질을 대상체에게 투여함으로써 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 대상체는 또한 상기 또는 각각의 하나 이상의 제제와 개별적으로, 순차적으로(예를 들어, 전 또는 후), 또는 동시에 치료된다.
치료가 동시적인 구현예에서, 본 발명의 제11 측면에 따라 사용될 하나 이상의 제제는 치료적, 예방적, 진단적, 예후적, 또는 치료진단적 물질과 조합하여 제형화 및/또는 투여될 수 있거나; 개별적으로 제형화될 수 있지만 2개의 별개의 제형으로 동시에 투여될 수 있다.
예를 들어, 하나의 구현예에서, 치료될 질환 또는 병태는 암의 형태(예컨대 상기 개시된 바와 같은 암의 하나 이상의 형태)일 수 있고, 추가의 치료적, 예방적, 진단적, 예후적, 또는 치료진단적 물질은 암을 표적할 수 있다.
본 발명의 제12 측면은 의약에 사용하기 위한 제제를 제공하며, 여기서 제제는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
i. 본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자,
ii. 본 발명의 제1 측면에 의해 정의된 바와 같은 상기 결합 분자의 기능적 단편,
iii. 본 발명의 제7 측면에 따른 단리된 결합 분자,
iv. 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합,
v. 본 발명의 제3 측면에 따른 벡터,
vi. 본 발명의 제4 측면에 따른 세포,
vii. 본 발명의 제8 측면에 따른 접합체, 및
viii. 본 발명의 제10 측면에 따른 단리된 접합체.
상기 제제는 예를 들어, 본 발명의 제11 측면과 관련하여 상기 정의된 바와 같은 제제일 수 있다.
본 발명의 제13 측면은 서열 TKKNNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 6)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어지거나, 서열번호: 6의 면역원성 단편의 서열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 제공한다. 상기 펩티드 또는 폴리펩티드는 US28 단백질이 아니다. 바람직하게는 상기 펩티드 또는 폴리펩티드에서 유일한 US28-유래된 서열은 서열번호: 6의 서열 또는 서열번호: 6의 면역원성 단편의 서열이다.
본 발명의 제14 측면은 서열 TKKDNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 7)를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어지거나, 서열번호: 7의 면역원성 단편의 서열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 제공한다. 상기 펩티드 또는 폴리펩티드는 US28 단백질이 아니다. 바람직하게는 상기 펩티드 또는 폴리펩티드에서 유일한 US28-유래된 서열은 서열번호: 7의 서열 또는 서열번호: 7의 면역원성 단편의 서열이다.
각각 본 발명의 제13 또는 제14 측면에 따른 참조 서열 서열번호: 6 또는 7의 면역원성 단편은 참조 서열의 전체 서열 미만을 포함하고, 바람직하게는 참조 서열의 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16개의 연속 아미노산을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 제13 및/또는 제14 측면의 펩티드 또는 폴리펩티드의 면역원성 단편은 서열번호: 6 및 서열번호: 7 모두와 공통이고 그 내에 존재하는 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
또한 각각 TKKNNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 6), 또는 TKKDNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 7)로부터 선택된 참조 서열의 면역원성 단편 또는 변이체를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어진 펩티드 또는 폴리펩티드가 본 발명의 제13 및 제14 측면에 의해 제공되며, 여기서 면역원성 단편 또는 변이체는 본원에 기재된 바와 같은 항체 1D3, 1C10, 1A10, 1G9 및/또는 1E8 중 임의의 것에 의해 결합된 US28의 ECD3 내의 에피토프의 서열을 포함한다(이에 의해 또한 각각 서열번호: 12, 104, 122, 68 및 88에 의해 정의된 바와 같은 1D3, 1C10, 1A10, 1G9 및/또는 1E8의 VH 서열을 갖는 VH 폴리펩티드 서열, 및 각각 서열번호: 18, 108, 126, 72 및 92에 의해 정의된 바와 같은 1D3, 1C10, 1A10, 1G9 및/또는 1E8의 VL 서열을 갖는 VL 폴리펩티드 서열을 포함하는 scFv가 포함됨). 바람직하게는 상기 펩티드 또는 폴리펩티드는 1D3, 1C10, 1A10, 1G9 및/또는 1E8에 의해 특이적으로 결합된다.
본 발명의 제15 측면은 제1 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 제2 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합을 제공하며, 여기서:
제1 펩티드 또는 폴리펩티드는 서열 TKKNNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 6), 또는 이의 면역원성 단편, 예컨대 본 발명의 제13 측면에 의해 정의된 바와 같은 면역원성 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것을 포함하며, 단 상기 면역원성 단편은 적어도 서열번호: 6의 4N 아미노산을 포함하고;
제2 펩티드 또는 폴리펩티드는 서열 TKKDNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 7), 또는 이의 면역원성 단편, 예컨대 본 발명의 제14 측면에 의해 정의된 바와 같은 면역원성 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것을 포함하며, 단 상기 면역원성 단편은 적어도 서열번호: 7의 4D 아미노산을 포함한다.
본 발명의 제16 측면은 제2 아미노산 서열에 직접적으로 또는 하나 이상의 링커 아미노산 서열을 통해 융합된 제1 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 융합 단백질을 제공하며, 여기서 제1 아미노산 서열은 본 발명의 제13 또는 제14 측면에 의해 정의된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드의 서열이고; 제2 아미노산 서열은 융합 파트너이다.
임의적으로, 융합 파트너는 제1 아미노산 서열에 대한 항체의 면역화 및 생성에 적합한 융합 단백질을 제공하기 위해 선택된 담체 단백질과 같은 담체 단백질이다. 예를 들어, 담체 단백질은 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), HSA(인간 혈청 알부민), BSA(소 혈청 알부민), OVA(오브알부민), 파상풍 톡소이드(TT), 디프테리아 톡소이드(DT), 디프테리아 독소의 유전적으로 변형된 교차-반응 물질(CRM), 메닝고코커스 외부 막 단백질 복합체(OMPC) 및　에이치. 인플루엔자에(H. influenzae)　단백질 D(HiD)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 제17 측면은 제1 융합 단백질, 및 제2 융합 단백질을 포함하는 적어도 2개의 별개의 융합 단백질의 조합을 제공하며, 여기서:
본 발명의 제16 측면에 따른 제1 융합 단백질은 제1 융합 단백질의 제1 아미노산 서열로서, 서열 TKKNNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 6), 또는 이의 면역원성 단편 또는 변이체를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것을 포함하는 서열을 포함하며, 단 상기 면역원성 단편 또는 변이체는 서열번호: 6의 4N 아미노산을 포함하고;
본 발명의 제16 측면에 따른 제2 융합 단백질은 제2 융합 단백질의 제1 아미노산 서열로서, 서열 TKKDNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 7), 또는 이의 면역원성 단편 또는 변이체를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 서열을 포함하며, 단 상기 면역원성 단편 또는 변이체는 서열번호: 7의 4D 아미노산을 포함한다.
본 발명의 제18 측면은 본 발명의 제13 및 제14 측면 중 어느 하나 또는 둘 다에 의해 정의된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 본 발명의 제16 측면에 의해 정의된 바와 같은 융합 단백질에 접합된 모이어티를 포함하는 접합체를 제공한다.
상기 접합체의 모이어티는 본 발명의 제13 및 제14 측면 중 어느 하나 또는 둘 다에 의해 정의된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 본 발명의 제16 측면에 의해 정의된 바와 같은 융합 단백질에 직접적으로 접합될 수 있다. 대안적으로, 상기 접합체의 모이어티는 본 발명의 제13 및 제14 측면 중 어느 하나 또는 둘 다에 의해 정의된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 본 발명의 제16 측면에 의해 정의된 바와 같은 융합 단백질에 간접적으로 예컨대 링커를 통해 접합될 수 있다.
임의적으로, 모이어티는 담체, 예를 들어 KLH(키홀 림펫 헤모시아닌), HSA(인간 혈청 알부민), BSA(소 혈청 알부민), OVA(오브알부민), 파상풍 톡소이드(TT), 디프테리아 톡소이드(DT), 디프테리아 독소의 유전적으로 변형된 교차 반응 물질(CRM), 메닝고코커스 외부 막 단백질 복합체(OMPC) 및　에이치. 인플루엔자에　단백질 D(HiD)로부터 선택된 담체와 같은 담체 단백질일 수 있다.
본 발명의 제19 측면은 적어도 2개의 별개의 접합체의 조합을 제공하며, 여기서 조합은:
펩티드 또는 폴리펩티드에 접합된 모이어티를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진, 본 발명의 제18 측면에 따른 제1 접합체를 포함하며, 여기서 펩티드 또는 폴리펩티드는 서열 TKKNNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 6), 또는 이의 면역원성 단편 또는 변이체를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어지며, 단 상기 면역원성 단편 또는 변이체는 서열번호: 6의 4N 아미노산을 포함하고;
펩티드 또는 폴리펩티드에 접합된 모이어티를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진, 본 발명의 제18 측면에 따른 제2 접합체를 포함하며, 여기서 펩티드 또는 폴리펩티드는 서열 TKKDNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 7), 또는 이의 면역원성 단편 또는 변이체를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어지며, 단 상기 면역원성 단편 또는 변이체는 서열번호: 7의 4D 아미노산을 포함한다.
본 발명의 제20 측면은 본 발명의 제19 측면에 따른 접합체를 생산하는 방법을 제공하며, 방법은 다음 단계를 포함한다:
(a) 본 발명의 제13 및/또는 제14 측면 중 어느 하나 또는 둘 다에 의해 정의된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드, 본 발명의 제15 측면에 의해 정의된 바와 같은 이의 조합, 또는 본 발명의 제16 측면에 의해 정의된 바와 같은 융합 단백질을 제공하는 단계; 및
(b) 이에 모이어티를 접합시키는 단계.
본 발명의 제21 측면은 본 발명의 제19 측면에 의해 정의된 바와 같은 적어도 2개의 별개의 접합체의 조합을 생산하는 방법을 제공한다.
하나의 구현예에서, 방법은 (a) 본 발명의 제20 측면에 따른 방법에 의해 본 발명의 제18 측면에 의해 정의된 바와 같은 제1 접합체를 제공하거나 생산하는 단계; (b) 본 발명의 제20 측면에 따른 방법에 의해 본 발명의 제18 측면에 의해 정의된 바와 같은 제2 접합체를 제공하거나 생산하는 단계(여기서 제1 및 제2 접합체는 별개임); 및 (c) 제1 및 제2 접합체를 조합하여, 본 발명의 제19 측면에 따른 조합을 형성하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 방법은 (a) 본 발명의 제15 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합, 또는 본 발명이 제17 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 융합 단백질의 조합을 제공하는 단계; 및 (b) 본 발명의 제15 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드, 또는 본 발명의 제17 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 융합 단백질의 조합에 모이어티를 접합시켜, 본 발명의 제19 측면에 따른 조합을 형성하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제20 또는 제21 측면의 방법은 임의적으로 이렇게 생산된 접합체 또는 접합체의 조합을 단리하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제22 측면은 본 발명의 제20 또는 제21 측면 중 임의의 방법에 의해 수득되거나, 수득가능한 단리된 접합체, 또는 접합체의 조합을 제공하며, 임의적으로, 여기서 단리된 접합체는 대상체에게 투여하기 위해 추가로 제형화된다.
본 발명의 제23 측면은 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합을 제공하며, 여기서 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합은 집합적으로, 개별적으로 또는 조합하여, 본 발명의 제13 및/또는 제14 측면 중 어느 하나 또는 둘 다에 따른 하나 이상의 펩티드 및/또는 폴리펩티드, 본 발명의 제15 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합, 본 발명의 제16 측면에 따른 융합 단백질, 및/또는 본 발명이 제17 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 융합 단백질의 조합을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 제23 측면에 따른 상기 또는 각각의 핵산 분자는 예를 들어, DNA 또는 RNA 분자로부터 각각 독립적으로 선택될 수 있다. 본 발명의 제23 측면에 따른 상기 또는 각각의 핵산 분자는 예를 들어, 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산 분자로부터 각각 독립적으로 선택될 수 있다.
본 발명의 제24 측면은 본 발명의 제23 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합을 포함하는 벡터를 제공한다. 임의의 벡터가 사용될 수 있지만, 제한없이, 상기 벡터는 임의적으로 레트로바이러스 벡터, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 및 아데노바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 제25 측면은 본 발명의 제23 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합, 또는 본 발명의 제24 측면에 따른 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 임의적으로, 세포는 본 발명의 제13 및/또는 제14 측면 중 어느 하나 또는 둘 다로부터 선택된 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드, 본 발명의 제15 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합, 본 발명의 제16 측면에 따른 융합 단백질, 및/또는 본 발명의 제17 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 융합 단백질의 조합을 발현한다.
본 발명의 제26 측면은 본 발명의 제13 및/또는 제14 측면 중 어느 하나 또는 둘 다로부터 선택된 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드, 본 발명의 제15 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합, 본 발명의 제16 측면에 따른 융합 단백질, 및/또는 본 발명의 제17 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 융합 단백질의 조합, 본 발명의 제18 측면에 따른 접합체, 본 발명의 제19 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 접합체의 조합, 본 발명의 제23 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합, 및/또는 본 발명의 제24 측면에 따른 벡터에 노출되고/되거나 이를 포함하는 세포를 제공한다.
본 발명의 제27 측면은 US28의 ECD3에서 에피토프에 대한 특이성을 갖는 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 세포(예를 들어 자연 발생 T 세포, 또는 본 발명의 제1 측면에 따른 CAR을 발현하는 재조합 세포, 예를 들어 CAR T-세포, CAR NK-세포 및/또는 CAR-대식세포)를 단리 및/또는 풍부화하는 방법을 제공하며, 여기서 방법은 서열번호: 6 및/또는 7의 서열 중 하나 또는 둘 다에 대한 결합 특이성을 갖는 세포를 단리 및/또는 풍부화하기 위해 하나 이상의 제제를 사용하는 단계를 포함하며,
여기서 하나 이상의 제제는 본 발명의 제13 및/또는 제14 측면 중 어느 하나 또는 둘 다에 따른 펩티드 또는 폴리펩티드, 본 발명의 제15 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합, 본 발명의 제16 측면에 따른 융합 단백질, 및/또는 본 발명의 제17 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 융합 단백질의 조합, 본 발명의 제18 측면에 따른 접합체, 및/또는 본 발명의 제19 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 접합체의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 제27 측면의 방법의 하나의 구현예에서, 서열은 MHC 사량체, 예를 들어 항원-특이적 CD8+　T 세포 검출을 위한 클래스 I MHC 사량체, 항원-특이적 CD4+　T 세포 검출을 위한 클래스 II MHC 사량체, 또는 유세포 분석법 또는 형광 현미경 검사를 위한 형광단 표지된 사량체로서 제형화될 수 있다. 임의적으로, T-세포는 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 효과기 T 세포, 헬퍼 T 세포, 기억 T 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), EBV-특이적 T 세포 수용체(TCR) 또는 γδ-T 세포 하위유형으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 제28 측면은 본 발명의 제13 및/또는 제14 측면 중 어느 하나 또는 둘 다에 따른 펩티드 또는 폴리펩티드에 따른 펩티드 또는 폴리펩티드, 본 발명의 제15 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합을 포함하는 MHC 사량체를 제공하며, 임의적으로 여기서 상기 또는 각각의 펩티드는 서열번호: 6 또는 서열번호: 7, 또는 어느 하나 또는 둘 다의 면역원성 단편을 포함하거나 이에 상응하고, 예를 들어 여기서 MHC 사량체는 항원-특이적 CD8+　T 세포 검출을 위한 클래스 I MHC 사량체, 항원-특이적 CD4+　T 세포 검출을 위한 클래스 II MHC 사량체, 유세포 분석법 또는 형광 현미경 검사를 위한 형광단 표지된 사량체이다. MHC 사량체는 US28의 ECD3에서 에피토프에 대한 특이성을 갖는 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 세포, 예를 들어, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 효과기 T 세포, 헬퍼 T 세포, 기억 T 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), EBV-특이적 T 세포 수용체(TCR) 또는 γδ-T 세포 하위유형으로 이루어진 군으로부터 선택된 T-세포 및/또는 본 발명의 제1 측면에 따른 CAR을 발현하는 재조합 세포, 예를 들어 CAR T-세포, CAR NK-세포 및/또는 CAR-대식세포를 단리 및/또는 풍부화하는 데 추가로 사용될 수 있다.
본 발명의 제29 측면은 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)와 연관된 질환 또는 병태에 대한 백신접종, 위험 감소, 예방, 또는 퇴치에 사용하기에 적합한 백신 조성물을 제공한다. 백신은 능동 또는 수동 백신일 수 있다. 본 발명의 제29 측면에 따른 능동 백신은 HCMV의 US28 단백질의 ECD3 내에 존재하는 에피토프에 대해 지시된 면역 반응을 촉발할 수 있다. 본 발명의 제29 측면에 따른 수동 백신은 HCMV의 US28 단백질의 ECD3 내에 존재하는 에피토프에 대해 지시된 면역 반응을 제공하는 조성물일 수 있다. 본 발명의 다른 측면의 맥락에서 상기 논의된 바와 같이, US28 단백질의 ECD3은 서열번호: 5에 제시된 바와 같은 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 DB 균주에 의해 암호화된 US28 단백질의 위치 167 내지 183에 상응하는 위치에서 HCMV의 균주에 의해 암호화된 US28 단백질에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 본 발명의 제29 측면의 백신 조성물은 하기에 대한 면역 반응을 촉발하고/하거나 제공한다:
(a) HCMV의 US28 단백질의 세포외 도메인 3(ECD3) 내에 완전히 존재하는 하나 이상의 에피토프;
(b) US28 단백질의 ECD3 내의 하나 이상의 선형 에피토프;
(c) HCMV의 4D-변이체 균주 및 4N-변이체 균주 둘 다에서 동일한 형태로 존재하는 에피토프이며, 여기서 HCMV의 4D-변이체 균주는 TKKDNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 7)의 서열을 갖는 ECD3을 포함하는 US28 단백질을 암호화하고 여기서 HCMV의 4N-변이체 균주는 TKKNNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 6)의 서열을 갖는 ECD3을 포함하는 US28 단백질을 암호화하는 것인, HCMV의 US28 단백질의 ECD3 내의 하나 이상의 에피토프; 및/또는
(d) 백신에 의해 촉발되거나 제공되는 면역 반응이 HCMV의 4D-변이체 균주 및 4N-변이체 균주에 대해 불가지론적인 HCMV 균주이고, Towne, VR1814, TB40/E, Merlin, JP, Ad169, VHL/E, BL, AF1 및 DAVIS로부터 선택된 4D-변이체 HCMV 균주 중 하나 이상에 대해 지시되고 또한 Toledo, TR 및 DB로부터 선택된 4N-변이체 HCMV 균주 중 하나 이상에 대해 지시되는 면역 반응을 촉발하고/하거나 제공하는 것.
상기 백신 조성물은 수동 백신일 수 있고/있거나, 임의적으로 (a) 본 발명의 제1 측면에 따른 하나 이상의 결합 분자, (b) 본 발명의 제1 측면에 의해 정의된 바와 같은 상기 하나 이상의 결합 분자의 하나 이상의 기능적 단편, (c) 본 발명의 제7 측면에 따른 하나 이상의 단리된 결합 분자, (d) 본 발명의 제2 측면에 따른 하나 이상의 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합, (e) 본 발명의 제3 측면에 따른 하나 이상의 벡터, (f) 본 발명의 제4 측면에 따른 하나 이상의 세포, (g) 본 발명의 제8 측면에 따른 하나 이상의 접합체, 및/또는 (h) 본 발명의 제10 측면에 따른 하나 이상의 단리된 접합체를 포함한다.
대안적으로, 상기 백신 조성물은 능동 백신일 수 있고/있거나, 임의적으로 다음을 포함한다:
(a) 본 발명의 제13 및/또는 제14 측면 중 어느 하나 또는 둘 다에 따른 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드, 본 발명의 제15 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합, 본 발명의 제16 측면에 따른 융합 단백질, 본 발명의 제17 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 융합 단백질의 조합, 본 발명의 제18 측면에 따른 접합체, 및/또는 본 발명의 제19 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 접합체의 조합;
(b) 본 발명의 제23 측면에 따른 하나 이상의 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합, 및/또는 본 발명의 제24 측면에 따른 벡터; 및/또는
(c) 세포, 예컨대 항원-제시 세포(예를 들어 수지상 세포), 또는 상기 세포의 동종 또는 이종 집단 세포로서, 여기서 상기 또는 각각의 상기 세포는 다음 중 하나 이상으로 로딩되는 것: 본 발명의 제13 및/또는 제14 측면 중 어느 하나 또는 둘 다에 따른 펩티드 또는 폴리펩티드, 본 발명의 제15 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합, 본 발명의 제16 측면에 따른 융합 단백질, 본 발명의 제17 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 융합 단백질의 조합, 본 발명의 제18 측면에 따른 접합체, 본 발명의 제19 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 접합체의 조합, 본 발명의 제23 측면에 따른 하나 이상의 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합, 및/또는 본 발명의 제24 측면에 따른 벡터.
본 발명의 제30 측면은 HCMV와 연관된 질환 또는 병태에 대한 백신접종, 위험 감소, 예방, 및/또는 퇴치 방법을 제공하며, 방법은 본 발명의 제29 측면에 따른 백신을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제30 측면은 대상체에서 HCMV와 연관된 질환 또는 병태에 대한 백신접종, 위험 감소, 예방, 및/또는 퇴치에 사용하기 위한 본 발명의 제29 측면에 따른 백신을 제공한다.
본 발명의 제30 측면은 HCMV와 연관된 질환 또는 병태에 대한 백신접종, 위험 감소, 예방, 및/또는 퇴치를 위한 약제의 제조에서 본 발명의 제29 측면에 따른 백신의 용도를 제공한다.
HCMV와 연관된 상기 질환 또는 병태는 예를 들어, 본 발명의 제11 측면의 맥락에서 상기 개시된 바와 같은 HCMV와 연관된 질환 또는 병태일 수 있다. 임의적으로, 질환 또는 병태는 잠복성 HCMV 감염이거나, 잠복성 HCMV 감염과 연관된 질환 또는 병태이다.
일부 구현예에서, HCMV와 연관된 질환 또는 병태에 대한 백신접종, 위험 감소, 예방, 및/또는 퇴치 방법은 대상체에게 백신을 단지 1회 투여하는 것을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, HCMV와 연관된 질환 또는 병태에 대한 백신접종, 위험 감소, 예방, 및/또는 퇴치 방법은 대상체에게 백신을 2회 또는 여러 번 투여하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 백신이 능동 백신인 구현예에서, 대상체에게 1차 용량, 및 후속 부스터 용량을 별도로 투여하는 것이 적절할 수 있다.
본 발명의 제31 측면은 대상체 및/또는 생체외 생물학적 물질의 하나 이상의 생물학적 조건 및/또는 생물학적 특성을 평가하는 방법을 제공하며, 여기서 방법은 (a) 대상체 및/또는 생체외 생물학적 물질을 예를 들어 본 발명의 제1 측면에 정의된 바와 같은 결합 분자, 또는 예를 들어 본 발명의 제8 또는 제10 측면에 정의된 바와 같은 접합체와 접촉시키는 단계; 및 (b) 대상체 및/또는 생체외 생물학적 물질에 대한 결합 분자 또는 접합체의 결합의 직접 및/또는 간접 측정에 기반하여 대상체 및/또는 생체외 생물학적 물질을 평가하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체 및/또는 생체외 생물학적 물질의 하나 이상의 생물학적 조건 및/또는 생물학적 특성을 평가하는 방법(진단을 포함할 수 있음)은 HCMV에 의해 암호화된 하나 이상의 핵산 서열의 특이적 검출을 위한 제자리 혼성화(ISH)에 의해 이루어지며, 가장 바람직하게는 여기서 상기 ISH는 건강한(즉 HCMV에 의해 감염되지 않은) 대상체 및/또는 건강한 생체외 생물학적 물질에 의해 암호화된 핵산 서열을 검출하지 않는다. 비제한적인 예로서, ISH는 본 출원의 실시예에 논의된 바와 같은 핵산 서열을 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 생물학적 조건은 암이고/이거나 생물학적 특성은 암과 관련된다. 일부 구현예에서, 암은 본원에 명시된 암 중 하나 이상으로부터 선택되며, 임의적으로 여기서 암은 교모세포종이 아니다. 일부 구현예에서, 암은 유방암(예를 들어 HER2+ 유방암, 또는 삼중 음성 유방암), 성상세포종, 교모세포종, 부신 피질 암, 신장암, 심장 육종, 간암, 및 혈관 평활근 암으로 이루어진 군으로부터 선택되며; 임의적으로 여기서 암은 교모세포종이 아니다.
일부 구현예에서, 대상체 및/또는 생체외 생물학적 물질의 하나 이상의 생물학적 조건 및/또는 생물학적 특성을 평가하는 방법(진단 방법을 포함할 수 있음)은 HCMV에 의해 암호화된 하나 이상의 단백질 서열의 특이적 검출을 위한 면역조직화학(IHC)에 의해 이루어지며, 가장 바람직하게는 여기서 상기 IHC는 건강한(즉 HCMV에 의해 감염되지 않은) 대상체 및/또는 건강한 생체외 생물학적 물질에 의해 암호화된 단백질 서열을 검출하지 않는다. 일부 구현예에서, IHC는 잠복성 HCMV 감염에 의해 단지 발현되거나, 단지 표면 발현된 하나 이상의 단백질 서열의 특이적 검출을 허용하는 결합 분자를 사용한다. 일부 구현예에서, IHC는 용해성 HCMV 감염에 의해 단지 발현되거나, 단지 표면 발현된 하나 이상의 단백질 서열의 특이적 검출을 허용하는 결합 분자를 사용한다. 일부 구현예에서, IHC는 용해성 및 잠복성 HCMV 감염 둘 다에 의해 발현된, 예를 들어 표면 발현된 하나 이상의 단백질 서열의 특이적 검출을 허용하는 결합 분자를 사용한다. 일부 구현예에서, IHC는 세포 표면-발현된 단백질의 검출만을 허용하도록 (예를 들어 세포가 투과되지 않은 생물학적 조직을 사용하여) 수행될 수 있다. 다른 구현예에서, IHC는 세포내 단백질의 검출을 허용하도록 (예를 들어 세포가 투과된 생물학적 조직을 사용하여) 수행될 수 있다. 비제한적인 예로서, IHC는 본 출원의 실시예에 논의된 바와 같이 및/또는 본 발명의 결합 분자 중 하나 이상을 사용하여, HCMV에 의해 암호화된 하나 이상의 단백질 서열의 특이적 검출을 위한 항체-기반 분자를 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 생물학적 조건은 암이고/이거나 생물학적 특성은 암과 관련된다. 일부 구현예에서, 암은 본원에 명시된 암 중 하나 이상으로부터 선택되며, 임의적으로 여기서 암은 교모세포종이 아니다. 일부 구현예에서, 암은 유방암(예를 들어 HER2+ 유방암, 또는 삼중 음성 유방암), 성상세포종, 교모세포종, 부신 피질 암, 신장암, 심장 육종, 간암, 및 혈관 평활근 암으로 이루어진 군으로부터 선택되며; 임의적으로 여기서 암은 교모세포종이 아니다.
HCMV 감염이 본 발명의 제32 측면에 의해 양성으로 식별된 대상체 및/또는 살아있는 생체외 생물학적 물질은 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 다른 측면에 따라 치료될 수 있는 예시적인 대상체 및/또는 물질일 수 있다.
본 발명의 제32 측면은 살아있는 생체외 생물학적 물질에서 HCMV 감염(예컨대 잠복성 HCMV 감염 및/또는 용해성 HCMV 감염 및/또는 다중 균주 HCMV 감염)을 퇴치하는 방법을 제공하며, 방법은 살아있는 생체외 생물학적 물질을 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 제제와 접촉시키는 단계를 포함한다:
i. 본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자,
ii. 본 발명의 제1 측면에 의해 정의된 바와 같은 상기 결합 분자의 기능적 단편,
iii. 본 발명의 제7 측면에 따른 단리된 결합 분자,
iv. 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합,
v. 본 발명의 제3 측면에 따른 벡터,
vi. 본 발명의 제5 측면에 따른 세포,
vii. 본 발명의 제8 측면에 따른 접합체, 및
viii. 본 발명의 제10 측면에 따른 단리된 접합체.
본 발명의 제32 측면은 또한 이 측면의 방법에 의해 수득되거나, 수득가능한 살아있는 생체외 생물학적 물질을 제공한다.
본 발명의 제32 측면의 방법, 및/또는 이에 의해 수득되거나, 수득가능한 살아있는 생체외 생물학적 물질의 하나의 구현예에서, 생체외 살아있는 생물학적 물질은 하나 이상의 유형의 생체외 세포; 하나 이상의 유형의 생체외 세포 배양물; 하나 이상의 유형의 생체외 조직; 하나 이상의 유형의 생체외 조직 배양물; 하나 이상의 유형의 생체외 오가노이드(organoid); 하나 이상의 유형의 생체외 오가노이드 배양물; 하나 이상의 유형의 생체외 기관; 및/또는 하나 이상의 유형의 생체외 기관 배양물을 포함하는 군으로부터 선택된 살아있는 생체외 생물학적 물질을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
본 발명의 제33 측면은 대상체에게 본 발명의 제32 측면에 의해 정의된 바와 같은 생체외 살아있는 생물학적 물질을 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
예를 들어, 방법은 생체외 살아있는 생물학적 물질, 예컨대 기관 또는 조직 이식물의 이식 방법일 수 있다. 상기 방법은 이식물의 수용자에서 HCMV 감염, 또는 HCMV 감염과 연관된 질환 또는 병태의 전파를 예방하거나, 위험을 감소시키는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 제34 측면은 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 US28 단백질의 세포외 도메인 3(ECD3) 내의 에피토프에 대한 결합 특이성 및/또는 결합 친화성을 갖는 결합 분자를 스크리닝하는 방법을 제공하며, 방법은 다음 단계를 포함한다:
(a) US28 단백질의 ECD3에 존재하는 아미노산에 상응하는 하나 이상의 펩티드를 제공하는 단계,
(b) 하나 이상의 후보 결합 분자를 제공하는 단계;
(c) 하나 이상의 펩티드에 대한 하나 이상의 후보 결합 분자의 결합 특이성 및/또는 결합 친화성을 결정하는 단계.
본 발명의 제35 측면은 결합 분자의 다중 카피를 포함하는 조성물을 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 제34 측면의 방법에 따라 선택된 선택된 후보 결합 분자의 재생산을 야기하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제36 측면은 본 발명의 제34 측면의 방법에 따라 선택되고/되거나 본 발명의 제35 측면의 방법에 따라 생산된 선택된 후보 결합 분자를 평가하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 예를 들어, 항체 또는 CAR인 선택된 후보 결합 분자에서 상기 또는 각각의 CDR 서열을 식별함으로써, 결합 특성(특히, 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 US28 단백질의 세포외 도메인 3(ECD3) 내의 에피토프에 대한 결합 특이성 및/또는 결합 친화성)을 제공하는 선택된 후보 결합 분자 내의 구조(들)를 포함하고 식별하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제37 측면은 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 US28 단백질의 세포외 도메인 3(ECD3) 내의 에피토프에 대한 결합 특이성 및/또는 결합 친화성을 갖는 결합 분자의 다중 카피를 포함하는 조성물을 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 결합 분자는 본 발명의 제36 측면의 방법에 따라 결합 특성을 제공함으로써 선택된 후보 결합 분자 내에서 식별된 상기 또는 각각의 구조(들)(예를 들어, CDR 서열)를 포함하며, 상기 방법은 결합 분자의 재생산을 야기하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제37 측면은 동일한 측면에 의해 수득된 결합 분자의 조성물을 추가로 제공한다.
도 1. 항-HIS Ab를 사용함으로써 형질전환된 CHO-US28-A1 세포에서 US28 단백질 발현을 확인하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 사용하였다. 왼쪽부터, 첫번째 줄: 래더(ladder), 두번째 줄: CHO 대조군 세포으로부터의 단백질 추출물, 세번째 줄: CHO-US28-A1 세포로부터의 단백질 추출물 및 네번째 줄: 6HIS 양성 대조군. CHO-US28-A1 세포로 형질감염된 US28-A1 작제물의 C-말단 부분은 6HIS 태그를 함유한다. 6HIS 태그에 결합하는 항-HIS 항체로 염색하면 래더와 비교할 때 ∽41 kDa에서 특이적 밴드가 표시되며, 이는 HCMV US28 단백질의 앞서 보고된 크기와 동등하다. 도면에서 원으로 표시된 이 밴드는 대조군 CHO-세포에는 존재하지 않았으며, 따라서 혈질감염된 CHO-US28-A1 세포에서 US28의 발현을 확인하였지만 대조군 CHO 세포에서는 아니었다. 6HIS 양성 대조군은 6HIS Ab가 예상대로 표적에 결합한다는 것을 나타내는 양성이다.
도 2. CHO-US28-A1 세포에서 US28-13-5G6-1D3 항체 클론의 표면 결합을 보여주는 유세포 분석법. 왼쪽부터, 블랭크 대조군, 2차 항체 대조군 및 CHO-US28-A1 세포의 표면에 결합하는 클론 US28-13-5G6-1D3 Ab. US28-13-5G6-1D3 Ab는 CHO-US28-A1 세포의 53,4%에 결합한 반면, 블랭크 및 2차 항체 대조군은 각각 0.11% 및 1.63%의 낮은 결합을 보였다.
도 3. CHO-US28-A1 세포에서 클론 US28-13-5G6-1D3의 양성 표면 결합은 FACS 분석에서 구배 희석에 의해 추가로 확인되엇다. 왼쪽부터, 1:20, 1:50, 1:200(w/v) 희석으로 CHO-US28-A1 세포에 대한 클론 US28-13-5G6-1D3 Ab 표면 결합.
도 4. CHO-US28-A1 세포에서 클론 US28-13-5G6-1D3의 양성 표면 결합을 US28 음성 CHO 대조군 세포와 비교하였다. 클론 US28-13-5G6-1D3 Ab는 1:50(w/v)으로 US28 음성 CHO 세포보다 US28 양성 CHO-US28-A1 세포의 표면에 15-배 더 많이 결합하였다.
도 5. 원래 ELISA 분석은 Bio-펩티드-1(US28 ECD3 유전자형 4N) 및 Bio-펩티드-2(US28 ECD3 유전자형 4D) 둘 다에 대한 US28-13-5G6-1D3 항체 클론의 동일한 정성적 결합을 보였다. ECD3에서 다른 돌연변이가 관찰되지 않았으므로, 이러한 결과는 표적에 대한 US28-13-5G6-1D3 Ab의 결합이 HCMV 균주 불가지론적임을 나타낸다.
도 6. Bio-펩티드 1 및 2에 대한 재조합 항체 생성물 US28-13-5G6-1D3 rAb의 결합을 보여주는 정성적 ELISA 분석. 이러한 결과는 재조합 항체가 그의 표적에 잘 결합하고 HCMV 균주 불가지론적 결합 특성을 유지함을 확인하는 US28 ECD3의 두 유전적 변이체에 대한 생성된 항체의 강력하고 동일한 결합을 보여준다.
도 7. FACS 분석을 사용함으로써 CHO-US28-A1 세포, 및 각각의 대조군 CHO 세포에서 13-5G6-1D3 rAb의 표면 결합을 확인하였다. CHO 세포에 대한 결과를 보여주는 막대는 짙은 회색인 반면 CHO-US28-A1 세포에 대한 결과를 보여주는 막대는 옅은 회색이다. 왼쪽부터, 첫번째 막대는 각각 CHO-US28-A1 및 CHO 세포에 대한 항체가 없는 블랭크 대조군의 측정을 보여주고; 왼쪽에서 두번째 막대는 두 세포 유형에서 항-마우스 IgG-Alexa 488 2차 Ab 단독의 표면 결합을 보여주고; 왼쪽에서 세번째 막대는 두 세포 유형에서 1:10 희석(w/v)으로 13-5G6-1D3 rAb의 표면 결합을 보여주고; 왼쪽에서 네번째 막대는 CHO-US28-A1 세포 단독에서 1:50 희석(w/v)으로 13-5G6-1D3 rAb 표면 결합을 보여주고; 왼쪽에서 다섯번째 막대는 CHO-US28-A1 세포 단독에서 1:100 희석(w/v)으로 13-5G6-1D3 rAb의 표면 결합을 보여준다. y-축은 세포 퍼센트에 대한 결합을 보여준다. 이러한 결과에 기반하여, 13-5G6-1D3 rAb에 대한 최적의 염색 희석은 1:50 w/v(왼쪽에서 세번째 막대)이다. CHO 세포에 대한 13-5G6-1D3 rAb의 표면 결합은 1:10 희석(w/v)에서만 측정되었고 블랭크 및 항-마우스 IgG-Alexa 488 2차 Ab 대조군에 대한 결합을 제거한 후 0.77%였다. 이러한 결과는 13-5G6-1D3 클론의 항체를 사용함으로써 수득된 이전 결과와 일치하고 CHO-US28-A1 세포에서 13-5G6-1D3 rAb의 매우 특이적인 표면 결합을 보여주며, 이는 정상 CHO 세포보다 21-배 초과로 더 많다.
도 8. Mock 세포가 아닌 HCMV Ad169 감염된 MRC-5 세포 집단의 표면에서 US28-13-5G6-1D3 rAb의 결합은 FACS 분석에 의해 나타내었다. a. 윗줄은 HCMV 감염된 세포에서 매우 특이적인 결합을 보여주는 Mock 대 HCMV Ad169 감염된 MRC-5 세포에서 US28-13-5G6-1D3 rAb의 표면 결합을 보여준다. b. 13-5G6-1D3 rAb가 HCMV 감염된 세포 집단의 표면에 결합하였는지를 확인하기 위해, 또 다른 세트의 HCMV Ad169 감염 및 Mock 세포를 투과화하고 용해성 HCMV 감염 동안 초기에 발현되는 것으로 알려진 세포내 단백질인 HCMV 주요 즉시 초기(IE) 항원에 대한 상업적 항체 MAB810X로 염색하였다. MAB810X 항체를 US28-13-5G6-1D3 rAb와 동일한 HCMV 감염된 MRC-5 세포 집단으로 염색하였으며, 이는 어느 한 항체에 대해서도 비감염된 세포에 대해 관찰되지 않았고, US28-13-5G6-1D3 rAb에 대해 입증된 표면 결합이 HCMV Ad169 감염된 세포에 특이적이었음을 확인하였다.
도 9. 염소 항-마우스 lgG-Alexa 488과 함께 인큐베이션하기 전에 1차 항체 대신에 마우스 IgG 이소형 대조군을 사용함으로써 US28-13-5G6-1D3 rAb의 비특이적 결합을 테스트하였다. 결과는 이소형 대조군과 비교하여 US28-13-5G6-1D3 rAb에 의한 HCMV 감염된 MRC-5 세포의 염색에서 변화를 보여준 반면, 비감염된 세포(Mock)의 염색은 IgG 이소형 대조군과 유사하였다. 종합하면, 이러한 결과는 US28-13-5G6-1D3 rAb가 비감염된 세포와 비교하여 용해적으로 HCMV 감염된 세포의 표면에 특이적으로 결합한다(~16-배 더 큰 결합)는 것을 보여준다.
도 10. 이전 연구에서와 동일한 유세포 분석법 프로토콜을 사용함으로써 3명의 HCMV 혈청 양성 개체로부터의 1차 PBMC에 대한 US28-13-5G6-1D3 rAb의 결합을 조사하였다. 도면에서 막대는 각각의 공여자로부터의 PBMC에 대한 US28-13-5G6-1D3 rAb의 상대적 표면 결합을 보여준다. 결과는 각각 3명의 개체로부터 총 PBMC의 18.37%, 3.57% 및 5.25%에 대한 US28-13-5G6-1D3 rAb의 표면 결합을 보여주었다. 동일한 개체로부터 특정 상이한 세포 표면 마커를 발현하는 PBMC의 상대적 비율은 막대 아래에 나열되어 있고; 동일한 세포의 일부가 이러한 세포 표면 마커 중 하나 초과를 발현하기 때문에 합계가 100%를 초과하였다(그러나, 이들은 US28-13-5G6-1D3 rAb 결합보다 동일한 실험 동안 측정되지 않았다). 연구된 PBMC 중, CD11+, CD14+ 및 CD16+ 양성 세포만이 HCMV의 담체일 수 있고, 이러한 표면 마커는 상이한 단핵 세포에서 부분적으로 중첩할 수 있다. HCMV로 잠복기 감염된 단핵 세포 집단은 종종 총 PBMC의 최대 약 15%까지 추가된다(그러나 개체 간에 일부 상당한 변이가 있을 수 있음). 결과적으로, 각각 공여자 1, 2 및 3에서 총 PBMC의 18.37%, 3.57% 및 5.25%에 대한 US28-13-5G6-1D3 rAb의 관찰된 표면 결합은 HCMV 담체가 될 수 있는 상당한 비율의 PBMC에 대한 결합을 입증한다. 이러한 결과는 PBMC의 하위유형과 관련되지 않지만, US28-13-5G6-1D3 rAb가 잠복성 HCMV 감염된 세포의 표면 상에 결합할 수 있음을 나타낸다.
도 11. CHO-US28-A1 세포에 대한 상업적 US28 폴리클로날 Ab의 결합을 테스트하고 동일한 세포에 대한 US28-13-5G6-1D3 rAb의 결합과 비교하였다. a. US28-13-5G6-1D3 항체는 CHO-US28-A1 세포의 50% 초과의 표면에 결합한 반면(왼쪽에서 첫번째 막대), 상업적 US28 Ab는 세포의 10%에만 결합하였다(왼쪽에서 두번째 막대). b. 그런 다음 본 발명자들은 HCMV Ad169 감염된 MRC-5 세포에서 상업적 US28 Ab를 테스트하였으며, 여기서 HCMV 감염된 집단에 대한 특이적 결합을 보여주었다. 그러나, 상업적 US28 폴리클로날 Ab는 또한 비감염된 MRC-5 세포의 표면에서 비특이적 결합을 나타내는 IgG 이소형 대조군과 비교하여 비감염된 Mock 세포를 약 2-배 염색하였다. HCMV Ad169 양성 MRC-5 세포에 대한 상업적 US28 Ab의 결합 특이성은 US28 음성 Mock MRC-5 세포와 비교할 때 IgG 이소형으로부터의 신호를 뺀 경우 단지 1.7이었다.
도 12. 면역조직화학 분석(IHC)을 사용함으로써 HCMV-감염된 인간 조직에 대한 1:400 희석(w/v)의 US28-13-5G5-1D3 결합을 연구하였다. a. HCMV 감염된 폐 조직을 US28-13-5G6-1D3 rAb로 염색하여 HCMV 감염된 폐포 및 내피 세포에 대한 특이성을 입증하였다. 화살표(이 도면의 무색 버전)는 HCMV 양성 대조군 슬라이드에서 특징적 사이토메갈로 효과가 있는 전형적인 HCMV 감염된 폐포 세포에 대한 US28-13-5G6-1D3 rAb 세포질 염색을 표시한다. b. 13-5G6-1D3은 대식세포에 대해 양성 US28 염색을 보여주지만, 정상 폐 조직에서 폐포 세포에 대한 음성 염색을 보여준다. c. 동일한 대식세포는 동일한 폐 생검에서 양성 HCMV DNA를 보여주는 반면, 정상 폐포 세포에서는 HCMV DNA 신호가 없으며, 동일한 샘플에서 US28 염색과 일치한다. d. HCMV 감염된 폐 조직을 MAB810R 항체로 염색하여 HCMV 감염된 폐포 및 내피 세포에 대한 특이성을 입증하였다. 화살표(이 도면의 무색 버전)는 HCMV 양성 대조군 슬라이드에서 특징적 사이토메갈로 효과가 있는 전형적인 HCMV 감염된 세포에 대한 MAB810R 항체 핵 염색을 표시한다. e. IE 염색은 정상 폐 조직에서 폐포 HCMV 양성 대식세포에 대해 음성이다. 정상 폐포 세포는 또한 음성 염색을 보여준다. f. IgG를 음성 대조군 항체로 사용하였고 동일한 폐 조직에 대해 음성 염색을 보여주었다. 도 12의 유색 버전은 또한 무색 버전 다음으로 제공된다.
도 13. 유방암 코호트에서 면역조직화학(IHC) 및 제자리 혼성화(ISH)에 의해 HCMV US28 발현을 연구하였다. a. US28-13-5G6-1D3 rAb는 삼중 음성 유방암(TNBC) 샘플에서 암 세포에 대한 강한 세포질 염색(3+)(이 도면의 무색 버전에서 화살표로 표시됨)을 보여주었다. 이 샘플에서 대부분의 종양 세포는 US28-13-5G6-1D3 rAb에 대해 양성으로 염색되었다(갈색). b. 동일한 샘플은 항-IE MAB810R 항체에 대해 전체 샘플 내의 몇몇 세포에서 일부 점형 양성 세포질 염색을 보여주었다. c. 이 ISH 분석은 동일한 종양 세포의 많은 핵에서 다중 HCMV DNA 신호를 보여주며, 이는 본 자료에서 많은 삼중 음성 및 HER2 양성 종양에 대해 전형적이다. 화살표는 도면에서 일부 양성 HCMV DNA 신호를 가리킨다. 세포의 세포질에서 HCMV DNA는 보이지 않았다. d. 음성 대조군 IgG Ab는 음성 염색을 보여준다. 도 13의 유색 버전은 무색 버전 다음 페이지에서 제공된다.
도 14. a. HER2 양성 유방암으로부터 선상 전이는 모든 종양 세포에서 US28-13-5G6-1D3 rAb에 대한 양성 중간 세포질 염색(2+)(갈색)을 보여준다. b. 동일한 샘플에서 대부분의 암 세포는 MAB810R 염색에 대해 음성이었다. 전체 샘플에서 1 또는 2개의 세포만이 MAB810R Ab에 대해 점형 양성 세포질 염색을 가졌다(도면에 제시되지 않음). c. ISH 분석은 동일한 종양 세포에서 많은 양성 핵 HCMV DNA 신호를 보여준다. 화살표는 이러한 양성 HCMV DNA 신호를 가리킨다. HCMV DNA는 종양 세포의 세포질에서 보이지 않았다. d. 동일한 샘플에 대한 음성 대조군 항-IgG Ab 염색은 음성이었다. 도 14의 유색 버전이 또한 제공된다.
도 15. US28 염색 및 HCMV ISH는 샘플 BR1008b_J6의 도면에 예시된 바와 같이 많은 정상 인접 종양(NAT) 유방 조직에서 음성이었다. a. US28-13-5G6-1D3 rAb는 정상 유방 조직에 대해 음성 IHC 염색을 보여주었다. b. MAB810R 항체는 또한 동일한 샘플에 대해 음성 염색을 보여주었다. c. ISH에 의한 핵 또는 세포질 HCMV DNA 신호는 동일한 샘플에 대해 보이지 않았다. d. IgG 염색은 또한 음성이었다. 이러한 결과는 항체가 HCMV 감염 징후가 없는 정상 선상 유방 조직에 대해 지속적으로 음성 염색을 보여준다는 것을 나타낸다. 참고로, HCMV 음성 샘플 BR1008b_J6은 샘플 BR1008b_D5 및 BR1008b_H6과 동일한 TMA 슬라이드에 배치되었으며, 이는 US28-13-5G6-1D3 항체에 대해 강한 양성 염색 및 HCMV DNA ISH에 대해 양성 핵 신호를 나타내었다. 따라서, 샘플은 정확히 동일한 염색 조건 및 항체/DNA 프로브 농도에 노출된다. US28-13-5G6-1D3 rAb로 보여진 양성 염색은 유방암 및 정상 조직 둘 다에서 HCMV 감염된 세포에 특이적인 것으로 평가되었다. 도 15의 유색 버전이 또한 제공된다.
도 16. a. US28-13-5G6-1D3 rAb로 원발성 유방암 샘플의 IHC 염색에서는 41개의 연구된 원발성 유방 종양 샘플의 ~73%에서 특이적이고 양성이었다. US28 염색에 대해 양성인 종양의 100%가 또한 핵 HCMV DNA 신호에 대해 양성이었고, 41개 종양 중 12개의 핵에서 다중 신호가 있었다. 10개의 정상 인접 조직 대조군(n = 10)은 모두 유방 상피 세포(0)에서 세포질 US28 염색에 대해 음성이었고 10개 중 7개가 또한 ISH 신호에 대해 음성이었다. b US28-13-5G6-1D3 rAb로의 양성 염색이 연구된 30개의 유방암 전이의 ~94%에서 보여졌고 전이 세포에 대해 특이적이었다. TNBC(n = 7) 및 HER2 양성(n = 11) 전이는 모두 양성 US28-13-5G6-1D3 염색을 가졌고, 유일한 음성 샘플(n = 2)은 호르몬 수용체 양성 암이었다. ISH 분석은 전이의 100%에서 양성 핵 HCMV DNA를 보여주었다. 전이 조직의 43%는 종양 세포에서 다중 핵 DNA 신호를 보여주었다. 이러한 샘플은 독점적으로 TNBC 또는 HER2+ 하위유형이었고 2가지 예외는 낮은 HR+ 상태를 가졌다. ISH 결과는 도면에 제시되지 않는다.
도 17. IHC를 사용하고 HCMV DNA에 대한 ISH 분석을 사용하여 US28-13-5G6-1D3 rAb 및 MAB810R 항체로 인간 교모세포종 조직을 연구하였다. a. 교모세포종 등급 IV 뇌 종양은 종양 세포에서 US28에 대해 중간정도 염색을 보인다(갈색). b. MAB810R 항체 염색은 동일한 암 세포에서 IE 발현을 보이지 않는다. 그러나, MAB810R에 대한 양성 세포질 염색은 교모세포종 샘플의 ~90%에서 보여졌다. 염색은 유방암 샘플과 상이한 각각의 양성 샘플에서 여러 세포에 존재하였다. 그러나, 교질 세포의 염색은 US28-13-5G6-1D3 rAb보다 더 약했다. c. 뇌 조직 NAT는 13-5G6-1D3 염색에 대해 음성이다. d. ISH 분석은 동일한 종양 세포에서 양성 핵 HCMV DNA 신호를 보인다. 화살표는 이러한 신호를 나타낸다. e. 동일한 교모세포종 등급 IV 샘플의 염색은 IgG 항체에 대해 음성이다. f. ISH 분석은 동일한 뇌 조직 NAT 샘플에 대해 음성이다. 양성 교질 세포는 이러한 도면의 무색 버전에서 화살표로 나타낸다. 도 17의 유색 버전은 무색 버전 다음 페이지에 제공된다.
도 18. 인간 성상세포종 등급 1-3 및 교모세포종 등급 4를 함유하는 인간 뇌 암 코호트 및 NAT 조직의 US28-13-5G6-1D3 염색. 성상세포종 등급 1(n = 4)은 모두 음성(0)으로 염색되었다. 등급 2-3 성상세포종 중, 6개가 음성(0)으로 염색되었고, 37개가 양성 세포질 염색(1+)이었고, 2개가 중간정도 양성 세포질 염색(2+)이었다. 교모세포종 등급 4(n = 19) 종양은 모두 US28-13-5G6-1D3 rAb에 대해 양성 세포질 염색(1+)을 보였고, 이 중 3개는 중간정도 양성(2+)이었다. ISH 분석은 모든 종양 샘플의 종양 세포에서 핵 HCMV DNA의 존재를 확인하였다. 10개의 NAT 샘플 중 3개만이 HCMV DNA 양성이었다.
도 19. a. 28-13-5G6-1D3-PE 항체를 사용한 유세포 분석법을 다양한 인간 1차 세포에서 수행하여 이러한 세포 유형의 표면에 대한 일반적인 표적외 결합을 제외하였다. 다음 세포주를 연구하였다: 인간 1차 부신 피질 세포, 인간 1차 신장 상피 세포, 인간 1차 심장 미세혈관 내피 세포, 인간 1차 간 상피 세포 및 인간 1차 정맥 평활근 세포. US28 표적화 항체 13-5G6-1D3은 이러한 세포 유형 모두에 대해 1% 미만보다 훨씬 아래의 매우 낮은 표면 결합을 보여주었으며, 이는 이러한 세포 유형에 대한 13-5G6-1D3의 표적외 표면 결합이 없음을 나타낸다. 이러한 결과는 정상 US28 음성 세포의 표면에 대한 낮은 결합을 보여주는 실험실 세포에 대한 본 발명의 관찰을 뒷받침한다. b. 원래 인간 1차 심장 세포는 이용가능하지 않았고, 따라서 인간 심장 조직 샘플을 면역조직화학에 의해 13-5G6-1D3의 염색에 대해 연구하였다. 도면의 예는 음성 IgG 항체 대조군으로의 염색과 유사한 심장 근육 조직의 음성 13-5G6-1D3 염색을 보여준다. ISH 분석은 인간 심장 근육에서 잠복성 HCMV 감염의 존재에 대한 임의의 징후를 보여주지 않았다. 인간 심장에 HCMV 감염이 존재한 경우, 이들은 항상 생산적 감염 유형이었다. 양성 대조군은 심장 샘플과 동일한 TMA 플레이트에 위치하였고 양성이었다: 13-5G6-1D3은 악성 크롬친화세포종에 대해 양성 염색을 보였다. ISH 대조군은 또한 동일한 생검에서 종양 세포의 핵에서 전형적인 HCMV DNA 염색을 보였으며 이는 이 종양 유형에서 잠복성 HCMV 감염의 존재를 나타낸다. 양성 13-5G6-1D3 및 HCMV ISH 결과는 도면에서 화살표로 표시된다. 도 19의 유색 버전이 또한 제공된다.
도 20. 일부 췌장 조직을 연구하여 이 조직 유형에 대한 28-13-5G6-1D3의 일반적인 표적외 결합을 제외하였다. 윗줄은 13-5G6-1D3, MAB810R 및 IgG 대조군 항체로 음성 염색한 정상 췌장 조직을 보여준다. HCMV ISH는 음성이며 이는 정상 췌장 조직 샘플에서 바이러스 HCMV DNA의 부재를 나타낸다. 아랫줄은 양성 13-5G6-1D3 및 MAB810R 염색 및 음성 IgG 대조군 항체 염색(음성 대조군)의 또 다른 환자로부터의 췌장 조직 샘플을 보여준다. HCMV ISH 분석은 또한 양성 결과를 보여주며 이는 동일한 샘플에서 세포질 HCMV DNA 응집체의 존재를 나타낸다. 따라서, 동일한 샘플은 두 HCMV 단백질 US28 및 IE 및 HCMV DNA에 대해 양성이지만 음성 대조군 IgG에 대해 음성이며 이는 특이적 항체 결합을 나타낸다. US28 단백질 염색은 예상대로 세포질이며, IE 단백질은 핵 단백질이므로 예상대로 세포 핵에 대부분 위치한다. HCMV ISH는 바이러스가 생산적 HCMV 감염을 나타내는 것으로 세포질에 패킹되어 있으므로 더 큰 세포질 바이러스 DNA 응집체를 보여준다. 이러한 결과는 항체 US28-13-5G6-1D3이 췌장 조직에 표적외 결합하지 않고 형태학적으로 정상 췌장 조직에 존재하는 HCMV 감염이 잠복성 특징으로 보이는 종양과 달리 생산적 속성이라는 것을 나타낸다. 도 20의 유색 버전이 또한 제공된다.
도 21. a. 대조군 CHO 세포 및 상이한 HCMV 균주(DB 및 TB40/E)에 의해 암호화된 US28을 발현하는 CHO 세포, 뿐만 아니라 알려진 US28 돌연변이를 모두 함유하는 변형된 US28을 발현하는 CHO 세포("돌연변이된 균주")와 관련하여, US28-13-5G6-1D3에 대한 선행 기술에 개시된 VUN100(1가, 또는 2가)의 결합 특성과 비교한 항체 패널의 절대 결합 수준. b. 대조군 CHO 세포와 비교하여 상이한 형태의 US28을 발현하는 CHO 세포에 대한 항체의 동일한 패널의 결합 특이성, 결과는 대조군 CHO 세포와 비교하여 US28-발현 세포에 대한 결합에서 배수 증가로 표현된다. c. HCMV 균주 DB 및 TB40/E에 의해 암호화된 US28을 발현하는 CHO 세포에 대한 결합 사이의 절대 결합 수준에서 백분율 변화로서 나타낸, 항체의 동일한 패널의 절대 결합 수준 정도에 대한 균주 차이의 영향, 여기서 백분율 변화가 작을수록 균주 불가지론적 결합 정도가 크다는 것을 나타낸다. d. HCMV 균주 DB 및 TB40/E에 의해 암호화된 US28의 형태를 발현하는 CHO 세포 사이의 동일한 항체 패널의 결합 특이성의 보유 백분율, 여기서 100%에 가까운 결합 특이성의 보유는 균주 불가지론적 결합 특이성을 나타내는 반면, 보다 상당한 차이(2개의 VUN100 항체 샘플에 의해 입증됨)는 US28을 암호화하는 균주에 의존하는 결합 특이성의 변화(즉 균주 불가지론적 결합 특이성 부족)를 나타낸다. e. 각각의 US28 형태에 대해 1D3에 대해 관찰된 결합 수준으로 정규화할 때, 상이한 형태의 US28(DB, TB40/E 및 돌연변이된 형태에 의해 암호화됨)을 발현하는 CHO 세포에 대한 항체의 결합 백분율, 여기서 상이한 CHO 형태에 걸친 주어진 항체에 대한 결합 %의 변화는 1D3-mFc 항체와 비교하여 균주 불가지론적 결합 활성의 감소를 나타내고, US28을 암호화하는 균주에 더 의존적인 결합(즉 1D3-mFc 항체와 비교하여 균주 불가지론적 결합의 부족)을 보여준다.
도 22. 대조군 CHO 세포에 대한 결합에 의해 평가된, VUN100과 비교하여 본 발명의 다양한 ECD3-결합 분자의 표적외 결합 백분율.
도 23. 동일한 검정에서 VUN100의 특이성 수준에 비해, US28-발현 CHO 대 대조군 CHO 세포에 대한 예시적인 ECD3-결합 분자 결합에 대한 결합 특이성의 배수 변화. a. VUN100과 비교하여 1D3에 대한 개선된 결합 특이성(n=3). b. VUN100과 비교하여 1C10에 대한 개선된 결합 특이성(n=3). c. VUN100과 비교하여 1A10에 대한 개선된 결합 특이성(n=3). d. VUN100과 비교하여 1G4에 대한 개선된 결합 특이성(n=3). e. VUN100과 비교하여 1E8에 대한 개선된 결합 특이성(n=1).
본 발명은 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)에 의해 암호화된 바와 같은 US28 단백질의 특이적 영역을 표적하는 제제, 및 HCMV-감염된 암 및 잠복성 또는 용해성 HCMV 감염과 연관된 다른 병태를 포함하나 이에 제한되지 않는 이와 관련된 치료적, 예방적 및 진단적 접근법에 관한 것이다.
HCMV US28 단백질은 다음과 같기 때문에, 잠복성 저장소를 포함하여 HCMV 감염을 표적하는 뛰어난 잠재력을 나타낸다:
(1) US28 단백질의 특정 부분은 용해성 및 잠복성 HCMV 감염 둘 다 동안 세포 표면 상에서 발현된다(Elder 등, iScience, 2019, 12: 13-26);
(2) US28은 GCPR이며, 그 중 원형질막으로의 트래피킹(trafficking)은 결합 분자로의 직접 표적화 및 구성적이거나 리간드 결합의 결과로서 발생하는 세포내이입으로 인한 페이로드의 수송체로서의 사용을 둘 다 허용한다. GCPR은 일반적으로 승인된 약물에 의해 표적된 가장 큰 단백질 패밀리를 구성한다(Sriram & Insel, Mol Pharmacol, 2018, 93(4): 251-258);
(3) 인간 DNA에 의해 암호화된 GCPR을 표적하는 많은 승인된 약물과 달리, HCMV US28은 바이러스 DNA에 의해 완전히 암호화되며, 따라서 건강한 인간 세포에서가 아니라 HCMV 감염된 세포에 배타적으로 위치한 매우 특이적인 약물 표적을 이용한다.
A. US28에 대한 결합 분자
US28에 대한 결합 분자의 설계를 고려할 때, 발명자는 N-말단 도메인이 US28 단백질의 리간드 결합 부분이며, 원형질막으로부터 물리적으로 연장되고 따라서 숙주 항체 생산, 면역 반응, 및 유전적 선택압에 노출될 가능성이 가장 높다는 것에 주목하였다(Mozzi 등, 2020, 상기). 일관되게, 이것은 또한 높은 균주간 가변성 및 돌연변이를 함유하는 것으로 알려진 영역이다(Arav-Boger 등, 2002, 상기). 덜 보존된 부위는 또한 시간 경과에 따라 이러한 영역을 표적하는 치료에 대한 반응을 변화시킬 수 있는 신규 돌연변이가 발생하기 더 쉽다(Komatsu 등, Antiviral Res, 2014, 101: 12-25). 따라서, HCMV 유전자에서 신규 돌연변이는 상이한 바이러스 균주 사이의 변이에 의해 정확히 지정된 덜 보존된 부위에서 발생할 가능성이 있다. 대부분의 구조적 항체는 US28 단백질의 N-말단 부분에 대해 가장 많이 발생할 가능성이 있으며(De Groof 등, Mol Pharm, 2019, 16(7): 3145-3156), 따라서 또한 인체에서 자연 항체에 대한 경우일 수 있다(Elder 등, 2019, 상기).
본 발명의 지식에 따르면, 지금까지 3가지 유형의 HCMV 고위험 발암 균주가 식별되었다. DB(KT95923) 및 BL(MW980585) 임상 HCMV 단리물은 발암 분자 경로를 촉진하고, 시험관 내에서 고정-독립적 성장을 확립하고 마우스 모델에서 종양형성을 생산하는 것으로 최근에 식별되었고, 따라서 고위험 발암 균주로 명명되어 있다(Kumar 등, 2018 및 Ahmad 등, 2021). 또한, Soroceanu 등은 10개의 HCMV 양성 교모세포종 종양에서 US28 유전자의 C-말단 부분을 서열분석하였다. 결과의 정렬(원본 간행물에 대해 NIHMS323374-supplement-1.pdf에 제시됨)은 이러한 균주가 모두 HCMV VHL/E 임상 단리물(L20501.1)과 유사할 것임을 보여주었다. 고위험 발암 균주 DB, BL 및 VHL/E는 모두 US28 유전자, 특히 N-말단 부분에서 상이한 돌연변이를 보여준다(표 3). N-말단 부분은 위치 E18D; A19E; F25L(VHL/E) 및 A19D, T21A, F25L(BL)에서 DB 균주와 상이하다. 따라서, 아미노산 위치 18, 19, 21 및 25는 모두 이러한 고위험 발암 균주에서 돌연변이며고; 다른 균주는 또한 위치 8 및/또는 15에 돌연변이가 있는 것으로 알려져 있다(표 3).
매우 가변적인 서열로 인해, 발명자는 US28 단백질(ECD1)의 N-말단 부분의 영역을 US28에 대해 매우 특이적이고 균주 불가지론적인 항체에 대한 부적절한 표적으로서 간주하였다.
대조적으로, 발명자는 US28의 ECD2 및 ECD3이 상이한 HCMV 균주 사이에 매우 보존되어 있음을 결정하였으며; ECD2는 임의의 알려진 돌연변이를 갖지 않는 반면, 많은 상이한 HCMV 균주로부터 ECD3의 알려진 서열에 대한 발명자의 분석은 단 하나의 알려진 돌연변이의 존재를 밝혀내었다. 알려진 고위험 발암 균주 중, DB 균주는 ECD3 N170N(US28 단백질의 위치 170이 ECD3의 위치 4에 상응하므로, 본원에서 "4N" 변이체 형태로도 언급됨)인 반면, BL 및 VHL/E 균주는 N170D(본원에서 "4D"로도 언급됨) 변이체를 나타낸다(표 3). 발명자는 US28 ECD4 DNA를 암호화하는 DNA 서열이 다중 다형성 부위를 함유하며, 그 중 단 하나가 보다 통상적인 아미노산 변화(R267K)를 야기함을 식별하였다. 참고로, 고위험 발암 BL 균주는 ECD4 변이체 V250L 및 R267K를 둘 다 함유한다(표 3).
놀랍게도, 본 연구는 ECD2 및 ECD4 단백질의 보존된 부분이 마우스에서 적절한 면역원이 아니었음을 입증하였지만, 출원인은 HCMV US28의 ECD3 영역에 대한 매우 특이적인 균주 불가지론적 결합 분자의 식별에 대한 신규 접근법을 개발할 수 있었다. 본 출원의 실시예에 보고된 바와 같이, 모노클로날 항체는 US28 과발현 US28-CHO-A1 세포, HCMV Ad169 감염된 MRC-5 세포, HCMV 혈청 양성 개체로부터의 1차 PBMC, HCMV 감염된 인간 폐 조직 및 여러 유형의 공격성 인간 종양, 예컨대 식도암, 위암, 직장암, 간암, 폐암, 췌장암, 자궁경부암, 악성 크롬친화세포종 및 국소 진행성 결장암, 유방암 및 그의 전이 및 교모세포종 등급 4에서 US28 ECD3 펩티드의 두 유전적 변이체에 특이적으로 잘 결합하는 것으로 보였다.
따라서, 출원인은 특히, 항체 및 키메라 항원 수용체('CAR')를 포함하나 이에 제한되지 않는 HCMV에 의해 암호화된 US28 단백질에 대한 매우 특이적이고 HCMV 균주 불가지론적인 결합 분자, 및 HCMV와 관련된 이의 용도, 예를 들어 진단적, 예방적 및 치료적 용도 및 방법을 제공하였다. 또한 상기 결합 분자를 생성하는 데 사용하기에 적합한 HCMV 백신 및 다른 제제를 제공하였다.
본 발명의 제1 측면은 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 US28 단백질의 세포외 도메인 3(ECD3) 내의 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는, 하나 이상의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 결합 분자를 제공하며, 여기서 US28 단백질의 ECD3은 서열번호: 5에 제시된 바와 같은 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)에 의해 암호화된 US28 단백질의 위치 167 내지 183에 상응하는 위치에서 US28 단백질에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 제1 측면에 따른 상기 결합 분자의 비제한적이지만 특히 바람직한 예는 아래에 추가로 논의된 바와 같은 항체 및 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함한다.
에피토프:
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자는 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 US28 단백질의 세포외 도메인 3(ECD3) 내의 에피토프에 대한 결합 특이성을 가지며, 여기서 US28 단백질의 ECD3은 서열번호: 5에 제시된 바와 같은 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)에 의해 암호화된 US28 단백질의 위치 167 내지 183에 상응하는 위치에서 US28 단백질에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 제1 측면의 결합 분자가 결합 특이성을 갖는 에피토프는 예를 들어, 바람직하게는 HCMV의 US28 단백질의 세포외 도메인 3(ECD3) 내에 완전히 존재할 수 있다.
에피토프는 예를 들어, US28 단백질의 ECD3 내의(바람직하게는 완전히 내의) 선형 에피토프일 수 있다. 대안적으로, 에피토프는 US28 단백질의 ECD3 내의(바람직하게는 완전히 내의) 불연속 및/또는 형태적 에피토프일 수 있다.
에피토프는 예를 들어, HCMV의 US28 단백질의 ECD3의 17개 이하의 아미노산을 포함하거나 이로 이루어질 수 있으며, 예를 들어 HCMV의 US28 단백질의 ECD3의 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3개 이하의 아미노산을 포함하거나 이로 이루어질 수 있으며, 임의적으로 US28의 ECD3에서 연속 아미노산일 수 있다.
서열번호: 5에 제시된 바와 같은 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)에 의해 암호화된 US28 단백질의 위치 167 내지 183에 상응하는 위치에서 US28 단백질에 제시된 아미노산 서열은 서열번호: 5의 해당 영역에서 발견된 서열과 반드시 동일한 것은 아닐 수 있는 데, 상이한 HCMV 균주 사이에 US28의 ECD3의 서열에 균주간 변이가 있을 수 있기 때문이다. 따라서, 이 맥락에서, 용어 "에 상응하는"은 임의의 관심 HCMV 균주에 의해 암호화된 US28 단백질의 상응하는 위치를 갖는 영역(즉, ECD3 영역으로도 언급되는 제2 세포외 루프)에서 발견된 아미노산을 지칭한다.
그러나, HCMV의 많은 상이한 임상 및 실험실 균주로부터의 US28 단백질의 서열 분석에 따라, 출원인은 HCMV-암호화된 US28의 ECD3 내에서 유일한 단일 다형성의 존재를 식별하였으며, 따라서 본원에서 4D-변이체 및 4N-변이체로서 언급되는 2개의 대안적인 ECD3 서열을 제시한다.
4D-변이체는 HCMV 균주의 제1 그룹에 의해 암호화된 바와 같은 US28의 ECD3에 존재하는 서열 변이를 지칭하고, 더 일반적인 형태인 것으로 보이며; BLAST 검색에 의해 식별된 바와 같은 상이한 HCMV 균주에 의해 암호화된 US28의 서열의 약 90%는 4D-변이체 서열을 나타낸다. 4D-변이체는 US28의 ECD3에서 TKKDNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 7; 밑줄 친 위치 4는 D임)의 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. US28의 4D-변이체를 갖는 제1 그룹의 예시적인 HCMV 균주는 Towne, VR1814, TB40/E, VHL/E, Merlin, JP, Ad169, AF1, BL 및 DAVIS 균주를 포함한다.
4N-변이체는 HCMV 균주의 제2 그룹에 의해 암호화된 바와 같은 US28의 ECD3에 존재하는 대체 서열 변이를 지칭하고, 덜 일반적인 형태인 것으로 보인다. 4D-변이체는 US28의 ECD3에서 TKKNNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 6; 밑줄 친 위치 4는 N임)의 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. US28의 4N-변이체를 갖는 제2 그룹의 예시적인 HCMV 균주는 Toledo, TR 및 DB 균주를 포함한다. US28의 ECD3에서 4N-변이체 서열을 보이는 HCMV의 이들 및 다른 균주는 표 1에 제시되어 있다.
본 발명의 제1 측면의 HMCV 균주 불가지론적 결합 분자와 같은 본 발명의 제1 측면의 결합 분자가 결합 특이성을 갖는 에피토프는 바람직하게는 서열 TKKNNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 6, US28의 ECD3의 4N 변이체에 상응) 및 TKKDNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 7, ECD3의 4D 변이체에 상응)의 서열 둘 다에 공통적이고 그 내에 존재하는 에피토프이다. 다르게 말하면, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자가 결합 특이성을 갖는 US28의 ECD3 내의 에피토프는 바람직하게는 서열번호: 6 및 7 각각의 4번째 아미노산 잔기를 제외하며, 이는 4N-변이체에서 N 및 4D-변이체에서 D에 상응한다.
선형 에피토프의 경우, 임의적으로, 4N- 및 4D-변이체 둘 다에 공통이고 그 내에 존재하고, 변이체 4번째 아미노산 잔기를 제외하는 에피토프는 서열 NQCMTDYDYLEVS의 13개 아미노산 모두, 또는 이의 임의의 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3개 이하의 아미노산을 포함할 수 있으며, 임의적으로 상기 서열의 연속 아미노산일 수 있다.
추가의 옵션에서, 에피토프가 US28 단백질의 ECD3 내의(바람직하게는 완전히 내의) 불연속 및/또는 형태적 에피토프이면, 불연속 에피토프는 TKKNNQCMTDYDYLEVS의 4N 변이체 ECD3 서열 및/또는 TKKDNQCMTDYDYLEVS의 4D 변이체 ECD3 서열의 17개 아미노산 중 임의의 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개를 포함할 수 있다.
ECD3 내의 선형, 불연속 또는 형태적 에피토프는 4N 변이체에서 TKKNNQCMTDYDYLEVS 및 4D 변이체에서 TKKDNQCMTDYDYLEVS에 상응하는 서열 내에서 1번째 내지 17번째 위치를 포함하는 US28의 ECD3의 아미노산 중 하나 이상을 제외할 수 있다.
하나의 바람직한 구현예에서, ECD3 내의 선형, 불연속 또는 형태적 에피토프는 바람직하게는 상이한 HCMV 균주 사이에서 달라지는 것으로 알려진 4번째 위치(N/D)를 제외한다.
추가로, 또는 대안적으로, US28의 ECD3의 아미노산 중 하나 이상은 본 발명의 제1 측면의 HMCV 균주 불가지론적 결합 분자와 같은 본 발명의 결합 분자에 의해 결합된 선형, 불연속 또는 형태적 에피토프에서 제외될 수 있다.
예를 들어, ECD3 내의 선형, 불연속 또는 형태적 에피토프는 추가로 또는 대안적으로 1번째 위치를 제외할 수 있다. ECD3 내의 선형, 불연속 또는 형태적 에피토프는 추가로 또는 대안적으로 2번째 위치를 제외할 수 있다. ECD3 내의 선형, 불연속 또는 형태적 에피토프는 추가로 또는 대안적으로 3번째 위치를 제외할 수 있다. ECD3 내의 선형, 불연속 또는 형태적 에피토프는 추가로 또는 대안적으로 5번째 위치를 제외할 수 있다. ECD3 내의 선형, 불연속 또는 형태적 에피토프는 추가로 또는 대안적으로 6번째 위치를 제외할 수 있다. ECD3 내의 선형, 불연속 또는 형태적 에피토프는 추가로 또는 대안적으로 7번째 위치를 제외할 수 있다. ECD3 내의 선형, 불연속 또는 형태적 에피토프는 추가로 또는 대안적으로 8번째 위치를 제외할 수 있다. ECD3 내의 선형, 불연속 또는 형태적 에피토프는 추가로 또는 대안적으로 9번째 위치를 제외할 수 있다. ECD3 내의 선형, 불연속 또는 형태적 에피토프는 추가로 또는 대안적으로 10번째 위치로 제외할 수 있다. ECD3 내의 선형, 불연속 또는 형태적 에피토프는 추가로 또는 대안적으로 11번째 위치를 제외할 수 있다. ECD3 내의 선형, 불연속 또는 형태적 에피토프는 추가로 또는 대안적으로 12번째 위치를 제외할 수 있다. ECD3 내의 선형, 불연속 또는 형태적 에피토프는 추가로 또는 대안적으로 13번째 위치를 제외할 수 있다. ECD3 내의 선형, 불연속 또는 형태적 에피토프는 추가로 또는 대안적으로 14번째 위치를 제외할 수 있다. ECD3 내의 선형, 불연속 또는 형태적 에피토프는 추가로 또는 대안적으로 15번째 위치를 제외할 수 있다. ECD3 내의 선형, 불연속 또는 형태적 에피토프는 추가로 또는 대안적으로 16번째 위치를 제외할 수 있다. ECD3 내의 선형, 불연속 또는 형태적 에피토프는 추가로 또는 대안적으로 17번째 위치를 제외할 수 있다.
본 발명의 제1 측면의 HMCV 균주 불가지론적 결합 분자와 같은 본 발명의 제1 측면의 결합 분자가 결합 특이성을 갖는 에피토프는 바람직하게는 HCMV의 알려진 임상 및/또는 실험실 균주의 90% 초과(적어도, 본 출원에 개시된 모든 HCMV 균주 포함), 예를 들어 HCMV의 임상 및/또는 실험실 균주의 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 실질적으로 100%(예를 들어, 90% 내지 100%, 91% 내지 100%, 92% 내지 100%, 93% 내지 100%, 95% 내지 100%, 96% 내지 100%, 97% 내지 100%, 98% 내지 100%, 99 내지 100%)(적어도, 본 출원에 개시된 모든 HCMV 균주 포함)에 공통이고 그 내에 존재하는 에피토프이다.
하나의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자가 결합 특이성을 갖는 에피토프 내의 아미노산은 본원에 기재된 바와 같은 US28-13-5G6-1D3, 13-1C10-1C10, 13-1H3-1A10, 13-1C10-1G9, 14-4E4-1E8 항체(본원에서 각각 "1D3", "1C10", "1A10", "1G9" 및 "1E8"로 통상적으로 약칭됨)(각각 서열번호: 12, 104, 122, 68 및 88에 의해 정의된 바와 같은 1D3, 1C10, 1A10, 1G9 및/또는 1E8의 VH 서열을 갖는 VH 폴리펩티드 서열, 및 각각 서열번호: 18, 108, 126, 72 및 92에 정의된 바와 같은 1D3, 1C10, 1A10, 1G9 및/또는 1E8의 VL 서열을 갖는 VL 폴리펩티드 서열을 포함하는 scFv도 포함됨) 중 임의의 하나 이상에 의해 결합된 ECD3 내의 에피토프에 아미노산을 포함하거나 이와 동일할 수 있거나, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산에 의해 상기 에피토프로부터 달라질 수 있다.
결합 특성:
본 출원의 실시예에 보고된 바와 같이, 본원에 기재된 방법을 사용함으로써 US28의 ECD3에 대한 다중 모노클로날 항체가 생성되었고, US28 ECD3 펩티드의 유전적 변이체 및 US28 과발현 US28-CHO-A1 세포 둘 다에 특이적으로 잘 결합하는 것으로 나타났고, 그로부터의 특정 예시적인 항체를 추가로 테스트하였으며 HCMV Ad169 감염된 MRC-5 세포, HCMV 혈청 양성 개체로부터의 1차 PBMC, HCMV 감염된 인간 폐 조직 및 여러 유형의 공격성 인간 종양, 예컨대 식도암, 위암, 직장암, 간암, 폐암, 췌장암, 자궁경부암, 악성 크롬친화세포종 및 국소 진행성 결장암, 유방암 및 그의 전이 및 교모세포종 등급 4에 대한 뛰어난 결합 특성을 제공하는 것으로 나타났다. 이러한 모노클로날 항체는 본 발명에 따른 결합 분자의 예시적인 구현예이다.
보다 구체적으로, 본원에 기재된 바와 같은 1D3, 1C10, 1A10, 1G9 및/또는 1E8 항체(각각 서열번호: 12, 104, 122, 68 및 88에 의해 정의된 바와 같은 1D3, 1C10, 1A10, 1G9 및/또는 1E8의 VH 서열을 갖는 VH 폴리펩티드 서열, 및 각각 서열번호: 18, 108, 126, 72 및 92에 정의된 바와 같은 1D3, 1C10, 1A10, 1G9 및 1E8의 VL 서열을 갖는 VL 폴리펩티드 서열을 포함하는 scFv도 포함됨)는 본 발명에 따른 바람직한 예시적인 결합 분자이지만, 다른 결합 분자가 생성되었고 본 발명의 제1 측면의 범위는 1D3, 1C10, 1A10, 1G9 및/또는 1E8에만, 그로부터 유래된 결합 분자(예컨대 1D3, 1C10, 1A10, 1G9 및/또는 1E8의 CDR을 공유하는 다른 결합 분자)에만 제한되지 않지만, 이들은 다양한 바람직한 구현예를 나타낼 수 있다. 그럼에도 불구하고, 1D3, 1C10, 1A10, 1G9 및/또는 1E8 항체(각각 서열번호: 12, 104, 122, 68 및 88에 의해 정의된 바와 같은 1D3, 1C10, 1A10, 1G9 및/또는 1E8의 VH 서열을 갖는 VH 폴리펩티드 서열, 및 각각 서열번호: 18, 108, 126, 72 및 92에 의해 정의된 바와 같은 1D3, 1C10, 1A10, 1G9 및/또는 1E8의 VL 서열을 갖는 VL 폴리펩티드 서열을 포함하는 scFv도 포함됨)는 본 발명의 제1 측면에 따른 다른 결합 분자의 결합 특성을 특성화하는 것에 대한 유용한 벤치마크를 제공할 수 있다.
예를 들어, US28 단백질의 세포외 도메인 3(ECD3) 내의 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자는 1D3, 1C10, 1A10, 1G4, 1G9 및/또는 1E8과 동일한 조건 하에 테스트될 때, 1D3, 1C10, 1A10, 1G4, 1G9 및/또는 1E8 중 임의의 하나, 또는 그 이상의 결합 특성과 유사하거나 실질적으로 동등한 결합 특성을 입증할 수 있다.
그러한 맥락에서, 본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자는 1D3, 1C10, 1A10, 1G4, 1G9 및/또는 1E8에 대해 유사하거나 실질적으로 동등한 결합 특이성, 유사하거나 실질적으로 동등한 균주 불가지론적 결합 특성, 및/또는 유사하거나 실질적으로 동등한 결합 친화성을 나타내는 경우, 각각 1D3, 1C10, 1A10, 1G4, 1G9 및/또는 1E8과 동일한 조건 하에 테스트될 때, 1D3, 1C10, 1A10, 1G4, 1G9 및/또는 1E8에 대한 "유사하거나 실질적으로 동등한 결합 특성"을 보유하는 것으로 간주될 수 있다. 이러한 테스트는 예를 들어, 1D3, 1C10, 1A10, 1G4, 1G9 및/또는 1E8의 결합 특성을 평가하기 위해 본 출원에 보고된 테스트 중 하나 이상, 예를 들어, US28 과발현 US28-CHO-A1 세포, HCMV Ad169 감염된 MRC-5 세포, HCMV 혈청 양성 개체로부터의 1차 PBMC, HCMV 감염된 인간 폐 조직 및 여러 유형의 공격성 인간 종양, 예컨대 식도암, 위암, 직장암, 간암, 폐암, 췌장암, 자궁경부암, 악성 크롬친화세포종 및 국소 진행성 결장암, 유방암 및 그의 전이 및 교모세포종 등급 4에서 US28 ECD3 펩티드에 대한 결합을 결정하기 위해 수행된 테스트 중 임의의 하나 이상에 상응할 수 있다.
본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자는 US28 ECD3 펩티드(음성 대조군, 예컨대 BSA와 비교하여), US28-발현 세포(US28을 발현하지 않는 동등한 세포와 비교하여), HCMV 감염된 세포(HCMV 감염이 없는 동등한 세포와 비교하여), HCMV 혈청 양성 개체로부터의 1차 PBMC(HCMV 혈청 음성 개체로부터의 1차 PBMC와 비교하여), HCMV 감염된 인간 폐 조직(HCMV 감염되지 않은 인간 폐 조직과 비교하여) 및/또는 HCMV-감염된 인간 종양 유형, 특히 공격성 종양, 예컨대 식도암, 위암, 직장암, 간암, 폐암, 췌장암, 자궁경부암, 악성 크롬친화세포종 및 국소 진행성 결장암, 유방암 및 그의 전이 및 교모세포종 등급 4(HCMV로 감염되지 않은 동등한 비암성 세포와 비교하여)에 특이적으로 결합하는 능력을 결정하기 위한 임의의 하나 이상의 테스트 하에, 결합 분자가 참조 결합 분자(예를 들어 1D3, 1C10, 1A10, 1G4 및/또는 1E8 중 임의의 것)의 결합 특이성의 적어도 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 또는 실질적으로 100%를 나타내는 경우, 본 발명의 참조 결합 분자, 예를 들어 1D3, 1C10, 1A10, 1G4 및/또는 1E8 중 임의의 하나 이상에 대한 유사하거나 실질적으로 동등한 결합 특이성을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 본 발명의 제1 측면에 따른 특정 결합 분자는 전술한 테스트 중 임의의 하나 이상 하에, 참조 결합 분자(예를 들어 1D3, 1C10, 1A10, 1G4 및/또는 1E8 중 임의의 하나 이상)의 결합 특이성보다 낮긴 하지만 참조 결합 분자(예를 들어 1D3, 1C10, 1A10, 1G4 및/또는 1E8 중 임의의 하나 이상)의 결합 특이성에 대한 유사하거나 실질적으로 동등한 결합 특이성을 가질 수 있는 반면; 본 발명의 제1 측면에 따른 특정 다른 결합 분자는 전술한 테스트 중 임의의 하나 이상 하에 참조 결합 분자(예를 들어 1D3, 1C10, 1A10, 1G4 및/또는 1E8 중 임의의 하나 이상)보다 높은 결합 특이성을 가질 수 있다.
본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자는 각각 4D- 및 4N-변이체 US28 ECD3 펩티드(각각 음성 대조군, 예컨대 BSA와 비교하여), 각각 4D- 및 4N-변이체 US28-발현 세포(각각 US28을 발현하지 않는 동등한 세포와 비교하여; 임의적으로 여기서 US28의 각각 4D- 및 4N-변이체는 HCMV의 균주 TB40/E 및 DB에 의해 암호화된 US28 서열이고/이거나, 추가로 임의적으로 여기서 세포는 CHO 세포임), 각각 4D- 및 4N-변이체 US28-암호화 HCMV 균주 감염된 세포(각각 HCMV 감염이 없는 동등한 세포와 비교하여), 각각 4D- 및 4N-변이체 US28-암호화 HCMV 균주 혈청 양성 개체 각각으로부터의 1차 PBMC (HCMV 혈청 음성 개체로부터의 1차 PBMC와 비교하여), 각각 4D- 및 4N-변이체 US28-암호화 HCMV 균주 감염된 인간 폐 조직(HCMV 감염되지 않은 인간 폐 조직과 비교하여) 및/또는 HCMV-감염된 인간 종양, 특히 공격성 종양, 예컨대 식도암, 위암, 직장암, 간암, 폐암, 췌장암, 자궁경부암, 악성 크롬친화세포종 및 국소 진행성 결장암, 유방암 및 그의 전이 및 교모세포종 등급 4의 각각 4D- 및 4N-변이체 US28-암호화 HCMV 균주 유형(HCMV로 감염되지 않은 동등한 비암성 세포와 비교하여)에 특이적으로 결합하는 능력을 결정하기 위한 임의의 하나 이상의 테스트 하에, 결합 분자가 참조 결합 분자(예를 들어 1D3, 1C10, 1A10, 1G4, 1G9 및/또는 1E8 중 임의의 하나 이상)에 의해 제시된 결합의 동등성과 유사하거나 실질적으로 동일한(예를 들어 ± 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% 이하) 4D- 및 4N-변이체에 대한 결합의 동등성을 나타내는 경우, 참조 결합 분자(예를 들어 1D3, 1C10, 1A10, 1G4, 1G9 및/또는 1E8 중 임의의 하나 이상)에 대한 유사하거나 실질적으로 동등한 균주 불가지론적 결합 특성을 갖는 것으로 간주될 수 있다.
본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자는 US28(US28을 발현하도록 조작된 동등한 세포와 비교하여), HCMV 비감염된 세포(HCMV 감염된 동등한 세포와 비교하여), HCMV 혈청 음성 개체로부터의 1차 PBMC(HCMV 혈청 양성 개체로부터의 1차 PBMC와 비교하여), HCMV 비감염된 인간 폐 조직(HCMV 감염된 인간 폐 조직과 비교하여) 및/또는 HCMV 비감염된 인간 종양 유형(HCMV로 감염된 동등한 암성 세포, 특히 공격성 종양, 예컨대 식도암, 위암, 직장암, 간암, 폐암, 췌장암, 자궁경부암, 악성 크롬친화세포종 및 국소 진행성 결장암, 유방암 및 그의 전이 및 교모세포종 등급 4와 비교하여)을 발현하지 않는 세포에 대한 배경 결합을 결정하기 위한 임의의 하나 이상의 테스트 하에, 배경 결합 분자가 1D3, 1C10, 1A10, 1G4, 1G9 및/또는 1E8의 배경 결합의 적어도 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 또는 실질적으로 100%를 나타내는 경우, 1D3, 1C10, 1A10, 1G4, 1G9 및/또는 1E8에 대한 유사하거나 실질적으로 동등한 배경 결합을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 본 발명의 제1 측면에 따른 특정 결합 분자는 전술한 테스트 중 임의의 하나 이상 하에 1D3, 1C10, 1A10, 1G4, 1G9 및/또는 1E8의 배경 결합보다 높긴 하지만 1D3, 1C10, 1A10, 1G4, 1G9 및/또는 1E8의 배경 결합에 대한 유사하거나 실질적으로 동등한 배경 결합을 가질 수 있는 반면; 본 발명의 제1 측면에 따른 특정 다른 결합 분자는 전술한 테스트 중 임의의 하나 이상 하에 1D3, 1C10, 1A10, 1G4, 1G9 및/또는 1E8보다 낮은 결합 특이성을 가질 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 본 발명의 제1 측면에 따른 특정 결합 분자는 전술한 테스트 중 임의의 하나 이상 하에, VUN100(1가 VUN100 및/또는 2가 VUN100)의 배경 결합과 비교하여 낮은 배경 결합(예를 들어 95, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 1% 미만, 또는 1% 미만)을 가질 수 있다.
본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자는 US28 ECD3 펩티드, US28-발현 세포, HCMV 감염된 세포, HCMV 혈청 양성 개체로부터의 1차 PBMC, HCMV 감염된 인간 폐 조직 및/또는 HCMV -감염된 인간 종양 유형, 특히 공격성 종양, 예컨대 식도암, 위암, 직장암, 간암, 폐암, 췌장암, 자궁경부암, 악성 크롬친화세포종 및 국소 진행성 결장암, 유방암 및 그의 전이 및 교모세포종 등급 4에 대한 결합 친화성을 결정하기 위한 임의의 하나 이상의 테스트 하에, 결합 분자가 Kd로 표현될 때 참조 결합 분자(예를 들어 1D3, 1C10, 1A10, 1G4, 1G9 및/또는 1E8 중 임의의 하나 이상)의 결합 친화성의 예를 들어, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 자릿수 이내인 결합 친화성을 나타내는 경우, 참조 결합 분자(예를 들어 1D3, 1C10, 1A10, 1G4, 1G9 및/또는 1E8 중 임의의 하나 이상)에 대해 실질적으로 동등한 결합 친화성(예를 들어 ± 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% 이하)을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 본 발명의 제1 측면에 따른 특정 결합 분자는 전술한 테스트 중 임의의 하나 이상 하에 참조 결합 분자(예를 들어 1D3, 1C10, 1A10, 1G4, 1G9 및/또는 1E8 중 임의의 하나 이상)보다 낮은 결합 친화성을 가질 수 있는 반면; 본 발명의 제1 측면에 따른 특정 다른 결합 분자는 전술한 테스트 중 임의의 하나 이상 하에 참조 결합 분자(예를 들어 1D3, 1C10, 1A10, 1G4, 1G9 및/또는 1E8 중 임의의 하나 이상)보다 높은 결합 친화성을 가질 수 있다. 예를 특히 높은 결합 친화성이 덜 바람직할 수 있는 CAR의 맥락에서 높은 결합 친화성이 반드시 항상 바람직한 것은 아니며, 높은 결합 특이성을 갖는 CAR이 일반적으로 높은 결합 친화성을 갖는 CAR보다 더 큰 치료적 이익을 야기한다는 점에 주목한다.
본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자는 전술한 특성 중 임의의 하나 이상을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 예를 들어, 결합 분자는 하기 특성 중 하나 이상(각각은 위에 보다 상세하게 기재되어 있음)을 갖는 것으로 간주될 수 있다:
1. 1D3, 1C10, 1A10, 1G4, 1G9 및/또는 1E8에 대한 유사하거나 실질적으로 동등한 결합 특이성;
2. 1D3, 1C10, 1A10, 1G4, 1G9 및/또는 1E8에 대한 유사하거나 실질적으로 동등한 균주 불가지론적 결합 특성;
3. 1D3, 1C10, 1A10, 1G4, 1G9 및/또는 1E8에 대한 유사하거나 실질적으로 동등한 배경 결합;
4. VUN100(1가 VUN100 및/또는 2가 VUN100)의 배경 결합보다 낮은 배경 결합; 및/또는
5. 1D3, 1C10, 1A10, 1G4, 1G9 및/또는 1E8에 대한 실질적으로 동등한 결합 친화성.
예를 들어, 결합 분자는 (i) 1D3, 1C10, 1A10, 1G4, 1G9 및/또는 1E8에 대한 유사하거나 실질적으로 동등한 균주 불가지론적 결합 특성; 및 (ii) 1D3, 1C10, 1A10, 1G4, 1G9 및/또는 1E8에 대한 유사하거나 실질적으로 동등한 배경 결합을 가질 수 있다. 다른 구현예에서, 결합 분자는 (i) 1D3, 1C10, 1A10, 1G4, 1G9 및/또는 1E8에 대한 유사하거나 실질적으로 동등한 균주 불가지론적 결합 특성; 및 (ii) VUN100(1가 VUN100 및/또는 2가 VUN100)의 배경 결합에 대한 낮은 배경 결합을 가질 수 있다. 다른 구현예에서, 결합 분자는 (i) 1D3, 1C10, 1A10, 1G4, 1G9 및/또는 1E8에 대한 유사하거나 실질적으로 동등한 균주 불가지론적 결합 특성; (ii) 1D3, 1C10, 1A10, 1G4, 1G9 및/또는 1E8에 대한 유사하거나 실질적으로 동등한 배경 결합; 및 (iii) VUN100(1가 VUN100 및/또는 2가 VUN100)의 배경 결합에 대한 낮은 배경 결합을 가질 수 있다. 다른 구현예에서, 결합 분자는 (i) 1D3, 1C10, 1A10, 1G4, 1G9 및/또는 1E8에 대한 유사하거나 실질적으로 동등한 균주 불가지론적 결합 특성; (ii) 1D3, 1C10, 1A10, 1G4, 1G9 및/또는 1E8에 대한 유사하거나 실질적으로 동등한 배경 결합; (iii) VUN100(1가 VUN100 및/또는 2가 VUN100)의 배경 결합에 대한 낮은 배경 결합; 및 (iv) 1D3, 1C10, 1A10, 1G4, 1G9 및/또는 1E8에 대한 유사하거나 실질적으로 동등한 결합 특이성을 가질 수 있다.
본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자의 결합 특성을 특성화하기 위한 추가의 임의적 겸정은 하기에 논의되어 있다.
(a) 검정 1:
본 출원의 도 5에 제시된 바와 같이, 본 발명에 따른 예시적인 결합 분자인 US28의 ECD3으로부터 유래된 펩티드 서열에 대해 생성된 모노클로날 항체 1D3은 음성 대조군 BSA와 비교하여, US28의 ECD3으로부터 유래된 펩티드 서열에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한다.
그러한 검정에 사용되는 펩티드 서열은 서열 TKKNNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 6, ECD3의 4N 변이체에 상응)를 갖는 펩티드-1 및 TKKDNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 7, ECD3의 4D 변이체에 상응)의 서열을 갖는 펩티드-2로 지정하였다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 1D3 항체는 BSA 대조군과 비교하여 각각의 펩티드 1 및 2에 대한 대략 27 내지 28-배 더 특이적 결합을 나타내고; 둘 다 절대 수준으로서 그리고 각각의 BSA 대조군에 대해 정규화될 때 펩티드 1 및 2에 대해 1D3의 관찰된 결합 수준은 본질적으로 동일하다(예를 들어 5% 미만의 차이, 및 실험 오차 영역 내에서 가능). 이러한 결과는 1D3이 US28의 ECD3에 대해 특이적이고, 또한 균주 불가지론적임을 분명히 보여준다.
대조적으로, WO 2019/151865의 VUN100의 결합 특성(본 출원의 서열번호: 60의 서열을 가짐)은 매우 상이하다. 상이한 HCMV 균주 사이에 높은 수준의 서열 변이를 보유하는 US28의 영역인 US28의 N-말단 영역에서 에피토프에 결합하는 것으로 보고되어 있다. VUN100은 상대적으로 낮은 수준의 결합 특이성을 갖는 것으로 나타났으며; De Groof 등, 2019(상기)의 지원 정보, 이의 도 S1.A, 및 본 출원의 표 2에 의해 4의 특이성 점수가 보고되었다. 또한, VUN100은 HCMV의 VHL/E, Merlin 및 TB40/E 균주 사이의 결합에서 상당한 차이를 나타내며, 결합은 Merlin 균주에 대해 관찰된 결합 수준의 약 절반 정도로 균주 TB40/E(B1 유형)에서 특히 감소되었다(WO 2019/151865의 도 8d). VUN100의 추가의 특성은 De Groof 등, 2020(doi: https://doi.org/10.1101/2020.05.12.071860)에 의해 온라인에서 이용가능한 미리 인쇄된 기사에 보고되어 있으며, 여기서 보충 데이터의 도 2는 4명의 상이한 HCMV 혈청 양성 공여자로부터의 VUN100에 의해 결합된 유도된 HCMV IE-양성 CD14+ 단핵구의 % 결과를 제공하며, 여기서 각 공여자 내에서 HCMV의 균주(들)는 결정되지 않았다. 이들 세포에 대한 VUN100 결합에 의해 유도된 IE 양성 수준은 상이한 공여자 사이에서 최대 14-배까지 달라졌다. 이것은 VUN100의 결합 능력이 HCMV의 상이한 균주로 감염된 세포 사이에서 상당히 달라진다는 추가 표시로서 볼 수 있다. 본 발명의 결합 분자와 비교하여 VUN100의 이러한 불리한 특성은 특히 도 21a-e, 도 22 및 도 23을 참조하여 본 출원의 실시예에서 추가로 입증된다.
따라서, 하나의 구현예에서, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자는 1D3인 참조 항체가 동일한 음성 대조군과 비교하여 펩티드 1 및/또는 펩티드 2(바람직하게는 둘 다)에 대한 더 큰 결합을 나타내는 조건 하에 결합 검정에서 음성 대조군(예컨대 BSA)과 비교하여 펩티드 1 및/또는 펩티드 2(바람직하게는 둘 다)에 대한 더 큰 결합을 나타내는 경우 HCMV의 US28 단백질의 ECD3 내의 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 참조 결합 분자는 1C10, 1A10, 1G4, 1G9 및/또는 1E8로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자는 전술한 검정에서 펩티드 1 및 2 각각에 대한 결합 분자의 관찰된 각각의 결합 수준이, 절대 수준으로서 및/또는 각각의 음성 대조군(예컨대 BSA) 대조군에 대해 관찰된 결합 수준에 대해 정규화될 때, 서로의 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하 이내와 같이 본질적으로 동일한 경우, ECD3에 대한 균주 불가지론적 결합을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
US28 단백질의 ECD3 내의 에피토프에 대한 결합 분자의 결합 특이성은 예를 들어, 본 출원의 실시예에 기재된 바와 같은 방법론, 또는 상기 방법론의 변형, 예컨대 마이크로타이터 플레이트의 제1 웰 세트에서 ECD3으로부터 유래된 코팅 펩티드(예컨대 Bio-펩티드 1 및/또는 Bio-펩티드-2) 및 마이크로타이터 플레이트의 제2 웰 세트에서 음성 대조군(예컨대 BSA)의 코팅에 의해 ELISA에서 평가될 수 있다. 제1 웰 세트는 임의적으로 US28의 ECD3으로부터의 4N-변이체의 서열을 포함하는 제1 웰 세트의 제1 하위그룹, 및 US28의 ECD3으로부터의 4D-변이체의 서열을 포함하는 제1 웰 세트의 제2 하위그룹으로 추가로 세분하여 각 변이체에 대한 상대적 결합 특이성의 결정을 허용할 수 있다. 제1 및 제2 웰 세트의 코팅 후, 관심 결합 분자는 임의적으로 각각의 제1 및 제2 웰 세트에서 양성 대조군(예를 들어 1D3, 1C10, 1A10, 1G4, 1G9 및/또는 1E8 중 임의의 하나 이상)의 추가 테스터와 함께, 제1 및 제2 웰 세트 각각에서 인큐베이션할 수 있다. 인큐베이션 후, 웰을 세척한 다음, 효소 접합 2차 항체와 함께 인큐베이션할 수 있다. 추가 세척 후, 결합 분자 및 대조군에 대한 결합량과 상관관계가 있는 측정가능한 반응(예를 들어 색상 변화, 흡광도)을 겪는 접합된 효소에 대한 기질을 첨가할 수 있으며, 이는 결합 특이성 및/또는 균주 불가지론적 결합 특성의 표시를 제공한다. 따라서, 일부 구현예에서, 관심 결합 분자는 음성 대조군(예컨대 BSA)에 대한 결합과 비교하여, 제1 웰 세트에서 ECD3으로부터 유래된 펩티드 1 및/또는 2 중 하나 이상(바람직하게는 둘 다)에 대한 양성 결합을 나타내는 ELISA 후 절대 값을 갖는다.
"양성 결합"이란 관심 결합 분자가 음성 대조군(예를 들어 BSA)에 대한 결합 수준과 비교하여 펩티드 1 및/또는 2 중 하나 이상(바람직하게는 둘 다)에 대한 더 높은 결합 수준을 가질 수 있음을 포함하며, 이는 더 높은 결합 특이성을 나타낸다.
예를 들어, 항체 1D3이 음성 대조군 예컨대 BSA와 비교하여 펩티드 1 및/또는 펩티드 2에 대한 약 27 내지 28-배 더 큰 결합을 나타내는 조건 하에 음성 대조군 예컨대 BSA와 비교하여 펩티드 1 및/또는 펩티드 2에 대한 적어도 약 2-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 약 26-배, 약 27-배, 또는 약 28-배 더 큰 결합을 나타낼 수 있다. 이러한 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 "약"은 명시된 값의 ± 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%인 값을 포함할 수 있다(예를 들어, 적어도 약 10-배의 ± 10%는 9-배 내지 11-배 범위를 지칭함). 예를 들어, 이러한 검정을 위한 조건은 도 5에 제시된 결과를 생성하는 데 사용된 검정에서 사용된 조건과 동일하거나 동등하도록 선택될 수 있다.
대안적으로, 또는 추가로, "양성 결합"은 관심 결합 분자가 양성 대조군(예를 들어 1D3, 1C10, 1A10, 1G4, 1G9 및/또는 1E8)과 비교하여 유사하거나(예를 들어 적어도 ± 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 이하), 더 높은/증가된/향상된/개선된 흡광도 수준을 포함할 수 있다.
(b) 검정 2:
추가의 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 예를 들어 유세포 분석법 검정에 의해 측정된 바와 같이 예를 들어, 1:50(w/v) 희석에서 US28-음성 세포(예컨대 야생형 CHO 세포)의 결합과 비교하여 US28-발현 세포(예컨대 US28을 발현하도록 조작된 CHO 세포)에 우선적으로 결합하는 것이 바람직하다. US28-발현 세포는 바람직하게는 US28 단백질의 세포 표면 발현을 나타내는 것을 특징으로 하는 세포이다. US28의 표면 발현은 전형적으로 세포 표면에서 US28의 세포외 도메인(서열번호: 5의 서열, 또는 다른 HCMV 균주의 동등한 서열에 의해 정의된 바와 같은 HCMV 균주 DB에 의해 암호화된 US28 단백질의 위치 1-37, 위치 91-101, 위치 167-183 및 위치 250-273에 각각 상응하는 ECD 1, 2, 3 및 4)을 나타내는 것을 특징으로 한다.
본 출원의 도 4, 7 및 표 2는 본 발명에 따른 예시적인 결합 분자인 US28의 ECD3에 대해 생성된 모노클로날 항체 1D3이 사용되는 결합 조건 하에 약 15 내지 21.5의 특이성 점수를 갖는 US28-음성 대조군 CHO 세포와 비교하여 US28-발현 중국 햄스터 난소(CHO-US28-A1) 세포에 특이적으로 결합하는 능력을 보유함을 입증한다. 이것은 임의의 적합한 기술을 사용하여, 예를 들어 FACS 분석을 사용하여 평가되어 결합된 총 세포 카운트의 백분율을 결정할 수 있다. 본 출원의 실시예 1에 추가로 보고된 바와 같이, 특히 표 2를 참조하여, 클론 US28-13-5G6-1D3(항체 1D3 암호화)이 가장 완전히 특성화되었지만, US28의 ECD3에 대해 생성된 다른 클로닝된 모노클로날 항체는 US28-음성 대조군 CHO 세포에 대한 그들의 결합과 비교할 때, CHO-US28-A1 세포에 대한 뛰어난 결합 특이성을 나타내었다. 실시예 2에 추가로 보고된 바와 같이, US28의 ECD3에 대해 생성된 추가의 또 다른 클로닝된 모노클로날 항체는 US28-음성 대조군 CHO 세포에 대한 결합과 비교할 때, CHO-US28-A1 세포에 대한 뛰어난 결합 특이성을 나타내었으며, 특히 매우 낮은 표적외 결합을 가지며(예를 들어 VUN100에 의해 입증된 훨씬 더 높은 표적외 결합 수준과 비교하여) 수많은 경우에 또한 US28-음성 대조군 CHO 세포에 대한 결합과 비교할 때, CHO-US28-A1 세포에 대한 더 높은 결합 특이성을 나타낸다.
이러한 데이터는 본 출원의 교시에 따라, US28-음성 세포(예컨대 US28-음성 CHO 세포)에 대한 결합과 비교하여 US28-발현 세포(예컨대 CHO 세포)에 대한 매우 특이적인 결합을 바람직하게는 VUN100에 의해 공유되지 않은 일련의 특성인 낮은 표적외 결합 수준으로 제공할 수 있는 US28의 ECD3에 대해 생성된 항체의 생성에 대한 일관된 경로를 제공함을 분명히 입증한다.
대조적으로, WO 2019/151865의 VUN100의 결합 특성(본 출원의 서열번호: 60의 서열을 가짐)은 매우 상이하다. 상이한 HCMV 균주 사이에 높은 수준의 서열 변이를 보유하는 US28의 영역인 US28의 N-말단 영역에서 에피토프에 결합하는 것으로 보고되어 있다. VUN100은 상대적으로 낮은 수준의 결합 특이성을 갖는 것으로 나타났다: US28-발현 HEK293T 막(HEK+US28) 또는 mock 형질감염된 HEK293T 막에 대한 결합에 대해 테스트될 때 De Groof 등, 2019(상기)의 지원 정보, 이의 도 S1.A(및 본 출원의 표 2에 요약됨)에 의해 4의 특이성 점수가 보고되었다. VUN100은 분명히 US28에 대한 매우 특이적인 결합을 제공할 수 없다. 본 발명의 결합 분자과 비교하여 VUN100의 이러한 불리한 특성은 특히 도 21a-e, 도 22 및 도 23을 참조하여 본 출원의 실시예에서 추가로 입증되어 있다.
따라서, 하나의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자는 US28-음성 세포(예컨대 CHO 세포)와 비교하여 US28-발현 세포(예컨대 CHO-US28-A1 세포, 임의적으로 여기서 US28 서열은 HCMV의 균주 DB 또는 TB40/E에 의해 암호화된 서열에 상응함)에 대한 결합 특이성이 VUN100에 의해 달성된 특이성 수준보다 더 크다는 점을 특징으로 하는 특이적 결합을 나타낼 것이다. 예를 들어, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자의 특이성 수준은 동일한 검정에서 VUN100에 의해 달성된 특이성 수준보다 동일한 몰 농도에서 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 80%, 약 90%, 약 100%(즉 약 2-배), 약 150%, 약 200%(즉 약 3-배), 약 300%(즉 약 4-배), 약 400%(즉 약 5-배) 또는 약 500%(즉 약 6-배)만큼 더 클 수 있다. 이러한 맥락에서, VUN100 비교자는 서열번호: 60-64의 서열 중 임의의 하나 이상의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. 서열번호: 61 및 63의 맥락에서, 이것은 신호 표시된 펩티드 서열이 있거나 없는 단백질을 포함할 수 있다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자는 US28-음성 세포(예컨대 CHO 세포)와 비교하여 US28-발현 세포(예컨대 CHO-US28-A1 세포, 임의적으로 여기서 US28 서열은 HCMV의 균주 DB 또는 TB40/E에 의해 암호화된 서열에 상응함)에 대한 결합 특이성이 동일한 몰 농도로 동일한 검정에서 1D3, 1C10, 1A10, 1G4 및/또는 1E8 중 임의의 하나 이상과 적어도 약 동일한 수준의 특이성이라는 점을 특징으로 하는 특이적 결합을 나타낼 것이다. 이러한 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 "약"은 동일한 몰 농도로 동일한 검정에서 1D3, 1C10, 1A10, 1G4 및/또는 1E8 중 임의의 하나 이상의 특이성 수준의 ± 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%인 값을 포함할 수 있다.
이러한 맥락에서, 1D3, 1C10, 1A10 및/또는 1E8 비교자(들)는 다음을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 항체 분자를 지칭할 수 있다:
서열번호: 20에 의해 정의된 바와 같은 1D3의 중쇄 폴리펩티드 서열(표시된 N-말단 리더 서열의 제거 후) 및 서열번호: 21에 의해 정의된 바와 같은 1D3의 경쇄 폴리펩티드 서열(표시된 N-말단 리더 서열의 제거 후);
서열번호: 157에 의해 정의된 바와 같은 1C10의 중쇄 폴리펩티드 서열(표시된 N-말단 리더 서열의 제거 후) 및 서열번호: 158에 의해 정의된 바와 같은 1C10의 경쇄 폴리펩티드 서열(표시된 N-말단 리더 서열의 제거 후);
서열번호: 161에 의해 정의된 바와 같은 1A10의 중쇄 폴리펩티드 서열(표시된 N-말단 리더 서열의 제거 후) 및 서열번호: 162에 의해 정의된 바와 같은 1A10의 경쇄 폴리펩티드 서열(표시된 N-말단 리더 서열의 제거 후); 또는
서열번호: 153에 의해 정의된 바와 같은 1E8의 중쇄 폴리펩티드 서열(표시된 N-말단 리더 서열의 제거 후) 및 서열번호: 154에 의해 정의된 바와 같은 1E8의 경쇄 폴리펩티드 서열(표시된 N-말단 리더 서열의 제거 후).
이러한 검정은 예를 들어 유세포 분석법 검정에 의해 결정된 바와 같이, 예를 들어, 1D3, 1C10, 1A10 및/또는 1E8의 1:50(w/v) 희석과 동등한 몰비로 예를 들어, US28-발현 세포(예컨대 CHO-US28-A1 세포, 임의적으로 여기서 US28 서열은 HCMV의 균주 DB 또는 TB40/E에 의해 암호화된 서열에 상응함) 및 US28-음성 세포(예컨대 CHO 세포)에 대한 상대적 결합을 결정하기 위해 수행될 수 있다.
(c) 검정 3:
추가의 구현예에서, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자가 HCMV 감염이 없는 동등한 세포의 결합과 비교하여 HCMV-감염된 세포(예컨대 MRC-5 세포; cat#CCL-171, RRID: CVCL_0440, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC), 미국 20110 버지니아주 머내서스)에 우선적으로 결합할 수 있는 것이 바람직하다. 본 출원의 도 8에 제시된 바와 같이, 본 발명에 따른 예시적인 결합 분자인 US28의 ECD3에 대해 생성된 모노클로날 항체 1D3은 유세포 분석법 분석을 사용함으로써 분석될 때, 비감염된(mock) 세포가 아닌 HCMV-감염된 MRC-5 세포에 결합하는 능력을 보유한다. 사용된 검정 조건 하에, 1D3은 비감염된(mock) 세포에 대한 0% 결합과 비교하여 HCMV-감염된 세포에 대한 약 5.4% 결합을 보였다. 도 9에 제시된 바와 같은 추가 테스트는 1D3이 비감염된 세포와 비교하여 HCMV 감염된 MRC-5 세포의 표면에 특이적으로(대략 16-배 더 큰 특이성으로) 결합하는 것으로 나타났다.
따라서, 추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자는 HCMV 감염이 없는 동등한 세포의 결합과 비교하여, 5-배, 약 6-배, 약 7-배, 약 8-배, 약 9-배, 약 10-배, 약 11-배, 약 12-배, 약 13-배, 약 14-배, 약 15-배 또는 약 16-배 더 크거나, 적어도 5-배, 약 6-배, 약 7-배, 약 8-배, 약 9-배, 약 10-배, 약 11-배, 약 12-배, 약 13-배, 약 14-배, 약 15-배 또는 약 16-배 더 큰 HCMV-감염된 세포(예컨대 MRC-5 세포)에 대한 우선적 결합을 나타낼 것이다. 이러한 검정은 예를 들어, 본 출원의 도 8 또는 9에 제시된 결과를 생성하는 데 사용되는 프로토콜, 또는 동등한 프로토콜에 따라 수행될 수 있다. 이러한 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 "약"은 명시된 값의 ± 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%인 값을 포함할 수 있다.
추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자는 VUN100에 의해 달성된 우선적 결합 수준보다 더 큰 HCMV 감염이 없는 동등한 세포의 결합과 비교하여 HCMV-감염된 세포(예컨대 MRC-5 세포)에 대한 우선적 결합을 나타낼 것이다. 예를 들어, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자의 우선적 결합 수준은 동일한 검정에서 VUN100에 의해 달성된 우선적 결합 수준보다 동일한 몰 농도에서 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 80%, 약 90%, 약 100%(즉 약 2-배), 약 150%, 약 200%(즉 약 3-배), 약 300%(즉 약 4-배), 약 400%(즉 약 5-배) 또는 약 500%(즉 약 6-배)만큼 더 클 수 있다. 이러한 맥락에서, VUN100 비교자는 서열번호: 60-64의 서열 중 임의의 하나 이상의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. 서열번호: 61 및 63의 맥락에서, 이것은 표시된 신호 펩티드 서열이 있거나 없는 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명의 제1 측면의 결합 분자는 예를 들어, 동일한 조건 하에 본 발명의 참조 항체(예를 들어 1D3, 1C10, 1A10, 1G4, 1G9 및/또는 1E8 중 임의의 하나 이상)의 우선적 결합 활성의 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 실질적으로 100%이거나, 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 실질적으로 100%인 HCMV 감염이 없는 동등한 세포의 결합과 비교하여 HCMV-감염된 세포에 대한 우선적 결합을 나타낼 수 있다. 이러한 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 "약"은 명시된 값의 ± 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%인 값을 포함할 수 있다(예를 들어, 10%의 ± 50%는 5% 내지 15% 범위를 지칭함). 예를 들어, 이러한 검정을 위한 조건은 도 8 또는 9에 제시된 결과를 생성하는 데 사용된 검정에서 사용된 조건과 동일하거나 동등하도록 선택될 수 있다.
폴리펩티드
본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자는 하나 이상의 폴리펩티드 쇄를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
"폴리펩티드"는 본원에서 2개 이상의 하위단위 아미노산, 아미노산 유사체, 또는 다른 펩티드 모방체(peptidomimetic)의 화합물을 지칭하는 가장 넓은 의미로 사용된다. 따라서 용어 "폴리펩티드"는 짧은 펩티드 서열 및 또한 긴 폴리펩티드 및 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "아미노산"은 표준 20개의 유전적으로 암호화된 아미노산 및 그들의 'D' 형태의 상응하는 입체이성질체(천연 'L' 형태와 비교), 오메가-아미노산 다른 자연 발생 아미노산, 비통상적인 아미노산(예를 들어 α,α-이치환된 아미노산, N-알킬 아미노산 등) 및 화학적으로 유도체화된 아미노산(하기 참조)을 포함한다.
본원에서 아미노산은 전체 이름, 3글자 코드 또는 1글자 코드로 언급될 수 있다. 아미노산이 "알라닌" 또는 "Ala" 또는 "A"와 같이 구체적으로 열거되는 경우, 용어는 달리 명시적으로 언급되지 않는 한 L-알라닌 및 D-알라닌을 둘 다 지칭한다. 다른 비통상적인 아미노산은 또한 원하는 기능적 특성이 폴리펩티드에 의해 유지며는 한, 본 발명의 폴리펩티드에 적합한 구성요소일 수 있다. 제시된 펩티드의 경우, 각각의 암호화된 아미노산 잔기는 적절한 경우 통상적인 아미노산의 관용명에 상응하는 1글자 명칭으로 나타낸다.
하나의 구현예에서, 본원에 정의된 바와 같은 폴리펩티드는 L-아미노산을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 발명 및/또는 본 발명과 함께 본원에 기재된 바와 같이 사용된 폴리펩티드는 변형되거나 유도체화된 하나 이상의 아미노산을 포함하거나 이로 이루어질 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.
하나 이상의 아미노산의 화학적 유도체는 작용성 측기와의 반응에 의해 달성될 수 있다. 이러한 유도체화된 분자는 예를 들어, 유리 아미노 기가 유도체화되어 아민 하이드로클로라이드, p-톨루엔 술포닐 기, 카르복시벤족시 기, t-부틸옥시카르보닐 기, 클로로아세틸 기 또는 포름일 기를 형성하는 분자를 포함한다. 유리 카르복실 기는 유도체화되어 염, 메틸 및 에틸 에스테르 또는 다른 유형의 에스테르 및 하이드라지드를 형성할 수 있다. 유리 하이드록실 기는 유도체화되어 O-아실 또는 O-알킬 유도체를 형성할 수 있다. 또한 20개의 표준 아미노산의 자연 발생 아미노산 유도체를 함유하는 펩티드가 화학적 유도체로 포함된다. 예를 들어: 4-하이드록시프롤린은 프롤린으로 치환될 수 있고; 5-하이드록시리신은 리신으로 치환될 수 있고; 3-메틸히스티딘은 히스티딘으로 치환될 수 있고; 호모세린은 세린으로, 오르니틴은 리신으로 치환될 수 있다. 유도체는 또한 필요한 활성이 유지며는 한 하나 이상의 첨가 또는 결실을 함유하는 펩티드를 포함한다. 다른 포함된 변형은 아미드화, 아미노 말단 아실화(예를 들어 아세틸화 또는 티오글리콜산 아미드화), 말단 카르복실아미드화(예를 들어 암모니아 또는 메틸아민 사용), 및 유사 말단 변형이다.
펩티드 모방체 화합물이 또한 유용할 수 있음이 당업자에 의해 추가로 이해될 것이다. 용어 '펩티드 모방체'는 치료제로서 특정 펩티드의 형태 및 바람직한 특징을 모방하는 화합물을 지칭한다.
예를 들어, 상기 폴리펩티드는 아미노산 잔기가 펩티드(-CO-NH-) 결합에 의해 연결된 분자 뿐만 아니라 펩티드 결합이 역전된 분자를 포함한다. 이러한 레트로-인버소(retro-inverso) 펩티드 모방체는 예를 들어 Meziere 등(1997, J. Immunol., 159(7): 3230-3237)에 기재된 것과 같은 당업계에 알려진 방법을 사용하여 만들어질 수 있다. 이 접근법은 측쇄의 배향이 아니라 백본에 관여하는 변화를 함유하는 유사-펩티드를 제조하는 것을 수반한다. CO-NH 펩티드 결합 대신 NH-CO 결합을 함유하는 레트로-인버스(Retro-inverse) 펩티드는 단백질분해에 훨씬 더 많은 저항이 있다. 대안적으로, 상기 폴리펩티드는 아미노산 잔기 중 하나 이상이 통상적인 아미드 결합 대신 -y(CH2NH)- 결합에 의해 연결된 펩티드 모방체 화합물일 수 있다.
추가의 대안에서, 펩티드 결합은 아미노산 잔기의 탄소 원자 사이의 간격을 유지하는 적절한 링커 모이어티가 사용된다면 완전히 생략될 수 있으며; 링커 모이어티가 펩티드 결합과 실질적으로 동일한 전하 분포 및 실질적으로 동일한 평면셩을 갖는 것이 유리할 수 있다.
상기 폴리펩티드는 엑소-단백질분해 소화에 대한 민감성을 줄이는 것을 돕기 위해 그의 N- 또는 C-말단에서 편리하게 차단될 수 있음이 또한 이해될 것이다.
D-아미노산 및 N-메틸 아미노산과 같은 다양한 코딩되지 않거나 변형된 아미노산이 또한 포유동물 펩티드를 변형시키는 데 사용되었다. 또한, 추정된 생물활성 형태는 결정화와 같은 공유 변형에 의해 또는 락탐의 혼입 또는 다른 유형의 가교에 의해 안정화될 수 있고, 예를 들어 Veber 등(1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:2636) 및 Thursell 등(1983, Biochem. Biophys. Res. Comm. 111:166)을 참조하며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
결합 분자 구조:
본 발명의 제1 측면에 따른 "결합 분자"는 전형적으로 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 결합 분자(또는 이의 일부)는 다중 폴리펩티드의 조합을 통해 형성될 수 있다. 예를 들어, VH 폴리펩티드는 VL 폴리펩티드와 조합되어, 그 안에 Fab 단편을 형성할 수 있다. 폴리펩티드의 조합은 동일한 예시적인 ECD3-결합 분자의 VL 폴리펩티드, 또는 상이한 예시적인 ECD3-결합 분자의 VL 폴리펩티드와 조합된 하나의 예시적인 ECD3-결합 분자로부터의 VH 폴리펩티드일 수 있다.
일부 바람직한 구현예에서, 결합 분자는 항체 및 키메라 항원 수용체(CAR)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 논의되고, 실시예 1의 표 2, 및 또한 실시예 2에 추가로 설명된 바와 같이, 본 출원은 항체 13-5G6-1D3(일반적으로 본원에서 "1D3"으로 약칭됨), 13-5C6-1B5, 14-1H3-1A6, 13-1C10-1C10(일반적으로 본원에서 "1C10"으로 약칭됨), 14-1H3-1A10(일반적으로 본원에서 "1A10"으로 약칭됨), 14-2C2-1G4(일반적으로 본원에서 "1G4"로 약칭됨), 13-1C10-1G9(일반적으로 본원에서 "1G9"로 약칭됨) 및 14-4E4-1E8(일반적으로 본원에서 "1E8"로 약칭됨)을 포함하여, US28에 대한 매우 유익한 결합 특성을 갖는, 본원에 기재된 방법에 따라 US28의 ECD3에 대해 생성된 수많은 항체를 기재한다.
본 출원은 또한 본 출원의 섹션 N에 추가로 논의된 바와 같이, 본 발명의 제34 측면에 따라 HCMV의 US28 단백질의 세포외 도메인 3(ECD3) 내의 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 추가의 항체를 수득하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 방법은 다음을 포함할 수 있다:
(a) US28 단백질의 ECD3에 존재하는 아미노산 서열에 상응하는 하나 이상의 펩티드, 예컨대 폴리펩티드 서열 TKKDNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 7) 및/또는 TKKNNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 6), 및/또는 어느 하나 또는 둘 다의 면역원성 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 펩티드 중 하나 또는 둘 다를 제공하는 단계;
(b) 하나 이상의 후보 항체(임의적으로 상기 펩티드 중 하나 또는 둘 다에 반응하여 생성된 것)를 제공하는 단계; 및
(c) 상기 펩티드 중 하나 또는 둘 다에 대한 하나 이상의 후보 항체의 결합 특이성 및/또는 결합 친화성을 결정하는 단계.
일부 바람직한 구현예에서, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자는 각각 서열번호: 8, 9, 10, 14, 15 및 16에 의해 정의된 바와 같은 항체 1D3의 CDR 서열 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 모두에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 상보성 결정 영역(CDR), 및/또는 항체 1D3의 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체를 포함하고, 임의적으로 여기서 결합 분자는 항체 및 CAR로부터 선택된다.
서열번호: 8, 9, 10, 14, 15 및 16에 의해 정의된 바와 같은 항체 1D3의 CDR 서열의 서열, 및 정체성은 다음과 같다:
또 다른 구현예에서, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자는 각각 서열번호: 112, 113, 114, 117, 83, 118에 의해 정의된 바와 같은 항체 1C10의 CDR 서열 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 모두에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 상보성 결정 영역(CDR), 및/또는 항체 1C10의 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체를 포함하고, 임의적으로 여기서 결합 분자는 항체 및 CAR로부터 선택된다.
서열번호: 112, 113, 114, 117, 83, 118에 의해 정의된 바와 같은 항체 1C10의 CDR 서열의 서열, 및 정체성은 다음과 같다:
또 다른 구현예에서, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자는 각각 서열번호: 112, 113, 114, 117, 83, 118에 의해 정의된 바와 같은 항체 1A10의 CDR 서열 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 모두에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 상보성 결정 영역(CDR), 및/또는 항체 1A10의 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체를 포함하고, 임의적으로 여기서 결합 분자는 항체 및 CAR로부터 선택된다.
서열번호: 112, 113, 114, 117, 83, 118에 의해 정의된 바와 같은 항체 1A10의 CDR 서열의 서열, 및 정체성은 다음과 같다:
또 다른 구현예에서, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자는 각각 서열번호: 76, 77, 78, 82, 83 및 84에 의해 정의된 바와 같은 항체 1G9의 CDR 서열 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 모두에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 상보성 결정 영역(CDR), 및/또는 항체 1G9의 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체를 포함하고, 임의적으로 여기서 결합 분자는 항체 및 CAR로부터 선택된다.
서열번호: 76, 77, 78, 82, 83 및 84에 의해 정의된 바와 같은 항체 1G9의 CDR 서열의 서열, 및 정체성은 다음과 같다:
또 다른 구현예에서, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자는 각각 서열번호: 76, 95, 96, 82, 99 및 100에 의해 정의된 바와 같은 항체 1E8의 CDR 서열 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 모두에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 상보성 결정 영역(CDR), 및/또는 항체 1E8의 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체를 포함하고, 임의적으로 여기서 결합 분자는 항체 및 CAR로부터 선택된다.
서열번호: 76, 95, 96, 82, 99 및 100에 의해 정의된 바와 같은 항체 1E8의 CDR 서열의 서열, 및 정체성은 다음과 같다:
다른 구현예에서, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자는 본원에 기재된 바와 같은 항체 13-5C6-1B5 및 14-1H3-1A6 중 어느 하나와 같은 US28의 ECD3에 대한 결합 특이성(및 바람직하게는 균주 불가지론적 결합 특이성)을 갖는 임의의 다른 항체, 및/또는 상기 기재된 바와 같은, HCMV의 US28 단백질의 세포외 도메인 3(ECD3) 내의 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 추가의 항체를 수득하는 방법에 의해 수득되는 임의의 항체의 CDR 서열(및/또는 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체) 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 모두에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.
3개 이하의 CDR 영역(일부 경우에 단일 CDR 또는 이의 일부만)을 함유하는 분자는 CDR(들)이 유래된 항체의 항원-결합 활성을 유지할 수 있음이 이해된다. 예를 들어, Gao 등(1994, J Biol Chem 269: 32389-93)은 기질에 대해 높은 친화성을 갖는 전체 VL 쇄(3개의 CDR을 모두 포함)를 기재한다.
2개의 CDR 영역을 함유하는 분자는 예를 들어, Vaughan 및 Sollazzo(2001, Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening, 4: 417-430)에 의해 기재되어 있다. 418 페이지(오른쪽 열 - 설계를 위한 3가지 전략)에는 프레임워크 영역 내에 산재된 H1 및 H2 CDR 초가변 영역만을 포함하는 미니바디가 기재되어 있다. 미니바디는 표적에 결합할 수 있는 것으로 기재되어 있다. Pessi 등(1993, Nature, 362: 367-9) 및 Bianchi 등(1994, J. Mol. Biol., 236: 649-59)은 Vaughan 및 Sollazzo에 의해 참조되고 H1 및 H2 미니마디 및 그의 특성을 보다 상세하게 기재하고 있다. Qiu 등(2007, Nature Biotechnology, 25:921-9)은 2개의 연결된 CDR로 이루어진 분자가 항원에 결합할 수 있음을 입증한다(초록 및 926 페이지, 오른쪽 열). Quiocho(1993, Nature, 362: 293-4)는 Pessi 등의 "미니바디" 기술의 요약을 제공한다. Ladner(2007, Nature Biotechnology, 25:875-7)는 Qiu 등의 기사를 검토하고 2개의 CDR을 함유하는 분자가 항원-결합 활성을 유지할 수 있음을 설명한다(875 페이지, 오른쪽 열).
단일 CDR 영역을 함유하는 분자는 예를 들어, CDR로부터 유래된 헥사펩티드의 범위가 항원-결합 활성을 나타낸다는 것(초록)을 입증하고 완전한 단일 CDR의 합성 펩티드가 강한 결합 활성을 나타낸다는 것(30942 페이지, 오른쪽 열)에 주목하는 Laune 등(1997, JBC, 272: 30937-44)에 의해 기재되어 있다. Monnet 등(1999, JBC, 274: 3789-96)은 12-mer 펩티드 및 연관된 프레임워크 영역의 범위가 항원-결합 활성을 갖는다는 것(초록)을 나타내고 CDR3-유사 펩티드 단독으로 항원에 결합할 수 있다는 것(3785 페이지, 왼쪽 열)을 설명한다. Heap 등(2005, J. Gen. Virol., 86: 1791-1800)은 "마이크로-항체"(단일 CDR을 함유하는 분자)가 항원에 결합할 수 있다는 것(초록 및 1791 페이지, 왼쪽 열)을 보고하고 항-HIV 항체로부터의 환형 펩티드가 항원-결합 활성 및 기능을 갖는다는 것을 나타낸다. Nicaise 등(2004, Ptotein Science, 13:1882-91)은 단일 CDR이 리소자임 항원에 대한 항원-결합 활성 및 친화성을 부여할 수 있다는 것을 나타낸다.
항체의 특정 CDR 서열의 기능적 변이체가 언급되는 경우, 정의된 바와 같은 항체 내의 CDR 중 하나 이상이 달라질 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 항체가 각각 특정 서열을 갖는 경쇄 또는 중쇄 CDR(예를 들어 CDR 1-3)을 포함하는 것으로 정의된 경우, 그러한 특정 서열 중 최대 1, 2, 또는 3개가 달라질 수 있다. 유사하게, 항체가 각각 특성 서열을 갖는 경쇄 및 중쇄 CDR(예를 들어 6개의 CDR)을 포함하는 것으로 정의된 경우, 그러한 특정 서열 중 최대 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 모두가 달라질 수 있다. 기능적 변이체는 전형적으로 하기에 추가로 기재된 바와 같은 보존적 아미노산 치환이고/이거나 아미노산 결실 및/또는 삽입을 포함할 수 있다.
예를 들어, 1D3의 VH-CDR1 서열은 8-아미노산 서열 GFTFTDYY(서열번호: 8)이다. 이의 기능적 변이체는 하기에 추가로 기재된 바와 같은 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개)의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있고/있거나 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 또는 5개)의 아미노산 결실 및/또는 하나 이상의 아미노산 삽입을 포함할 수 있다. 1C10, 1A10, 1G9 및 1E8의 VH-CDR1 서열은 5-아미노산 서열(서열번호: 각각 112, 112, 138, 76 및 76)이다. 이의 기능적 변이체는 하기에 추가로 기재된 바와 같은 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개)의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있고/있거나 하나 이상(예를 들어 1 또는 2개)의 아미노산 결실 및/또는 하나 이상의 아미노산 삽입을 포함할 수 있다.
1D3의 VH-CDR2 서열은 10-아미노산 서열 IRSKANGYTT(서열번호: 9)이다. 이의 기능적 변이체는 하기에 추가로 기재된 바와 같은 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있고/있거나 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개)의 아미노산 결실 및/또는 하나 이상의 아미노산 삽입을 포함할 수 있다. 1C10, 1A10, 1G9 및 1E8의 VH-CDR2 서열은 16-아미노산 서열(각각 서열번호: 113, 113, 77 및 95)이다. 이의 기능적 변이체는 하기에 추가로 기재된 바와 같은 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개)의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있고/있거나 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개)의 아미노산 결실 및/또는 하나 이상의 아미노산 삽입을 포함할 수 있다.
1D3의 VH-CDR3 서열은 12-아미노산 서열 ARDERRTAWLAY(서열번호: 10)이다. 이의 기능적 변이체는 하기에 추가로 기재된 바와 같은 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개)의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있고/있거나 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개)의 아미노산 결실 및/또는 하나 이상의 아미노산 삽입을 포함할 수 있다. 1G9의 VH-CDR3 서열은 14-아미노산 서열(서열번호: 78)이다. 이의 기능적 변이체는 하기에 추가로 기재된 바와 같은 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개)의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있고/있거나 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개)의 아미노산 결실 및/또는 하나 이상의 아미노산 삽입을 포함할 수 있다. 1C10, 1A10 및 1E8의 VH-CDR3 서열은 13-아미노산 서열(각각 서열번호: 114, 114 및 96)이다. 이의 기능적 변이체는 하기에 추가로 기재된 바와 같은 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개)의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있고/있거나 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 아미노산 결실 및/또는 하나 이상의 아미노산 삽입을 포함할 수 있다.
1D3의 VL-CDR1 서열은 11-아미노산 서열 QSIVHSNGNTY(서열번호: 14)이다. 이의 기능적 변이체는 하기에 추가로 기재된 바와 같은 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있고/있거나 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개)의 아미노산 결실 및/또는 하나 이상의 아미노산 삽입을 포함할 수 있다. 1C10, 1A10, 1G9 및 1E8의 VL-CDR1 서열은 10-아미노산 서열(각각 서열번호: 117, 117, 82 및 82)이다. 이의 기능적 변이체는 하기에 추가로 기재된 바와 같은 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있고/있거나 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개)의 아미노산 결실 및/또는 하나 이상의 아미노산 삽입을 포함할 수 있다.
1D3의 VL-CDR2 서열은 3-아미노산 서열 KVS(서열번호: 15)이다. 이의 기능적 변이체는 하기에 추가로 기재된 바와 같은 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3개)의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있고/있거나 하나 이상의 아미노산 결실 및/또는 하나 이상의 아미노산 삽입을 포함할 수 있다. 1C10, 1A10, 1G9 및 1E8의 VL-CDR2 서열은 7-아미노산 서열(각각 서열번호: 83, 83, 145, 83 및 99)이다. 이의 기능적 변이체는 하기에 추가로 기재된 바와 같은 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개)의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있고/있거나 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3 또는 4개)의 아미노산 결실 및/또는 하나 이상의 아미노산 삽입을 포함할 수 있다.
1D3의 VL-CDR3 서열은 10-아미노산 서열 FQGSHVPTWT(서열번호: 16)이다. 이의 기능적 변이체는 하기에 추가로 기재된 바와 같은 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있고/있거나 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개)의 아미노산 결실 및/또는 하나 이상의 아미노산 삽입을 포함할 수 있다. 1C10, 1A10, 1G9 및 1E8의 VL-CDR3 서열은 10-아미노산 서열(각각 서열번호: 118, 118, 84 및 100)이다. 이의 기능적 변이체는 하기에 추가로 기재된 바와 같은 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있고/있거나 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개)의 아미노산 결실 및/또는 하나 이상의 아미노산 삽입을 포함할 수 있다.
상기 CDR 중 하나 이상의 기능적 변이체는 당업계에 잘 알려진 다양한 과정 중 임의의 것에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하는 결합 분자의 결합 특성은 성숙 과정에 의해 개발될 수 있다. 예를 들어, 결합 분자의 CDR에 제공된 결합 친화성은 성숙 단계에 의해 변형(증가 또는 감소)될 수 있고/있거나; 결합 분자의 CDR에 제공된 결합 특이성은 성숙 단계에 의해 변형(일반적으로 증가)될 수 있다. US28에 대한 높거나 증가된 수준의 결합 친화성은 특히 건강한 인간 세포와 같은 표적외에 대한 허용할 수 없게 높은 수준의 결합 친화성을 희생하여 일어나는 경우 항상 바람직하지 않을 수 있음이 이해되어야 한다. 예를 들어, CAR 및 CAR-발현 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는 결합 분자는 더 낮은 수준의 결합 친화성으로부터 이익을 얻을 수 있지만, 일반적으로 최적화된 수준의 결합 특이성으로부터 항상 이익을 얻을 것이다.
성숙 과정의 하나의 예에서, 1가 디스플레이 파지미드 시스템은 항원-결합 스크리닝 동안 결합력(avidity) 효과를 변형시키는 데 사용될 수 있다. 2개의 대안적 또는 조합된 방법, 비표적화된 돌연변이생성 및 올리고뉴클레오티드-유도 돌연변이생성을 이용하여 원래 결합 분자의 다수의 돌연변이체를 도입하기 위해 무작위 또는 정의된 하위라이브러리를 구성할 수 있다. 그런 다음 원하는 변형된 특성(예컨대 증가된 특이성 및/또는 증가 또는 감소된 친화성)으로 US28-발현 세포, 및/또는 HCMV-감염된 세포에 결합하는 결합 분자는 엄격성에 대한 검정에서와 같이 스크리닝 조건을 변형시킴으로써 선택된다.
본 발명의 제1 측면의 결합 분자는 하기 항체의 CDR 서열 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 모두의 기능적 변이체를 포함하고:
(a) 각각 서열번호: 8, 9, 10, 14, 15 및 16에 의해 정의된 바와 같은 1D3;
(b) 각각 서열번호: 112, 113, 114, 117, 83 및 118에 의해 정의된 바와 같은 1C10;
(c) 각각 서열번호: 112, 113, 114, 117, 83 및 118에 의해 정의된 바와 같은 1A10;
(d) 각각 서열번호: 76, 77, 78, 82, 83 및 84에 의해 정의된 바와 같은 1G9; 및/또는
(e) 각각 서열번호: 76, 95, 96, 82, 99 및 100에 의해 정의된 바와 같은 1E8;
바람직하게는 상기 추가로 기재된 바와 같이, 각각 1D3, 1C10, 1A10, 1G9 및/또는 1E8과 동일한 조건 하에 테스트될 때, 1D3, 1C10, 1A10, 1G9 및/또는 1E8의 결합 특성과 유사하거나 실질적으로 동등한 하나 이상의 결합 특성을 보유한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자는 다음을 포함할 수 있다:
(a) 하기 항체의 가변 중쇄(VH)의 CDR 1, 2, 및 3 서열 중 1, 2, 또는 3개 모두:
i. 각각 서열번호: 8, 9, 및 10에 의해 정의된 바와 같은 1D3(및/또는 상기 CDR 서열 중 임의의 1, 2 또는 3개의 기능적 변이체);
ii. 각각 서열번호: 112, 113, 및 114에 의해 정의된 바와 같은 1C10(및/또는 상기 CDR 서열 중 임의의 1, 2 또는 3개의 기능적 변이체);
iii. 각각 서열번호: 112, 113, 및 114에 의해 정의된 바와 같은 1A10(및/또는 상기 CDR 서열 중 임의의 1, 2 또는 3개의 기능적 변이체);
iv. 각각 서열번호: 76, 77, 및 78에 의해 정의된 바와 같은 1G9(및/또는 상기 CDR 서열 중 임의의 1, 2 또는 3개의 기능적 변이체); 및/또는
v. 각각 서열번호: 76, 95, 및 96에 의해 정의된 바와 같은 1G9(및/또는 상기 CDR 서열 중 임의의 1, 2 또는 3개의 기능적 변이체);
및/또는
(b) 하기 항체의 가변 경쇄(VL)의 CDR 1, 2, 및 3 서열 중 1, 2, 또는 3개 모두:
i. 각각 서열번호: 14, 15, 및 16에 의해 정의된 바와 같은 1D3(및/또는 상기 CDR 서열 중 임의의 1, 2 또는 3개의 기능적 변이체);
ii. 각각 서열번호: 117, 83, 및 118에 의해 정의된 바와 같은 1C10(및/또는 상기 CDR 서열 중 임의의 1, 2 또는 3개의 기능적 변이체);
iii. 각각 서열번호: 117, 83, 및 118에 의해 정의된 바와 같은 1A10(및/또는 상기 CDR 서열 중 임의의 1, 2 또는 3개의 기능적 변이체);
iv. 각각 서열번호: 82, 83, 및 84에 의해 정의된 바와 같은 1G9(및/또는 상기 CDR 서열 중 임의의 1, 2 또는 3개의 기능적 변이체); 및/또는
v. 각각 서열번호: 82, 99, 및 100에 의해 정의된 바와 같은 1E8(및/또는 상기 CDR 서열 중 임의의 1, 2 또는 3개의 기능적 변이체).
추가로, 또는 대안적으로, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자는 다음을 포함할 수 있다:
(a) 하기 서열을 갖는 CDR 1, 2, 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드:
i. 각각 서열번호: 8, 9, 및 10(및/또는 상기 CDR 서열 중 임의의 1, 2 또는 3개의 기능적 변이체), 및 임의적으로 여기서 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드는 서열번호: 12의 서열(또는 이의 기능적 변이체)를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것;
ii. 각각 서열번호: 112, 113, 및 114(및/또는 상기 CDR 서열 중 임의의 1, 2 또는 3개의 기능적 변이체), 및 임의적으로 여기서 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드는 서열번호: 104의 서열(또는 이의 기능적 변이체)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것;
iii. 각각 서열번호: 112, 113, 및 114(및/또는 상기 CDR 서열 중 임의의 1, 2 또는 3개의 기능적 변이체), 및 임의적으로 여기서 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드는 서열번호: 122의 서열(또는 이의 기능적 변이체)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것;
iv. 각각 서열번호: 76, 77, 및 78(및/또는 상기 CDR 서열 중 임의의 1, 2 또는 3개의 기능적 변이체), 및 임의적으로 여기서 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드는 서열번호: 68의 서열(또는 이의 기능적 변이체)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것; 및/또는
v. 각각 서열번호: 76, 95, 및 96(및/또는 상기 CDR 서열 중 임의의 1, 2 또는 3개의 기능적 변이체), 및 임의적으로 여기서 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드는 서열번호: 88의 서열(또는 이의 기능적 변이체)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것;
및/또는
(b) 하기 서열을 갖는 CDR 1, 2 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드:
i. 각각 서열번호: 14, 15, 및 16(및/또는 상기 CDR 서열 중 임의의 1, 2 또는 3개의 기능적 변이체), 및 임의적으로 여기서 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드는 서열번호: 18의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것;
ii. 각각 서열번호: 117, 83, 및 118(및/또는 상기 CDR 서열 중 임의의 1, 2 또는 3개의 기능적 변이체), 및 임의적으로 여기서 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드는 서열번호: 108의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것;
iii. 각각 서열번호: 117, 83, 및 118(및/또는 상기 CDR 서열 중 임의의 1, 2 또는 3개의 기능적 변이체), 및 임의적으로 여기서 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드는 서열번호: 126의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것;
iv. 각각 서열번호: 82, 83, 및 84(및/또는 상기 CDR 서열 중 임의의 1, 2 또는 3개의 기능적 변이체), 및 임의적으로 여기서 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드는 서열번호: 72의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것; 및/또는
v. 각각 서열번호: 82, 99, 및 100(및/또는 상기 CDR 서열 중 임의의 1, 2 또는 3개의 기능적 변이체), 및 임의적으로 여기서 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드는 서열번호: 92의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것.
각각 서열번호: 12 및 18에 의해 정의된 바와 같은 항체 1D3의 가변 중쇄(VH) 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드 서열의 서열, 및 정체성은 다음과 같다:
각각 서열번호: 104 및 108에 의해 정의된 바와 같은 항체 1C10의 가변 중쇄(VH) 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드 서열의 서열, 및 정체성은 다음과 같다:
각각 서열번호: 122 및 126에 의해 정의된 바와 같은 항체 1A10의 가변 중쇄(VH) 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드 서열의 서열, 및 정체성은 다음과 같다:
각각 서열번호: 68 및 72에 정의된 바와 같은 항체 1G9의 가변 중쇄(VH) 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드 서열의 서열, 및 정체성은 다음과 같다:
각각 서열번호: 88 및 92에 의해 정의된 바와 같은 항체 1E8의 가변 중쇄(VH) 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드 서열의 서열, 및 정체성은 다음과 같다:
다른 구현예에서, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자는 (a) US28의 ECD3에 대한 결합 특이성(및 바람직하게는 균주 불가지론적 결합 특이성)을 갖는 또 다른 항체의 VH 쇄의 CDR 1, 2, 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드(및/또는 상기 CDR 서열 중 임의의 1, 2 또는 3개의 기능적 변이체), 및/또는 (b) US28의 ECD3에 대한 결합 특이성(및 바람직하게는 균주 불가지론적 결합 특이성)을 갖는 동일한 다른 항체의 VL 쇄의 CDR 1, 2 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드(및/또는 상기 CDR 서열 중 임의의 1, 2 또는 3개의 기능적 변이체)를 포함한다. 상기 다른 항체는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 항체 13-5C6-1B5 및 14-1H3-1A6, 및/또는 상기 기재된 바와 같이, HCMV의 US28 단백질의 세포외 도메인 3(ECD3) 내의 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 추가의 항체를 수득하는 방법에 의해 수득되는 또 다른 항체 중 어느 하나일 수 있다.
항체가 특정 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 특정 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 갖는 것으로 정의된 경우, 그러한 서열 중 최대 1 또는 2개가 정의된 바와 같이 달라질 수 있음이 이해될 것이다. 변이는 서열의 비-CDR 영역 내에서만, 서열의 CDR 영역 내에서만, 또는 서열의 비-CDR 및 CDR 영역 둘 다 내에서 있을 수 있다. 전형적으로, 변이는 CDR 영역의 외부에 있고, 따라서 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역의 변이체는 본원에 정의된 특정 CDR 서열 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
항체가 본원에 정의된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(예를 들어 서열번호: 12, 104, 122, 130, 68 및 88로부터 선택된 VH 및/또는 서열번호: 18, 108, 126, 134, 72 및 92로부터 선택된 VL)의 변이체를 포함하는 경우, 변이체는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 전형적으로, 변이체는 30, 20, 또는 10개 초과의 아미노산 치환을 갖지 않는다. 따라서, 변이체는 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환을 가질 수 있지만 30, 20 또는 10개 초과의 아미노산 치환을 갖지 않을 수 있다.
항체가 본원에 정의된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(예를 들어 서열번호: 12, 104, 122, 130, 68 및 88로부터 선택된 VH 및/또는 서열번호: 18, 108, 126, 134, 72 및 92로부터 선택된 VL)의 변이체를 포함하는 경우, 변이체는 일반적으로 정의된 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 가지며, 보다 일반적으로 정의된 아미노산 서열에 대해 95-99% 서열 동일성(예를 들어 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성)을 갖는다. 변이 수준은 비-CDR 영역에만 적용가능할 수 있다. 예를 들어 본원에 정의된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(예를 들어 서열번호: 12, 104, 122, 130, 68 및 88로부터 선택된 VH 및/또는 서열번호: 18, 108, 126, 134, 72 및 92로부터 선택된 VL)의 변이체는 정의된 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 동일성(예를 들어 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성)을 가질 수 있지만 본원에 정의된 바와 같은 하나 이상(예컨대 모두)의 동일한 CDR을 포함한다.
2개의 폴리펩티드 사이의 퍼센트 서열 동일성은 적합한 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 위스콘신 대학 유전자 컴퓨팅 그룹(University of Wisconsin Genetic Computing Group)의 GAP 프로그램을 사용하여 결정될 수 있고 퍼센트 동일성은 서열이 최적으로 정렬된 폴리펩티드와 관련하여 계산됨이 이해될 것이다. 정렬은 대안적으로 Clustal W 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다(Thompson 등, (1994) Nucleic Acids Res 22, 4673-80). 사용되는 매개변수는 다음과 같을 수 있다: 빠른 쌍별 정렬 매개변수: K-투플(단어) 크기; 1, 윈도우 크기; 5, 갭 패널티; 3, 상위 대각선의 수; 5. 점수화 방법: x 퍼센트. 다중 정렬 매개변수: 갭 개방 패널티; 10, 갭 확장 패널티; 0.05. 점수화 매트릭스: BLOSUM.
각각 VH에 대한 서열번호: 12, 104, 122, 68 및 88 및 VL에 대한 18, 108, 126, 72 및 92에 의해 정의된 바와 같은 항체 1D3, 1C10, 1A10, 1G9 및/또는 1E8의 가변 중쇄(VH) 및/또는 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드 서열의 기능적 변이체를 포함하는 본 발명의 제1 측면의 결합 분자는 바람직하게는 상기 추가로 기재된 바와 같이, 각각 1D3, 1C10, 1A10, 1G9 및/또는 1E8과 동일한 조건 하에 테스트될 때, 1D3, 1C10, 1A10, 1G9 및/또는 1E8의 결합 특성과 유사하거나 실질적으로 동등한 하나 이상의 결합 특성을 보유한다.
전형적으로, 본원에 개시된 변이체의 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이며, 예를 들어 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이 바람직하다. 보존적 아미노산 치환은 당업계에 잘 알려져 있고 (원래 잔기 → 치환) Ala(A) → Val, Gly 또는 Pro; Arg(R) → Lys 또는 His; Asn(N) → Gln; Asp(D) → Glu; Cys(C) → Ser; Gln(Q) → Asn; Glu(G) → Asp; Gly(G) → Ala; His(H) → Arg; Ile(I) → Leu; Leu(L) → Ile, Val 또는 Met; Lys(K) → Arg; Met(M) → Leu; Phe(F) → Tyr; Pro(P) → Ala; Ser(S) → Thr 또는 Cys; Thr(T) → Ser; Trp(W) → Tyr; Tyr(Y) → Phe 또는 Trp; 및 Val(V) → Leu 또는 Ala를 포함한다.
항체:
하나의 비제한적이지만 바람직한 구현예에서, 본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자는 항체일 수 있으며 이를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 임의적으로 상기 항체의 항원-결합 단편을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "키메라 항원 수용체(CAR)"는 임의적으로 상기 CAR의 항원-결합 단편을 포함한다.
"항체 또는 이의 항원-결합 단편"은 실질적으로 온전한 항체 분자, 뿐만 아니라 키메라 항체, 인간화 항체, 단리된 인간 항체, 단일 쇄 항체, 단일특이적 항체, 이중특이적 항체, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 동종이량체 및 이종이량체, 및 이의 항원-결합 단편 및 유도체를 포함한다. 적합한 항원-결합 단편 및 유도체는 Fv 단편(예를 들어 단일 쇄 Fv 및 이황화-결합된 Fv), Fab-유사 단편(예를 들어 Fab 단편, Fab' 단편 및 F(ab)2 단편), 단일 가변 도메인(예를 들어 VH 및 VL 도메인) 및 단일 도메인 항체(단일 및 이중 형식[즉 dAb-링커-dAb], 및 나노바디를 포함하는 dAb)를 포함한다. 전체 항체보다 항체 단편을 사용하는 잠재적인 이점은 몇 배이다. 단편의 크기가 작을수록 고형 조직의 더 나은 침투와 같은 개선된 약리학적 특성을 야기할 수 있다. 더욱이, Fab, Fv, ScFv 및 dAb 항체 단편과 같은 항원-결합 단편은 재조합 공급원(예를 들어 CHO 세포, 이. 콜라이(E. coli) 등)에서 발현되고 이로부터 분비되어 다량의 상기 단편의 용이한 생산을 허용할 수 있다.
"항체" 또는 "이의 항원-결합 단편"은 실질적으로 온전한 항체 분자, 뿐만 아니라 키메라 항체, 인간화 항체, 및 단리된 인간 항체를 포함한다.
"이의 항원-결합 단편"을 포함하는 "항체", CAR 또는 이의 항원-결합 단편, 및/또는 본 발명의 제1 측면에 따른 다른 결합 분자는 예를 들어
i. "n"의 원자가를 가질 수 있으며, 여기서 n은 1 이상의 정수이므로, 1가, 2가, 3가 또는 다가일 수 있고/있거나;
ii. 1개의 항원, 또는 2개 이상의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 가질 수 있으며, 예를 들어 "x"개의 상이한 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 가질 수 있고, 여기서 x는 적어도 하나의 항원이 US28 단백질의 ECD3인 요건에 따라 1, 또는 2 이상의 정수이며; 예를 들어, 단일특이적, 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적 결합 특이성을 가질 수 있다.
항체 또는 이의 항원-결합 단편의 예시적인 형태는 단일 쇄 항체, 이중특이적 항체, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 동종이량체 및 이종이량체, 및 이의 항원-결합 단편 및 유도체 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다. 적합한 항원-결합 단편 및 유도체는 Fv 단편(예를 들어 단일 쇄 Fv 및 이황화-결합된 Fv), Fab-유사 단편(예를 들어 Fab 단편, Fab' 단편 및 F(ab)2 단편), 단일 가변 도메인(예를 들어 VH 및 VL 도메인) 및 단일 도메인 항체(단일 및 이중 형식[즉 dAb-링커-dAb], 및 나노바디를 포함하는 dAb)를 포함한다. 전체 항체보다 항체 단편을 사용하는 잠재적인 이점은 몇 배이다. 단편의 크기가 작을수록 고형 조직의 더 나은 침투와 같은 개선된 약리학적 특성을 야기할 수 있다. 더욱이, Fab, Fv, 단일 쇄 Fv(ScFv) 및 dAb 항체 단편과 같은 항원-결합 단편은 이. 콜라이와 같은 재조합 숙주 세포에서 발현되고 이로부터 분비되어, 다량의 상기 단편의 용이한 생산을 허용할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "이중특이적"은 폴리펩티드가 적어도 2개의 표적 실체(entity)에 특이적으로 결합할 수 있음을 의미한다. 이러한 표적 실체 각각은 동일한 단백질로부터 유래된 에피토프에 대한 것일 수 있다(예를 들어 동일한 단백질, 예를 들어 US28의 제1 에피토프 및 제2 에피토프에 결합). 대안적으로, 표적 실체는 상이한 단백질로부터 유래된 에피토프에 대한 것일 수 있다(예를 들어 제1 단백질의 제1 에피토프, 및 상이한 단백질과 같은 제2 상이한 표적의 제2 에피토프에 결합).
"ScFv 분자"란 VH 및 VL 파트너 도메인이 유연한 올리고펩티드를 통해 연결된 분자를 의미한다. ScFv 항체와 같은 조작된 항체는 당업계에 오랫동안 알려진 기술 및 접근법을 사용하여 만들어질 수 있다. 전체 항체보다 항체 단편을 사용하는 이점은 몇 배이다. 단편의 크기가 작을수록 표적 부위에 대한 더 나은 침투와 같은 개선된 약리학적 특성을 야기할 수 있다. 보체 결합과 같은 전체 항체의 효과기 기능이 제거된다. Fab, Fv, ScFv 및 dAb 항체 단편은 모두 이. 콜라이에서 발현되고 이로부터 분비되어, 다량의 단편의 용이한 생산을 허용할 수 있다. 전체 항체, 및 F(ab')2 단편은 "2가"이다. "2가"란 항체 및 F(ab')2 단편이 2개의 항원 조합 부위를 가짐을 의미한다. 대조적으로, Fab, Fv, ScFv 및 dAb 단편은 1가이며, 단지 하나의 항원 조합 부위를 갖는다.
어구 "항체" 또는 "이의 항원-결합 단편"은 또한 항체 모방체(예를 들어, 높은 안정성 정도를 갖지만 특정 위치에서 가변성을 도입할 수 있는 비-항체 스캐폴드 구조)를 포함하도록 의도된다. 생화학 분야의 숙련자는 Gebauer & Skerra, 2009에 논의된 바와 같은 많은 이러한 분자와 친숙할 것이다. 예시적인 항체 모방체는 아피바디(affibody)(트리넥틴(Trinectin)으로도 불림; Nygren, 2008, FEBS J, 275, 2668-2676); CTLD(테트라넥틴(Tetranectin)으로도 불림; Innovations Pharmac. Technol.(2006), 27-30); 애드넥틴(adnectin)(모노바디(monobody)로도 불림; Meth. Mol. Biol., 352(2007), 95-109); 안티칼린(anticalin)(Drug Discovery Today(2005), 10, 23-33); DARPins(안키린(ankyrin); Nat. Biotechnol.(2004), 22, 575-582); 아비머(avimer)(Nat. Biotechnol.(2005), 23, 1556-1561); 마이크로바디(microbody)(FEBS J, (2007), 274, 86-95); 펩티드 압타머(aptamer)(Expert. Opin. Biol. Ther.(2005), 5, 783-797); 쿠니츠(Kunitz) 도메인(J. Pharmacol. Exp. Ther.(2006) 318, 803-809); 아필린(affilin)(Trends. Biotechnol.(2005), 23, 514-522); 아피머(affimer)(Avacta Life Sciences, 영국 웨더비)를 포함한다.
당업자는 본 발명이 또한 현재 존재하든 향후에 존재하든 항체 및 이의 항원-결합 단편의 변형된 버전, 예를 들어　 폴리에틸렌 글리콜 또는 또 다른 적합한 폴리머(하기 참조)의 공유 부착에 의해 변형되고/되거나 다른 폴리펩티드 서열에 공유적으로 또는 비공유적으로 부착된(예를 들어, 융합 단백질로서 제시됨으로써) 것을 포함한다는 것을 추가로 이해할 것이다.
항체 및 항체 단편을 생성하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 항체는 항체 분자의 생체내 생산 유도, 면역글로불린 라이브러리의 스크리닝(Orlandi 등, 1989; Winter 등, 1991) 또는 배양 중인 세포주에 의한 모노클로날 항체 분자의 생성을 이용하는 여러 방법 중 임의의 하나를 통해 생성될 수 있다. 이들은 하이브리도마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술, 및 엡스타인-바 바이러스(EBV)-하이브리도마 기술을 포함하나 이에 제한되지 않는다(Kohler at al., 1975. Nature 256:4950497; Kozbor 등, 1985. J. Immund. Methods 81:31-42; Cote 등, 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030; Cole 등, 1984. Mol. Cell. Biol. 62:109-120).
모노클로날 항체의 생산에 적합한 방법은 또한 "Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H Zola(CRC Press, 1988) 및 "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", J G R Hurrell(CRC Press, 1982)에 개시되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종 항체 집단으로부터 수득된 항체에 대한 언급을 포함하며, 즉, 집단을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 매우 특이적이며, 단일 항원성 부위에 대해 지시된다. 또한, 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제와 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원에 대한 단일 결정인자에 대해 지시된다. 그들의 특이성 외에도, 모노클로날 항체는 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않은 하이브리도마 배양물에 의해 합성된다는 점에서 이점이 있다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동종 항체 집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 Kohler et at, Nature, 256: 495(1975)에 의해 처음으로 기재된 하이브리도마 방법으로 만들어질 수 있거나, 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조)으로 만들어질 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어 Clackson et at, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et at, J. Mol. Biol., 222:581-597(1991)에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
마찬가지로, 항체 단편은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 수득될 수 있다(예를 들어, Harlow & Lane, 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, New York 참조). 예를 들어, 본 발명에 따른 항체 단편은 항체의 단백질분해 가수분해에 의해 또는 단편을 암호화하는 DNA의 이. 콜라이 또는 포유동물 세포에서의 발현에 의해(예를 들어　중국 햄스터 난소 [CHO] 세포 배양 또는 다른 단백질 발현 시스템) 제조될 수 있다. 대안적으로, 항체 단편은 통상적인 방법에 의해 전체 항체의 펩신 또는 파파인 소화에 의해 수득될 수 있다.
인간 요법 및/또는 진단을 위해, 인간 또는 인간화 항체가 바람직하게 사용됨이 당업자에 의해 이해될 것이다. 비인간(예를 들어　뮤린) 항체의 인간화 형태는 바람직하게는 비인간 항체로부터 유래된 최소 부분을 갖는 유전적으로 조작된 키메라 항체 또는 항체 단편(예를 들어 항원-결합 단편)이다. 인간화 항체는 인간 항체(수용자 항체)의 상보성 결정 영역(CDR)이 원하는 기능을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비인간 종(공여자 항체)의 관심 상보성 결정 영역의 잔기로 대체된 항체를 포함한다. 일부 경우에, 인간 항체의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 대체된다. 인간화 항체는 또한 수용자 항체에서도 유입된 상보성 결정 영역 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 상보성 결정 영역은 비인간 항체와 같은 관심 공여자 항체의 상보성 결정 영역에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역은 관련 인간 공통 서열의 상보성 결정 영역에 상응한다. 인간화 항체는 임의적으로 전형적으로 인간 항체로부터 유래된 Fc 영역과 같은 항체 불변 영역의 적어도 일부를 또한 포함한다(예를 들어, Jones 등, 1986. Nature 321:522-525; Riechmann 등, 1988, Nature 332:323-329; Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596을 참조하며, 이들은 본원에 참조로 포함됨).
비인간 항체를 인간화하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비인간인 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 종종 유입된 잔기로 언급되는 이러한 비인간 아미노산 잔기는 전형적으로 유입된 가변 도메인으로부터 취해진다. 인간화는 인간 상보성 결정 영역을 상응하는 설치류 상보성 결정 영역으로 대체함으로써 기재된 바와 같이 본질적으로 수행될 수 있다(예를 들어, Jones 등, 1986; Reichmann 등, 1988; Verhoeyen 등, 1988, Science 239:1534-1536I; US 4,816,567을 참조하며, 이들은 본원에 참조로 포함됨). 따라서, 이러한 인간화 항체는 키메라 항체이며, 여기서 온전한 인간 가변 도메인보다 실직적으로 적은 것이 비인간 종으로부터의 상응하는 서열로 대체되었다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 상보성 결정 영역 잔기 및 아마도 일부 프레임워크 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기로 대체된 인간 항체일 수 있다.
인간 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리를 포함하는 당업계에 알려진 다양한 기술을 사용하여 식별될 수 있다(예를 들어, Hoogenboom & Winter, 1991, J. Mol. Biol. 227:381; Marks 등, 1991, J. Mol. Biol. 222:581; Cole 등, 1985, In: Monoclonal antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77; Boerner 등, 1991. J. Immunol. 147:86-95, Soderlind 등, 2000, Nat Biotechnol 18:852-6 및 WO 98/32845를 참조하며, 이들은 본원에 참조로 포함됨).
본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어　항체가 임의의 적합한 구조적 형식일 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.
항체는 또한 Fc-특이적 수용체가 있는 경우 Fc 영역으로 구성될 수 있다. 치료적 모노클로날 항체 또는 Fc 융합 단백질의 Fc 영역을 조작하면 그들을 필요로 하는 약리학적 활성에 더 적합한 분자의 생성을 허용한다(Strohl, 2009, Curr Opin Biotechnol 20(6):685-91, 이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨).
(a) 증가된 반감기를 위해 조작된 Fc 영역
치료적 항체의 효능을 개선하기 위한 한 가지 접근법은 혈청 지속성을 증가시켜, 순환 수준을 높이고, 투여 빈도를 줄이고 용량을 감소시키는 것이다.
IgG의 반감기는 신생아 수용체 FcRn에 대한 pH-의존적 결합에 따라 달라진다. 내피 세포 표면에서 발현되는 FcRn은 pH-의존적 방식으로 IgG와 결합하고 분해로부터 보호한다.
pH 7.4가 아니라 pH 6.0에서 FcRn에 선택적으로 결합하는 일부 항체는 다양한 동물 모델에서 더 높은 반감기를 나타낸다.
T250Q/M428L(Hinton 등, 2004, J Biol Chem. 279(8):6213-6, 이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨) 및 M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F(Vaccaro 등, 2005, Nat Biotechnol. 23(10):1283-8, 이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)와 같은 CH2와 CH3 도메인 사이의 계면에 위치한 여러 돌연변이는 FcRn에 대한 결합 친화성 및 생체내에서 IgG1의 반감기를 증가시키는 것으로 나타났다.
(b) 변경된 효과기 기능을 위해 조작된 Fc 영역
FcγRI, FcγRII 및 III에 대한 항체의 Fc 부분의 친화성은 FcγR 발현 세포의 농도 절반 최대 결합을 달성하기 위해, 유세포 분석법에 의해 야생형 IgG1과 비교될 수 있다(Hezareh 등, 2001, J Virol., 75(24): 12161-12168, 본원에 참조로 포함됨). 이것은 대안적으로 FcγR 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 결정될 수 있다(Shields 등, 2001, Mol. Basis Cell Dev. Biol., 276(9): 6591-6604, 본원에 참조로 포함됨).
4개의 인간 IgG 이소형은 활성화 Fcγ 수용체(FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa), 억제 FcγRIIb 수용체, 및 보체(C1q)의 제1 구성요소에 상이한 친화성으로 결합하여, 매우 상이한 효과기 기능을 산출한다(Bruhns 등, 2009, Blood. 113(16):3716-25, 이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨). IgG1 분자는 가장 높은 친화성 및 효과기 기능을 유도하는 능력을 갖는 반면, IgG2, IgG3 및 IgG4는 덜 효과적이다(Bruhns, 2012, Blood. 119(24):5640-9; Hogarth and Pietersz, 2012, Nature Reviews Drug Discovery 11, 311-331; Stewart 등 2014 Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2:29; Wang 등 2015 Front Immunol; 6: 368; Vidarsson 등 2014, Front Immunol. 5:520, 본원에 참조로 포함됨). 또한, IgG1의 Fc 영역에서 특정 돌연변이는 신생아 FcR(FcRn) 상호작용을 유지하면서 FcγR 친화성 및 효과기 기능을 극적으로 감소시킨다(Ju and Jung, 2014, Curr Opin Biotechnol. 30:128-39; Leabman 등 2013, mAbs, 5:6, 896-903; Oganesyan 등 2008 Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 64(Pt 6): 700-704; Oganesyan 등 2008 Mol Immunol. 45(7):1872-82; Sazinsky 등, 2008 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 105(51) 20167-20172, 이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨).
가장 널리 사용되는 IgG1 돌연변이체는 N297A 단독 또는 D265A와 조합된 돌연변이, 뿐만 아니라 소위 "LALA" 이중 돌연변이체 L234A/L235A를 포함하는 위치 L234 및 L235에 있는 돌연변이이다. 돌연변이에 의해 IgG1을 추가로 침묵시키는 것으로 기재된 또 다른 위치는 P329이다(US 2012/0251531 참조). Fc 영역에서 추가 돌연변이는 WO 2021/234402에 기재되어 있다. 따라서, 본 발명의 결합 분자는 WO 2021/234402에 기재된 바와 같은 임의의 Fc 영역을 포함할 수 있으며, 이의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
예시적인 구현예에서, 폴리펩티드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다(이들 중 임의의 것은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다):
(a) 2가 항체, 예컨대 IgG-scFv 항체(예를 들어, 여기서 제1 결합 도메인은 온전한 IgG이고 제2 결합 도메인은 IgG의 경쇄의 N-말단 및/또는 경쇄의 C-말단 및/또는 중쇄의 N-말단 및/또는 중쇄의 C-말단에서 제1 결합 도메인에 부착된 scFv이거나, 반대의 경우도 마찬가지임);
(b) 1가 항체, 예컨대 DuoBody ®(Genmab AS, 덴마크 코펜하겐) 또는 '놉-인-홀' 이중특이적 항체(예를 들어, scFv-KIH, scFv-KIHr, BiTE-KIH 또는 BiTE-KIHr(Xu 등, 2015, mAbs 7(1):231-242 참조);
(c) scFv2-Fc 항체(예컨대 Emergent Biosolutions Inc로부터의 ADAPTIR™ 이중특이적 항체);
(d) BiTE/scFv2 항체;
(e) DVD-Ig 항체;
(f) DART-기반 항체(예를 들어, DART2-Fc 또는 DART);
(g) DNL-Fab3 항체; 및
(h) scFv-HSA-scFv 항체.
예를 들어, 항체는 IgG-scFv 항체일 수 있다. IgG-scFv 항체는 VH-VL 또는 VL-VH 배향 중 어느 하나에 있을 수 있다. 하나의 구현예에서, scFv는 VH와 VL 사이의 S-S 가교에 의해 안정화될 수 있다.
제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인은 서로 직접적으로 융합될 수 있다. 대안적으로, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인은 폴리펩티드 링커와 같은 링커를 통해 연결될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 링커는 약 10 내지 약 25개 아미노산의 짧은 링커 펩티드일 수 있다. 링커는 일반적으로 유연성을 위해 글리신, 뿐만 아니라 용해성을 위해 세린 또는 트레오닌에 풍부하고, VH의 N-말단을 VL의 C-말단과 연결하거나, 그 반대의 경우도 마찬가지일 수 있다.
용어 "결합 활성" 및 "결합 친화성"은 표적에 결합하거나 결합하지 않는 폴리펩티드 분자의 경향을 지칭하는 것으로 의도된다. 결합 친화성은 폴리펩티드 및 그의 표적에 대한 해리 상수(Kd)를 결정함으로써 정량화될 수 있다. Kd가 낮을수록 표적에 대한 높은 친화성을 나타낸다. 유사하게, 폴리펩티드의 표적에 대한 결합 특이성은 폴리펩티드 및 또 다른 비표적 분자에 대한 해리 상수와 비교하여 폴리펩티드의 표적에 대한 비교 해리 상수(Kd) 관점에서 정의될 수 있다.
이 해리 상수 값은 잘 알려진 방법에 의해 직접적으로 결정될 수 있고, 예를 들어, Caceci 등, 1984에 제시된 것들과 같은 방법에 의해 복잡한 혼합물에 대해서도 계산될 수 있다. 예를 들어, Kd는 Wong & Lohman, 1993에 의해 개시된 것들과 같은 이중-필터 니트로셀룰로스 필터 결합 검정을 사용하여 확립될 수 있다. 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯, RIA, 및 유세포 분석법 분석을 포함하여, 표적에 대한 항체와 같은 리간들의 결합 능력을 평가하기 위한 다른 표준 검정은 당업계에 알려져 있다. 폴리펩티드의 결합 동역학(예를 들어 결합 친화성)은 또한 Biacore™ 시스템 분석에 의해서와 같이 당업계에 알려진 표준 검정에 의해 평가될 수 있다.
표적에 대한 폴리펩티드의 결합을 또 다른 폴리펩티드와 같은 해당 표적의 또 다른 알려진 리간드에 의한 표적의 결합과 비교하는 경쟁적 결합 검정이 수행될 수 있다. 50% 억제가 발생하는 농도는 Ki로 알려져 있다. 이상적인 조건 하에, Ki는 Kd와 동등하다. Ki 값은 Kd보다 결코 작지 않을 것이므로, Ki의 측정은 Kd에 대한 상한을 제공하기 위해 편리하게 대체될 수 있다.
결합 친화성의 대안적인 측정치는 EC50 또는 IC50을 포함한다. 이러한 맥락에서 EC50은 폴리펩티드가 고정된 양의 표적에 대한 최대 결합의 50%를 달성하는 농도를 나타낸다. IC50은 폴리펩티드가 고정된 양의 표적에 대한 고정된 양의 경쟁자의 최대 결합의 50%를 억제하는 농도를 나타낸다. 두 경우, 낮은 수준의 EC50 또는 IC50은 표적에 대한 높은 친화성을 나타낸다. 표적에 대한 리간드의 EC50 및 IC50 값은 둘 다 잘 알려진 방법, 예를 들어 ELISA에 의해 결정될 수 있다. 폴리펩티드의 EC50 및 IC50을 평가하기에 적합한 검정은 실시예에 제시되어 있다.
언급된 바와 같이, 항체는 표준 기술에 의해, 예를 들어 적절한 (당)폴리펩티드 또는 이의 일부(들)로의 면역화에 의해, 또는 파지 디스플레이 라이브러리를 사용함으로써 생산될 수 있다.
폴리클로날 항체가 바람직한 경우, 선택된 포유동물(예를 들어 마우스, 토끼, 염소, 말 등)은 원하는 에피토프(들)를 보유하는 면역원성 폴리펩티드로 면역화되며, 임의적으로 또 다른 폴리펩티드에 합텐화된다. 숙주 종에 따라, 다양한 애쥬번트(adjuvant)가 면역학적 반응을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 이러한 애쥬번트는 프로인트(Freund's), 미네랄 겔 예컨대 수산화알루미늄, 및 표면 활성 물질 예컨대 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌, 및 디니트로페놀을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 면역화된 동물로부터의 혈청이 수집되고 알려진 절차에 따라 처리된다. 원하는 에피토프에 대한 폴리클로날 항체를 함유하는 혈청이 다른 항원에 대한 항체를 함유하는 경우, 폴리클로날 항체는 면역친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 폴리클로날 항혈청을 생산하고 처리하는 기술은 당업계에 잘 알려져 있다.
전체 폴리펩티드 또는 이의 특정 에피토프에 대해(예를 들어, 본 출원의 경우, US28의 ECD3에 대해) 지시된 모노클로날 항체는 또한 당업자에 의해 용이하게 생산될 수 있다. 하이브리도마에 의해 모노클로날 항체를 제조하기 위한 일반적인 방법론이 잘 알려져 있다. 불멸의 항체-생산 세포주는 세포 융합에 의해, B 림프구를 발암 DNA로 직접 형질전환, 또는 엡스타인-바 바이러스로 형질감염과 같은 다른 기술에 의해서도 생성될 수 있다. 상기 나열된 폴리펩티드에 대해 생산된 모노클로날 항체의 패널은 다양한 특성; 즉 이소형 및 에피토프 특이성 및/또는 친화성, 뿐만 아니라 균주 불가지론적 결합 특성에 대해 스크리닝될 수 있다. 모노클로날 항체는 배양 중인 연속 세포주에 의한 항체 분자의 생산을 제공하는 잘 알려진 기술 중 임의의 것을 사용하여 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, 항체가 모노클로날 항체인 경우가 바람직할 수 있다. 일부 상황에서, 특히 항체가 인간 환자에게 반복적으로 투여되는 경우, 모노클로날 항체가 인간 모노클로날 항체 또는 인간화 모노클로날 항체인 경우 바람직하며, 이는 투여된 면역글로불린에 대한 인간의 면역 반응을 일으키지 않고 인간에게 투여하기에 적합하다. 적합하게 제조된 비인간 항체는 알려진 방식으로 예를 들어 마우스 항체의 CDR 영역을 인간 항체의 프레임워크로 삽입함으로써 "인간화"될 수 있다. 인간화 항체는 Verhoeyen 등, (1988) Science, 239, 1534-1536, 및 Kettleborough 등, (1991) Protein Engineering, l4(7), 773-783에 기재된 기술 및 접근법을 사용하여 만들어질 수 있다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 대체된다. 일반적으로, 인간화 항체는 모든 또는 대부분의 CDR 영역이 비인간 면역글로불린의 것에 상응하는 가변 도메인, 및 실질적으로 또는 완전히 인간 면역글로불린 공통 서열의 것인 프레임워크 영역을 함유할 것이다.
완전히 인간 항체는 재조합 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 전형적으로, 수십 억개의 상이한 항체를 포함하는 큰 라이브러리가 사용된다. 예를 들어, 뮤린 항체의 키메라화 또는 면역화를 이용하는 이전 기술과 대조적으로, 이 기술은 특이적 항체를 생성하기 위해 동물의 면역화에 의존하지 않는다. 대신에 재조합 라이브러리는 라이브러리가 임의의 항원에 특이적인 적어도 하나의 항체를 가질 가능성이 있는 수많은 미리 만들어진 항체 변이체를 포함한다. 따라서, 이러한 라이브러리를 사용하여, 원하는 결합 특성을 갖는 기존 항체가 식별될 수 있다. 라이브러리에서 우수한 결합제를 효율적인 방식으로 찾기 위해, 표현형, 즉 항체 또는 이의 단편을 그의 유전자형, 즉 암호화 유전자(들)에 연결하는 다양한 시스템이 고안되었다. 가장 흔히 사용되는 이러한 시스템은 소위 파지 디스플레이 시스템이며 여기서 항체 단편은 디스플레이된 분자를 암호화하는 유전적 정보를 동시에 전달하면서, 사상 파지 입자 표면에서 파지 코트 단백질과의 융합으로 발현되고 디스플레이된다(McCafferty 등, 1990, Nature 348: 552-554). 특정 항원에 특이적인 파지 디스플레이 항체 단편은 해당 항원에 대한 결합을 통해 선택될 수 있다. 그런 다음 단리된 파지는 증폭될 수 있고 선택된 항체 가변 도메인을 암호화하는 유전자는 예를 들어 전장 면역글로불린과 같은 다른 항체 형식으로 전달되고, 당업계에 잘 알려진 적절한 벡터 및 숙주 세포를 사용하여 다량으로 발현될 수 있다. 대안적으로, "인간" 항체는 본질적으로, 인간 면역글로불린 유전자를 함유하는 유전자이식 마우스를 면역화함으로써 만들어질 수 있다(Vaughan 등, (1998) Nature Biotechnol. 16, 535-539).
항체가 비인간 개체에게 투여하기 위한 것인 경우, 항체는 의도된 수용자 종을 위해 특이적으로 설계/생산되었을 수 있음이 이해된다.
파지 입자에 대한 디스플레이된 항체 특이성의 형식은 상이할 수 있다. 가장 흔히 사용되는 형식은 Fab(Griffiths 등, 1994. EMBO J. 13: 3245-3260) 및 scFv(Hoogenboom 등, 1992, J Mol Biol. 227: 381-388)이며 둘 다 항체의 가변 항원 결합 도메인을 포함한다. 단일 쇄 형식은 유연한 링커를 통해 가변 경쇄 도메인(VL)에 연결된 가변 중쇄 도메인(VH)으로 구성된다(US 4,946,778). 치료제로서 사용하기 전에, 항체를 가용성 형식 예를 들어 Fab 또는 scFv로 전달하고 이와 같이 분석할 수 있다. 나중 단계에서 원하는 특성을 갖는 것으로 식별된 항체 단편은 전장 항체와 같은 또 다른 형식으로 전달될 수 있다.
WO　98/32845 및 Soderlind 등, (2000) Nature BioTechnol. 18: 852-856은 항체 라이브러리에서 가변성의 생성을 위한 기술을 기재한다. 이 라이브러리로부터 유래된 항체 단편은 모두 동일한 프레임워크 영역을 가지며 그들의 CDR에서만 상이하다. 프레임워크 영역은 생식선 서열의 것이므로 라이브러리로부터 유래된 항체의 면역원성, 또는 동일한 기술을 사용하여 생산된 유사한 라이브러리는 특히 낮을 것으로 예상된다(Soderlind 등, 2000, 상기). 이 특성은 치료적 항체에 대한 큰 가치가 있으며, 환자가 투여된 항체에 대한 항체를 형성할 위험을 줄여, 알레르기 반응의 위험, 차단 항체의 발생을 줄이고, 항체의 긴 혈장 반감기를 허용한다. 따라서, 인간에서 사용될 치료적 항체를 개발할 때, 현대의 재조합 라이브러리 기술(Soderlind 등, 2001, Comb. Chem. & High Throughput Screen. 4: 409-416)은 이제 초기 하이브리도마 기술보다 우선적으로 사용된다.
항체란 또한 낙타과 항체로부터 구조적으로 유래된 중쇄 항체, 예컨대 Nanobodies®(Ablynx)를 포함한다. 이들은 자연 발생 중쇄 항체의 구조적 및 기능적 특성을 함유하는 항체-유래 치료적 단백질이다. Nanobody® 기술은 낙타과(낙타 및 라마)가 경쇄가 없는 완전 기능적 항체를 보유한다는 발견 후에 개발되었다. 이들 중쇄 항체는 단일 가변 도메인(VHH) 및 2개의 불변 도메인(CH2 및 CH3)을 함유한다. 클로닝 및 단리된 VHH 도메인은 원래 중쇄 항체의 완전 항원 결합 능력을 보유하는 완벽하게 안정한 폴리펩티드이다. 고유한 구조적 및 기능적 특성을 갖는 이들 VHH 도메인은 Nanobodies®의 기초를 형성한다. 이들은 통상적인 항체의 이점(높은 표적 특이성, 높은 표적 친화성 및 낮은 고유한 독성)을 소분자 약물의 중요한 특징(효소를 억제하고 수용체 틈새에 접근하는 능력)과 조합한다. 또한, 이들은 안정하고, 주사 이외의 수단에 의해 투여될 가능성이 있고, 제조가 더 용이하고, 인간화될 수 있다. (예를 들어 US 5,840,526; US 5,874,541; US 6,005,079, US 6.765,087; EP 1 589 107; WO 97/34103; WO97/49805; US 5,800,988; US 5,874, 541 및 US 6,015,695 참조).
US28의 ECD3에 선택적으로 결합하는 항체, 또는 다른 결합 분자가 CCR5와 같은 관련 폴리펩티드에 결합하지 않거나, 항체가 CCR5와 같은 관련 폴리펩티드보다 더 큰 친화성으로 US28에 결합하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 항체는 관련 폴리펩티드보다 적어도 5 배, 또는 적어도 10 배, 또는 적어도 50 배 더 큰 친화성으로 US28에 결합한다. 보다 바람직하게는, 항체 분자는 관련 폴리펩티드보다 적어도 100 배, 또는 적어도 1,000 배, 또는 적어도 10,000 배 더 큰 친화성으로 US28에 결합한다. 이러한 결합은 Biacore® 시스템 중 하나와 같은 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 결정될 수 있다.
이중특이적 항체 및 다른 이중특이적 결합 분자
하나의 특정 관심 구현예에서, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자는 이중특이적 결합 분자이거나 이를 포함한다.
예를 들어, 본 발명의 제1 측면에 따른 이중특이적 결합 분자는 효과기 세포에 위치한 효과기 항원에 특이적으로 결합함으로써 효과기 세포의 활성을 모집할 수 있는 제1 도메인; 및 표적 항원으로서 HCMV-암호화된 US28 단백질의 ECD3에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 도메인을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 표적 항원은 효과기 세포 이외의 표적 세포에 위치할 수 있다. 제2 도메인은 본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자이거나 이를 포함한다.
제1 및 제2 도메인의 전부 또는 일부는 임의적으로 하나 이상의 링커 서열에 의해 연결될 수 있다. 제1 도메인은 다중 기능적 도메인을 포함할 수 있고 이러한 기능적 도메인 각각은 이웃 도메인에 직접적으로 또는 링커 서열을 통해 연결될 수 있고/있거나 하나 초과의 별개의 폴리펩티드 서열로부터 형성될 수 있다. 제2 도메인은 다중 기능적 도메인을 포함할 수 있고 이러한 기능적 도메인 각각은 이웃 도메인에 직접적으로 또는 링커 서열을 통해 연결될 수 있고/있거나 하나 초과의 별개의 폴리펩티드 서열로부터 형성될 수 있다.
하나 이상의 링커 서열이 본 발명의 이중특이적 결합 분자에 존재하는 경우에, 각각의 링커 서열은 독립적으로 임의의 적합한 링커 서열로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 각각의 링커 서열은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개, 또는 그 이상의 아미노산 잔기 길이일 수 있다. 각각의 링커 서열은 임의의 자연 발생 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 링커 서열은 아미노산 글리신 및 세린을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 또는 각각의 링커 서열은 (Gly4Ser)n과 같은 글리신 및 세린 반복부 세트를 포함하거나 이로 이루어질 수 있으며, 여기서 n은 1 이상, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6 이상의 양수이다. 하나의 구현예에서, 링커는 (Gly4Ser)3이다. 링커 길이의 변이는 활성을 유지 또는 향상시켜, 활성 연구에서 우수한 효능을 생성할 수 있다.
하나의 구현예에서, 이중특이적 결합 분자는 Suurs 등, 2019, Pharmacology & Therapeutics, 201: 103-119(이의 내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것과 같은 이중특이적 항체(bsAb) 형식이고, 특히 Suurs 등, 2019(상기)의 도 1c에 예시된 형식 중 하나 이상, 예컨대 TriMab, IgG-유사 BsAb, CrossMab, 2:1 CrossMab, 2:2 CrossMab, DuoBody, DVD-Ig BsAb, scFv-IgG, 및 IgG-IgG, Fab-scFv-Fc, TF, ADAPTIR, BiTE, BiTE-Fc, DART, DART-Fc, 4가 DART, TandAb, ImmTAC, TriKE, 및 scFv-scFv-scFv, 또는 삼중특이적 나노바디 형식이다.
하나의 구현예에서, 제1 및/또는 제2 도메인은 적어도 하나의 가변 경쇄 및/또는 적어도 하나의 가변 중쇄를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 제1 및/또는 제2 도메인은 scFv를 형성하기 위해 적어도 하나의 가변 경쇄 및 적어도 하나의 가변 중쇄를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 제1 및/또는 제2 도메인은 디아바디를 형성하기 위해 링커(예를 들어 작은 펩티드 링커)에 의해 연결된 scFv의 비공유 이량체를 포함한다. 하나의 구현예에서, 제1 및/또는 제2 도메인은 탠덤 디아바디(TandAb)를 형성하기 위해 다중 디아바디를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 제1 및/또는 제2 도메인은 적어도 하나의 불변 경쇄 및/또는 적어도 하나의 불변 중쇄를 추가로 포함하는 scFv를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제1 및/또는 제2 도메인은 Fab를 형성하기 위해 불변 경쇄 및 불변 중쇄를 추가로 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 제1 및/또는 제2 도메인은 다중 Fab(예를 들어, 2개의 Fab)를 포함한다.
하나의 구현예에서, 제1 및/또는 제2 도메인은 적어도 하나의 Fc를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 제1 및/또는 제2 도메인은 scFv-IgG를 형성하기 위해 Fc를 추가로 포함하는 scFv를 포함할 수 있다. 추가로, 또는 대안적으로, 제1 및/또는 제2 도메인은 IgG를 형성하기 위해 Fc를 추가로 포함하는 2개의 Fab 도메인을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 제1 도메인은 BiTE를 형성하기 위해 임의적으로 링커를 통해 scFv인 제2 도메인에 연결된 scFv일 수 있으며, 임의적으로 여기서 BiTE는 BiTE-Fc를 형성하기 위해 Fc를 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서, 제1 도메인의 VH 또는 VL은 각각 제2 도메인의 VH 또는 VL로 교체되어 제1 및 제2 도메인을 포함하는 DART를 형성할 수 있으며, 임의적으로 여기서 DART는 DART-Fc를 형성하기 위해 Fc를 추가로 포함한다. 추가로, 또는 대안적으로, 다중 DART는 4가 DART를 형성하기 위해 단일 Fc에 연결될 수 있다.
하나의 구현예에서, 제1 및/또는 제2 도메인은 T 세포 수용체의 형태이며, scFv의 형태인 제1 및/또는 제2 도메인과 조합하여 ImmTAC를 형성할 수 있다. 예를 들어, 제1 도메인은 scFv일 수 있고 제2 도메인은 T 세포 수용체일 수 있으며, 바람직하게는 여기서 scFv는 CD3의 에피토프(즉 CD3-결합 도메인)에 특이적이어서, ImmTAC를 초래한다.
하나의 구현예에서, 제1 도메인의 효과기 세포는 면역 효과기 세포, 예를 들어 T 세포(예를 들어, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포), NK T 세포, NK 세포, 대식세포, 또는 이의 임의의 재조합 세포(예를 들어, CAR-발현 세포, 예컨대 CAR-T 세포, CAR-NK 세포 또는 CAR-M 세포)로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 효과기 세포이다. 이러한 구현예에서, 이중특이적 결합 분자는 '이중특이적 면역 세포 관여 항체'로서 언급될 수 있으며, 여기서 "면역 세포"는 효과기 세포 유형을 대체할 수 있다. 예를 들어, 제1 도메인의 효과기 세포가 T 세포이면, 이러한 구현예는 '이중특이적 T 세포 관여 항체'(BiTE, Suurs 등, 2019, 상기의 도 1c에 제시된 BiTE 또는 BiTE-Fc 분자의 형식일 수 있지만 반드시 가지고 있는 것은 아님)로 언급될 수 있고, 제1 도메인의 효과기 세포가 NK 세포이면, 이러한 구현예는 '이중특이적 NK 세포 관여 항체' 등으로 언급될 수 있다.
하나의 구현예에서, 이중특이적 결합 분자의 제1 도메인은 CD3의 에피토프에 특이적이며, 이는 CD3-결합 도메인으로 언급될 수 있다.
하나의 구현예에서, CD3-결합 도메인은 예를 들어 본 출원의 서열번호: 48의 서열에 의해 정의된 바와 같은 OKT3 중쇄 가변 영역의 서열, 또는 서열번호: 48의 서열의 CD3-결합 특이성 및/또는 친화성을 실질적으로 보유하는 이의 기능적 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다. 이의 기능적 변이체 또는 단편은 임의적으로 서열번호: 48에 의해 정의된 바와 같은 OKT3 중쇄 가변 영역의 CDR 서열 중 임의의 1, 2, 또는 3개 모두에 상응하는 1, 2, 또는 3개의 CDR을 포함할 수 있다. OKT3 중쇄 가변 영역의 CDR 서열은 각각 서열번호: 49, 50 및 51, 및/또는 항체 OKT3의 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체에 의해 정의된 바와 같다.
또 다른 구현예에서, CD3-결합 도메인은 예를 들어 본 출원의 서열번호: 52의 서열에 의해 정의된 바와 같은 OKT3 경쇄 가변 영역의 서열, 또는 서열번호: 52의 서열의 CD3-결합 특이성 및/또는 친화성을 실질적으로 보유하는 이의 기능적 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다. 이의 기능적 변이체 또는 단편은 임의적으로 서열번호: 52에 의해 정의된 바와 같은 OKT3 경쇄 가변 영역의 CDR 서열 중 임의의 1, 2 또는 3개 모두에 상응하는 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함할 수 있다. OKT3 중쇄 가변 영역의 CDR 서열은 각각 서열번호: 53, 54 및 55, 및/또는 항체 OKT3의 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체에 의해 정의된 바와 같다.
또 다른 구현예에서, CD3-결합 도메인은 예를 들어 각각 본 출원의 서열번호: 48 및 52에 의해 정의된 바와 같은 OKT3 중쇄 가변 영역 및 OKT3 경쇄 가변 영역의 서열 둘 다, 또는 상기 기재된 바와 같은 기능적 변이체 또는 단편과 같은 어느 하나 또는 둘 다의 이의 기능적 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, CD3-결합 도메인은 예를 들어 임의적으로 서열 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호: 56)을 갖는 링커와 같은 링커에 의해 연결된 본 출원의 서열번호: 48 및 52의 서열에 의해 정의된 바와 같은 OKT3 중쇄 가변 영역 및 OKT3 경쇄 가변 영역의 서열을 둘 다 포함할 수 있다. 임의적으로 링커에 의해 연결된 OKT3 중쇄 가변 영역 및 OKT3 경쇄 가변 영역의 조합은 OKT3의 scFv를 형성할 수 있다.
따라서, CD3-결합 도메인은 순서대로 함께 연결된 서열번호: 48, 56 및 52의 서열을 포함하는 OKT3의 scFv일 수 있으며, 여기서 서열번호: 48의 OKT3 중쇄 가변 영역은 C-말단에서 서열번호: 56의 링커 서열의 N-말단에 연결되고, 차례로 C-말단에서 서열번호: 52의 OKT3 경쇄 가변 영역의 N-말단에 연결된다. 대안적으로, 경쇄 및 중쇄 영역의 순서는 대략 교환될 수 있어서, CD3-결합 도메인은 순서대로 함께 연결된 서열번호: 52, 56 및 48의 서열을 포함한다. 다른 링커 서열이 서열번호: 56의 예시적인 서열 대신에 사용될 수 있고; 다른 링커 서열이 임의적으로 서열 GGGGS(서열번호: 57)의 다중 반복을 포함할 수 있고, 따라서 서열 [GGGGS]n을 가질 수 있으며, 여기서 n은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10 또는 그 이상의 정수이거나; 임의의 다른 적합한 링커 서열을 함유할 수 있음이 이해될 것이다.
임의적으로, CD3-결합 도메인은 OKT3의 적어도 하나(바람직하게는 2개)의 scFv를 포함한다. 예를 들어, 이중특이적 결합 분자는 OKT3의 2개의 scFv를 포함하는 제1 도메인을 포함할 수 있으며, 임의적으로 여기서 2개의 scFv는 서로 직접적으로 연결되거나 제2 도메인을 통해 간접적으로 연결된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자를 포함하고 HCMV의 US28 단백질의 ECD3에 대한 결합 특이성을 갖는 이중특이적 결합 분자의 제2 도메인은 US28-발현 세포 및/또는 HCMV 감염된 세포(예를 들어, 잠복기 감염되거나 용해적으로 감염될 수 있음)인 표적 세포에 대한 결합 특이성을 갖는다.
하나의 구현예에서, 이중특이적 결합 분자의 제2 도메인은 다음 항체의 CDR 서열 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 모두에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 상보성 결정 영역(CDR):
(a) 각각 서열번호: 8, 9, 10, 14, 15 및 16에 의해 정의된 바와 같은 1D3;
(b) 각각 서열번호: 112, 113, 114, 117, 83 및 118에 의해 정의된 바와 같은 1C10;
(c) 각각 서열번호: 112, 113, 114, 117, 83 및 118에 의해 정의된 바와 같은 1A10;
(d) 각각 서열번호: 76, 77, 78, 82, 83 및 84에 의해 정의된 바와 같은 1G9; 및/또는
(e) 각각 서열번호: 76, 95, 96, 82, 99 및 100에 의해 정의된 바와 같은 1E8;
및/또는 항체 1D3, 1C10, 1A10, 1G9 및/또는 1E8의 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체를 포함한다.
임의적으로, 이 구현예에 따른 US28-결합 도메인은 다음을 포함할 수 있다:
(a) 하기 항체의 가변 중쇄(VH)의 CDR 1, 2, 및 3 서열 중 1, 2, 또는 3개 모두:
i. 각각 서열번호: 8, 9, 및 10에 의해 정의된 바와 같은 1D3;
ii. 각각 서열번호: 112, 113, 및 114에 의해 정의된 바와 같은 1C10(및/또는 상기 CDR 서열 중 임의의 1, 2 또는 3개의 기능적 변이체);
iii. 각각 서열번호: 112, 113, 및 114에 의해 정의된 바와 같은 1A10(및/또는 상기 CDR 서열 중 임의의 1, 2 또는 3개의 기능적 변이체);
iv. 각각 서열번호: 76, 77, 및 78에 의해 정의된 바와 같은 1G9(및/또는 상기 CDR 서열 중 임의의 1, 2 또는 3개의 기능적 변이체); 및/또는
v. 각각 서열번호: 76, 95, 및 96에 의해 정의된 바와 같은 1E8(및/또는 상기 CDR 서열 중 임의의 1, 2 또는 3개의 기능적 변이체);
및/또는
(b) 하기 항체의 가변 경쇄(VL)의 CDR 1, 2, 및 3 서열 중 1, 2, 또는 3개 모두:
i. 각각 서열번호: 14, 15, 및 16에 의해 정의된 바와 같은 1D3(및/또는 상기 CDR 서열 중 임의의 1, 2 또는 3개의 기능적 변이체);
ii. 각각 서열번호: 117, 83, 및 118에 의해 정의된 바와 같은 1C10(및/또는 상기 CDR 서열 중 임의의 1, 2 또는 3개의 기능적 변이체);
iii. 각각 서열번호: 117, 83, 및 118에 의해 정의된 바와 같은 1A10(및/또는 상기 CDR 서열 중 임의의 1, 2 또는 3개의 기능적 변이체);
iv. 각각 서열번호: 82, 83, 및 84에 의해 정의된 바와 같은 1G9(및/또는 상기 CDR 서열 중 임의의 1, 2 또는 3개의 기능적 변이체); 및/또는
v. 각각 서열번호: 82, 99, 및 100에 의해 정의된 바와 같은 1E8(및/또는 상기 CDR 서열 중 임의의 1, 2 또는 3개의 기능적 변이체).
바람직하게는, 이 구현예에 따른 US28-결합 도메인은 적어도 4개의 상이한 CDR 서열, 예를 들어 적어도 5 또는 6개의 상이한 CDR 서열을 포함한다.
추가로, 또는 대안적으로, 추가의 옵션에서 이 구현예에 따른 이중특이적 결합 분자의 제2 도메인은 (a) 각각 서열번호: 8, 9, 및 10의 서열을 갖는 CDR 1, 2, 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드, 및 임의적으로 여기서 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드는 서열번호: 12의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진, 것; 및/또는 (b) 각각 서열번호: 14, 15, 및 16의 서열을 갖는 CDR 1, 2 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드, 및 임의적으로 여기서 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드는 서열번호: 18의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것을 포함할 수 있다.
추가로, 또는 대안적으로, 추가의 옵션에서 이 구현예에 따른 이중특이적 결합 분자의 제2 도메인은 (a) 각각 서열번호: 76, 77, 및 78의 서열을 갖는 CDR 1, 2, 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드, 및 임의적으로 여기서 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드는 서열번호: 68의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것; 및/또는 (b) 각각 서열번호: 82, 83, 및 84의 서열을 갖는 CDR 1, 2 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드, 및 임의적으로 여기서 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드는 서열번호: 72의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것을 포함할 수 있다.
추가로, 또는 대안적으로, 추가의 옵션에서 이 구현예에 따른 이중특이적 결합 분자의 제2 도메인은 (a) 각각 서열번호: 76, 95, 및 96의 서열을 갖는 CDR 1, 2, 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드, 및 임의적으로 여기서 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드는 서열번호: 88의 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것; 및/또는 (b) 각각 서열번호: 82, 99, 및 100의 서열을 갖는 CDR 1, 2 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드, 및임의적으로 여기서 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드는 서열번호: 92의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것을 포함할 수 있다.
추가로, 또는 대안적으로, 추가의 옵션에서 이 구현예에 따른 이중특이적 결합 분자의 제2 도메인은 (a) 각각 서열번호: 112, 113, 및 114의 서열을 갖는 CDR 1, 2, 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드, 및 임의적으로 여기서 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드는 서열번호: 104의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것; 및/또는 (b) 각각 서열번호: 117, 83, 및 118의 서열을 갖는 CDR 1, 2 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드, 및 임의적으로 여기서 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드는 서열번호: 108의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 일어지거나, 이로 이루어진 것을 포함할 수 있다.
추가로, 또는 대안적으로, 추가의 옵션에서 이 구현예에 따른 이중특이적 결합 분자의 제2 도메인은 (a) 각각 서열번호: 112, 113, 및 114의 서열을 갖는 CDR 1, 2, 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드, 및 임의적으로 여기서 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드는 서열번호: 122의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것; 및/또는 (b) 각각 서열번호: 117, 83, 및 118의 서열을 갖는 CDR 1, 2 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드, 및 임의적으로 여기서 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드는 서열번호: 126의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것을 포함할 수 있다.
추가로, 또는 대안적으로, 추가의 옵션에서 이 구현예에 따른 이중특이적 결합 분자의 제2 도메인은 (a) 각각 서열번호: 138, 139, 및 140의 서열을 갖는 CDR 1, 2, 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드, 및 임의적으로 여기서 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드는 서열번호: 130의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것; 및/또는 (b) 각각 서열번호: 144, 145, 및 146의 서열을 갖는 CDR 1, 2 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드, 및 임의적으로 여기서 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드는 서열번호: 134의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 이중특이적 결합 분자의 제1 도메인은 OKT3의 6개의 CDR 서열을 모두 포함하는 scFv이고(바람직하게는 여기서 제1 도메인은 OKT3의 scFv임), 이중특이적 결합 분자의 제2 도메인은 1D3, 1C10, 1A10, 1G9 및/또는 1E8의 6개의 CDR 서열을 모두 포함하는 scFv이며(바람직하게는 여기서 제2 도메인은 1D3, 1C10, 1A10, 1G9 및/또는 1E8의 scFv임), 임의적으로 제1 및 제2 도메인은 링커를 통해 연결된다.
하나의 구현예에서, 이중특이적 결합 분자의 제1 도메인은 각각이 OKT3의 6개의 CDR 서열을 모두 포함하는 2개의 scFv이고(바람직하게는 여기서 제1 도메인은 OKT3의 2개의 scFv를 포함함); 이중특이적 결합 분자의 제2 도메인은 각각이 다음 항체의 CDR 서열 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 모두에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하는 2개의 Fab를 포함하고:
(a) 서열번호: 8, 9, 10, 14, 15 및 16에 의해 정의된 바와 같은 1D3(바람직하게는 여기서 제1 도메인은 1D3의 2개의 Fab를 포함함);
(b) 서열번호: 112, 113, 114, 117, 83 및 118에 의해 정의된 바와 같은 1C10(바람직하게는 여기서 제1 도메인은 1C10의 2개의 Fab를 포함함);
(c) 서열번호: 112, 113, 114, 117, 83 및 118에 의해 정의된 바와 같은 1A10(바람직하게는 여기서 제1 도메인은 1A10의 2개의 Fab를 포함함);
(d) 서열번호: 76, 77, 78, 82, 83 및 84에 의해 정의된 바와 같은 1G9(바람직하게는 여기서 제1 도메인은 1G9의 2개의 Fab를 포함함); 및/또는
(e) 서열번호: 76, 95, 96, 82, 99 및 100에 의해 정의된 바와 같은 1E8(바람직하게는 여기서 제1 도메인은 1E8의 2개의 Fab를 포함함);
Fc를 추가로 포함하며, 임의적으로 여기서 Fc는 인간 IgG의 Fc에 상응한다.
일부 구현예에서, 2개의 Fab는 동일하다. 일부 구현예에서, 2개의 Fab는 1D3, 1C10, 1A10, 1G9 및 1E8로 이루어진 군으로부터 선택된 상이한 항체에 상응한다.
하나의 특정 구현예에서, 이중특이적 결합 분자는 CD3-결합 OKT3 scFv 도메인 결합 영역을 갖는 BiTE이고, 1D3 항체의 서열을 갖는 US28 ECD3-결합 영역을 포함하고, 보다 구체적으로 바람직하게는 다음을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다:
(i) 1D3의 VH 영역, 임의적으로 하나 이상의 CH 서열(예컨대 CH1, CH2 및/또는 CH3 서열), 임의의 링커 서열, 및 OKT3 scFv의 서열을 포함하는 중쇄 서열, 예를 들어 서열번호: 58의 서열을 갖는 중쇄 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 제1 폴리펩티드 서열; 및
(ii) 1D3의 VL 영역, 및 임의적으로 CL 서열을 포함하는 경쇄 서열, 예를 들어 서열번호: 59의 서열을 갖는 경쇄 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 제2 폴리펩티드 서열.
또 다른 구현예에서, 1D3 항체의 서열은 1C10, 1A10, 1G9 및 1E8로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 상응하는 서열에 의해 BiTE에서 대체될 수 있다.
CAR/CAR T 세포 및 CAR을 재조합적으로 발현하는 다른 세포
면역요법-기반 치료는 키메라 항원 수용체(CAR)에 기반할 수 있다. CAR은 단일 분자에서, T 림프구 및 다른 면역 세포의 특이성 및 기능을 재지시하는 항원에 대한 재조합 수용체이다(Sadelain 등 2013 Cancer Discov 3(4): 388).
암 면역요법에서 이들의 사용에 대한 일반적인 전제는 능동 면역화의 장벽 및 증분 동역학을 우회하여 종양-표적화 T 세포를 빠르게 생성하는 것이다. 일단 T 세포에서 발현되면, CAR-변형된 T 세포는 초생리학적 특성을 획득하고 즉각적 및 장기적 효과를 모두 발휘할 수 있는 "살아있는 약물"로서 작용한다. CAR을 T 세포로 조작하려면 T 세포를 배양하여 형질도입 및 확장을 허용하는 것이 필요하다. 형질도입은 다양한 방법을 활용할 수 있지만, 클론 확장 및 지속된 T 세포에서 지속적인 CAR 발현을 가능하게 하기 위한 안정한 유전자 전달이 필요하다.
원칙적으로, 임의의 세포 표면 분자는 CAR을 통해 표적되어, T 세포 반응성 범위를 제한하는 생리학적 T 세포 레퍼토리에서 자기-항원에 대한 내성 및 항원 인식 격차를 우선할 수 있다.
다양한 T 세포 하위세트, 뿐만 아니라 T 세포 전구체 및 다른 면역 세포 예컨대 자연 살해 세포는 CAR로 표적될 수 있다.
T 세포와 같은 CAR 조작된 세포를 사용한 입양 면역요법은 암 치료의 유망한 접근법이다(Han 등 2013 J Hematol Oncol 6: 47). 지난 수십 년 동안 이루어진 상당한 진전은 보다 효율적인 항종양 면역요법의 개발에 기여하였다. 예를 들어, 종양 항원 특이적 항체의 단일 쇄 가변 단편(scFv) 및 T 세포 수용체의 신호전달 도메인의 혼입은 항체의 특이성 및 세포독성 T 림프구의 세포독성을 갖는 CAR을 제공한다. CAR은 MHC 독립적 방식으로 T 세포 항원 특이적 인식, 활성화 및 증식을 부여한다. 또한, CAR은 암 세포가 면역인식을 피하는 것을 통해 많은 매커니즘을 우회한다. 이들 메커니즘은 MHC의 하향 조절, 공자극 분자의 발현 감소, 억제성 사이토카인 유도 및 조절 T 세포 모집을 포함한다. 이러한 유익한 효과 외에도, CAR의 기술적 실현가능성은 입양 면역요법의 개발에서 이들을 보다 더 매력적으로 만든다. 전임상 및 임상 연구로부터의 관찰은 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 흑색종 및 신경모세포종을 포함한 다양한 암에서 CAR-매개 면역요법의 매우 고무적인 치료적 효능을 입증하였다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자는 CAR, 예를 들어 다음을 포함하는 CAR일 수 있으며:
(i) 상기 정의된 바와 같은 결합 분자(예컨대 항체), 또는 상기 결합 분자의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진, 세포외 도메인;
(ii) 막관통 도메인; 및
(iii) 세포내 도메인;
여기서 CAR의 세포외 도메인은 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 US28 단백질의 세포외 도메인 3(ECD3) 내의 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖고,
여기서 US28 단백질의 ECD3은 서열번호: 5에 제시된 바와 같은 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)에 의해 암호화된 US28 단백질의 위치 167 내지 183에 상응하는 위치에서 US28 단백질에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
임의적으로:
(a) CAR의 세포외 도메인은 HCMV의 US28 단백질의 세포외 도메인 3(ECD3) 내에 완전히 존재하는 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖고/갖거나;
(b) CAR의 세포외 도메인은 US28 단백질의 ECD3 내의 선형 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖고/갖거나;
(c) CAR의 세포외 도메인은 HCMV 균주 불가지론적인 US28 단백질의 ECD3 내의 에피토프에 대한 결합 특이성, 예를 들어, DB, Towne, AD169, BL, DAVIS, JP, Merlin, PH, TB40/E, Toledo, TR, VHL/E 및 VR1814(FIX)로 이루어진 군으로부터 선택된 HCMV 균주 중 2개 이상(예컨대 모두)에 불가지론적인 HCMV의 US28 단백질의 ECD3 내의 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖고/갖거나;
(d) US28 단백질의 ECD3이 다음 서열을 포함하는지 여부에 관계없이, CAR의 세포외 도메인은 HCMV의 US28 단백질의 ECD3 내의 에피토프에 대한 특이성을 갖는다:
- 다수의 HCMV 균주에 의해 암호화된 바와 같은 US28의 ECD3에서 발견된 TKKDNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 7), 또는
- 소수의 HCMV 균주에 의해 암호화된 바와 같은 US28의 ECD3에서 발견된 TKKNNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 6).
하나의 바람직한 구현예에서, CAR의 세포외 도메인은 다음 항체의 CDR 서열 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 모두에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함할 수 있다:
(a) 각각 서열번호: 8, 9, 10, 14, 15 및 16에 의해 정의된 바와 같은 1D3, 및/또는 항체 1D3의 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체;
(b) 각각 서열번호: 112, 113, 114, 117, 83 및 118에 의해 정의된 바와 같은 1C10, 및/또는 항체 1C10의 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체;
(c) 각각 서열번호: 112, 113, 114, 117, 83 및 118에 의해 정의된 바와 같은 1A10, 및/또는 항체 1A10의 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체;
(d) 각각 서열번호: 76, 77, 78, 82, 83 및 84에 의해 정의된 바와 같은 1G9, 및/또는 항체 1G9의 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체; 및/또는
(e) 각각 서열번호: 76, 95, 96, 82, 99 및 100에 의해 정의된 바와 같은 1E8, 및/또는 항체 1E8의 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체.
추가로, 또는 대안적으로, CAR의 세포외 도메인은 다음을 포함할 수 있다:
(a) 하기 항체의 가변 중쇄(VH)의 CDR 1, 2, 및 3 서열 중 1, 2, 또는 3개 모두:
i. 각각 서열번호: 8, 9, 및 10에 의해 정의된 바와 같은 1D3(또는 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체);
ii. 각각 서열번호: 112, 113, 및 114에 의해 정의된 바와 같은 1C10(또는 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체);
iii. 각각 서열번호: 112, 113, 및 114에 의해 정의된 바와 같은 1A10(또는 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체);
iv. 각각 서열번호: 76, 77, 및 78에 의해 정의된 바와 같은 1G9(또는 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체); 및/또는
v. 각각 서열번호: 76, 95, 및 96에 의해 정의된 바와 같은 1E8(또는 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체);
및/또는
(b) 하기 항체의 가변 경쇄(VL)의 CDR 1, 2, 및 3 서열 중 1, 2, 또는 3개 모두:
i. 각각 서열번호: 14, 15, 및 16에 의해 정의된 바와 같은 1D3(또는 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체);
ii. 각각 서열번호: 117, 83, 및 118에 의해 정의된 바와 같은 1C10(또는 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체);
iii. 각각 서열번호: 117, 83, 및 118에 의해 정의된 바와 같은 1A10(또는 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체);
iv. 각각 서열번호: 82, 83, 및 84에 의해 정의된 바와 같은 1G9(또는 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체);
v. 각각 서열번호: 82, 99, 및 100에 의해 정의된 바와 같은 1E8(또는 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체).
추가로, 또는 대안적으로, CAR의 세포외 도메인은 다음을 포함할 수 있다:
(a) 하기 서열을 갖는 CDR 1, 2, 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드 서열:
i. 각각 서열번호: 8, 9, 및 10(또는 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체), 및 임의적으로 여기서 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드 서열은 서열번호: 12의 서열(또는 이의 기능적 변이체)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것;
ii. 각각 서열번호: 112, 113, 및 114(또는 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체), 및 임의적으로 여기서 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드 서열은 서열번호: 104의 서열(또는 이의 기능적 변이체)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것;
iii. 각각 서열번호: 112, 113, 및 114(또는 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체), 및 임의적으로 여기서 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드 서열은 서열번호: 122의 서열(또는 이의 기능적 변이체)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것;
iv. 각각 서열번호: 76, 77, 및 78(또는 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체), 및 임의적으로 여기서 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드 서열은 서열번호: 68의 서열(또는 이의 기능적 변이체)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것; 및/또는
v. 각각 서열번호: 76, 95, 및 96(또는 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체), 및 임의적으로 여기서 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드 서열은 서열번호: 88의 서열(또는 이의 기능적 변이체)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것;
및/또는
(b) 하기의 서열을 갖는 CDR 1, 2 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드 서열:
i. 각각 서열번호: 14, 15, 및 16(또는 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체), 및 임의적으로 여기서 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드는 서열번호: 18의 서열(또는 이의 기능적 변이체)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것;
ii. 각각 서열번호: 117, 83, 및 118(또는 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체), 및 임의적으로 여기서 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드 서열은 서열번호: 108의 서열(또는 이의 기능적 변이체)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것;
iii. 각각 서열번호: 117, 83, 및 118(또는 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체), 및 임의적으로 여기서 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드 서열은 서열번호: 126의 서열(또는 이의 기능적 변이체)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것;
iv. 각각 서열번호: 82, 83, 및 84(또는 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체), 및 임의적으로 여기서 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드 서열은 서열번호: 72의 서열(또는 이의 기능적 변이체)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것; 및/또는
v. 각각 서열번호: 82, 99, 및 100(또는 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체), 및 임의적으로 여기서 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드 서열은 서열번호: 92의 서열(또는 이의 기능적 변이체)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것.
서열번호: 12, 18, 68, 72, 88, 92, 104, 108, 122 또는 126으로부터 선택된 참조 서열의 기능적 변이체는 임의적으로 정의된 참조에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%. 98% 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있고, 보다 일반적으로 정의된 아미노산 서열에 대해 95-99% 서열 동일성(예를 들어 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성)을 갖는다. 변이는 가변 중쇄 또는 경쇄의 기능적 변이체의 서열의 비-CDR 영역 내에서만, 서열의 CDR 영역 내에서만, 또는 서열의 비-CDR 및 CDR 영역 둘 다 내에서 있을 수 있다. 변이가 기능적 변이체의 CDR 영역에 포함된다면, 변이는 중쇄 가변 영역, 또는 경쇄 가변 영역의 각각 1개의 CDR, 2개의 CDR, 또는 3개의 CDR 내에 있을 수 있음이 이해될 것이다. 전형적으로, 변이는 CDR 영역의 외부에 있다.
특정 구현예에서, CAR의 세포외 도메인은 항체, 임의적으로 인간화 항체, 예를 들어 단일 쇄 가변 단편(scFv) 또는 이의 기능적 변이체의 서열이거나, 이를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어지며, 여기서 상기 항체 및 이의 기능적 변이체는 본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자이다.
scFv는 VL과 VH 영역 사이에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 아미노산 잔기의 링커를 포함할 수 있다. 링커는 임의의 자연 발생 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 아미노산 글리신 및 세린을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 링커 서열은 (Gly4Ser)n과 같은 글리신 및 세린 반복부의 세트를 포함하며, 여기서 n은 1 이상, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6 이상의 양수이다. 하나의 구현예에서, 링커는 (Gly4Ser)3이다. 링커 길이의 변이는 활성을 유지하거나 향상시켜, 활성 연구에서 우수한 효능을 생성할 수 있다.
scFv의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은 예를 들어, 다음 배향 중 임의의 것일 수 있다: 경쇄 가변 영역-링커-중쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역-링커-경쇄 가변 영역.
본원에 기재된 바와 같은 CAR은 막관통 도메인을 포함한다. 막관통 도메인이란 지질 막에 내장될 수 있는 임의의 모이어티의 의미를 포함한다. 지질 막에 내장되는이란 지질 막을 구성하는 지질의 소수성 부분과 호의적으로 상호작용하는 막관통 도메인의 의미를 포함한다. 지질 막으로 삽입은 형광 현미경 검사를 사용한 형광 표지화를 포함하는 당업계에 알려진 임의의 적합한 방법을 사용하여 검정될 수 있다. 따라서, 막관통 도메인은 CAR 분자를 지질 막 내에 위치시키는 것임이 이해될 것이다.
임의적으로, 막관통 도메인은 단백질(예를 들어 막관통 단백질)의 막관통 도메인, 예를 들어 막관통 수용체 단백질의 막관통 도메인을 포함한다. 구현예에서, 막관통 도메인은 CAR의 다른 도메인 중 하나와 연관된 것이다. 구현예에서, 막관통 도메인은 세포내 신호전달 도메인의 적어도 일부를 구성하는 세포내 신호전달 단백질의 막관통 부분을 포함한다. 일부 경우에, 막관통 도메인은 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 대한 이러한 도메인의 결합을 피하기 위해, 예를 들어 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형될 수 있다. 일부 경우에, 막관통 도메인은 세포 표면 상의 또 다른 CAR과 동종이량체화할 수 있다.
막관통 도메인은 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 도메인은 임의의 막 결합된 단백질 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 하나의 구현예에서, 막관통 도메인은 CAR이 표적에 결합할때마다 세포내 도메인(들)에 신호전달할 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 막관통 도메인은 T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD8, CD45 및 CD4의 막관통 영역(들)을 포함할 수 있다.
막관통 도메인은 예를 들어, 막관통 도메인이 유래된 단백질의 세포외 영역과 연관된 하나 이상의 아미노산(예를 들어 세포외 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 최대 15개의 아미노산) 및/또는 막관통 단백질이 유래된 단백질의 세포내 영역과 연관된 하나 이상의 추가 아미노산(예를 들어 세포내 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 최대 15개의 아미노산)과 같은 막관통 영역에 인접한 하나 이상의 추가 아미노산을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, CAR의 세포외 도메인은 힌지 영역에 의해 막관통 도메인에 연결된다. 힌지 영역은 하나 이상의 면역글로불린 도메인을 포함할 수 있다. 특정 예는 IgG1의 Fc 영역 및 CD4 및 CD8의 면역글로불린-유사 세포외 영역을 포함한다. US28에 선택적으로 결합하는 항체가 scFv 분자일 때, 힌지 영역이 US28에 대한 결합에 영향을 미치지 않고 막관통 도메인에 부착하도록 scFv의 도달을 확장하기 위해 사용됨이 이해될 것이다. 힌지는 인간 면역글로불린과 같은 인간 단백질로부터 유래될 수 있다. 힌지 영역은 예를 들어, CD8α 힌지 영역일 수 있다(예를 들어, An 등, 2016, Oncotarget, 7:10638-10649에 기재된 바와 같으며, 이의 내용은 본원에 참조로 포함됨).
전형적으로, 막관통 도메인은 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 아미노산 잔기를 포함한다.
구현예에서, 2 내지 10개의 아미노산 길이와 같은 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커는 막관통 도메인과 CAR의 세포내 신호전달 도메인 사이에 결합을 형성할 수 있다. 링커는 예를 들어, 글리신 및/또는 세린 잔기를 포함할 수 있다. 적합한 링커의 예는 글리신-세린 이중항이다.
세포내 신호전달 도메인이란 면역 세포(예를 들어 T 세포)의 정상 효과기 기능 중 적어도 하나와 같은 CAR이 도입된 세포의 정상 기능 중 적어도 하나를 활성화할 수 있는 도메인의 의미를 포함한다. 효과기 기능은 세포의 특화된 기능을 지칭한다. 예를 들어, T 세포의 효과기 기능은 사이토카인의 분비를 포함하는 세포용해 기능 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 따라서, 세포내 신호전달 도메인은 효과기 기능 신호를 전달하고 세포(예를 들어 T 세포)가 특화된 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 일부일 수 있다.
일반적으로, 전체 세포내 신호전달 도메인이 사용될 수 있지만; 사용되는 신호전달 도메인의 어떤 부분이 여전히 효과기 기능 신호를 전달할 수 있다면, 반드시 전체 도메인을 사용하지 않음이 이해된다. 또한 실질적으로 동일하거나 더 큰 기능적 능력을 갖는 이러한 세포내 신호전달 도메인의 변이체가 또한 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 이것은 변이체가 효과기 기능 신호의 실질적으로 동일하거나 더 큰 전달을 가져야 한다는 의미를 포함한다. 전형적으로, 실질적으로 동일하거나 더 큰 신호 전달은 비변형된 세포내 신호전달 도메인의 신호 전달의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 105%, 110%, 115%, 또는 120%, 또는 그 이상을 포함하며, 여기서 비변형된 세포내 신호전달 도메인의 전달은 100%에 상응한다.
효과기 기능 신호의 전달을 평가하는 방법은 당업장에게 잘 알려져 있고 예를 들어, 전달된 신호를 나타내는 분자(예를 들어 사이토카인과 같은 단백질)의 양 및/또는 활성을 평가하는 것을 포함한다. 따라서, 신호가 T-세포의 세포용해 기능인 경우, 방법은 사이토카인이 세포용해 활성을 갖는 것으로 알려진, T-세포에 의해 분비되는 하나 이상의 사이토카인의 측정(예를 들어 IFN 감마), 및 표적 세포 용해의 후속 측정을 수반할 수 있다.
본 발명의 CAR에 사용하기 위한 세포내 신호전달 도메인의 예는 T 세포 수용체(TCR) 및 항원 수용체 결속 후 신호 전달을 개시하기 위해 함께 작용하는 공수용체의 세포질 서열, 뿐만 아니라 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 재조합 서열을 포함한다.
TCR 단독을 통해 생성된 신호가 일반적으로 T 세포의 완전 활성화에 불충분하고 2차 및/또는 공자극 신호가 또한 필요할 수 있다는 것이 알려져 있다. 따라서, T 세포 활성화는 세포내 신호전달 서열의 2개의 별개의 부류에 의해 매개된다고 말할 수 있다: TCR을 통해 항원-의존적 1차 활성화를 개시하는 것(1차 세포내 신호전달 도메인) 및 2차 또는 공자극 신호를 제공하기 위해 항원-독립적 방식으로 작용하는 것(2차 세포내 신호전달 도메인, 예컨대 공자극 도메인). 공자극 도메인은 효과기 기능의 활성화를 촉진하고 또한 효과기 기능의 지속성 및/또는 세포의 생존을 촉진할 수 있다.
1차 세포내 신호전달 도메인은 자극 방식, 또는 억제 방식으로 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM(예를 들어 2, 3, 4, 5개 이상의 ITAM)으로 알려진 신호전달 모티프를 함유할 수 있다. 따라서, 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 ITAM을 포함할 수 있다. 본 발명에서 특히 사용하기 위한 ITAM 함유 1차 세포내 신호전달 도메인의 예는 CD3 제타, Fc 수용체 감마, Fc 수용체 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d의 것을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 CAR은 CD3-제타의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
세포내 신호전달 도메인의 하나 이상의 ITAM은 예를 들어 돌연변이에 의해 변형될 수 있음이 이해될 것이다. 변형은 천연 ITAM 도메인과 비교하여 ITAM의 신호전달 기능을 증가 또는 감소시키는 데 사용될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 세포내 신호전달 도메인은 1차 세포내 신호전달 도메인을 그 자체로 포함할 수 있거나, 하나 이상의 공자극 신호전달 도메인과 같은 하나 이상의 2차 세포내 신호전달 도메인과 조합하여 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 따라서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타 신호전달 도메인을 그 자체로 포함할 수 있거나 하나 이상의 공자극 신호전달 도메인과 같은 하나 이상의 다른 세포내 신호전달 도메인과 조합하여 포함할 수 있다.
공자극 신호전달 도메인은 공자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 일부를 지칭한다. 공자극 분자는 항원에 대한 면역 세포(예를 들어 림프구)의 효율적인 반응에 필요한 항원 수용체 또는 그의 리간드 이외의 세포 표면 분자일 수 있다. 이러한 분자의 예는 CD28, 4-1BB(CD137), OX40, ICOS, DAP10, CD27, CD30, CD40, PD1, ICOS, 림프구 기능 연관 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다. 예를 들어, CD27 공자극은 시험관내에서 인간 CAR T 세포의 확장, 효과기 기능, 및 생존을 향상시키고 생체내에서 인간 T 세포 지속성 및 항종양 활성을 증가시키는 것으로 입증되었다(Song 등, Blood. 2012, 119(3):696-706).
본 발명의 CAR의 세포내 부분 내의 세포내 신호전달 서열은 무작위 또는 특정 순서로 서로 연결될 수 있다. 임의적으로, 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커, 예를 들어, 2 내지 10개의 아미노산(예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산) 길이는 세포내 신호전달 서열 사이에 결합을 형성할 수 있다. 하나의 구현예에서, 글리신-세린 이중항이 적합한 링커로서 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 알라닌 또는 글리신과 같은 단일 아미노산이 적합한 링커로서 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 2개 이상, 예를 들어 3, 4, 5개, 또는 그 이상의 공자극 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 구현예에서, 2개 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5개, 또는 그 이상의 공자극 신호전달 도메인은 본원에 기재된 것과 같은 링커 분자에 의해 분리된다. 하나의 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 2개의 공자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커 분자는 글리신 잔기이다. 일부 구현예에서, 링커는 알라닌 잔기이다.
바람직한 구현예에서, CAR의 세포내 부분은 CD3 제타의 신호전달 도메인 및 CD28의 신호전달 도메인을 포함한다.
또 다른 구현예에서, CAR의 세포내 부분은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함한다.
또 다른 구현예에서, CAR의 세포내 부분은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 OX40의 신호전달 도메인을 포함한다.
또 다른 구현예에서, CAR의 세포내 부분은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 ICOS의 신호전달 도메인을 포함한다.
또 다른 구현예에서, CAR의 세포내 부분은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 DAP10의 신호전달 도메인을 포함한다.
또 다른 구현예에서, CAR의 세포내 부분은 CD3-제타의 신호전달 도메인, 4-1BB의 신호전달 도메인 및 OX40의 신호전달 도메인을 포함한다.
CAR의 다른 임의적 구성요소
구현예에서, CAR은 리더 서열을 추가로 포함할 수 있다. "리더 서열"이란 CAR을 세포 막으로 지시할 수 있는 펩티드 서열의 의미를 포함한다. 따라서, CAR이 키메라 융합 단백질인 경우, 아미노-말단(N-말단)에 리더 서열을 함유할 수 있다. 임의적으로, 리더 서열은 세포 처리 및 세포 막에 CAR의 국소화 동안 CAR로부터 절단된다.
추가의 구현예에서, CAR은 유도성 자살 모이어티를 포함할 수 있다. 유도성 자살 모이어티란 CAR이 상주하는 세포 막의 세포(예를 들어 T 세포)의 사멸을 야기하는 유도 능력을 보유하는 분자의 의미를 포함한다. 이 방식으로, CAR이 대상체에 미치는 영향은 이를 포함하는 세포의 선택적 결실을 통해 엄격하게 제어될 수 있다. 편리하게는, 자살 모이어티는 직접적으로 또는 간접적으로 세포독성이 있는 항체의 에피토프를 포함한다. 직접적으로 세포독성이 있는 항체는 CD20에 결합하는 리툭시맙(Rituximab)과 같은 용해성 항체를 포함한다. 따라서, 하나의 구현예에서, CAR은 CD20 에피토프를 포함할 수 있다. 항체는 또한 하나 이상의 세포독성 모이어티에 접합됨으로써 간접적으로 세포독성이 있을 수 있다.
하나의 바람직한 구현예에서, CAR은 (i) US28 폴리펩티드의 ECD3에 선택적으로 결합하는 본 발명의 제1 측면에 따른 항체를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 세포외 도메인(예를 들어 scFv 단편); (ii) 막관통 도메인, 및 (iii) 세포내 신호전달 도메인(예를 들어 1차 신호전달 도메인 예컨대 CD3 제타, 및 임의적으로 하나 이상의 공자극 도메인 예컨대 CD28, 4-1BB, OX40, ICOS 및 DAP10을 포함하는 세포내 신호전달 도메인)을 포함한다.
융합 폴리펩티드:
추가의 옵션에서, 본 발명의 제1 측면에 의해 정의된 바와 같은 결합 분자는 융합 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 융합 폴리펩티드 서열은 제2 아미노산 서열에 융합된 제1 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 제1 아미노산 서열은 결합 분자 또는 이의 기능적 단편의 폴리펩티드 쇄 중 적어도 하나를 포함하거나 이로 이루어지고, 제2 아미노산 서열은 융합 파트너이다.
임의의 관심 융합 파트너가 선택될 수 있다. 당업자는 당업계에 알려진 융합 파트너 서열을 잘 알고 있으며, 임의의 것이 선택될 수 있다. 융합 파트너는 예를 들어, 추가의 또는 대안적인 결합 특성을 제공할 수 있고/있거나; 결합 분자의 결합 부위에서 효과를 생성하는 효과기 부분을 제공할 수 있고/있거나(예는 면역 반응을 증폭시키거나 결합 분자에 의해 결합된 임의의 세포에 직접 손상을 유도할 수 있는 서열, 예를 들어 세포독성 서열을 포함함); 결합 분자의 순환 반감기의 조절(예컨대 증가 또는 감소)을 제공할 수 있고/있거나; 결합 분자의 포획, 회수 또는 정제를 용이하게 하는 서열을 제공할 수 있고/있거나; 결합 분자의 검출을 용이하게 하는 서열을 제공할 수 있다.
접합체:
본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자는 항체 접합체와 같은 접합체를 형성하기 위한 적어도 하나의 제제를 포함하고/하거나 이에 연결될 수 있다. 상기 제제는 임의적으로 소분자 약물 또는 다른 제제와 같은 비-단백질성일 수 있으며, 이는 예를 들어, 저분자량(< 900 달톤) 유기 화합물일 수 있다.
진단제 또는 치료제로서 항체 분자, 및 다른 결합제의 효능을 증가시키기 위해, 적어도 하나의 원하는 분자 또는 모이어티를 연결하거나 공유적으로 결합하거나 복합체화하는 것이 통상적이다. 이러한 분자 또는 모이어티는 적어도 하나의 효과기 또는 리포터 분자일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 효과기 분자는 원하는 활성을 갖는 분자, 예를 들어, 약물, 세포독성제, 면역억제제, 항염증제 등을 포함할 수 있다. 이러한 분자는 임의적으로 분자가 표적 부위 또는 근처에 방출되도록 설계된 절단가능한 링커를 통해 항체 분자, 또는 다른 결합제에 부착될 수 있다.
상기 원하는 분자 또는 모이어티는 임의적으로 세포외 환경에서 선택적으로 활성이거나 세포내 환경에서 선택적으로 활성일 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, US28은 GCPR이며, 원형질막으로 트래피킹은 결합 분자로의 직접 표적화 및 구성적이거나 리간드 결합의 결과로서 발생하는 세포내이입으로 인한 페이로드의 수송체로서 용도를 모두 허용한다. GCPR은 일반적으로 승인된 약물에 의해 표적화된 가장 큰 단백질 패밀리를 구성한다(Sriram & Insel, Mol Pharmacol, 2018, 93(4): 251-258). 따라서, US28의 ECD3에 대한 결합 특이성을 갖는 본 발명의 결합 분자는 US28-발현 세포(특히, HCMV-감염된 세포)에 의해, 본 발명의 결합 분자에 대한 상기 하나 이상의 원하는 분자 또는 모이어티의 접합에 의해 세포내 환경에서 선택적으로 활성인 원하는 분자 또는 모이어티와 같은 하나 이상의 원하는 분자 또는 모이어티의 내재화를 야기하는 데 사용될 수 있다.
대조적으로, 리포터 분자는 검정을 사용하여 검출될 수 있는 임의의 모이어티로서 정의된다. 항체, 및 다른 결합제에 접합된 리포터 분자의 비제한적인 예는 효소, 방사성 표지, 합텐, 형광 표지, 인광 분자, 화학발광 분자, 발색단, 광친화성 분자, 유색 입자 또는 리간드, 예컨대 비오틴을 포함한다.
이러한 접합체는 통상적으로 진단제로서 사용하기 위한 것이다. 이들 진단제는 일반적으로 다양한 면역검정 및/또는 면역조직화학(IHC)에서와 같은 시험관내 진단제에 사용하기 위한 것, 및 일반적으로 "항체-유도 영상화"로 알려진 생체내 진단 프로토콜에 사용하기 위한 것의 2가지 부류에 속한다. 항체 및 다른 이러한 결합 분자에 대한 부착 방법과 같은 많은 적절한 영상화제가 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 5,021,236, 4,938,948, 및 4,472,509 참조). 사용되는 영상화 모이어티는 상자성 이온, 방사성 동위원소, 형광색소, NMR-검출가능한 물질, 및 X선 영상화제일 수 있다.
상자성 이온의 경우, 크롬(III), 망간(II), 철(III), 철(II), 코발트(II), 니켈(II), 구리(II), 네오디뮴(III), 사마륨(III), 이테르븀(III), 가돌리늄(III), 바나듐(II), 테르븀(III), 디스프로슘(III), 홀뮴(III) 및/또는 에르븀(III)과 같은 이온이 예로서 언급될 수 있으며, 가돌리늄이 특히 바람직하다. X선 영상화와 같은 다른 맥락에서 유용한 이온은 란타늄(III), 금(III), 납(II), 및 특히 비스무트(III)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
치료적 및/또는 진단적 적용을 위한 방사성 동위원소의 경우, 아스타틴211, 14탄소, 51크롬, 36염소, 57코발트, 58코발트, 구리67, 152Eu, 갈륨67, 3수소, 요오드123, 요오드125, 요오드131, 인듐111, 59철, 32인, 레늄186, 레늄188, 75셀레늄, 35황, 테크니슘99m 및/또는 이트륨90이 언급될 수 있다. 125I는 특정 구현예에서 사용하기에 종종 선호되고, 테크니슘99m 및/또는 인듐111은 또한 낮은 에너지 및 긴 검출 범위에 대한 적합성으로 인해 종종 선호된다. 방사성으로 표지된 모노클로날 항체는 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 생산될 수 있다. 예를 들면, 모노클로날 항체 및 다른 결합제는 요오드화나트륨 및/또는 요오드화칼륨 및 하이포아염소산나트륨과 같은 화학적 산화제, 또는 락토퍼옥시다제와 같은 효소적 산화제와 의 접촉에 의해 요오드화될 수 있다. 모노클로날 항체 및 다른 결합제는 리간드 교환 공정에 의해, 예를 들어, 주석 용액으로 퍼테크네이트를 환원시키고, 환원된 테크네튬을 세파덱스(Sephadex) 컬럼으로 킬레이트화하고 항체를 이 컬럼에 적용함으로써 테크네튬99m으로 표지될 수 있다. 대안적으로, 직접 표지화 기술은 예를 들어, 퍼테크네이트, SNCl2와 같은 환원제, 나트륨-칼륨 프탈레이트 용액과 같은 완충액, 및 항체를 인큐베이션함으로써 사용될 수 있다. 중간 작용기는 종종 방사성 동위원소를 항체, 또는 다른 결합제에 결합시키는 데 사용되고, 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA) 또는 에틸렌 디아민테트라아세트산(EDTA)이 금속성 이온으로 존재한다.
접합체로서 사용하기 위해 고려되는 형광 표지 중에는 Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, 캐스캐이드 블루(Cascade Blue), Cy3, Cy5,6-FAM, 플루오레세인 이소티오시아네이트, HEX, 6-JOE, 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린 500, 오레곤 그린 514, 퍼시픽 블루(Pacific Blue), REG, 로다민 그린(Rhodamine Green), 로다민 레드(Rhodamine Red), 레노그라핀(Renographin), ROX, TAMRA, TET, 테트라메틸로다민, 및/또는 텍사스 레드(Texas Red)를 포함한다.
고려되는 또 다른 유형의 접합체는 항체, 또는 다른 결합 분자가 발색 기질과 접촉 시 유색 생성물을 생성하는 2차 결합 리간드 및/또는 효소(효소 태그)에 연결되는 경우, 시험관내 사용이 주로 의도되는 것들이다. 적합한 효소의 예는 우레아제, 알칼리 포스파타제, (서양고추냉이) 수소 퍼옥시다제 또는 글루코스 옥시다제를 포함한다. 바람직한 2차 결합 리간드는 비오틴 및 아비딘 및 스트렙타비딘 화합물이다. 이러한 표지의 사용은 당업자에게 잘 알려져 있고, 예를 들어, 미국 특허 3,817,837, 3,850,752, 3,939,350, 3,996,345, 4,277,437, 4,275,149 및 4,366,241에 기재되어 있다.
항체, 또는 다른 결합 분자를 그의 접합체 모이어티에 부착 또는 접합하기 위한 여러 방법이 당업계에 알려져 있다. 일부 부착 방법은 예를 들어, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 무수물(DTPA)과 같은 유기 킬레이트화제; 에틸렌트리아민테트라아세트산; N-클로로-p-톨루엔술폰아미드; 및/또는 항체에 부착된 테트라클로로-3α-6α-디페닐글리코우릴-3을 이용하는 금속 킬레이트 복합체의 사용을 수반한다(미국 특허 4,472,509 및 4,938,948). 모노클로날 항체, 또는 다른 결합 분자는 또한 글루타르알데하이드 또는 페리오데이트와 같은 결합제의 존재 하에 효소와 반응할 수 있다.플루오레세인 마커가 있는 접합체는 이러한 결합제의 존재 하에 또는 이소티오시아네이트와의 반응에 의해 제조된다. 미국 특허 4,938,948에서, 유방 종양의 영상화는 모노클로날 항체를 사용하여 달성되고 검출가능한 영상화 모이어티는 메틸-p-하이드록시벤즈이미데이트 또는 N-숙신이미딜-3-(4-하이드록시페닐)프로피오네이트와 같은 링커를 사용하여 항체에 결합된다.
다른 구현예에서, 항체 조합 부위를 변경하지 않는 반응 조건을 사용하여 면역글로불린의 Fc 영역에 술피드릴 기를 선택적으로 도입함으로써 면역글로불린, 또는 다른 결합 분자의 이량체화가 고려된다. 이 방법론에 따라 생산된 항체 접합체는 개선된 수명, 특이성 및 민감성을 나타내는 것으로 개시되어 있다(미국 특허 5,196,066, 본원에 참조로 포함됨). 리포터 또는 효과기 분자가 Fc 영역의 탄수화물 잔기에 접합된 효과기 또는 리포터 분자의 부위-특이적 부착이 또한 문헌에 개시되었다.
전구약물:
본 발명의 제1 측면의 결합 분자는 "전구약물" 형태로 투여될 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, 전구약물 형태에서, US28의 ECD3에 선택적으로 결합하는 결합 분자의 ECD3-결합 부분은 표적 세포(예를 들어 US28을 발현하고/하거나 잠복성 및/또는 용해성 감염된 HCMV인 것)의 국소성에서만 선택적으로 차폐되지 않는 방식으로 차폐될 수 있다.
본 출원에서 사용된 바와 같은 용어 "전구약물"은 모 생물학적으로 또는 약제학적으로 활성 물질과 비교하여 덜 활성이고 효소적으로 활성화되거나 보다 활성인 모 형태로 전환될 수 있는 생물학적으로 또는 약제학적으로 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 지칭한다(예를 들어, D. E. V. Wilman "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions 14, 375-382(615th Meeting, Belfast 1986) 및 V. J. Stella 등, "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery" Directed Drug Delivery R. Borchardt 등, (ed.) 247-267 페이지(Humana Press 1985) 참조).
B. 핵산 분자
본 발명의 제2 측면은 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합을 제공하며, 여기서 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합은 집합적으로, 개별적으로 또는 조합하여, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자에 의해 제공된 하나 이상의 폴리펩티드 쇄를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함한다.
본 발명의 제2 측면에 따른 상기 또는 각각의 핵산 분자는 예를 들어, DNA(예를 들어 게놈 DNA 또는 상보적 DNA) 또는 RNA(예를 들어 mRNA 분자, 시험관내 전사된 RNA 또는 합성 RNA)일 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 또는 각각의 핵산 분자는 cDNA 분자이다. 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 그들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해, 또는 합성 반응에 의해 중합체로 혼입될 수 있는 임의의 기질을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 및 이들의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 유입될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 구성요소에 의해 중단될 수 있다. 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 분자의 일부 특이적 예는 본원에 기재되어 있다. 다른 적합한 서열은 항체 구조 및 유전자 코드에 대한 지식에 기반하여 용이하게 결정될 수 있다.
용어 "시험관내 전사된 RNA"란 시험관 내에서 합성된 mRNA를 포함하는 RNA의 의미를 포함한다. 일반적으로, 시험관내 전사된 RNA는 시험관내 전사 벡터 또는 PCR-생성된 폴리뉴클레오티드 주형으로부터 생성된다. 시험관내 전사 벡터는 시험관내 전사된 RNA를 생성하는 데 사용되는 주형을 포함한다. 형질감염에 사용하기 위한 mRNA를 생성하는 방법은 전형적으로 50-2000개 염기 길이의 3' 및 5' 비번역된 서열("UTR"), 5' 캡 및/또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 발현될 핵산, 및 polyA 꼬리를 함유하는 작제물을 생산하기 위해 특별하게 설계된 프라이머를 사요한 주형의 시험관내 전사, 이어서 polyA 첨가를 수반할 수 있다. 이러한 RNA는 하기에 추가로 기재된 바와 같이, 상이한 종류의 세포를 효율적으로 형질감염시키는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합은 단리될 수 있다. "단리된"이란 핵산 분자가 세포 내에 위치하지 않거나 달리 제공되지 않는다는 임의적 의미를 포함한다.
본 발명의 제2 측면에 따른 상기 또는 각각의 핵산 분자는 단일 가닥일 수 있다. 본 발명의 제2 측면에 따른 대안적으로 상기 또는 각각의 핵산 분자는 이중 가닥일 수 있다.
본 발명의 제1 측면의 결합 분자가 단일 연속 아미노산 서열로부터 형성되는 경우, 본 발명에 따른 단일 핵산 분자 코딩 서열에 의해 암호화될 수 있다.
본 발명의 제1 측면의 결합 분자가 2개 이상의 별개의 폴리펩티드 서열로부터 형성되는 경우, 각각의 별개의 폴리펩티드 서열은 결합 분자의 전체가 다수의 별개의 핵산 분자의 조합에 의해 암호화되도록 별개의 핵산 분자에 의해 암호화될 수 있으며; 대안적으로, 결합 분자의 2개 이상의 별개의 폴리펩티드 서열은 다수의 별개의 코딩 서열을 포함하는 단일 핵산 분자에 의해 암호화될 수 있으며, 여기서 다수의 별개의 코딩 각각의 서열은 결합 분자의 상이한 2개 이상의 별개의 폴리펩티드 서열 각각을 암호화한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자는 항체 중쇄 또는 이의 가변 영역을 포함하는, 결합 분자 또는 본 발명의 제1 측면, 또는 일부를 암호화한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자는 항체 경쇄 또는 이의 가변 영역을 포함하는, 결합 분자 또는 본 발명의 제1 측면, 또는 이의 일부를 암호화한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 또는 본 발명의 제2 측면에 따른 다수의 별개의 핵산 분자의 조합은 집합적으로 항체 중쇄 또는 이의 가변 영역 및 항체 경쇄 또는 이의 가변 영역을 둘 다 포함하는, 결합 분자 또는 본 발명의 제1 측면, 또는 이의 일부를 암호화한다.
따라서, 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합은 상기 정의된 바와 같은 특정 아미노산 서열의 변이체를 포함하는, 본 발명의 제1 측면의 임의의 결합 분자(예컨대 항체, 이의 단편, 융합 단백질, CAR 등), 또는 이의 일부를 암호화할 수 있음이 이해될 것이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자는 다음을 포함한다(또는 본 발명의 제2 측면에 따른 다수의 별개의 핵산 분자의 조합은 집합적으로 다음을 포함한다):
a) 하기 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열:
i. 각각 1D3의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 서열을 암호화하는 서열번호: 22, 23 및 24;
ii. 각각 1C10의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 서열을 암호화하는 서열번호: 109, 110 및 111;
iii. 각각 1A10의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 서열을 암호화하는 서열번호: 109, 110 및 111;
iv. 각각 1G9의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 서열을 암호화하는 서열번호: 73, 74 및 75; 및/또는
v. 각각 1E8의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 서열을 암호화하는 서열번호: 73, 93 및 94;
및
b) 하기 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열:
i. 각각 1D3의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 서열을 암호화하는 서열번호: 28, 29 및 30;
ii. 각각 1C10의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 서열을 암호화하는 서열번호: 115, 80 및 116;
iii. 각각 1A10의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 서열을 암호화하는 서열번호: 115, 80 및 116;
iv. 각각 1G9의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 서열을 암호화하는 서열번호: 79, 80 및 81; 및/또는
v. 각각 1E8의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 서열을 암호화하는 서열번호: 79, 97 및 98;
또는 이들 서열 중 임의의 것의 기능적 변이체, 예를 들어 상기 서열번호 중 임의의 하나 이상 내에 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드 치환을 포함하는 변이체, 및/또는 상기 서열번호에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95 서열 동일성을 갖는 변이체. 예를 들어, 상기 또는 각각의 변이체 핵산 변화는 침묵 돌연변이일 수 있고, 따라서 그것이 암호화하는 아미노산 서열의 서열을 변화시키지 않을 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자는 다음을 포함한다(또는 본 발명의 제2 측면에 따른 다수의 별개의 핵산 분자의 조합은 집합적으로 다음을 포함한다):
a) 각각 1D3, 1C10, 1A10, 1G9 및 1E8의 가변 중쇄 서열을 암호화하는 서열번호: 26, 102, 120, 66 및 86으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열, 및
b) 각각 1D3, 1C10, 1A10, 1G9 및 1E8의 가변 경쇄 서열을 암호화하는 서열번호: 32, 106, 124, 70 및 90으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열,
또는 이들 서열 중 임의의 것의 기능적 변이체, 예를 들어 상기 서열번호에 대해 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 변이체.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자는 다음을 포함한다(또는 본 발명의 제2 측면에 따른 다수의 별개의 핵산 분자의 조합은 집합적으로 다음을 포함한다):
a) 하기 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열:
i. 서열번호: 20에 의해 정의된 바와 같은 1D3의 중쇄의 완전 성숙 서열을 암호화하는 서열번호: 34(나타낸 바와 같이 리더 서열-암호화 영역이 있거나 없고, 없는 경우, 대안적인 리더 서열을 암호화하는 서열을 임의적으로 포함함);
ii. 서열번호: 157에 의해 정의된 바와 같은 1C10의 중쇄의 완전 성숙 서열을 암호화하는 서열번호: 155(나타낸 바와 같이 리더 서열-암호화 영역이 있거나 없고, 없는 경우, 대안적인 리더 서열을 암호화하는 서열을 임의적으로 포함함);
iii. 서열번호: 161에 의해 정의된 바와 같은 1A10의 중쇄의 완전 성숙 서열을 암호화하는 서열번호: 159(나타낸 바와 같이 리더 서열-암호화 영역이 있거나 없고, 없는 경우, 대안적인 리더 서열을 암호화하는 서열을 임의적으로 포함함);
iv. 서열번호: 149에 의해 정의된 바와 같은 1G9의 중쇄의 완전 성숙 서열을 암호화하는 서열번호: 147(나타낸 바와 같이 리더 서열-암호화 영역이 있거나 없고, 없는 경우, 대안적인 리더 서열을 암호화하는 서열을 임의적으로 포함함); 및/또는
v. 서열번호: 153에 의해 정의된 바와 같은 1E8의 중쇄의 완전 성숙 서열을 암호화하는 서열번호: 151(나타낸 바와 같이 리더 서열-암호화 영역이 있거나 없고, 없는 경우, 대안적인 리더 서열을 암호화하는 서열을 임의적으로 포함함);
및
b) 하기 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열:
i. 서열번호: 35(나타낸 바와 같이 리더 서열-암호화 영역이 있거나 없고, 없는 경우, 대안적인 리더 서열을 암호화하는 서열을 임의적으로 포함함), 서열번호: 21에 의해 정의된 바와 같은 1D3의 경쇄의 완전 성숙 서열;
ii. 서열번호: 158에 의해 정의된 바와 같은 1C10의 경쇄의 완전 성숙 서열을 암호화하는 서열번호: 156(나타낸 바와 같이 리더 서열-암호화 영역이 있거나 없고, 없는 경우, 대안적인 리더 서열을 암호화하는 서열을 임의적으로 포함함);
iii. 서열번호: 162에 의해 정의된 바와 같은 1A10의 경쇄의 완전 성숙 서열을 암호화하는 서열번호: 160(나타낸 바와 같이 리더 서열-암호화 영역이 있거나 없고, 없는 경우, 대안적인 리더 서열을 암호화하는 서열을 임의적으로 포함함);
iv. 서열번호: 150에 의해 정의된 바와 같은 1G9의 경쇄의 완전 성숙 서열을 암호화하는 서열번호: 148(나타낸 바와 같이 리더 서열-암호화 영역이 있거나 없고, 없는 경우, 대안적인 리더 서열을 암호화하는 서열을 임의적으로 포함함); 및/또는
v. 서열번호: 154에 의해 정의된 바와 같은 1E8의 경쇄의 완전 성숙 서열을 암호화하는 서열번호: 152(나타낸 바와 같이 리더 서열-암호화 영역이 있거나 없고, 없는 경우, 대안적인 리더 서열을 암호화하는 서열을 임의적으로 포함함);
또는 이들 서열 중 임의의 것의 기능적 변이체, 예를 들어 상기 서열번호에 대해 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 변이체(임의적으로, 여기서 서열 동일성은 나타낸 바와 같은 리더 서열-암호화 영역이 없는 상기 서열과 관련하여 결정됨).
전술한 구현예에 따른 상기 정의된 핵산 서열이 기능적 변이체는 예를 들어, 상기 핵산 서열 중 임의의 것의 치환, 결실 및/또는 첨가 변이체일 수 있다. 변이체 폴리뉴클레오티드는 서열 목록에 주어진 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5개, 최대 10개, 최대 20개, 최대 30개, 최대 40개, 최대 50개, 최대 75개 이상의 핵산 치환 및/또는 결실을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 변이체는 본원에 개시된 핵산 서열 중 임의의 하나의 폴리뉴클레오티드에 대해 적어도 70% 상동, 바람직하게는 적어도 80% 또는 90%, 보다 바람직하게는 이에 대해 적어도 95%, 97% 또는 99% 상동일 수 있다. 바람직하게는 이러한 수준에서 상동성 및 동일성은 적어도 폴리뉴클레오티드의 코딩 영역과 관련하여 존재한다. 상동성을 측정하는 방법을 당업계에 잘 알려져 있고 본 맥락에서, 상동성은 핵산 동일성에 기초하여 계산됨이 당업자에 의해 이해될 것이다. 이러한 상동성은 적어도 15개, 바람직하게는 적어도 30개, 예를 들면 적어도 40, 60, 100, 200개 이상의 인접 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐 존재할 수 있다. 이러한 상동성은 비변형된 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 존재할 수 있다.
임의적으로, 본원에 기재된 일부 변이체 핵산 서열에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 내에 존재하는 6개의 CDR 서열 중 임의의 하나 이상을 암호화하는 영역의 서열은 보존될 수 있고, 임의의 서열 변이가 다른 곳에 존재하거나; 추가의 옵션에서 가변 중쇄 및 가변 경쇄 내에 존재하는 6개의 CDR 서열 중 임의의 하나 이상을 암호화하는 영역에서 변이의 수준 및/또는 속성은 나머지 상기 또는 각각의 핵산 분자와 비교하여 최소화될 수 있다. 예를 들어, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 내에 존재하는 6개의 CDR 서열 중 임의의 하나 이상을 암호화하는 상기 또는 각각의 영역 내에서 변이 정도는 1, 2, 3, 4 또는 5개 뉴클레오티드 치환으로 제한될 수 있고/있거나 상응하는 비-변이체 CDR 코딩 영역에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 CDR 코딩 영역을 제시한다. 상기 또는 각각의 변이체 핵산 변화에서 변이는 예를 들어, 침묵 돌연변이일 수 있고, 따라서 암호화하는 아미노산 서열의 서열을 변화시키지 않으며; VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 서열 및/또는 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 서열 중 임의의 하나 이상을 암호화하는 영역에서 (반드시 필요한 것은 아니지만) 특히 바람직할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 상동성 또는 동일성을 측정하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, UWGCG 패키지는 상동성을 계산하는 데 사용될 수 있는(예를 들어 기본 설정에서 사용됨) BESTFIT 프로그램을 제공한다(Devereux 등, 1984, Nucleic Acids Research 12: 387-395, 이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨).
PILEUP 및 BLAST 알고리즘은 예를 들어 Altschul, 1993, J Mol Evol 36:290-300; Altschul 등, 1990, J Mol Biol 215:403-10, 이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 상동성을 계산하거나 (전형적으로 기본 설정에서) 서열을 정렬하는 데 사용될 수 있다.
BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립생물공학정보센터(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 공개적으로 이용가능하다. 이 알고리즘은 먼저 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 단어와 정렬될 때 일부 양수값 임계 점수 T와 일치하거나 충족하는 질의 서열에서 길이 W의 짧은 단어를 식별함으로써 높은 점수 서열 쌍(HSP)을 식별하는 것을 수반한다. T는 이웃 단어 점수 임계값(Altschul 등, 상기)으로 언급된다. 이러한 초기 이웃 단어는 히트(hit)는 이들을 함유하는 HSP를 찾는 검색을 개시하기 위한 시드(seed) 역할을 한다. 단어 히트는 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한 각 서열을 따라 양쪽 방향으로 확장된다. 각 방향으로 단어 히트의 확장은 누적 정렬 점수가 하나 이상의 음성-점수 잔기 정렬의 누적으로 인해 0 이하가 될 때; 또는 어느 한 서열의 끝에 도달했을 때 중단된다. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X는 정렬 민감도 및 속도를 결정한다. BLAST 프로그램은 기본값으로서 단어 길이(W) 11, BLOSUM62 점수 매트릭스(Henikoff & Henikoff, 1992 참조) 정렬(B) 50, 기대치(E) 10, M=5, N=4, 및 두 가닥의 비교를 사용한다.
BLAST 알고리즘은 2개 서열 사이의 유사성의 통계적 분석을 수행하며; 예를 들어 Karlin & Altschul, 1993을 참조한다. BLAST 알고리즘에 의해 제공된 유사성의 하나의 척도는 최소 합계 확률(P(N))이며, 이는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 일치가 우연히 발생할 확률을 나타낸다. 예를 들어, 서열은 제1 서열과 제2 서열의 비교에서 최소 합계 확률이 약 1 미만, 바람직하게는 약 0.1 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우 또 다른 서열과 유사한 것으로 간주된다.
상동체는 3, 5, 10, 15, 20개 미만 또는 그 이상의 돌연변이(각각은 치환, 결실 또는 삽입일 수 있음)에 의해 관련 폴리뉴클레오티드의 서열과 상이할 수 있다. 이러한 돌연변이는 상동체의 적어도 30개, 예를 들면 적어도 40, 60 또는 100개 이상의 연속 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐 측정될 수 있다.
하나의 구현예에서, 변이체 서열은 유전자 코드의 중복성에 의해 서열 목록에 주어진 특이적 서열로부터 달라질 수 있다. DNA 코드는 4개의 기본 핵산 잔기(A, T, C 및 G)를 가지고 있으며 이들은 유기체의 유전자에서 단백질이 암호화된 아미노산을 나타내는 3개의 글자 코돈을 "철자화"하는 데 사용한다. DNA 분자를 따라 코돈의 선형 서열은 해당 유전자에 의해 암호화된 단백질(들)에서 아미노산의 선형 서열로 번역된다. 모드는 20개의 천연 아미노산을 코딩하는 61개의 코돈 및 "정지" 신호를 나타내는 3개의 코돈으로 매우 축퇴되어 있다. 따라서, 대부분의 아미노산은 1개 초과의 코돈에 의해 코딩되며, 실제로 여러 개가 4개 이상의 상이한 코돈에 의해 코딩된다. 따라서 본 발명의 변이체 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 또 다른 폴리뉴클레오티드와 동일한 폴리펩티드 서열을 암호화할 수 있지만, 동일한 아미노산을 암호화하는 상이한 코돈의 사용으로 인해 상이한 핵산 서열을 가질 수 있다.
따라서 본 발명의 제1 측면의 결합 분자 내에 존재하는 하나 이상의 폴리펩티드는 암호화하고 발현할 수 있는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 형태로부터 생산되거나 전달될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 Green & Sambrook(2012, Molecular Cloning - a laboratory manual, 4th edition; Cold Spring Harbor Press)에 예로서 기재된 바와 같이, 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 합성될 수 있다.
핵산 분자는 특정 숙주 세포에서 항체의 폴리뉴클레오티드의 발현을 위해, 예를 들어　 인간 세포에서 발현을 위해 코돈-최적화될 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다(예를 들어, Angov, 2011 참조).
의심을 피하기 위해, 특정 CDR 서열을 암호화하는 핵산의 변이체가 언급되는 경우, 정의된 바와 같은 CDR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상이 달라질 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 핵산이 각각 특정 핵산 서열에 의해 암호화되어 있는 중쇄 또는 경쇄 CDR(예를 들어 CDR 1-3)을 암호화하는 것으로 정의된 경우, 이러한 특정 서열 중 최대 1, 2 또는 3개가 달라질 수 있다. 유사하게는, 핵산이 각각 특정 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되어 있는 경쇄 및 중쇄 CDR(예를 들어 6개의 CDR)을 암호화하는 것으로 정의된 경우, 이러한 특정 서열 중 최대 1, 2, 3, 4, 5개 또는 6개 모두가 달라질 수 있다. 변이체는 전형적으로 상기 기재된 바와 같은 보존적 아미노산 치환을 야기하는 것이다.
핵산이 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 암호화하는 것으로 정의되는 경우, 이러한 서열 중 최대 1 또는 2개가 정의된 바와 같이 달라질 수 있는 것으로 이해될 것이다. 변이는 비-CDR 영역을 암호화하는 서열의 일부 내에서만, CDR 영역을 암호하는 서열의 일부 내에서만, 또는 CDR 영역을 암호화하는 부분 및 비-CDR 영역을 암호화하는 부분 둘 다 내에 있을 수 있다. 전형적으로, 변이는 CDR 영역의 외부에 있으므로, 핵산은 본원에 정의된 특정 CDR을 암호화하는 핵산 중 임의의 것을 포함할 수 있다(예를 들어 1D3의 경우 서열번호: 8, 9, 10, 14, 15 및/또는 16, 또는 1C10, 1A10, 1G9 및/또는 1E8에서 상응하는 서열번호 중 임의의 것에서).
본원에 기재된 특이적 핵산 서열의 임의의 변이체는 원하는 결합 특성, 예를 들어 US28의 ECD3에 대한 선택적 결합 특이성, US28의 ECD3에 특이적이지만 균주 불가지론적 방식으로 결합하는 능력 및/또는 US28의 ECD3에 대한 결합 친화성 중 하나 이상에 유의하게 영향을 미치지 않아야 함이 이해될 것이다. 이러한 원하는 활성을 테스트하는 방법은 본 발명의 제1 측면과 관련하여 상기 기재되어 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 핵산은(또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합은 집합적으로) US28의 ECD3에 선택적으로 결합하는 scFv인 본 발명의 제1 측면의 결합 분자를 암호화한다. 따라서, 핵산(또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합)은 scFv가 단일 핵산 서열에 의해 암호화된 단일 폴리펩티드로서 발현될 수 있도록, 전형적으로 단일 연속 핵산 코딩 영역, 예를 들어 VH 및 VL 서열을 암호화하는 서열의 영역이 링커 서열을 암호화하는 서열에 의해 연결되는 단일 연속 핵산 코딩 영역의 형태로 각각 가변 중쇄(VH) 서열 및 가변 경쇄(VL) 서열을 암호화하는 서열의 영역을 포함할 수 있다.
또 다른 특히 바람직한 구현예에서, 핵산은(또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합은 집합적으로) 이중특이적 면역 세포 관여 항체, 예를 들어, 이중특이적 T-세포 관여(BiTE)인 본 발명의 제1 측면의 결합 분자를 암호화한다. 예를 들어, 핵산(또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합 중 하나 이상)은 세포-관여 영역, 예컨대 T-세포 관여 영역인 영역, 예를 들어 CD3-결합 도메인을 암호화할 수 있다.
또 다른 특히 바람직한 구현예에서, 핵산은(또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합은 집합적으로) 키메라 항원 수용체(CAR)인 본 발명의 제1 측면의 결합 분자를 암호화한다. 따라서, 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합은 다음을 포함하는 CAR을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있으며:
(i) 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 제1 측면의 결합 분자, 또는 본원에 정의된 바와 같은 상기 결합 분자의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진 세포외 도메인(예를 들어 항체, 예컨대 scFv);
(ii) 막관통 도메인(예를 들어, 막관통 수용체 단백질의 막관통 도메인, 및 임의적으로 막관통 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD8, CD45 및 CD4로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막관통 도메인을 포함함); 및
(iii) 세포내 도메인(예를 들어, 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 여기서: (a) 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하고/하거나; (b) 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타, Fc 수용체 감마, Fc 수용체 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d의 신호전달 도메인을 포함함);
여기서 CAR의 세포외 도메인은 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 US28 단백질의 세포외 도메인 3(ECD3) 내의 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖고,
여기서 US28 단백질의 ECD3은 서열번호: 5에 제시된 바와 같은 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)에 의해 암호화된 US28 단백질의 위치 167 내지 183에 상응하는 위치에서 US28 단백질에 존재하는 아미노산 서열을 포함한다.
임의적으로, 본 발명의 제2 측면의 핵산 분자(들)에 의해 암호화된 CAR의 세포외 도메인은 예를 들어, 힌지 영역에 의해 막관통 도메인에 연결될 수 있다. 따라서, 본 발명의 제2 측면의 핵산 분자(들)는 상기 힌지 영역을 암호화하는 핵산 서열의 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 제2 측면의 핵산 분자(들)에 의해 암호화된 CAR의 세포내 도메인은 예를 들어, 힌지 영역에 의해 막관통 도메인에 연결될 수 있으며 예를 들어, 하나 이상의 공자극 도메인을 포함하며, 예를 들어: (a) 여기서 하나 이상의 공자극 도메인은 CD28, 41BB, OX40, ICOS, CD27, 및 DAP10으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터 수득된 하나 이상의 기능적 신호전달 도메인을 포함하고/하거나; (b) 여기서 세포내 도메인은 세포내 신호전달 도메인에 근접한 공자극 도메인을 혼입하고/하거나, (c) 여기서 세포내 도메인은 2개 이상의 공자극 도메인, 예를 들어 2개의 인라인 공자극 도메인을 포함하고/하거나, (d) 여기서 세포내 도메인은 별도의 사이토카인 신호를 혼입한다. 따라서, 본 발명의 제2 측면의 핵산 분자(들)는 상기 하나 이상의 공자극 도메인을 암호화하는 핵산 서열의 하나 이상의 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 제2 측면에 따른 상기 또는 각각의 핵산 분자는 또한 리더 서열, 막관통 도메인, 세포내 신호전달 도메인, 및 힌지 영역, 예컨대 상기 기재된 바와 같은 이러한 서열 중 임의의 하나 이상을 암호화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 제2 측면에 따른 상기 또는 각각의 핵산 분자는 (예를 들어 서열번호: 13 또는 19의) 리더 서열을 포함할 수 있다.
임의적으로, 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합은 삽입된 서열에 작동가능하게 연결된 제어 서열을 포함하는 발현 카세트의 형태로 (집합적으로, 또는 개별적으로 별개의 형태로) 제공되어, 생체내에서 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 허용할 수 있다. 이러한 발현 카세트는 숙주 대상체에 직접적으로 투여될 수 있다. 차례로 이러한 발현 카세트는 전형적으로 예를 들어 하기에 추가로 논의된 바와 같은 벡터(예를 들어, 플라스미드 또는 재조합 바이러스 벡터) 내에 제공된다.
C. 벡터
본 발명의 제3 측면은 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합을 포함하는 벡터를 추가로 제공한다.
용어 "벡터"는 하나 이상의 단리된 핵산 서열의 서열을 혼입하고 상기 또는 각각의 단리된 핵산을 세포의 내부에 전달하는 데 사용될 수 있는 핵산을 지칭한다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 연관된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 및 바이러스를 포함하는 수많은 벡터가 당업계에 알려져 있다. 따라서, 용어 벡터는 자율적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 용어는 또한 예를 들어, 폴리리신 화합물, 리포솜 등과 같이 핵산을 세포로 전달하는 것을 용이하게 하는 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물을 추가로 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
본원에 사용되는 맥락에서, 용어 "벡터"는 단일 및/또는 다중 벡터를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자가 본 발명의 제2 측면에 따른 다수의 별개의 핵산 분자의 조합에 의해 암호화되어, 상기 다수의 별개의 핵산 분자의 조합에 존재하는 핵산 중 하나 이상이 제1 벡터 상에 제시될 수 있고/있거나, 상기 다수의 별개의 핵산 분자의 조합에 존재하는 다른 핵산 중 하나 이상이 제2 별개의 벡터 상에 제시될 수 있고/있거나, 상기 다수의 별개의 핵산 분자의 조합에서 또 다른 핵산이 제3, 제4, 제5 등의 별개의 추가 벡터 상에 제시될 수 있는 맥락에서 다중 벡터를 포함할 수 있다.
따라서, 예를 들어, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자가 하나 초과의 별개의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 항체 또는 cAR인 경우, 임의적으로 본 발명의 제3 측면에 따른 벡터의 단일 형태는 결합 분자를 형성하는 하나 초과의 별개의 폴리펩티드 쇄를 암호화하는 데 필요한 모든 핵산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 제3 측면은 또한 다수의 별개의 벡터(예를 들어 2개의 벡터, 또는 그 이상)의 조합을 제공하며, 여기서 다수의 별개의 벡터의 조합은 집합적으로 본 발명의 제2 측면에 따른 다수의 별개의 핵산 분자의 조합을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 제1 측면의 결합 분자가 하나 초과의 별개의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 항체 또는 CAR인 경우, 다수의 별개의 벡터는 결합 분자를 집합적으로 형성하는 상이하고 별개의 폴리펩티드 쇄를 각각 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 각각 포함할 수 있어서, 결합 분자가 제1 벡터에 의해 암호화된 하나 이상의 별개의 폴리펩티드 쇄 및 하나 이상의 후속 상이한 벡터에 의해 암호화된 하나 이상의 다른 별개의 폴리펩티드 쇄를 포함하도록 한다.
간결성을 위해, 일반적으로 본 출원은 단수형으로 "벡터"를 지칭하지만, 이것이 임의적으로 또한 상기 기재된 바와 같은 벡터의 다수의 별개의 형태를 포함하는, 복수형의 "벡터"를 포함할 수 있음이 이해되어야 한다.
임의적으로, 상기(또는 각각의) 벡터는 레트로바이러스 벡터, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 및 아데노바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합을 포함하는 본 발명의 제3 측면에 따른 상기(또는 각각의) 벡터는 숙주 대상체에게 투여될 수 있다. 바람직하게는 폴리뉴클레오티드는 유전적 벡터를 사용하여 제조되고/되거나 투여된다. 적합한 벡터는 충분한 양의 유전적 정보를 운반하고, 본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자의 발현을 허용하는 것과 같이, 상기 또는 각각의 벡터에 의해 암호화된 하나 이상의 폴리펩티드 서열의 발현을 허용하는 임의의 벡터일 수 있다.
본 발명의 제1 측면의 결합 분자를 암호화하는 천연 또는 합성 핵산(예컨대 scFv, BiTE 등, 뿐만 아니라 CAR을 포함하는 항체 또는 이의 단편)의 발현은 전형적으로 각각이 독립적으로 하나 이상의 폴리펩티드(또는 이의 부분)를 프로모터에 암호화하고, 상기 또는 각각의 작제물을 하나 이상의 발현 벡터로 혼입하는, 하나 이상의 핵산을 작동가능하게 연결함으로써 달성된다. 따라서, 상기(또는 각각의) 벡터는 발현 벡터일 수 있다.
따라서 본 발명의 제3 측면은 이러한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. "발현 벡터"란 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터의 의미를 포함한다. 이러한 발현 벡터는 분자 생물학 분야에서 일상적으로 구성되고 예를 들어 본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자의 발현을 허용하는 것과 같이, 상기 또는 각각의 벡터에 의해 암호화된 하나 이상의 폴리펩티드 서열의 발현을 허용하기 위해, 플라스미드 DNA 및 적절한 개시제, 프로모터, 인핸서 및 예를 들어 필요할 수 있고, 정확한 배향으로 위치하는 폴리아데닐화 신호와 같은 다른 요소의 사용을 수반할 수 있다. 다른 적합한 벡터는 당업자에게 명백할 것이다(Green & Sambrook, 상기 참조).
발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스-작용 요소를 포함할 수 있으며; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에 공급될 수 있다. 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오티드를 혼입하는 코스미드, 플라스미드(예를 들어 리포솜에 없거나 함유됨) 및 바이러스(예를 들어 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노 연관 바이러스)를 포함하여 당업자에게 알려진 것들을 모두 포함한다. 전형적인 클로닝 벡터는 원하는 핵산 서열의 발현 조절에 유용한 전사 및 번역 종결자, 개시 서열, 및 프로모터를 함유한다.
또한, 발현 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 당업계에 잘 알려져 있고 예를 들어, Sambrook 등, 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 1-4 권, Cold Spring Harbor Press, NY)에 기재되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 및 렌티바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
포유동물 세포로의 유전자 전달의 위한 다수의 바이러스 기반 시스템이 개발되었다. 예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 하나 이상의 관심 폴리펩티드 서열을 암호화하는 하나 이상의 선택된 핵산 서열은 당업계에 알려진 기술을 사용하여 벡터로 삽입되고 레트로바이러스 입자에 패키징될 수 있다. 그런 다음 재조합 바이러스는 단리되어 생체내 또는 생체외에서 세포로 전달될 수 있다. 다수의 레트로바이러스 시스템은 당업계에 알려져 있다.
용어 "렌티바이러스"는 레트로바이러스 과(Retroviridae) 패밀리의 속을 지칭한다. 렌티바이러스는 비분할 세포를 감염시킬 수 있다는 점에서 레트로바이러스 중에서 독특하며; 이들은 상당한 양의 유전적 정보를 숙주 세포의 DNA로 전달할 수 있으므로, 이들은 유전자 전달 벡터의 가낭 효율적인 방법 중 하나이다. HIV, SIV, 및 FIV는 모두 렌티바이러스의 예이다. 렌티바이러스 벡터는 이식유전자의 장기간 안정한 통합 및 딸 세포에서의 증식을 허용하므로 장기간 유전자 전달을 달성하는데 특히 적합한 도구이다.
용어 "렌티바이러스 벡터"는 Milone 등, Mol. Ther. 17(8): 1453-1464(2009)에 제공된 바와 같이 특히 자기 불활성화 렌티바이러스 벡터를 포함하는 렌티바이러스 게놈의 적어도 일부로부터 유래된 벡터를 지칭한다. 임상에서 사용될 수 있는 렌티바이러스 벡터의 다른 예는 예를 들어 Oxford BioMedica의 LENTIVECTOR® 유전자 전달 기술, Lentigen의 LENTIMAX™ 벡터 시스템 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 비임상 유형의 렌티바이러스 벡터가 또한 이용가능하고 당업자에게 알려져 있을 수 있다.
아데노바이러스 벡터가 또한 사용될 수 있고, 다수의 아데노바이러스 벡터가 당업계에 알려져 있다.
하이브리드 벡터가 또한 사용될 수 있고, 다수의 하이브리드 벡터가 당업계에 알려져 있다. 하이브리드 벡터는 일반적으로 하나 초과의 벡터의 양을 갖도록 유전적으로 조작된 벡터 바이러스를 포함한다. 바이러스는 제한된 부하 능력, 면역원성, 유전독성을 가질 수 있고, 장기간 적절한 유전자이식 발현을 뒷받침하지 못할 수 있는 전형적인 바이러스 벡터의 단점을 피하기 위해 변경된다.
본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자를 암호화하는 핵산의 발현은 또한 잠자는 숲속의 미녀(sleeping beauty), CRISPR, CAS9, 및 아연 핑거 뉴클레아제와 같은 트랜스포존을 사용하여 달성될 수 있다.
벡터는 진핵생물에서의 복제 및 통합에 적합할 수 있고/있거나, 박테리아 종과 같은 원핵생물에서의 발현에 적합할 수 있다. 바람직하게는, 상기 또는 각각의 벡터는 본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자를 생산 세포(예를 들어 CHO 세포, 이. 콜라이 세포 등) 또는 대상체의 세포, 예를 들어 포유동물 세포(예를 들어 인간 세포), 예컨대 포유동물(예를 들어 인간) 면역 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포, 대식세포 등)에서 발현할 수 있다.
본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합은 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스, 및 코스미드를 포함한 다수의 유형의 벡터로 클로닝될 수 있다. 특정 관심 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터, 및 서열분석 벡터를 포함한다.
일반적으로, 적합한 벡터는 임의적으로 적어도 하나의 유기체에서 기능적인 복제 기점, 상기 또는 각각의 암호화 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및/또는 하나 이상의 선택가능한 마커를 함유할 것이다, (예를 들어 WO　01/96584; WO 01/29058; 및 미국 특허 번호 6,326,193).
본 발명의 제3 측면에 따른 벡터는 추가 프로모터 요소, 예를 들어 전사 개시 빈도를 조절하는 인핸서를 포함할 수 있음이 이해될 것이다. 전형적으로, 이들은 시작 부위의 영역 30-110 bp 상류에 위치하지만, 다수의 프로모터가 시작 부위의 하류에 있는 기능적 요소를 또한 함유하는 것으로 나타났다. 프로모터 요소 사이의 간격은 빈번하게 유연하므로, 요소가 반전되거나 서로 상대적으로 이동할 때 프로모터 기능이 보존된다. 티미딘 키나제(tk) 프로모터에서, 프로모터 요소 사이의 간격은 활성 감소가 시작되기 전에 50 bp 간격으로 증가될 수 있다. 프로모터에 따르면, 개별 요소는 협력하여 또는 독립적으로 기능하여 전사를 활성화시킬 수 있다.
포유동물 T 세포에서 관심 이식유전자를 발현할 수 있는 프로모터의 예는 EFla 프로모터이다. 천연 EFla 프로모터는 아미노아실 tRNA를 리보솜으로 효소적 전달하는 것을 담당하는 신장 인자-1 복합체의 알파 서브유닛의 발현을 구동한다. EFla 프로모터는 포유동물 발현 플라스미드에서 광범위하게 사용되었고 렌티바이러스 벡터로 클로닝된 이식유전자(예를 들어 CAR-암호화 이식유전자)로부터 발현을 구동하는 데 효과적인 것으로 나타났다. 예를 들어, Milone 등, Mol. Ther. 17(8): 1453-1464(2009) 참조.
프로모터의 또 다른 예는 즉시 초기 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 서열이다. 이 프로모터 서열은 이에 작동가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 높은 수준의 발현을 구동할 수 있는 강력한 구성적 프로모터 서열이다.
시미안 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바 바이러스 즉시 초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 뿐만 아니라 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 신장 인자-la 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 및 크레아틴 키나제 프로모터와 같으나 이에 제한되지 않는 인간 유전자 프로모터를 포함하하 이에 제한되지 않는 다른 구성적 프로모터 서열이 대안적으로 또는 추가로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 구성적 프로모터의 사용으로 제한되지 않는다. 유도성 프로모터가 또한 본 발명의 일부로서 고려된다. 유도성 프로모터의 사용은 이러한 발현이 바람직할 때 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 켜거나, 발현이 바람직하지 않을 때 발현을 끌 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터, 및 테트라사이클린 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 따라서, 본원에 기재된 본 발명의 임의의 방법 또는 용도에서, 예를 들어 환경적 자극을 통한 또는 제2 분자의 작용을 통한 본 발명의 제2 측면의 핵산(들) 또는 본 발명의 제3 측면에 따른 벡터(들)에 의해 암호화된 본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자의 발현은 조건적 또는 유도성일 수 있음이 이해될 것이다. 이러한 방식으로, (예를 들어 US28을 발현하지 않거나, 낮은 수준으로 발현하는 조직에서) 불리한 표적외 효과를 제거하거나 최소화하는 것이 가능할 수 있다.
세포에서 관심 폴리펩티드(들)(예를 들어, 본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자)의 발현을 평가하기 위해, 벡터는 발현 세포의 식별 및 선택을 용이하게 하기 위해 선택가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 둘 다를 편리하게 함유할 수 있다. 다른 구현예에서, 선택가능한 마커는 DNA의 별개의 조각에 운반되고 공형질감염 절차에 사용될 수 있다. 두 선택가능한 마커 및 리포터 유전자는 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 적절한 조절 서열과 함께 측면에 있을 수 있다. 유용한 선택가능한 마커는 예를 들어, neo 등과 같은 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 식별하고 조절 서열의 기능을 평가하는 데 사용된다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수용자 유기체 또는 조직에 존재하지 않거나 이에 의해 발현되지 않고 발현이 일부 용이하게 검출가능한 특성, 예를 들어 효소적 활성에 의해 나타난 폴리펩티드를 암호화하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용자 세포로 도입된 후 적합한 시간에 검정된다. 적합한 리포터 유전자는 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비된 알칼리 포스파타제, 또는 녹색 형광 단백질 유전자(GFP)를 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다(예를 들어 Ui-Tei 등, 2000 FEBS Letters 479: 79-82). 적합한 발현 시스템은 잘 알려져 있고 알려진 기술을 사용하여 제조되거나 상업적으로 수득될 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자의 가장 높은 수준의 발현을 나타내는 최소 5' 측면 영역이 있는 작제물이 프로모터로서 식별된다. 이러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결되고 프로모터 구동된 전사를 조절하는 능력에 대해 제제를 평가하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 발현 작제물은 또한 표준 유전자 전달 프로토콜(예를 들어, US 5,399,346 참조)을 사용하여 핵산 면역화 및 유전자 요법에 사용될 수 있다. 따라서, 벡터는 유전자 요법 벡터일 수 있다. 이 경우, 발현을 위해 적절한 세포, 조직 또는 기관으로 지시될 수 있도록 핵산 및/또는 벡터를 적합한 표적화 모이어티에 연결하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서 본 발명의 핵산 분자 및/또는 벡터는 하기에 기재되고 당업계에 알려진 제형 및 방법을 사용하여, 유전자 요법 접근법을 통해 본 발명의 치료적 측면에서 사용될 수 있음이 이해될 것이다.
D. 형질전환된 세포
본 발명의 제4 측면은 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합, 및/또는 본 발명의 제3 측면에 따른 벡터를 포함하는 세포, 또는 세포 집단(임의적으로 동종 또는 이종 세포 집단)을 제공하며, 임의적으로 여기서 세포는 본 발명의 제1 측면에 따른 하나 이상의 결합 분자(예컨대 하나 이상의 항체, 예를 들어 모노클로날 항체, 및/또는 하나 이상의 CAR)를 발현하며, 상기 하나 이상의 결합 분자 및/또는 CAR은 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합, 또는 본 발명의 제3 측면에 따른 벡터에 의해 암호화된다. 상기 세포는 임의적으로, 단리된 세포, 생체외 세포, 및 시험관내 세포로부터 선택될 수 있다.
이러한 세포는 일시적이거나, 바람직하게는 안정한 고등 진핵생물 세포주, 예컨대 포유동물 세포 또는 곤충 세포, 하등 진핵생물 세포, 예컨대 효모 또는 원핵생물 세포 예컨대 박테리아 세포를 포함한다. 본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자를 암호화하는 벡터 또는 발현 카세트의 삽입에 의해 변형될 수 있는 세포의 특정 예는 포유동물 HEK293T, CHO, HeLa, NS0 및 COS 세포를 포함한다. 바람직하게는 선택된 세포주는 안정할 뿐만 아니라 성숙 글리코실화 및/또는 폴리펩티드의 세포 표면 발현을 허용하는 것일 것이다.
본 발명의 이러한 세포주는 본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자를 생산하기 위한 일상적인 방법을 사용하여 배양될 수 있거나, 본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자를 대상체에게 전달하기 위해 치료적으로 또는 예방적으로 사용될 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트 또는 벡터는 생체외에서 대상체로부터의 세포에 투여될 수 있고 이어서 세포는 대상체의 신체로 되돌아갈 수 있다.
상기 세포(들)가 대상체와 함께 치료적으로 또는 예방적으로 사용되는 구현예에서, 세포는 임의적으로 하기에 추가로 기재된 바와 같이 대상체에 대해 "자가" 또는 "동종이계"일 수 있다.
본 발명의 제4 측면에 따른 세포는 예를 들어, (a) 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합으로, 여기서 암호화된 결합 분자는 항체, 상기 항체의 기능적 단편, 또는 본 발명의 제1 측면에 따른 융합 폴리펩티드 서열을 포함하는 이의 기능적 단편의 항체인 것; 및/또는 (b) 본 발명의 제3 측면에 따른 벡터로, 여기서 상기 벡터는 이 단락의 옵션 (a)에 의해 정의된 바와 같은 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합을 포함하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 제4 측면에 따른 세포는 예를 들어, (a) 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합으로, 여기서 암호화된 결합 분자는 본 발명의 제1 측면에 따른 CAR인 것; 및/또는 (b) 본 발명의 제3 측면에 따른 벡터로, 여기서 상기 벡터는 이 단락의 (a) 부분에 의해 정의된 바와 같은 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합을 포함하는 것을 포함할 수 있다. 제한없이, 상기 세포는 예를 들어, T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 및 대식세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 따라서, 세포는 임의적으로 CAR-T 세포, CAR-NK 세포 또는 CAR-대식세포일 수 있고, 임의적으로, 세포가 CAR-T 세포인 경우, 예를 들어 T-세포는 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 효과기 T 세포, 헬퍼 T 세포, 기억 T 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), EBV-특이적 T 세포 수용체(TCR) 또는 γδ-T 세포 하위유형으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 제4 측면은 또한 본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자 및/또는 상기 결합 분자를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 제공하며, 임의적으로 여기서 상기 핵산은 각각 본 발명의 제2 또는 제3 측면에 의해 정의된 바와 같은 핵산 또는 벡터이다. 예를 들어, 결합 분자는 본 발명의 제1 측면에 따른 항체, 본 발명의 제1 측면에 따른 상기 항체의 기능적 단편, 또는 본 발명의 제1 측면에 따른 융합 폴리펩티드 서열을 포함하는 이의 기능적 단편의 항체일 수 있고, 임의적으로 여기서 항체는 모노클로날 항체이고, 추가로 예를 들어 여기서 세포는 모노클로날 항체를 재조합적으로 발현하는 CHO 세포와 같은 포유동물 세포이다.
본 발명의 제4 측면은 또한 본 발명의 제1 측면에 따른 CAR 및/또는 상기 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 제공하며, 임의적으로 여기서 상기 핵산은 각각 본 발명의 제2 또는 제3 측면에 의해 정의된 바와 같은 핵산 또는 벡터이다. 제한없이, 상기 세포는 예를 들어, T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 및 대식세포(M)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 따라서, 세포는 임의적으로 CAR-T 세포, CAR-NK 세포 또는 CAR-M 세포일 수 있고, 임의적으로, 세포가 CAR-T 세포인 경우, 예를 들어 T-세포는 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 효과기 T 세포, 헬퍼 T 세포, 기억 T 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), EBV-특이적 T 세포 수용체(TCR) 또는 γδ-T 세포 하위유형으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 제5 측면은 세포, 보다 특히 재조합 세포, 또는 이러한 세포의 집단(임의적으로 동종 또는 이종 세포 집단)을 생산하는 방법을 제공하며, 방법은 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합, 및/또는 본 발명의 제3 측면에 따른 벡터를 세포로 도입하는 단계를 포함한다.
유전자를 세포로 도입하고 발현하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 발현 벡터의 맥락에서, 벡터는 당업계에서 임의의 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어 포유동물, 박테리아, 효모, 또는 곤충 세포로 용이하게 도입될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 물리적, 화학적, 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포로 형질감염될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포로 도입하기 위한 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격, 미세주사, 전기영동 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Sambrook 등, 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 1-4 권, Cold Spring Harbor Press, NY)을 참조한다. 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포로 도입하기 위한 바람직한 방법은 인산칼슘 형질감염이다.
관심 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포로 도입하기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터, 특히 레트로바이러스 벡터는 유전자를 포유동물, 예를 들어 인간 세포로 삽입하기 위한 가장 널리 사용되는 방법이 되었다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노 연관 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,350,674 및 5,585,362를 참조한다. 관심 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입을 통해 세포에 전달될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포로 도입하기 위한 화학적 수단은 매크로분자 복합체, 나노캡술, 미소구체, 비드, 및 수중유 에멀젼, 미셸(micelle), 혼합 미셸, 및 리포솜을 포함하는 지질-기반 시스템과 같은 콜로이드성 분산 시스템을 포함한다. 전형적으로, 리포솜(예를 들어 인공 막 소포)은 시험관내 및 생체내에서 전달 비히클로서 사용될 수 있다. 표적화된 나노입자 또는 다른 적합한 미크론 미만 크기의 전달 시스템을 사용한 폴리펩티드의 전달과 같은 핵산의 최신 표적 전달의 다른 방법이 이용가능하다.
비바이러스 전달 시스템이 활용되는 경우, 전달 비히클은 리포솜일 수 있다. 지질 제형의 사용은 핵산을 (시험관내, 생체외 또는 생체내에서) 숙주 세포로 도입하기 위해 고려된다. 지질과 연관된 핵산은 리포솜의 수성 내부에 캡슐화되거나, 리포솜의 지질 이중층 내에 산재되어 있거나, 리포솜 및 올리고뉴클레오티드 둘 다와 연관된 연결 분자를 통해 리포솜에 부착되거나, 리포솜에 포획되거나, 리포솜과 복합체화되거나, 지질을 함유하는 용액에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 조합되거나, 지질에 현탁액으로 함유되거나, 미셸을 함유하거나 이와 복합체화되거나, 달리 지질과 연관될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 연관 조성물은 용액에서 임의의 특정 구조로 제한되지 않는다. 예를 들어, 이들은 이중층 구조에, 미셸로서, 또는, "붕괴된" 구조로 존재할 수 있다. 이들은 또한 단순히 용액에 산재되어, 아마도 크기 또는 모양이 균일하지 않는 응집체를 형성할 수 있다. 지질은 자연 발생 또는 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들어, 지질은 세포질에서 자연적으로 발생하는 지방 액적 뿐만 아니라 장쇄 지방족 탄화수소 및 그들의 유도체를 함유하는 화합물 부류, 예컨대 지방산, 알코올, 아민, 아미노 알코올, 및 알데하이드를 포함한다.
사용하기에 적합한 지질은 상업적 공급처로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 디미리스틸 포스파티딜콜린("DMPC")은 미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma로부터 수득될 수 있고; 디세틸 포스페이트("DCP")는 K & K Laboratories(뉴욕주 플레인뷰)로부터 수득될 수 있고; 콜레스테롤("Choi")은 Calbiochem-Behring으로부터 수득될 수 있고; 디미리스틸 포스파티딜글리세롤("DMPG") 및 다른 지질은 Avanti Polar Lipids, Inc.(앨라배마주 버밍햄)로부터 수득될 수 있다.
"리포솜"은 동봉된 지질 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다층판 지질 비히클을 포함하는 일반적인 용어이다. 리포솜은 인지질 이중층 막 및 내부 수성 매질을 갖는 소포 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 다층판 리포솜은 수성 매질에 의해 분리된 다중 지질 층을 가질 수 있다. 이들은 인지질이 과량의 수용액에 현탁될 때 자발적으로 형성된다. 지질 구성요소는 폐쇄 구조의 형성 전에 자기 재배열을 거치고 지질 이중층 사이에 물 및 용해된 용질을 포획한다(Ghosh 등, 1991 Glycobiology 5: 505-10). 그러나, 용액 내에 정상 소포 구조와 상이한 구조를 갖는 조성물이 또한 포함된다. 예를 들어, 지질은 미셸 구조로 가정할 수 있거나 단순히 지질 분자의 균일하지 않은 응집체로서 존재할 수 있다. 또한 리포펙타민-핵산 복합체가 고려된다.
본 발명의 제1 측면의 결합 분자를 암호화하는 하나 이상의 RNA 분자는 일시적 형질감염의 형태를 사용하여 세포에 도입될 수 있다. 암호화 RNA(a)를 세포에 도입하는 다른 방법은 예를 들어, 전기천공법(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems, 독일 쾰른)), (ECM 830(BTX)(Harvard Instruments, 매사추세츠주 보스톤) 또는 Gene Pulser II(BioRad, 콜로라도주 덴버), Multiporator(Eppendort, 독일 함부르크), 리포펙션을 사용한 양이온성 리포솜 매개 형질감염, 중합체 캡슐화, 펩티드 매개 형질감염, 또는 유전자총 입자 전달 시스템 예컨대 "유전자 총"을 포함하나 이에 제한되지 않는다(예를 들어, Nishikawa, 등, Hum Gene Ther., 12(8):861-70(2001) 참조.
외인성 핵산을 숙주 세포로 도입하거나 달리 세포를 본 발명의 핵산 또는 벡터에 노출시키는 데 사용되는 방법에도 불구하고, 숙주 세포에서 핵산의 존재를 확인하기 위해, 다양한 검정이 수행될 수 있다. 이러한 검정은 예를 들어, 서던(Southern) 및 노던(Northern) 블롯팅, RT-PCR 및 PCR과 같은 당업자에게 잘 알려진 "분자 생물학적" 검정; 예를 들어 본 발명의 범위 내에 속하는 제제를 식별하기 위한 면역학적 수단(ELISA 및 웨스턴 블롯) 또는 본원에 기재된 검정에 의해 특정 펩티드의 존재 또는 부재를 검출하는 것과 같은"생화학적" 검정을 포함한다.
상기 방법은 임의적으로 본 발명의 제5 측면에 따라 세포를 선택하는 단계를 추가로 포함하며; 예를 들어 이종 세포 집단으로부터 상기 세포를 선택하여, 풍부화 및/또는 동종 세포 집단을 생성한다. 상기 선택 단계는 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합, 및/또는 본 발명의 제3 측면에 따른 벡터에 존재하는 하나 이상의 선택가능한 마커의 존재를 선택하는 것을 포함할 수 있다.
상기 방법은 임의적으로 상기 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 상기 배양된 세포는 결과적으로 본 발명의 제1 측면에 따른 하나 이상의 결합 분자를 생산할 수 있고, 상기 방법은 상기 배양된 세포로부터 하나 또는 결합 분자의 단리 및/또는 정제를 포함할 수 있다. 임의적으로, 단리된 및/또는 정제된 하나 이상의 결합 분자는 예를 들어 약제학적으로 허용되는 제형으로 제형화되고/되거나, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다.
E. CAR-발현 세포:
상기 논의된 바와 같이, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 제4 측면에 따른 세포는 다음을 포함할 수 있다:
(a) 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합으로서, 여기서 암호화된 결합 분자는 본 발명의 제1 측면에 따른 CAR인 것; 및/또는
(b) 본 발명의 제3 측면에 따른 벡터로서, 여기서 상기 벡터는 이 단락의 (a) 부분에 의해 정의된 바와 같은 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합을 포함하는 것.
제한없이, 상기 세포는 예를 들어, T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 및 대식세포(M)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 따라서, 세포는 임의적으로 CAR-T 세포, CAR-NK 세포 또는 CAR-M 세포일 수 있다.
세포가 CAR-T 세포인 경우, T 세포는 알파-베타 T 세포, 감마-델타 T 세포, 기억 T 세포(예를 들어 줄기 세포-유사 특성을 갖는 기억 T 세포) 중 임의의 것일 수 있다. 예를 들어 T-세포는 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 효과기 T 세포, 헬퍼 T 세포, 기억 T 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), EBV-특이적 T 세포 수용체(TCR) 또는 γδ-T 세포 하위유형으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 면역 세포는 줄기 세포 유사 특성을 갖는 기억 T 세포일 수 있다.
세포가 CAR-NK 세포인 경우, NK 세포는 임의적으로 불변 NK 세포일 수 있다.
세포가 CAR-대식세포(CAR-M) 세포인 경우, 대식세포는 임의적으로 M1-유형 대식세포일 수 있다. Mukhopadhyay(Nature Methods, 2020, 17: 559-565)에 논의된 바와 같이, T 세포 상에서 CAR의 발현이 악성종양의 치료에서 거대한 가능성을 제시하였지만, CAR-T 세포 요법은 T 세포가 고형 종양에 침투할 수 없는 능력, 뿐만 아니라 억제 종양 미세환경(TME)에 의해 방해될 수 있는 반면, CAR을 대식세포(CAR-M)로 도입하면 항종양 반응에 효율적으로 기여할 수 있음을 제시하였다.
그러나, 보다 일반적으로, CAR-발현 세포는 대상체(예를 들어 인간 대상체), 또는 임의의 세포주로부터 유래된 임의의 유형의 세포(예를 들어 면역 세포 예컨대 T-세포)일 수 있음이 이해될 것이다. 이러한 세포는 본 발명에 따른 핵산 또는 벡터를 포함하도록 변형되어 본 발명의 CAR을 발현할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 CAR을 발현하는 세포를 생산하는 방법을 제공하며, 방법은 대상체로부터 유래된 세포를 수득하는 단계 또는 대상체로부터 유래된 세포를 제공하거나 세포주를 제공하는 단계, 및 본 발명의 제2 측면에 따른 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자, 또는 본 발명의 제3 측면에 따른 벡터를 상기 세포 또는 세포주에 도입하는 단계를 포함한다.
대상체의 예는 포유동물, 인간, 개, 고양이, 마우스, 래트 및 이의 유전자이식 종을 포함한다.
세포는 하기에 추가로 기재된 바와 같이 "자가" 또는 "동종이계"일 수 있다.
"자가"란 CAR-발현 세포가 본 출원의 다양한 측면에 따라 CAR-발현 세포가 사용될 개체로부터 기원하는 세포로부터 유래된다는 의미를 포함한다.
"동종이계"란 CAR-발현 세포가 본 발명의 다양한 측면에 따라 CAR-발현 세포가 사용될 개체로부터 기원하지 않는 세포로부터 유래된다는 의미를 포함한다. 전형적으로, 세포는 방법 또는 용도가 수행될 개체와 동일한 종의 세포로부터 유래된다.
T 세포와 같은 면역 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위의 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직, 및 종양의 다수의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 당업계에서 이용가능한 임의의 수의 세포주(예를 들어 면역 세포주 예컨대 T 세포주)가 또한 사용될 수 있다.
구현예에서, 면역 세포(예를 들어 T 세포)는 Ficoll™ 분리와 같은 당업계에 알려진 임의의 적합한 기술을 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 수득된다. 또 다른 구현예에서, 대상체의 순환 혈액으로부터의 세포는 성분채집술(apheresis)에 의해 수득된다. 성분채집술 생성물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구, 및 혈소판을 포함하는 림프구를 함유한다. 성분채집술에 의해 수집된 세포는 혈장 단편을 제거하고 후속 처리 단계를 위해 적절한 완충액 또는 배지에 세포를 넣기 위해 세척될 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, 세포는 포스페이트 완충 염수(PBS)로 세척될 수 있다. 대안적으로, 세척 용액은 칼슘이 부족하고 마그네슘이 부족할 수 있거나 전부는 아니지만 많은 2가 양이온이 부족할 수 있다. 칼슘의 부재 하에 초기 활성화 단계는 확대된 활성화로 이어질 수 있다. 세척 단계는 제조업체의 지침에 따라 반자동 "흐름형(flow-through)" 원심분리(예를 들어, Cobe 2991 세포 처리기, Baxter CytoMate, 또는 Haemonetics Cell Saver 5)를 사용하는 것과 같은 당업자에게 알려진 방법에 의해 달성될 수 있다. 세척 후, 세포는 예를 들어, Ca-무함유, Mg-무함유 PBS, PlasmaLyte A, 또는 완충제가 있거나 없는 다른 염수 용액과 같은 다양한 생체적합성 완충액에 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 성분채집술 샘플의 바람직하지 않은 구성요소는 제거될 수 있거나, 세포가 배양 배지에 직접적으로 재현탁된다.
구현예에서, T 세포는 예를 들어, PERCOLLTM 구배를 통한 원심분리에 의해 또는 역류 원심분리 용출법에 의해 적혈구를 용해하고 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 림프구로부터 단리된다. CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및 CD45RO+T 세포와 같은 T 세포의 특이적 하위집단은 당업계에 알려진 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 추가로 단리될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 원하는 T 세포의 양성 선택에 충분한 기간 동안 항-CD3/항-CD28(예를 들어 3x28)-접합된 비드, 예컨대 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T와 함께 인큐베이션함으로써 단리될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, T 세포 집단은 음성 선택에 의해, 예를 들면 음성으로 선택된 세포에 고유한 표면 마커로 지시된 항체를 조합함으로써 풍부화될 수 있다. 음성 자기 면역부착 또는 유세포 분석법을 통한 세포 분류 및/또는 선택이 사용될 수 있다.
본 발명의 CAR(및/또는 다른 결합 분자)을 발현하도록 변형될 대상체로부터 유래된 세포는 그들의 사용 전에 일정 기간 동안 저장될 수 있음이 이해될 것이다(예를 들어, 하기 치료 방법 참조). 예를 들어, 세포는 임의적으로 세척된 후 동결될 수 있거나, 필요할 때까지 생존한 채 남아있도록 적합한 조건 하에 인큐베이션될 수 있다(예를 들어 2-10℃에서 또는 실온에서 회전기에서). 이 방식으로, 세포는 필요할 때까지 저장될 수 있다. 이들은 비변형된 상태(즉 본 발명의 CAR을 발현하지 않음) 또는 변형된 상태(즉 본 발명의 CAR을 발현하도록 변형됨)로 저장될 수 있다.
하기에 추가로 기재된 치료적 적용에서 사용하기 전에, 세포는 일반적으로 당업계에 알려진 방법을 사용하여 활성화 및 확장될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 CD3/TCR 복합체 연관 신호를 자극하는 제제 및 T 세포 표면 상의 공자극 분자를 자극하는 리간드가 부착된 표면과의 접촉에 의해 확장될 수 있다. 특히, T 세포 집단은 항-CD3 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 표면 상에 고정화된 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이오노포어와 함께 단백질 키나제 C 활성자(예를 들어 브리오스타틴)와의 접촉에 의해서와 같이, 본원에 기재된 바와 같이 자극될 수 있다. T 세포 표면 상의 보조 분자의 공자극을 위해, 보조 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T 세포 집단은 T 세포의 증식을 자극하기에 적절한 조건 하에 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. 항-CD28 항체의 예는 9.3, B-T3, XR-CD28(Diaclone, 프랑스 브장송)을 포함하며 당업계에 통상적으로 알려진 다른 방법으로 사용될 수 있다(Berg 등, Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen 등, J. Exp. Med. 190(9): 13191328, 1999; Garland 등, J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999).
구현예에서, 본 발명의 CAR(및/또는 다른 결합제)을 발현하는 세포는 세포(예를 들어 T 세포)의 활성을 향상시키는 하나 이상의 다른 제제를 포함하거나 발현하도록 추가로 변형된다.
예를 들어, 다른 제제는 효과적인 면역 반응을 일으키는 CAR-발현 세포의 능력을 감소시키는 것으로 알려져 있는 억제 분자를 억제하는 제제일 수 있다. 억제 분자의 예는 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGF-베타 수용체를 포함한다. 억제 분자를 억제하는 제제는 제1 폴리펩티드, 예를 들어 세포에 양성 신호를 제공하는 제2 폴리펩티드와 연관된 억제 분자, 예를 들어 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, 다른 제제는 염증-촉진 또는 증식-촉진 사이토카인일 수 있다. 이러한 사이토카인의 목적은 CAR-발현 세포의 기능, 증식 및/또는 지속성을 향상시키기 위한 자가분비 지원을 제공하는 것, 및/또는 종양 미세환경을 유리하게 변경하고 내인성 선천적 및 동족 면역 효과를 모집하는 것일 수 있다.
본 발명은 본 발명의 제2 측면에 따른 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명의 제4 측면에 따른 하나 이상의 벡터를 포함하는 세포 집단을 제공함이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 CAR(및/또는 다른 결합 분자)을 발현하는 세포 집단(예를 들어 면역 세포 예컨대 T 세포)을 제공한다. 일부 구현예에서, CAR 발현 세포의 집단은 상이한 CAR을 발현하는 세포의 혼합물을 포함한다. 예를 들어, 세포 집단은 본원에 기재된 바와 같은 US28의 ECD3에 대한 특이성이 있는 결합 도메인을 갖는 CAR을 발현하는 제1 세포, 및 항-US28 결합 도메인과 같은 상이한 결합 도메인을 갖는 CAR, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 US28의 ECD3에 대한 특이성을 갖는 상이한 CAR을 발현하는 제2 세포를 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, CAR 발현 세포의 집단은 본원에 기재된 바와 같은 US28의 ECD3에 대한 특이성을 갖는 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제1 세포, 및 US28 이외의 표적에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제2 세포를 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, CAR 발현 세포의 집단은 본원에 기재된 바와 같은 US28의 ECD3에 대한 특이성을 갖는 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제1 세포, 및 CAR 발현 세포(예를 들어 T 세포)의 활성을 향상시키는 하나 이상의 제제를 발현하는 제2 세포를 포함할 수 있다.
CAR 활성 검정
본 발명은 또한 본 발명의 CAR을 제조하는 방법을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 적합한 숙주 세포에서 CAR을 암호화하는 재조합 벡터를 발현시키고, CAR을 회수하는 것을 포함한다. 폴리펩티드(예를 들어 항체)를 발현하고 정제하는 방법은 당업계에 매우 잘 알려져 있다.
일단 본 발명의 CAR이 구성되면, 항원 자극 후 T 세포를 확장하는 능력, 재자극 없이 T 세포 확장을 유지하는 능력, 및 적절한 시험관내 및 생체내(예를 들어 동물) 모델에서 항암 활성을 검정하는 것을 포함하는 다양한 검정을 사용하여 활성을 평가할 수 있다.
항원 자극 후 CAR-발현 세포(예를 들어 T 세포)의 시험관내 확장은 유세포 분석법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 세포는 형광 리포터, 및 US28의 존재 또는 부재 하에, 및/또는 본 발명의 제13 및/또는 제14 측면에 따른 하나 이상의 펩티드의 존재 또는 부재 하에 측정된 형광과 함께 CAR을 발현할 수 있다. 적합한 방법은 Milone 등, Molecular Therapy 17(8): 1453-1464(2009)에 기재되어 있다.
또한 CAR 발현 세포(예를 들어 면역 세포 예컨대 T 세포)의 활성을 측정하기 위해 동물 모델이 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역결핍 마우스에서 프리-B ALL을 치료하는 데 있어서 CD19-특이적 CAR-발현 T 세포에 대해 수행된 것과 같이, 면역결핍 마우스에서 원발성 인간 US28-발현 암을 치료하기 위해 US28-특이적 CAR-발현 T 세포를 사용하는 이종이식 모델이 사용될 수 있다(예를 들어 Milone 등, Molecular Therapy 17(8): 1453-1464(2009) 참조).
또한, CAR의 활성은 세포 증식 및 사이토카인 생산을 평가함으로써 결정될 수 있다(예를 들어 Milone 등, Molecular Therapy 17(8): 1453-1464(2009) 참조).
또한 종양-보유 동물 모델에서 CAR의 특이적 트래피킹 및 증식을 평가하기 위해 영상화 기술이 사용될 수 있다. 이러한 검정은 예를 들어, Barrett 등, Human Gene Therapy 22: 1575-1586(2011)에 기재되었다.
본 발명의 CAR 작제물을 평가하기 위해 당업계에 알려진 것들을 포함하는 다른 검정이 또한 사용될 수 있다.
CAR-발현 세포 요법과 조합하여 유용한 제제:
본 발명은 또한 상기 CAR-발현 세포의 효능, 및/또는 증식, 및/또는 지속성을 증가시키는 제제와 조합하여 CAR-발현 세포의 사용을 고려한다. 바람직하게는 CAR-발현 세포의 효능, 및/또는 증식, 및/또는 지속성을 증가시키는 제제는 사이토카인이다.
추가의 치료제는 CAR-발현 세포(예를 들어 T 세포)의 효능/지속성/확장을 향상시키는 사이토카인일 수 있다.
추가의 치료제는 CAR-발현 세포의 투여와 연관된 하나 이상의 부작용을 개선하는 제제일 수 있다. 예를 들어, 추가의 치료제는 "사이토카인 폭풍"(예를 들어 항-IL6 항체)을 치료하는 데 사용될 수 있다. "사이토카인 폭풍"(사이토카인 캐스케이트 및 고사이토카인혈증으로도 알려짐)이란 병원체 및 면역 손상에 의한 T 세포 및 대식세포의 자극에 반응하여 염증 매개자(사이토카인)의 잠재적으로 치명적인 과다 방출을 의미한다.
추가의 치료제는 CTLA-4(예를 들어 이필리무맙(ipilimumab) 및 트레멜리무맙(tremelimumab)), PD-1(예를 들어 니볼루맙(nivolumab), 펨브롤리주맙(pembrolizumab) 및 피딜리주맙(pidilizumab)) 및/또는 PD-L1(예를 들어 MDX-1105 및 MPDL3280A)을 차단하는 항체, 또는 항체의 조합일 수 있다.
CAR-T 세포 요법은 케모카인 수용체(CXCR2 또는 CCR4)의 공발현을 통해 또는 케모카인과의 조합을 통해 종양 조직으로 지시될 수 있음이 확인되었다(Di Stasi 등, 2009, Blood,　113:6392-6402; Kershaw 등, 2002, Hum Gene Ther.,　13:1971-1980). US28은 다중 CC 케모카인 뿐만 아니라 CX3CR1에도 결합하므로 이것은 선택일 수 있다.
Xia　등, 2016, Cancer Res.　76:6747-6759는 종양용해성 바이러스와 CAR-T 세포 요법의 조합이 인터페론 유전자 단백질-비활성화 및 유형 I IFN-파괴 종양의 자극인자에서 특히 효과적일 수 있음을 제안하였다. 대조적으로, Ajina 및 Maher(J Immunother Cancer.,　2017; 5:90), Kim(Nat Commun.　2017; 8:344) 및 Scott　등(Macromol Biosci.,　2018 Jan; 18)은 종양용해성 바이러스 감염이 CAR-T 세포의 진입 및 동원을 증가시키고, 국소 면역억제를 완화 또는 역전시키고 CAR-T 세포 효과기의 기능 및 지속성을 향상시킬 수 있음을 나타내었다.
F. 결합 분자의 생산 및 정제
본 발명의 제6 측면은 본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자, 예를 들어 본 발명의 제1 측면에 따른 항체 또는 CAR을 생산하는 방법을 제공하며, 방법은 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합, 및/또는 본 발명의 제3 측면에 따른 벡터를 세포, 보다 특히 재조합 세포, 또는 이러한 세포의 집단(임의적으로 동종 또는 이종 세포 집단)에서 발현시키는 단계를 포함한다. 상기 세포 또는 세포들은 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 본 발명의 제5 측면에 따른 세포일 수 있다.
임의적으로, 본 발명의 제6 측면의 방법은 또한 이렇게 생산된 결합 분자를 세포로부터 단리 또는 정제하는 단계를 포함할 수 있으며; 예를 들어, 여기서 결합 분자는 본 발명의 제1 측면에 따른 항체, 상기 항체의 기능적 단편, 또는 본 발명의 제1 측면에 따른 융합 폴리펩티드 서열을 포함하는 이의 기능적 단편의 항체이다.
따라서, 특정 구현예에서, 본 개시내용의 결합 분자는 정제될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "정제된"은 다른 구성요소로부터 단리가능한 조성물을 지칭하는 것으로 의도되며, 여기서 결합 분자는 초기 생산 후에 수득가능한 상태, 예를 들어 세포 또는 세포 배양물에서 생산되는 상태에 비해 임의의 정도로 정제된다. 용어 "실질적으로 정제된"이 사용되는 경우, 이 명칭은 결합 분자가 조성물 중 단백질성 함량의 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 이상(중량 기준)을 구성하는 것과 같이 조성물의 주요 구성요소를 형성하는 조성물을 지칭할 것이다.
단백질 정제 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 기술은 하나의 수준에서, 폴리펩티드 및 비-폴리펩티드 분획에 대한 세포 환경의 조질 분획화를 수반한다. 다른 단백질로부터 관심 폴리펩티드(예를 들어 본 발명의 결합 분자)를 분리하면, 관심 폴리펩티드는 크로마토그래픽 및 전기영동 기술을 사용하여 추가로 정제되어 부분 또는 완전 정제(또는 균일성에 대한 정제)를 달성할 수 있다. 순수 펩티드의 제조에 특히 적합한 분석 방법은 이온-교환 크로마토그래피, 제외 크로마토그래피; 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; 등전 포커싱이다. 단백질 정제를 위한 다른 방법은 황산암모늄, PEG, 항체 등을 사용한 침전 또는 열 변성 후 원심분리; 겔 여과, 역상, 하이드록실아파타이트 및 친화성 크로마토그래피; 및 이러한 기술 및 다른 기술의 조합을 포함한다.
본 발명의 항체 또는 다른 결합 분자를 정제하는 데 있어서, 원핵생물 또는 진핵생물 발현 시스템에서 폴리펩티드를 발현하고 변성 조건을 사용하여 단백질을 추출하는 것이 바람직할 수 있다. 폴리펩티드는 폴리펩티드의 태깅된 부분에 결합하는 친화성 컬럼을 사용하여 다른 세포 구성요소로부터 정제될 수 있다. 당업계에 일반적으로 알려진 바와 같이, 다양한 정제 단계를 수행하는 순서가 변할 수 있거나, 특정 단계가 생략될 수 있고, 여전히 실질적으로 정제된 단백질 또는 펩티드의 제조에 적합한 방법을 초래할 수 있는 것으로 여겨진다.
통상적으로, 완전 항체는 항체의 Fc 부분에 결합하는 제제(즉, 단백질 A)를 활용하여 분획화된다. 대안적으로, 항원을 사용하여 적절한 항체를 동시에 정제하고 선택할 수 있다. 예를 들어, US28의 ECD3에 대한 결합 특이성을 보유하는 본 발명에 따른 결합 분자의 맥락에서, 적합한 항원은 본 발명의 제13 및/또는 제14 측면 중 어느 하나 또는 둘 다로부터 선택된 펩티드 또는 폴리펩티드 중 하나 이상, 본 발명의 제15 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합, 본 발명의 제16 측면에 따른 융합 단백질, 및/또는 본 발명의 제17 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 융합 단백질의 조합, 본 발명의 제18 측면에 따른 접합체, 및/또는 본 발명의 제19 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 접합체의 조합을 포함할 수 있다.
이러한 방법은 종종 컬럼, 필터 또는 비드와 같은 지지체에 결합된 선택 제제를 활용한다. 항체 또는 다른 결합 분자는 지지체에 결합될 수 있고, 오염물이 제거(예를 들어, 세척)될 수 있고, 조건(염, 열 등)을 적용함으로써 항체(또는 다른 결합 분자)가 방출될 수 있다.
단백질 또는 펩티드의 정제 정도를 정량화하는 다양한 방법은 본 개시내용에 비추어 당업자에게 알려져 있을 것이다. 이들은 예를 들어, 활성 분획의 특이적 활성을 결정하거나, SDS/PAGE 분석에 의해 분획 내의 폴리펩티드의 양을 평가하는 것을 포함한다. 분획의 순도를 평가하기 위한 또 다른 방법은 초기 추출물의 특이적 활성과 비교하여, 분획의 특이적 활성을 계산하고, 따라서 순도를 계산하는 것이다. 활성의 양을 나타내는 데 사용되는 실제 단위는 물론 정제를 따르기 위해 선택된 특정 검정 기술 및 발현된 단백질 또는 펩티드가 검출가능한 활성을 나타내는지 여부에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 제7 측면은 본 발명의 제6 측면의 방법에 의해 수득되거나, 수득가능한 단리된 및/또는 정제된 결합 분자를 제공하며, 임의적으로, 여기서 단리된 결합 분자는 대상체에게 투여하기 위해 추가로 제형화된다.
하나의 구현예에서 본 발명의 결합 분자는 약제학적 조성물로서 제형화될 수 있으며; 상기 조성물은 약제학적 유효량의 본원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 본 발명의 결합 분자를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 애쥬번트, 희석제 또는 담체를 추가로 포함하며, 이는 전형적으로 의도된 투여 경로 및 표준 약제학적 관행과 관련하여 선택될 것이다. 조성물은 즉시-, 지연- 또는 제어-방출 적용 형태일 수 있다. 바람직하게는, 제형은 활성 성분의 일일 용량 또는 단위, 일일 하위 용량 또는 이의 적절한 분율을 함유하는 단위 투여량이다.
어구 "약제학적 또는 수의학적 허용되는"은 적절한 경우 동물 또는 인간에게 투여될 때 불리한 반응, 알레르기 반응 또는 다른 원치않은 반응을 생산하지 않는 조성물에 대한 언급을 포함한다. 이러한 약제학적 또는 수의학적 조성물의 제조는 본원에 참조로 포함된 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990에 의해 예시된 바와 같이, 본 개시내용에 비추어 당업자에게 알려져 있다. 더욱이, 동물 또는 인간 투여의 경우, 제제가 FDA 생물 표준 사무국에서 요구한 바와 같은 멸균성, 발열성, 일반적인 안전성 및 순도 표준을 충족해야 함이 이해될 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체"는 의약 분약의 숙련자에게 알려진 바와 같은, 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 계면활성제, 산화방지제, 방부제(예를 들어, 항미생물제, 항진균제), 등장성제, 염, 방부제, 약물, 약물 안정화제, 부형제, 붕해제, 이러한 유사 물질 및 이의 조합을 포함한다. 임의의 통상적인 담체가 활성 성분과 호환될 수 없는 경우를 제외하고, 치료적 또는 약제학적 조성물에서의 사용이 고려된다.
하나의 구현예에서, 약제학적 조성물은 추가의 약물, 및/또는 다른 치료제, 예방제 또는 진단제를 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 결합 분자, 본원에 기재된 조성물, 또는 본원에 기재된 약제학적 조성물은 경구, 비경구, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 안구내, 두개내, 대뇌내, 골내, 뇌실내, 경막내 또는 피하 투여를 위해 제형화된다.
멸균 주사가능 용액은 본 발명의 결합 분자를 필요에 따라 상기 열거된 다양한 다른 성분과 함께 절절한 용매에 필요한 양으로 혼입한 후, 멸균화함으로써 제조될 수 있다. 약제학적 조성물은 다른 물질, 예를 들어, 용액을 혈액과 등장성이게 만들기에 충분한 염 또는 글루코스를 함유할 수 있는 멸균 수용액의 형태로 최상으로 사용될 수 있다. 수용액은 필요에 따라 적합하게 완충될 수 있다(바람직하게는 pH 3 내지 9). 멸균 조건 하에 적합한 약제학적 제형의 제제는 의약 분야의 숙련자에게 잘 알려진 표준 약제학적 기술에 의해 용이하게 달성된다.
본 발명에 따른 약제학적 또는 수의학적 조성물은 대안적으로 동결건조된 분말일 수 있는 멸균 분말과 같은 분말 형태로 제형화될 수 있다.
G. HCMV 및/또는 HCMV와 연관된 질환 또는 병태의 퇴치
본 발명의 제11 측면은 HCMV 또는 HCMV와 연관된 질환 또는 병태를 퇴치하는 방법을 제공한다.
이러한 맥락에서, 용어 "퇴치하는"은 임의적으로 HCMV 감염 또는 HCMV 감염과 연관된 질환 또는 병태의 예방, 백신접종, 위험 감소, 예방, 치료, 개선, 진행 둔화 또는 방지, 역전 및/또는 치유 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다.
하나의 옵션에서, 용어 "퇴치하는"은 치료적 치료를 지칭할 수 있다. 이러한 치료적 치료는 질환 증상의 중증도 감소, 및/또는 무증상 기간의 빈도 또는 지속기간 증가를 초래할 수 있다. 이를 달성하기에 적절한 양은 "치료적 유효량"으로 정의된다.
예방적 적용에서, 방법의 대상체는 아직 HCMV 감염의 증상 또는 HCMV 감염과 연관된 질환 또는 병태를 나타내지 않을 수 있고, 방법은 증상 발달을 예방하거나 지연시키는 데 사용될 수 있다. 이를 달성하기에 충분한 양은 "예방적 유효량"으로 정의된다. 대상체는 임의의 적합한 수단에 의해 질환 또는 병태가 발생할 위험이 있는 것으로 식별되었다.
본 발명의 제11 측면의 방법은 대상체에게, 또는 생체외 또는 시험관내 세포 물질에 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 제제를 투여하는 단계를 포함한다:
i. 본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자,
ii. 본 발명의 제1 측면에 따른 상기 결합 분자의 기능적 단편,
iii. 본 발명의 제7 측면에 따른 단리된 결합 분자,
iv. 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합,
v. 본 발명의 제3 측면에 따른 벡터,
vi. 본 발명의 제4 측면에 따른 세포,
vii. 본 발명의 제8 측면에 따른 접합체, 및
viii. 본 발명의 제10 측면에 따른 단리된 접합체.
다르게 말하면, 본 발명의 제11 측면은 대상체에서, 또는 생체외 또는 시험관내 세포 물질에서 HCMV와 연관된 질환 또는 병태를 퇴치하는 데 사용하기 위한 상기 제제 중 하나 이상을 제공한다.
또한, 본 발명의 제11 측면은 대상체에서, 또는 생체외 또는 시험관내 세포 물질에서 HCMV와 연관된 질환 또는 병태를 퇴치하기 위한 약제의 제조에서 상기 제제 중 하나 이상의 용도를 제공한다.
대상체는 바람직하게는 인간이다. 그러나, 대상체는 비인간, 예컨대 임의의 비인간 포유동물, 예를 들어 말, 개, 돼지, 소, 양, 래트, 마우스, 기니 피그 또는 영장류일 수 있음이 또한 이해될 것이며, 예를 들어 여기서 비인간 동물은 HCMV의 담체일 수 있는 이식된 인간 세포를 갖는 인간화 동물 모델이다.
대상체는 임의적으로 수컷, 예컨대 남성일 수 있다.
대상체는 임의적으로 암컷, 예컨대 여성일 수 있다.
대상체는 예를 들어, 성인, 미성년, 청소년, 아동, 유아, 신생아, 태아 또는 배아; 예컨대 인간 성인, 인간 미성년, 인간 청소년, 인간 아동, 인간 유아, 인간 신생아, 인간 태아 또는 인간 배아일 수 있다.
대상체는 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 8, 9, 10, 11 또는 12개월 미만의 인간 유아일 수 있다.
대상체는 예를 들어, 적어도 1세 이상, 예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20세 이상; 및 임의적으로 100, 90, 85, 80, 75, 65, 60, 55, 50, 45 또는 40세 미만의 인간(예를 들어 남성 및/또는 여성)일 수 있다.
대상체는 예를 들어, 적어도 20세 이상, 예를 들어, 적어도 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 또는 80세 이상; 및 임의적으로 100, 90 또는 85세 미만의 인간(예를 들어 남성 및/또는 여성)일 수 있다.
상기 대상체는 실제(양성 진단 포함), 의심, 또는 잠재적 HCMV 감염이 있는 대상체일 수 있다. 따라서, 대상체는 상기 대상체로부터 취한 생물학적 샘플(예를 들어 혈액, 타액 및/또는 소변)에서 HCMV 바이러스의 직접 검출에 의한 실제 HCMV 감염을 갖는 것으로 결정될 수 있다.
상기 대상체는 임의적으로 HCMV 감염 및/또는 이와 연관된 임의의 병태 또는 증상에 대한 임의의 하나 이상의 다른 치료를 받았거나, 계속 받고 있거나, 후속적으로 받을 대상체일 수 있다. HCMV 감염의 진행을 억제하는 데 사용될 수 있는 당업계에 알려진 두가지 약물은 간시클로비르 및 포스카네트이다. 전형적으로, 이들은 정맥내로 전달되고, 전형적으로 치료는 장기간에 걸쳐 계속된다. 눈의 CMV 감염에 대해 승인된 정제 형태의 간시클로비르가 이용가능하게 되었다. 또한, 유리체내 이식물(예를 들어 Vitrasert Implant) 형태로 전달된 간시클로비르는 눈에 약물의 장기간 전달을 제공하는 수단으로 이용가능하다. 이 전달 시스템은 전형적으로 전달 시스템을 이식하기 위해 눈(들)에 약간의 작업이 필요하다. 이러한 전달 형태는 전형적으로 3 내지 6개월 동안 지속된 후 반복되어야 한다. 출생 시 선천성 CMV 감염의 징후가 있는 아기의 경우, 항바이러스 약제인 주로 발간시클로비르가　청력 및 발달 결과를 개선시킬 수 있다. 발간시클로비르는 심각한 부작용이 있을 수 있고 선천성 CMV 감염의 징후가 있는 아기에서만 연구되었다. 정맥내 HCMV 면역 글로불린(인간)(CMV IGIV)이 또한 사용되었다. CMV IGIV는 사이토메갈로바이러스(CMV)에 대한 항체에서 풍부한 정맥내 면역 글로불린이며; 신장, 폐, 간, 췌장, 및 심장의 이식과 연관된 CMV 질환에 대한 예방적 조치(예방)로서 미국 FDA에 의해 승인받았다.
HCMV 감염이 의심되는 대상체는 HCMV 바이러스 보유에 대해 반드시 직접적으로 테스트되지 않을 수 있지만, HCMV 감염의 하나 이상의 증상을 보일 수 있다. 예를 들어, 달리 건강한 성인에서 HCMV 감염(특히, 용해성 HMCV 감염)과 연관된 증상은 예를 들어 피로; 발열; 인후통; 및/또는 근육통 중 임의의 1, 2, 3 또는 4개 모두를 포함하는 감염성 단핵구증과 유사한 증상을 포함할 수 있다. 특히 면역력이 약화된 개체 및/또는 면역력이 저하된 개체에서 추가 증상은 눈, 폐, 간, 식도, 위, 장 및/또는 뇌 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개 모두에 문제가 있을 수 있다. 선천성 HCMV 감염(특히 용해성 HMCV 감염)이 있는 유아에서 HCMV와 연관된 증상은 예를 들어, 다음 특징 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개 모두일 수 있다: 조산; 저체중; 황색 피부 및 눈(황달); 확대되고 불량하게 기능하는 간; 자주색 피부 반점 또는 발진 또는 둘 다; 비정상적으로 작은 머리(소뇌증); 확대된 비장; 폐렴; 및/또는 발작.
HCMV는 체액, 예컨대 혈액, 타액, 소변, 정액 및 모유를 포함한 다양한 경로를 통해 감염된 사람에서 비감염된 사람으로 전파될 수 있다. 예를 들어, 전염은 감염된 사람의 체액과 접촉한 후 대상체가 눈이나 코 또는 입 안쪽을 만지거나; 감염된 사람과 성적 접촉하거나; 감염된 어머니의 모유와 접촉(섭취 포함)하거나; 감염된 사람의 생물학적 물질(기관, 조직, 골수 또는 줄기 세포 이식)과의 접촉(예를 들어 착상(implantation) 또는 이식 포함) 또는 수혈에 의해; 또는 감염된 어머니가 출산 전 또는 동안 아기에게 바이러스를 옮길 수 있는 임신 및/또는 출산 중에 발생할 수 있다. 잠재적인 HCMV 감염이 있는 대상체는 HCMV 바이러스 보유에 대해 직접적으로 테스트되지 않았을 수 있고/있거나 HCMV 감염의 하나 이상의 증상을 보이지 않을 수 있지만, 그럼에도 불구하고 상기 정의된 경로 중 임의의 하나 이상에 의해서와 같이, 하나 이상의 감염된 개체로부터 HCMV에 걸릴 위험이 있는 병력(예를 들어 예를 들어 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2 또는 1년 이전 이내, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개월 이전, 또는 4, 3, 2, 또는 1주 이전 이내, 또는 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1일 이전 이내와 같은 최근 병력)이 있을 수 있고, 따라서 본 발명에 따른 잠재적인 HCMV 감염이 있는 대상체로서 특징될 수 있다.
본 발명의 제11 측면에 따라 퇴치될 HCMV와 연관된 질환 또는 병태는 HCMV 감염일 수 있거나 HCMV 감염과 연관될 수 있다. 하기에 추가로 논의된 바와 같이, HMCV-감염된 암은 본 발명의 특히 관심 대상이지만, 임의의 맥락에서 HCMV 감염, 및 HCMV 감염과 연관된 임의의 질환 또는 병태가 본 발명에 따라 퇴치할 관심 대상이다.
임의적으로, 본 발명의 제11 측면에 따라 퇴치될 질환, 장애 또는 병태는 특히 US28의 표면 발현 및 세포 표면에서 US28의 ECD3의 노출을 포함하여, US28의 발현과 연관될 수 있다. 이것은 예를 들어, US28을 발현하는 세포와 연관된 임의의 질환 또는 병태를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포는 원치않은 세포일 수 있다. 원치않은 세포는 숙주에 존재하는 것이 바람직하지 않은 임의의 세포일 수 있다. 따라서, US28의 발현과 연관된 질환 또는 병태는 US28을 발현하고 원치않은 세포의 존재를 특징으로 하는 임의의 병태, 예를 들어, 병리학의 적어도 일부가 US28을 발현하는 이러한 원치않은 세포의 존재에 의해 매개되는 임의의 생물학적 또는 의학적 병태 또는 장애일 수 있다. 병태는 원치않은 세포의 존재에 의해 야기될 수 있거나 달리 원치않은 세포의 존재는 병태의 영향일 수 있다.
US28의 발현이란 US28 단백질이 세포 상에서 또는 내에서, 또는 세포로부터 제조된 추출물에서 검출될 수 있거나, 폴리펩티드의 발현이 US28-암호화 mRNA의 검출에 의해 추론될 수 있다는 의미를 포함한다. 세포 상에서 또는 내에서 US28의 발현을 확인하기 위해, 다양한 검정이 수행될 수 있다. 이러한 검정은 예를 들어, 면역학적 수단(ELISA 및 웨스턴 블롯)에 의해 특정 단백질(즉 US28)의 존재를 검출하는 것과 같은 당업자에게 잘 알려진 생물학적 검정, 또는 US28 mRNA의 존재를 검출하기 위한 노던 블롯팅, RT-PCR 및 PCR과 같은 당업자에게 잘 알려진 분자 생물학적 검정을 포함한다. 그러나, 본원에 추가로 기재된 바와 같이, US28의 검출은 HCMV의 상이한 균주 사이의 아미노산 수준에서 변이 및/또는 유전적 수준에서 다형성에 의해 복잡해질 수 있고, 특정 방법은 HCMV의 제한된 수의 균주로부터 US28 단백질 발현의 검출에 민감하고/하거나 허용할 수 있다. 이것은 다른 균주로부터 HCMV 감염을 검출하지 못할 수 있다. US28 발현은 균주-불가지론적 접근법을 사용하여 검출되는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 결합 분자는 US28의 ECD3에 대한 균주 불가지론적 결합을 제공할 수 있고, 대상체의 하나 이상의 세포 상에서 또는 내에서, 또는 세포로부터 제조된 추출물에서 US28 발현을 평가하는 특히 바람직한 접근법일 수 있다.
임의적으로, HCMV 감염은 무증상일 수 있고/있거나, 진단되지 않을 수 있다. 임의적으로, HCMV 감염은 잠복성 감염일 수 있으며, 예를 들어 골수에 상주하는 CD34+ 조혈 전구체 세포 집단에서 주로 상주하는 바이러스 게놈과 함께 낮은 수준 또는 존재하지 않는 바이러스 복제를 특징으로 할 수 있다.
HCMV와 연관된 질환 또는 병태가 퇴치되어야 할 대상체는 면역력이 저하된 환자, 예를 들어 1차 HCMV 감염, 재감염 또는 재활성화가 하나 이상의 많은 기관에 영향을 미치는 생명을 위협하는 질환과 같은 질환을 유발할 수 있는 환자일 수 있다. 면역력이 저하된 사람은 예를 들어 눈, 폐, 간, 식도, 위, 장 및/또는 뇌 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 모두에 영향을 미치는 하나 이상의 심각한 문제를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 면역력이 저하된 대상체는 예를 들어, 기관, 줄기 세포 또는 골수 이식과 같은 생물학적 물질의 이식을 받거나, 받았거나, 받을 의도가 있는 사람일 수 있으며; 추가로, 또는 대안적으로, 하나의 옵션에서, 이식될 생물학적 물질은 본 발명의 제11 측면에 따라 치료될 생체외 또는 시험관내 세포 물질일 수 있다.
HCMV는 가장 흔한 선천성 바이러스 감염 중 하나이고 선천적 결손증의 가장 중요한 원인이다. 영아는 또한 출생 중 또는 출생 직후 감염될 수 있으며(출산 전후 HCMV); 이 그룹은 모유를 통해 감염된 아기를 포함한다. 따라서, HCMV와 연관된 병태는 선천성 HCMV 감염 또는 선천성 HCMV-연관 선천적 결함일 수 있거나 출산 전후 HCMV 감염 또는 출산 전후 HCMV-연관 질환 또는 병태일 수 있다. 아기에서 선천성 HCMV 감염은 예를 들어, 다음 특징: 조산; 저체중; 황색 피부 및 눈(황달); 확대되고 좋지 않게 기능하는 간; 자주색 피부 반점 또는 발진 또는 둘 다; 비정상적으로 작은 머리(소뇌증); 확대된 비장; 폐렴; 및/또는 발작 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개 모두를 나타내는 병태를 특징으로 할 수 있으며; 어떤 경우에도 상기 아기에서 HCMV 감염의 직접 검출은 선천성 감염을 확인하는 데 사용될 수 있다.
대상체는 예를 들어, 영아일 수 있다. 상기 영아는 실제(양성 진단 포함), 의심, 또는 잠재적 HCMV 감염이 있는 어머니에서 태어난 신생아일 수 있다. 상기 영아는 실제(양성 진단 포함), 의심, 또는 잠재적 HCMV 감염이 있는 환자(특히, 어머니)가 있는 영아일 수 있다. 상기 영아는 실제(양성 진단 포함), 의심, 또는 잠재적 HCMV 감염이 있는 어머니에 의해 모유 수유받는 영아일 수 있다. 대상체는 실제(양성 진단 포함), 의심, 또는 잠재적 HCMV 감염이 있는 어머니에 의해 옮겨진 태아 또는 배아일 수 있다. 대상체는 실제(양성 진단 포함), 의심, 또는 잠재적 HCMV 감염이 있는 어머니, 임신한 여성, 또는 예비 어머니일 수 있다. 대상체는 실제(양성 진단 포함), 의심, 또는 잠재적 HCMV 감염이 있는 모유 수유 어머니일 수 있다. 대상체는 임신 전에 실제(양성 진단 포함), 의심, 또는 잠재적 HCMV 감염이 있는 여성일 수 있다.
HCMV와 연관된 병태는 예를 들어, 아테롬성동맥경화증, 또는 자가면역 질환과 같은 심혈관 질환일 수 있다.
HCMV 혈청 상태는 화상, 외상, 패혈증, 및 HCMV 이외의 박테리아 및/또는 바이러스와 같은 병원체로의 감염의 임상 과정에 추가로 영향을 미칠 수 있고; HCMV와 연관된 질환 또는 병태가 퇴치될 대상체는 화상 손상, 외상, 패혈증 및/또는 병원성 감염(예를 들어 박테리아 감염 또는 HCMV 이외의 바이러스로 감염)을 앓고 있는 대상체일 수 있고/있거나 상기 HCMV와 연관된 질환 또는 병태는 화상 손상, 외상, 패혈증 및/또는 병원성 감염(예를 들어 박테리아 감염 또는 HCMV 이외의 바이러스로 감염) 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다. 특히 면역력이 약화된 개체 및/또는 면역력이 저하된 개체에서 HCMV와 연관된 병태는 예를 들어, 눈의 빛 감지 층의 염증(망막염)으로 인한 시력 상실; 결장(대장염), 식도(식도염) 및/또는 간(간염)의 염증을 포함하는 소화계 문제; 뇌 염증(뇌염)을 포함하는 신경계 문제; 및/또는 폐렴 중 임의의 하나 이상일 수 있다.
선천성 HCMV 감염이 있는 영아에서 HCMV와 연관된 병태는 예를 들어, 청각 상실, 지적 장애, 시력 문제, 발작, 조정 부족, 쇠약 및/또는 근육 사용 문제 중 임의의 하나 이상일 수 있다.
HCMV 감염은 하나의 구현예에서, 단일 균주 감염일 수 있다.
대안적인 구현예에서, HCMV 감염은 다중 균주 HCMV 감염을 포함하며, 여기서 다중 균주 HCMV 감염은 HCMV의 하나 초과의 상이한 균주, 예를 들어 2개 이상의 상이한 HCMV 균주로의 감염을 포함한다. 이러한 다중 균주 감염은 통상적이며, 다중 균주 감염에서 HCMV 균주의 전부가 아니라 일부만을 표적할 수 있는 제제는 상기 제제에 의해 표적화된 하나 이상의 경쟁 HCMV 균주를 억제하거나 제거함으로써, 다중 균주 HCMV 감염에서 표적되지 않은 균주(들)를 촉진할 수 있는 선택압을 생성할 위험이 있을 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 실제, 의심, 또는 잠재적 다중 균주 HCMV 감염을 퇴치하는 접근법을 선택하는 경우, 균주 불가지론적 효과를 제공하는 치료 양식을 사용하는 것이 특히 바람직하다. 이에 의해 본 발명에 따른 균주 불가지론적 제제의 사용은 다중 균주 HCMV 감염에서 모든 HCMV 균주가 균주 불가지론적 제제에 의해 표적되기 때문에, 다중 균주 HCMV 감염에 존재하는 하나 이상의 HCMV 균주에 의한 감염의 발생을 선택적으로 촉진하는 치료된 대상체에서 병태의 생성을 방지하는 데 사용될 수 있다.
임의적으로, 다중 균주 감염의 2개 이상의 상이한 HCMV 균주는 상이한 US28 단백질 암호화 서열을 암호화한다. 상기 2개 이상의 균주는 N-말단(ECD1) 영역, 제1 세포외 루프(ECD2) 영역, 제2 세포외 루프(ECD3) 영역, 및/또는 제3 세포외 루프(ECD4) 영역에서와 같은 세포외 영역 중 하나 이상에서 상이한 US28 단백질을 암호화할 수 있다. 하나의 관심 구현예에서, 다중 균주 HCMV 감염에서 2개 이상의 HCMV 균주는 각각 적어도 N-말단(ECD1) 영역의 하나 이상의 위치에서 다른 것과 상이한 US28 단백질을 암호화하며; 예를 들어 이들은 N-말단(ECD1) 영역에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10개 이상의 아미노산 위치에서 상이할 수 있다. 추가로, 또는 대안적으로, 또 다른 관심 구현예에서, 다중 균주 HCMV 감염에서 2개 이상의 HCMV 균주 각각은 제2 세포외 루프(ECD3) 영역의 하나 이상의 위치에서 다른 것과 상이한 US28 단백질을 암호화하며, 예를 들어 다중 균주 HCMV 감염에서 HCMV 균주 중 하나 이상은 ECD3의 4N-변이체를 암호화하는 US28 단백질을 암호화할 수 있고, 다중 균주 HCMV 감염에서 다른 HCMV 균주 중 하나 이상은 ECD3의 4D-변이체를 암호화하는 US28 단백질을 암호화할 수 있다. 예를 들어, 상이한 US28 단백질 암호화 서열을 암호화하는 2개 이상의 HCMV 균주는 HCMV 균주 DB(수탁 번호 KT959235), HCMV 균주 Toledo(수탁 번호 GU937742), HCMV 균주 Towne(수탁 번호 FJ616285), HCMV 균주 VR1814(수탁 번호 GU179289), HCMV 균주 TB40/E(수탁 번호 KF297339), HCMV 균주 Merlin(수탁 번호 AY446894), HCMV 균주 JP(수탁 번호 GQ221975), HCMV 균주 Ad169(수탁 번호 X17403.1), HCMV 균주 AF1(수탁 번호 GU179291.1), HCMV 균주 VHL/E(수탁 번호 L20501.1), HCMV 균주 BL(수탁 번호 MW980585), HCMV 균주 DAVIS(수탁 번호 JX512198.1), HCMV 균주 TR(수탁 번호 KF021605.1) 중 임의의 2개 이상으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 제11 측면에 따라 퇴치될 HCMV와 연관된 질환 또는 병태는 잠복성 HCMV 감염(예를 들어, 단일 또는 다중 균주 잠복성 HCMV 감염)일 수 있거나 잠복성 HCMV 감염(임의적으로 다중 균주 잠복성 HCMV 감염)과 연관될 수 있다.
본 발명의 제11 측면에 따라 퇴치될 HCMV와 연관된 질환 또는 병태는 용해성 HCMV 감염(임의적으로 다중 균주 용해성 HCMV 감염)일 수 있거나 용해성 HCMV 감염(임의적으로 다중 균주 용해성 HCMV 감염)과 연관될 수 있다.
본 발명의 제11 측면에 따라 퇴치될 HCMV와 연관된 질환 또는 병태는 선천성 HCMV 감염(예를 들어, 단일 또는 다중 균주 감염), 예컨대 잠복성 선천성 단일 또는 다중 균주 HCMV 감염 또는 용해성 선천성 단일 또는 다중 균주 HCMV 감염일 수 있다;
본 발명의 제11 측면에 따라 퇴치될 HCMV와 연관된 질환 또는 병태는 암, 예를 들어 HCMV-감염된 암(임의적으로 단일 균주, 또는 다중 균주, HCMV 감염된 암), 예컨대 잠복성 HCMV-감염된 암(임의적으로 단일 균주, 또는 다중 균주, 잠복성 HCMV 감염된 암)일 수 있다.
암은 대상체의 신체에서 1차, 2차 또는 임의의 다른 종양 부위에 있을 수 있다.
종양은 종종 등급 및 병기로 할당된다. 고형 종양의 병기는 그의 크기 또는 정도 및 다른 기관 및 조직으로 전이며었는지 여부를 지칭한다. 종양의 등급, 즉 암 등급은 얼마나 빨리 성장하고 전이될 가능성이 있는지를 나타낸다.
예를 들어, 암은 0기, I기, II기, III기 또는 IV기, 또는 이의 임의의 하나 이상의 하위분류일 수 있다. 이러한 상이한 병기 및 이의 하위분류의 특성은 당업계에 잘 알려져 있다. 그러나, 일반적인 용어에서: 0기는 암이 시작된 곳(제자리)에 있고 전이며지 않았음을 나타낸다. I기는 암이 작고 다른 곳으로 전이며지 않았음을 나타낸다. II기는 암이 성장했지만 전이며지 않았음을 나타낸다. III기는 암이 더 크고 주위 조직 및/또는 림프절(림프계의 일부)에 전이될 수 있음을 나타낸다. IV기는 암이 시작된 곳에서 적어도 하나의 다른 신체 기관으로 전이며었음을 나타내며; "2차" 또는 "전이성" 암으로도 알려져 있다.
하나의 구현예에서, 암은 TNM 병기 시스템으로 분류된 암의 병기일 수 있다. 이것은 AJCC 및 국제 암 억제 연합(UICC)에서 개발하였고 유지하고 있는 시스템이다. 전 세계 의료 전문가들에 의해 가장 통상적으로 사용되는 병기 시스템이다. TNM 분류 시스템은 의사가 특정 표준화된 기준에 기반하여 상이한 유형의 암에 대한 병기를 결정하는 도구로서 개발되었다. TNM 병기 시스템은 종양의 정도(T), 림프절로 전이 정도(N), 전이의 존재(M)에 기반한다.
- T 범주는 원래(원발성) 종양을 설명한다. TX는 평가될 수 없는 원발성 종양을 지칭한다. T0은 원발성 종양의 증거가 없음을 나타낸다. Ti는 제자리 암종(이웃 조직으로 전이며지 않은 초기 암)을 지칭한다. T1, T2, T3 및 T4는 원발성 종양의 크기 및/또는 정도와 관련된다.
- N 범주는 암이 인근 림프절에 도달했는지 여부를 설명한다. NX는 국소 림프절이 평가될 수 없음을 나타낸다. N0은 국소 림프절 침범이 없음(암이 림프절에서 발견되지 않음)을 나타낸다. N1, N2 및 N3은 국소 림프절 침범(전이 수 및/또는 정도)을 나타낸다.
- M 범주는 원격 전이(신체의 다른 부분으로 암의 전이)가 있는지 여부를 말한다. M0은 원격 전이가 없음(암이 신체의 다른 부분으로 전이며지 않음)을 나타낸다. M1은 원격 전이(암이 신체의 먼 부분으로 전이됨)를 나타낸다.
각각의 암 유형은 자체 분류 시스템이 있기 때문에, 문자 및 숫자가 모든 종류의 암에 대해 항상 동일한 것을 의미하지는 않는다. 일단 T, N, 및 M이 결정되면, 이들은 조합되고, 0, I, II, III, IV의 전반적인 병기가 할당될 수 있다. 때때로 이러한 병기는 IIIA 및 IIIB와 같은 문자를 사용하여 또한 세분화된다. 추가의 지침은 https://cancerstaging.org에서 찾을 수 있다.
일부 암 유형에서, 해부학적 단계/예후 그룹을 할당하기 위해 비-해부학적 인자가 고려될 수 있다. 이들은 AJCC 암 병기 매뉴얼의 각 장에 명확하게 정의되어 있다(예를 들어 전립선의 Gleason 점수). 이러한 인자는 순전히 해부학적으로 유지며고 병기 그룹을 할당하는 데 사용되는 T, N, 및 M으로부터 별도로 수집된다. 비-해부학적 인자가 그룹화에 사용되는 경우, 비-해부학적 인자가 이용가능하지 않는 경우(X) 또는 비-해부학적 인자를 무시하는 그룹을 할당하는 것이 바람직한 경우 제공되는 그룹화의 정의가 있다.
I기 암은 가장 덜 진행되며 종종 더 나은 예후를 갖는다. 더 높은 병기의 암이 종종 더 진행되지만, 많은 경우에 여전히 성공적으로 치료될 수 있다.
추가 및/또는 대안적 옵션에서, 암은 명시된 등급의 것일 수 있다. 등급화는 전형적으로 세포의 분화(정상 세포와 유사한 정도)에 기반한다. 암의 명시된 등급은 예를 들어, 등급 I, 등급 II, 등급 III 또는 등급 IV 암, 또는 2 또는 3개 범주의 조합일 수 있다. 이러한 상이한 등급의 특성은 당업계에 잘 알려져 있다. 그러나, 일반적인 용어에서: 등급 I 암은 세포가 정상 세포와 유사하고 빠르게 성장하지 않는 암의 유형이고; 등급 II 암은 암 세포가 정상 세포처럼 보이지 않고 정상 세포보다 더 빠르게 성장하는 유형의 암이고; 등급 III 및 IV는 암 세포가 비정상으로 보이고 보다 공격적으로 성장하고 전이될 수 있는 유형의 암이다. 성장 특성은 예를 들어, 세포 분열 빈도에 기반하여 일부 암에서 평가될 수 있다.
암은 예를 들어, 암종, 육종, 골수종, 백혈병, 림프종 및 혼합 유형의 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 유형의 암일 수 있다.
암종은 상피 기원의 악성 신생물 또는 신체의 내부 또는 외부 내벽의 암을 지칭한다. 상피 조직의 악성종양인 암종은 모든 암 사례의 80 내지 90 퍼센트를 차지한다. 상피 조직은 신체 전반에 걸쳐 발견된다. 상기 추가로 논의된 바와 같이, 위장관과 같은 기관 및 내부 통로의 덮개 및 내벽, 뿐만 아니라 피부에 존재한다.
암종은 두가지 주요 하위유형으로 나눌 수 있다: 선상 기관에서 발생하는 선암종, 및 편평 상피에서 기원하는 편평 세포 암종.
선암종은 일반적으로 점막에서 발생하고 먼저 두꺼워진 플라크-유사 흰색 점막으로 보인다. 이들은 종종 발생하는 연조직을 통해 용이하게 전이된다. 편평 세포 암종은 신체의 많은 영역에서 발생한다.
대부분의 암종은 우유를 생산하는 유방, 또는 점액을 분비하는 폐, 또는 결장 또는 전립선 또는 방광과 앝은 분비할 수 있는 기관 또는 샘에 영향을 미친다.
하나의 구현예에서, 암종은 유방암, 기저 세포 암종, 선암종, 위장관암, 입술암, 구강암, 식도암, 소장암 및 위암, 결장암, 간암, 방광암, 췌장암, 난소암, 자궁경부암, 폐암, 및 피부암, 예컨대 편평 세포 및 기저 세포 암, 전립선암, 신 세포 암종, 및 신체의 전반에 걸쳐 상피 세포에 영향을 미치는 다른 알려진 암으로부터 선태택된 상피 세포로부터 발생하는 암일 수 있다.
육종은 뼈, 힘줄, 연골, 근육, 및 지방과 같은 지지 및 결합 조직에서 기원하는 암을 지칭한다. 일반적으로 젊은 성인에서 발생하는 가장 흔한 육종은 종종 뼈에 고통스러운 종괴로서 발생한다. 육종은 일반적으로 이들이 성장하는 조직과 유사하다.
육종의 예는 다음과 같다: 골육종 또는 골형성 육종(뼈), 연골육종(연골), 평활근육종(평활근), 횡문근육종(골격근), 중피 육종 또는 중피종(체강의 막 내벽), 섬유육종(섬유 조직), 혈관육종 또는 혈관내피종(혈관), 지방육종(지방 조직), 신경교종 또는 성상세포종(뇌에서 발견되는 신경 결합 조직), 점액육종(원시 배아 결합 조직), 중간엽 또는 혼합 중배엽 종양(혼합 연결 조직 유형).
골수종은 골수의 형질 세포에서 기원하는 암이다. 형질 세포는 혈액에서 발견되는 단백질 중 일부를 생산한다.
암은 고형암, 또는 액상암일 수 있다.
예를 들어, 백혈병("액상암" 또는 "혈액암")은 골수(혈액 세포 생산 부위)의 암이다. 질환은 종종 미성숙 백혈구의 과잉 생산과 연관된다. 이러한 미성숙 백혈구는 이들이 해야하는 만큼 수행하지 않으므로, 환자는 종종 감염되기 쉽다. 백혈병은 또한 적혈구에 영향을 미치고 빈혈로 인한 불량한 혈액 응고 및 피로를 야기할 수 있다. 백혈병의 예는 다음을 포함한다:
- 골수성 또는 과립구성 백혈병(골수성 및 과립구성 백혈구 계열의 악성종양)
- 림프성, 림프구성, 또는 림프모구성 백혈병(림프성 및 림프구성 혈액 세포 계열의 악성종양)
- 진성적혈구증가증(Polycythaemia Vera) 또는 적혈병(erythraemia)(적혈구가 우세한 다양한 혈액 세포 생성물의 악성종양)
림프종은 체액을 정제하고 감염과 싸우는 백혈구, 또는 림프구를 생산하는 혈관, 결절, 및 기관(구체적으로 비장, 편도선, 및 흉선)의 네트워크인 림프계의 샘 또는 결절에서 발생한다. 때때로 "액상암"이라고 하는 백혈병과 달리, 림프종은 "고형암"이다. 림프종은 또한 위, 유방 또는 뇌와 같은 특이적 기관에서 발생할 수 있다. 이러한 림프종은 추가 결절 림프종으로 언급된다. 림프종은 2가지 범주로 하위분류된다:　호지킨 림프종　및 비호지킨 림프종. 호지킨 림프종에서 Reed-Sternberg 세포의 존재는 호지킨 림프종과 비호지킨 림프종을 진단적으로 구별한다.
혼합 유형의 암은 유형 구성요소가 암의 하나의 범주 내에 있거나 상이한 범주로 있는 암을 포함할 수 있다. 일부 예는 선편평상피암종; 혼합 중배엽 종양; 암육종; 및 기형암종이다.
임의적으로, 암은 원발성 암, 또는 전이성 암일 수 있다. 원발성 암은 원발성 종양의 암 세포를 지칭하며, 이는 대상체 내의 첫번째 부위에서 보이는 종양이며 원발성 종양에서 떨어진 부위에 있는 대상체의 신체에서 보이는 전이성 종양과 구별될 수 있다. 전이성 암은 전이로 인해 발생하며, 이는 암이 원래 기관에서 환자의 추가 말단 부위로 전이며는 상태를 지칭한다.
예를 들어, 암의 유형은 임의적으로 다음 목록 중 임의의 하나 이상으로부터 선택될 수 있다:
ㆍ 급성 림프모구성 백혈병(ALL),
ㆍ 급성 골수성 백혈병(AML),
ㆍ 미성년의 암(예를 들어 12-18세 미성년),
ㆍ 예를 들어 또한 다음을 포함하는 부신피질 암종:
o 소아 부신피질 암종
ㆍ 예를 들어 또한 다음을 포함하는 AIDS-관련 암:
o 카포시 육종(연조직 육종)
o AIDS-관련 림프종(림프종)
o 원발성 CNS 림프종(림프종)
ㆍ 항문암
ㆍ 맹장암
ㆍ 소아　성상세포종(뇌암)
ㆍ 비정형 기형/횡문근 종양, 소아, 중추신경계(뇌암)
ㆍ 피부의 기저 세포 암종
ㆍ 담관암
ㆍ 예를 들어 또한 다음을 포함하는 방광암:
o 소아 방광암
ㆍ 골암(예를 들어, 유잉 육종, 골육종 또는 악성 섬유성 조직구종)
ㆍ 뇌 종양(예를 들어, 신경교종 또는 교모세포종 포함)
ㆍ 예를 들어 또한 다음을 포함하는 유방암:
o 소아 유방암
ㆍ 소아 기관지 종양
ㆍ 버킷 림프종
ㆍ 예를 들어 또한 다음을 포함하는 카르시노이드 종양(위장관):
o 소아 카르시노이드 종양
ㆍ 예를 들어 또한 다음을 포함하는 미지의 원발성 암종:
o 미지의 원발성 소아 암종
ㆍ 소아 심장(심장) 종양
ㆍ 예를 들어 또한 다음을 포함하는 중추신경계:
o 소아 비정형 기형/횡문근 종양, (뇌암)
o 소아 배아 종양, (뇌암)
o 소아 생식 세포 종양, (뇌암)
o 원발성 CNS 림프종
ㆍ 예를 들어 또한 다음을 포함하는 자궁경부암:
o 소아 자궁경부암
ㆍ 소아암(예를 들어 18세 미만, 바람직하게는 16, 14 또는 12세 미만, 예컨대 1-12세 이내의 아동),
ㆍ 소아의 비정상적인 암,
ㆍ 담관암종
ㆍ 소아 척색종,
ㆍ 만성 림프구성 백혈병(CLL)
ㆍ 만성 골수성 백혈병(CML)
ㆍ 만성 골수증식성 신생물
ㆍ 예를 들어 또한 다음을 포함하는 결장직장암:
o 소아 결장직장암
ㆍ 소아 두개인두종(뇌암)
ㆍ 피부 T-세포 림프종
ㆍ 제자리 단관암종(DCIS)
ㆍ 배아 종양, 중추신경계, 소아(뇌암)
ㆍ 자궁내막암(자궁암)
ㆍ 소아 뇌실막세포종(뇌암)
ㆍ 예를 들어 또한 다음을 포함하는 식도암:
o 소아 식도암
ㆍ 감각신경모세포종(두경부암)
ㆍ 유잉 육종(골암)
ㆍ 소아 두개외 생식 세포 종양,
ㆍ 고환 생식 세포 종양
ㆍ 예를 들어 또한 다음을 포함하는 안암:
o 소아 안내 흑색종
o 안내 흑색종
o 망막모세포종
ㆍ 나팔관암
ㆍ 뼈의 섬유조직구증, 악성, 및 골육종
ㆍ 담낭암
ㆍ 예를 들어 또한 다음을 포함하는 위(위장) 암:
o 소아 위(위장) 암
ㆍ 위장관 유암종 종양
ㆍ 예를 들어 또한 다음을 포함하는 위장관 기질 종양(GIST)(연조직 육종):
o 소아 위장관 기질 종양
ㆍ 예를 들어 또한 다음을 포함하는 생식 세포 종양:
o 소아 중추신경계 생식 세포 종양(뇌암)
o 소아 두개외 생식 세포 종양
o 고환외 생식 세포 종양
o 난소 생식 세포 종양
o 고환암
ㆍ 임신성 융모성 질환
ㆍ 모양 세포 백혈병
ㆍ 두경부암
ㆍ 소아 심장 종양
ㆍ 간세포(간)암
ㆍ 조직구증, 랑게르한스 세포
ㆍ 호지킨 림프종
ㆍ 하인두암(두경부암)
ㆍ 예를 들어 또한 다음을 포함하는 안내 흑색종:
o 소아 안내 흑색종
ㆍ 섬 세포 종양, 췌장 내분비 종양
ㆍ 카포시 육종(연조직 육종)
ㆍ 신장(신 세포)암
ㆍ 랑게르한스 세포 조직구증
ㆍ 후두암(두경부암)
ㆍ 백혈병
ㆍ 입술 및 구강암(두경부암)
ㆍ 간암
ㆍ 예를 들어 또한 다음을 포함하는 폐암(비소세포 및 소세포):
o 소아 폐암
ㆍ 림프종
ㆍ 남성 유방암
ㆍ 뼈의 악성 섬유 조직구증 및 골육종
ㆍ 예를 들어 또한 다음을 포함하는 흑색종:
o 소아 흑색종
ㆍ 예를 들어 또한 다음을 포함하는 안내(눈) 흑색종:
o 소아 안내 흑색종
ㆍ 메르켈 세포 암종(피부암)
ㆍ 예를 들어 또한 다음을 포함하는 악성 중피종:
o 소아 중피종
ㆍ 전이암
ㆍ 잠복 원발성 전이성 편평 경부암(두경부암)
ㆍ NUT　유전자 변화가 있는 정중선관 암종
ㆍ 구강암(두경부암)
ㆍ 다발성 내분비선 신생물 증후군
ㆍ 다발성 골수종/형질 세포 신생물
ㆍ 균상 식육종(림프종)
ㆍ 골수이형성 증후군,　골수이형성/골수증식성 신생물
ㆍ 만성 골수성 백혈병(CML)
ㆍ 급성 골수성 백혈병(AML)
ㆍ 만성 골수증식성 신생물
ㆍ 비강 및 부비동 암(두경부암)
ㆍ 비인두암(두경부암)
ㆍ 신경모세포종
ㆍ 비호지킨 림프종
ㆍ 비소세포 폐암
ㆍ 구강암, 입술 및 구강암 및 구강인두암(두경부암)
ㆍ 골육종 및 뼈의 악성 섬유성 조직구증
ㆍ 예를 들어 또한 다음을 포함하는 난소암:
o 소아 난소암
ㆍ 예를 들어 또한 다음을 포함하는 췌장암:
o 소아 췌장암
ㆍ 췌장 신경내분비 종양(섬 세포 종양)
ㆍ 유두종증(소아 후두)
ㆍ 예를 들어 또한 다음을 포함하는 부신경절종:
o 소아 부신경절종
ㆍ 부비동 및 비강암(두경부암)
ㆍ 부갑상선암
ㆍ 음경암
ㆍ 인두암(두경부암)
ㆍ 예를 들어 또한 다음을 포함하는 크롬친화세포종:
o 소아 크롬친화세포종
ㆍ 뇌하수체 종양
ㆍ 형질 세포 신생물/다발성 골수종
ㆍ 흉막페아세포종
ㆍ 임신 및 유방암(즉 임신한 여성의 유방암)
ㆍ 원발성 중추신경계(CNS) 림프종
ㆍ 원발성 복막암
ㆍ 전립선암
ㆍ 직장암
ㆍ 재발암
ㆍ 신 세포(신장) 암
ㆍ 망막모세포종
ㆍ 소아 횡문근육종(연조직 육종)
ㆍ 침샘암(두경부암)
ㆍ 예를 들어 또한 다음을 포함하는 육종:
o 소아 횡문근육종(연조직 육종)
o 소아 혈관 종양(연조직 육종)
o 유잉 육종(골암)
o 카포시 육종(연조직 육종)
o 골육종(골암)
o 연조직 육종
o 자궁 육종
ㆍ 세자리 증후군(림프종)
ㆍ 예를 들어 또한 다음을 포함하는 피부암:
o 소아 피부암
ㆍ 소세포폐암
ㆍ 소장암
ㆍ 연조직 육종
ㆍ 피부의 편평 세포 암종
ㆍ 잠복 원발성 전이성 편평 경부암(두경부암)
ㆍ 예를 들어 또한 다음을 포함하는 위장(위)암:
o 소아 위장(위)암
ㆍ 피부 T-세포 림프종
ㆍ 예를 들어 또한 다음을 포함하는 고환암:
o 소아 고환암
ㆍ 예를 들어 또한 다음을 포함하는 인후암(두경부암):
o 비인두암
o 구강인두암
o 하인두암
ㆍ 흉선종 및 흉선 암종
ㆍ 갑상선암
ㆍ 신우 및 요관의 이행 세포 암(신장(신 세포) 암)
ㆍ 예를 들어 또한 다음을 포함하는 미지의 원발성 암종:
o 미지의 원발성 소아 암
ㆍ 소아의 특이한 암
ㆍ 요관 및 신우, 이행 세포 암(신장(신 세포) 암
ㆍ 요도암
ㆍ 자궁내막암
ㆍ 자궁 육종
ㆍ 예를 들어 또한 다음을 포함하는 질암:
o 소아 질암
ㆍ 혈관 종양(연조직 육종)
ㆍ 외음부 암
ㆍ 빌름스 종양 및 다른 소아 신장 종양
ㆍ 젊은 성인의 암(예를 들어 16-30세, 예컨대 18-30세; 임의적으로 28, 26, 24, 22 또는 20세 미만의 젊은 성인)
보다 구체적으로, 암의 유형은 임의적으로 다음 목록 중 임의의 하나 이상으로부터 선택될 수 있다:
피부암: 피부암에는 기저 세포, 편평 세포, 및 흑색종의 3가지 기본 유형이 있다. 이러한 암은 동일한 이름의 표피 층으로부터 유래된다. 흑색종은 표피의 가장 깊은 수준에 있는 멜라닌세포, 또는 색소 세포로부터 유래된다. 기저 세포 및 편평 세포 암은 일반적으로 얼굴, 귀, 및 사지와 같이 태양에 노출되는 신체의 부분에서 발생한다.
폐암: 폐암은 초기 단계에서 검출하기가 매우 어려운 데, 질환이 진행될 때까지 증상이 종종 보이지 않기 때문이다. 증상은 지속적인 기침, 피가 섞인 가래, 가슴 통증, 및 폐렴 또는 기관지염의 반복된 발작을 포함한다.
여성 또는 남성 유방암: 미국에서, 여성 8 명 중 약 1 명에서 궁극적으로 평생 동안 유방암이 발생할 것으로 추정되었다. 대부분의 유방암은 유관 암종이다. 질환이 발생할 가능성이 가장 높은 여성은 50세 이상의 사람; 한쪽 유방에 이미 암이 있는 사람; 어머니아 자매가 유방암이 있는 사람; 아이가 없는 사람; 및 첫 출산이 30세 이후인 사람이다. 다른 위험 인자는 비만, 고지방 식이, 조기 초경(월경이 시작됨) 및 후기 폐경(월경이 중단됨)을 포함한다.
전립선암: 전립선의 암은 주로 노인 남성에서 발견된다. 남성이 나이가 들수록, 전립선은 비대해지고 요도 또는 방광이 막힐 수 있다. 이것은 배뇨를 어렵게 하거나 성기능을 방해할 수 있다. 이 상태를 양성 전립선 비대증병(BPH)이라고 한다. BPH는 암성이 아니지만, 이를 고치기 위해 수술이 필요할 수 있다. BPH, 또는 다른 전립선 문제의 증상은 전립선암에 대한 증상과 유사할 수 있다.
결장 및/또는 직장암: 결장직장암(CRC)은 전형적으로 위장관의 결장 또는 직장의 상피 세포 내벽으로부터 기원하는 질환이다. 대장에 영향을 미치는 암 중에서, 약 70 퍼센트가 결장에서 발생하고 약 30 퍼센트가 직장에서 발생한다. 이들 암은 전반적으로 세번째로 가장 흔한 암이다. 증상은 간단한 대변 잠혈 검사에 의해 테스트할 수 있는 대변 내 혈액, 또는 심각한 변비 또는 설사와 같은 배변 습관의 변화를 포함한다.
자궁(자궁체) 암: 자궁은 아기가 수정란으로부터 발달하고 출산할 때까지 보호하는 여성의 골반에 있는 주머니다. 자궁의 암은 가장 흔한 부인과 악성종양이다. 이 암은 40세 미만의 여성에서 드물게 발생한다. 60세 이후에 가장 빈번하게 발생한다. 제시되는 증상은 일반적으로 비정상적인 자궁 출혈이다. 진단을 확인하기 위해 자궁내막 생검 또는 D&C가 종종 수행된다.
상기 논의된 원발성 부위의 이름을 딴 암 유형 외에도, 뇌암, 고환암, 방광암 등과 같은 많은 다른 예가 있다.
본 발명의 제11 측면에 따라 퇴치될 HCMV와 연관된 질환 또는 병태는 특히 상피암일 수 있으며; 임의적으로 여기서 상피암은 유방암이고; 예를 들어, 여기서 유방암은 삼중 음성 유방암(TNBC), 또는 HER2-양성 유방암(본원에 기재된 바와 같음)이다. 상기 상피암 형태는 임의적으로 HCMV 감염된 상피암의 단일 균주 또는 다중 균주 형태, 예를 들어 상피암의 잠복성 HCMV-감염된 형태(임의적으로 단일 균주, 또는 다중 균주, 잠복성 HCMV 감염된 암)일 수 있다.
본 발명의 제11 측면에 따라 퇴치될 HCMV와 연관된 질환 또는 병태는 암의 전이성 및/또는 공격성 형태일 수 있다. 상기 전이성 및/또는 공격성 암의 형태는 임의적으로 HCMV 감염된 전이성 및/또는 공격성 암의 단일 균주 또는 다중 균주 형태, 예를 들어 전이성 및/또는 공격성 암의 잠복성 HCMV-감염된 형태(임의적으로 단일 균주, 또는 다중 균주, 잠복성 HCMV 감염된 암)일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 제11 측면에 따라 퇴치될 HCMV와 연관된 질환 또는 병태는 교모세포종일 수 있다. 본원에 기재된 다른 구현예에서, 질환 또는 병태는 교모세포종이 아니고/아니거나 치료될 대상체는 교모세포종을 갖지 않고/않거나 갖는 것으로 진단되지 않았다.
일부 구현예에서, 본 발명의 제11 측면에 따라 치료될 대상체(또는 생체외 또는 시험관내 세포 물질)은 HCMV-감염된 암 세포, 예컨대 잠복성 HCMV-감염된 암 세포를 가질 수 있고/있거나, 갖거나 보유하는 것으로 진단되었다.
일부 구현예에서, 본 발명의 제11 측면에 따라 치료될 대상체는 세포 생성물의 기증과 같은 세포 물질의 수용자일 수 있거나, 되도록 의도될 수 있다. 상기 세포 생성물은 예를 들어, 하나 이상의 유형의 생체외 세포; 하나 이상의 유형의 생체외 세포 배양물; 하나 이상의 유형의 생체외 조직; 하나 이상의 유형의 생체외 조직 배양물; 하나 이상의 유형의 생체외 기관; 및/또는 하나 이상의 유형의 생체외 기관 배양물을 포함하는 군으로부터 선택된 살아있는 생체외 세포 물질을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다. 임의적으로, 세포 생성물은 살아있는 공여자로부터 직접적으로 또는 간접적으로 유래될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 제11 측면에 따라 치료될 대상체는 세포 생성물의 공여자와 같은 세포 물질의 공여자일 수 있거나, 되도록 의도될 수 있다. 상기 세포 생성물은 상기 공여자로부터의 세포, 조직 또는 기관 중 임의의 하나 이상을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 제11 측면에 따라 치료될 생체외 또는 시험관내 세포 물질은 생체외 세포 생성물일 수 있다. 상기 생체외 세포 생성물은 예를 들어, 하나 이상의 유형의 생체외 세포; 하나 이상의 유형의 생체외 세포 배양물; 하나 이상의 유형의 생체외 조직; 하나 이상의 유형의 생체외 조직 배양물; 하나 이상의 유형의 생체외 기관; 및/또는 하나 이상의 유형의 생체외 기관 배양물을 포함하는 군으로부터 선택된 살아있는 생체외 세포 물질을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다. 임의적으로, 세포 생성물은 살아있는 공여자로부터 직접적으로 또는 간접적으로 유래될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 제11 측면에 따라 사용될 수 있는 하나 이상의 제제는 예를 들어, 다음으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다(또는 하나 이상의 제제를 포함함):
i. 본 발명의 제1 측면에 의해 정의된 바와 같은 치료적 항체,
ii. 본 발명의 제1 측면에 의해 정의된 바와 같은 상기 치료적 항체의 기능적 단편,
iii. 본 발명의 제1 측면에 의해 정의된 바와 같은 융합 폴리펩티드 서열로서 포함하는 치료적 항체; 및
iv. 본 발명의 제1 측면에 의해 정의된 바와 같은 융합 폴리펩티드 서열로서 포함하는 상기 치료적 항체의 기능적 단편.
예를 들어, 본 발명의 제11 측면에 따라 사용되는 하나 이상의 제제는 본 발명의 제1 측면에 의해 정의된 바와 같은 이중특이적 항체일 수 있다(또는 이로부터 선택된 하나 이상의 제제를 포함함). 제한없이, 이것은 이중특이적 면역 세포 관여 항체일 수 있다. 이의 예시적인 구현예는 이중특이적 T-세포 관여(BiTE) 항체이며, 임의적으로 여기서, US28 단백질의 ECD3 영역에 대해 결합 특이성을 갖는 본 발명의 제1 측면의 결합 분자를 포함하는 영역 외에도, BiTE 항체는 CD3-결합 도메인과 같은 T-세포 관여 도메인을 추가로 포함한다.
추가의 구현예에서, 본 발명의 제11 측면에 따라 사용될 하나 이상의 제제는 예를 들어, 본 발명의 제8 측면 및/또는 본 발명의 제10 측면에 따른 접합체, 예컨대 항체-약물 접합체("ADC")인 접합체, 또는 방사성 모이어티를 포함하는 접합체, 예컨대 방사선면역요법("RIT")에 사용하기에 적합한 접합체일 수 있다(또는 포함함).
또 다른 구현예에서, 본 발명의 제11 측면에 따라 사용될 하나 이상의 제제는 예를 들어, 세포(또는 세포 집단, 예를 들어 동종 세포 집단)일 수 있으며(또는 포함함) 여기서 상기 또는 각각의 세포는 본 발명의 제4 측면에 따른 CAR을 포함한다. 상기 세포 또는 세포 집단은 전형적으로 대상체에게 투여하기 위해 단리 및/또는 제형화된다.
H. 조합 치료:
임의적으로, 본 발명의 제11 측면에 따르면, 대상체는 추가의 물질, 예컨대 추가의 치료적, 예방적, 진단적, 예후적, 또는 치료진단적 물질을 투여받을 수 있고, 임의적으로 여기서 추가의 물질은 상기 또는 각각의 하나 이상의 제제와 개별적으로, 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다.
따라서, 본 발명의 제11 측면은 또한 대상체에게 치료적, 예방적, 진단적, 예후적, 또는 치료진단적 물질을 투여함으로써 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 대상체는 또한 상기 또는 각각의 하나 이상의 제제와 개별적으로, 순차적으로(예를 들어, 전 또는 후), 또는 동시에 치료될 수 있다.
치료가 동시적인 구현예에서, 본 발명의 제11 측면에 따라 사용될 하나 이상의 제제는 치료적, 예방적, 진단적, 예후적, 또는 치료진단적 물질과 조합하여 제형화 및/또는 투여될 수 있거나; 개별적으로 제형화될 수 있지만 2개의 별개의 제형으로 동시에 투여될 수 있다.
예를 들어, 하나의 구현예에서, 치료될 질환 또는 병태는 암의 형태(예컨대 상기 개시된 바와 같은 암의 하나 이상의 형태)일 수 있고, 추가의 치료적, 예방적, 진단적, 예후적, 또는 치료진단적 물질은 암으로 표적될 수 있다.
따라서, 본 개시내용의 맥락에서, 본 발명의 결합 분자 및 본 발명의 제11 측면에 의해 정의된 바와 같은 다른 치료제는 화학- 또는 방사성 치료적 개입, 또는 다른 치료와 함께 암의 치료에서 유사하게 사용될 수 있음이 또한 고려된다.
상기 상이한 형태의 치료는 수분 내지 수주 범위의 간격에 의해 다른 것보다 선행되거나 뒤따를 수 있다. 예를 들어, 서로 약 12-24시간 이내, 보다 바람직하게는, 서로 약 6-12시간 이내이며, 단지 약 12시간의 지연 시간이 하나의 바람직한 옵션이다. 일부 상황에서, 치료 기간을 상당히 연장하는 것이 바람직할 수 있지만, 각각의 투여 사이에 수일(2, 3, 4, 5, 6 또는 7) 내지 수주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8)가 경과한다.
본 발명의 치료제를 환자에게 투여하는 것은 임의의 경우에 독성을 고려하여 치료의 특정한 2차 요법의 투여를 위한 일반적인 프로토콜을 따를 것이다. 치료 주기는 필요한 만큼 반복될 것으로 예상된다. 또한 다양한 표준 요법 뿐만 아니라 외과적 개입이 기재된 암 요법과 조합하여 적용될 수 있음이 고려된다.
당업자는 "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, Chapter 33, 특히 624-652 페이지를 참조한다. 투여량의 일부 변이가 치료될 대상체의 상태에 따라 필연적으로 발생할 것이다. 투여를 담당하는 사람은 어떠한 경우에도 개별 대상체에 대한 적절한 용량을 결정할 것이다. 더욱이, 인간 투여의 경우, 제제는 FDA 생물의약품 표준에 의해 요구되는 바와 같은 멸균성, 발열성, 일반적 안전성 및 순도 표준을 충족해야 한다.
1. 화학요법
화학요법 항암제는 예를 들어, 질소 머스타드 예컨대 메클로레타민(HN2), 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 멜팔란(L-사르콜리신) 및 클로람부실을 포함하는 알킬화제; 에틸렌이민 및 메틸멜라민 예컨대 헥사메틸멜라민, 티오테파; 알킬 술포네이트 예컨대 부설판; 니트로소우레아 예컨대 카르무스틴(BCNU), 로무스틴(CCNU), 세무스틴(메틸-CCNU) 및 스트렙토조신(스트렙토조토신); 및 트리아젠 예컨대 데카르바진(DTIC; 디메틸트리아제노이미다졸-카르복사미드); 메토트렉세이트(아메톱테린)와 같은 엽산 유사체를 포함한 항대사물; 피리미딘 유사체 예컨대 플루오로우라실(5-플루오로우라실; 5-FU), 플록수리딘(플루오로데옥시우리딘; FUdR) 및 시타라빈(사이토신 아라비노시드); 및 퓨린 유사체 및 관련 억제제 예컨대 메르캅토퓨린(6-메르캅토퓨린; 6-MP), 티오구아닌(6-티오구아닌; TG) 및 펜토스타틴(2'-데옥시코포르마이신); 빈블라스틴(VLB) 및 빈크리스틴과 같은 빈카 알칼로이드를 포함한 천연 생성물; 에피포도필로톡신 예컨대 에토포시드 및 테니포시드; 항생제 예컨대 닥티노마이신(악티노마이신 D), 다우노루비신(다우노마이신; 루비도마이신), 독소루비신, 블레오마이신, 플리카마이신(미트라마이신) 및 미토마이신(미토마이신 C); 효소 예컨대 L-아스파라기나제; 및 생물학적 반응 개질제 예컨대 인터페론 알페놈; 시스플라틴(시스-DDP) 및 카르보플라틴과 같은 백금 배위 복합체를 포함한 다양한 제제; 안트라센디온 예컨대 미토잔트론 및 안트라사이클린; 치환된 우레아 예컨대 하이드록시우레아; 메틸 하이드라진 유도체 예컨대 프로카바진(N-메틸하이드라진, MIH); 및 부신피질 억제제 예컨대 미토탄(o,p'-DDD) 및 아미노글루테티미드; 탁솔 및 유사체/유도체; 세포 주기 억제제; 프로테오솜 억제제 예컨대 보르테조밉(Bortezomib)(Velcade®); 신호 트랜스덕타제(예를 들어 티로신 키나제) 억제제 예컨대 이마티닙(Imatinib)(Glivec®), COX-2 억제제, 및 호르몬 작용제/길항제 예컨대 플루타미드 및 타목시펜으로부터 선택될 수 있다.
임상적으로 사용되는 항암제는 전형적으로 작용 메커니즘에 의해 그룹화된다: 알킬화제, 토포이소머라제 I 억제제, 토포이소머라제 II 억제제, RNA/DNA 항대사물, DNA 항대사물 및 항진균제. US NIH/국립 암 연구소(National Cancer Institute) 웹사이트는 122개의 화합물을 나열하며(http://dtp.nci.nih.gov/docs/cancer/ searches/standard_mechanism.html), 이들 모두는 본 발명의 다양한 측면에 의해 기재된 바와 같은 US28-표적 접근법과 함께 사용될 수 있다. 이들은 아살레이, AZQ, BCNU, 부설판, 카르복시프탈라토플라티눔, CBDCA, CCNU, CHIP, 클로람부실, 클로로조토신, 시스-백금, 클로메손, 시아노모르폴리노-독소루비신, 사이클로디손, 디안하이드로갈락티톨, 플루오로도판, 헵설팜, 하이칸톤, 멜팔란, 메틸 CCNU, 미토마이신 C, 미토졸아미드, 질소 머스타드, PCNU, 피페라진, 피페라진디온, 피포브로만, 포르피로마이신, 스피로하이단토인 머스타드, 테록시론, 테트라플라틴, 피코플라틴(SP-4-3)(시스-아민디클로로(2-메틸피리딘)Pt(II)), 티오-테파, 트리에틸렌멜라민, 우라실 질소 머스타드, Yoshi-864를 포함하는 아킬화제; 알로콜히친, 할리콘드린 B, 콜히친, 콜히친 유도체, 돌라스타틴 10, 메이탄신, 리족신, 탁솔, 탁솔 유도체, 티오콜히친, 트리틸 시스테인, 빈블라스틴 설페이트, 빈크리스틴 설페이트를 포함하는 세포분열 억제제; 캄포테신, 캄포테신, Na 염, 아미노캄포테신, 캄포테신 유도체, 모르폴리노독소루비신을 포함하는 토포이소머라제 I 억제제; 독소루비신, 아모나피드, m-AMSA, 안트라피라졸 유도체, 피라졸로아크리딘, 비산트렌 HCL, 다우노루비신, 데옥시독소루비신, 미토잔트론, 메노가릴, N,N-디벤질 다우노마이신, 옥산트라졸, 루비다존, VM-26, VP-16을 포함하는 토포이소머라제 II 억제제; L-알라노신, 5-아자사이티딘, 5-플루오로우라실, 아시비신, 3개의 아미노프테린 유도체, 안티폴, Baker의 가용성 안티폴, 디클로르알릴 로손, 브레퀴나르, 프토라푸르(전구약물), 5,6-디하이드로-5-아자시티딘, 메토트렉세이트, 메토트렉세이트 유도체, N-(포스포노아세틸)-L-아스파르테이트(PALA), 피라조푸린, 트리메트렉세이트를 포함하는 RNA/DNA 항대사물; 3-HP, 2'-데옥시-5-플루오로우리딘, 5-HP, 알파-TGDR, 아피디콜린 글리시네이트, 아라-C, 5-아자-2'-데옥시사이티딘, 베타-TGDR, 사이클로사이티딘, 구아나졸, 하이드록시우레아, 이노신 글리코디알데하이드, 마크베신 II, 피라졸로이미다졸, 티오구아닌 및 티오퓨린을 포함하는 DNA 항대사물을 포함한다.
그러나, 적어도 하나의 추가의 항암제는 시스플라틴; 카르보플라틴; 피코플라틴; 5-플루오로우라실; 파클리탁셀; 미토마이신 C; 독소루비신; 젬시타빈; 토무덱스; 페메트렉세드; 메토트렉세이트; 이리노테칸, 플루오로우라실 및 류코보린; 옥살리플라틴, 5-플루오로우라실, 에피루비신, 카베시타빈, 독소탁셀, 파클리탁셀 및 카르보플라틴으로부터 선택된 것이 바람직하다.
바람직한 항혈관생성 화합물은 베바시주맙(bevacizumab)(Avastin®); 이트라코나졸; 카르복시아미도트리아졸; TNP-470(푸마길린의 유사체); CM101; IFN-α; IL-12; 혈소판 인자-4; 수마린; SU5416; 트롬보스폰딘; VEGFR 길항제; 혈관신생억제 스테로이드 + 헤파린; 연골-유래 혈관생성 억제 인자; 기질 메탈로프로테이나제 억제제; 안지오스타틴; 엔도스타틴; 2-메톡시에스트라디올; 테코갈란; 테트라티오몰리브데이트; 탈리도미드; 프로락틴; αVβ3 억제제; 리노미드; 타스퀴니모드; 라니비주맙; 소라페닙; (Nexavar®); 수니티닙(Sutent®); 파조파닙(Votrient®); 및 에베롤리무스(Afinitor®)를 포함한다.
추가의 치료제는 저산소증 활성화 세포독성제(예를 들어 티라파자민(Tirapazamine))일 수 있다.
암 요법은 또한 화학 및 방사선 기반 치료를 모두 사용하는 다양한 조합 요법을 포함한다. 조합 화학요법은 예를 들어, 시스플라틴(CDDP), 카르보플라틴, 프로카바진, 메클로레타민, 사이클로포스파미드, 캄포테신, 이포스파미드, 멜팔란, 클로람부실, 부설판, 니트로소우레아, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 블레오마이신, 플리코마이신, 미토마이신, 에토포시드(VP16), 타목시펜, 랄록시펜, 에스트로겐 수용체 결합제, 탁솔, 젬시타빈, 나벨빈, 파르네실-단백질 트랜스퍼라제 억제제, 트랜스플라니눔, 5-플루오로우라실, 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 메토트렉세이트, 테마졸로미드(Temazolomide)(DTIC의 수성 형태), 또는 전술한 것의 임의의 유사체 또는 유도체 변이체를 포함한다.
화학요법과 생물학적 요법의 조합은 생화학요법으로 알려져 있다. 본 발명은 암을 치료하거나 예방하기 위해 당업계에서 이용될 수 있거나 알려진 임의의 화학요법제를 고려한다.
2. 방사선요법
DNA 손상을 유발하고 광범위하게 사용된 다른 인자는 통상적으로 γ-선, X-선, 및/또는 종양 세포에 방사성 동위원소의 직접 전달로 알려진 것을 포함한다. 마이크로파 및 UV-조사와 같은 DNA 손상 인자의 다른 형태가 또한 고려된다. 이들 인자는 모두 DNA, DNA의 전구체, DNA 복제 및 복구, 및 염색체 조립 및 유지에 대한 광범위한 손상에 영향을 미칠 가능성이 크다. X-선에 대한 선량 범위는 장기간(3 내지 4주) 동안 50 내지 200 뢴트겐 일일 용량 범위이고, 단일 용량의 경우 2000 내지 6000 뢴트겐 범위이다. 방사성 동위원소에 대한 선량 범위는 광범위하게 달라지며, 동위원소의 반감기, 방출되는 방사선의 강도 및 유형, 및 신생 세포에 의한 흡수에 의존한다.
용어 "접촉된" 및 "노출된"은 세포에 적용될 때, 치료제 및 화학요법제 또는 방사선요법제가 표적에 전달되거나 표적과 직접 병치되게 놓이게 되는 과정을 설명하기 위해 본원에서 사용된다. 세포 사멸 또는 정지를 달성하기 위해, 두 제제가 표적에서 하나 이상의 세포를 사멸시키거나 상기 세포가 분열하는 것을 방지하기에 효과적인 조합된 양으로 세포에 전달된다.
3. 면역요법
일반적으로, 면역요법은 암 세포를 표적하고 파괴하기 위한 면역 효과기 세포 및 분자의 사용에 의존한다. 면역 효과기는 예를 들어, 종양 세포의 표면 상의 일부 마커에 특이적인 항체일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 그리고 제한없이, 마커는 HCMV-감염된 종양 세포의 표면 상에서 발현된 바와 같은 US28일 수 있으며; 이 경우 항체는 본 발명의 결합 분자 중 임의의 것일 수 있거나 이를 포함한다. 항체 단독은 요법의 효과기로서 역할을 할 수 있거나 다른 세포를 모집하여 세포 사멸에 실질적으로 영향을 미칠 수 있다. 항체는 또한 약물 또는 독소(화학요법, 방사성 핵종, 리신 A 쇄, 콜레라 독소, 백일해 독소 등)에 접합될 수 있으며 단순히 표적화제로서 역할을 할 수 있다. 대안적으로, 효과기는 종양 세포 표적과 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 표면 분자를 운반하는 림프구일 수 있다. 다양한 효과기 세포는 세포독성 T-세포 및 NK 세포를 포함한다. 치료적 양식의 조합, 즉, 직접 세포독성 활성 및 포르틸린(Fortilin)의 억제 및 감소는 암의 치료에서 치료적 이익을 제공할 것이다.
면역요법은 또한 조합 요법의 일부로서 사용될 수 있다. 조합 요법에 대한 일반적인 접근법은 하기에 논의되어 있다. 면역요법의 하나의 측면에서, 종양 세포는 표적화로 처리할 수 있는, 즉, 대다수의 다른 세포에 존재하지 않는 일부 마커를 보유해애 한다. 많은 종양 마커가 존재하고 이들 중 임의의 것은 본 발명의 맥락에서 표적화에 적합할 수 있다. 통상의 종양 마커는 암배아 항원, 전립선 특이적 항원, 비뇨기 종양 연관 항원, 태아 항원, 티오시나제(p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시알릴 루이스 항원, MucA, MucB, PLAP, 에스트로겐 수용체, 라미닌 수용체, erb B 및 p155를 포함한다. 면역요법의 대안적인 측면은 면역 자극 효과가 있는 항암 효과이다. 사이토카인 예컨대 IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, 감마-IFN, 케모카인 예컨대 MIP-1, MCP-1, IL-8 및 성장 인자 예컨대 FLT3 리간드를 포함하는 면역 자극 분자가 또한 존재한다. 단백질로서 면역 자극 분자를 조합하거나 mda-7과 같은 종양 억제자와 조합하여 유전자 전달을 사용하는 것은 항종양 효과를 향상시키는 것으로 나타났다(Ju 등, 2000).
현재 조사 중에 있거나 사용 중인 면역요법의 예는 면역 애쥬번트(예를 들어, 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 디니트로클로로벤젠 및 방향족 화합물)(미국 특허 5,801,005; 미국 특허 5,739,169; Hui and Hashimoto, 1998, Infect. Immun., 66(11):5329-36; Christodoulides 등, 1998, Microbiology, 144(Pt ll):3027-37), 사이토카인 요법(예를 들어, 인터페론, 및; IL-1, GM-CSF 및 TNF)(Bukowski 등, 1998, Clin. Cancer Res., 4(10):2337-47; Davidson 등, 1998, J. Immunother., 21(5):389-98; Hellstrand 등, 1998, Oncol, 37(4):347-353), 유전자 요법(예를 들어, TNF, IL-1, IL-2, p53)(Qin 등, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(24): 1441 1-14416; Austin-Ward and Villaseca, 1998, Rev. Med. Chil, 126(7):838-45; 미국 특허 5,830,880 및 미국 특허 5,846,945) 및 모노클로날 항체(예를 들어, 항-강글리오시드 GM2, 항-HER-2, 항-p185)(Pietras 등, 1998, Oncogene, 17(17):2235-49; Hanibuchi 등, 1998, Int J. Cancer, 78(4):480-5; 미국 특허 5,824,311)이다. 허셉틴(Herceptin)(트라스투주맙(trastuzumab))은 HER2-neu 수용체를 차단하는 키메라(마우스-인간) 모노클로날 항체이다. 이는 항-종양 활성을 보유하고 악성 종양의 치료에서 사용하기 위해 승인되었다(Dillman, 1999, Cancer Biother. Radiopharm., 14:5-10). 허셉틴 및 화학요법을 사용한 암의 조합 요법은 개별 요법보다 더 효과적인 것으로 나타났다. 따라서, 하나 이상의 항암 요법은 본원에 기재된 바와 같은 HCMV-암호화된 US28의 ECD3에 대해 지시된 본 발명의 요법과 함께 이용될 수 있음이 고려된다.
입양 면역요법에서, 환자의 순환 림프구, 또는 종양 침윤 림프구는 시험관내에서 단리되고, IL-2와 같은 림포카인에 의해 활성화되거나 종양 괴사를 위한 유전자로 형질도입되고, 재투여된다(Rosenberg 등, 1988, N. Engl J. Med, 319:1676; Rosenberg 등, 1989, Ann. Surg., 210:474). 이를 달성하기 위해, 동물, 또는 인간 환자에게 면역학적 유효량의 활성화된 림프구를 본원에 기재된 바와 같은 애쥬번트-혼입된 항원성 펩티드 조성물과 조합하여 투여할 것이다. 활성화된 림프구는 가장 바람직하게는 혈액 또는 종양 샘플로부터 이전에 단리되고 시험관 내에서 활성화된(또는 "확장된") 환자 자신의 세포일 것이다. 이러한 형태의 면역요법은 흑색종 및 신장 암종 퇴행의 여러 사례를 생성하였지만, 반응자의 백분율은 반응하지 않은 사람과 비교하여 적었다.
암의 수동 면역요법을 위한 다수의 상이한 접근법이 존재한다. 이들은 다음으로 광범위하게 분류될 수 있다: 항체 단독 주사; 독소 또는 화학요법제와 결합된 항체 주사; 방사성 동위원소와 결합된 항체 주사; 항-이디오타입 항체 주사; 및 마지막으로, 골수에서 종양 세포 제거.
인간 모노클로날 항체는 환자에서 부작용을 거의 또는 전혀 생산하지 않으므로 수동 면역요법에서 이용된다. 그러나, 그들의 부족으로 인해 적용은 다소 제한되고 병변내로만 투여되었다. 강글리로시드 항원에 대한 인간 모노클로날 항체는 피부 재발성 흑색종을 앓고 있는 환자에게 병변내로 투여되었다(Irie & Morton, 1986, Proc. Nat Acad. Sci. USA 83:8694-8698). 매일 또는 매주 병변내 주사 후, 환자 10 명 중 6명에서 퇴행이 관찰되었다. 또 다른 연구에서, 2개의 인간 모노클로날 항체의 병변내 주입으로부터 중간정도 성공을 달성하였다(Irie 등, " Melanoma gangliosides and human monoclonal antibody" In: Human Tumor Antigens and Specific Tumor Therapy, Metzgar & Mitchell(eds.), Alan R. Liss, Inc., New York, pp. 115-126, 1989). 가능한 치료적 항체는 항-TNF, 항-CD25, 항-CD3, 항-CD20, CTLA-4-IG, 및 항-CD28을 포함한다.
2개의 상이한 항원에 대해 지시된 하나 초과의 모노클로날 항체 또는 심지어 다중 항원 특이성을 갖는 항체를 투여하는 것이 유리할 수 있다. 치료 프로토콜은 또한 Bajorin 등, 1988, Proc. Anu. Meet. Am. Soc. Clin. Oncol, 7:A967에 의해 기재된 바와 같은 림포카인 또는 다른 면역 인핸서의 투여를 포함할 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 개발은 명세서의 다른 곳에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
4. 유전자 요법
또 다른 구현예에서, 2차 치료는 치료적 폴리뉴클레오티드가 본 발명의 제11 측면의 요법 전에, 후에, 또는 동시에 투여되는 유전자 요법이다. 본 발명과 조합된 일부 형태의 유전자 요법에 대해 표적화될 수 있는 다양한 유전자는 당업자에게 잘 알려져 있고 암에 관여하는 임의의 유전자를 포함할 수 있다.
세포 증식의 유도인자. 세포 증식을 유도하는 단백질은 추가로 기능에 따라 다양한 범주에 속한다. 이러한 단백질 모두의 공통점은 세포 증식을 조절하는 능력이다. 예를 들어, PDGF의 형태인 sis 발암유전자는 분비된 성장 인자이다. 발암유전자는 성장 인자를 암호화하는 유전자로부터 거의 발생하지 않으며, 현재 sis는 유일하게 알려진 자연 발생 발암 성장 인자이다. 본 발명이 하나의 구현예에서, 세포 증식의 특정 유도인자에 대해 지시된 항-센스 mRNA는 세포 증식 유도인자의 발현을 방지하는데 사용되는 것으로 고려된다.
단백질 FMS, ErbA, ErbB 및 neu는 성장 인자 수용체이다. 이러한 수용체에 대한 돌연변이는 조절가능한 기능의 상실을 초래한다. 예를 들어, Neu 수용체 단백질의 막관통 도메인에 영향을 미치는 점 돌연변이는 neu 발암유전자를 초래한다. erbA 발암유전자는 갑상선 호르몬에 대한 세포내 수용체로부터 유래된다. 변형된 발암성 ErbA 수용체는 내인성 갑상선 호르몬 수용체와 경쟁하여, 제어되지 않은 성장을 유발하는 것으로 여겨진다.
발암유전자의 가장 큰 부류는 신호 전달 단백질(예를 들어, Src, Abl 및 Ras)을 포함한다. 단백질 Src는 세포질 단백질-티로신 키나제이며, 일부 경우에 티로신 잔기 527에서 돌연변이를 통해 원발암 유전자에서 발암유전자로의 형질전환을 초래한다. 대조적으로, 하나의 예에서 원발암 유전자에서 발암유전자로 GTPase 단백질의 형질전환은 서열의 아미노산 12에서 발린에서 글리신으로의 돌연변이를 초래하여, ras GTPase 활성을 감소시킨다. 단백질 Jun, Fos 및 Myc는 전사 인자로서 핵 기능에 직접적으로 영향을 미치는 단백질이다.
세포 증식의 억제제. 종양 억제자 발암유전자는 과도한 세포 증식을 억제하는 기능을 한다. 이들 유전자의 비활성화는 그들의 억제 활성을 파괴하여, 조절되지 않은 증식을 초래한다. 가장 통상적인 종양 억제자는 Rb, p53, p21 및 p16이다. 본 발명에 따라 이용될 수 있는 다른 유전자는 APC, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, zac1, p73, VHL, C-CAM, MMAC1/PTEN, DBCCR-1, FCC, rsk-3, p27, p27/p16 융합, 및 p21/p27 융합을 포함한다.
프로그램화 세포 사멸의 조절인자. 세포자멸사, 또는 프로그램화 세포 사멸은 정상적인 배아 발달, 성체 조직에서 항상성 유지, 및 발암 억제에 필수적인 과정이다(Kerr 등, 1972). 단백질의 Bcl-2 패밀리 및 ICE-유사 프로테아제는 다른 시스템에서 세포자멸사의 중요한 조절인자 및 효과기인 것으로 입증되었다. 여포성 림프종과 연관하여 발견된 Bcl-2 단백질은 세포자멸사을 제어하고 다양한 세포자멸 자극에 반응하여 세포 생존을 향상시키는 데 중요한 역할을 한다(Bakhshi 등, 1985, Cell, 41(3):899-906; Cleary and Sklar, 1985, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 82(21):7439-43; Cleary 등, 1986, J. Exp. Med, 164(1):315-20; Tsujimoto 등, 1985, Science, 228(4706):1440-3; Tsujimoto and Croce, 1986, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 83(14):5214-8). 진화적으로 보존된 Bcl-2 단백질은 이제 사멸 작용제 또는 사멸 길항제로서 분류될 수 있는 관련 단백질 패밀리의 구성원으로 인식된다.
발견 이후에, Bcl-2는 다양한 자극에 의해 촉발된 세포 사멸을 억제하기 위해 작용하는 것으로 나타났다. 또한, 공통 구조 및 서열 상동성을 공유하는 Bcl-2 세포 사멸 조절 단백질의 패밀리가 있다는 것이 현재 명백하다. 이러한 상이한 패밀리 구성원은 Bcl-2와 유사한 기능을 보유하거나(예를 들어, BclXL, BclW, BclS, Mcl-1, A1, Bfl-1) Bcl-2 기능에 대응하고 세포 사멸을 촉진하는(예를 들어, Bax, Bak, Bik, Bim, Bid, Bad, Harakiri) 것으로 나타났다.
5. 수술
암이 있는 사람의 대략 60%는 일부 유형의 수술을 거칠 것이며, 이는 예방, 진단 또는 병기 결정, 근치 및 완화 수술을 포함한다. 근치 수술은 본 발명의 치료, 화학요법, 방사선요법, 호르몬 요법, 유전자 요법, 면역요법 및/또는 대체 요법과 같은 다른 요법과 함께 사용될 수 있는 암 치료이다.
근치 수술은 암성 조직의 전부 또는 일부가 물리적으로 제거, 절개, 및/또는 파괴되는 절제술을 포함한다. 종양 절제술은 종양의 적어도 일부를 물리적으로 제거하는 것을 지칭한다. 종양 절제술 외에도, 수술에 의한 치료는 레이저 수술, 냉동수술, 전기수술, 및 현미경 제어 수술(모스(Moh's) 수술)을 포함한다. 본 발명이 표재성 암, 전암, 또는 부수적인 양의 정상 조직의 제거와 함께 사용될 수 있음이 추가로 고려된다.
암성 세포, 조직, 또는 종양의 일부 또는 전부를 절개하면, 공동(cavity)이 신체에 형성될 수 있다. 치료는 추가 항암 요법과 함께 관류, 직접 주사 또는 국소 적용 부위에 의해 달성될 수 있다. 이러한 치료는 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일마다, 또는 1, 2, 3, 4, 및 5주마다 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월마다 반복될 수 있다.
I. ECD3-유도된 펩티드 서열 및 이의 용도
상기 논의된 바와 같이, US28에 대한 결합 분자의 설계를 고려할 때, 발명자는 US28 단백질의 N-말단 부분(ECD1)이 상이한 HCMV 균주 사이에서 높은 수준의 돌연변이를 함유하고 매우 특이적이고 균주 불가지론적 항체에 대해 부적절한 표적으로 보인다는 것에 주목하고, 발명자는 놀랍게도 보존된 ECD2 및 ECD4 단백질의 보존된 부분이 마우스에서 적절한 면역원이 아니었음을 발견한 반면, 출원인은 HCMV US28의 ECD3 영역에 대한 매우 특이적인 균주 불가지론적 결합 분자의 식별에 대한 신규 접근법을 개발할 수 있었다.
이 접근법은 ECD3의 2개의 변이체 형태인, 서열번호: 6에 의해 정의된 바와 같은 서열 TKKNNQCMTDYDYLEVS를 갖는 4N-변이체; 및 서열번호: 7에 의해 정의된 바와 같은 서열 TKKDNQCMTDYDYLEVS를 갖는 4D-변이체로부터 유래된 펩티드 서열의 사용에 기반하였다.
본 출원의 실시예에서 각각 펩티드 1 및 2로 언급되는 이러한 펩티드 서열은 마우스를 면역화하고, US28 ECD3 펩티드의 두 유전적 변이체에 대해 매우 특이적이지만 균주 불가지론적 결합 특성 가질 뿐만 아니라, US28 과발현 US28-CHO-A1 세포, HCMV Ad169 감염된 MRC-5 세포, HCMV 혈청 양성 개체로부터의 1차 PBMC, HCMV 감염된 인간 폐 조직 및 여러 유형의 공격성 인간 종양, 예컨대 식도암, 위암, 직장암, 간암, 폐암, 췌장암, 자궁경부암, 악성 크롬친화세포종 및 국소 진행성 결장암, 유방암 및 그의 전이 및 교모세포종 등급 4에 대한 매우 특이적인 결합을 나타내는 항체를 스크리닝하고 식별하기 위해 사용되었다.
상기 펩티드 서열, 및 이의 기능적 유도체 및 변이체, 뿐만 아니라 본 발명에 따른 그들의 용도가 추가로 제공되어 있다.
따라서, 본 발명의 제13 측면은 US28의 ECD3의 4N-변이체의 서열, TKKNNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 6)를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어지거나, 서열번호: 6의 면역원성 단편 또는 변이체의 서열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 제공한다.
상기 펩티드 또는 폴리펩티드는 US28 단백질이 아니다. 예를 들어, 서열번호: 6에 의해 정의된 서열 또는 이의 면역원성 단편 또는 변이체 외에, 본 발명의 제13 측면의 펩티드 또는 폴리펩티드의 나머지 서열은 전체 길이에 걸쳐 고려할 때, US28의 서열에 대해 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 미만의 서열 동일성을 가질 수 있다. 바람직하게는 상기 펩티드 또는 폴리펩티드에서 유일한 US28-유래 서열은 서열번호: 6의 서열 또는 서열번호: 6의 면역원성 단편 또는 변이체의 서열이다.
본 발명의 제14 측면은 서열 TKKDNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 7)를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어지거나, 서열번호: 7의 면역원성 단편 또는 변이체의 서열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 제공한다.
상기 펩티드 또는 폴리펩티드 US28 단백질이 아니다. 예를 들어, 서열번호: 7에 의해 정의된 서열 또는 이의 면역원성 단편 또는 변이체 외에, 본 발명의 제14 측면의 펩티드 또는 폴리펩티드의 나머지 서열은 전체 길이에 걸쳐 고려할 때 US28의 서열에 대해 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 미만의 서열 동일성을 가질 수 있다. 바람직하게는 상기 펩티드 또는 폴리펩티드에서 유일한 US28-유래 서열은 서열번호: 7의 서열 또는 서열번호: 7의 면역원성 단편 또는 변이체의 서열이다.
각각 본 발명의 제13 또는 제14 측면에 따른 참조 서열 서열번호: 6 또는 7의 면역원성 단편 또는 변이체는 참조 서열의 전체 서열 미만을 포함하고, 바람직하게는 참조 서열의 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16개의 연속 아미노산을 포함한다.
서열번호: 6의 상기 면역원성 단편은 예를 들어, 다음 중 임의의 하나 이상으로부터 선택될 수 있다:
- KKNNQCMTDYDYLEVS 또는 TKKNNQCMTDYDYLEV로부터 선택된 16-mer;
- KNNQCMTDYDYLEVS; KKNNQCMTDYDYLEV; 또는 TKKNNQCMTDYDYLE로부터 선택된 15-mer;
- NNQCMTDYDYLEVS; KNNQCMTDYDYLEV; KKNNQCMTDYDYLE; 또는 TKKNNQCMTDYDYL로부터 선택된 14-mer;
- NQCMTDYDYLEVS; NNQCMTDYDYLEV; KNNQCMTDYDYLE; KKNNQCMTDYDYL; 또는 TKKNNQCMTDYDY로부터 선택된 13-mer;
- QCMTDYDYLEVS; NQCMTDYDYLEV; NNQCMTDYDYLE; KNNQCMTDYDYL; KKNNQCMTDYDY; TKKNNQCMTDYD로부터 선택된 12-mer;
- CMTDYDYLEVS; QCMTDYDYLEV; NQCMTDYDYLE; NNQCMTDYDYL; KNNQCMTDYDY; KKNNQCMTDYD; 또는 TKKNNQCMTDY로부터 선택된 11-mer;
- MTDYDYLEVS; CMTDYDYLEV; QCMTDYDYLE; NQCMTDYDYL; NNQCMTDYDY; KNNQCMTDYD; KKNNQCMTDY; 또는 TKKNNQCMTD로부터 선택된 10-mer;
- TDYDYLEVS; MTDYDYLEV; CMTDYDYLE; QCMTDYDYL; NQCMTDYDY; NNQCMTDYD; KNNQCMTDY; KKNNQCMTD; 또는 TKKNNQCMT로부터 선택된 9-mer;
- DYDYLEVS; TDYDYLEV; MTDYDYLE; CMTDYDYL; QCMTDYDY; NQCMTDYD; NNQCMTDY; KNNQCMTD; KKNNQCMT; 또는 TKKNNQCM으로부터 선택된 8-mer;
- YDYLEVS; DYDYLEV; TDYDYLE; MTDYDYL; CMTDYDY; QCMTDYD; NQCMTDY; NNQCMTD; KNNQCMT; KKNNQCM; 또는 TKKNNQC로부터 선택된 7-mer;
- DYLEVS; YDYLEV; DYDYLE; TDYDYL; MTDYDY; CMTDYD; QCMTDY; NQCMTD; NNQCMT; KNNQCM; KKNNQC; 또는 TKKNNQ로부터 선택된 6-mer;
- YLEVS; DYLEV; YDYLE; DYDYL; TDYDY; MTDYD; CMTDY; QCMTD; NQCMT; NNQCM; KNNQC; KKNNQ; 또는 TKKNN으로부터 선택된 5-mer;
- LEVS; YLEV; DYLE; YDYL; DYDY; TDYD; MTDY; CMTD; QCMT; NQCM; NNQC; KNNQ; KKNN; 또는 TKKN으로부터 선택된 4-mer; 또는
- EVS; LEV; YLE; DYL; YDY; DYD; TDY; MTD; CMT; QCM; NQC; NNQ; KNN; KKN; 또는 TKK로부터 선택된 3-mer.
서열번호: 7의 상기 면역원성 단편은 예를 들어, 다음 중 임의의 하나 이상으로부터 선택될 수 있다:
- KKDNQCMTDYDYLEVS 또는 TKKDNQCMTDYDYLEV로부터 선택된 16-mer;
- KDNQCMTDYDYLEVS; KKDNQCMTDYDYLEV; 또는 TKKDNQCMTDYDYLE로부터 선택된 15-mer;
- DNQCMTDYDYLEVS; KDNQCMTDYDYLEV; KKDNQCMTDYDYLE; 또는 TKKDNQCMTDYDYL로부터 선택된 14-mer;
- NQCMTDYDYLEVS; DNQCMTDYDYLEV; KDNQCMTDYDYLE; KKDNQCMTDYDYL; 또는 TKKDNQCMTDYDY로부터 선택된 13-mer;
- QCMTDYDYLEVS; NQCMTDYDYLEV; DNQCMTDYDYLE; KDNQCMTDYDYL; KKDNQCMTDYDY; TKKDNQCMTDYD로부터 선택된 12-mer;
- CMTDYDYLEVS; QCMTDYDYLEV; NQCMTDYDYLE; DNQCMTDYDYL; KDNQCMTDYDY; KKDNQCMTDYD; 또는 TKKDNQCMTDY로부터 선택된 11-mer;
- MTDYDYLEVS; CMTDYDYLEV; QCMTDYDYLE; NQCMTDYDYL; DNQCMTDYDY; KDNQCMTDYD; KKDNQCMTDY; 또는 TKKDNQCMTD로부터 선택된 10-mer;
- TDYDYLEVS; MTDYDYLEV; CMTDYDYLE; QCMTDYDYL; NQCMTDYDY; DNQCMTDYD; KDNQCMTDY; KKDNQCMTD; 또는 TKKDNQCMT로부터 선택된 9-mer;
- DYDYLEVS; TDYDYLEV; MTDYDYLE; CMTDYDYL; QCMTDYDY; NQCMTDYD; DNQCMTDY; KDNQCMTD; KKDNQCMT; 또는 TKKDNQCM으로부터 선택된 8-mer;
- YDYLEVS; DYDYLEV; TDYDYLE; MTDYDYL; CMTDYDY; QCMTDYD; NQCMTDY; DNQCMTD; KDNQCMT; KKDNQCM; 또는 TKKDNQC로부터 선택된 7-mer;
- DYLEVS; YDYLEV; DYDYLE; TDYDYL; MTDYDY; CMTDYD; QCMTDY; NQCMTD; DNQCMT; KDNQCM; KKDNQC; 또는 TKKDNQ로부터 선택된 6-mer;
- YLEVS; DYLEV; YDYLE; DYDYL; TDYDY; MTDYD; CMTDY; QCMTD; NQCMT; DNQCM; KDNQC; KKDNQ; 또는 TKKDN으로부터 선택된 5-mer;
- LEVS; YLEV; DYLE; YDYL; DYDY; TDYD; MTDY; CMTD; QCMT; NQCM; DNQC; KDNQ; KKDN; 또는 TKKD로부터 선택된 4-mer; 또는
- EVS; LEV; YLE; DYL; YDY; DYD; TDY; MTD; CMT; QCM; NQC; DNQ; KDN; KKD; 또는 TKK로부터 선택된 3-mer.
바람직하게는, 선택된 상기 또는 각각의 면역원성 단편은 임의의 다른 단백질, 특히 다른 GPCR과 같은 임의의 단백질의 세포외 영역에 존재하는 그러한 서열을 제외하며; 이것은 US28의 ECD3에 대해 요구되는 특이성을 수득하고, 임의의 표적외 효과를 최소화하거나 바람직하게는 피하는 데 도움이 될 수 있다. 따라서, 더 긴 면역원성 단편, 예를 들어 적어도 5-mer, 적어도 6-mer, 적어도 7-mer, 적어도 8-mer, 적어도 9-mer, 적어도 10-mer, 적어도 11-mer, 적어도 12-mer, 적어도 13-mer, 적어도 14-mer, 적어도 15-mer, 또는 적어도 16-mer가 바람직할 수 있다.
각각 본 발명의 제13 또는 제14 측면에 따른 참조 서열 서열번호: 6 또는 7의 면역원성 단편 또는 변이체는 전형적으로 체액 및/또는 세포-매개 면역 반응을 유발하는 것과 같이, 면역 반응(예를 들어 인간 또는 다른 동물의 신체 내 면역 반응)을 유발할 수 있다. 상기 면역 반응은 각각 본 발명의 제13 또는 제14 측면에 따른 펩티드 또는 폴리펩티드 내에 존재하는 참조 서열(즉 서열번호: 6 및/또는 7)에 대한 특이성을 갖는 것이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 제13 및/또는 제14 측면의 펩티드 또는 폴리펩티드의 면역원성 단편 또는 변이체는 서열번호: 6 및 서열번호: 7 둘 다에 공통이고 그 내에 존재하는 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 상기 공통 서열은 연속 아미노산 서열 또는 비-연속 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 제13 및/또는 제14 측면의 펩티드 또는 폴리펩티드의 면역원성 단편 또는 변이체에 의해 유발될 수 있는 면역 반응은 서열번호: 6 및 서열번호: 7 둘 다에 공통이고 그 내에 존재하는 서열에 대한 특이성을 갖는 면역 반응일 수 있다. 예를 들어, 공통 서열은 서열번호: 6 및 서열번호: 7 둘 다에 공통이고 그 내에 존재하는 연속 아미노산 서열 또는 비-연속 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다.
또한 본 발명의 제13 및 제14 측면에 의해 각각 TKKNNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 6), 또는 TKKDNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 7)로부터 선택된 참조 서열의 면역원성 단편 또는 변이체를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 펩티드 또는 폴리펩티드가 제공되며, 여기서 면역원성 단편 또는 변이체는 항체 1D3, 1C10, 1A10, 1G9 및/또는 1E8(각각 서열번호: 12, 104, 122, 68 및 88에 의해 정의된 바와 같은 1D3, 1C10, 1A10, 1G9 및/또는 1E8의 VH 서열을 갖는 VH 폴리펩티드 서열, 및 각각 서열번호: 18, 108, 126, 72 및 92에 의해 정의된 바와 같은 1D3, 1C10, 1A10, 1G9 및/또는 1E8의 VL 서열을 갖는 VL 폴리펩티드 서열을 포함하는 scFv가 또한 포함됨)에 의해 결합된 US28의 ECD3 내의 에피토프의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 바람직하게는 상기 펩티드 또는 폴리펩티드는 1D3, 1C10, 1A10, 1G9 및/또는 1E8에 의해 특이적으로 결합된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 제13 및/또는 제14 측면의 상기(또는 각각의) 펩티드(들) 또는 폴리펩티드(들)(및/또는 이의 면역원성 단편 또는 변이체)는 정제된 및/또는 단리된 형태로 제공된다.
본 발명의 제13 및/또는 제14 측면에 의해 정의된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드(또는 이의 면역원성 단편 또는 변이체)는 매우 다양한 역할 및 유용성에서 유용하다. 제한없이, 이들은 HCMV의 US28 단백질의 ECD3에 대한 특이성을 갖는 면역 반응을 유발하기 위해(예를 들어 대상체에서 백신으로서 및/또는 US28의 ECD3에 대한 결합 특이성을 갖는 추가의 항체를 생성하기 위해); 그리고 또한 US28의 ECD3에 대한 특이성을 갖는 결합 분자를 포획, 식별 및/또는 특성화하기 위해(예를 들어, 상기 균주 불가지론적 결합 분자가 4N-변이체 서열 또는 4D-변이체 서열의 존재와 관계없이 본 발명의 제13 및/또는 제14 측면에 의해 정의된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드(또는 이의 면역원성 단편 또는 변이체) 각각에 본질적으로 동일하게 결합하는 것으로 확인될 수 있도록, US28의 ECD3에 대한 균주 불가지론적 결합 특이성을 갖는 이러한 결합 분자를 포획, 식별 및/또는 특성화하기 위한 수단을 제공하는 것을 포함함), 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서 본 발명의 제13 및/또는 제14 측면에 의해 정의된 바와 같은 상기 펩티드 또는 폴리펩티드(또는 이의 면역원성 단편 또는 변이체)를 조합하여, 개별적으로(예를 들어 별개의 검정에서 각각의 유형 중 하나, 상기 별개의 검정은 조합하여 사용됨), 또는 서로 혼합하여 사용하는 것이 유용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 제15 측면은 제1 펩티드 또는 폴리펩티드 및 제2 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합을 제공하며, 여기서:
제1 펩티드 또는 폴리펩티드는 서열 TKKNNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 6), 또는 이의 면역원성 단편 또는 변이체, 예컨대 본 발명의 제13 측면에 의해 정의된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드(또는 이의 면역원성 단편 또는 변이체)를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루진 것을 포함하며, 단 상기 면역원성 단편은 적어도 서열번호: 6의 4N 아미노산을 포함하고;
제2 펩티드 또는 폴리펩티드는 서열 TKKDNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 7), 또는 이의 면역원성 단편, 예컨대 본 발명의 제14 측면에 의해 정의된 바와 같은 면역원성 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것을 포함하며, 단 상기 면역원성 단편은 적어도 서열번호: 7의 4D 아미노산을 포함한다.
본 발명의 제13 및/또는 제14 측면에 의해 정의된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드(또는 이의 면역원성 단편 또는 변이체), 및 본 발명의 제15 측면에 의해 정의된 바와 같은 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합은 그들의 유용성에 대한 가장 적절한 방식으로 제시될 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질 또는 접합체(이는 제한없이 상기 펩티드 또는 폴리펩티드(또는 이의 면역원성 단편 또는 변이체)를 면역계에 제시하기 위한 담체로서 적절할 수 있음)를 생성하고/하거나, 예를 들어 US28의 ECD3에 대한 특이성을 갖는 결합 분자의 포획, 식별 및/또는 특성화를 위한 검정에서 상기 고정화된 분자의 사용을 위해, 상기 펩티드 또는 폴리펩티드(또는 이의 면역원성 단편 또는 변이체), 또는 이의 융합 단백질 또는 접합체의 고정화된 버전을 생성하기에 적합할 수 있다.
따라서, 본 발명의 제16 측면은 제2 아미노산 서열에 직접적으로 또는 하나 이상의 링커 아미노산 서열을 통해 융합된 제1 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 융합 단백질을 제공하며, 여기서 제1 아미노산 서열은 본 발명의 제13 또는 제14 측면에 의해 정의된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드(또는 이의 면역원성 단편 또는 변이체)의 서열이고; 제2 아미노산 서열은 융합 파트너이다.
임의의 관심 융합 파트너가 선택될 수 있다. 당업자는 당업계에 알려진 융합 파트너 서열을 잘 알고 있고, 임의의 것이 선택될 수 있다. 융합 파트너는 예를 들어, 담체 단백질일 수 있다. 추가로, 또는 대안적으로, 융합 파트너는 융합되는 제1 아미노산 서열에 추가적 또는 대안적 결합 특성 및/또는 항원성 특성을 제공할 수 있고; 제1 아미노산 서열의 결합 부위에서 효과를 생성하는 효과기 부분을 제공할 수 있고; 결합 분자의 순환 반감기의 조절(예컨대 증가 또는 감소)을 제공할 수 있고; 결합 분자의 검출을 용이하게 하는 서열을 제공할 수 있다.
하나의 바람직한 옵션에서, 융합 파트너는 담체 단백질, 예컨대 제1 아미노산 서열에 대한 항체의 면역화 및 생성에 적합한 융합 단백질을 제공하기 위해 선택된 담체 단백질이다. 예를 들어, 담체 단백질은 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), HSA(인간 혈청 알부민), BSA(소 혈청 알부민), OVA(오브알부민), 파상풍 톡소이드(TT), 디프테리아 톡소이드(DT), 디프테리아 독소의 유전적으로 변형된 교차 반응 물질(CRM), 메닝고코커스 외부 막 단백질 복합체(OMPC) 및　에이치. 인플루엔자에　단백질 D(HiD)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
출원인이 아는 범위 내에서, 지금까지, 허가된 접합체 백신에서 사용된 5개의 담체 단백질은 TT, DT, 디프테리아 독소의 유전적으로 변형된 CRM, 메닝고코커스 OMPC 및　HiD이다. 임상 시험은 감염성 질환을 예방하는 데 있어서 이러한 접합체 백신의 효능을 입증하였다. 5개의 담체 단백질은 모두 백신의 면역원성을 증가시키는 데 효과적이지만 상이한 친화성을 가진 상이한 양의 항체를 도출한다. 평가된 추가의 담체 단백질은 임상 시험에서 덜 광범위하지만, rEPA(슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)　외독소 A), KLH(키홀 림펫 헤모시아닌), 및 플라젤린을 포함한다.
본 발명의 제17 측면은 제1 융합 단백질, 및 제2 융합 단백질을 포함하는 적어도 2개의 별개의 융합 단백질의 조합을 제공하며, 여기서:
본 발명의 제16 측면에 따른 제1 융합 단백질은 제1 융합 단백질의 제1 아미노산 서열로서, 서열 TKKNNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 6), 또는 이의 면역원성 단편 또는 변이체를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것을 포함하며, 단 상기 면역원성 단편 또는 변이체는 서열번호: 6의 4N 아미노산을 포함하고;
본 발명의 제16 측면에 따른 융합 제2 단백질은 제2 융합 단백질의 제1 아미노산 서열로서, 서열 TKKDNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 7), 또는 이의 면역원성 단편 또는 변이체를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 서열을 포함하며, 단 상기 면역원성 단편 또는 변이체는 서열번호: 7의 4D 아미노산을 포함한다.
예를 들어, 상기 조합은 HCMV 바이러스의 4N-변이체 및 4D-변이체 균주 둘 다에 대한 반응성을 갖는 대상체에서 면역 반응을 유발하는 데 사용될 수 있는 백신 조성물의 면역원성 구성요소로서 특히 유용할 수 있다. 예를 들어, 상기 반응은 US28의 ECD3의 4N-변이체에 대한 결합 특이성을 갖는 항체, US28의 ECD3의 4D-변이체에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 및 바람직하게는 US28의 ECD3의 4N- 및 4D-변이체 둘 다에 대한 균주-불가지론적 결합 특이성을 갖는 항체를 포함하는 항체 집단을 포함하는 폴리클로날 항체 반응을 생성하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 상기 폴리클로날 항체 반응으로부터 수득될 수 있는 단리된 폴리클로날 항체 생성물을 제공하며, 여기서 상기 폴리클로날 항체 생성물은 US28의 ECD3의 4N- 및 4D- 변이체 중 어느 하나, 또는 바람직하게는 둘 다에 대한 결합 특이성을 갖는 항체를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어지도록 선택될 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 융합 단백질의 생성에 대한 대안(또는 추가 변형)으로서, 본 발명은 또한 접합체의 생산을 제공한다. 따라서, 본 발명의 제18 측면은 본 발명의 제13 및 제14 측면 중 어느 하나 또는 둘 다에 의해 정의된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 본 발명의 제16 측면에 의해 정의된 바와 같은 융합 단백질에 접합된 모이어티를 포함하는 접합체를 제공한다.
상기 접합체의 모이어티는 본 발명의 제13 및 제14 측면 중 어느 하나 또는 둘 다에 의해 정의된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드(또는 이의 면역원성 단편 또는 변이체), 또는 본 발명의 제16 측면에 의해 정의된 바와 같은 융합 단백질에 직접적으로 접합될 수 있다. 대안적으로, 상기 접합체의 모이어티는 본 발명의 제13 및 제14 측면 중 어느 하나 또는 둘 다에 의해 정의된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 본 발명의 제16 측면에 의해 정의된 바와 같은 융합 단백질에 간접적으로, 예컨대 링커를 통해 접합될 수 있다.
임의적으로, 모이어티는 담체, 예를 들어 KLH(키홀 림펫 헤모시아닌), HSA(인간 혈청 알부민), BSA(소 혈청 알부민), OVA(오브알부민), 파상풍 톡소이드(TT), 디프테리아 톡소이드(DT), 디프테리아 독소의 유전적으로 변형된 교차 반응 물질(CRM), 메닝고코커스 외부 막 단백질 복합체(OMPC) 및 에이치. 인플루엔자에　단백질 D(HiD)로부터 선택된 담체와 같은 담체 단백질일 수 있다.
본 발명의 제19 측면은 적어도 2개의 별개의 접합체의 조합을 제공하며, 여기서 조합은
본 발명의 제18 측면에 따른 제1 접합체를 포함하며, 여기서 제1 접합체는 펩티드 또는 폴리펩티드에 접합된 모이어티를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고, 여기서 펩티드 또는 폴리펩티드는 서열 TKKNNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 6), 또는 이의 면역원성 단편 또는 변이체를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어지며, 단 상기 면역원성 단편 또는 변이체는 서열번호: 6의 4N 아미노산을 포함하고;
본 발명의 제18 측면에 따른 제2 접합체를 포함하며, 여기서 제2 접합체는 펩티드 또는 폴리펩티드에 접합된 모이어티를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고, 여기서 펩티드 또는 폴리펩티드는 서열 TKKDNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 7), 또는 이의 면역원성 단편 또는 변이체를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어지며, 단 상기 면역원성 단편 또는 변이체는 서열번호: 7의 4D 아미노산을 포함한다.
예를 들어, 상기 조합은 HCMV 바이러스의 4N-변이체 및 4D-변이체 균주 둘 다에 대한 반응성을 갖는 대상체에서 면역 반응을 유발하는 데 사용될 수 있는 백신 조성물의 면역원성 구성요소로서 특히 유용할 수 있다. 예를 들어, 상기 반응은 US28의 ECD3의 4N-변이체에 대한 결합 특이성을 갖는 항체, US28의 ECD3의 4D-변이체에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 및 바람직하게는 US28의 ECD3의 4N- 및 4D-변이체 둘 다에 대한 균주-불가지론적 결합 특이성을 갖는 항체를 포함하는 항체 집단을 포함하는 폴리클로날 항체 반응을 생성하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 상기 폴리클로날 항체 반응으로부터 수득될 수 있는 단리된 폴리클로날 항체 생성물을 제공하며, 여기서 상기 폴리클로날 항체 생성물은 US28의 ECD3의 4N- 및 4D- 변이체 중 어느 하나, 또는 바람직하게는 둘 다에 대한 결합 특이성을 갖는 항체를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 제20 측면은 본 발명의 제19 측면에 따른 접합체를 생산하는 방법을 제공하며, 방법은 (a) 본 발명의 제13 및/또는 제14 측면 중 어느 하나 또는 둘 다에 의해 정의된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드(또는 이의 면역원성 단편 또는 변이체), 본 발명의 제15 측면에 의해 정의된 바와 같은 이의 조합, 또는 본 발명의 제16 측면에 의해 정의된 바와 같은 융합 단백질을 제공하는 단계; 및 (b) 모이어티를 이에 접합시키는 단계를 포함한다.
모이어티를 펩티드 또는 폴리펩티드(또는 이의 면역원성 단편 또는 변이체)에 접합시키는 임의의 수단이 사용될 수 있으며; 당업자는 선택한 펩티드/폴리펩티드와 선택한 다른 모이어티 사이에 접합체를 생성하는 통상적인 방식을 잘 알고 있고, 가장 적절한 방법을 자유롭게 선택한다.
예를 들어, 그리고 제한없이, 교차-결합 폴리펩티드의 일부 통상적인 방식은 O'Sullivan 등, Anal. Biochem., 1979, 100, 100-108에 일반적으로 기재된 것들을 포함한다. 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드는 하나 이상의 티올 기 및 이러한 티올 기와 반응할 수 있는 이작용성 제제, 예를 들어 접합된 종 사이에 이황화 가교를 혼입하는 헤테로이작용성 교차-연결제인 요오도아세트산의 N-하이드록시숙신이미드 에스테르(NHIA) 또는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP)와의 반응에 적합한 선택된 모이어티로 풍부화되도록 조작될 수 있다. 예를 들어, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르로 달성된 아미드 및 티오에테르 결합은 일반적으로 이황화 결합보다 생체내에서 더 안정하다.
추가의 유용한 교차-연결제는 제한없이, 온화한 조건 하에 설피드릴 기의 탈보호를 허용하는 1차 아민을 위한 티올화 시약인 S-아세틸티오글리콜산 N-하이드록시숙신이미드 에스테르(SATA)(Julian 등, Anal. Biochem., 1983, 132: 68), 디메틸수베리미데이트 디하이드로클로라이드 및 N,N'-o-페닐렌디말레이미드를 포함한다.
본 발명의 제21 측면은 본 발명의 제19 측면에 의해 정의된 바와 같은 적어도 2개의 별개의 접합체의 조합을 생산하는 방법을 제공한다. 2개의 별개의 접합체가 개별적으로 생산된 다음 조합될 수 있거나, 대안적으로, 2개의 별개의 펩티드 또는 폴리펩티드(또는 이의 면역원성 단편 또는 변이체)는 조합될 수 있으며, 이어서 각각의 접합체는 적어도 2개의 별개의 접합체의 조합을 생산하기 위해 동일한 반응에서 생성될 수 있다.
본 발명의 제20 또는 제21 측면의 방법은 임의적으로 이렇게 생산된 접합체 또는 접합체의 조합을 단리하는 단계를 포함하고; 본 발명의 제22 측면은 본 발명의 제20 또는 제21 측면 중 임의의 것의 방법에 의해 수득되거나, 수득가능한 단리된 접합체, 또는 접합체의 조합을 제공하며, 임의적으로, 여기서 단리된 접합체는 대상체에게 투여하기 위해 추가로 제형화된다. 예를 들어, 후속 사용을 위해 예를 들어, 약제학적 또는 수의학적 조성물로서 수용자에게 투여하기 위해 제형화될 수 있다.
본 발명의 제23 측면은 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합을 제공하며, 여기서 핵산 분자는 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합은 집합적으로, 개별적으로 또는 조합하여 본 발명의 제13 및/또는 제14 측면 중 어느 하나 또는 둘 다에 따른 하나 이상의 펩티드 및/또는 폴리펩티드, 본 발명의 제15 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합, 본 발명의 제16 측면에 따른 융합 단백질, 및/또는 본 발명의 제17 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 융합 단백질의 조합을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 제23 측면에 따른 상기 또는 각각의 핵산 분자는 예를 들어, DNA 또는 RNA 분자로부터 각각 독립적으로 선택될 수 있다. 본 발명의 제23 측면에 따른 상기 또는 각각의 핵산 분자는 예를 들어, 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산 분자로부터 각각 독립적으로 선택될 수 있다. 본 출원의 섹션 B에서 상기 논의된 각각의 옵션은 본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자를 암호화하는 핵산의 맥락에서, 본원에 개시되어 있고 약간 수정하여 본 발명의 제23 측면에 따른 상기 또는 각각의 핵산 분자에 적용될 수 있다.
본 발명의 제24 측면은 본 발명의 제23 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합을 포함하는 벡터를 제공한다. 임의의 벡터가 사용될 수 있지만, 제한없이, 상기 벡터는 임의적으로 레트로바이러스 벡터, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 및 아데노바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 출원의 섹션 C에서 상기 논의된 각가의 옵션은 본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 혼입하는 벡터의 맥락에서, 본원에 개시되어 있고 약간 수정하여 본 발명의 제24 측면에 따른 상기 또는 각각의 벡터에 적용될 수 있다.
본 발명의 제25 측면은 본 발명의 제23 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합, 또는 본 발명의 제24 측면에 따른 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 임의적으로, 세포는 본 발명의 제13 및/또는 제14 측면 중 어느 하나 또는 둘 다로부터 선택된 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드, 본 발명의 제15 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합, 본 발명의 제16 측면에 따른 융합 단백질, 및/또는 본 발명의 제17 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 융합 단백질의 조합을 발현한다. 본 출원의 섹션 D에서 상기 논의된 각각의 옵션은 본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자를 암호화하는 하나 이상의 핵산(또는 상기 또는 더 많은 핵산을 혼입하는 벡터)을 혼입하는 세포의 맥락에서, 본원에 개시되어 있고 약간 수정하여 본 발명의 제25 측면에 따른 상기 또는 각각의 세포에 적용될 수 있다.
본 발명은 HCMV의 US28 단백질의 ECD3에 대한 특이성(바람직하게는 균주-불가지론적 특이성)을 갖는 세포를 단리 및/또는 확장하는 데 사용하기 위한 단리된 분자 집단을 추가로 제공하고, 임의적으로 여기서 세포는 T 세포 및/또는 B 세포이고, 여기서 단리된 분자 집단은 본 발명의 제13 및/또는 제14 측면 중 어느 하나 또는 둘 다로부터 선택된 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드, 본 발명의 제15 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합, 본 발명의 제16 측면에 따른 하나 이상의 융합 단백질, 및/또는 본 발명의 제17 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 융합 단백질의 조합, 본 발명의 제18 측면에 따른 하나 이상의 접합체, 및/또는 본 발명의 제19 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 접합체의 조합을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
본 발명은 HCMV의 US28 단백질의 ECD3을 특이적으로 표적할 수 있는 세포(바람직하게는 균주-불가지론적 특이성을 가짐)를 단리 및/또는 확장시키는 방법을 추가로 제공하며, 여기서 방법은 HCMV의 US28 단백질의 ECD3에 대한 특이성을 갖는 세포를 선택하고(바람직하게는 균주-불가지론적 특이성을 선택하고), 선택된 세포를 확장시키는 방법에서, 세포의 공급원을 제공하는 단계, 및 선행 단락에서 정의된 바와 같은 단리된 분자 집단을 사용하는 단계를 포함하고, 임의적으로 여기서 세포의 공급원은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
i. 본 발명의 임의의 다양한 측면에 따라, 치료될 대상체 및/또는 HCMV 감염 또는 이와 연관된 질환 병태가 퇴치될 대상체로부터의 세포;
ii. 본 발명의 임의의 다양한 측면에 따라, 치료될 대상체 및/또는 HCMV 감염 또는 이와 연관된 질환 또는 병태가 퇴치될 대상체에 대해 HLA-일치된 세포;
iii. 말초 혈액 백혈구 또는 PBMC; 및
iv. T 세포 또는 B 세포.
상기 선택된 세포는 임의적으로 다음일 수 있다:
(a) HCMV의 US28 단백질의 ECD3에 특이적인 T 세포 수용체(TcR)(바람직하게는 균주-불가지론적 특이성)을 갖는 T 세포;
(b) HCMV의 US28 단백질의 ECD3에 특이적인 표면 결합된 항체(바람직하게는 균주-불가지론적 특이성)을 갖는 B 세포; 및/또는
(c) HCMV의 US28 단백질의 ECD3에 특이적인 항체를 분비하는 B 세포(바람직하게는 균주-불가지론적 특이성 가짐).
본 발명의 제26 측면은 본 발명의 제13 및/또는 제14 측면 중 어느 하나 또는 둘 다로부터 선택된 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드, 본 발명의 제15 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합, 본 발명의 제16 측면에 따른 융합 단백질, 및/또는 본 발명의 제17 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 융합 단백질의 조합, 본 발명의 제18 측면에 따른 접합체, 본 발명의 제19 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 접합체의 조합, 본 발명의 제23 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합, 및/또는 본 발명의 제24 측면에 따른 벡터에 노출되고/되거나 이를 포함하는 세포를 제공한다.
예를 들어, 세포(또는 세포 집단)는 항원 제시 세포(APC)일 수 있다. 임의적으로, APC는 수지상 세포(DCs), 대식세포, 랑게르한스 세포 및 B 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
임의적으로 세포(또는 세포 집단)는 본 발명의 제13 및/또는 제14 측면 중 어느 하나 또는 둘 다로부터 선택된 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드, 본 발명의 제15 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합, 본 발명의 제16 측면에 따른 융합 단백질, 및/또는 본 발명의 제17 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 융합 단백질의 조합, 본 발명의 제18 측면에 따른 접합체, 및/또는 본 발명의 제19 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 접합체의 조합으로 펄스(pulse)될 수 있거나 펄스되었다. 추가로, 또는 대안적으로, 세포(또는 세포 집단)는 본 발명의 제23 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합, 및/또는 본 발명의 제24 측면에 따른 벡터를 발현할 수 있거나 발현되었고 이에 의해 상기 하나 이상의 핵산에 의해 암호화된 펩티드 또는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
임의적으로 세포, 예컨대 APC(예를 들어 DC)는 본 발명의 임의의 다양한 측면에 따라 치료될 대상체 및/또는 HCMV 감염 또는 이와 연관된 질환 또는 병태가 퇴치될 대상체로부터 유래될 수 있다.
임의적으로 DC는 단핵구-유래 DC(MoDC)일 수 있고, 예를 들어 DC가 유래된 단핵구는 본 발명의 임의의 다양한 측면에 따라 치료될 대상체 및/또는 HCMV 감염 또는 이와 연관된 질환 또는 병태가 퇴치될 대상체로부터의 단핵구일 수 있다.
임의적으로, DC는 본 발명의 임의의 다양한 측면에 따라 치료될 대상체 및/또는 HCMV 감염 또는 이와 연관된 질환 또는 병태가 퇴치될 대상체에 대해 HLA-일치된 공여자로부터 유래된다.
임의적으로, DC는 MoDC이고 DC가 유래된 단핵구는 본 발명의 임의의 다양한 측면에 따라 치료될 대상체 및/또는 HCMV 감염 또는 이와 연관된 질환 또는 병태가 퇴치될 대상체에 대해 HLA-일치된 공여자로부터의 단핵구이다.
본 발명의 제27 측면은 US28의 ECD3에서 에피토프에 대한 특이성을 갖는 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 세포(예를 들어 자연 발생 T 세포, 또는 본 발명의 제1 측면에 따른 CAR을 발현하는 재조합 세포, 예를 들어 CAR T-세포, CAR NK-세포 및/또는 CAR-대식세포)를 단리 및/또는 풍부화하는 방법을 제공하며, 여기서 방법은 서열번호: 6 및/또는 7의 서열 중 하나 또는 둘 다에 대한 결합 특이성을 갖는 세포를 단리 및/또는 풍부화하기 위해 하나 이상의 제제를 사용하는 단계를 포함하며,
여기서 하나 이상의 제제는 본 발명의 제13 및/또는 제14 측면 중 어느 하나 또는 둘 다에 따른 펩티드 또는 폴리펩티드, 본 발명의 제15 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합, 본 발명의 제16 측면에 따른 융합 단백질, 및/또는 본 발명의 제17 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 융합 단백질의 조합, 본 발명의 제18 측면에 따른 접합체, 및/또는 본 발명의 제19 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 접합체의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 제27 측면의 방법의 하나의 구현예에서, 서열은 MHC 사량체로서 제형화될 수 있다.
MHC 사량체는 T 세포 면역 반응의 특이성 및 표현형을 특성화하고 이에 따라 매우 다양한 질환 및 백신 연구에 유용한 T 세포 수용체(TCR)를 재조합적으로 발현하는 세포에 대해서도 중요한 도구로서 등장하였다. 펩티드-MHC 다량체는 전형적으로 항원-제시 세포와의 T 세포 수용체 상호작용의 일부로서 발생하는 인식 이벤트에 대한 대리물로서 기능하는 MHC 결합 홈에서 항원성 펩티드를 나타낸다. 오늘날 사용되는 다량체의 가장 일반적인 형태는 스트렙타비딘 분자 상에 나타낸 비오틴-표지된 pMHC로 이루어져 4가 복합체를 형성하므로; 이 검출 방법에 대해 용어 "사량체"가 통상적으로 사용된다. 첫번째 설명 이후에, MHC 사량체는 항원-특이적 T 세포 반응의 정량화를 위해 널리 사용되었다. MHC 분자에 결합하는 펩티드를 예측하는 방법과 결합할 때, 사량체 분석은 T 세포 수용체 에피토프를 식별하는 데 극도로 유용할 수 있다. 구체적으로, 자기 항원을 연구하기 위한 클래스 I 사량체의 적용은 또한 종양 항원 연구에서 광범위하게 발전하였다.
특정 구현예에서, 본 발명의 제27 측면에 따르면, 상기 MHC 사량체는 예를 들어 항원-특이적 CD8+　T 세포 검출을 위한 클래스 I MHC 사량체, 항원-특이적 CD4+　T 세포 검출을 위한 클래스 II MHC 사량체, 또는 유세포 분석법 또는 형광 현미경 검사를 위한 형광단 표지된 사량체일 수 있다.
임의적으로, T-세포는 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 효과기 T 세포, 헬퍼 T 세포, 기억 T 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), EBV-특이적 T 세포 수용체(TCR) 또는 γδ-T 세포 하위유형으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 제28 측면은 본 발명의 제13 및/또는 제14 측면 중 어느 하나 또는 둘 다에 따른 펩티드 또는 폴리펩티드에 따른 펩티드 또는 폴리펩티드, 본 발명의 제15 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합을 포함하는 MHC 사량체를 제공하며, 임의적으로 여기서 상기 또는 각각의 펩티드는 서열번호: 6 또는 서열번호: 7, 또는 이중 하나 또는 둘 다의 면역원성 단편을 포함하거나 이에 상응하고, 예를 들어 여기서 MHC 사량체는 항원-특이적 CD8+　T 세포 검출을 위한 클래스 I MHC 사량, 항원-특이적 CD4+　T 세포 검출을 위한 클래스 II MHC 사량체, 유세포 분석법 또는 형광 현미경 검사를 위한 형광단 표지된 사량체이다. MHC 사량체는 US28의 ECD3 내의 에피토프에 대한 특이성을 갖는 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 세포, 예를 들어, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 효과기 T 세포, 헬퍼 T 세포, 기억 T 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), EBV-특이적 T 세포 수용체(TCR) 또는 γδ-T 세포 하위유형으로 이루어진 군으로부터 선택된 T-세포 및/또는 본 발명의 제1 측면에 따른 CAR을 발현하는 재조합 세포, 예를 들어 CAR T-세포, CAR NK-세포 및/또는 CAR-대식세포를 단리 및/또는 풍부화하는 데 추가로 사용될 수 있다.
J. 제형
본 발명의 다양한 측면에 따른 생성물은 추가 용도를 위해 제형화될 수 있다. 예를 들어, 이들은 약제학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 제형으로 제형화될 수 있다.
약제학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 제형은 충분히 저장 안정성이 있고 인간 및 동물에 대한 투여에 적합한 당업계에 알려진 방식으로 제조될 수 있다. 한 가지 옵션에서, 이들은 멸균 용액과 같은 용액의 형태로 제시될 수 있다. 또 다른 옵션에서, 특히 비세포 생성물의 제형과 관련하여, 약제학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 제형은 예를 들어 동결 건조, 분무 건조, 분무 냉각을 통해, 또는 초임계 입자 형성으로부터 입자 형성의 사용을 통해 동결건조될 수 있다.
이러한 비세포 생성물은 제한없이, 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 본 발명의 제1 또는 제7 측면에 따른 결합 분자; 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합; 본 발명의 제3 측면에 따른 벡터, 또는 다수의 별개의 벡터의 조합; 본 발명의 8 측면에 따른 접합체; 본 발명의 제10 측면에 따른 단리된 접합체; 본 발명의 제12 측면에 의해 제공된 제제의 다양한 비세포 옵션에 따른 비세포 제제; 본 발명의 제13 및/또는 제14 측면 중 어느 하나 또는 둘 다로부터 선택된 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드, 본 발명의 제15 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합, 본 발명의 제16 측면에 따른 융합 단백질, 및/또는 본 발명의 제17 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 융합 단백질의 조합, 본 발명의 제18 측면에 따른 접합체, 본 발명의 제19 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 접합체의 조합, 본 발명의 제23 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합, 및/또는 본 발명의 제24 측면에 따른 벡터; 본 발명의 제28 측면에 따른 MHC 사량체; 본 발명의 제29 측면에 의해 제공된 다양한 비세포 옵션에 따른 비세포 백신 조성물.
"약제학적으로 허용되는"이란 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 완충제, 담체 및/또는 부형제를 포함하여 본 발명의 다양한 측면에 따른 하나 이상의 제형화된 생성물의 효과를 감소시키지 않는 무독성 물질을 의미한다. 이러한 약제학적으로 허용되는 완충제, 담체 또는 부형제는 당업계에 잘 알려져 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A.R Gennaro, Ed., Mack Publishing Company(1990) 및 handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press(2000) 참조).
용어 "완충제"는 pH를 안정화할 목적으로 산-염기 혼합물을 함유하는 수용액을 의미하는 것으로 의도된다. 완충제의 예는 Trizma, Bicine, Tricine, MOPS, MOPSO, MOBS, Tris, Hepes, HEPBS, MES, 포스페이트, 카르보네이트, 아세테이트, 시트레이트, 글리콜레이트, 락테이트, 보레이트, ACES, ADA, 타르트레이트, AMP, AMPD, AMPSO, BES, CABS, 카코딜레이트, CHES, DIPSO, EPPS, 에탄올아민, 글리신, HEPPSO, 이미다졸, 이미다졸락트산, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO 및 TES이다.
용어 "희석제"는 약제학적 제제에 폴리펩티드를 희석할 목적으로 수성 또는 비수성 용액을 의미하는 것으로 의도된다. 희석제는 예를 들어, 식염수, 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에탄올 또는 오일(예컨대 홍화유, 옥수수유, 땅콩유, 면실유 또는 참기름) 중 하나 이상일 수 있다.
임의적으로, 약제학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 제형은 애쥬번트를 포함할 수 있다. 용어 "애쥬번트"는 제형 내에서 본 발명의 하나 이상의 생성물의 생물학적 효과를 증가시키기 위해 제형에 첨가되는 임의의 화합물을 의미하는 것으로 의도된다. 애쥬번트는 상이한 음이온을 갖는 아연, 구리 또는 은 염 중 하나 이상일 수 있으며, 예를 들어, 불화물, 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 티오시아네이트, 설파이트, 수산화물, 포스페이트, 카르보네이트, 락테이트, 글리콜레이트, 시트레이트, 보레이트, 타르타레이트, 및 상이한 아실 조성물의 아세테이트에 제한되지 않는다. 애쥬번트는 또한 양이온성 중합체 예컨대 양이온성 셀룰로스 에테르, 양이온성 셀룰로스 에스테르, 탈아세틸화된 히알루론산, 키토산, 양이온성 덴드리머, 양이온성 합성 중합체 예컨대 폴리(비닐 이미다졸), 및 양이온성 폴리펩티드 예컨대 폴리히스티딘, 폴리리신, 폴리아르기닌, 및 이러한 아미노산을 함유하는 펩티드일 수 있다.
부형제는 탄수화물, 폴리머, 지질 및 미네랄 중 하나 이상일 수 있다. 탄수화물의 예는 락토스, 글루코스, 수크로스, 만니톨, 및 사이클로덱스트린을 포함하며, 이는 예를 들어 동결건조를 용이하게 하기 위해 조성물에 첨가될 수 있다. 중합체의 예는 예를 들어, 전분, 셀룰로스 에테르, 셀룰로스 카르복시메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 에틸하이드록시에틸 셀룰로스, 알기네이트, 카라기난, 히알루론산 및 이의 유도체, 폴리아크릴산, 폴리술포네이트, 폴리에틸렌글리콜/폴리에틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌옥사이드/폴리프로필렌 옥사이드 공중합체, 상이한 가수분해도의 폴리비닐알코올/폴리비닐아세테이트, 및 폴리비닐피롤리돈이며, 모든 상이한 분자량이 예를 들어 점도 조절을 위해, 생체접착을 달성하기 위해, 또는 화학적 및 단백질분해 분해로부터 지질을 보호하기 위해 제형에 첨가된다. 지질의 예는 지방산, 인지질, 모노글리세리드, 디글리세리드, 및 트리글리세리드, 세라마이드, 스핑고지질 및 당지질, 모든 상이한 아실 쇄 길이 및 포화도, 달걀 레시틴, 대두 레시틴, 수소화 달걀 및 대두 레시틴이며, 이는 중합체에 대한 것과 유사한 이유로 조성물에 첨가된다. 미네랄의 예는 활석, 산화마그네슘, 산화아연 및 산화티타늄이며, 이는 액체 축적 감소 또는 유리한 안료 특성과 같은 이익을 수득하기 위해 조성물에 첨가된다.
본 발명의 의학적 용도의 구현예에서, 제형은 또한 적어도 하나의 추가의 치료제(예를 들어 항암제 및/또는 항-혈관생성 화합물, 이의 예는 본 출원의 섹션 H에서 상기 논의되어 있음)를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 리포솜 형태일 수 있으며, 여기서 본 발명의 다양한 측면에 따른 하나 이상의 생성물(이하에서 "활성제(들)"로서 언급됨)은 다른 약제학적으로 허용되는 담체에 더하여, 미셸, 불용성 단일층 및 액정과 같은 응집 형태로 존재하는 지질과 같은 양친매성 제제와 조합하여 제형화될 수 있다. 리포솜 제형에 적합한 지질은 제한없이, 모노글리세리드, 디글리세리드, 설파티드, 리소레시틴, 인지질, 사포닌, 담즙산 등을 포함한다. 적합한 지질은 또한 혈류 순환 시간을 연장하기 위해 극성 헤드기에서 폴리(에틸렌 글리콜)에 의해 변형된 상기 지질을 포함한다. 이러한 리포솜 제형의 제조는 예를 들어 US 4,235,871에서 찾을 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 생분해성 미소구체 형태일 수 있다. 지방족 폴리에스테르, 예컨대 폴리(락트산)(PLA), 폴리(글리콜산)(PGA), PLA 및 PGA(PLGA)의 공중합체 또는 폴리(카프로락톤)(PCL), 및 폴리무수물이 미소구체의 생산에서 생분해성 중합체로서 널리 사용되었다. 이러한 미소구체의 제조는 US　5,851,451 및 EP　0 213　303에서 찾을 수 있다.
추가의 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 중합체 겔의 형태로 제공되며, 여기서 중합체 예컨대 전분, 셀룰로스 에스테르, 셀룰로스 카르복시메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 에틸하이드록시에틸 셀룰로스, 알기네이트, 카라기난, 히알루론산 및 이의 유도체, 폴리아크릴산, 폴리비닐 이미다졸, 폴리술포네이트, 폴리에틸렌글리콜/폴리에틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌옥사이드/폴리프로필렌 옥사이드 공중합체, 상이한 가수분해도의 폴리비닐알코올/폴리비닐아세테이트, 및 폴리비닐피롤리돈은 제제를 함유하는 용액의 증점에 사용된다. 중합체는 또한 젤라틴 또는 콜라겐을 포함할 수 있다.
대안적으로, 활성제(들)는 단순히 식염수, 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에탄올 또는 오일(예컨대 홍화유, 옥수수유, 땅콩유, 면실유 또는 참기름), 트라가칸트 검, 및/또는 다양한 완충제에 용해될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 활성 폴리펩티드의 작용 강화를 위해 이온 및 정의된 pH를 포함할 수 있음이 이해될 것이다. 추가로, 조성물은 멸균과 같은 통상적인 약제학적 작동에 적용될 수 있고/있거나 방부제, 안정화제, 습윤제, 에멀젼, 완충제, 충전제 등과 같은 통상적인 애쥬번트를 함유할 수 있다.
비경구 투여에 적합한 제형은 산화방지제, 완충제, 세균발육저지제 및 의도된 수용자의 혈액과 등장성인 제형을 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사 용액; 및 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다.
대안적인 바람직한 구현예에서, 약제학적 조성물은 환자에게 국소 투여하기에 적합하다.
바람직하게는, 제형은 활성 성분의 일일 용량 또는 단위, 일일 하위용량 또는 이의 적절한 분율을 함유하는 단위 투여량이다.
하기 기재된 투여 경로에서, 당업자는 어떤 활성제가 임의의 주어진 투여 경로에 적용가능한지 알 수 있음이 이해될 것이다.
활성제(들)는 활성 성분을 포함하는 약제학적 제형의 형태로, 임의적으로 무독성 유기, 또는 무기, 산, 또는 염기 부가 염의 형태로, 약제학적으로 허용되는 투여량 형태로 경구로 또는 임의의 비경구 경로로 투여될 수 있다. 치료될 장애 및 환자, 뿐만 아니라 투여 경로에 따라, 조성물은 다양한 용량으로 투여될 수 있다.
인간 요법에서 활성제(들)는 일반적으로 의도된 투여 경로 및 표준 약제학적 관행과 관련하여 선택된 적합한 약제학적 부형제, 희석제 또는 담체와 혼합하여 투여될 것이다.
예를 들어, 활성제(들)는 즉시-방출, 지연-방출 또는 제어-방출 적용을 위해, 향미제 또는 착색제를 함유할 수 있는 정제, 캡슐, 배주, 엘릭시르, 용액 또는 현탁액의 형태로 경구로, 협측으로 또는 설하로 투여될 수 있다. 활성제(들)는 또한 해면체내 주사를 통해 투여될 수 있다.
적합한 정제는 부형제 예컨대 미세결정질 셀룰로스, 락토스, 시트르산나트륨, 탄산칼슘, 이염기성 인산칼슘 및 글리신, 붕해제 예컨대 전분(바람직하게는 옥수수, 감자 또는 타피오카 전분), 나트륨 전분 글리콜레이트, 크로스카멜로스 나트륨 및 특정 복합 실리케이트, 및 과립화 결합제 예컨대 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필메틸셀룰로스(HPMC), 하이드록시-프로필셀룰로스(HPC), 수크로스, 젤라틴 및 아카시아를 함유할 수 있다. 추가로, 윤활제 예컨대 스테아르산마그네슘, 스테아르산, 글리세릴 베헤네이트 및 활석이 포함될 수 있다.
유사한 유형의 고형 조성물이 또한 젤라틴 캡슐에서 충전제로서 이용될 수 있다. 이와 관련하여 바람직한 부형제는 락토스, 전분, 셀룰로스, 유당 또는 고분자량 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 수성 현탁액 및/또는 엘릭시르의 경우, 본 발명의 화합물은 다양한 감미제 또는 향미제, 착색 물질 또는 염료, 유화제 및/또는 현탁제 및 희석제 예컨대 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜 및 글리세린, 및 이의 조합과 조합될 수 있다.
활성제(들)는 또한 비경구로, 예를 들어, 정맥내, 동맥내, 복강내, 척수강내, 뇌실내, 흉골내, 두개내, 근육내 또는 피하로 투여될 수 있거나, 이들은 주입 기술에 의해 투여될 수 있다. 이들은 다른 물질, 예를 들어 용액을 혈액과 등장성이게 만들기에 충분한 염 또는 글루코스를 함유할 수 있는 멸균 수용액 형태로 가장 잘 사용된다. 수용액은 필요한 경우 적합하게 완충되어야 한다(바람직하게는 pH 3 내지 9). 멸균 조건 하에 적합한 비경구 제형의 제조는 당업자에게 잘 알려진 표준 약제학적 기술에 의해 용이하게 달성된다.
제형은 단위-용량 또는 다중-용량 용기, 예를 들어 밀봉된 앰플 및 바이알에 제시될 수 있고, 사용 직전에, 멸균 액체 담체, 예를 들어 주사용수의 첨가만을 필요로 하는 동결-건조된(동결건조) 상태로 저장될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 이전에 기재된 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.
인간 환자에게 경구 및 비경구 투여의 경우, 활성제의 일일 투여량 수준은 일반적으로 단일 또는 분할 용량으로 투여된 성인 당 1 내지 1,000 mg(즉 약 0.015 내지 15 mg/kg)일 수 있다.
따라서, 예를 들어, 활성제(들)의 정제 또는 캡슐은 적절한 경우 하나씩 또는 2회 이상 투여하기 위해 1 mg 내지 1,000 mg의 활성제를 함유할 수 있다. 의사는 어떠한 경우에도 임의의 개별 환자에 대해 가장 적합한 실제 투여량을 결정할 것이며 특정 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 달라질 것이다. 상기 투여량은 평균 사례의 예시이다. 물론, 더 높거나 더 낮은 투여량 범위가 당연한 개별 경우가 있을 수 있고, 이러한 경우는 본 발명의 범위 내에 있다.
활성제(들)는 또한 비강내로 또는 흡입에 의해 투여될 수 있고 건조 분말 흡입기 또는 적합한 추진체, 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로-에탄, 하이드로플루오로알칸 예컨대 1,1,1,2-테트라플루오로에탄(HFA 134A3 또는 1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판(HFA 227EA3), 이산화탄소 또는 다른 적합한 가스를 사용한 압축 용기, 펌프, 스프레이 또는 분무기로부터의 에어로졸 분무 제시로 편리하게 전달된다. 가압 에어로졸의 경우, 투여량 단위는 계량된 양을 전달하기 위해 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 가압 용기, 펌프, 스프레이 또는 분무기는 예를 들어 에탄올 및 추진체의 혼합물을 용매로서 사용하여 활성 화합물의 용액 또는 현탁액을 함유할 수 있으며, 윤활제, 예를 들어 소르비탄 트리올레에이트를 추가로 함유할 수 있다. 흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한 캡슐 및 카트리지(예를 들어, 젤라틴으로 제조됨)는 활성제의 분말 믹스 및 적합한 분말 베이스 예컨대 락토스 또는 전분을 함유하도록 제형화될 수 있다. 이러한 제형은 예를 들어, 소세포 폐암종, 비소 세포 폐암종, 흉막폐모세포종 또는 카르시노이드 종양과 같은 폐의 고형 종양을 치료하는 데 특히 유용할 수 있다.
에어로졸 또는 건조 분말 제형은 바람직하게는 각각의 계량된 용량 또는 "퍼프(puff)"가 대상체에게 전달하기 위한 유효량(예를 들어 적어도 1 mg)의 활성제(들)를 함유하도록 배열된다. 에어로졸을 사용하는 전반적인 일일 용량은 환자마다 달라질 것이고, 단일 용량으로 또는, 보다 일반적으로, 하루 종일 분할 용량으로 투여될 수 있음이 이해될 것이다.
대안적으로, 활성제(들)는 특히 결장, 직장 또는 전립선 종양을 치료하거나 표적하기 위해 좌제 또는 페서리 형태로 투여될 수 있다.
활성제(들)는 또한 안구 경로에 의해 투여될 수 있다. 안과용으로, 활성제(들)는 예를 들어 등장성 pH 조정된 멸균 식염수에서 미분화된 현탁액으로서, 또는, 바람직하게는, 임의적으로 벤질알코늄 클로라이드와 같은 방부제와 조합하여 등장성 pH 조정된 멸균 염수의 용액으로서 제형화될 수 있다. 대안적으로, 활성제(들)는 바셀린과 같은 연고로 제형화될 수 있다. 이러한 제형은 망막모세포종, 속질상피종, 포도막 흑색종, 횡문근육종, 안내림프종, 또는 안와 림프종과 같은 눈의 고형 종양을 치료하는 데 특히 유용할 수 있다.
활성제(들)는 로션, 용액, 크림, 연고 또는 가루 분말의 형태로 국소로 적용될 수 있거나, 예를 들어, 피부 패치의 사용에 의해 경피 투여될 수 있다. 피부에 국소 적용하는 경우, 활성제(들)는 예를 들어, 다음 중 하나 이상과의 혼합물에 현탁되거나 용해된 활성 화합물을 함유하는 적합한 연고로서 제형화될 수 있다: 광유, 액체 바셀린, 백색 바셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화 왁스 및 물. 대안적으로, 이들은 예를 들어, 다음 중 하나 이상의 혼합물에 현탁되거나 용해된 적합한 로션 또는 크림으로 제형화될 수 있다: 광유, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜, 액체 파라핀, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알코올, 2-옥틸도데카놀, 벤질 알코올 및 물. 이러한 제형은 예를 들어, 기저 세포 암, 편평 세포 암 또는 흑색종과 같은 피부의 고형 종양을 치료하는 데 특히 유용할 수 있다.
피부 암의 경우, 활성제(들)는 또한 전기혼입(EI)에 의해 전달될 수 있다. EI는 피부 표면의 직경이 최대 30 미크론인 작은 입자가 전기천공법에 사용되는 것과 동일하거나 유사한 전기 펄스를 경험할 때 발생한다. EI에서, 이러한 입자는 각질 층을 통해 그리고 피부의 더 깊은 층으로 구동된다. 입자는 억제제로 로딩되거나 코팅될 수 있거나 단순히 제제, 항체 또는 화합물이 들어갈 수 있는 피부에서 기공을 생성하는 "총알"로서 작용할 수 있다.
입에 국소 투여하기에 적합한 제형은 향미 베이스, 일반적으로 수크로스 및 아카시아 또는 트라가칸트에 활성 성분을 포함하는 로젠지(lozenge); 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로스 및 아카시아와 같은 불활성 베이스에 활성 성분을 포함하는 패스틸(pastille); 및 적합한 액체 담체에 활성 성분을 포함하는 구강 청결제를 포함한다. 이러한 제형은 입과 목의 고형 종양을 치료하는 데 특히 유용할 수 있다.
구현예에서, 활성제(들)가 폴리펩티드(들)를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 경우, 활성제(들)는 주사가능한 지연-방출 약물 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있다. 이들은 주사 빈도를 감소시키도록 특이적으로 설계된다. 이러한 시스템의 예는 생분해성 미소구체에 재조합 인간 성장 호르몬(rhGH)을 캡슐화하는 Nutropin Depot이며, 일단 주사되면, 지속된 기간에 걸쳐 rhGH를 서서히 방출한다.
활성제(들)는 필요한 부위에, 예를 들어, 안구 종양을 치료하기 위해 눈에 직접적으로 활성제(들)를 방출하는 외과적으로 이식된 장치에 의해 투여될 수 있다. 질환 부위에 이러한 직접 적용은 유의한 전신 부작용 없이 효과적인 요법을 달성한다.
항체 및 CAR과 같은 폴리펩티드(들)를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 활성제(들)의 전달을 위한 대안적인 방법은 열에 민감한 ReGel 주사가능한 시스템이다. 체온 미만에서, ReGel은 주사가능한 액체이지만 체온에서는 즉시 젤 저장소를 형성하여 알려진 안전한 생분해성 중합체를 서서히 약화시키고 용해시킨다. 활성 약물은 생체중합체가 용해될 때 시간 경과에 따라 전달된다.
폴리펩티드 활성제(들)는 또한 경구로 전달될 수 있다. 과정은 단백질 및 펩티드를 동시 전달하기 위해 신체에서 비타민 B12를 경구 섭취하는 자연적 과정을 이용한다. 비타민 B12 섭취 시스템을 타고 달림으로써, 단백질 또는 펩티드 활성제(들)는 장의 벽을 통해 이동할 수 있다. 복합체는 비타민 B12 유사체와 약물 사이에서 합성되어 복합체의 비타민 B12 부분의 내인성 인자(IF)에 대한 유의한 친화성 및 복합체의 약물 부분의 유의한 생체활성을 모두 유지한다.
핵산 활성제(들)는 본원에 기재된 바와 같은 적합한 유전적 작제물로서 투여되고 발현을 위해 대상체에게 전달될 수 있다. 전형적으로, 유전적 작제물에서 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결되어 세포에서 화합물을 발현할 수 있다. 본 발명의 유전적 작제물은 당업계에, 예를 들어 Sambrook 등(2012) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 1-4 권, Cold Spring Harbor Press, NY에 잘 알려진 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
바람직하게는, 유전적 작제물은 인간 세포에 전달하기 위해 채택될 수 있다. 유전적 작제물을 세포로 도입하기 위한 수단 및 방법은 당업계에 알려져 있고, 면역리포솜, 리포솜, 바이러스 벡터(백시니아, 변형된 백시니아, 렌티바이러스, 파보바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터 포함)의 사용, 및 예를 들어 유전자 총 및 전기천공법을 사용한 DNA의 직접 전달을 포함한다. 또한, 치료를 위해 환자의 표적 조직에 폴리뉴클레오티드를 전달하는 방법이 또한 당업계에 잘 알려져 있다. 대안적인 방법에서, DNA 거대분자를 세포로 운반하기 위해 수용체-매개 세포내이입을 사용하는 고효율 핵산 전달 시스템이 이용된다. 이것은 철 수송 단백질 트랜스페린을 핵산에 결합하는 폴리양이온에 접합함으로써 달성된다. Cotten 등(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6094-6098의 방법에 의해 생산된 결함성 또는 화학적으로 비활성화된 아데노바이러스 입자의 엔도솜-파괴 활성을 사용하는 본 발명의 DNA 작제물 또는 다른 유전적 작제물의 고효율 수용체-매개 전달이 또한 사용될 수 있다. "네이키드 DNA" 및 양이온성 및 중성 지질과 복합체화된 DNA는 또한 본 발명의 DNA를 치료될 개체의 세포로 도입하는 데 유용할 수 있음이 이해될 것이다. 유전자 요법에 대한 비바이러스 접근법은 Ledley(1995, Human Gene Therapy 6, 1129-1144)에 기재되어 있다.
특이적 조직의 암/종양에 대해 본 발명의 핵산 분자를 암호화하는 벡터에서 조직-특이적 프로모터를 사용하는 것이 유용할 수 있지만, 이것은 암/종양 이외의 위치에서 신체 내 핵산 서열의 발현 위험이 암/종양을 앓고 있는 환자에 대한 치료적 이익과 비교하여 허용할 수 있을 것으로 예상되기 때문에 필수적인 것은 아니다.
구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물 또는 제형은 비경구 투여, 보다 특히 정맥내 투여를 위한 것이다. 바람직한 구현예에서, 약제학적 조성물은 예를 들어 주사에 의해 환자에게 정맥내 투여하기에 적합하다. 다른 구현예에서, 척추강내 투여는 예를 들어 뇌 및/또는 신경계를 표적하는 데 사용될 수 있다.
K. 백신
본 발명의 제29 측면은 HCMV 감염 및/또는 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)와 연관된 질환 또는 병태에 대한 백신접종, 위험 감소, 예방, 또는 퇴치하는 데 사용하기에 적합한 백신 조성물을 제공한다. 상기 HCMV 감염 및/또는 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)와 연관된 질환 또는 병태는 본 출원의 섹션 G에 정의된 바와 같을 수 있다.
백신은 능동 백신 및/또는 수동 백신의 구성요소를 포함할 수 있다. 능동 백신 구성요소는 능동 면역을 유발하도록 설계되는 반면; 수동 백신 구성요소는 수동 면역을 유발하도록 설계된다.
본 발명의 제29 측면에 따른 능동 백신은 대상체에게 투여될 때, 대상체의 면역계를 유도하여 HCMV의 US28 단백질의 ECD3 내의 에피토프에 대해 지시된 면역 반응, 바람직하게는 균주 불가지론적 면역 반응을 생성할 수 있다.
본 발명의 제29 측면에 따른 수동 백신은 대상체에게 투여될 때, HCMV의 US28 단백질의 ECD3 내에 존재하는 에피토프에 대해 지시된 면역계 능력, 바람직하게는 균주 불가지론적 면역계 능력을 제공하는 조성물일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 제29 측면의 백신 조성물은 다음에 대한 면역 반응을 촉발하고/하거나 제공하며:
(a) HCMV의 US28 단백질의 세포외 도메인 3(ECD3) 내에 완전히 존재하는 하나 이상의 에피토프(예를 들어, 본 발명의 제13 및/또는 제14 측면에 따라 기재된 바와 같은 서열번호: 6 또는 7의 면역원성 단편 중 하나 이상에 존재하는 에피토프);
(b) US28 단백질의 ECD3 내의 하나 이상의 선형 에피토프;
(c) HCMV의 4D-변이체 균주 및 4N-변이체 균주 둘 다에서 동일한 형태로 존재하는 에피토프인 HCMV의 US28 단백질의 ECD3 내의 하나 이상의 에피토프, 여기서 HCMV의 4D-변이체 균주는 TKKDNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 7)의 서열을 갖는 ECD3을 포함하는 US28 단백질을 암호화하고 여기서 HCMV의 4N-변이체 균주는 TKKNNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 6)의 서열을 갖는 ECD3을 포함하는 US28 단백질을 암호화함; 및/또는
(d) 여기서 백신에 의해 촉발되거나 제공된 면역 반응은 HCMV의 4D-변이체 균주 및 4N-변이체 균주에 대해 불가지론적인 HCMV 균주이고, Towne, VR1814, TB40/E, Merlin, JP, Ad169, VHL/E, AF1, BL 및 DAVIS로부터 선택된 4D-변이체 HCMV 균주 중 하나 이상에 대해 지시되고 또한 Toledo, TR 및 DB로부터 선택된 4N-변이체 HCMV 균주 중 하나 이상에 대해 지시된 면역 반응을 촉발하고/하거나 제공한다.
상기 백신 조성물은 수동 백신일 수 있고/있거나, 임의적으로 (a) 본 발명의 제1 측면에 따른 하나 이상의 결합 분자, (b) 본 발명의 제1 측면에 의해 정의된 바와 같은 상기 하나 이상의 결합 분자의 하나 이상의 기능적 단편, (c) 본 발명의 제7 측면에 따른 하나 이상의 단리된 결합 분자, (d) 본 발명의 제2 측면에 따른 하나 이상의 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합, (e) 본 발명의 제3 측면에 따른 하나 이상의 벡터, (f) 본 발명의 제4 측면에 따른 하나 이상의 세포, (g) 본 발명의 제8 측면에 따른 하나 이상의 접합체, 및/또는 (h) 본 발명의 제10 측면에 따른 하나 이상의 단리된 접합체를 포함한다.
대안적으로, 상기 백신 조성물은 능동 백신일 수 있고/있거나, 임의적으로 다음을 포함한다:
(a) 본 발명의 제13 및/또는 제14 측면 중 어느 하나 또는 둘 다에 따른 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드, 본 발명의 제15 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합, 본 발명의 제16 측면에 따른 융합 단백질, 본 발명의 제17 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 융합 단백질의 조합, 본 발명의 제18 측면에 따른 접합체, 및/또는 본 발명의 제19 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 접합체의 조합;
(b) 본 발명의 제23 측면에 따른 하나 이상의 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합, 및/또는 본 발명의 제24 측면에 따른 벡터; 및/또는
(c) 세포, 예컨대 항원-제시 세포(예를 들어 수지상 세포), 또는 상기 세포의 동종 또는 이종 집단, 여기서 상기 또는 각각의 상기 세포는 다음 중 하나 이상으로 로딩됨: 본 발명의 제13 및/또는 제14 측면 중 어느 하나 또는 둘 다에 따른 펩티드 또는 폴리펩티드, 본 발명의 제15 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합, 본 발명의 제16 측면에 따른 융합 단백질, 본 발명의 제17 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 융합 단백질의 조합, 본 발명의 제18 측면에 따른 접합체, 본 발명의 제19 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 접합체의 조합, 본 발명의 제23 측면에 따른 하나 이상의 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합, 및/또는 본 발명의 제24 측면에 따른 벡터.
본 발명의 제30 측면은 HCMV와 연관된 질환 또는 병태에 대한 백신접종, 위험 감소, 예방, 및/또는 퇴치 방법을 제공하며, 방법은 본 발명의 제29 측면에 따른 백신을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 제30 측면은 대상체에서 HCMV와 연관된 질환 또는 병태에 대한 백신접종, 위험 감소, 예방, 및/또는 퇴치에 사용하기 위한 본 발명의 제29 측면에 따른 백신을 제공한다.
본 발명의 제30 측면은 HCMV와 연관된 질환 또는 병태에 대한 백신접종, 위험 감소, 예방, 및/또는 퇴치를 위한 약제의 제조에서 본 발명의 제29 측면에 따른 백신의 용도를 제공한다.
HCMV와 연관된 상기 질환 또는 병태는 예를 들어, 본 발명의 제11 측면의 맥락에서 상기 개시된 바와 같은 HCMV와 연관된 질환 또는 병태일 수 있다. 임의적으로, 질환 또는 병태는 잠복성 HCMV 감염이거나, 잠복성 HCMV 감염과 연관된 질환 또는 병태이다.
일부 구현예에서, HCMV와 연관된 질환 또는 병태에 대한 백신접종, 위험 감소, 예방, 및/또는 퇴치 방법은 대상체에게 백신을 단지 1회 투여하는 것을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, HCMV와 연관된 질환 또는 병태에 대한 백신접종, 위험 감소, 예방, 및/또는 퇴치 방법은 대상체에게 백신을 백신 2회 또는 여러 번 투여하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 백신이 능동 백신인 구현예에서, 대상체에게 1차 용량, 및 후속 부스터 용량을 개별적으로 투여하는 것이 적절할 수 있다.
L. 진단 및 다른 검출 및 평가 모드
본 출원의 발명의 내용 섹션에서 논의된 바와 같이, 본 발명의 제31 측면은 대상체 및/또는 생체외 생물학적 물질의 하나 이상의 생물학적 조건 및/또는 생물학적 특성을 평가하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 US28 단백질의 ECD3에 높은 특이성으로 결합하고, 바람직하게는 HCMV의 상이한 균주 사이의 구별 없이 높은 특이성으로 결합하기 위해 본 발명에 따른 결합 분자 또는 이의 접합체의 결합 특성을 사용한다.
방법은 (a) 대상체 및/또는 생체외 생물학적 물질을 본 발명의 제1 측면에 의해 정의된 바와 같은 결합 분자, 또는 본 발명의 제8 또는 제10 측면에 의해 정의된 바와 같은 접합체와 접촉시키는 단계; 및 (b) 대상체 및/또는 생체외 생물학적 물질에 대한 결합 분자 또는 접합체의 결합의 직접 및/또는 간접 측정에 기반하여 대상체 및/또는 생체외 생물학적 물질을 평가하는 단계를 포함한다.
평가를 위해 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 그리고 제한없이, 방법은 ELISA 방법을 포함할 수 있고, 임의적으로 방법은 생체외 생물학적 물질, 예컨대 하나 이상의 체액(예를 들어 혈액, 타액, 소변)에 대해 수행된다.
대안적인 예에서, 방법은 유세포 분석 방법을 포함하고, 임의적으로 방법은 대상체로부터의 생체외 혈액 샘플 및/또는 생체외 골수 샘플을 평가하는 방법이다.
추가의 대안적 구현예에서, 방법은 본 발명의 제8 또는 제10 측면에 의해 정의된 바와 같은 접합체의 용도를 포함하며, 여기서 접합체는 검출가능한 모이어티, 예컨대 방사성 모이어티를 포함하고, 방법은 대상체 및/또는 생체외 생물학적 물질에서 검출가능한 모이어티의 검출을 포함하며, 예를 들어, 여기서 방법은 면역 양전자 방출(PET) 영상화 방법이다.
추가의 대안적 구현예에서, 방법은 면역조직화학(IHC), 예를 들어 생체외 생물학적 물질의 샘플에서 수행된 IHC 방법이다. 상기 샘플은 예를 들어, 대상체 또는 다른 관심 생물학적 공급원으로부터 수득된 생물학적 물질로부터의 조직학적 표본일 수 있다. 당업자는 생물학적 물질로부터의 조직학적 표본의 제조를 위해 당업계에 잘 알려진 수많은 기술을 잘 알고 있다. 조직학적 표본의 제조에 적합한 임의의 수단이 본 발명의 맥락에서 사용된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 제31 측면의 방법은 대상체에서 HCMV 감염 및/또는 HCMV와 연관된 질환 또는 병태의 진단적 또는 예후적 평가에 적합한 데이터(예를 들어 영상 또는 다른 측정가능한 데이터)를 생성할 목적을 위해 대상체, 또는 대상체로부터 수득된 생체외 생물학적 물질에서 수행된다.
진단적 또는 예후적 평가가 본 발명의 제31 측면의 방법에 의해 이루어질 수 있는(또는 그에 관한 데이터가 생성될 수 있는) 상기 HCMV 감염 및/또는 HCMV와 연관된 질환 또는 병태는 예를 들어, 본 출원의 섹션 G에 정의된 바와 같을 수 있다.
진단적 또는 예후적 평가가 본 발명의 제31 측면의 방법에 의해 이루어질 수 있는(또는 그에 관한 데이터가 생성될 수 있는) 대상체는 예를 들어, 본 출원의 섹션 G에 기재된 임의의 대상체일 수 있다.
진단적 또는 예후적 평가가 본 발명의 제31 측면의 방법에 의해 이루어질 수 있는(또는 그에 관한 데이터가 생성될 수 있는) HCMV와 연관된 질환 또는 병태는 HCMV 감염일 수 있거나 또는 HCMV 감염과 연관될 수 있다.
HCMV 감염은 하나의 구현예에서, 단일 균주 감염일 수 있다.
임의적으로, 대안적인 구현예에서, HCMV 감염은 다중 균주 HCMV 감염을 포함하며, 여기서 다중 균주 HCMV 감염은 HCMV의 하나 초과의 상이한 균주, 예를 들어 상이한 US28 단백질 암호화 서열을 암호화하는 2개 이상의 HCMV 균주로의 감염을 포함한다. 상기 2개 이상의 균주는 N-말단(ECD1) 영역, 제1 세포외 루프(ECD2) 영역, 제2 세포외 루프(ECD3) 영역, 및/또는 제3 세포외 루프(ECD4) 영역에서와 같은 세포외 영역 중 하나 이상에서 상이한 US28 단백질을 암호화할 수 있다. 하나의 관심 구현예에서, 다중 균주 HCMV 감염에서 2개 이상의 HCMV 균주 각각은 N-말단(ECD1) 영역의 적어도 하나 이상의 위치에서 다른 것과 상이한 US28 단백질을 암호화하며; 예를 들어 이들은 N-말단(ECD1) 영역에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10개 이상의 아미노산 위치에서 상이할 수 있다. 추가로, 또는 대안적으로, 또 다른 관심 구현예에서, 다중 균주 HCMV 감염에서 2개 이상의 HCMV 균주 각각은 제2 세포외 루프(ECD3) 영역의 하나 이상의 위치에서 다른 것과 상이한 US28 단백질을 암호화하며, 예를 들어 다중 균주 HCMV 감염에서 HCMV 균주 중 하나 이상은 ECD3의 4N-변이체를 암호화하는 US28 단백질을 암호화할 수 있고, 다중 균주 HCMV 감염에서 다른 HCMV 균주 중 하나 이상은 ECD3의 4D-변이체를 암호화하는 US28 단백질을 암호화할 수 있다.
진단적 또는 예후적 평가가 본 발명의 제31 측면의 방법에 의해 이루어질 수 있는(또는 그에 관한 데이터가 생성될 수 있는) HCMV와 연관된 질환 또는 병태는 잠복성 HCMV 감염(예를 들어, 단일 또는 다중 균주 잠복성 HCMV 감염)일 수 있거나 잠복성 HCMV 감염(임의적으로 다중 균주 잠복성 HCMV 감염)과 연관될 수 있다.
진단적 또는 예후적 평가가 본 발명의 제31 측면의 방법에 의해 이루어질 수 있는(또는 그에 관한 데이터가 생성될 수 있는) HCMV와 연관된 질환 또는 병태는 용해성 HCMV 감염(임의적으로 다중 균주 용해성 HCMV 감염)일 수 있거나 용해성 HCMV 감염(임의적으로 중 균주 용해성 HCMV 감염)과 연관될 수 있다.
진단적 또는 예후적 평가가 본 발명의 제31 측면의 방법에 의해 이루어질 수 있는(또는 그에 관한 데이터가 생성될 수 있는) HCMV와 연관된 질환 또는 병태는 선천성 HCMV 감염(예를 들어, 단일 또는 다중 균주 감염), 예컨대 잠복성 선천성 단일 또는 다중 균주 HCMV 감염 또는 용해성 선천성 단일 또는 다중 균주 HCMV 감염일 수 있다. 따라서, 이러한 평가의 대상체는 질환 또는 병태가 평가되는 것과 관련한 대상체, 예컨대 영아(예컨대 신생아), 태아 또는 배아, 또는 어머니(또는 대상체의 예비 어머니), 예컨대 대상체의 수유모, 대상체를 임신한 여성, 또는 개체의 임신 전에 평가될 여성일 수 있다.
진단적 또는 예후적 평가가 본 발명의 제31 측면의 방법에 의해 이루어질 수 있는(또는 그에 관한 데이터가 생성될 수 있는) HCMV와 연관된 질환 또는 병태는 암, 예를 들어 HCMV-감염된 암(임의적으로 단일 균주, 또는 다중 균주, HCMV 감염된 암), 예컨대 잠복성 HCMV-감염된 암(임의적으로 단일 균주, 또는 다중 균주, 잠복성 HCMV 감염된 암)일 수 있다.
진단적 또는 예후적 평가가 본 발명의 제31 측면의 방법에 의해 이루어질 수 있는(또는 그에 관한 데이터가 생성될 수 있는) HCMV와 연관된 질환 또는 병태는 상피암일 수 있으며; 임의적으로 여기서 상피암은 유방암이고; 예를 들어, 여기서 유방암은 삼중 음성 유방암(TNBC), 또는 HER2-양성 유방암(본원에 기재된 바와 같음)이다. 상피암의 상기 형태는 임의적으로 HCMV 감염된 상피암의 단일 균주, 또는 다중 균주 형태 예를 들어 상피암의 잠복성 HCMV-감염된 형태(임의적으로 단일 균주, 또는 다중 균주, 잠복성 HCMV 감염된 암)일 수 있다.
진단적 또는 예후적 평가가 본 발명의 제31 측면의 방법에 의해 이루어질 수 있는(또는 그에 관한 데이터가 생성될 수 있는) HCMV와 연관된 질환 또는 병태는 암의 전이성 및/또는 공격성 형태일 수 있다. 상기 전이성 및/또는 공격성 암의 형태는 임의적으로 HCMV 감염된 전이성 및/또는 공격성 암의 단일 균주, 또는 다중 균주 형태 예를 들어 잠복성 HCMV-감염된 형태의 전이성 및/또는 공격성 암(임의적으로 단일 균주, 또는 다중 균주, 잠복성 HCMV 감염된 암)일 수 있다.
진단적 또는 예후적 평가가 본 발명의 제31 측면의 방법에 의해 이루어질 수 있는(또는 그에 관한 데이터가 생성될 수 있는) HCMV와 연관된 질환 또는 병태는 교모세포종일 수 있다.
진단적 또는 예후적 평가가 본 발명의 제31 측면의 방법에 의해 이루어질 수 있는(또는 그에 관한 데이터가 생성될 수 있는) HCMV와 연관된 질환 또는 병태는 HCMV-감염된 암 세포, 예컨대 잠복성 HCMV-감염된 암 세포를 갖거나, 갖거나 보유하는 것으로 진단되었거나, 갖는 것으로 의심되는 대상체, 또는 대상체로부터 수득된 생체외 생물학적 물질에서 이루어질 수 있다.
진단적 또는 예후적 평가가 본 발명의 제31 측면의 방법에 의해 이루어질 수 있는(또는 그에 관한 데이터가 생성될 수 있는) HCMV와 연관된 질환 또는 병태는 세포 생성물의 기증과 같은 세포 물질의 수용자일 수 있거나, 수용자인 것으로 의도될 수 있다. 상기 세포 생성물은 예를 들어, 하나 이상의 유형의 생체외 세포; 하나 이상의 유형의 생체외 세포 배양물; 하나 이상의 유형의 생체외 조직; 하나 이상의 유형의 생체외 조직 배양물; 하나 이상의 유형의 생체외 기관; 및/또는 하나 이상의 유형의 생체외 기관 배양물을 포함하는 군으로부터 선택된 살아있는 생체외 세포 물질을 포함하거나, 이로 본직절으로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다. 임의적으로, 세포 생성물은 살아있는 공여자로부터 직접적으로 또는 간접적으로 유래될 수 있다.
진단적 또는 예후적 평가가 본 발명의 제31 측면의 방법에 의해 이루어질 수 있는(또는 그에 관한 데이터가 생성될 수 있는) HCMV와 연관된 질환 또는 병태는 세포 생성물의 공여자와 같은 세포 물질의 공여자이거나 의도되는 대상체; 또는 상기 공여자로부터의 생체외 생물학적 물질에서 평가될 수 있다. 상기 세포 생성물은 상기 공여자로부터의 세포, 조직 또는 기관 중 임의의 하나 이상을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다.
진단적 또는 예후적 평가가 본 발명의 제31 측면의 방법에 의해 이루어질 수 있는(또는 그에 관한 데이터가 생성될 수 있는) HCMV와 연관된 질환 또는 병태는 생물학적 물질, 예컨대 생체외 또는 시험관내 세포 물질, 예컨대 수용자 대상체에게 투여하기에 적합하고/하거나 사용될 생물학적 물질에서 수행될 수 있다. 상기 생체외 세포 생성물은 예를 들어, 하나 이상의 유형의 생체외 세포; 하나 이상의 유형의 생체외 세포 배양물; 하나 이상의 유형의 생체외 조직; 하나 이상의 유형의 생체외 조직 배양물; 하나 이상의 유형의 생체외 기관; 및/또는 하나 이상의 유형의 생체외 기관 배양물을 포함하는 군으로부터 선택된 살아있는 생체외 세포 물질을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다. 임의적으로, 세포 생성물은 살아있는 공여자로부터 직접적으로 또는 간접적으로 유래될 수 있다.
또한 본원에는, 예를 들어 본 발명의 제31 측면에 따라 대상체 및/또는 생체외 생물학적 물질의 하나 이상의 생물학적 조건 및/또는 생물학적 특성을 평가하는 방법을 수행하는 데 있어서, 사용에 적합한 형태로 상기 키트 내에 제시될 때(또는, 예를 들어 저장된 형태의 재구성 또는 다른 단순한 조작에 의해 사용에 적합한 형태로 전환될 수 있음) 본 섹션에서 상기 논의된 하나 이상의 구성요소를 포함하는 진단 키트와 같은 키트가 제공된다.
M. 생체외 물질의 치료
상기 언급된 바와 같이, 대상체에 대한 HCMV 전염의 일부 경로는 감염된 사람, 또는 임의의 다른 감염원으로부터의 생체외 생물학적 물질과의 접촉을 통해 이루어질 수 있다. 예는 상기 대상체로 생체외 생물학적 물질(예컨대 기관, 조직, 골수 또는 줄기 세포 이식)의 착상 또는 이식, 또는 수혈을 포함한다.
따라서, 본 발명의 제32 측면은 살아있는 생체외 생물학적 물질에서 HCMV 감염(예컨대 잠복성 HCMV 감염 및/또는 용해성 HCMV 감염 및/또는 다중 균주 HCMV 감염)을 퇴치하는 방법을 제공하며, 방법은 살아있는 생체외 생물학적 물질을 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 제제와 접촉시키는 단계를 포함한다:
i. 본 발명의 제1 측면에 따른 결합 분자,
ii. 본 발명의 제1 측면에 의해 정의된 바와 같은 상기 결합 분자의 기능적 단편,
iii. 본 발명의 제7 측면에 따른 단리된 결합 분자,
iv. 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합,
v. 본 발명의 제3 측면에 따른 벡터,
vi. 본 발명의 제5 측면에 따른 세포,
vii. 본 발명의 제8 측면에 따른 접합체, 및
viii. 본 발명의 제10 측면에 따른 단리된 접합체.
본 발명의 제32 측면은 또한 이 측면의 방법에 의해 수득되거나, 수득가능한 살아있는 생체외 생물학적 물질을 제공한다.
본 발명의 제32 측면의 방법, 및/또는 이에 의해 수득되거나, 수득가능한 살아있는 생체외 생물학적 물질의 하나의 구현예에서, 생체외 살아있는 생물학적 물질은 하나 이상의 유형의 생체외 세포; 하나 이상의 유형의 생체외 세포 배양물; 하나 이상의 유형의 생체외 조직; 하나 이상의 유형의 생체외 조직 배양물; 하나 이상의 유형의 생체외 오가노이드; 하나 이상의 유형의 생체외 오가노이드 배양물; 하나 이상의 유형의 생체외 기관; 및/또는 하나 이상의 유형의 생체외 기관 배양물을 포함하는 군으로부터 선택된 살아있는 생체외 생물학적 물질을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 예시적인 구현예는 기관 이식, 조직 이식, 골수 이식, 줄기 세포 이식, 및 또는 수혈을 포함한다.
본 발명의 제33 측면은 대상체에게 본 발명의 제32 측면에 의해 정의된 바와 같은 생체외 살아있는 생물학적 물질을 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체(즉, 예를 들어, 상기 생체외 살아있는 생물학적 물질의 착상 또는 이식을 필요로 하는 대상체)를 치료하는 방법을 제공한다.
예를 들어, 방법은 생체외 살아있는 생물학적 물질의 이식, 예컨대 기관 또는 조직 이식 방법일 수 있다. 상기 방법은 이식물의 수용자에서 HCMV 감염, 또는 HCMV 감염과 연관된 질환 또는 병태의 전염을 예방하거나, 위험을 감소시키는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 제33 측면에 따라 치료될 대상체는 예를 들어, 본 출원의 섹션 G에 기재된 바와 같은 임의의 대상체일 수 있다.
본 발명의 제33 측면에 따른 HCMV와 연관된 질환 또는 병태는 예를 들어, 본 출원의 섹션 G에 기재된 바와 같은 임의의 형태의 HCMV 감염 또는 HCMV 감염과 연관된 질환 또는 병태일 수 있다.
N. 결합 분자에 대한 스크리닝 방법
본 출원의 실시예에 기재된 바와 같이, 출원인은 HCMV US28의 ECD3 영역 내의 에피토프에 대한 결합 분자를 생성하는 것에 초점을 맞춤으로써, HCMV US28 단백질에 대한 매우 특이적인 균주 불가지론적 결합 분자의 식별을 위한 신규 접근법을 개발하였다. 본 출원의 실시예에 보고된 바와 같이, 이러한 접근법에 의해 생성된 모노클로날 항체는 US28 ECD3 펩티드의 두 유전적 변이체에 특이적으로 잘 결합하는 것으로 나타났으며, 이에 의해 특이성 및 균주 불가지론적 결합 특성을 둘 다 입증하고, US28 과발현 US28-CHO-A1 세포, HCMV Ad169 감염된 MRC-5 세포, HCMV 혈청 양성 개체로부터의 1차 PBMC, HCMV 감염된 인간 폐 조직 및 여러 유형의 공격성 인간 종양, 예컨대 식도암, 위암, 직장암, 간암, 폐암, 췌장암, 자궁경부암, 악성 크롬친화세포종 및 국소 진행성 결장암, 유방암 및 그의 전이 및 교모세포종 등급 4에 대한 특이적 결합을 추가로 입증하였다.
출원인의 접근법은 US28의 ECD3에서 아미노산 변이의 식별된 단일 부위를 사용하여, 면역 반응을 일으키기 위해 선택된 펩티드의 조합을 활용하고, US28의 ECD3에 대한 균주 불가지론적 결합 특이성을 갖는 항체를 생성 및 단리하였다. 이 접근법은 본 발명의 유리한 결합 특성을 갖는 이러한 결합 분자를 추가로 생성하고 식별하는 데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 제34 측면은 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 US28 단백질의 세포외 도메인 3(ECD3) 내의 에피토프에 대한 결합 특이성 및/또는 결합 친화성을 갖는 결합 분자를 스크리닝하는 방법을 제공하며, 방법은
(a) US28 단백질의 ECD3에 존재하는 아미노산 서열에 상응하는 하나 이상의 펩티드를 제공하는 단계,
(b) 하나 이상의 후보 결합 분자를 제공하는 단계;
(c) 하나 이상의 펩티드에 대한 하나 이상의 후보 결합 분자의 결합 특이성 및/또는 결합 친화성을 결정하는 단계
를 포함한다.
임의적으로 단계 (a)에 제공된 상기 또는 각각의 하나 이상의 펩티드는 본 발명의 제13 및/또는 제14 측면 중 어느 하나 또는 둘 다에 따른 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드, 본 발명의 제15 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합, 본 발명의 제16 측면에 따른 융합 단백질, 본 발명의 제17 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 융합 단백질의 조합, 본 발명의 제18 측면에 따른 접합체, 본 발명의 제19 측면에 따른 적어도 2개의 별개의 접합체의 조합의 형태로 제공된다.
임의적으로, 상기 또는 각각의 하나 이상의 펩티드는 폴리펩티드 서열 TKKDNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 7) 및/또는 TKKNNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 6), 및/또는 어느 하나 또는 둘 다의 면역원성 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
임의적으로, 하나 이상의 후보 결합 분자는 항체 및/또는 CAR, 예컨대 다음 중 임의의 하나 이상일 수 있다:
(a) 2가 항체, 예컨대 IgG-scFv 항체(예를 들어, 여기서 제1 결합 도메인은 온전한 IgG이고 제2 결합 도메인은 IgG의 경쇄의 N-말단 및/또는 경쇄의 C-말단 및/또는 중쇄의 N-말단 및/또는 중쇄의 C-말단에서 제1 결합 도메인에 부착된 scFV이거나, 반대의 경우도 마찬가지임);
(b) 1가 항체, 예컨대 DuoBody ® 또는 '놉-인-홀' 이중특이적 항체(예를 들어, scFv-KIH, scFv-KIHr, BiTE-KIH 또는 BiTE-KIHr;
(c) scFv2-Fc 항체;
(d) 이중특이적 항체, 예컨대 이중특이적 T-세포 관여(BiTE) 항체;
(e) 이중 가변 도메인(DVD)-Ig 항체;
(f) 이중-친화성 재표적화(DART)-기반 항체(예를 들어, DART2-Fc 또는 DART);
(g) 삼중특이적 항체, 예컨대 DNL-Fab3 항체;
(h) scFv-HSA-scFv 항체; 및
(i) 키메라 항원 수용체(CAR).
본 발명의 제34 측면의 방법은 하나 이상의 펩티드에 대한 결합 특이성 및/또는 결합 친화성에 기반하여 후보 결합 분자를 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 선택된 후보 결합 분자는:
(a) HCMV의 US28 단백질의 세포외 도메인 3(ECD3) 내에 완전히 존재하는 에피토프에 대한 결합 특이성을 가질 수 있고/있거나;
(b) US28 단백질의 ECD3 내의 선형 에피토프에 대한 결합 특이성을 가질 수 있고/있거나;
(c) HCMV 균주 불가지론적인 HCMV의 US28 단백질의 ECD3 내의 에피토프에 대한 결합 특이성, 예를 들어, DB, Towne, AD169, BL, DAVIS, JP, Merlin, PH, TB40/E, Toledo, VHL/E, TR 및 VR1814(FIX)로 이루어진 군으로부터 선택된 HCMV 균주 중 2개 이상(예컨대 모두)에 대해 불가지론적인 HCMV의 US28 단백질의 ECD3 내의 에피토프에 대한 결합 특이성을 가질 수 있고/있거나;
(d) US28 단백질의 ECD3이 TKKDNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 7) 또는 TKKNNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 6)의 서열을 포함하는지 여부에 관계없이, HCMV의 US28 단백질의 ECD3 내의 에피토프에 대한 특이성을 가질 수 있다.
선택된 후보 결합 분자는 서열번호: 12, 104, 122, 68 또는 88의 서열로 이루어진 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드 및 서열번호: 18, 108, 126, 72 또는 92의 서열로 이루어진 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드를 포함하는 항체에 의해 입증된 바와 같은 동일한 하나 이상의 펩티드에 대한 결합 특이성 및/또는 결합 친화성과 동등한 하나 이상의 펩티드에 대한 결합 특이성 및/또는 결합 친화성을 가질 수 있다. 상기 항체는 예를 들어, 본원에 추가로 기재된 바와 같은 1D3, 1C10, 1A10, 1G9 또는 1E8 항체일 수 있다.
상기 선택된 후보 결합 분자 중 하나 이상의 기능적 변이체는 당업계에 잘 알려진 다양한 과정 중 임의의 것에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 선택된 후보 결합 분자(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하는 선택된 후보 결합 분자)의 결합 특성은 성숙 과정에 의해 개발될 수 있다. 예를 들어, 결합 친화성은 성숙 단계에 의해 변형(증가 또는 감소)될 수 있고/있거나; 결합 특이성은 성숙 단계에 의해 변형(일반적으로 증가)될 수 있다. US28에 대한 높거나 증가된 수준의 결합 친화성은 특히 이것이 건강한 인간 세포와 같은 표적외에 대한 허용할 수 없는 높은 수준의 결합 친화성을 희생시키면서 발생하는 경우 항상 바람직하지 않을 수 있음이 이해되어야 한다. 예를 들어, CAR 및 CAR-발현 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는 결합 분자는 낮은 수준의 결합 친화성으로부터 이익을 얻을 수 있지만, 일반적으로 항상 최적 수준의 결합 특이성으로부터 이익을 얻을 것이다. 성숙 과정의 예는 본 출원의 섹션 A에서 상기 논의된다.
본 발명의 제35 측면은 결합 분자의 다중 카피를 포함하는 조성물을 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 제34 측면의 방법에 따라 선택된 선택된 후보 결합 분자의 재생산을 야기하는 단계를 포함한다.
상기 방법은 예를 들어, 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합을 제공하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합은 집합적으로, 개별적으로 또는 조합하여, 선택된 후보 결합 분자를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. 상기 방법은 예를 들어 상기 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합으로 형질전환된 재조합 세포 또는 세포 집단에서 상기 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합을 발현하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 발현은 선택된 후보 분자의 추가의 카피를 생산하는 데 사용될 수 있다.
임의적으로 상기 선택된 후보 분자는 예를 들어 약제학적으로 허용되는 조성물의 형태로 후속적으로 단리 및/또는 정제 및/또는 제형화된다.
임의적으로, 상기 선택된 후보 분자는 예를 들어 본 출원의 섹션 A에서 논의된 바와 같은 접합체의 논의에 따라 접합된다.
본 발명의 제36 측면은 본 발명의 제34 측면의 방법에 따라 선택되고/되거나 본 발명의 제35 측면의 방법에 따라 생산된 선택된 후보 결합 분자를 평가하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 결합 특성(특히, 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 US28 단백질의 세포외 도메인 3(ECD3) 내의 에피토프에 대한 결합 특이성 및/또는 결합 친화성)을 제공하는 선택된 후보 결합 분자 내의 구조(들)를 포함하고 식별한다.
예를 들어, 결합 특성을 제공하는 선택된 후보 결합 분자 내의 구조(들)를 식별하는 단계는 항체 또는 CAR인 선택된 후보 결합 분자에서 상기 또는 각각의 가변 경쇄 및/또는 가변 중쇄 영역을 식별 및/또는 서열분석하는 것을 포함할 수 있다.
추가로, 또는 대안적으로, 결합 특성을 제공하는 선택된 후보 결합 분자 내의 구조(들)를 식별하는 단계는 항체 또는 CAR인 선택된 후보 결합 분자에서 상기 또는 각각의 CDR 영역을 식별 및/또는 서열분석하는 것을 포함할 수 있다.
가변 경쇄 및/또는 가변 중쇄 영역을 식별하고, CDR 서열을 식별하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 일상적인 기술을 사용하여 당업자에 의해 이용될 수 있다.
예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열(VH 및 VL)은 당업계에 일반적으로 알려진 기술에 의해 각각의 mRNA로부터 합성된 중쇄 및 경쇄 cDNA로부터 결정될 수 있다. 그런 다음 CDR 영역은 당업계에 알려진 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, CDR 영역은 Kabat 방법(Wu and Kabat, J.(1970) J. Exp. Med. 132, 211)을 사용하여 결정될 수 있다. CDR은 X-선 결정학 또는 분자 모델링 기술을 사용하는 구조적 분석에 의해 결정될 수 있다. 복합 CDR은 하나의 CDR의 모든 잔기 및 상응하는 초가변 영역의 모든 잔기를 함유하는 것으로 정의될 수 있다. 프레임워크 영역으로부터의 특정 선택 잔기와 함께 이러한 복합 CDR은 바람직하게는 전달가능한 "항원 결합 부위"로 식별된다. CDR 서열을 식별하는 다른 잘 알려진 방법은 Chothia 넘버링 체계(예를 들어, Al-Lazikani 등, JMB, 1997, 273: 927-948에 기재된 바와 같음) 또는 Martin(향상된 Chothia) 넘버링 체계를 포함한다.
본 발명의 결합 분자 및 폴리펩티드의 CDR은 Kabat 방법을 사용하여 결정되었다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 결합 분자의 CDR 중 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개는 Kabat 방법을 사용하여 결정되었다. 또한, CDR 서열이 특성화되지 않은 경우, 일상적인 방법(예컨대 컴퓨터 알고리즘 또는 돌연변이/결합 검정)을 사용하여, 일단 전장 가변 경쇄 및/또는 중쇄가 제공되면, CDR 중 하나 이상을 결정하는 것은 당업자에게 일상적인 문제이다.
본 발명의 제37 측면은 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 US28 단백질의 세포외 도메인 3(ECD3) 내의 에피토프에 대한 결합 특이성 및/또는 결합 친화성을 갖는 결합 분자의 다중 카피를 포함하는 조성물을 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 결합 분자는 본 발명의 제36 측면의 방법에 따라 결합 특성을 제공할 때 선택된 후보 결합 분자 내에서 식별된 상기 또는 각각의 구조(들)(예를 들어 CDR 서열, 또는)를 포함하며, 상기 방법은 결합 분자의 재생산을 야기하는 것을 포함한다.
본 발명의 제37 측면은 동일한 측면에 의해 수득되는 결합 분자의 조성물, 예를 들어 약제학적으로 허용되는 조성물을 추가로 제공한다. 그런 다음 상기 결합 분자 또는 이의 조성물은 본 발명의 제1 측면에 대한 결합 분자의 맥락에서 본원에 개시된 임의의 방식으로 사용될 수 있다.
본원에서 논의되고 청구된 모든 방법은 본 개시내용에 비추어 과도한 실험 없이 이루어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 구현예의 관점에서 기재되었지만, 본 발명의 개념, 취지 및 범위를 벗어나지 않고 본원에 기재된 방법 및 단계 또는 방법의 단계의 순서에 변경이 적용될 수 있음이 당업장에게 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 동일하거나 유사한 결과를 달성하면서 화학적으로 및 생리학적으로 모두 관련된 특정 제제가 본원에 기재된 제제를 대체할 수 있다는 것이 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 이러한 유사한 대체 및 변형은 모두 청구된 청구범위에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 취지, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
본 발명은 이제 하기 비제한적인 실시예의 도움으로 기재될 것이다.
실시예
실시예 1
방법:
인체 재료 및 윤리 표준:
모든 조직 재료는 지역 윤리 위원회의 프로토콜 승인 및 정보제공자 동의에 대한 정보를 받고 서명한 공여자를 포함한 최고의 윤리 표준 하에 수집한다. 생검은 표준 의료 관리 동안 수집하였고 결과는 개별 공여자까지 추적할 수 없다. 모든 인간 조직은 HIPPA 승인 프로토콜 하에 수집한다. 모든 인간 샘플은 HIV 및 B형 간염에 대해 음성으로 테스트되었고 상용 제품 개발을 위해 승인받았다.
동물:
BABL/c 마우스를 미국 11967 뉴욕주 셜리 소재의 Creative Biolabs Inc의 지침 하에 동물 시설에서 유지하였다. 모든 동물 실험은 미국 농무부(USDA)의 동물 관리 및 과학적 사용에 대한 지침에 따라 수행하였다.
면역화:
HCMV US28 ECD3의 경우, 2개의 펩티드를 화학적 합성을 통해 준비하였다: 펩티드-1: TKKNNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 6); 펩티드-2: TKKDNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 7). 면역원성을 향상시키기 위해, 키홀 림펫 헤모시아닌(KHL)을 모 펩티드의 N 말단에 연결하였다. KLH-접합된 펩티드를 각각 KLH-펩티드-1 및 KLH-펩티드-2로 명명하고, 면역화에 사용하였다. 질량 분광법(MS) 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석은 2개의 KLH-연결된 펩티드가 면역화에 매우 적합하였음을 입증하였다. 또한, 비오티닐화된 펩티드를 준비하여 나중에 항체 스크리닝에 사용하였다. 간단히 말해서, 비오틴을 모 펩티드의 N 말단에 첨가하여, 각각 Bio-펩티드-1 및 Bio-펩티드-2로 이름을 변경하였다.
5 마리 마우스(#10-15)를 펩티드 1 및 2로 면역화하였다. 면역화는 14일마다 반복하였다. 각 마우스는 초기 면역화로서 완전 프로인트 애쥬번트와 조합하여 KLH-펩티드-1 30 μg 및 KLH-펩티드-2 30 μg의 공동 면역화를 받았다. 2차 부스터부터, 각 마우스는 불완전 프로인트 애쥬번트와 조합하여 KLH-펩티드-1 30 μg 및 KLH-펩티드-2 30 μg의 공동 면역화를 받았다. 3차 부스터 용량 후, 항혈청을 수집하고, 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 면역 반응을 검사하여 각각 펩티드-1 및 펩티드-2에 대해 양성 신호를 보였다. 4차 부스터 용량 후, 항혈청을 수집하고, 항혈청은 각각 펩티드-1 및 펩티드-2에 대해 증가된 양성 신호를 보였다. 역가는 마우스 11#, 13#, 14# 및 15#에서 40,000 초과, 마우스 12#에서 10,000 초과에 도달하였다.
대조적으로, KHL-연결된 HCMV US28 ECD2 및 ECD4 펩티드인 QYLLDHNSLAS 및 DTLKLLKWISSSCE로 4 마리 마우스(16#, 17#, 18# 및 19#)의 면역화는 상기 기재된 바와 같은 유사한 부스팅 프로토콜을 갖는 임의의 항체 역가의 경우 낮았다. MS 및 HPLC 분석은 면역화를 위한 이들 펩티드의 낮은 면역원성을 추가로 확인하였다. 이러한 데이터는 세포외 도메인의 서열 내에서도 HCMV US28 단백질의 적합한 면역원성 부분을 식별하는 것이 어려울 수 있다는 것을 입증한다. ECD2-유래된 펩티드 및 ECD4-유래된 펩티드의 실패와 비교하여 ECD3-유래된 펩티드의 성공은 선험적으로 예측가능하지 않았다.
하이브리도마 배양:
항혈청 ELISA 결과를 고려하여, 세포 융합을 위해 마우스 13# 및 14#을 선택하였다. 마우스 13# 및 14#의 비장을 각각 KLH-펩티드-1 100 μg 및 KLH-펩티드-2 100 μg의 i.v. 주사로 5차 부스터 후 5일째에 수집하였다. 비장 세포를 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 1500(Sigma-Aldrich, Merck KGaA, 독일 64293 다른슈타트)을 사용하여 골수종 세포와 융합하였다. 그런 다음 융합된 세포를 96 웰 플레이트로 시딩하고 수소 원자 전달(HAT) 시약(카탈로그 번호 21060017, Thermofisher, 미국 02451 매사추세츠주 월섬)이 있는 반고체 배지에서 배양하였다. Bio-펩티드-1 및 2에 대해 QC-ELISA 검증을 수행하였다. 960개의 단일 클론을 펩티드-1에 대한 1차 스크리닝(Bio-펩티드-1 코팅)에서 테스트하고, 26개의 양성 클론을 식별하였다. 32개의 클론(상기 26개의 양성 클론 포함)을 2차 스크리닝에서 추가로 연구하여 펩티드-1 및 -2를 둘 다 특이적으로 인식하는 클론을 식별하였다. 2차 스크리닝에서 18개의 양성 클론을 식별하였다.
제한 희석 방법에 의해 10개의 클론에 대해 서브클로닝을 수행하였다. 세포 융합 스크리닝 단계에서 ELISA 역가에 기반하여 마우스 13# 및 14#로부터 각각 5개의 클론을 선택하였다: 마우스 13#: 1C10, 3H9, 4C10, 4F1, 및 5G6; 마우스 14#: 1F12, 2C2, 3D11, 4F11, 및 5H11. Bio-펩티드-1에 대해 QC-ELISA 검증을 수행하였다. 8개의 양성 클론이 펩티드 1에 결합하는 것으로 식별되었으며, 이 중 6개의 클론은 모노클로날이었다. 보다 특이적인 클론을 식별하기 위해, 마우스 14#로부터의 나머지 8개의 클론에 대해 서브클로닝을 수행하였다: 1D2, 1B9, 1H3, 2E3, 2G8, 2G12, 3A1 및 4E4. Bio-펩티드-1에 대해 QC-ELISA 검증을 수행하였다. 7개의 양성 클론이 펩티드 1에 결합하는 것으로 식별되었으며, 이 중 4개의 클론은 모노클로날이었다. 이들 10개의 모노클로날 클론 중, 추가 검증은 추가 연구를 위해 선택된 US28-13-5G6-1D3 클론에 대한 우수한 결합 특성을 보였다. 그러나, 또한 클론 13-1C10-1C10, 13-1C10-1G9, 14-IH3-IA10, 14-2C2-1G4 및 14-4E4-1E8을 추가로 연구하였다.
US28-13-5G6-1D3 클론의 서열분석:
Creative Biolabs(미국 11967 뉴욕주 셜리)의 하이브리도마 서열분석 서비스를 사용하여 US28-13-5G6-1D3, 13-1C10-1C10, 13-1C10-1G9, 14-IH3-IA10 및 14-4E4-1E8 항체의 서열 정보를 수득하였다. 하이브리도마 서열분석은 특이적 항체의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 암호화하는 cDNA에 관한 서열 정보를 수득하는 과정을 지칭한다. 서열분석 전에, 선택된 하이브리도마 세포의 총 mRNA를 RNA 단리기(Cat. R401-01, Vazyme Biotech, Cellagen Technology LLC, 미국 92121 캘리포니아주 샌디에이고)로 추출하였다. Georgious 등[1]에 의해 기재된 바와 같은 5'RACE 방법을 완전 특이적 항체 가변 영역(VH 및 VL) 뿐만 아니라 비-가변 측면 불변 영역 서열을 증폭, 클로닝 및 서열분석하는 데 적용하였으며, 후속적으로 하류 서열 조작 및 발현 벡터 구성을 위해 2개의 클로닝 벡터로 클로닝하였다. 그런 다음 벡터 작제물을 Sanger 서열분석 방법을 사용하여 서열분석하고 HEK293-F 세포에서 재조합 항체(rAb)를 발현하는 데 사용하였다. 항체를 단백질 G 크로마토그래피로 정제하고 결과를 아가로스 겔에서 SDS-PAGE로 확인하였다.
다른 항체:
항-HIS HRP 항체는 08854 뉴욕주 피스카타웨이 소재의 GenScrip(카탈로그 번호 A00612)에서 주문하였다. 항-HIS FITC 항체는 미국 02451 매사추세츠주 월섬 소재의 Thermofisher(Cat. MA1-81891)에서 주문하였다. 토끼로 제조된 상업적 폴리클로날 항-US28 항체 제제는 92195 캘리포니아주 샌디에이고 소재의 Mybiosource(카탈로그 번호 MBS9606669)에서 주문하였다. CMV 즉시 초기 항원 Alexa488 Ab는 노르웨이 오슬로 소재의 Merck Life Sciences(카탈로그 번호 MAB810X) 및 미국 01803 매사추세츠주 버링턴 소재의 MilliporeSigma(카탈로그 번호 MAB810R)에서 주문하였다. 사용되는 2차 및 IgG 이소형 대조군 항체는 노르웨이 오슬로 소재의 Thermofisher에서 주문하였다; 염소 항-마우스 lgG-Alexa 488(카탈로그 번호 A11001); 염소 항-토끼 lgG Alexa 488(카탈로그 번호 A11008); 염소 항-마우스 lgG에 대한 이소형 대조군(카탈로그 번호 14-4714-82); 및 염소 항-토끼 lgG(카탈로그 번호 MA516384). 1가 및 2가 VUN100 ScFv는 Creative Biolabs에서 재조합 기술을 사용하여 HEK293-F 세포로부터 제조하였다.
실험실 세포:
재조합 항체 합성 외에도, 중국 햄스터 난소(CHO-K1) 세포(Creative Biolabs, 미국 11967 뉴욕주 셜리)를 사용하여 US28 단백질을 과발현하여 US28 항체의 표면 결합을 연구하였다. 인간 배아 신장 293-F(HEK293-F) 세포주를　 US28-13-5G6-1D3 재조합 항체(rAb)(Creative Biolabs, 미국 11967 뉴욕주 셜리)의 발현에 사용하였다. 인간 배아 폐 섬유모세포(cat#CCL-171, RRID: CVCL_0440, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC), 미국 20110 버지니아주 머내서스)로부터 유래된 의학 연구 협의회 세포주-5(MRC-5)를 사용하여 HCMV 감염된 세포 표면에 대한 항체 결합을 연구하였다. 상업적으로 입수가능한 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 3명의 건강한 혈청 양성 공여자(공여자 # 509, # 526, # 230, Cellero, 미국 98021 워싱턴주 보셀)로부터 수득하였다.
1차 세포:
상이한 조직 기원의 1차 세포를 3mL 젤라틴-기반 코팅 용액(Cellbiologeics, 6950)으로 코팅된 T25 플라스크에서 배양하고 37℃에서 1시간 동안 두었다. 세포 시딩 전에 과량의 용액을 흡인하였다. 15 mL 원심분리 튜브는 6 mL 예열된 완전 배지로 준비하였다. 액체 질소에 저장된 1차 세포를 37℃ 수조에서 1분 미만 동안 빠르게 해동시키고, 15 mL 원심분리 튜브로 옮겼다. 세포를 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후, 상청액을 흡인하고 세포 펠릿을 6 mL 완전 배지에 재현탁하였다. 재현탁된 세포를 미리 코팅된 T25 플라스크에 첨가하고, 37℃에서 5% CO2를 함유하는 가습 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 비부착된 세포를 제거하고 영양분을 보충하기 위해 다음 날에 배양 배지를 교체하고, 매일 반복하였다. 세포가 85% 초과 합류에 도달하였을 때, 플라스크에서 세포 배양 배지를 제거하고 따라버렸다. 부착 층을 멸균 PBS(1X)로 2회 세척하였다. 세포를 따뜻한(37℃) 0.25% Trypsin-EDTA 용액 2 mL와 함께 3분 동안 인큐베이션하였다. 세포가 분리되자마자, 완전 배지 8 mL를 첨가하여 트립신을 중화시킨 후, 37℃의 가습, 5% CO2 인큐베이터에서 젤라틴-기반 코팅 용액으로 미리 코팅된 새 플라스크에 플레이팅하였다. 비-부착 세포를 제거하기 위해 다음 날 배양 배지를 교체하고, 적절한 세포 형태를 확인하기 위해 세포를 현미경으로 매일 확인하였다. FACS 분석을 본원에 기재된 바와 같이 수행하였다.
US28 발현 작제물:
US28-과발현 세포주를 생성하기 위해 플라스미드 구성을 수행하였다. C 말단 부분에서 6His 태그에 융합된 HCMV DB 균주(수탁 번호: KT959235; 본 출원의 서열번호. 5)을 pCDH-EF1a-MCS 벡터(Creative Biolabs, 미국 11967 뉴욕주 셜리)로 삽입하였다. 플라스미드 작제물을 CHO-K1 세포주로 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후에 세포를 수집하였다. 세포주는 CHO-US28-A1-6His로 명명하였고 그의 단백질 서열(서열번호: 47)은 다음과 같다:
TB40/E 및 돌연변이된 US28 균주에 대한 DNA를 보유하는 플라스미드(각각 서열번호: 254 및 255)를 또한 유사한 방식으로 제조하였다.
서열번호: 177:
서열번호: 178:
HCMV로 MRC-5 세포의 감염:
MRC-5 인간 배아 폐 섬유모세포, 계대 21 내지 30을 트립신 처리하고 T75 플라스크 당 1 x 106개 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS), 2 mM L-글루타민, 0.1 mM 비필수 아미노산, 10 mM HEPES, 및 페니실린 및 스트렙토마이신 각각 100 U/ml가 보충된 듈베코의 변형된 이글 배지(DMEM)에 플레이팅하였다. 세포를 비감염된 상태로 두거나(Mock) 5의 감염 다중도(m.o.i.)로 HCMV 균주 Ad169(ATCC® VR538™, ATCC, 미국 20110 버지니아주)로 감염시켰다. 각각의 세포에 바이러스를 첨가한 후, 감염 후(p.i.) 4일째(96시간 pi)에 세포를 수확할 때까지 세포를 5% CO2로 37℃에서 인큐베이션하였다. 감염을 현미경으로 확인하였다.
효소 결합 면역흡착 검정(ELISA):
마이크로타이터 플레이트 웰을 pH 9.6의 1 L 증류수 중 Na2CO3, 1.5 g 및 NaHCO3, 2.93 g으로 이루어진 코팅 완충액에서 1-10 μg/ml 사이의 농도로 Bio-펩티드-1 및 Bio-펩티드-2를 함유하는 용액 100 μl로 코팅한 다음, 실온에서 1-2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 0.05% v/v Tween-20을 함유하는 PBS로 이루어진 세척 완충액으로 3회 세척한 후 종이 타월로 닦아냈다. 1% w/v BSA를 함유하는 포스페이트 완충 염수(PBS)를 함유하는 차단 용액 150 μl을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 웰을 세척 완충액으로 4회 세척하고 마지막 세척 후 종이 타월로 닦아냈다. 항체 희석액 100 μl를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 효소 접합 2차 항체(세척 완충액에 적절하게 희석됨) 100 μl를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 웰을 다시 세척 완충액으로 3회 세척하고 마지막 세척 후 종이 타월로 닦아냈다. 적절한 기질 용액 100 μl를 각 웰에 첨가하고 30분 동안, 또는 원하는 색상 변화를 얻을 때까지 실온에서 인큐베이션하였다. 흡광도 값을 적절한 파장에서 즉시 판독하고 데이터를 미국 95134 캘리포니아주 산호세 소재의 CMax Plus, Molecular Devices에 의해 분석하였다.
웨스턴 블롯:
웨스턴 블롯을 사용하여 CHO-US28-A1-6His 세포에서 US28 단백질의 발현을 확인하였다. 수집된 세포 및 US28 음성 대조군 CHO 세포를 PBS로 2회 세척하고 1% PMSF를 함유하는 빙냉 RIPA 용해 완충액을 첨가하였다. 부착 세포를 플라스틱 세포 스크래퍼를 사용하여 접시에서 부드럽게 긁어내고 세포 현탁액을 미리 냉각된 마이크로원심분리 튜브로 옮기고, 이를 4℃에서 30분 동안 교반하였다. 그런 다음 튜브를 원심분리하고, 상청액을 새 튜브로 흡인하였다. BCA 방법에 의해 튜브의 단백질 농도를 결정하였다. 4% SDS, 10% 2-메르캅토에탄올, 20% 글리세롤, 0.004% 브로모페놀 블루 및 0.125 M Tris HCl을 함유하는 2X Laemmli 완충액을 동일한 부피로 첨가하였다. 샘플 완충액 중 용해물을 끓여 샘플을 환원 및 변성시켰다. 폴리아크릴아미드 겔(12%)을 준비하고 각 샘플의 단백질 30-120 μg을 SDS-PAGE 웰에 로딩하였다. 단백질 마커를 첫번째 레인에 로딩하였다. 전기영동을 pH 8.3으로 조정된 25 mM Tris 염기, 250 mM 글리신, 0.1% SDS로 이루어진 1x 실행 완충액을 사용하여 80V 전압에서 30분 및 100 전압에서 1.5시간 실행하였다. 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 막을 메탄올에서 30초 동안 적신 다음 잠시 증류수 이어서 pH 8.3으로 조정된 25 mM Tris 염기, 192 mM 글리신, 20% 메탄올을 함유하는 1X 전달 완충액에 담가 준비하였다. 그런 다음 전달 카세트에서 샌드위치 습식 방법에 의해 단백질을 PVDF 막으로 옮겼다. 막을 1X Tris-완충 염수 및 Tween 20(TBST) 용액으로 세척하고 1X TBST 및 10% 무지방 분유를 함유하는 차단 용액에서 인큐베이션하였다. 그런 다음 1차 항체를 5% 무지방 분유를 함유하는 1X TBST에서 작업 농도로 희석하고 실온에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 막을 1X TBST로 3회 세척하고 2차 항체를 상기 기재된 바와 동일한 인큐베이션 및 세척 절차로 첨가하였다. 미리 혼합된 화학발광 기질 용액(Thermofisher, 미국 02451 매사추세츠주 월섬, Cat. 34075)을 막 위에 첨가한 후, 화학발광 영상화 시스템(BIO-RAD ChemiDocXRS+, Bio-Rad, 미국 94547 캘리포니아주 에르쿨레스)으로 1-90초 동안 영상화하였다.
유세포 분석법(FACS) 분석:
유세포 분석법을 사용하여 US28 항체에 의한 세포 표면 결합을 분석하였다. 세포 수확 시, 부착성 비감염된 세포 및 US28 과발현 또는 HCMV 감염된 세포를 세포 염색 완충액(0.5% BSA 및 0.05% 나트륨 아지드(NaN3)가 첨가된 포스페이트-완충 염수(PBS(Amresco, 미국 44139 오하이오주 클리블랜드))으로 3회 세척하였다. 세포를 트립신 처리한 다음 10% FBS를 함유하는 DMEM에 재현탁하여 트립신 작용을 억제하였다. 그런 다음 세포를 400 x g에서 10분 동안 펠릿화하고 세포 염색 완충액으로 3회 세척하였다. 트리판 블루 생존력 검정 및 세포 계수기(Countess, Invitrogen, 미국 92008 캘리포니아주 칼즈배드)에 의해 세포 생존력 및 세포 농도를 측정하였다. 세포 현탁액을 빙냉 세포 염색 완충액으로 1 x 106개 세포/mL로 조정하였다. 세포를 1 x 106개 세포 당 PBS 중 10% FBS 또는 1% BSA　1 ml에서 차단하고, 잠시 볼텍싱하고, 10-30분 동안 인큐베이션하여 비-특이적 염색을 제거하였다. 그런 다음 세포를 각각의 항체 및 적절한 음성 대조군으로 염색하였다.
사용되는 1차 항체는 I) 13-5G6-1D3 1:50 내지 50 mg/ml; 및 II) 상업적 US28 폴리클로날 항체(50 mg/ml), III) 1가 및 2가 VUN100 ScFv(50 mg/ml)였고 특정 실험의 경우 적절한 이소형 대조군이 포함되었다.
항체를 세포에 첨가하고, 볼텍싱하고 얼음 위에서 15 내지 30분 동안 최대 밤새도록 인큐베이션하고 세포 염색 완충액으로 2회 세척하여 임의의 결합되지 않은 항체를 제거하였다. 또한, 실험 중 하나에서 HCMV 감염된 세포를 확인하기 위해 CMV 즉시 초기 항원(IE) Alexa488 Ab, MAB810X, 1:50을 포함하였다. 이것은 세포내 HCMV 암호화된 단백질에 결합하기 때문에, 세포를 얼음에서 30분 동안 70% 에탄올에 투과시킨 후에 첨가하였다.
적절한 형광-접합된 2차 항체: (I) 염소 항-마우스 IgG-Alexa 488; 및 (II) 염소 항-토끼 IgG-Alexa 488의 세포 염색 완충액 중 1:500-1:5000을 첨가하고 암실에서 15-20분 동안 얼음에서 인큐베이션하였다. 세포를 3회 세척하여 임의의 결합되지 않은 항체를 제거하였다. 그런 다음 세포를 얼음에서 30분 동안 0.5% 파라포름알데히드(PFA)로 고정시키고 Accuri C6 유세포 분석법 시스템(BD Biosciences, 미국 95131 캘리포니아주 산호세)을 사용한 최종 유세포 분석법 분석을 위해 세포 염색 완충액 200-500 μL에 재현탁하였다. FlowJo 소프트웨어 v8.8(Treestar Inc. 미국 97520 오리건주 애슐랜드)을 사용하여 데이터 분석을 수행하였다.
인간 파라핀 포매된 조직 검정:
CMV 양성 폐 조직 및 CMV 음성 자궁근층을 함유하는 사이토메갈로바이러스(CMV) 대조군 슬라이드(제품 번호 #3240A)를 미국 53562-2579 위스콘신주 미들턴 소재의 Newcomer Supply Inc.에서 수득하였다. 조직 마이크로어레이(TMA)를 미국 20855 메릴랜드주 더우드 소재의 US Biomax Inc.에서 수득하였고, 종양 조직 # BR1008b, # BS17016c, # BCN721b 및 정상 조직 # FDA662a 및 심장 조직 # HEN241a가 포함되었다.
면역조직화학(IHC) 분석:
파라핀 절편을 a. 100% 크실렌 3회(각각 5분); b. 100% 에탄올 2회(각각 2분); c. 95% 에탄올 2회(각각 2분)에 순차적으로 담궜다. 슬라이드를 5분 동안 물로 2회 헹구어 에탄올을 제거하였다. 항원 회수를 위해, 슬라이드를 5분 동안 3% H2O2에 담근 후 증류수로 2회(2x) 세척하였다. 그런 다음 슬라이드를 작업 시트레이트 완충액(pH 6.0)에 담그고 뚜껑을 덮었다. 완충액을 끓을 때까지 마이크로파에서 가열한 다음, 찜기에서 15분 동안 유지하였다.
절편을 실온에서 30분 동안 냉각시키고 PBS로 세척하였다. 그런 다음 5% BSA 차단 용액을 HIER 처리된 샘플에 첨가하고 이들을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 1차 항체를 희석 구배 테스트의 최상의 결과에 따라 희석하고 4℃에서 밤새 또는 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하기 위해 샘플에 첨가하였다. 그런 다음 슬라이드를 셰이커에서 PBS로 3회 세척하였다.　2차 항체를 1:200 희석으로 사용하고, 샘플에 첨가하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 슬라이드를 셰이커에서 PBS로 3회(각각 5분) 세척하였다. Strept-아비딘 비오틴 복합체(SABC) HRP- 또는 AP-접합된 시약을 첨가하고, 샘플을 암실에서 실온으로 인큐베이션하였다. 이후에 샘플을 증류수로 세척하고, 헤마톡실린으로 대조 염색한 다음, 70%에서 100%까지 에탄올 구배를 통해 탈수하고, 크실렌으로 3회, 각각 5분씩 정화하였다. 슬라이드를 ACRYMOUNT(StatLab, 미국 75069 텍사스주 매키니)에 의해 장착하고 커버-슬립하였다. 디지털화된 사진을 Olympus VS120 스캐너로 촬영하고 수석 병리학자에 의해 OlyVia 3.2 소프트웨어(Olympus Corporation, 일본 20101 도쿄)를 사용하여 분석하였다.
제자리 혼성화(ISH)
CMV ISH 프로브(카탈로그 번호: ISHP-031, Creative Bioarray)를 발색성 제자리 혼성화(CISH)에 의해 포르말린 고정된 파라핀 포매된 조직 또는 세포에서 사이토메갈로바이러스(CMV) DNA 검출을 위해 설계한다. CMV 프로브를 CMV IE1 유전자 벡터와 함께 NICK 방법을 사용하여 디곡신(Digoxin)으로 표지하였다.
슬라이드를 85℃에서 15분 동안 구운 후, 슬라이드를 RT에서 5분 동안 새 크실린에 2회 담가 슬라이드를 먼저 전처리하였다. 그런 다음 슬라이드를 100%, 85%, 75% 에탄올로 RT에서 각각 3분씩 탈수하고 PBS에 2분 동안 담갔다.
이후에 슬라이드를 0.2M HCl에 12분 동안 담가 스라이드를 프로테아제로 전처리하였다. 0.5% Triton X-100을 PBS에 첨가하고 슬라이드를 12분 동안 인큐베이션하였다. 슬라이드를 1X PBS로 2분 동안 2회 세척한 다음, 20 μg/ml 프로테이나제 K에 15분 동안 담근 다음 다시 1X PBS로 2분 동안 2회 세척하였다. 이후에 슬라이드를 3% H2O2에 15분 동안 담그고, 1X PBS로 2분 동안 2회 세척하고 공기 건조하였다.
프로브를 함유하는 혼성화 완충액을 제조하기 위해, 프로브 스톡 용액 1 μl를 혼성화 완충액 50 μl에 첨가한 다음, 볼텍싱하고 원심분리하였다. ISH 프로브를 85℃에서 10분 동안 변성시키고 37℃에서 30분 동안 유지하였다. 슬라이드를 90+분 동안 건조시킨 후, 프로브를 함유하는 혼성화 완충액 200 μl를 슬라이드의 조직 절편 위에 분배하였다. 깨끗한 24 x 60 mm 직사각형 유리 커버슬립을 혼성화 용액 위에 조심스럽게 놓아 조직 절편을 완전히 덮고 혼성화 용액을 고르게 분포시켰다. 슬라이드를 가습 챔버에 넣고, 조직 배양 뚜껑을 덮고, 챔버를 파라필름으로 밀봉하였다. 슬라이드를 암실에서 37℃에서 20-36시간 동안 인큐베이션하였다.
슬라이드를 2 x SSC에 5분 동안 담가 절편으로부터 커버슬립을 제거한 후 제자리 세척을 수행하였다. 슬라이드를 37℃에서 30분 동안 3% BSA 용액과 함께 인큐베이션한 후 37℃에서 30분 동안 항-DIG-HRP 용액(1% BSA에 1:100으로 희석됨)과 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음 슬라이드를 먼저 2 X SSC로 2분 동안 2회 세척한 다음 1 X PBS로 5분 동안 2회 세척하였다. 이후에 슬라이드를 DAB 용액과 2-10분 동안 인큐베이션하고 흐르는 수돗물로 세척하였다. 슬라이드를 헤마톡실린에 담가 3-5분 동안 대조염색하고 다시 흐르는 수돗물로 세척하였다. 슬라이드를 최종적으로 100% 에탄올로 RT에서 1분 동안 탈수하고 공기 건조한 다음 크실렌에 RT에서 10분 동안 담갔다. 절편을 장착하기 위해 수성 장착 용액을 사용하였다.
40x 대물렌즈가 장착된 Nikon 80I 현미경을 사용하여 명시야 영상을 획득하였다.
결과
항체 설계:
HCMV 암호화된 US28 단백질은 4개의 세포외 도메인(ECD)을 가지며, 그 중 2번째 및 3번째 ECD 및 4번째 ECD의 일부는 상이한 HCMV 균주 사이에서 매우 보존된다. 대조적으로, HCMV US28의 N-말단 부분(ECD1)은 빈번한 돌연변이를 함유하고(예를 들어, 다양한 식별된 N-말단 영역 돌연변이는 본 출원의 표 3에 제시된 바와 같음) 따라서 본 발명자들은 ECD1이 일반적으로 US28에 매우 특이적이지만, 또한 균주 불가지론적인 HCMV-암호화 US28 단백질에 대한 항체 개발을 위한 적절한 면역원이 아님을 결정하였다.
KHL-연결된 HCMV US28 ECD2 및 ECD4 펩티드의 5회 부스트를 사용한 마우스의 반복 면역화는 임의의 경우에 예기치 않게 낮은 항체 역가를 초래하였다. 이들 펩티드의 낮은 품질의 면역화는 MS 및 HPLC 분석으로 확인하였다.
면역화를 위한 ECD3-유래 펩티드를 설계하기 위해, 본 발명자들은 상이한 HCMV 균주 사이의 유전적 변이를 고려하였다. BLAST 검색을 사용하였고, 본 발명자들은 US28 ECD3의 4번째 아미노산에서 단일 D에서 N으로 변이의 존재를 식별하였다. 100개의 무작위로 선택된 HCMV 임상 균주 중 90%가 US28 ECD3 4D-변이체를 함유한 반면, 10%는 US28 ECD3 4N 변이체를 가졌다. US28 ECD3 4N 변이체를 보이는 균주 중에는 HCMV DB(수탁 번호: KT959235), TR(수탁 번호: KF021605.1) 임상 균주 및 Toledo(수탁 번호: GU93774) 실험실 균주(표 1)가 있었으며, 모두 US28 서열에 기반하여 HCMV A1 균주 유전자형을 보유한다[2].
두 유전적 변이체를 함유하는 HCMV US28 ECD3 펩티드-1 및 -2(각각 서열번호: 6 및 7)를 면역화된 마우스에서 4N 및 4D 유전자형 둘 다를 인식할 수 있는 균주 불가지론적 항체의 추가의 개발을 위한 면역원으로서 선택하였다. 5 마리의 면역화된 마우스로부터 식별된 총 1000개 초과의 하이브리도마 클론 중, 32개의 양성 클론을 수득하였고, 이 중 18개의 양성 클론이 두 펩티드-1 및 -2를 특이적으로 인식하는 것으로 식별되었다. 이들을 서브클로닝하여 Bio-펩티드 1에 결합하는 것으로 식별된 15개의 양성 클론을 생성하였으며, 이 중 10개의 클론은 모노클로날이었다.
항-US28 클론의 결합 특성:
수득된 10개의 모노클로날 HCMV US28 항체 클론을 테스트하기 위해, C-말단 6His 태그가 있는 HCMV 균주 DB(아미노산 서열 서열번호: 47)로부터 US28을 암호화하는 DNA 서열을 pCDH-EF1a-MCS 벡터로 삽입한 다음 벡터 작제물을 CHO-K1 세포로 형질감염시켜 US28 단백질-과발현 세포주를 생성하였다. 이후에 US28 과발현 세포를 CHO-US28-A1 세포로 명명하였다.
US28-A1 단백질 작제물의 C-말단 부분에 첨가된 6HIS 태그에 결합하는 항-HIS 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 통해 형질전환된 CHO-US28-A1 세포에서 US28 단백질의 성공적인 발현을 확인하였다. 항-HIS 항체는 대조군 CHO-세포에 존재하지 않는 HCMV US28의 이전에 보고된 단백질 크기와 동등한 ∽41 kDa에서 특이적 밴드를 표시하였으며, 따라서 이는 대조군 CHO 세포에서가 아니라 형질감염된 CHO-US28-A1 세포에서 US28 단백질의 발현을 나타낸다(도 1).
수득된 10개의 모노클로날 항체 클론(1:50 w/v Ab 희석으로)의 FACS 분석을 수행하여 CHO-US28-A1 세포 표면 상의 HCMV US28 막관통 단백질에 대한 이들 클론의 표면 결합을 측정하였다. 클론 US28-13-5G6-1D3은 임의의 다른 9개의 클론보다 우수한 최상의 결합 결과(CHO-US28-A1 세포에 대해 ~8-10배 이상 결합)를 보였다(데이터는 제시되지 않음). 임의의 항체가 없고 마우스 2차 항체만 있는 음성 대조군은 음성으로 간주되었다(도 2).
CHO-US28-A1 세포에서 클론 US28-13-5G6-1D3의 양성 표면 결합은 항체 결합에 대한 직접적인 상관관계를 보여주는 구배 희석(1:20, 1:50, 1:200, w/v로 표현됨)에 의해 추가로 확인하였다(도 3). CHO 대조군 세포에 대한 표면 결합은 여러 실험에서 낮은 것으로 확인되었으며(15-배 초과 적은 결합), US28 발현 CHO 세포 표면에 대한 클론 US28-13-5G6-1D3 Ab의 결합은 매우 특이적이었음을 나타낸다(도 4).
원래 ELISA 분석은 펩티드-1(US28 ECD3 유전자형 4N) 및 펩티드-2(US28 ECD3 유전자형 4D) 둘 다에서 US28-13-5G6 항체 클론의 동일한 정성적 결합 친화성을 보여주었다(도 5). 이들 결과는 생성된 US28-13-5G6-1D3 항체 클론이 HCMV US28 단백질 과발현 CHO 세포 표면에 특이적으로 잘 결합할 수 있고, 표적에 대한 US28-13-5G6-1D3 항체의 결합이 HCMV 균주 불가지론적임을 나타낸다.
US28-13-5G6-1D3 rAb의 생성 및 검증
US28-13-5G6-1D3 항체의 재조합 생산을 가능하게 하기 위해, US28-13-5G6-1D3 암호화 하이브리도마 클론을 서열분석하였다. US28-13-5G6-1D3 항체의 아래에 서열은 하기 기재된 서열 식별 번호("서열번호")를 참조하여 식별하였다:
상기 언급된 서열번호에 상응하는 서열은 이들 실시예에 뒤따르는 "서열"이라는 제목의 본 출원의 섹션에 제공된다.
서열분석은 US28-13-5G6-1D3의 하위유형이 IgG1 카파일 가능성이 크다는 것을 입증하였다. US28-13-5G6-1D3 DNA 서열을 2개의 클로닝 벡터에 삽입하고 재조합 생산을 위해 HEK293-F 세포주로 형질감염시켰다. 생성된 재조합 항체 제품 US28-13-5G6-1D3 rAb의 결합을 정성적 ELISA에 의해 Bio-펩티드 1 및 2에 대해 테스트하였으며 두 US28 ECD3 유전적 변이체에 대해 다시 동일하고 강력하고 높은 결합 친화성을 보였고 이는 재조합 항체가 또한 HCMV 균주 불가지론적 특성을 보임을 확인하였다(도 6).
이후에 CHO-US28-A1 세포에 대한 13-5G6-1D3 rAb의 표면 결합을 다른 후보 하이브리도마 클론(13-5C6-1B5, 13-5G6-1D3 배양물, 13-4C10-1D8, 14-1H3-1A6, 14-2C2-1A7, 14-2E3-1A12, 14-4E4-1B3)으로부터의 항체에 대해 검증하고 확인하였다(데이터는 제시되지 않음). 13-5G6-1D3 클론으로부터의 항체를 사용한 이전 테스트 결과와 유사하게, 결과는 CHO-US28-A1 세포에 대한 13-5G6-1D3 rAb의 대부분의 결합을 보여준다.
1:10, 1:50 및 1:100 희석(w/v)으로 CHO-US28-A1 세포, 및 각각의 대조군 CHO 세포에 대한 13-5G6-1D3 rAb의 표면 결합의 추가의 FACS 검증은 13-5G6-1D rAb가 US28 발현 세포의 16,55%의 표면에 결합하고 13-5G6-1D3 rAb에 대해 테스트된 최적의 염색 희석이 1:50(w/v)임을 보여주었다. 대조군 CHO 세포에 대한 13-5G6-1D rAb의 표면 결합을 1:10 희석(w/v)으로 측정하였으며, 이는 임의의 비특이적 결합의 검출을 향상시켜야 하는 고농도이지만, 블랭크 및 항-마우스 lgG-Alexa 488 2차 Ab 대조군에 대한 결합을 제거한 후 대조군 CHO 세포의 0.77%에만 결합하는 것으로 보여졌다(도 7). 21 배 초과 더 높은 표면 결합을 보여주는 이러한 결과는 대조군 CHO 세포와 비할 때 US28 발현 CHO 세포에서 13-5G6-1D3 Ab 클론으로 수득한 다른 특이성 결과와 완전히 일치한다(도 4). US28의 ECD3에 대해 생성된 여러 다른 항체 클론은 또한 US28 발현 세포에 대한 큰 특이성을 나타냈으며(US28-음성 대조군 CHO 세포에 대해 관찰된 결합 수준과 비교하여 US28 발현 CHO 세포에 대한 약 11-배 내지 26-배 더 큰 결합의 특이성 인자 범위), 따라서 ECD3 펩티드를 US28 결합 항체에 대한 특이적 표적으로서 확인하였다(표 2).
HCMV 감염된 MRC-5 세포에 US28-13-5G6-1D3 rAb의 결합
이어서 본 발명자들은 US28-13-5G6-1D3 rAb가 HCMV 감염된 세포의 표면에 특이적으로 결합할 수 있는지 여부를 연구하였다. HCMV는 인간 섬유모세포에서 진입, 복제 및 용해성 감염을 유발하는 것으로 알려져 있다[3]. 따라서 본 발명자들은 감염된 인간 MRC-5 세포를 5 m.o.i.에서 HCMV Ad169 실험실 균주로 감염시키고 세포를 p.i. 4일째(96 hpi)에 수확하였다. 감염된 세포는 현미경에 의해 관찰된 바와 같은 다수의 세포에서 용해성 HCMV 감염의 전형적인 징후(편평하고 팽창된 세포를 특징으로 하는 사이토메갈로)를 보였다.
HCMV Ad169 감염된 세포에 대한 US28-13-5G6-1D rAb의 표면 결합을 유세포 분석법 분석을 사용하여 적절한 IgG 이소형 대조군으로 염색된 감염된 세포 뿐만 아니라 비감염된 배양된 MRC-5 세포(Mock)와 비교하였다. 결과는 Mock 세포에서가 아니라 HCMV Ad169 감염된 MRC-5 세포 표면에서 US28-13-5G6-1D rAb의 특이적 결합을 보여주었다(도 8-9).
13-5G6-1D rAb가 HCMV 감염된 세포 집단의 표면에 결합하는 것을 제어하기 위해, 또 다른 세트의 HCMV Ad169 감염된 세포 및 Mock 세포를 용해성 HCMV 감염 동안 초기에 발현되는 것으로 알려진 세포내 단백질인 HCMV 주요 즉시 초기(IE) 항원에 대한 상업적 항체 MAB810X로 투과 및 염색하였다[3]. MAB810X 항체를 FACS 분석에서 US28-13-5G6-1D3 rAb와 동일한 HCMV 감염된 MRC-5 세포 집단으로 염색하였으며, 어느 한 항체에 대한 비감염된 세포에 대해 관찰되지 않았고, US28-13-5G6-1D3 rAb에 대해 입증된 표면 결합이 HCMV 감염된 세포에 특이적이었음을 확인하였다(도 8a 및 b).
염소 항-마우스 lgG-Alexa 488과 함께 인큐베이션하기 전에 1차 항체 대신 마우스에서 만든 비-면역 혈청(IgG 이소형 대조군)을 사용하여 US28-13-5G6-1D3 rAb의 비특이적 결합을 테스트하였다. 결과는 이소형 대조군과 비교하여 US28-13-5G6-1D3 rAb에 의한 HCMV 감염된 MRC-5 세포의 염색에서 변화를 보인 반면, 비감염된 세포(Mock)의 염색은 IgG 이소형 대조군과 유사하였다. 종합하면, 이들 결과는 US28-13-5G6-1D3 rAb가 비감염된 세포와 비교하여 HCMV 감염된 세포 표면에 특이적으로 결합함(~16-배 더 큰 특이성)을 보여준다(도 9).
HCMV Ad169 실험실 균주는 이전 실험에서 논의된 CHO-US28-A1 세포를 생성하는 데 사용된 서열인 DB 균주에 의해 암호화된 4N 변이체에 대조적으로 ECD3 서열의 4번째 아미노산에 D를 제시한다는 점에서 US28(서열번호: 42)의 4D 변이체를 암호화한다는 점에 주목하였다. 본 실시예에서 입증된 바와 같이 US28의 4D 및 4N 변이체 둘 다에 대한 US28-13-5G6-1D3의 결합은 제공된 균주 불가지론적 결합 특성의 분명한 표시이다.
인간 PBMC에 결합하는 US28-13-5G6-1D3
과립구-대식세포 전구체 및 CD14+ 단핵구를 포함하는 CD34+ 전구체 및 이들의 유도체에서 평생 잠복성 HCMV 캐리지는 혈청 양성 개체에서 재활성화될 수 있는 HCMV의 저장소를 제공한다[4]. 다음으로 본 발명자들은 이전 연구에서와 동일한 유세포 분석법을 사용함으로써 US28-13-5G6-1D3 rAb가 3 명의 HCMV 혈청 양성 개체(공여자 1-3)의 1차 PBMC에 결합할 수 있는지 여부를 조사하였다. 결과는 각각 3명의 공여자로부터의 PBMC 세포의 18.37%, 3.57% 및 5.25%에서 US28-13-5G6-1D3 rAb에 의한 표면 결합을 보여주었다(도 10). 연구된 PBMC 중, CD11+, CD14+ 및 CD16+ 양성 세포만이 HCMV의 담체일 수 있고, 이들 세포 마커는 상이한 단핵 세포에서 부분적으로 중첩할 수 있다. 사람 및 상황에 따라, 잠복기 감염된 세포 집단은 최대 약 15%까지 추가되지만 달라질 수 있다. 결과적으로, 각각 공여자 1, 2 및 3에서 총 PBMC의 18.37%, 3.57% 및 5.25%에서 US28-13-5G6-1D3 rAb의 관찰된 표면 결합은 HCMV 담체일 수 있는 PBMC의 상당한 비율에 대한 결합을 입증한다. 이러한 결과는 PBMC의 하위유형과 관련되지 않지만, US28-13-5G6-1D3 rAb가 잠복성 HCMV 감염된 세포 표면에 결합할 수 있음을 나타낸다.
상업적 US28 항체
US28-13-5G6-1D3 Ab과의 결합 특성을 비교하기 위해 상업적 폴리클로날 US28 Ab를 구입하였다.
CHO-US28-A1 세포에 대한 상업적 US28 폴리클로날 Ab의 결합을 테스트하고 동일한 세포에 대한 US28-13-5G6-1D3 rAb의 결합과 비교하였다. US28-13-5G6-1D3 항체는 CHO-US28-A1 세포의 50% 초과에 결합되는 반면, 상업적 US28 Ab는 동일한 실험에서 세포의 10%만 염색하였다(도 11a). 이어서 본 발명자들은 HCMV Ad169 감염된 MRC-5 세포에 대한 상업적 US28 Ab를 테스트하여, HCMV 감염된 집단에 대한 특이적 결합을 보여주었다. 그러나, 이 항체는 또한 IgG 이소형 대조군과 비교하여 비감염된 Mock 세포를 약 2-배 염색하였고, 이는 비감염된 MRC-5 세포 표면에 대한 비특이적 결합을 나타낸다(도 11b). 또한, 인간 1차 PBMC에 대한 상업적 US28 항체의 결합은 테스트된 3개 샘플 모두에서 80% 초과였으며, 이는 잠복기 감염된 세포가 최대 약 15%까지 첨가될 때 이 세포 집단에 대한 비특이적 결합을 나타낸다(데이터는 제시되지 않음). 따라서, HCMV Ad169 감염된 MRC-5 세포에서 관찰된 상업적 US28 항체의 특이적 결합 효과의 일부는 이러한 비특이적 표면 결합 구성요소로부터 생겨날 수 있다.
1가 및 2가 VUN100과의 비교
WO 2019/151865는 동등한 저널 기사 De Groof 등, 2019[5]에도 보고된 바와 같이, VUN100으로 언급되는 특정 VHH에 의해 예시된 US28에 대한 단일 중쇄 가변 도메인 항체(VHH)를 기재한다. VUN100(본 출원의 서열번호: 60으로 제공된 서열)은 불연속 에피토프에 결합하는 것으로 보여졌으며, 이는 US28의 N-말단 세포외 영역의 다중 결합 위치(위치 1-37, 본원에서 ECD1로도 언급됨)를 포함하고, WO 2019/151865(36 페이지, 11-32 행)의 실시예 3 및 De Groof 등, 2019[5]의 도 2에 대한 범례에서 논의된 바와 같이, US28의 세번째 세포외 루프(ECL3, 위치 250-273, 본원에서 ECD4로도 언급됨)의 존재에 의해 추가로 영향을 받았다. 특이성 점수가 4인 HEK293-F Mock 세포에 대한 VUN100 Ab의 표면 결합(~20%)은 De Groof 등, 2019[5]의 지원 정보, 이의 도 S1.A에 보고되었다(및 본 출원의 표 2에 요약됨). 단지 약 4의 특이성 점수를 갖는 US28-발현 세포와 US28-음성 세포를 구별하는 명백한 능력은 항체 13-5G6-1D3, 13-5C6-1B5 및 14-1H3-1A6을 포함하는 US28의 ECD3에 대해 생성된 항체를 사용하여 수득된 지속적으로 더 높은 수준의 특이성 점수와 비교하여 차선이며, 이는 임의의 비특이적 결합을 최대화하기 위해 높은 항체 농도를 선택하였을 때에도 11-26 범위의 특이성 점수(표 2)를 지속적으로 입증하였고, 보다 상업적으로-관련된(낮은) 항체 농도를 사용하여 보다 더 큰 특이성 점수를 입증하였다(도 7).
VUN100에 대해 보고된 낮은 특이성 점수는 건강한 세포에서 표적외 부작용을 피하면서, HCMV-감염된 세포에 대해 특이적으로 표적화된 효과를 제공하는 능력에 대한 우려를 제기한다. 건강한 세포에서 허용되지 않는 수준의 표적외 결합을 실질적으로 피하는 US28의 ECD3에 대한 매우 특이적인 결합 분자를 제공하는 것은 본원에 제공된 결합 분자의 US28-결합 활성을 포함하는 BiTE 및/또는 CAR-T 세포를 사용하는 것과 같이, HCMV-감염된 세포에 대한 높은 특이성을 갖는 세포독성 활성을 지시하는 맥락에서, 본 발명의 특정 초점이다. VUN100에 대해 보고된 특성은 HCMV-감염된 세포에 대해 높은 특이적 세포독성 활성을 지시하는 적합성이 부족함을 나타낸다. 또한 본 발명의 매우 특이적인 결합 분자와 대조적으로, 면역조직화학(IHC)에서 사용하기 위한 것과 같은 진단적 검정을 포함하는 검정에서 US28-발현 세포(특히, HCMV-감염된 세포)를 용이하게 식별하는 맥락에서 유용할 수 있는 VUN100의 능력에 관한 우려를 제기한다.
WO　2019/151865, 및 동등한 저널 논문 De Groof 등, 2019, Mol. Pharmaceutics, 16: 3145-3156에서, 저자들은 VUN100을 언급하고 GBM 조직에서 US28을 특이적으로 검출하고 리간드 의존적 및 구성적 US28 활성을 억제하고, 결과적으로 정위 이종이식 모델에서 시험관내 및 생체내에서 US28-의존적 GBM 성장을 손상시키는 능력을 나타내었다.
그러나, US28을 치료적 표적으로 사용하기 위해, 특히 US28의 표면 발현을 나타내는 세포에 대한 세포독성 활성을 지시하려는 목적을 위해, 당업계에 알려진 VUN100 분자에 대해 보고된 상대적으로 높은 수준의 비특이적 결합 활성을 포함하는 이전에 기재된 바와 같은 가장 중요한 장애물을 극복할 뿐만 아니라, 균주 다양성, 바이러스 돌연변이, 돌연변이생성 부동 및 바이러스 잠복기 동안 바이러스가 면역계로부터 숨는 능력의 장애물을 극복하는 US28-결합 분자를 제공하는 것이 중요하다.
따라서, US28의 ECD3에 결합하는 본 발명의 결합 분자(예컨대 13-5G6-1D3)와, US28의 N-말단 및 ECD4 내에 존재하는 불연속 에피토프에 결합하는 것으로 보고된 WO 2019/151865 및 De Groof 등, 2019(상기)의 VUN100 Ab 및/또는 De Groof 등, 2020(상기)의 VUN100b 2가 분자사이에서 비교가 이루어졌다.
HCMV 균주 DB(대표적인 4N-변이체) 또는 HCMV 균주 TB40/E(대표적인 4D-변이체)로부터의 US28 서열을 재조합적으로 발현하는 CHO 세포에서, 대조군으로서 비-재조합 CHO 세포를 사용하여 비교를 수행하였다. 상기 언급된 바와 같이, 출원인은 HCMV 균주가 그들의 ECD3 서열을 참조하여 분류될 수 있고, 일반적으로 4N- 또는 4D-변이체인 범위에 속하고(이는 각각 대략 10%/90% 분할임), 따라서 예시된 DB 및 TB40/E 균주가 이러한 2개 그룹화에 내에 있는 다수의 추가 균주를 대표한다는 것을 식별하였다. 따라서, 4N- 및 4D-변이체 둘 다에 대한 교차 반응성을 보이는 것은 광범위한 범위의 HCMV 균주에 대한 균주 불가지론적 결합을 나타낸다.
다음 1차 항체를 사용하여 감염된 세포주 각각에 대한 FACS 분석을 수행하였다(상기 기재된 바와 같음): (i) 13-5G6-1D3; (ii) 1가("Mv"로 약칭됨) VUN100; 및 (iii) 2가 VUN100("BvVUN100"으로 약칭되며 VUN100b로도 언급됨). 세포 결합은 항체에 의해 결합된 집단 내 세포의 백분율로 표시된다.
CHO 음성 대조군에 대해 낮은 결합 백분율이 관찰되었으며, 1가 VUN100은 2.25% 배경 결합을 보였고, 2가 VUN100은 1.06% 배경 결합을 보였고, 13-5G6-1D3(도면에서 "1D3"으로 약칭됨)은 0.88%의 최저 배경 결합을 보였다(도 21a). 이들 데이터는 예시적인 ECD3-결합 항체인 13-5G6-1D3가 VUN100 항체보다 비감염된 CHO 세포에 대한 배경 결합이 더 낮다는 것을 입증한다.
HCMV의 DB 균주(예시적인 4N-변이체)에 의해 암호화된 US28을 발현하는 CHO 세포에서, 모든 테스트 항체에 대한 결합의 증가가 관찰되었으며, 1가 VUN100은 집단의 6.91%에 결합하고, 2가 VUN100은 집단의 9.24%에 결합하고, 13-5G6-1D3은 집단의 16.65%에 결합한다(도 21a). 이것은 1가 또는 2가 VUN100보다 낮은 배경 결합을 갖는 것 외에도, 13-5G6-1D3이 또한 US28의 DB 형태를 발현하는 CHO 세포에 대한 실질적으로 더 높은 결합을 가짐을 보여준다. CHO 대조군 세포와 US28의 DB 형태를 발현하는 CHO 세포 사이에서 결합의 증가율(%)로 표현될 때, 이 결과는 1가 또는 2가 VUN100으로 관찰된 낮은 수준의 특이성과 비교하여, 13-5G6-1D3에 의해 제공된 뚜렷하게 개선된 결합 특이성을 나타낸다(도 21b). 이들 데이터는 예시적인 ECD3-결합 항체인 13-5G6-1D3이 HCMV의 4N-변이체 균주로 감염된 CHO 세포에 대한 개선된 특이적 결합을 가짐을 입증한다.
유사하게, US28의 TB40/E 형태(예시적인 4D-변이체)를 발현하는 CHO 세포에서의 결합을 CHO 대조군 세포에 대한 결합과 비교할 때, 데이터는 US28의 TB40/E 형태를 발현하는 CHO 세포에 대한 예시적인 ECD3-결합 항체인 13-5G6-1D3의 더 높은 결합(도 21a) 및 1가 및 2가 VUN100 둘 다의 크게 개선된 특이성(도 21b)을 분명하게 보여준다.
이들 데이터는 또한 균주-불가지론적 결합 활성의 상대적 수준을 나타낸다.
패널에서 상이한 항체의 US28의 DB 형태(ECD3에서 예시적인 4N-변이체) 및 US28의 TB40/E 형태(ECD3에서 예시적인 4D-변이체)를 발현하는 CHO 세포에서 결합 수준을 비교할 수 있다. 도 21a에 나타낸 바와 같이, 1가 VUN100에 대한 4N-변이체와 비교하여 4D-변이체에 대한 감소된 결합이 관찰되었으며, 집단의 6.91%에서 4.33%로 하락하였다. 마찬가지로, 2가 VUN100은 감소된 결합을 나타내었으며, 집단의 9.24%에서 5.2%로 하락하였다. 이들 결과는 WO 2019/151865의 결과와 일치한다. 그러나, 흥미롭게도, 예시적인 ECD3-결합 항체인 13-5G6-1D3은 4N-변이체 균주와 비교하여 특이적 결합이 추가로 개선되었으며, 집단의 16.65%에서 18.25%로 약간 증가하였다.
도 21c는 US28의 DB 및 TB40/E 형태를 발현하는 CHO 세포에 대한 결합 사이에, 테스트 패널에서 상이한 항체에 대한 세포 집단과의 결합에 대한 절대 수준의 % 변화를 보여준다. 이들 데이터로부터, US28 서열이 유래된 HCMV의 균주에 따라 1가 및 2가 VUN100 둘 다의 결합 능력에서 상당한 차이가 있음(각각 35% 초과 및 40% 초과)이 명백하다. 대조적으로, US28 단백질이 수득되는 HCMV 균주 정체성은 예시적인 ECD3-결합 항체인 13-5G6-1D3의 결합에 훨씬 적은 정도로 영향을 미치며, 차이는 10% 미만이다.
또한 HCMV의 이러한 상이한 균주로부터 유래된 US28과 비교할 때, 이들 데이터를 비교하여 US28에 대한 결합 활성의 보유 백분율을 결정할 수 있다. 도 21d는 예시적인 ECD3-결합 항체인 13-5G6-1D3가 이들 균주 사이에서 본질적으로 100% 결합 활성을 보유하는 반면, VUN100 1가 및 2가 형태는 US28 단백질이 수득되는 HCMV 균주 정체성에 따라 60% 이하만을 보유함(즉, 40% 이상의 상실)을 나타낸다.
US28이 수득되는 HCMV의 균주에 따른 결합 능력의 이러한 차이는 또한 도 21e에 명백하게 예시되어 있으며, 여기서 각각의 1가 및 2가 VUN100이 각각의 테스트된 HCMV 균주로부터의 US28에 결합하는 능력은 동일한 형태의 US28에 대한 13-5G6-1D3의 결합에 대해 각각 정규화된 값에 기반하여 계산된다. 이 방식으로 정규화되는 경우, 13-5G6-1D3에 대해 관찰된 것과 비교하여 각각의 1가 및 2가 VUN100 결합에서 균주-의존적 가변성이 명백하게 눈에 보인다.
이들 데이터는 1가 및 2가 VUN100 항-US28 항체가 US28을 암호화하는 HCMV의 균주에 의해 크게 영향을 받은 US28에 대한 결합 활성을 갖지만, 대조적으로 본 발명의 예시적인 ECD3-결합 항체인 13-5G6-1D3은 HCMV의 4N- 및 4D-변이체 둘 다에 대한 높은 수준의 결합으로 효과적으로 균주 불가지론적임을 입증한다.
이들 데이터는 본 발명의 ECD3-결합 분자가 HCMV의 다양한 상이한 균주에 대한 높은 결합 특이성을 보유하기 위해 이용할 수 있는 균주 불가지론적 에피토프 서열("SAES")이 US28 내에 존재함을 추가로 보여준다. 따라서, 본 발명의 결합 분자는 이전에 표적화되지 않은 유리한 에피토프, 즉 US28의 ECD3 내의 SAES를 표적한다. 대조적으로, N-말단 영역 및 ECD4 내의 불연속 에피토프에 결합하는 당업계의 VUN100 분자는 비교적 더 높은 배경(표적외) 결합, 실질적으로 낮은 특이성을 가지며 HMCV 균주-의존적 결합 특성을 나타낸다.
이들 비교 결과는 US28-13-5G6-1D3 rAb에 의해 예시된 바와 같이 US28의 ECD3 내의 SAES에 결합하는 본 발명의 항체가 테스트된 모든 세포주 및 세포에서 높은 US28-특이적 표면 결합 특성 정도를 나타내는 반면, 상업적 폴리클로날 US28 Ab 및 VUN100 Ab 모노클로날 항체의 두 참조 항체가 US28 음성 대조군 세포 표면에 대한 높은 비특이적 결합 정도를 나타냄을 입증한다. 따라서, 특히 본 출원에 기재된 과정에 의해 수득된 US28-13-5G6-1D3 rAb 및 다른 항-ECD3 항체에 의해 예시된 바와 같이, 본원에 기재된 프로토콜에 따라 US28의 ECD3에 대해 생성된 항체는 본 발명의 지식에 따르면 매우 특이적이지만 또한 균주 불가지론적인 방식으로 US28-발현 HCMV 감염된 세포의 표면에 결합할 수 있는 유일한 현재 존재하는 항체이다.
US28의 인공적으로 생성된 돌연변이된 균주에 대한 결합
US28은 돌연변이될 수 있는 서열 내에서 알려진 다수의 지점을 갖는다(표 3 참조). 또한 HCMV와 같은 바이러스는 요법에 채택되도록 돌연변이며는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 발간시클로비르는 돌연변이를 통해 바이러스가 내성을 발생하기 쉽다(Boivin 등, 2012; 등, 2015; 및 Jung 등, 2019). 따라서, HCMV 균주 내에서 가능한 향후 유전적 부동의 극단적인 형태로 모의하기 위해, 서열 내의 모든 알려진 지점에서 돌연변이를 포함하는 US28의 돌연변이된 버전(본원에서 "돌연변이된" 형태로 언급됨)을 제조하였다. 서열은 본원에서 서열번호: 173으로 제공되고, HCMV 균주 DB(서열번호: 5)에 의해 암호화된 바와 같은 US28의 서열과 비교하여 다음 돌연변이를 갖는다: P3Q, T7del(즉 결실), A8T, E18L, A19G, T21A, P22L, V24T, F25L, V35I, N170D, V250L, F265S, R267K.
돌연변이체 형태를 발현하도록 조작된 CHO 세포("CHO-돌연변이된 균주")를 예시적인 ECD3-결합 분자인 1D3과 ECD3에 결합하지 않는 VUN100 분자 사이의 결합에 대해 비교하였다(도 21a 참조).
흥미롭게도, 1가 VUN100에 대해 관찰된 바에 의해(이러한 실험에서 대조군 CHO 세포에 대한 2.25% 결합과 비교하여, 돌연변이된 균주에 대해 1.41% 결합) CHO 음성 대조군보다 돌연변이된 균주에 대한 결합이 검출되지 않았으며, 이는 1가 VUN100이 US28-발현 세포보다 표적외 세포에 실제로 더 강력하게 결함함을 나타낸다. 이것은 도 21b에 추가로 예시되어 있으며, CHO-돌연변이된 균주에 대한 1가 VUN100에 대해 1 미만의 특이성을 나타낸다(즉 대조군 세포보다 돌연변이된 US28-발현 세포에 덜 결함함).
2가 VUN100은 US28의 돌연변이된 형태를 발현하는 세포에 대해 2.58%의 매우 낮은 결합을 나타내었으며, 이는 대조군 CHO 세포보다 1.52%만 증가한 것이며(도 21a), 이것은 대조군 CHO 세포와 비교하여 US28의 돌연변이된 균주를 발현하는 세포에 대한 결합에서 단지 2.43-배 증가에 상응한다(도 21b).
대조적으로, 본 발명의 예시적인 ECD3-결합 분자인 13-5G6-1D3("1D3")은 대조군 세포의 0.88%와 비교하여 12.93%에서 돌연변이된 US28 형태를 발현하는 세포에 대한 높은 결합을 보유하였고(도 21a), 이것은 대조군 세포와 비교하여 US28 돌연변이된 형태를 발현하는 세포에 대한 거의 15-배 더 큰 수준의 결합이다(도 21b).
이들 데이터는 선행 기술의 VUN100 분자(이는 US28의 N-말단 영역 및 ECD4를 갖는 불연속 에피토프에 결합함)가 바이러스 돌연변이에 따라(예를 들어 내성을 발생하도록 진화할 때) 결합 특성 및 특이성의 변화에 매우 민감할 수 있는 반면, 본 발명의 ECD3-결합 분자(예컨대 1D3)는 식별된 균주 불가지론적 에피토프 서열("SAES")에 대해 지시된 결합을 가지며, 이것은 본 발명의 항-ECD3 결합 분자가 US28의 추가의 돌연변이된 균주에 대한 높은 수준의 특이적 결합을 유지하게 한다는 것을 입증한다. 따라서, 이러한 데이터에 기반하여, HCMV가 예를 들어, WO　2019/151865, De Groof 등, 2019, 상기, 및 De Groof 등, 2020, 상기에 기재된 바와 같은 VUN100 항체보다 돌연변이를 통해 ECD3-결합 분자에 대한 내성을 발생할 가능성이 적다. 이것은 발간시클로비르와 같은 다른 HCMV 요법에 비해 본 발명의 ECD3-결합 분자에 대한 추가 이점이다.
실시예 2:
추가 ECD3 항체는 HCMV의 4N- 및 4D-변이체에 결합한다
실시예 1의 발견에 비추어, 본 발명자들은 4N- 및 4D-Bio-펩티드를 사용하는 상기 방식으로 US28의 ECD3에 대한 항체 및 다른 결합 분자를 생성 및 선택하는 과정이 ECD3 내에서 식별된 균주 불가지론적 에피토프 서열("SAES")을 사용으로 인한 균주 불가지론적 결합을 포함하는 유익한 결합 특성의 제공한다는 가설을 세운다.
이 가설을 확인하기 위해, 이전에 기재된 바와 동일한 방법을 사용하여 추가의 서브클론을 생성하였고, 후속적으로 ELISA에 의해 두 펩티드 변이체에 대한 결합을 테스트하였다(상기 기재된 바와 같음, 검정 1 참조). 이전과 같이, 이 ELISA 검정에 사용되는 펩티드 서열은 서열 TKKNNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 6, ECD3의 4N 변이체에 상응)를 갖는 Bio-펩티드-1 및 TKKDNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 7, ECD3의 4D 변이체에 상응)의 서열을 갖는 Bio-펩티드-2였다.
US28의 ECD3에 대한 특이성으로 생성된 총 28개의 서브클론을 테스트하였다. 서브클론이 유래된 클론의 세부사항은 표 4에서 볼 수 있다. "13" 및 "14"는 이전에 기재된 바와 같이 마우스 13 및 마우스 14를 나타낸다. 따라서 서브클론은 예를 들어, 각각의 클론 정체성의 끝에 서브클론 정체성을 태그하고 "US28"을 제외함으로써 13-1C10-1A2로 완전히 특성화할 수 있으며, 이는 단지 클론이 US28에 대한 특이성을 위해 생성된다는 것을 나타낸다.
표 4: ECD3 결합 분자의 클론 및 서브클론.
전체 서브클론 정체성은 표 5A에 나열되어 있으며 각 서브클론에 대한 흡광도 값은 상응하는 표 5B에 수치로 표시된다. 이러한 두 표는 실험을 위한 96-웰 플레이트 레이아웃을 나타내므로, 항체 서브클론을 나타내는 표 5A에 대한 세포(96-웰 플레이트에서 웰을 나타냄)를 표 5B에 대한 상응하는 세포와 일치시킬 수 있다. 블랭크 웰은 각각의 펩티드로 코팅하고 1차 항체의 부재 하에 2차 항체로 처리하였다.
Bio-펩티드-1 및 Bio-펩티드-2 둘 다에 대한 28개의 항체 서브클론 모두에 대해 높은 흡광도 값이 관찰되었으며, 이는 다양한 서열의 다수의 항체가 HCMV의 4N- 및 4D-변이체에 대한 균주 작용제 결합의 유익한 특성을 공유할 ECD3에 대해 생성될 수 있음을 입증한다.
표 5A: HCMV의 4N- 및 4D-변이체에 대한 결합에 대해 테스트된 추가 28개 클론에 대한 핵심 ECD3 항체 클론.
표 5B: HCMV의 4N- 및 4D-변이체에 대한 결합에 대해 테스트된 추가 28개 클론에 대한 흡광도 값.
US28-발현 세포에 대한 추가 클론의 결합
HCMV 병인론의 많은 부분은 바이러스 잠복기와 연관되는 것으로 간주되며, 이는 다수의 메커니즘을 통해 체액 및 세포 숙주 면역 반응으로부터 탈출하는 바이러스 능력과 밀접하게 연결되어 있다(Manandhar 등, Int J Mol Sci, 2019. 20(15)). 이러한 메커니즘의 가장 중요한 것 중 하나는 HCMV의 이러한 끊임없이 변하는 높은 유전적 다양성을 포함한다. 많은 CMV 유전자는 다수의 N-말단 다형성이 보고된 G 단백질-결합된 수용체 US28을 포함하여 매우 가변적인 것으로 식별되었다(Goffard 등, Virus Genes, 2006; 33(2):175-81; Arav-Boger 등, J Infect Dis., 2002; 186(8):1057-64).
본 발명의 조사는 HCMV 균주가 그들의 ECD3 서열을 참조하여 분류될 수 있고, 각각 4N- 또는 4D-변이체인 범위(이는 대략 10%/90% 분할임)에 속한다는 것을 식별하였다. 상기 표 5B에 제공된 결합 데이터는 ECD3 내에서 균주 불가지론적 에피토프 서열("SAES")에 대해 생성된 결합 분자가 본 출원의 도 21의 데이터에 의해 입증된 바와 같이(상기 논의된 바와 같이 실시예 1), VUN100과 같은 US28 분자의 다른 영역에 결합하는 항-US28 항체의 특성(이는 US28의 N-말단 및 ECD4 영역에서 불연속 에피토프에 결합하는 것으로 보고됨)과 달리, 지속적으로 균주 불가지론적 결합을 나타냄을 보여준다.
따라서, 본 발명의 결합 분자는 US28-발현 세포에 대한 균주 불가지론적 결합을 갖는 것을 특징으로 할 수 있으며, 여기서 결합 정도 및/또는 결합 특이성 정도는 US28을 발현하는 HCMV의 균주에 의해 실질적으로 영향을 받지 않는다. 이것은 상이한 개체가 HCMV의 상이한 균주로 감염될 수 있다는 관점에서 중요할 뿐만 아니라, 개체가 HCMV의 다수의 상이한 균주로 동시에 감염될 수 있으므로 중요할 수 있다(Gorzer 등, J Virol, 2010, 84(14): 7195-7203; Renzette 등, PLoS Pathog, 2011, 7(5): e1001344; Renzette 등, Curr Opin Virol, 2014. 8: 109-15; Renzette 등, Proc Natl Acad Sci USA, 2015, 112(30): E4120-8; Renzette 등, J Virol, 2017, 91(5)). HCMV의 상이한 균주로 감염되는 맥락에서, 존재하는 HCMV 균주와 관계없이 그들의 결합 특성을 발휘할 수 있고 따라서 치료를 시작하기 전에 HCMV 감염 균주를 분류할 필요성을 피하는 결합제를 제공하는 것이 매우 유익하다. HCMV의 다수의 상이한 균주로 동시에 감염되는 개체의 맥락에서, 개체에서 동시에 모든 균주를 치료할 수 있는 것이 매우 유익하며; 특히, 이것은 선택압을 적용하여 임의의 결합되지 않은 균주의 감염 발생을 촉진하는 환경의 생성을 피하는 데 도움을 줄 수 있다.
또한 신규 숙주 감염이 각 감염된 개체에 대해 고유한 바이러스 균주를 생성하고 신규 유전자형이 면역 반응의 선택압으로 인해 우세하게 될 수 있는 선택 이벤트를 생성하는 것으로 알려져 있으며(Renzette 등, 2011, 상기), 바이러스 및 숙주 인자는 둘 다 HCMV 감염 동안 바이러스 유전적 부동을 조성하는 데 기여할 수 있음이 가능하다(Vabret 등, Trends Immunol, 2017, 38(1): 53-65; Christensen & Paludan, Cell Mol Immunol, 2017, 14(1): 4-13). 이것은 균주 불가지론적 결합을 갖는 항-US28 결합 분자의 제공이 중요하다는 추가의 맥락이다.
적어도 이러한 이유로 인해 균주 불가지론적 결합(또는, 적어도 HCMV의 상이한 균주 사이에서와 같이, 본 발명의 항-US28 결합 분자의 결합 특성의 가변성 정도를 최소화하는 것)은 매우 바람직할 수 있다.
본 발명의 결합 분자는 추가로 또는 대안적으로, US28-음성 세포의 결합과 비교하여 US28-발현 세포에 우선적으로 결합하는 것을 추가로 특징으로 할 수 있다. 따라서, 특이성은 균주-불가지론적 방식으로 해당 특이성을 보유하는 능력과 함께, 또 다른 중요한 특징이다.
적어도 일부 맥락에서(예를 들어 본 발명의 결합 분자가 결합된 세포에 대해 세포독성 활성을 전달하기 위해 사용되는 치료적 맥락에서), 표적외 결합 정도는 절대적인 의미에서 낮은 것이 또한 중요하다. 이러한 맥락에서, 결합이 US28-발현 세포에 대해 강력하고 특이적인 것만 적합하지 않을 수 있다. 즉, US28-발현 세포에 대한 매우 높은 수준의 결합이 특정 맥락에서 도움이 될 수 있는 반면, 이것은 상대적 수준의 결합 특이성(표적 세포 대 표적외 세포에 대한 절대 수준의 결합과 비교하여)이 유리한 비율을 제공할 수 있을지라도, US28-발현 세포에 대한 높은 수준의 결합이 또한 상대적으로 높은 수준의 표적외 결합과 함께 오는 경우 치료적 맥락에서 허용되지 않을 수 있다. 실제로, 이러한 맥락에서, 표적외 세포(즉 HCMV에 의해 감염되지 않은 세포)에 대한 결합의 회피는 표적외 활성을 피하는 치료적으로 유용한 분자의 제공을 허용하는 매우 중요한 추가 특성일 수 있다. 즉, US28-음성 세포에 대한 낮은 절대 수준의 결합을 갖는 본 발명의 결합 분자는 높은 배경 결합이 결합 분자에 대한 표적외 영향을 위태롭게 할 것이므로, 일부 맥락에서 보다 치료적으로 관련한 활성을 제공할 수 있다. 예를 들어, 결합된 임의의 세포를 선택적으로 사멸시키는 CAR T-세포 또는 BiTE에 따라, CAR T-세포 또는 BiTE가 표적에 대해 음성인 세포에 대해 낮은 수준의 배경 결합을 갖는 것이 중요하다. 달리, CAR T-세포 또는 BiTE는 의도된 표적 이외의 세포를 사멸시킬 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 본 출원의 실시예 1에서(도 21에 추가로 나타낸 바와 같음), 항-US28 VUN100 선행 기술 항체(US28의 N-말단 및 ECD4 영역에서 불연속 에피토프에 결합하는 것으로 보고됨)와 비교하여, 예시적인 본 발명의 ECD3-결합 분자(13-5G6-1D3)는 실질적으로 낮은 표적외 결합 활성을 제공하고, 뚜렷하게 개선된 균주 불가지론적 결합을 제공하고, 또한 상이한 HCMV 균주에 따른 더 높은 특이성 뿐만 아니라 해당 특이성의 개선된 보유를 제공하였다.
따라서, 선택된 추가의 항-ECD3 결합 분자의 결합 특성을 VUN100 및 1D3과 비교하여 추가로 분석하였다.
US28-발현 세포에 대한 표적외 결합 정도 및 결합 특이성 정도를 결정하기 위해, 상기 기재된 28개의 균주 불가지론적 ECD3-결합 분자로부터 선택된 다양한 후보 서브클론(선택된 후보는 표 6에서 볼 수 있음)에 대해 상기 검정 2와 동일한 유세포 분석법을 사용하고, 양성 대조군으로서 뮤린 Fc 수용체를 함유하는 예시적인 13-5G6-1D3의 형태인 1D3-mFc, 및 US28에 대해 당업계에 알려진 결합 분자인 Mv 및 Bv VUN100 분자의 혼합물과, 추가 비교 대조군으로서 50 μg/ml에서 1:1 비율로 비교하였다.
표 6: US28-발현 세포에 대한 결합 검정을 위해 선택된 서브클론.
선택된 서브클론을 다양한 결합 분자에 대해 비특이적 결합을 측정하는 방식으로서 US28을 발현하지 않는 CHO 세포("CHO" 세포)와 비교하여 DB-US28을 발현하도록 조작된 CHO 세포("CHO-US28" 세포)에 대한 결합에 대해 유세포 분석법으로 테스트하였다. 배경 수준은 CHO 세포 및 CHO-US28 세포와 함께 각각의 2차 항체(서브클론의 경우 항-mFc-FITC, 또는 VUN100 분자의 경우 항-myc-PE)를 사용하여 결정하였다. US28이 세포 표면 상에서 발현된다는 점을 고려하면, 세포는 이러한 실험을 위해 비투과되었다.
표 7 및 도 22는 대조군 CHO 세포(즉 US28을 발현하지 않음)의 유세포 분석법에서 결합 백분율을 요약하며, 이는 2차 항체에 대한 배경 수준이 제거된 표적외 결합에 대한 위험을 나타낸다. 따라서, 각 조건에 의해 나타낸 결합 백분율은 테스트된 결합 분자의 표적외 결합이다.
표 7: US28에 대해 음성인 CHO 세포에 대한 결합 백분율.
표 7 및 도 22의 데이터는 VUN100 분자가 ECD3 내에서 균주 불가지론적 에피토프 서열("SAES")에 대해 생성된 항체와 비교하여 US28-음성 CHO 세포에 대한 지속적으로 높은 수준의 배경 결합을 가짐을 보여준다. VUN100이 VUN100 샘플의 검출된 표적외 결합을 줄이는 데 도움이 되어야 하는 대부분의 다른 항체보다 높은 희석/낮은 농도에서 테스트되었다는 점에 주목한다(높은 항체 농도는 높은 배경 결합을 야기하는 경향이 있기 때문). 그럼에도 불구하고, 데이터는 본 발명의 항체가 VUN100 샘플과 비교하여 감소된 배경 결합을 지속적으로 나타냄을 보여준다.
전형적으로, VUN100 분자는 적어도 3- 또는 4-배 이상 증가된 수준으로 비표적 세포에 결합한다.
비교하여, 이전에 기재된 1D3 결합 분자와 마찬가지로 추가의 ECD3-결합 분자는 US28-음성 CHO 세포에 대한 훨씬 더 낮은 배경 결합을 입증한다.
따라서, ECD3 내에서 균주 불가지론적 에피토프 서열("SAES")에 대해 생성된 본 발명의 ECD3-결합 분자는 VUN100 분자와 비교하여 더 낮은 표적외 결합 위험으로 더 많은 치료적으로 관련된 활성을 지속적으로 입증한다.
VUN100-기반 분자와 비교하여, 개선된 균주 불가지론적 결합 및/또는 낮은 배경 수준은 ECD3-결합 분자에 대해 충분히 유리한 특성이지만, 출원인은 VUN100 분자보다 개선된 결합 특이성을 갖는 ECD3-결합 분자가 용이하게 수득될 수 있는지 여부를 추가로 조사하였다. 따라서, 5개의 예시적인 ECD3-결합 분자를 이미 예시된 유망한 1D3 후보, 및 대조군으로서 VUN100과 비교하였다. 5개의 예시적인 ECD3-결합 분자는 표 8에 나열되어 있다.
대조군 세포와 비교하여, US28-발현 CHO 세포에 대한 결합 특이성을 계산하기 위해, 예시적인 ECD3-결합 분자에 대한 특이성 수준을 다음과 같이 계산하였다: 배경 수준을 상기 기재된 바와 같이 빼고, 각 테스트 항체 샘플에 대한 CHO-US28 결합 수준을 각각의 대조군 CHO 결합 수준으로 나누고(즉 음성 결합에 대한 양성 결합의 비율), 차이(VUN100 샘플에 대해 결정된 결합 특이성에 비해)를 계산하였으며, 여기서 1 초과의 값은 VUN100과 비교하여 개선된 특이성을 나타낸다.
이들 실험의 결과는 표 8 및 도 23에 나타내었다.
표 8: 5개의 예시적인 ECD3-결합 서브클론에 대한 결합 특이성.
결합 특이성 데이터는 다수의 추가 서브클론이 ECD3에 대해 제기된 1D3-Fc 결합 분자에 대한 개선된 특이성을 제공하고 심지어 증가하였고, 또한 VUN100 분자에 비해 개선된 결합 특이성을 입증한다.
이것은 ECD3 내에서 균주 불가지론적 에피토프 서열("SAES")에 대해 생성된 다수의 ECD3-결합 분자가 1D3과 비교하여 개선된 결합 특이성을 갖고/갖거나, VUN100 분자과 비교하여 적어도 개선된 결합 특이성을 갖는 본원에 기재된 프로토콜에 따라 용이하게 식별될 수 있음을 입증한다.
전반적으로, 이들 데이터는 ECD3 내에서 균주 불가지론적 에피토프 서열("SAES")에 대해 본원에 기재된 프로토콜에 따라 생산된 바와 같은 ECD3-결합 특이성을 갖는 결합 분자가 하기 특성 중 1, 2, 또는 3개 모두를 나타내도록 제공될 수 있음을 입증한다:
1. VUN100 분자과 비교하여 상이한 HCMV 균주에 의해 암호화된 US28에 대한 지속적으로 개선된 균주 불가지론적 결합;
2. VUN100 분자와 비교하여 US28-음성 세포에 대한 지속적으로 실질적으로 낮은 배경 결합; 및 임의적으로
3. VUN100 및/또는 1D3 분자와 비교하여 유지며거나 바람직하게는 개선된 결합 특이성.
실시예 3:
HCMV 감염된 인간 조직에 대한 결합
면역조직화학 분석(IHC)을 사용하여 HCMV 감염된 인간 조직에 결합하는 본 발명의 예시적인 ECD3-결합 분자인 US28-13-5G6-1D3 rAb를 검증하기 위해 HCMV 감염된 인간 폐 조직을 사용하였다.
US28-13-5G6-1D3 rAb는 1:400-1:1600 희석(w/v) 사이에서 염색을 보였고, 추가의 스크리닝 연구를 위해 1:400 희석(w/v)을 선택하였다(도 12 a). HCMV 항-IE 상업적 항체 MAB810R을 양성 대조군으로서 사용하였고 제조업체의 매뉴얼에 권고된 바와 같이 1:200(w/v) 희석에서 HCMV 감염된 폐 조직에 대한 최적의 염색을 보였다(도 12 d). lgG를 음성 대조군 항체로서 사용하였다(도 12 f). US28-13-5G6-1D3 rAb로 HCMV 감염된 폐 조직의 염색은 정상 폐 조직에서 폐포 세포 및 섬유모세포의 염색이 없거나(도 12 b) 또는 HCMV 음성 자궁근층의 염색이 없기 때문에(데이터는 제시되지 않음) HCMV 감염된 폐포 세포에 대한 특이성을 입증하였다. US28-13-5G6-1D3 rAb는 HCMV 양성 대조군 슬라이드에서 특징적 사이토메갈로 효과가 있는 전형적인 HCMV 감염된 세포를 염색하였다(도 12 a). US28 단백질은 세포질 및 세포막에 위치하는 것으로 알려져 있으므로 13-5G6-1D3 rAb는 이들 세포에서 강한 세포질 염색을 보인 반면, IE 단백질은 생산적 HCMV 감염 동안 세포 핵에 위치하는 것으로 알려져 있으므로 항-IE 대조군 항체 MAB810R은 예상된 바와 같이 핵 염색을 보였다(도 12 d). 양성 염색은 동일한 샘플에서 HCMV DNA를 표적하는 프로브와 함께 제자리 혼성화(ISH) 방법을 사용함으로써 HCMV 특이적인 것으로 확인되었다. 흥미롭게도, 정상 폐 조직에서, 13-5G6-1D3 rAb는 잠복성 또는 재활성화된 HCMV의 담체인 것으로 알려진 일부 조직 대식세포에 대해 양성으로 염색되었다(도 12 b). 동일한 대식세포는 양성 ISH 신호에 의해 입증된 바와 같이 HCMV DNA의 존재를 보였다(도 12 c). 동일한 대식세포는 IE 단백질에 대해 양성 염색을 보이지 않았다(도 12 e). 음성 항체 대조군 항-IgG Ab로의 염색은 폐 조직에 대해 음성으로 남아있었다(도 12 f). 이들 결과는 HCMV 감염된 인간 조직에 대한 US28-13-5G6-1D3 rAb의 특이적 결합을 보이는 세포 연구로부터 본원에 제시된 본 발명의 다른 결과와 일치한다. 도 20은 형태학적으로 정상인 인접 종양(NAT) 췌장 조직에서 생산적 HCMV 감염의 추가 예의 특이적 염색 결과를 보여준다.
HCMV 감염된 인간 암에 대한 결합
이후에 본 발명자들은 IHC 및 확인 ISH 분석을 사용하여 인간 암 조직에 대한 US28-13-5G6-1D3 rAb의 결합을 연구하였다. 결과는 수석 병리학자에 의해 평가하였다. 본 발명자들은 여러 암 유형에서 US28-13-5G6-1D3 rAb의 특이적 염색을 발견하였다. 이들 중에는 암의 병리학에서 US28의 잠재적인 보편적 역할을 처음으로 보여주는, 교모세포종(예를 들어 교모세포종 등급 4), 결장암, 직장암, 유방암(예를 들어 국소 진행성 유방암 및 그의 전이), 식도암, 위장/위암, 췌장암, 간암 예컨대 간세포 암종, 폐암, 악성 크롬친화세포종 및 자궁경부암이 있었다. 상이한 암 세포의 염색 강도는 다음과 같이 분류하였다: 음성 = 0, 약한 양성 = 1+, 중간정도 양성 = 2+ 또는 강력한 양성 = 3+. US28 염색은 종양 세포가 인접 정상 조직과 구별되는 양성 염색을 가진 경우에 양성으로만 분류하였다. 양성 US28-13-5G6-1D3 rAb 염색이 있는 대다수의 종양에서, 염색은 일반적으로 대부분의 종양 세포에서 양성이었다. 종양 양성은 ISH를 사용함으로써 종양 세포의 핵에서 HCMV DNA의 양성 발견에 의해 확인되었다. 많은 경우에 종양 샘플은 혈관 내피 및 평활근 세포에 대해 양성 염색을 보였으며, 이는 또한 인접 정상 조직에서도 보였고 종양 양성의 징후로 간주되지 않았다. IgG 대조군 Ab 염색은 음성 대조군으로서 사용되었고 연구된 암성 및 정상 조직 모두에서 음성이었다.
3개의 연구된 식도 및 위 선암종 샘플 중 하나에서 핵 HCMV DNA의 발견과 조합된 양성 US28-13-5G6-1D3 rAb 염색 강도가 있었다. HCMV 양성 위 종양은 소세포 그룹에서 정상적으로 성장하고 단지 위의 하나의 부위가 아니라 넓은 부위에 영향을 미치는 확산형 위암의 형태학적 징후를 보였다. 양성 종양 샘플은 56세 남성으로부터 유래되었으며, 종양은 등급 3이고 T3N1M0으로 TNM-분류되었다. 또한, US28 양성 식도암은 IIIa기, T3N1M0의 공격성 유형을 보였다. 인접 식도 조직은 모두(3/3) 상피 세포 염색에 대해 음성이었고 2/3의 위 종양 인접 샘플도 HCMV DNA에 대해 음성이었다.
US28-13-5G6-1D3 rAb로의 염색 강도는 테스트된 결장 선암종의 1/3에서 양성 HCMV DNA 분석에 더하여 양성(1+)인 반면, 3/3의 대조군은 인접 상피 세포에서 US28-13-5G6-1D3 염색에 대해 모두 음성이었다. HCMV DNA는 여전히 2/3개의 인접 샘플에서 추적할 수 있었다. 양성 종양은 T4N1M0의 TNM 분류로 등급 3이었다. 참고로, T4 병기는 암이 결장의 벽을 통해 관통하여 다른 주변 조직 또는 기관에 부착되거나 성장했을 수 있으며, 따라서 정의에 의해 국소 진행성 결장암으로 분류됨을 의미한다.
3개의 연구된 직장 선암종 샘플은 모두 양성 US28-13-5G6-1D3 염색 및 양성 HCMV ISH를 가졌다. 이들은 T3N0M0, 등급 2; T4N0M0, 등급 2; 및 T3N1M0, 등급 3이었다. 인접 샘플 중 2/3는 HCMV에 대해 음성이었고 1/3은 양성 US28-13-5G6-1D3 염색 및 양성 ISH 둘 다를 가졌다.
2/3의 연구된 간세포 암종은 US28-13-5G6-1D3 염색 및 HCMV ISH에 대해 양성이었다. 현저하게, 인접 간 조직은 중간정도 US28-13-5G6-1D3 염색 및 Kupffer 세포에서 크고 빈번한 세포질 HCMV DNA 응집체로 생산적 HCMV 감염에 대한 징후를 보였다. 이것은 종양 인접 간 조직 및 별개의 인접 샘플 둘 다에서 보여졌다.
본 발명자들은 또한 2/3 폐암 샘플, 2/3 자궁경부암 샘플 및 1/3 췌장암 샘플에서 US28-13-5G6-1D3 염색 및 양성 ISH를 모두 발견하였다.
그런 다음 본 발명자들은 IHC 및 ISH를 사용하여 유방암 코호트에서 HCMV US28 발현을 보다 상세하게 연구하였다. 41개의 연구된 원발성 유방 종양 샘플의 ~74%는 암 세포에서 US28-13-5G6-1D3 rAb 및 양성 핵 HCMV DNA의 양성 및 특이적 세포질 염색을 보였다(도 13 및 15). 놀랍게도, 호르몬 수용체의 발현이 낮은 것과 같이, 종양 형태가 보다 공격적이수록 HER2 양성 또는 삼중 음성 유방암(TNBC)이었으며, US28-13-5G6-1D3 rAb에 대한 종양 세포에서 더 강력한 염색 경향을 보였다(도 13 및 16 a). US28-13-5G6-1D3 rAb 염색은 종양 세포로 제한되었지만, 많은 종양 혈관에서도 강한 양성 염색을 보였다. 흥미롭게도, 연구된 30개의 전이성 림프절의 ~94%는 전이성 세포에 대한 특이적인 US28-13-5G6-1D3 rAb 염색을 보였다. 가장 집중적인 염색은 TNBC 및 HER2 양성 전이를 보였다(도 14 및 16 b). TNBC(n = 8) 및 HER2 양성(n = 11) 전이는 모두 양성 US28-13-5G6-1D3 염색을 가졌다(도 16 b). HCMV ISH는 연구된 유방암 샘플(n=41)의 98% 및 연구된 선상 유방암 전이(n=30)의 100%에 대해 양성이었다. 흥미롭게도, HCMV DNA 음성 유방암 샘플만이 신경내분비 종양이었으며, 또한 음성 US28-13-5G6-1D3 염색을 보였다. ISH 발견은 또한 원발성 종양의 12%에서만 종양 세포 당 많은 핵 HCMV DNA 신호를 보이는 상기 나열된 IHC 결과와 일치한 반면, 전이의 39%에서 종양 세포 당 많은 핵 ISH 신호가 있었다. 종양 세포 당 많은 ISH 신호는 삼중 음성 및 HER2 양성 종양에서 단지 1 또는 2개의 예외를 제외하고, 원발성 종양 및 전이 모두에서 배타적으로 보였다. 정상 유방 상피 세포 및 10/10 인접 대조군 유방 조직에서 U28-13-5G6-1D3의 세포질 염색은 없었다(도 15). 정상 림프 조직은 임의의 양성 US28 염색을 보이지 않았다(2/2 샘플은 모두 음성이었음). 그러나, 많은 인접 조직은 혈관 내피 및 평활근 세포에 대해 양성 염색을 보였으며(인접 유방 조직의 70%에서), 이는 종양 샘플과 유사하였다. 일관되게, HCMV DNA는 3/10 정상 인접 유방 조직에서 소량으로 발견되었다. 13-5G6-1D3 염색은 유방암 및 인접 정상 조직 모두에서 HCMV 감염된 세포에 대해 특이적인 것으로 평가되었다.
여러 이전 연구는 교모세포종 조직에서 HCMV 감염 및 US28 발현을 문서화하였다[5,6]. 본 발명자들은 인간 성상세포종 등급 1-3 및 교모세포종 등급 4 조직을 US28-13-5G6-1D3 rAb 및 MAB810R 항체로 염색하였다. 모든 성상세포종 등급 1(n = 4)은 US28-13-5G6-1D3 rAb 염색에 대해 음성이었다. 등급 2-3 성상세포종 중, US28-13-5G6-1D3 rAb 염색에 대해 6개는 음성이었고, 37개는 양성(1+)이었고, 2개는 중간정도 양성(2+)이었다. 모든 교모세포종 등급 4(n = 19)는 양성이었으며, 이 중 3개는 US28-13-5G6-1D3 rAb 염색에 대해 중간정도 양성(2+)이었다(도 17 및 18). 항-IE 항체 MAB810R은 19개 중 17개의 교모세포종 등급 4 샘플에 대해 양성 염색을 보인 반면, 2개의 샘플은 음성으로 간주되었다. HCMV ISH는 모든 종양 샘플에서 양성이었으며, 이는 샘플의 100%에서 HCMV DNA의 존재를 나타낸다. 인접한 정상 뇌 조직 대조군은 US28-13-5G6-1D3 rAb에 대해 임의의 일반적인 염색을 보이지 않았다(도 17 c). 5개의 NAT는 HCMV DNA에 대해 완전히 음성이었다. HCMV DNA는 나머지 5개의 NAT 샘플에서 성상세포 및 교질 세포 핵에서 발견되었다. 종양 조직에서 음성 IgG 대조군 염색은 음성이었으며(도 17 c) 이는 뇌 조직에서 13-5G6-1D3 rAb에 의한 HCMV US28 특이적 염색을 나타낸다.
6/41만이 유방암 샘플에서 연구되었지만, 대부분의 교모세포종 등급 4 샘플(17/19)은 항-IE MAB810R 항체에 대해 양성 세포질 염색을 보였다. 양성 유방암 샘플은 종종 양성 세포질 염색이 있는 드문 양성 세포만 함유하였지만, 5/6의 양성 샘플은 HER2 양성(n = 4) 또는 TNBC(n = 1)였다. 또한, 하나의 HER2 양성 샘플은 종양 대식세포에서 MAB810R Ab에 대해 양성으로 염색되었다. 1/37 전이만이 MAB810R Ab에 대해 양성으로 염색되었지만, 이 샘플은 또한 HER2 양성이었다. MAB810R Ab의 염색은 유방암 샘플에서 US28-13-5G6-1D3 rAb의 양성 염색과 항상 조합되었다. 매우 흥미롭게도, 음성 MAB810R 염색이 있는 여러 종양 샘플은 양성 혈관 내피 및 평활근 세포 염색을 보였으며, 이는 US28-13-5G6-1D3 rAb 및 MAB810R 항체 모두에 대해 양성이었다.
HCMV IE 단백질의 세포질 염색은 여러 암 유형에서 이전에 기재되었다[7,8]. MAB810R 모노클로날 항체는 세포내 HCMV 암호화된 IE1 및 IE2 단백질을 표적하는 본 발명의 실험에서 HCMV 양성 대조군으로 사용하였다. 이들 단백질은 엑손 1-3을 공유하고 추가로 엑손 4(IE1) 또는 5(IE2)를 포함한다. 전장 IE 단백질은 생산적 HCMV 감염을 유발하기 위해 잠복기로부터 HCMV 복제 및 재활성화를 필요로 한다[4]. 이들은 HCMV 실험 잠복기 동안 발현되지 않는다[9]. 그러나, 자연적 및 실험적 잠복기 시스템 모두에서 IE1 단백질의 엑손 4(IE1x4)(~60 kDa 크기)의 RNA 및 단백질 발현은 이전에 잠복성 HCMV 감염된 CD34+ 조혈 전구체 세포에서 보였지만 CD14+ 단핵구에서는 보이지 않았다[10]. 따라서, US28 단백질에 더하여 잠복기 동안 HCMV 유전자 발현은 IE1x4의 발현을 포함할 수 있지만 전장 IE1 및 2 단백질은 포함하지 않았다[10]. 제조업체(MerckMillipore.com)의 정보에 따르면, MAB810R 항체는 ~68-72 kDa 전장 IE1 및 IE2 단백질에 결합하며 이는 MAB810R Ab가 용해성 또는 복제성 CMV 감염된 세포를 표적함을 나타낸다. 따라서 잠복성 HCMV 감염된 세포에 결합하지 않아야 한다. 본 발명의 결과는 양성 유방 종양 샘플에서 대다수의 암 세포가 US28 단백질을 발현하지만, IE 단백질은 발현하지 않음을 보여준다.
본 연구에서 유방암 전이의 100% 및 뇌 종양의 100%는 ISH로 연구하였을 때 모두 HCMV DNA 양성이었다. 본 발명자들은 악성 종양에서, HCMV DNA가 종양 세포 핵에 배타적으로 위치함을 관찰하였다. 핵 HCMV DNA 신호의 수는 상이한 종양 샘플 사이에서 다양하다. 본 발명자들은 또한 종양 세포 당 핵 ISH 신호의 수가 TNBC 및 HER2 양성 유방암과 같은 공격성 암 유형에서 증가하였음을 관찰하였다. ISH 신호의 핵 국소화는 바이러스 DNA가 주로 세포질에 위치하는 경우 정상 조직에서 다수의 큰 응집체로 관찰되지 않았다(도 20). 생산적 HCMV 감염 동안, 바이러스 입자는 세포로부터 추출되기 전에 소포체에 가득찬다. 이것은 생산적 HCMV 감염 동안 대부분의 바이러스 DNA의 세포질 위치를 설명한다. 본 발명자들은 췌장(도 20), 유방, 간 및 폐 조직(도 12)과 같은 같은 정상 조직(및 NAT)에서만 이러한 생산적 HCMV 감염을 관찰하였다.
종합하면, 이들 데이터는 암 세포, 특히 유방암 세포가 잠복성 HCMV 감염을 보유함을 입증한다. 이러한 발견은 본 연구에서 IE 단백질 발현의 부족 및 세포질 바이러스 응집체의 부족뿐만 아니라, 종양 세포에서 핵 HCMV 신호의 존재를 뒷받침한다. 본 발명의 결과 및 결론은 세포변성 효과의 부족 및 종양 세포에서 바이러스 복제 증거의 부족을 나타내는 이전 데이터에 의해 뒷받침된다[11,12].
잠복성 HCMV 감염된 단핵구는 세포 생존 연장을 위해 프로그램화되고[13] 합리적으로, 종양 세포에서 잠복성 HCMV 감염은 종양 세포 생존 증가에 기여할 수 있다. 잠복성 HCMV 감염된 단핵구는 면역계에 의한 제거로부터 자신을 보호하기 위해 미세환경에서 광범위한 면역억제 기능을 발휘하는 것으로 나타났다[13]. 이것은 또한 암 세포와 유사하며, 면역 파괴를 회피하는 것은 암의 10개의 특징 중 1개로서 인정되고 있다[14].
흥미롭게도, 이전에도 다른 사람들에 의해 기재된 바와 같이[7,8], 본 발명자들은 몇몇 공격성 유방암 샘플 및 대부분의 교모세포종 4 샘플에서 세포질 전장 IE 단백질 발현을 발견하였다. 히스톤 변형, DNA 저메틸화, 또는 특정 바이러스 또는 숙주 돌연변이와 같은 암 특이적 후성 메커니즘은 바이러스 복제를 억제할 수 있지만, 여전히 특정 공격성 암에서 일부 IE의 발현을 허용한다[15]. 일부 양성 유방 종양 샘플의 단지 몇몇 세포의 세포질에서 IE 단백질 발현의 존재에 대한 본 발명의 발견은 이종 암 세포 집단이 복제 바이러스에 대해 더 관대한 소수의 세포/세포 유형을 함유할 수 있음을 나타낸다. 암 줄기 세포는 HCMV 감염에 대해 특히 관대하고 교모세포종 세포에서 IE 단백질 발현은 돌연변이를 생성하고 세포 생존, 종양 성장 및 상피-중간엽(EMT) 표현형을 유도한다고 제안되었다[16]. 잠복성 HCMV 감염된 US28 양성 암 세포는 강력한 면역억제 미세환경을 추가로 생성하여, 소수의 종양 세포에서 매우 면역원성 CD4+ 및 CD8+ T 세포 항원으로 알려져 있는[17] IE 단백질의 발현을 허용할 수 있다. 본 발명의 결과는 추가로 종양이 내피 및 평활근 세포 및 때때로 대식세포와 같은 IE 단백질에 대해 양성으로 염색되는 다른 HCMV 감염된 세포를 함유하고 있음을 보여준다. 이들 세포 유형은 종양 세포보다 복제 바아이러스 감염에 더 관대한 것으로 알려져 있고[16], 종양 내에서 바이러스 유지 및 발산에 추가로 기여할 수 있다. 그러나, 교모세포종 종양에서 HCMV 관련된 감염에 관여하는 메커니즘은 이들 암의 세포 기원이 상이하기 때문에 유방암과 상이할 수 있다.
상기 나열된 결과와 종합하면, 본 발명자들은 여기서 US28-13-5G6-1D3 rAb에 의해 본원에 예시된 바와 같이 US28의 ECD3에 특이적으로 결합하는 결합제가 US28 과발현 세포 모델, HCMV 감염된 세포 및 조직, HCMV 혈청 양성 개체로부터의 PBMC 및 종양 조직 내의 HCMV 양성 암 세포에서 US28-13-5G6-1D3 rAb의 결합에 의해 나타낸 바와 같이 HCMV 감염된 세포 표면에 특이적으로 결합함을 보여준다. 대조적으로, US28-13-5G6-1D3 rAb에 의해 본원에 예시된 바와 같이 US28의 ECD3에 특이적으로 결합하는 결합제는 일반적으로 HCMV 음성 대조군 세포 또는 조직에 결합하지 않는다(도 12, 15, 17, 19 및 20에 제시된 바와 같음). 이러한 발견은 용해성 및 잠복성 HCMV 감염 동안 존재하는 것으로 나타난 US28 단백질의 역할과 일치한다[18]. 본 발명자들은 여기서 인간 유방암, 직장암, 식도암, 위암, 췌장암, 간암, 폐암 및 자궁경부암에서 처음으로 양성 US28 염색을 보여주고 교모세포종 등급 4[5,6] 및 결장암[19]에서 HCMV US28 발현의 일부 초기 결과를 확인한다. 가장 중요하게는, 본 발명자들은 국소 진행성 결장암, 전이성 유방암 조직(~94%) 및 교모세포종 등급 IV 종양(~100%)에 대한 US28-13-5G6-1D3 rAb의 특이적 결합을 보여주어 공격성, 국소 진행성 및 전이성 인간 암에서 높은 HCMV US28 발현에 대한 본 발명의 가설을 확인하고 US28의 ECD3에 특이적으로 결합하는 결합제의 추가 역할을 제공한다.
이러한 발견은 HCMV 감염(잠복성 HCMV 감염에 특히 관심 있음) 및 HCMV 양성 암(공격성, 국소 진행성 및 전이성 HCMV 양성 암에서 특히 관심 있음)에 대한 중요한 치료적 표적으로서 HCMV US28 역할을 뒷받침하고, US28의 ECD3에 대한 항체 및 다른 결합제, 특히 US28에 대해 특이성이 높은 결합제 및/또는 항체 US28-13-5G6-1D3과 같은 균주 불가지론적 결합을 매우 강력한 치료적, 예방적, 및 진단적 결합 분자로서 지적한다. 이것은 HCMV 감염(잠복성 HCMV 감염에 특히 관심 있음) 및 HCMV 양성 암에 대하여 세포독성 활성에 대한 매우 특이적인 표적화를 제공하는 능력을 포함한다.
HCMV로 비감염된 1차 조직에 대한 결합
치료적 분자를 고려할 때, 결합 분자에 대한 표적외 결합의 위험을 평가하는 것이 중요하다. 이것은 대상체에 존재할 수 있는 CCR5에 대한 서열 상동성 수준을 갖는 US28에 대해 특히 중요하다. 따라서 높은 결합 특이성 및 낮은 표적외 결합은 표적외 효과의 위험이 낮은 유망한 치료적 결합 분자의 지표이다.
따라서, 본 발명자들은 표적외 결합 수준을 평가하기 위해 다양한 인간 1차 조직에 대한 예시적인 본 발명의 결합 분자의 결합을 연구하였다. 이들 데이터는 유세포 분석법(FACS)에서 이전에 기재된 것과 동일한 방식으로 제조된 US28-13-5G6-1D3 항체를 사용하여 생성하였다.
13-5G6-1D3 항체를 사용한 유세포 분석법 분석을 다양한 인간 1차 세포에 대해 수행하여 일반적인 표적외 결합을 제외하였다. 다음 세포주를 연구하였다: 인간 1차 부신 피질 세포, 인간 1차 신장 상피 세포, 인간 1차 심장 미세혈관 내피 세포, 인간 1차 간 상피 세포 및 인간 1차 정맥 평활근 세포. US28 표적화 항체 13-5G6-1D3은 이들 세포 유형 모두에서 1% 미만보다 훨씬 낮은 매우 낮은 표면 결합을 보였으며 이는 1:40 농도에서 이들 세포 유형에 대한 13-5G6-1D3의 표적외 결합이 없음을 나타낸다(도 19 a). 이러한 결과는 정상 US28 음성 세포에 대한 낮은 결합을 보여주는 실험실 세포(즉 비-1차 세포주)에 대한 본 발명의 관찰을 뒷받침한다. 인간 췌장 조직의 US28-13-5G6-1D3 Ab로의 IHC 염색은 HCMV 감염된 췌장 조직에 대한 특이적 염색 및 HCMV 비감염된 췌장 조직에 대한 음성 염색을 보여준다(도 20).
인간 심장 조직에 대한 IHC
1:400 농도에서 면역조직화학으로 13-5G6-1D3의 염색에 대해 인간 심장 조직 샘플을 연구하였다. 면역조직화학은 인간 심장 근육 조직에서 13-5G6-1D3의 임의의 일반적인 표적외 결합을 보이지 않았다(도 19 b). 동일한 근육 조직 또한 HCMV DNA에 대해 음성이었다(데이터는 제시되지 않음). 13-5G6-1D3으로의 염색은 음성 IgG 항체 대조군으로의 염색과 유사하였다. 인간 악성 크롬친화세포종 종양을 HCMV 감염에 대한 양성 대조군으로서 검정에서 사용하였다. 이는 심장 샘플과 동일한 TMA 플레이트에 위치하고 13-5G6-1D3 항체에 대해 양성 염색을 보였다(도 19 b). ISH 대조군은 또한 동일한 생검에서 종양 세포의 핵에서 전형적인 HCMV DNA 염색을 보였으며 이는 양성 대조군에서 잠복성 HCMV 감염의 존재를 확인하였다(도 19 b).
이들 데이터는 항체 US28-13-5G6-1D3이 생상적 및 잠복성 HCMV 감염된 세포 및 인간 조직 둘 다에 특이적으로 결합하고 건강한 인간 세포 및 조직의 표면에 결합하지 않음을 입증한다. 양성 및 음성 결과는 ISH 분석에 의한 MAB810 항체 및 HCMV DNA 대조군으로의 염색, 및 인간 IgG 항체로의 음성 대조군 염색과 같은 HCMV 감염에 대한 다른 독립적인 대리 마커에 의해 확인하였다.
실시예에 대한 참고문헌:
서열
표 1: Blast 검색에 따르면, HCMV 균주의 90%는 ECD 4D 변이체를 보여준다. 4N 변이체를 보여주는 균주는 하기에 나열되어 있다:
표 2: 잠재적인 US28 결합 항체의 표면 결합 특이성의 비교
비율은 *US28 음성 대조군 CHO 세포와 비교하여 CHO-US28-A1 세포; **De Groof 등 2019(상기)에 의해 보고된 바와 같은 US28 발현 HEK-293 대 Mock HEK-293 막; ***HCMV Ad169 감염된 MRC-5 세포 대 Mock MRC-5 세포에 대한 항체의 표면 결합에 기반한다. 1 초과의 값은 음성 대조군 세포보다 US28 발현 세포에 대한 더 높은 결합을 의미한다.
표 3: HCMV 균주 DB(서열번호: 5 / 수탁 번호 KT959235; 돌연변이는 굵은 글자로 표시됨)에 의해 암호화된 US28 단백질 구조, 및 상이한 HCMV 균주에 의해 암호화된 US28 단백질에서의 돌연변이:
(서열번호: 5)
SEQUENCE LISTING <110> Thelper AS <120> Therapeutic and Diagnostic Agents and Uses Thereof <130> THEBE/P78812PC <150> GB2101228.1 <151> 2021-01-29 <160> 178 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ECD1 of US28, HCMV strain DB <400> 1 Met Thr Pro Thr Thr Thr Thr Ala Glu Leu Thr Thr Glu Phe Asp Tyr 1 5 10 15 Asp Glu Ala Ala Thr Pro Cys Val Phe Thr Asp Val Leu Asn Gln Ser 20 25 30 Lys Pro Val Thr Leu 35 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ECD2 of US28, HCMV strain DB <400> 2 Gln Tyr Leu Leu Asp His Asn Ser Leu Ala Ser 1 5 10 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ECD3 of US28, HCMV strain DB <400> 3 Thr Lys Lys Asn Asn Gln Cys Met Thr Asp Tyr Asp Tyr Leu Glu Val 1 5 10 15 Ser <210> 4 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ECD4 of US28, HCMV strain DB <400> 4 Val Asp Thr Leu Lys Leu Leu Lys Trp Ile Ser Ser Ser Cys Glu Phe 1 5 10 15 Glu Arg Ser Leu Lys Arg Ala Leu 20 <210> 5 <211> 354 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> US28, HCMV strain DB <400> 5 Met Thr Pro Thr Thr Thr Thr Ala Glu Leu Thr Thr Glu Phe Asp Tyr 1 5 10 15 Asp Glu Ala Ala Thr Pro Cys Val Phe Thr Asp Val Leu Asn Gln Ser 20 25 30 Lys Pro Val Thr Leu Phe Leu Tyr Gly Val Val Phe Leu Phe Gly Ser 35 40 45 Ile Gly Asn Phe Leu Val Ile Phe Thr Ile Thr Trp Arg Arg Arg Ile 50 55 60 Gln Cys Ser Gly Asp Val Tyr Phe Ile Asn Leu Ala Ala Ala Asp Leu 65 70 75 80 Leu Phe Val Cys Thr Leu Pro Leu Trp Met Gln Tyr Leu Leu Asp His 85 90 95 Asn Ser Leu Ala Ser Val Pro Cys Thr Leu Leu Thr Ala Cys Phe Tyr 100 105 110 Val Ala Met Phe Ala Ser Leu Cys Phe Ile Thr Glu Ile Ala Leu Asp 115 120 125 Arg Tyr Tyr Ala Ile Val Tyr Met Arg Tyr Arg Pro Val Lys Gln Ala 130 135 140 Cys Leu Phe Ser Ile Phe Trp Trp Ile Phe Ala Val Ile Ile Ala Ile 145 150 155 160 Pro His Phe Met Val Val Thr Lys Lys Asn Asn Gln Cys Met Thr Asp 165 170 175 Tyr Asp Tyr Leu Glu Val Ser Tyr Pro Ile Ile Leu Asn Val Glu Leu 180 185 190 Met Leu Gly Ala Phe Val Ile Pro Leu Ser Val Ile Ser Tyr Cys Tyr 195 200 205 Tyr Arg Ile Ser Arg Ile Val Ala Val Ser Gln Ser Arg His Lys Gly 210 215 220 Arg Ile Val Arg Val Leu Ile Ala Val Val Leu Val Phe Ile Ile Phe 225 230 235 240 Trp Leu Pro Tyr His Leu Thr Leu Phe Val Asp Thr Leu Lys Leu Leu 245 250 255 Lys Trp Ile Ser Ser Ser Cys Glu Phe Glu Arg Ser Leu Lys Arg Ala 260 265 270 Leu Ile Leu Thr Glu Ser Leu Ala Phe Cys His Cys Cys Leu Asn Pro 275 280 285 Leu Leu Tyr Val Phe Val Gly Thr Lys Phe Arg Gln Glu Leu His Cys 290 295 300 Leu Leu Ala Glu Phe Arg Gln Arg Leu Phe Ser Arg Asp Val Ser Trp 305 310 315 320 Tyr His Ser Met Ser Phe Ser Arg Arg Ser Ser Pro Ser Arg Arg Glu 325 330 335 Thr Ser Ser Asp Thr Leu Ser Asp Glu Val Cys Arg Val Ser Gln Ile 340 345 350 Ile Pro <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ECD3 4N variant group of HCMV strains <400> 6 Thr Lys Lys Asn Asn Gln Cys Met Thr Asp Tyr Asp Tyr Leu Glu Val 1 5 10 15 Ser <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ECD3 4D variant group of HCMV strains <400> 7 Thr Lys Lys Asp Asn Gln Cys Met Thr Asp Tyr Asp Tyr Leu Glu Val 1 5 10 15 Ser <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR1 sequence of 1D3 <400> 8 Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr 1 5 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR2 sequence of 1D3 <400> 9 Ile Arg Ser Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr 1 5 10 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR3 sequence of 1D3 <400> 10 Ala Arg Asp Glu Arg Arg Thr Ala Trp Leu Ala Tyr 1 5 10 <210> 11 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immature form of the recombinantly expressed VH sequence of 1D3, wherein positions 1-19 correspond to a leader sequence <400> 11 Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly 1 5 10 15 Ile Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu 50 55 60 Glu Trp Leu Gly Phe Ile Arg Ser Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu 65 70 75 80 Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95 Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ser Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Glu Arg Arg Thr Ala Trp Leu Ala 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 130 135 140 <210> 12 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mature form of VH sequence of 1D3, without the leader sequence <400> 12 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Ser Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Thr Tyr 85 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Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe 325 330 335 Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 340 345 350 Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile 355 360 365 Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys 370 375 380 Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp 385 390 395 400 Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp 405 410 415 Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser 420 425 430 Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly 435 440 445 Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 21 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Complete sequence of the light chain of 1D3 <400> 21 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Val Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile 35 40 45 Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Thr Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe 145 150 155 160 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp 165 170 175 Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp 180 185 190 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys 195 200 205 Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys 210 215 220 Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 235 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR1 sequence of 1D3 <400> 22 gggttcacct tcactgatta ctat 24 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR2 sequence of 1D3 <400> 23 attagaagca aagctaatgg ttacacaaca 30 <210> 24 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR3 sequence of 1D3 <400> 24 gcaagagatg agcgccgtac tgcctggctt gcttac 36 <210> 25 <211> 422 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Immature form of the recombinantly expressed VH sequence of 1D3 <400> 25 atgaagttgt ggctgaactg gattttcctt gtaacacttt taaatggtat ccagtgtgag 60 gtgaagctgg tggagtctgg aggaggcttg gtacagccgg ggggttctct gagactcgcc 120 tgtgcaactt ctgggttcac cttcactgat tactatatga gctgggtccg ccagcctcca 180 ggaaaggcac ttgagtggct gggttttatt agaagcaaag ctaatggtta cacaacagag 240 tacagtgcat ctgttaaggg tcggttcacc atctccagag ataattccca aagcatcctc 300 tatcttcaaa tgaacaccct gagatctgag gacagtgcca cttattactg tgcaagagat 360 gagcgccgta ctgcctggct tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 420 gc 422 <210> 26 <211> 365 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mature form of VH sequence of 1D3 <400> 26 gaggtgaagc tggtggagtc tggaggaggc ttggtacagc cggggggttc tctgagactc 60 gcctgtgcaa cttctgggtt caccttcact gattactata tgagctgggt ccgccagcct 120 ccaggaaagg cacttgagtg gctgggtttt attagaagca aagctaatgg ttacacaaca 180 gagtacagtg catctgttaa gggtcggttc accatctcca gagataattc ccaaagcatc 240 ctctatcttc aaatgaacac cctgagatct gaggacagtg ccacttatta ctgtgcaaga 300 gatgagcgcc gtactgcctg gcttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct 360 gcagc 365 <210> 27 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leader sequence of recombinantly expressed VH sequence of 1D3 <400> 27 atgaagttgt ggctgaactg gattttcctt gtaacacttt taaatggtat ccagtgt 57 <210> 28 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR1 sequence of 1D3 <400> 28 cagagcattg tacatagtaa tggaaacacc tat 33 <210> 29 <400> 29 000 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR3 sequence of 1D3 <400> 30 tttcaaggtt cacatgttcc cacgtggacg 30 <210> 31 <211> 396 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Immature form of the recombinantly expressed VL sequence of 1D3 <400> 31 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atggtctgga ttcctgcttc cagcagtgat 60 gttttgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120 tcttgcagat ctagtcagag cattgtacat agtaatggaa acacctattt agactggtac 180 cttcagaaac caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240 ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caaaatcagc 300 agagtggagg ctgaggatct gggagtttat tactgctttc aaggttcaca tgttcccacg 360 tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 396 <210> 32 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mature form of VL sequence of 1D3 <400> 32 gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagcattgta catagtaatg gaaacaccta tttagactgg 120 taccttcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttccc 300 acgtggacgt tcggtggagg caccaagctg gaaatcaaa 339 <210> 33 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leader sequence of recombinantly expressed VL sequence of 1D3 <400> 33 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atggtctgga ttcctgcttc cagcagt 57 <210> 34 <211> 1395 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Complete sequence of the heavy chain of 1D3 <400> 34 atgaagttgt ggctgaactg gattttcctt gtaacacttt taaatggtat ccagtgtgag 60 gtgaagctgg tggagtctgg aggaggcttg gtacagccgg ggggttctct gagactcgcc 120 tgtgcaactt ctgggttcac cttcactgat tactatatga gctgggtccg ccagcctcca 180 ggaaaggcac ttgagtggct gggttttatt agaagcaaag ctaatggtta cacaacagag 240 tacagtgcat ctgttaaggg tcggttcacc atctccagag ataattccca aagcatcctc 300 tatcttcaaa tgaacaccct gagatctgag gacagtgcca cttattactg tgcaagagat 360 gagcgccgta ctgcctggct tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 420 gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac 480 tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc 540 tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac 600 ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggcccag cgagaccgtc 660 acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgcccagg 720 gattgtggtt gtaagccttg catatgtaca gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc 780 cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg 840 gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag 900 gtgcacacag ctcagacgca accccgggag gagcagttca acagcacttt ccgctcagtc 960 agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc 1020 aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa aggcagaccg 1080 aaggctccac aggtgtacac cattccacct cccaaggagc agatggccaa ggataaagtc 1140 agtctgacct gcatgataac agacttcttc cctgaagaca ttactgtgga gtggcagtgg 1200 aatgggcagc cagcggagaa ctacaagaac actcagccca tcatggacac agatggctct 1260 tacttcatct acagcaagct caatgtgcag aagagcaact gggaggcagg aaatactttc 1320 acctgctctg tgttacatga gggcctgcac aaccaccata ctgagaagag cctctcccac 1380 tctcctggta aatga 1395 <210> 35 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Complete sequence of the light chain of 1D3 <400> 35 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atggtctgga ttcctgcttc cagcagtgat 60 gttttgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120 tcttgcagat ctagtcagag cattgtacat agtaatggaa acacctattt agactggtac 180 cttcagaaac caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240 ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caaaatcagc 300 agagtggagg ctgaggatct gggagtttat tactgctttc aaggttcaca tgttcccacg 360 tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaacggg ctgatgctgc accaactgta 420 tccatcttcc caccatccag tgagcagtta acatctggag gtgcctcagt cgtgtgcttc 480 ttgaacaact tctaccccaa agacatcaat gtcaagtgga agattgatgg cagtgaacga 540 caaaatggcg tcctgaacag ttggactgat caggacagca aagacagcac ctacagcatg 600 agcagcaccc tcacgttgac caaggacgag tatgaacgac ataacagcta tacctgtgag 660 gccactcaca agacatcaac ttcacccatt gtcaagagct tcaacaggaa tgagtgttag 720 <210> 36 <211> 354 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> US28 Toledo strain <400> 36 Met Thr Pro Thr Thr Thr Thr Ala Glu Leu Thr Thr Glu Phe Asp Tyr 1 5 10 15 Asp Glu Ala Ala Thr Pro Cys Val Phe Thr Asp Val Leu Asn Gln Ser 20 25 30 Lys Pro Val Thr Leu Phe Leu Tyr Gly Val Val Phe Leu Phe Gly Ser 35 40 45 Ile Gly Asn Phe Leu Val Ile Phe Thr Ile Thr Trp Arg Arg Arg Ile 50 55 60 Gln Cys Ser Gly Asp Val Tyr Phe Ile Asn Leu Ala Ala Ala Asp Leu 65 70 75 80 Leu Phe Val Cys Thr Leu Pro Leu Trp Met Gln Tyr Leu Leu Asp His 85 90 95 Asn Ser Leu Ala Ser Val Pro Cys Thr Leu Leu Thr Ala Cys Phe Tyr 100 105 110 Val Ala Met Phe Ala Ser Leu Cys Phe Ile Thr Glu Ile Ala Leu Asp 115 120 125 Arg Tyr Tyr Ala Ile Val Tyr Met Arg Tyr Arg Pro Val Lys Gln Ala 130 135 140 Cys Leu Phe Ser Ile Phe Trp Trp Ile Phe Ala Val Ile Ile Ala Ile 145 150 155 160 Pro His Phe Met Val Val Thr Lys Lys Asn Asn Gln Cys Met Thr Asp 165 170 175 Tyr Asp Tyr Leu Glu 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of an OKT3 scFv <400> 58 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Ser Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Glu Arg Arg Thr Ala Trp Leu Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 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Asp Ile Ala Ala Lys Arg 65 70 75 80 Val Tyr Leu Glu Met Asn Asp Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Lys Thr Gly Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 61 <211> 148 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VUN100 sequence with additional N-terminal signal peptide, and C-terminal Myc-6His tag <400> 61 Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val 1 5 10 15 Arg Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 20 25 30 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Val Ser Gly Pro Gly Leu Ile 35 40 45 Phe Lys Phe Thr Gly Val Ala Trp Tyr Arg Arg Gln Val Pro Gly Ala 50 55 60 Lys Arg Gly Leu Val Ala Leu Ile Thr Gly Asp Gly Ala Thr Arg Tyr 65 70 75 80 Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Ile Ala Ala 85 90 95 Lys Arg Val Tyr Leu Glu Met Asn Asp Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Lys Thr Gly Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His 130 135 140 His His His His 145 <210> 62 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VUN100b <400> 62 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Val Ser Gly Pro Gly Leu Ile Phe Lys 20 25 30 Phe Thr Gly Val Ala Trp Tyr Arg Arg Gln Val Pro Gly Ala Lys Arg 35 40 45 Gly Leu Val Ala Leu Ile Thr Gly Asp Gly Ala Thr Arg Tyr Gly Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Ile Ala Ala Lys Arg 65 70 75 80 Val Tyr Leu Glu Met Asn Asp Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Lys Thr Gly Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 145 150 155 160 Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Val Ser Gly Pro Gly Leu Ile Phe Lys 165 170 175 Phe Thr Gly Val Ala Trp Tyr Arg Arg Gln Val Pro Gly Ala Lys Arg 180 185 190 Gly Leu Val Ala Leu Ile Thr Gly Asp Gly Ala Thr Arg Tyr Gly Asp 195 200 205 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Ile Ala Ala Lys Arg 210 215 220 Val Tyr Leu Glu Met Asn Asp Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr 225 230 235 240 Tyr Cys Lys Thr Gly Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val 245 250 255 Ser Ser <210> 63 <211> 292 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VUN100b with additional N-terminal signal peptide, and C-terminal Myc-6His tag <400> 63 Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val 1 5 10 15 Arg Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 20 25 30 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Val Ser Gly Pro Gly Leu Ile 35 40 45 Phe Lys Phe Thr Gly Val Ala Trp Tyr Arg Arg Gln Val Pro Gly Ala 50 55 60 Lys Arg Gly Leu Val Ala Leu Ile Thr Gly Asp Gly Ala Thr Arg Tyr 65 70 75 80 Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Ile Ala Ala 85 90 95 Lys Arg Val Tyr Leu Glu Met Asn Asp Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Lys Thr Gly Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160 Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 165 170 175 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Val Ser Gly Pro Gly Leu Ile 180 185 190 Phe Lys Phe Thr Gly Val Ala Trp Tyr Arg Arg Gln Val Pro Gly Ala 195 200 205 Lys Arg Gly Leu Val Ala Leu Ile Thr Gly Asp Gly Ala Thr Arg Tyr 210 215 220 Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Ile Ala Ala 225 230 235 240 Lys Arg Val Tyr Leu Glu Met Asn Asp Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala 245 250 255 Val Tyr Tyr Cys Lys Thr Gly Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val 260 265 270 Thr Val Ser Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His 275 280 285 His His His His 290 <210> 64 <400> 64 000 <210> 65 <211> 423 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Immature form of the recombinantly expressed VH sequence of 1G9 <400> 65 atgaagttgt ggctgaactg gattttcctt gtaacacttt taaatggtat ccagtgtgaa 60 gtgaagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgaagcctg gagggtccct gaaactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac tttcagtagc tatgccatgt cttgggttcg ccagactcca 180 gagaagaggc tggagtgggt cgcatccatt agtagtggtg gtagcaccta ctatccagac 240 agtgtgaagg gccgattcac catctccaga gataatgcca ggaacatcct gtacctgcaa 300 atgagcagtc tgaggtctga ggacacggcc atgtattact gtgcaagagg cgggtctact 360 atgattacga cggggctggg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct 420 gca 423 <210> 66 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mature form of VH sequence of 1G9 <400> 66 gaagtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcatcc attagtagtg gtggtagcac ctactatcca 180 gacagtgtga agggccgatt caccatctcc agagataatg ccaggaacat cctgtacctg 240 caaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccatgtatt actgtgcaag aggcgggtct 300 actatgatta cgacggggct ggggtttgct tactggggcc aagggactct ggtcactgtc 360 tctgca 366 <210> 67 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immature form of the recombinantly expressed VH sequence of 1G9, wherein positions 1-19 correspond to a leader sequence <400> 67 Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly 1 5 10 15 Ile Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp 65 70 75 80 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile 85 90 95 Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Ser Thr Met Ile Thr Thr Gly Leu Gly Phe 115 120 125 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 130 135 140 <210> 68 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mature form of VH sequence of 1G9, without the leader sequence <400> 68 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Gly Ser Thr Met Ile Thr Thr Gly Leu Gly Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 69 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Immature form of the recombinantly expressed VL sequence of 1G9 <400> 69 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atggtctgga ttcctgcttc cagcagtcaa 60 attgttctca cccagtctcc agcaatcatg tctgcatctc caggggagaa ggtcaccatg 120 acctgcagtg ccagctcaag tgtaagttac atgcactggt accagcagaa gtcaggcacc 180 tcccccaaaa gatggattta tgacacatcc aaactggctt ctggagtccc tgctcgcttc 240 agtggcagtg ggtctgggac ctcttactct ctcacaatca gcagcatgga ggctgaagat 300 gctgccactt attactgcca gcagtggagt agtaacccac ccctcacgtt cggtgctggg 360 accaagctgg agctgaaa 378 <210> 70 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mature form of VL sequence of 1G9 <400> 70 caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 120 acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc cacccctcac gttcggtgct 300 gggaccaagc tggagctgaa a 321 <210> 71 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immature form of the recombinantly expressed VL sequence of 1G9, wherein positions 1-19 correspond to a leader sequence <400> 71 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Val Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ser Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala 20 25 30 Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val 35 40 45 Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg 50 55 60 Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met 85 90 95 Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn 100 105 110 Pro Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 115 120 125 <210> 72 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mature form of VL sequence of 1G9, without the leader sequence <400> 72 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 73 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR1 sequence of 1G9, 1E8 <400> 73 agctatgcca tgtct 15 <210> 74 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR2 sequence of 1G9 <400> 74 tccattagta gtggtggtag cacctactat ccagacagtg tgaagggc 48 <210> 75 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR3 sequence of 1G9 <400> 75 ggcgggtcta ctatgattac gacggggctg gggtttgctt ac 42 <210> 76 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR1 sequence of 1G9, 1E8 <400> 76 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 77 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR2 sequence of 1G9 <400> 77 Ser Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 78 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR3 sequence of 1G9 <400> 78 Gly Gly Ser Thr Met Ile Thr Thr Gly Leu Gly Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 79 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR1 sequence of 1G9, 1E8 <400> 79 agtgccagct caagtgtaag ttacatgcac 30 <210> 80 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR2 sequence of 1G9, 1C10, 1A10 <400> 80 gacacatcca aactggcttc t 21 <210> 81 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR3 sequence of 1G9 <400> 81 cagcagtgga gtagtaaccc acccctcacg 30 <210> 82 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR1 sequence of 1G9, 1E8 <400> 82 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His 1 5 10 <210> 83 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR2 sequence of 1G9, 1C10, 1A10 <400> 83 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 84 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR3 sequence of 1G9 <400> 84 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Leu Thr 1 5 10 <210> 85 <211> 420 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Immature form of the recombinantly expressed VH sequence of 1E8 <400> 85 atgaagttgt ggctgaactg gattttcctt gtaacacttt taaatggtat ccagtgtgaa 60 gtgaagctgg tggagtctgg gggagactta gtgaagcctg gagggtccct gaaactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac tttcagtagc tatgccatgt cttgggttcg ccagactcca 180 gagaagaggc tggagtgggt cgcatccatt agtagtggtg gtagaaccta ctatccagac 240 agtgtgaagg gccgattcac catctccaga gataatgcca ggaacatcct gtacctgcaa 300 atgagcagtc tgaggtctga agacacggcc atctattact gtgcacgagg cgggactcgt 360 cattcctacg gcaacgggtt tgactactgg ggccaaggca ccactctcac agtctcctca 420 <210> 86 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mature form of VH sequence of 1E8 <400> 86 gaagtgaagc tggtggagtc tgggggagac ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcatcc attagtagtg gtggtagaac ctactatcca 180 gacagtgtga agggccgatt caccatctcc agagataatg ccaggaacat cctgtacctg 240 caaatgagca gtctgaggtc tgaagacacg gccatctatt actgtgcacg aggcgggact 300 cgtcattcct acggcaacgg gtttgactac tggggccaag gcaccactct cacagtctcc 360 tca 363 <210> 87 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immature form of the recombinantly expressed VH sequence of 1E8, wherein positions 1-19 correspond to a leader sequence <400> 87 Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly 1 5 10 15 Ile Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp 65 70 75 80 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile 85 90 95 Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Thr Arg His Ser Tyr Gly Asn Gly Phe Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 88 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mature form of VH sequence of 1E8, without the leader sequence <400> 88 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Gly Thr Arg His Ser Tyr Gly Asn Gly Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 89 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Immature form of the recombinantly expressed VL sequence of 1E8 <400> 89 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atggtctgga ttcctgcttc cagcagtcaa 60 attgttctct cccagtctcc aacaatcatg tctgcatctc caggggagaa ggtcaccatg 120 acctgcagtg ccagctcaag tgtaagttac atgcactggt accagcagaa gtcaggcacc 180 tcccccaaaa gatggattta tgactcatcc aaactggctt ctggagtccc tgctcgcttc 240 agtggcagtg ggtctgggac ctcttactct ctcacaatca gcagcatgga ggctgaagat 300 gctgccactt attactgcca gcagtggact agtaacccac ccatcacgtt cggtgctggg 360 accaagctgg agctgaaa 378 <210> 90 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mature form of VL sequence of 1E8 <400> 90 caaattgttc tctcccagtc tccaacaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 120 acctccccca aaagatggat ttatgactca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg actagtaacc cacccatcac gttcggtgct 300 gggaccaagc tggagctgaa a 321 <210> 91 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immature form of the recombinantly expressed VL sequence of 1E8, wherein positions 1-19 correspond to a leader sequence <400> 91 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Val Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ser Ser Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Thr Ile Met Ser Ala 20 25 30 Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val 35 40 45 Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg 50 55 60 Trp Ile Tyr Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met 85 90 95 Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn 100 105 110 Pro Pro Ile Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 115 120 125 <210> 92 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mature form of VL sequence of 1E8, without the leader sequence <400> 92 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Thr Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 93 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR2 sequence of 1E8 <400> 93 tccattagta gtggtggtag aacctactat ccagacagtg tgaagggc 48 <210> 94 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR3 sequence of 1E8 <400> 94 ggcgggactc gtcattccta cggcaacggg tttgactac 39 <210> 95 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR2 sequence of 1E8 <400> 95 Ser Ile Ser Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 96 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR3 sequence of 1E8 <400> 96 Gly Gly Thr Arg His Ser Tyr Gly Asn Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 97 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR2 sequence of 1E8 <400> 97 gactcatcca aactggcttc t 21 <210> 98 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR3 sequence of 1E8 <400> 98 cagcagtgga ctagtaaccc acccatcacg 30 <210> 99 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR2 sequence of 1E8 <400> 99 Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 100 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR3 sequence of 1E8 <400> 100 Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Ile Thr 1 5 10 <210> 101 <211> 420 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Immature form of the recombinantly expressed VH sequence of 1C10 <400> 101 atgaagttgt ggctgaactg gattttcctt gtaacacttt taaatggtat ccagtgtgaa 60 gtgaaactgg ttgagtctgg gggagtctta gtgaagcctg gagggtccct gaaattttcc 120 tgtgcagcct ctggattcac tttcagtagc catgccttgt cttgggttcg ccagactcca 180 gagaagagac tggagtgggt cgcatccatt agtagtcgtg gtcgaaccta ctatccagac 240 agtgtaaagg gccgattcac cgtctccaga gataatgcca ggaacatcct gtatctgcaa 300 gtgagcagtc tgaggtctga ggacacggcc atgtattatt gtacaagagg cgggactcat 360 tattcctacg gcaacggttt tgacttctgg ggccaaggca ccactctcac agtctcctca 420 <210> 102 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mature form of VH sequence of 1C10 <400> 102 gaagtgaaac tggttgagtc tgggggagtc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaattt 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agccatgcct tgtcttgggt tcgccagact 120 ccagagaaga gactggagtg ggtcgcatcc attagtagtc gtggtcgaac ctactatcca 180 gacagtgtaa agggccgatt caccgtctcc agagataatg ccaggaacat cctgtatctg 240 caagtgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccatgtatt attgtacaag aggcgggact 300 cattattcct acggcaacgg ttttgacttc tggggccaag gcaccactct cacagtctcc 360 tca 363 <210> 103 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immature form of the recombinantly expressed VH sequence of 1C10, wherein positions 1-19 correspond to a leader sequence <400> 103 Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly 1 5 10 15 Ile Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Val Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Phe Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser His Ala Leu Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Arg Gly Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp 65 70 75 80 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile 85 90 95 Leu Tyr Leu Gln Val Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr 100 105 110 Tyr Cys Thr Arg Gly Gly Thr His Tyr Ser Tyr Gly Asn Gly Phe Asp 115 120 125 Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 104 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mature form of VH sequence of 1C10, without the leader sequence <400> 104 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Val Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Phe Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His 20 25 30 Ala Leu Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Ser Arg Gly Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Val Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95 Arg Gly Gly Thr His Tyr Ser Tyr Gly Asn Gly Phe Asp Phe Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 105 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Immature form of the recombinantly expressed VL sequence of 1C10 <400> 105 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atggtctgga ttcctgcttc cagcagtcaa 60 attgttctca cccagtctcc agcaatcatg tctgcatctc caggggagaa ggtcaccatg 120 acctgcagtg tcagctcaag tgttagttac atgcactggt accagcagaa gtcaggcacc 180 tcccccaaaa gatggattta tgacacatcc aaactggctt ctggagtccc tgctcgcttc 240 agtggcagtg ggtctgggac ctcttactct ctcacaatca gcaccatgga ggctgaagat 300 gctgccactt attactgcca gcagtggagt aataacccac ccatcacgtt cggtgctggg 360 accaagctgg aactgaaa 378 <210> 106 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mature form of VL sequence of 1C10 <400> 106 caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 atgacctgca gtgtcagctc aagtgttagt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 120 acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcaccat ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtaataacc cacccatcac gttcggtgct 300 gggaccaagc tggaactgaa a 321 <210> 107 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immature form of the recombinantly expressed VL sequence of 1C10, wherein positions 1-19 correspond to a leader sequence <400> 107 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Val Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ser Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala 20 25 30 Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Val 35 40 45 Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg 50 55 60 Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Thr Met 85 90 95 Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asn Asn 100 105 110 Pro Pro Ile Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 115 120 125 <210> 108 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mature form of VL sequence of 1C10, without the leader sequence <400> 108 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Thr Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asn Asn Pro Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 109 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR1 sequence of 1C10, 1A10 <400> 109 agccatgcct tgtct 15 <210> 110 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR2 sequence of 1C10, 1A10 <400> 110 tccattagta gtcgtggtcg aacctactat ccagacagtg taaagggc 48 <210> 111 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR3 sequence of 1C10, 1A10 <400> 111 ggcgggactc attattccta cggcaacggt tttgacttc 39 <210> 112 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR1 sequence of 1C10, 1A10 <400> 112 Ser His Ala Leu Ser 1 5 <210> 113 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR2 sequence of 1C10, 1A10 <400> 113 Ser Ile Ser Ser Arg Gly Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 114 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR3 sequence of 1C10, 1A10 <400> 114 Gly Gly Thr His Tyr Ser Tyr Gly Asn Gly Phe Asp Phe 1 5 10 <210> 115 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR1 sequence of 1C10, 1A10 <400> 115 agtgtcagct caagtgttag ttacatgcac 30 <210> 116 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR3 sequence of 1C10, 1A10 <400> 116 cagcagtgga gtaataaccc acccatcacg 30 <210> 117 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR1 sequence of 1C10, 1A10 <400> 117 Ser Val Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His 1 5 10 <210> 118 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR3 sequence of 1C10, 1A10 <400> 118 Gln Gln Trp Ser Asn Asn Pro Pro Ile Thr 1 5 10 <210> 119 <211> 420 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Immature form of the recombinantly expressed VH sequence of 1A10 <400> 119 atgaagttgt ggctgaactg gattttcctt gtaacacttt taaatggtat ccagtgtgaa 60 gtgaaactgg ttgagtctgg gggagtctta gtgaagcctg gagggtccct gaaattttcc 120 tgtgcagcct ctggattcac tctcagtagc catgccttgt cttgggttcg ccagactcca 180 gagaagagac tggagtgggt cgcatccatt agtagtcgtg gtcgaaccta ctatccagac 240 agtgtaaagg gccgattcac cgtctccaga gataatgcca ggaacatcct gtatctgcaa 300 gtgagcagtc tgaggtctga ggacacggcc atgtattatt gtacaagagg cgggactcat 360 tattcctacg gcaacggttt tgacttctgg ggccaaggca ccactctcac agtctcctca 420 <210> 120 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mature form of VH sequence of 1A10 <400> 120 gaagtgaaac tggttgagtc tgggggagtc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaattt 60 tcctgtgcag cctctggatt cactctcagt agccatgcct tgtcttgggt tcgccagact 120 ccagagaaga gactggagtg ggtcgcatcc attagtagtc gtggtcgaac ctactatcca 180 gacagtgtaa agggccgatt caccgtctcc agagataatg ccaggaacat cctgtatctg 240 caagtgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccatgtatt attgtacaag aggcgggact 300 cattattcct acggcaacgg ttttgacttc tggggccaag gcaccactct cacagtctcc 360 tca 363 <210> 121 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immature form of the recombinantly expressed VH sequence of 1A10, wherein positions 1-19 correspond to a leader sequence <400> 121 Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly 1 5 10 15 Ile Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Val Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Phe Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu 35 40 45 Ser Ser His Ala Leu Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Arg Gly Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp 65 70 75 80 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile 85 90 95 Leu Tyr Leu Gln Val Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr 100 105 110 Tyr Cys Thr Arg Gly Gly Thr His Tyr Ser Tyr Gly Asn Gly Phe Asp 115 120 125 Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 122 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mature form of VH sequence of 1A10, without the leader sequence <400> 122 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Val Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Phe Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ser His 20 25 30 Ala Leu Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Ser Arg Gly Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Val Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95 Arg Gly Gly Thr His Tyr Ser Tyr Gly Asn Gly Phe Asp Phe Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 123 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Immature form of the recombinantly expressed VL sequence of 1A10 <400> 123 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atggtctgga ttcctgcttc cagcagtcaa 60 attgttctca cccagtctcc agcaatcatg tctgcatctc caggggagaa ggtcaccatg 120 acctgcagtg tcagctcaag tgttagttac atgcactggt accagcagaa gtcaggcacc 180 tcccccaaaa gatggattta tgacacatcc aaactggctt ctggagtccc tgctcgcttc 240 agtggcagtg ggtctgggac ctcttactct ctcacaatca gcaccatgga ggctgaagat 300 gctgccactt attactgcca gcagtggagt aataacccac ccatcacgtt cggtgctggg 360 accaagctgg aactgaaa 378 <210> 124 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mature form of VL sequence of 1A10 <400> 124 caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 atgacctgca gtgtcagctc aagtgttagt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 120 acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcaccat ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtaataacc cacccatcac gttcggtgct 300 gggaccaagc tggaactgaa a 321 <210> 125 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immature form of the recombinantly expressed VL sequence of 1A10, wherein positions 1-19 correspond to a leader sequence <400> 125 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Val Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ser Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala 20 25 30 Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Val 35 40 45 Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg 50 55 60 Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Thr Met 85 90 95 Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asn Asn 100 105 110 Pro Pro Ile Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 115 120 125 <210> 126 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mature form of VL sequence of 1A10, without the leader sequence <400> 126 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Thr Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asn Asn Pro Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 127 <211> 354 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Full sequence of US28 as encoded by HCMV strain BL (Accession number MW980585.1) <400> 127 Met Thr Pro Thr Thr Thr Thr Ala Glu Leu Thr Thr Glu Phe Asp Tyr 1 5 10 15 Asp Glu Asp Ala Ala Pro Cys Val Leu Thr Asp Val Leu Asn Gln Ser 20 25 30 Lys Pro Val Thr Leu Phe Leu Tyr Gly Val Val Phe Leu Phe Gly Ser 35 40 45 Ile Gly Asn Phe Leu Val Ile Phe Thr Ile Thr Trp Arg Arg Arg Ile 50 55 60 Gln Cys Ser Gly Asp Val Tyr Phe Ile Asn Leu Ala Ala Ala Asp Leu 65 70 75 80 Leu Phe Val Cys Thr Leu Pro Leu Trp Met Gln Tyr Leu Leu Asp His 85 90 95 Asn Ser Leu Ala Ser Val Pro Cys Thr Leu Leu Thr Ala Cys Phe Tyr 100 105 110 Val Ala Met Phe Ala Ser Leu Cys Phe Ile Thr Glu Ile Ala Leu Asp 115 120 125 Arg Tyr Tyr Ala Ile Val Tyr Met Arg Tyr Arg Pro Val Lys Gln Ala 130 135 140 Cys Leu Phe Ser Ile Phe Trp Trp Ile Phe Ala Val Ile Ile Ala Ile 145 150 155 160 Pro His Phe Met Val Val Thr Lys Lys Asp Asn Gln Cys Met Thr Asp 165 170 175 Tyr Asp Tyr Leu Glu Val Ser Tyr Pro Ile Ile Leu Asn Val Glu Leu 180 185 190 Met Leu Gly Ala Phe Val Ile Pro Leu Ser Val Ile Ser Tyr Cys Tyr 195 200 205 Tyr Arg Ile Ser Arg Ile Val Ala Val Ser Gln Ser Arg His Lys Gly 210 215 220 Arg Ile Val Arg Val Leu Ile Ala Val Val Leu Val Phe Ile Ile Phe 225 230 235 240 Trp Leu Pro Tyr His Leu Thr Leu Phe Leu Asp Thr Leu Lys Leu Leu 245 250 255 Lys Trp Ile Ser Ser Ser Cys Glu Phe Glu Lys Ser Leu Lys Arg Ala 260 265 270 Leu Ile Leu Thr Glu Ser Leu Ala Phe Cys His Cys Cys Leu Asn Pro 275 280 285 Leu Leu Tyr Val Phe Val Gly Thr Lys Phe Arg Gln Glu Leu His Cys 290 295 300 Leu Leu Ala Glu Phe Arg Gln Arg Leu Phe Ser Arg Asp Val Ser Trp 305 310 315 320 Tyr His Ser Met Ser Phe Ser Arg Arg Ser Ser Pro Ser Arg Arg Glu 325 330 335 Thr Ser Ser Asp Thr Leu Ser Asp Glu Ala Cys Arg Val Ser Gln Ile 340 345 350 Ile Pro <210> 128 <400> 128 000 <210> 129 <400> 129 000 <210> 130 <400> 130 000 <210> 131 <400> 131 000 <210> 132 <400> 132 000 <210> 133 <400> 133 000 <210> 134 <400> 134 000 <210> 135 <400> 135 000 <210> 136 <400> 136 000 <210> 137 <400> 137 000 <210> 138 <400> 138 000 <210> 139 <400> 139 000 <210> 140 <400> 140 000 <210> 141 <400> 141 000 <210> 142 <400> 142 000 <210> 143 <400> 143 000 <210> 144 <400> 144 000 <210> 145 <400> 145 000 <210> 146 <400> 146 000 <210> 147 <211> 1396 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Complete sequence of the heavy chain of 1G9 <400> 147 atgaagttgt ggctgaactg gattttcctt gtaacacttt taaatggtat ccagtgtgaa 60 gtgaagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgaagcctg gagggtccct gaaactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac tttcagtagc tatgccatgt cttgggttcg ccagactcca 180 gagaagaggc tggagtgggt cgcatccatt agtagtggtg gtagcaccta ctatccagac 240 agtgtgaagg gccgattcac catctccaga gataatgcca ggaacatcct gtacctgcaa 300 atgagcagtc tgaggtctga ggacacggcc atgtattact gtgcaagagg cgggtctact 360 atgattacga cggggctggg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct 420 gcacaaaacg acacccccat ctgtctatcc actggcccct ggatctgctg cccaaactaa 480 ctccatggtg accctgggat gcctggtcaa gggctatttc cctgagccag tgacagtgac 540 ctggaactct ggatccctgt ccagcggtgt gcacaccttc ccagctgtcc tgcagtctga 600 cctctacact ctgagcagct cagtgactgt cccctccagc acctggccca gcgagaccgt 660 cacctgcaac gttgcccacc cggccagcag caccaaggtg gacaagaaaa ttgtgcccag 720 ggattgtggt tgtaagcctt gcatatgtac agtcccagaa gtatcatctg tcttcatctt 780 ccccccaaag cccaaggatg tgctcaccat tactctgact cctaaggtca cgtgtgttgt 840 ggtagacatc agcaaggatg atcccgaggt ccagttcagc tggtttgtag atgatgtgga 900 ggtgcacaca gctcagacgc aaccccggga ggagcagttc aacagcactt tccgctcagt 960 cagtgaactt cccatcatgc accaggactg gctcaatggc aaggagttca aatgcagggt 1020 caacagtgca gctttccctg cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aaggcagacc 1080 gaaggctcca caggtgtaca ccattccacc tcccaaggag cagatggcca aggataaagt 1140 cagtctgacc tgcatgataa cagacttctt ccctgaagac attactgtgg agtggcagtg 1200 gaatgggcag ccagcggaga actacaagaa cactcagccc atcatggaca cagatggctc 1260 ttacttcatc tacagcaagc tcaatgtgca gaagagcaac tgggaggcag gaaatacttt 1320 cacctgctct gtgttacatg agggcctgca caaccaccat actgagaaga gcctctccca 1380 ctctcctggt aaatga 1396 <210> 148 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Complete sequence of the light chain of 1G9 <400> 148 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atggtctgga ttcctgcttc cagcagtcaa 60 attgttctca cccagtctcc agcaatcatg tctgcatctc caggggagaa ggtcaccatg 120 acctgcagtg ccagctcaag tgtaagttac atgcactggt accagcagaa gtcaggcacc 180 tcccccaaaa gatggattta tgacacatcc aaactggctt ctggagtccc tgctcgcttc 240 agtggcagtg ggtctgggac ctcttactct ctcacaatca gcagcatgga ggctgaagat 300 gctgccactt attactgcca gcagtggagt agtaacccac ccctcacgtt cggtgctggg 360 accaagctgg agctgaaacg ggctgatgct gcaccaactg tatccatctt cccaccatcc 420 agtgagcagt taacatctgg aggtgcctca gtcgtgtgct tcttgaacaa cttctacccc 480 aaagacatca atgtcaagtg gaagattgat ggcagtgaac gacaaaatgg cgtcctgaac 540 agttggactg atcaggacag caaagacagc acctacagca tgagcagcac cctcacgttg 600 accaaggacg agtatgaacg acataacagc tatacctgtg aggccactca caagacatca 660 acttcaccca ttgtcaagag cttcaacagg aatgagtgtt ag 702 <210> 149 <211> 465 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Complete sequence of the heavy chain of 1G9 <400> 149 Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly 1 5 10 15 Ile Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp 65 70 75 80 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile 85 90 95 Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Ser Thr Met Ile Thr Thr Gly Leu Gly Phe 115 120 125 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr 130 135 140 Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr 145 150 155 160 Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser 195 200 205 Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn 210 215 220 Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro 225 230 235 240 Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser 245 250 255 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr 260 265 270 Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp 275 280 285 Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr 290 295 300 Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser 305 310 315 320 Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 325 330 335 Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys 340 345 350 Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr 355 360 365 Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr 370 375 380 Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln 385 390 395 400 Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met 405 410 415 Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys 420 425 430 Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu 435 440 445 Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly 450 455 460 Lys 465 <210> 150 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Complete sequence of the light chain of 1G9 <400> 150 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Val Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ser Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala 20 25 30 Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val 35 40 45 Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln 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tttgtagatg atgtggaggt 900 gcacacagct cagacgcaac cccgggagga gcagttcaac agcactttcc gctcagtcag 960 tgaacttccc atcatgcacc aggactggct caatggcaag gagttcaaat gcagggtcaa 1020 cagtgcagct ttccctgccc ccatcgagaa aaccatctcc aaaaccaaag gcagaccgaa 1080 ggctccacag gtgtacacca ttccacctcc caaggagcag atggccaagg ataaagtcag 1140 tctgacctgc atgataacag acttcttccc tgaagacatt actgtggagt ggcagtggaa 1200 tgggcagcca gcggagaact acaagaacac tcagcccatc atggacacag atggctctta 1260 cttcatctac agcaagctca atgtgcagaa gagcaactgg gaggcaggaa atactttcac 1320 ctgctctgtg ttacatgagg gcctgcacaa ccaccatact gagaagagcc tctcccactc 1380 tcctggtaaa tga 1393 <210> 152 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Complete sequence of the light chain of 1E8 <400> 152 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atggtctgga ttcctgcttc cagcagtcaa 60 attgttctct cccagtctcc aacaatcatg tctgcatctc caggggagaa ggtcaccatg 120 acctgcagtg ccagctcaag tgtaagttac atgcactggt accagcagaa gtcaggcacc 180 tcccccaaaa gatggattta tgactcatcc aaactggctt ctggagtccc 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ctgcaacgtt gcccacccgg ccagcagcac caaggtggac aagaaaattg tgcccaggga 720 ttgtggttgt aagccttgca tatgtacagt cccagaagta tcatctgtct tcatcttccc 780 cccaaagccc aaggatgtgc tcaccattac tctgactcct aaggtcacgt gtgttgtggt 840 agacatcagc aaggatgatc ccgaggtcca gttcagctgg tttgtagatg atgtggaggt 900 gcacacagct cagacgcaac cccgggagga gcagttcaac agcactttcc gctcagtcag 960 tgaacttccc atcatgcacc aggactggct caatggcaag gagttcaaat gcagggtcaa 1020 cagtgcagct ttccctgccc ccatcgagaa aaccatctcc aaaaccaaag gcagaccgaa 1080 ggctccacag gtgtacacca ttccacctcc caaggagcag atggccaagg ataaagtcag 1140 tctgacctgc atgataacag acttcttccc tgaagacatt actgtggagt ggcagtggaa 1200 tgggcagcca gcggagaact acaagaacac tcagcccatc atggacacag atggctctta 1260 cttcatctac agcaagctca atgtgcagaa gagcaactgg gaggcaggaa atactttcac 1320 ctgctctgtg ttacatgagg gcctgcacaa ccaccatact gagaagagcc tctcccactc 1380 tcctggtaaa tga 1393 <210> 156 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Complete sequence of the light chain of 1C10 <400> 156 atgaagttgc 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tctatccact ggcccctgga tctgctgccc aaactaactc 480 catggtgacc ctgggatgcc tggtcaaggg ctatttccct gagccagtga cagtgacctg 540 gaactctgga tccctgtcca gcggtgtgca caccttccca gctgtcctgc agtctgacct 600 ctacactctg agcagctcag tgactgtccc ctccagcacc tggcccagcg agaccgtcac 660 ctgcaacgtt gcccacccgg ccagcagcac caaggtggac aagaaaattg tgcccaggga 720 ttgtggttgt aagccttgca tatgtacagt cccagaagta tcatctgtct tcatcttccc 780 cccaaagccc aaggatgtgc tcaccattac tctgactcct aaggtcacgt gtgttgtggt 840 agacatcagc aaggatgatc ccgaggtcca gttcagctgg tttgtagatg atgtggaggt 900 gcacacagct cagacgcaac cccgggagga gcagttcaac agcactttcc gctcagtcag 960 tgaacttccc atcatgcacc aggactggct caatggcaag gagttcaaat gcagggtcaa 1020 cagtgcagct ttccctgccc ccatcgagaa aaccatctcc aaaaccaaag gcagaccgaa 1080 ggctccacag gtgtacacca ttccacctcc caaggagcag atggccaagg ataaagtcag 1140 tctgacctgc atgataacag acttcttccc tgaagacatt actgtggagt ggcagtggaa 1200 tgggcagcca gcggagaact acaagaacac tcagcccatc atggacacag atggctctta 1260 cttcatctac agcaagctca atgtgcagaa gagcaactgg gaggcaggaa atactttcac 1320 ctgctctgtg ttacatgagg gcctgcacaa ccaccatact gagaagagcc tctcccactc 1380 tcctggtaaa tga 1393 <210> 160 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Complete sequence of the light chain of 1A10 <400> 160 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atggtctgga ttcctgcttc cagcagtcaa 60 attgttctca cccagtctcc agcaatcatg tctgcatctc caggggagaa ggtcaccatg 120 acctgcagtg tcagctcaag tgttagttac atgcactggt accagcagaa gtcaggcacc 180 tcccccaaaa gatggattta tgacacatcc aaactggctt ctggagtccc tgctcgcttc 240 agtggcagtg ggtctgggac ctcttactct ctcacaatca gcaccatgga ggctgaagat 300 gctgccactt attactgcca gcagtggagt aataacccac ccatcacgtt cggtgctggg 360 accaagctgg aactgaaacg ggctgatgct gcaccaactg tatccatctt cccaccatcc 420 agtgagcagt taacatctgg aggtgcctca gtcgtgtgct tcttgaacaa cttctacccc 480 aaagacatca atgtcaagtg gaagattgat ggcagtgaac gacaaaatgg cgtcctgaac 540 agttggactg atcaggacag caaagacagc acctacagca tgagcagcac cctcacgttg 600 accaaggacg agtatgaacg acataacagc tatacctgtg aggccactca caagacatca 660 acttcaccca ttgtcaagag cttcaacagg aatgagtgtt ag 702 <210> 161 <211> 464 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Complete sequence of the heavy chain of 1A10 <400> 161 Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly 1 5 10 15 Ile Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Val Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Phe Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu 35 40 45 Ser Ser His Ala Leu Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Arg Gly Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp 65 70 75 80 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile 85 90 95 Leu Tyr Leu Gln Val Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr 100 105 110 Tyr Cys Thr Arg Gly Gly Thr His Tyr Ser Tyr Gly Asn Gly Phe Asp 115 120 125 Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr 130 135 140 Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn 145 150 155 160 Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170 175 Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr 180 185 190 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val 195 200 205 Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val 210 215 220 Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg 225 230 235 240 Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser 245 250 255 Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu 260 265 270 Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro 275 280 285 Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala 290 295 300 Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val 305 310 315 320 Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe 325 330 335 Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 340 345 350 Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile 355 360 365 Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys 370 375 380 Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp 385 390 395 400 Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp 405 410 415 Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser 420 425 430 Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly 435 440 445 Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 162 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Complete sequence of the light chain of 1A10 <400> 162 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Val Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ser Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala 20 25 30 Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Val 35 40 45 Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg 50 55 60 Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Thr Met 85 90 95 Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asn Asn 100 105 110 Pro Pro Ile Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala 115 120 125 Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu 130 135 140 Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn 165 170 175 Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His 195 200 205 Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile 210 215 220 Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 <210> 163 <400> 163 000 <210> 164 <400> 164 000 <210> 165 <400> 165 000 <210> 166 <400> 166 000 <210> 167 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> X2 = Y or H; X4 = M or L <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Y or H <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> M or L <400> 167 Ser Xaa Ala Xaa Ser 1 5 <210> 168 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> X5 = G or R; X7 = S or R <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> G or R <220> <221> VARIANT <222> 7 <223> S or R <400> 168 Ser Ile Ser Ser Xaa Gly Xaa Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 169 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> X3 = S or T; X4 = T, R or H; X5 = M, H or Y; X6 = I or S; X7 = T or Y; X8 = T or G; X9 = G or N; X10 = L or blank; X13 = A or D; X14 = Y or F <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> S or T <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> T, R or H <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> M, H or Y <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> I or S <220> <221> VARIANT <222> 7 <223> T or Y <220> <221> VARIANT <222> 8 <223> T or G <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> G or N <220> <221> VARIANT <222> 10 <223> L or blank (also denoted as *) <220> <221> VARIANT <222> 13 <223> A or D <220> <221> VARIANT <222> 14 <223> Y or F <400> 169 Gly Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Phe Xaa Xaa 1 5 10 <210> 170 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> X2 = A or V <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> A or V <400> 170 Ser Xaa Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His 1 5 10 <210> 171 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> X2 = T or S <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> T or S <400> 171 Asp Xaa Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 172 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> X4 = S, T or blank; X7 = blank or N; X10 = I or L <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> S, T or blank (also denoted as *) <220> <221> VARIANT <222> 7 <223> N or blank (also denoted as *) <220> <221> VARIANT <222> 10 <223> I or L <400> 172 Gln Gln Trp Xaa Ser Asn Xaa Pro Pro Xaa Thr 1 5 10 <210> 173 <211> 353 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artifically mutated strain of US28 <400> 173 Met Thr Gln Thr Thr Thr Thr Glu Leu Thr Thr Glu Phe Asp Tyr Asp 1 5 10 15 Leu Gly Ala Ala Leu Cys Thr Leu Thr Asp Val Leu Asn Gln Ser Lys 20 25 30 Pro Ile Thr Leu Phe Leu Tyr Gly Val Val Phe Leu Phe Gly Ser Ile 35 40 45 Gly Asn Phe Leu Val Ile Phe Thr Ile Thr Trp Arg Arg Arg Ile Gln 50 55 60 Cys Ser Gly Asp Val Tyr Phe Ile Asn Leu Ala Ala Ala Asp Leu Leu 65 70 75 80 Phe Val Cys Thr Leu Pro Leu Trp Met Gln Tyr Leu Leu Asp His Asn 85 90 95 Ser Leu Ala Ser Val Pro Cys Thr Leu Leu Thr Ala Cys Phe Tyr Val 100 105 110 Ala Met Phe Ala Ser Leu Cys Phe Ile Thr Glu Ile Ala Leu Asp Arg 115 120 125 Tyr Tyr Ala Ile Val Tyr Met Arg Tyr Arg Pro Val Lys Gln Ala Cys 130 135 140 Leu Phe Ser Ile Phe Trp Trp Ile Phe Ala Val Ile Ile Ala Ile Pro 145 150 155 160 His Phe Met Val Val Thr Lys Lys Asp Asn Gln Cys Met Thr Asp Tyr 165 170 175 Asp Tyr Leu Glu Val Ser Tyr Pro Ile Ile Leu Asn Val Glu Leu Met 180 185 190 Leu Gly Ala Phe Val Ile Pro Leu Ser Val Ile Ser Tyr Cys Tyr Tyr 195 200 205 Arg Ile Ser Arg Ile Val Ala Val Ser Gln Ser Arg His Lys Gly Arg 210 215 220 Ile Val Arg Val Leu Ile Ala Val Val Leu Val Phe Ile Ile Phe Trp 225 230 235 240 Leu Pro Tyr His Leu Thr Leu Phe Leu Asp Thr Leu Lys Leu Leu Lys 245 250 255 Trp Ile Ser Ser Ser Cys Glu Ser Glu Lys Ser Leu Lys Arg Ala Leu 260 265 270 Ile Leu Thr Glu Ser Leu Ala Phe Cys His Cys Cys Leu Asn Pro Leu 275 280 285 Leu Tyr Val Phe Val Gly Thr Lys Phe Arg Gln Glu Leu His Cys Leu 290 295 300 Leu Ala Glu Phe Arg Gln Arg Leu Phe Ser Arg Asp Val Ser Trp Tyr 305 310 315 320 His Ser Met Ser Phe Ser Arg Arg Ser Ser Pro Ser Arg Arg Glu Thr 325 330 335 Ser Ser Asp Thr Leu Ser Asp Glu Val Cys Arg Val Ser Gln Ile Ile 340 345 350 Pro <210> 174 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Wherein X = G or R <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> G or R <400> 174 Ser Ile Ser Ser Xaa Gly Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 175 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> X3 = S or T; X4 = T, R or H; X5 = M, H or Y; X6 = I or S; X7 = T or Y; X8 = T or G; X9 = G or N; X12 = A or D; X13 = Y or F <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> S or T <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> T, R or H <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> M, H or Y <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> I or S <220> <221> VARIANT <222> 7 <223> T or Y <220> <221> VARIANT <222> 8 <223> T or G <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> G or N <220> <221> VARIANT <222> 12 <223> A or D <220> <221> VARIANT <222> 13 <223> Y or F <400> 175 Gly Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Phe Xaa Xaa 1 5 10 <210> 176 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> X4 = T or blank; X7 = blank or N; X10 = I or L <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> T or blank <220> <221> VARIANT <222> 7 <223> N or blank <220> <221> VARIANT <222> 10 <223> I or L <400> 176 Gln Gln Trp Xaa Ser Asn Xaa Pro Pro Xaa Thr 1 5 10 <210> 177 <211> 367 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> US28 fusion protein, comprising US28 sequence from HCMV TB40/E strain <400> 177 Met Thr Pro Thr Thr Thr Thr Thr Glu Leu Thr Thr Glu Phe Glu Tyr 1 5 10 15 Asp Leu Gly Ala Thr Pro Cys Thr Phe Thr Asp Val Leu Asn Gln Ser 20 25 30 Lys Pro Val Thr Leu Phe Leu Tyr Gly Val Val Phe Leu Phe Gly Ser 35 40 45 Val Gly Asn Phe Leu Val Ile Phe Thr Ile Thr Trp Arg Arg Arg Ile 50 55 60 Gln Cys Ser Gly Asp Val Tyr Phe Ile Asn Leu Ala Ala Ala Asp Leu 65 70 75 80 Leu Phe Val Cys Thr Leu Pro Leu Trp Met Gln Tyr Leu Leu Asp His 85 90 95 Asn Ser Leu Ala Ser Val Pro Cys Thr Leu Leu Thr Ala Cys Phe Tyr 100 105 110 Val Ala Met Phe Ala Ser Leu Cys Phe Ile Thr Glu Ile Ala Leu Asp 115 120 125 Arg Tyr Tyr Ala Ile Val Tyr Met Arg Tyr Arg Pro Val Lys Gln Ala 130 135 140 Cys Leu Phe Ser Ile Phe Trp Trp Ile Phe Ala Val Ile Ile Ala Ile 145 150 155 160 Pro His Phe Met Val Val Thr Lys Lys Asp Asn Gln Cys Met Thr Asp 165 170 175 Tyr Asp Tyr Leu Glu Val Ser Tyr Pro Ile Ile Leu Asn Val Glu Leu 180 185 190 Met Leu Gly Ala Phe Val Ile Pro Leu Ser Val Ile Ser Tyr Cys Tyr 195 200 205 Tyr Arg Ile Ser Arg Ile Val Ala Val Ser Gln Ser Arg His Lys Gly 210 215 220 Arg Ile Val Arg Val Leu Ile Ala Val Val Leu Val Phe Ile Ile Phe 225 230 235 240 Trp Leu Pro Tyr His Leu Thr Leu Phe Val Asp Thr Leu Lys Leu Leu 245 250 255 Lys Trp Ile Ser Ser Ser Cys Glu Phe Glu Arg Ser Leu Lys Arg Ala 260 265 270 Leu Ile Leu Thr Glu Ser Leu Ala Phe Cys His Cys Cys Leu Asn Pro 275 280 285 Leu Leu Tyr Val Phe Val Gly Thr Lys Phe Arg Gln Glu Leu His Cys 290 295 300 Leu Leu Ala Glu Phe Arg Gln Arg Leu Phe Ser Arg Asp Val Ser Trp 305 310 315 320 Tyr His Ser Met Ser Phe Ser Arg Arg Ser Ser Pro Ser Arg Arg Glu 325 330 335 Thr Ser Ser Asp Thr Leu Ser Asp Glu Val Cys Arg Val Ser Gln Ile 340 345 350 Ile Pro Ala Ala Ala Leu Glu Gly Ser His His His His His His 355 360 365 <210> 178 <211> 366 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> US28 fusion protein, comprising US28 sequence from HCMV mutated strain <400> 178 Met Thr Gln Thr Thr Thr Thr Glu Leu Thr Thr Glu Phe Asp Tyr Asp 1 5 10 15 Leu Gly Ala Ala Leu Cys Thr Leu Thr Asp Val Leu Asn Gln Ser Lys 20 25 30 Pro Ile Thr Leu Phe Leu Tyr Gly Val Val Phe Leu Phe Gly Ser Ile 35 40 45 Gly Asn Phe Leu Val Ile Phe Thr Ile Thr Trp Arg Arg Arg Ile Gln 50 55 60 Cys Ser Gly Asp Val Tyr Phe Ile Asn Leu Ala Ala Ala Asp Leu Leu 65 70 75 80 Phe Val Cys Thr Leu Pro Leu Trp Met Gln Tyr Leu Leu Asp His Asn 85 90 95 Ser Leu Ala Ser Val Pro Cys Thr Leu Leu Thr Ala Cys Phe Tyr Val 100 105 110 Ala Met Phe Ala Ser Leu Cys Phe Ile Thr Glu Ile Ala Leu Asp Arg 115 120 125 Tyr Tyr Ala Ile Val Tyr Met Arg Tyr Arg Pro Val Lys Gln Ala Cys 130 135 140 Leu Phe Ser Ile Phe Trp Trp Ile Phe Ala Val Ile Ile Ala Ile Pro 145 150 155 160 His Phe Met Val Val Thr Lys Lys Asp Asn Gln Cys Met Thr Asp Tyr 165 170 175 Asp Tyr Leu Glu Val Ser Tyr Pro Ile Ile Leu Asn Val Glu Leu Met 180 185 190 Leu Gly Ala Phe Val Ile Pro Leu Ser Val Ile Ser Tyr Cys Tyr Tyr 195 200 205 Arg Ile Ser Arg Ile Val Ala Val Ser Gln Ser Arg His Lys Gly Arg 210 215 220 Ile Val Arg Val Leu Ile Ala Val Val Leu Val Phe Ile Ile Phe Trp 225 230 235 240 Leu Pro Tyr His Leu Thr Leu Phe Leu Asp Thr Leu Lys Leu Leu Lys 245 250 255 Trp Ile Ser Ser Ser Cys Glu Ser Glu Lys Ser Leu Lys Arg Ala Leu 260 265 270 Ile Leu Thr Glu Ser Leu Ala Phe Cys His Cys Cys Leu Asn Pro Leu 275 280 285 Leu Tyr Val Phe Val Gly Thr Lys Phe Arg Gln Glu Leu His Cys Leu 290 295 300 Leu Ala Glu Phe Arg Gln Arg Leu Phe Ser Arg Asp Val Ser Trp Tyr 305 310 315 320 His Ser Met Ser Phe Ser Arg Arg Ser Ser Pro Ser Arg Arg Glu Thr 325 330 335 Ser Ser Asp Thr Leu Ser Asp Glu Val Cys Arg Val Ser Gln Ile Ile 340 345 350 Pro Ala Ala Ala Leu Glu Gly Ser His His His His His His 355 360 365

Claims (111)

  1. 하나 이상의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 결합 분자로서, 상기 결합 분자는 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 US28 단백질의 세포외 도메인 3(ECD3) 내의 에피토프에 대한 결합 특이성을 가지며,
    상기 US28 단백질의 ECD3은 서열번호: 5에 제시된 바와 같은 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)에 의해 암호화된 US28 단백질의 위치 167 내지 183에 상응하는 위치에서 US28 단백질에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 결합 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 결합 분자가 항체 및 키메라 항원 수용체(CAR)로부터 선택되는 것인, 결합 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 결합 분자는 HCMV의 US28 단백질의 세포외 도메인 3(ECD3) 내에 완전히 존재하는 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 것인, 결합 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 분자는 US28 단백질의 ECD3 내의 선형 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 것인, 결합 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, HCMV 균주 불가지론적인 HCMV의 US28 단백질의 ECD3 내의 에피토프에 대한 결합 특이성을 가지며,
    예를 들어, 상기 결합 분자는 (a) 2개 이상(예컨대 모두)의 HCMV 균주에 대해 불가지론적인 HCMV의 US28 단백질의 ECD3 내의 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖고/갖거나, (b) 4D-변이체 균주 및 4N-변이체 균주에 대해 불가지론적인 결합 특이성을 갖고/갖거나, (c) DB, Towne, AF1, VHL/E, AD169, BL, DAVIS, JP, Merlin, PH, TB40/E, Toledo, TR 및 VR1814(FIX)로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상(예컨대 모두)의 HCMV 균주에 대해 불가지론적인 결합 특이성을 갖는 것인, 결합 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 분자는 US28 단백질의 ECD3이 4D-변이체 또는 4N-변이체의 서열을 포함하는지 여부에 관계없이, HCMV의 US28 단백질의 ECD3 내의 에피토프에 대한 결합 특이성을 가지며:
    - 상기 4D-변이체는 Towne, VR1814, TB40/E, Merlin, JP, Ad169, AF1, VHL/E, BL 및 DAVIS와 같은 HCMV 균주의 제1 그룹에 의해 암호화된 바와 같은 US28의 ECD3에서 발견된 TKKDNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 7)의 서열을 포함하고;
    - 상기 4N-변이체는 Toledo, TR 및 DB 균주와 같은 HCMV 균주의 제2 그룹에 의해 암호화된 바와 같은 US28의 ECD3에서 발견된 TKKNNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 6)의 서열을 포함하는 것인, 결합분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체:
    (a) 각각 서열번호: 8, 9, 10, 14, 15 및 16에 의해 정의된 바와 같은 1D3, 및/또는 항체 1D3의 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체;
    (b) 각각 서열번호: 112, 113, 114, 117, 83 및 118에 의해 정의된 바와 같은 1C10, 및/또는 항체 1C10의 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체;
    (c) 각각 서열번호: 112, 113, 114, 117, 83 및 118에 의해 정의된 바와 같은 1A10, 및/또는 항체 1A10의 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체;
    (d) 각각 서열번호: 76, 77, 78, 82, 83 및 84에 의해 정의된 바와 같은 1G9, 및/또는 항체 1G9의 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체; 및/또는
    (e) 각각 서열번호: 76, 95, 96, 82, 99 및 100에 의해 정의된 바와 같은 1E8, 및/또는 항체 1E8의 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체
    의 CDR 서열 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 모두에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하고;
    임의적으로 상기 결합 분자는 항체 및 CAR로부터 선택되는 것인, 결합 분자.
  8. 제7항에 있어서,
    (a) 하기 항체의 가변 중쇄(VH)의 CDR 1, 2, 및 3 서열 중 1, 2, 또는 3개 모두:
    (i) 각각 서열번호: 8, 9, 및 10에 의해 정의된 바와 같은 1D3;
    (ii) 각각 서열번호: 112, 113, 및 114에 의해 정의된 바와 같은 1C10;
    (iii) 각각 서열번호: 112, 113, 및 114에 의해 정의된 바와 같은 1A10;
    (iv) 각각 서열번호: 76, 77, 및 78에 의해 정의된 바와 같은 1G9; 및/또는
    (v) 각각 서열번호: 76, 95, 및 96에 의해 정의된 바와 같은 1E8;
    및/또는
    (b) 하기 항체의 가변 경쇄(VL)의 CDR 1, 2, 및 3 서열 중 1, 2, 또는 3개 모두:
    (i) 각각 서열번호: 14, 15, 및 16에 의해 정의된 바와 같은 1D3; (ii) 각각 서열번호: 117, 83, 및 118에 의해 정의된 바와 같은 1C10;
    (iii) 각각 서열번호: 117, 83, 및 118에 의해 정의된 바와 같은 1A10;
    (iv) 각각 서열번호: 82, 83, 및 84에 의해 정의된 바와 같은 1G9; 및/또는
    (v) 각각 서열번호: 82, 99, 및 100에 의해 정의된 바와 같은 1E8
    을 포함하는 결합 분자.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    (a) 하기 서열을 갖는 CDR 1, 2, 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드:
    (i) 각각 서열번호: 8, 9, 및 10, 및
    임의적으로 상기 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드는 서열번호: 12의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것;
    (ii) 각각 서열번호: 112, 113, 및 114, 및
    임의적으로 상기 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드는 서열번호: 104의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것;
    (iii) 각각 서열번호: 112, 113, 및 114, 및
    임의적으로 상기 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드는 서열번호: 122의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것;
    (iv) 각각 서열번호: 76, 77, 및 78, 및
    임의적으로 상기 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드는 서열번호: 68의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것; 및/또는
    (v) 각각 서열번호: 76, 95, 및 96, 및
    임의적으로 상기 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드는 서열번호: 88의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것;
    및/또는
    (b) 하기 서열을 갖는 CDR 1, 2 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드:
    (i) 각각 서열번호: 14, 15, 및 16, 및
    임의적으로 상기 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드는 서열번호: 18의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것;
    (ii) 각각 서열번호: 117, 83, 및 118, 및
    임의적으로 상기 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드는 서열번호: 108의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것;
    (iii) 각각 서열번호: 117, 83, 및 118, 및
    임의적으로 상기 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드는 서열번호: 126의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것;
    (iv) 각각 서열번호: 82, 83, 및 84, 및
    임의적으로 상기 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드는 서열번호: 72의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것; 및/또는
    (v) 각각 서열번호: 82, 99, 및 100, 및
    임의적으로 상기 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드는 서열번호: 92의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것
    을 포함하는 결합 분자.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 분자는
    (a) 2가 항체, 예컨대 IgG-scFv 항체(예를 들어, 여기서 제1 결합 도메인은 온전한 IgG이고 제2 결합 도메인은 IgG의 경쇄의 N-말단 및/또는 경쇄의 C-말단 및/또는 중쇄의 N-말단 및/또는 중쇄의 C-말단에서 제1 결합 도메인에 부착된 scFv이거나, 반대의 경우도 마찬가지임);
    (b) 1가 항체, 예컨대 DuoBody ® 또는 '놉-인-홀' 이중특이적 항체(예를 들어, scFv-KIH, scFv-KIHr, BiTE-KIH 또는 BiTE-KIHr;
    (c) scFv2-Fc 항체;
    (d) 이중특이적 항체, 예컨대 이중특이적 T-세포 관여(BiTE) 항체;
    (e) 이중 가변 도메인(DVD)-Ig 항체;
    (f) 이중-친화성 재표적화(DART)-기반 항체(예를 들어, DART2-Fc 또는 DART);
    (g) 삼중특이적 항체, 예컨대 DNL-Fab3 항체;
    (h) scFv-HSA-scFv 항체;
    (i) 단일 도메인 항체;
    (j) 중쇄-단독 IgG(hcIgG), 예컨대 낙타과 IgG(예를 들어 VHH 항체) 및 상어 면역글로불린 신규 항원 수용체(IgNAR), 및 이의 단일 쇄 항체; 및
    (k) 제1항 또는 이에 대한 어느 한 종속항에 따른 세포외 도메인, 예를 들어 본 청구항의 옵션 (a) 내지 (h) 중 임의의 하나, 또는 이의 조합을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 결합 분자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 분자는
    (i) 이중특이적 면역 세포 관여 항체, 예를 들어, 이중특이적 T-세포 관여(BiTE)이며, 임의적으로 상기 BiTE 항체가 CD3-결합 도메인을 포함하는 것; 또는
    (ii) 모노클로날 항체, 임의적으로 재조합 모노클로날 항체, 예를 들어, CHO 세포에 의해 재조합적으로 생산된 모노클로날 항체인, 결합 분자.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 결합 분자의 기능적 단편으로서, 상기 기능적 단편은
    (a) Fv 단편(예컨대 단일 쇄 Fv 단편(scFv), 또는 이황화-결합된 Fv 단편), Fab-유사 단편(예컨대 Fab 단편, Fab' 단편 또는 F(ab)2 단편), 및 단일 도메인 항체(dAb-링커-dAb 및 나노바디와 같은 단일 또는 이중 형식을 포함하는 dAb)로 이루어진 군으로부터 선택된 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 결합 분자의 항원-결합 단편, 또는 이의 변이체, 융합체 또는 유도체를 포함하거나 이로 이루어지고/지거나;
    (b) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 결합 특성을 제공하고/하거나;
    (c) 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 CDR 서열을 포함하고/하거나;
    (d) 제9항에 정의된 바와 같은 VH 및/또는 VL 서열을 포함하는 것인, 기능적 단편.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 분자 또는 이의 기능적 단편은 융합 폴리펩티드 서열을 포함하며,
    상기 융합 폴리펩티드 서열은 제2 아미노산 서열에 융합된 제1 아미노산 서열을 포함하고,
    제1 아미노산 서열은 결합 분자 또는 이의 기능적 단편의 폴리펩티드 쇄 중 적어도 하나를 포함하거나 이로 이루어지고,
    제2 아미노산 서열은 융합 파트너인, 결합 분자, 또는 상기 결합 분자의 기능적 단편.
  14. 키메라 항원 수용체(CAR)로서,
    (i) 제1항 내지 제11항 또는 제13항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 결합 분자, 또는 제12항 또는 제13항에 정의된 바와 같은 상기 결합 분자의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진, 세포외 도메인;
    (ii) 막관통 도메인; 및
    (iii) 세포내 도메인
    을 포함하며;
    상기 CAR의 세포외 도메인은 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 US28 단백질의 세포외 도메인 3(ECD3) 내의 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖고,
    상기 US28 단백질의 ECD3은 서열번호: 5에 제시된 바와 같은 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)에 의해 암호화된 US28 단백질의 위치 167 내지 183에 상응하는 위치에서 US28 단백질에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, CAR.
  15. 제14항에 있어서,
    (a) CAR의 세포외 도메인은 HCMV의 US28 단백질의 세포외 도메인 3(ECD3) 내에 완전히 존재하는 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖고/갖거나;
    (b) CAR의 세포외 도메인은 US28 단백질의 ECD3 내의 선형 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖고/갖거나;
    (c) CAR의 세포외 도메인은 HCMV 균주 불가지론적인 HCMV의 US28 단백질의 ECD3 내의 에피토프에 대한 결합 특이성, 예를 들어, DB, Towne, AD169, BL, DAVIS, JP, Merlin, PH, TB40/E, Toledo, TR, VHL/E 및 VR1814(FIX)로 이루어진 군으로부터 선택된 HCMV 균주 중 2개 이상(예컨대 모두)에 대해 불가지론적인 HCMV의 US28 단백질의 ECD3 내의 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖고/갖거나;
    (d) CAR의 세포외 도메인은 US28 단백질의 ECD3이
    - 다수의 HCMV 균주에 의해 암호화된 바와 같은 US28의 ECD3에서 발견된 TKKDNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 7), 또는
    - 소수의 HCMV 균주에 의해 암호화된 바와 같은 US28의 ECD3에서 발견된 TKKNNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 6)
    의 서열을 포함하는지 여부에 관계없이, HCMV의 US28 단백질의 ECD3 내의 에피토프에 대한 특이성을 갖는 것인, CAR.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    (a) CAR의 세포외 도메인은 항체:
    (i) 각각 서열번호: 8, 9, 10, 14, 15 및 16에 의해 정의된 바와 같은 1D3, 및/또는 항체 1D3의 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체;
    (ii) 각각 서열번호: 112, 113, 114, 117, 83 및 118에 의해 정의된 바와 같은 1C10, 및/또는 항체 1C10의 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체;
    (iii) 각각 서열번호: 112, 113, 114, 117, 83 및 118에 의해 정의된 바와 같은 1A10, 및/또는 항체 1A10의 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체;
    (iv) 각각 서열번호: 76, 77, 78, 82, 83 및 84에 의해 정의된 바와 같은 1G9, 및/또는 항체 1G9의 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체; 및/또는
    (v) 각각 서열번호: 76, 95, 96, 82, 99 및 100에 의해 정의된 바와 같은 1E8, 및/또는 항체 1E8의 상기 CDR 서열 중 임의의 하나 이상의 기능적 변이체
    의 CDR 서열의 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 모두에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하고/하거나;
    (b) CAR의 세포외 도메인은
    항체: (i) 각각 서열번호: 8, 9, 및 10에 의해 정의된 바와 같은 1D3;
    (ii) 각각 서열번호: 112, 113, 및 114에 의해 정의된 바와 같은 1C10;
    (iii) 각각 서열번호: 112, 113, 및 114에 의해 정의된 바와 같은 1A10;
    (iv) 각각 서열번호: 76, 77, 및 78에 의해 정의된 바와 같은 1G9; 및/또는
    (v) 각각 서열번호: 76, 95, 및 96에 의해 정의된 바와 같은 1E8
    의 가변 중쇄(VH)의 CDR 1, 2, 및 3 서열 중 1, 2, 또는 3개 모두;
    및/또는
    항체: (vii) 각각 서열번호: 14, 15, 및 16에 의해 정의된 바와 같은 1D3;
    (viii) 각각 서열번호: 117, 83, 및 118에 의해 정의된 바와 같은 1C10;
    (ix) 각각 서열번호: 117, 83, 및 118에 의해 정의된 바와 같은 1A10;
    (x) 각각 서열번호: 82, 83, 및 84에 의해 정의된 바와 같은 1G9; 및/또는
    (xi) 각각 서열번호: 82, 99, 및 100에 의해 정의된 바와 같은 1E8
    의 가변 경쇄(VL)의 CDR 1, 2, 및 3 서열 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함하고/하거나;
    (c) CAR의 세포외 도메인은
    (i) 각각 서열번호: 8, 9, 및 10, 및 임의적으로 상기 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드 서열은 서열번호: 12의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것;
    (ii) 각각 서열번호: 112, 113, 및 114, 및
    임의적으로 상기 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드는 서열번호: 104의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것;
    (iii) 각각 서열번호: 112, 113, 및 114, 및
    임의적으로 상기 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드는 서열번호: 122의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것;
    (iv) 각각 서열번호: 76, 77, 및 78, 및
    임의적으로 상기 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드는 서열번호: 68의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것; 및/또는
    (v) 각각 서열번호: 76, 95, 및 96, 및
    임의적으로 상기 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드는 서열번호: 88의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것
    의 서열을 갖는 CDR 1, 2, 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드 서열; 및/또는
    (vii) 각각 서열번호: 14, 15, 및 16, 및 임의적으로 상기 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드는 서열번호: 18의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것;
    (viii) 각각 서열번호: 117, 83, 및 118, 및
    임의적으로 상기 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드는 서열번호: 108의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것;
    (ix) 각각 서열번호: 117, 83, 및 118, 및
    임의적으로 상기 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드는 서열번호: 126의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것;
    (x) 각각 서열번호: 82, 83, 및 84, 및
    임의적으로 상기 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드는 서열번호: 72의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것; 및/또는
    (xi) 각각 서열번호: 82, 99, 및 100, 및
    임의적으로 상기 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드는 서열번호: 92의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것
    의 서열을 갖는 CDR 1, 2 및 3 서열을 포함하는 적어도 하나의 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인, CAR.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 도메인은 항체, 예를 들어 단일 쇄 가변 단편(scFv)인, CAR.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막관통 도메인은 단백질의 막관통 도메인, 예를 들어 막관통 수용체 단백질의 막관통 도메인을 포함하고,
    임의적으로 상기 막관통 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD8, CD45 및 CD4로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막관통 도메인을 포함하는 것인, CAR.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 도메인은 힌지 영역에 의해 막관통 도메인에 연결되는 것인, CAR.
  20. 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포내 도메인은 세포내 신호전달 도메인을 포함하며, 예를 들어
    (a) 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하고/하거나;
    (b) 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타, Fc 수용체 감마, Fc 수용체 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d의 신호전달 도메인을 포함하는 것인, CAR.
  21. 제20항에 있어서, 상기 세포내 도메인은 하나 이상의 공자극 도메인을 포함하며, 예를 들어
    (a) 상기 하나 이상의 공자극 도메인이 CD28, 41BB, OX40, ICOS, CD27, 및 DAP10으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터 수득된 하나 이상의 기능적 신호전달 도메인을 포함하고/하거나;
    (b) 상기 세포내 도메인이 세포내 신호전달 도메인에 근접한 공자극 도메인을 혼입하고/하거나,
    (c) 상기 세포내 도메인이 2개 이상의 공자극 도메인, 예를 들어 2개의 인라인 공자극 도메인을 포함하고/하거나,
    (d) 상기 세포내 도메인이 별도의 사이토카인 신호를 혼입하는 것인, CAR.
  22. 제14항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR는 리더 서열을 추가로 포함하는 것인, CAR.
  23. 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합으로서,
    상기 핵산 분자는, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합은 집합적으로, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 결합 분자, 또는 제14항 내지 제22항 중 어느 한 항의 CAR을 개별적으로 또는 조합하여, 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 것인, 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합.
  24. 제23항에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합을 포함하는 벡터.
  25. 제24항에 있어서, 상기 벡터가 레트로바이러스 벡터, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 및 아데노바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 벡터.
  26. 제23항에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합, 또는 제24항 또는 제25항에 따른 벡터를 포함하는 세포로서,
    임의적으로 상기 세포가 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 결합 분자, 및/또는 제14항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 CAR을 발현하며, 상기 하나 이상의 결합 분자 및/또는 CAR이 제23항에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합, 또는 제24항 또는 제25항에 따른 벡터에 의해 암호화되는 것인, 세포.
  27. 제26항에 있어서,
    (a) 제23항에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합이며, 상기 암호화된 결합 분자는 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 항체, 제12항에 따른 상기 항체의 기능적 단편, 또는 제13항에 따른 융합 폴리펩티드 서열을 포함하는 이의 기능적 단편의 항체인 것; 및/또는
    (b) 본 청구항의 (a) 부분에 의해 정의된 바와 같은 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합을 포함하는, 제25항 또는 제26항에 따른 벡터
    를 포함하는, 세포.
  28. 제26항에 있어서,
    (a) 제23항에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합이며, 상기 암호화된 결합 분자는 제14항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 CAR인 것; 및/또는
    (b) 본 청구항의 (a) 부분에 의해 정의된 바와 같은 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합을 포함하는, 제25항 또는 제26항에 따른 벡터
    를 포함하는, 세포.
  29. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자 및/또는 상기 결합 분자를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포로서, 임의적으로 상기 핵산이 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 핵산 또는 벡터인, 세포.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 결합 분자가 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 항체, 제12항에 따른 상기 항체의 기능적 단편, 또는 제13항에 따른 융합 폴리펩티드 서열을 포함하는 이의 기능적 단편의 항체이고,
    임의적으로 상기 항체가 모노클로날 항체이고, 추가로 예를 들어 상기 세포가 모노클로날 항체를 재조합적으로 발현하는 CHO 세포인, 세포.
  31. 제14항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 CAR 및/또는 상기 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 세포로서, 임의적으로 상기 핵산이 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 핵산 또는 벡터인, 세포.
  32. 제26항, 제28항, 제29항, 제31항, 또는 제32항에 있어서, 상기 세포가 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 또는 대식세포인, 세포, 또는 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 세포가 CAR-T 세포, CAR-NK 세포 또는 CAR-대식세포이고,
    임의적으로, 세포가 CAR-T 세포이면, T-세포가 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 효과기 T 세포, 헬퍼 T 세포, 기억 T 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), EBV-특이적 T 세포 수용체(TCR) 또는 γδ-T 세포 하위유형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 세포.
  34. 세포를 생산하는 방법으로서, 제23항에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합, 및/또는 제24항 또는 제25항에 따른 벡터를 세포로 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
  35. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자, 또는 제14항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 CAR을 생산하는 방법으로서,
    세포에서 제23항에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합, 및/또는 제24항 또는 제25항에 따른 벡터를 발현시키는 단계를 포함하는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 이렇게 생산된 결합 분자를 세포로부터 단리하는 단계를 포함하고;
    임의적으로, 상기 결합 분자가 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 항체, 제12항에 따른 상기 항체의 기능적 단편, 또는 제13항에 따른 융합 폴리펩티드 서열을 포함하는 이의 기능적 단편의 항체인, 방법.
  37. 제36항의 방법에 의해 수득되거나, 수득가능한 단리된 결합 분자로서,
    임의적으로, 상기 단리된 결합 분자가 대상체에게 투여하기 위해 추가로 제형화되는 것인, 단리된 결합 분자.
  38. 제1항 내지 제11항 또는 제13항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 결합 분자, 또는 제12항 또는 제13항에 정의된 바와 같은 상기 결합 분자의 기능적 단편에 접합된 모이어티를 포함하는 접합체.
  39. 제38항에 있어서, 상기 모이어티가 치료적, 예방적, 진단적, 예후적, 또는 치료진단적 모이어티인, 접합체.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 상기 모이어티가 약물(예를 들어, 접합체는 항체-약물 접합체("ADC")임) 및/또는 방사성 모이어티(예를 들어, 접합체는 방사선면역요법("RIT")에 사용하기에 적합함)인, 접합체.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 접합체를 생산하는 방법으로서,
    (a) 제1항 내지 제11항 또는 제13항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 결합 분자, 또는 제12항 또는 제13항에 의해 정의된 바와 같은 상기 결합 분자의 기능적 단편을 제공하는 단계;
    (b) 제1항 내지 제11항 또는 제13항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 결합 분자, 또는 제12항 또는 제13항에 의해 정의된 바와 같은 상기 결합 분자의 기능적 단편에 모이어티를 접합시키는 단계
    를 포함하는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 이렇게 생산된 접합체를 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
  43. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 분자가 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 항체, 제12항에 따른 상기 항체의 기능적 단편, 또는 제13항에 따른 융합 폴리펩티드 서열을 포함하는 이의 기능적 단편의 항체인, 접합체, 또는 방법.
  44. 제42항 또는 제43항의 방법에 의해 수득되거나, 수득가능한 단리된 접합체로서,
    임의적으로, 상기 단리된 접합체가 대상체에게 투여하기 위해 추가로 제형화되는 것인, 단리된 접합체.
  45. HCMV 또는 HCMV와 연관된 질환 또는 병태를 퇴치하는 방법으로서, 대상체, 또는 생체외 또는 시험관내 세포 물질에
    i. 제1항 내지 제11항 또는 제13항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자,
    ii. 제12항 또는 제13항에 정의된 바와 같은 상기 결합 분자의 기능적 단편,
    iii. 제37항에 따른 단리된 결합 분자,
    iv. 제23항에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합,
    v. 제24항 또는 제25항에 따른 벡터,
    vi. 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 세포,
    vii. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 접합체, 및
    viii. 제44항에 따른 단리된 접합체
    로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  46. 대상체, 또는 생체외 또는 시험관내 세포 물질에서 HCMV와 연관된 질환 또는 병태를 퇴치하는 데 사용하기 위한 하나 이상의 제제로서, 상기 하나 이상의 제제는
    i. 제1항 내지 제11항 또는 제13항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자,
    ii. 제12항 또는 제13항에 정의된 바와 같은 상기 결합 분자의 기능적 단편,
    iii. 제37항에 따른 단리된 결합 분자,
    iv. 제23항에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합,
    v. 제24항 또는 제25항에 따른 벡터,
    vi. 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 세포,
    vii. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 접합체, 및
    viii. 제44항에 따른 단리된 접합체
    로 이루어진 군으로부터 각각 개별적으로 선택되는 것인, 하나 이상의 제제.
  47. 대상체, 또는 생체외 또는 시험관내 세포 물질에서 HCMV와 연관된 질환 또는 병태를 퇴치하기 위한 약제의 제조에서 하나 이상의 제제의 용도로서, 상기 하나 이상의 제제가
    i. 제1항 내지 제11항 또는 제13항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자,
    ii. 제12항 또는 제13항에 정의된 바와 같은 상기 결합 분자의 기능적 단편,
    iii. 제37항에 따른 단리된 결합 분자,
    iv. 제23항에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합,
    v. 제24항 또는 제25항에 따른 벡터,
    vi. 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 세포,
    vii. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 접합체, 및
    viii. 제44항에 따른 단리된 접합체
    로 이루어진 군으로부터 각각 개별적으로 선택되는 것인, 용도.
  48. 제45항, 제46항, 또는 제47항에 있어서,
    i. 상기 질환 또는 병태가 HCMV 감염이거나 HCMV 감염과 연관되고, 임의적으로 HCMV 감염이 다중 균주 HCMV 감염을 포함하며, 상기 다중 균주 HCMV 감염이 HCMV의 하나 초과의 상이한 균주, 예를 들어 US28의 ECD3의 4N-변이체를 암호화하는 하나 이상의 HCMV 균주 및 US28의 ECD3의 4D-변이체를 암호화하는 하나 이상의 HCMV 균주로의 감염을 포함하고/하거나;
    ii. 질환 또는 병태가 잠복성 HCMV 감염(임의적으로 다중 균주 잠복성 HCMV 감염)이거나 잠복성 HCMV 감염(임의적으로 다중 균주 잠복성 HCMV 감염)과 연관되고/되거나;
    iii. 질환 또는 병태가 용해성 HCMV 감염(임의적으로 다중 균주 용해성 HCMV 감염)이거나 용해성 HCMV 감염(임의적으로 다중 균주 용해성 HCMV 감염)과 연관되고/되거나;
    iv. 질환 또는 병태가 선천성 단일 또는 다중 균주 HCMV 감염, 예컨대 잠복성 선천성 단일 또는 다중 균주 HCMV 감염 또는 용해성 선천성 단일 또는 다중 균주 HCMV 감염이고/이거나;
    v. 질환 또는 병태가 암이고/이거나;
    vi. 질환 또는 병태가 HCMV-감염된 암(임의적으로 다중 균주 HCMV 감염된 암), 예컨대 잠복성 HCMV-감염된 암(임의적으로 다중 균주 잠복성 HCMV 감염된 암)이고/이거나;
    vii. 질환 또는 병태가 상피암이고; 임의적으로 상기 상피암은 유방암이며; 예를 들어, 상기 유방암은 삼중 음성 유방암(TNBC), 또는 HER2-양성 유방암(예컨대 삼중 양성 유방암 "TPBC")이고/이거나;
    viii. 질환이 암의 전이성 및/또는 공격성 형태, 예컨대 HCMV-감염된 암(예를 들어 잠복성 HCMV 감염 및/또는 다중 균주 HCMV 감염이 있는 암)의 전이성 및/또는 공격성 형태이고/이거나;
    ix. 질환 또는 병태가 교모세포종이 아니고/아니거나;
    x. 이를 필요로 하는 대상체가 HCMV-감염된 암 세포, 예컨대 잠복성 HCMV-감염된 암 세포 또는 생산적 HCMV 감염이 있는 암 세포(생산적 HCMV 감염이 있는 종양 연관 대식세포를 포함하나 이에 제한되지 않음)로 진단받았고/받았거나;
    xi. 이를 필요로 하는 대상체가 기관 기증의 수용자, 또는 기관 공여자이거나, 되도록 의도되는 것인,
    방법, 하나 이상의 제제, 또는 용도.
  49. 제45항, 제46항, 제47항 또는 제48항에 있어서, 상기 제제는
    i. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 치료적 항체,
    ii. 제12항에 정의된 바와 같은 상기 치료적 항체의 기능적 단편,
    iii. 제13항에 정의된 바와 같은 융합 폴리펩티드 서열을 포함하는 치료적 항체; 및
    iv. 제13항에 의해 정의된 바와 같은 융합 폴리펩티드 서열로서 포함하는 상기 치료적 항체의 기능적 단편
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법, 하나 이상의 제제, 또는 용도.
  50. 제45항, 제46항, 제47항 또는 제48항에 있어서,
    상기 제제는 이중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 면역 세포 관여 항체, 예컨대 이중특이적 T-세포 관여(BiTE) 항체이며, 임의적으로 상기 BiTE 항체가 CD3-결합 도메인을 포함하는 것인, 방법, 하나 이상의 제제, 또는 용도.
  51. 제45항, 제46항, 제47항 또는 제48항에 있어서,
    상기 제제는 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 접합체, 예컨대 항체-약물 접합체("ADC")인 접합체, 또는 방사성 모이어티를 포함하는 접합체, 예컨대 방사선면역요법("RIT")에 사용하기에 적합한 접합체인, 방법, 하나 이상의 제제, 또는 용도.
  52. 제45항, 제46항, 제47항 또는 제48항에 있어서,
    상기 제제는 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 CAR을 포함하는 세포, 예를 들어 CAR-T 세포, CAR-NK 세포 또는 CAR-대식세포인, 방법, 하나 이상의 제제, 또는 용도.
  53. 제45항, 제46항, 제47항 또는 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체가 추가의 물질, 예컨대 추가의 치료적, 예방적, 진단적, 예후적, 또는 치료진단적 물질을 투여받은 사람이고,
    임의적으로 상기 추가의 물질이 상기 하나 이상의 제제 또는 이의 각각과 개별적으로, 순차적으로 또는 동시에 투여되는 것인, 방법, 하나 이상의 제제, 또는 용도.
  54. 의약에서 사용하기 위한 제제로서, 상기 제제는
    i. 제1항 내지 제11항 또는 제13항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자,
    ii. 제12항 또는 제13항에 의해 정의된 바와 같은 상기 결합 분자의 기능적 단편,
    iii. 제37항에 따른 단리된 결합 분자,
    iv. 제23항에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합,
    v. 제24항 또는 제25항에 따른 벡터,
    vi. 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 세포,
    vii. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 접합체, 및
    viii. 제44항에 따른 단리된 접합체
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 제제.
  55. 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)와 연관된 질환 또는 병태에 대한 백신 접종, 위험 감소, 예방, 또는 퇴치에 사용하기에 적합한 백신 조성물로서,
    상기 백신이 능동 또는 수동 백신이고,
    상기 백신이 HCMV의 US28 단백질의 ECD3 내에 존재하는 에피토프에 대해 지시된 면역 반응을 촉발 및/또는 제공하고,
    상기 US28 단백질의 ECD3이 서열번호: 5에 제시된 바와 같은 HCMV에 의해 암호화된 US28 단백질의 위치 167 내지 183에 상응하는 위치에서 US28 단백질에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 백신 조성물.
  56. 제55항에 있어서, 상기 백신이 하기에 대한 면역 반응을 촉발 및/또는 제공하는 것인, 백신 조성물:
    (a) HCMV의 US28 단백질의 세포외 도메인 3(ECD3) 내에 완전히 존재하는 하나 이상의 에피토프;
    (b) US28 단백질의 ECD3 내의 하나 이상의 선형 에피토프;
    (c) HCMV의 4D-변이체 균주 및 4N-변이체 균주 둘 다에서 동일한 형태로 존재하는 에피토프인 HCMV의 US28 단백질의 ECD3 내의 하나 이상의 에피토프이며, 상기 HCMV의 4D-변이체 균주는 TKKDNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 7)의 서열을 갖는 ECD3을 포함하는 US28 단백질을 암호화하고 상기 HCMV의 4N-변이체 균주는 TKKNNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 6)의 서열을 갖는 ECD3을 포함하는 US28 단백질을 암호화하는 것; 및/또는
    (d) 백신에 의해 촉발되거나 제공되는 면역 반응이 HCMV의 4D-변이체 균주 및 4N-변이체 균주에 대해 HCMV 균주 불가지론적이고, Towne, VR1814, TB40/E, Merlin, JP, Ad169, VHL/E, AF1, BL 및 DAVIS로부터 선택된 4D-변이체 HCMV 균주 중 하나 이상에 대해 지시되고 또한 Toledo, TR 및 DB로부터 선택된 4N-변이체 HCMV 균주 중 하나 이상에 대해 지시되는 면역 반응을 촉발 및/또는 제공하는 것.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서,
    (i) 상기 백신이 수동 백신이고/이거나, 임의적으로
    (a) 제1항 내지 제11항 또는 제13항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 결합 분자,
    (b) 제12항 또는 제13항에 정의된 바와 같은 상기 하나 이상의 결합 분자의 하나 이상의 기능적 단편,
    (c) 제37항에 따른 하나 이상의 단리된 결합 분자,
    (d) 제23항에 따른 하나 이상의 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합,
    (e) 제24항 또는 제25항에 따른 하나 이상의 벡터,
    (f) 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 세포,
    (g) 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 접합체, 및/또는
    (h) 제44항에 따른 하나 이상의 단리된 접합체
    를 포함하고/하거나;
    (ii) 상기 백신이 능동 백신이고/이거나, 임의적으로
    (a) 제84항 내지 제88항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드, 제89항에 따른 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합, 제90항에 따른 융합 단백질, 제91항에 따른 적어도 2개의 별개의 융합 단백질의 조합, 제92항 내지 제94항 중 어느 한 항에 따른 접합체, 및/또는 제95항에 따른 적어도 2개의 별개의 접합체의 조합; 및/또는
    (b) 제101항 또는 제102항에 따른 하나 이상의 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합, 또는 제103항 또는 제104항에 따른 벡터; 및/또는
    (c) 수지상 세포, 또는 이의 동종 또는 이종 집단이며, 상기 또는 각각의 수지상 세포가 하기: 제84항 내지 제88항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 폴리펩티드, 제89항에 따른 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합, 제90항에 따른 융합 단백질, 제91항에 따른 적어도 2개의 별개의 융합 단백질의 조합, 제92항 내지 제94항 중 어느 한 항에 따른 접합체, 제95항에 따른 적어도 2개의 별개의 접합체의 조합, 제101항 또는 제102항에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합, 및/또는 제103항 또는 제104항에 따른 하나 이상의 벡터 중 하나 이상으로 로딩되는 것
    을 포함하는 것인, 백신 조성물.
  58. HCMV와 연관된 질환 또는 병태에 대한 백신접종, 위험 감소, 예방, 및/또는 퇴치 방법으로서, 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 따른 백신을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며,
    임의적으로 상기 질환 또는 병태가 잠복성 HCMV 감염이거나, 잠복성 HCMV 감염과 연관된 질환 또는 병태인, 방법.
  59. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 HCMV와 연관된 질환 또는 병태에 대한 백신접종, 위험 감소, 예방, 및/또는 퇴치에 사용하기 위한 백신이며,
    임의적으로 상기 질환 또는 병태가 잠복성 HCMV 감염이거나, 잠복성 HCMV 감염과 연관된 질환 또는 병태인, 백신.
  60. 대상체에서 HCMV와 연관된 질환 또는 병태에 대한 백신접종, 위험 감소, 예방, 및/또는 퇴치를 위한 약제의 제조에서 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 따른 백신의 용도로서,
    임의적으로 상기 질환 또는 병태가 잠복성 HCMV 감염이거나, 잠복성 HCMV 감염과 연관된 질환 또는 병태인, 용도.
  61. 제55항 내지 제57항, 제58항, 제59항, 또는 제60항 중 어느 한 항에 있어서,
    i. 질환 또는 병태가 HCMV 감염이거나 HCMV 감염과 연관되고, 임의적으로 상기 HCMV 감염이 다중 균주 HCMV 감염을 포함하며, 상기 다중 균주 HCMV 감염은 HCMV의 하나 초과의 상이한 균주, 예를 들어 US28의 ECD3의 4N-변이체를 암호화하는 하나 이상의 HCMV 균주 및 US28의 ECD3의 4D-변이체를 암호화하는 하나 이상의 HCMV 균주로의 감염을 포함하고/하거나;
    ii. 질환 또는 병태가 잠복성 HCMV 감염(임의적으로 다중 균주 잠복성 HCMV 감염)이거나 잠복성 HCMV 감염(임의적으로 다중 균주 잠복성 HCMV 감염)과 연관되고/되거나;
    iii. 질환 또는 병태가 용해성 HCMV 감염(임의적으로 다중 균주 용해성 HCMV 감염)이거나 용해성 HCMV 감염(임의적으로 다중 균주 용해성 HCMV 감염)과 연관되고/되거나;
    iv. 질환 또는 병태가 선천성 단일 또는 다중 균주 HCMV 감염, 예컨대 잠복성 선천성 단일 또는 다중 균주 HCMV 감염 또는 용해성 선천성 단일 또는 다중 균주 HCMV 감염이고/이거나;
    v. 질환 또는 병태가 암이고/이거나;
    vi. 질환 또는 병태가 HCMV-감염된 암(임의적으로 다중 균주 HCMV 감염된 암), 예컨대 잠복성 HCMV-감염된 암(임의적으로 다중 균주 잠복성 HCMV 감염된 암)이고/이거나;
    vii. 질환 또는 병태가 상피암이고; 임의적으로 상기 상피암은 유방암이며; 예를 들어, 상기 유방암은 삼중 음성 유방암(TNBC), 또는 HER2-양성 유방암(예컨대 삼중 양성 유방암 "TPBC")이고/이거나;
    viii. 질환 또는 병태가 암의 전이성 및/또는 공격성 형태, 예컨대 HCMV-감염된 암(예를 들어 잠복성 HCMV 감염 및/또는 다중 균주 HCMV 감염을 갖는 암)의 전이성 및/또는 공격성 형태이고/이거나;
    ix. 질환 또는 병태가 교모세포종이 아니고/아니거나;
    x. 이를 필요로 하는 대상체가 HCMV-감염된 암 세포, 예컨대 잠복성 HCMV-감염된 암 세포 또는 생산적 HCMV 감염을 갖는 암 세포(생산적 HCMV 감염을 갖는 종양 연관 대식세포를 포함하나 이에 제한되지 않음)로 진단받았고/받았거나;
    xi. 이를 필요로 하는 대상체가 기관 기증의 수용자, 또는 기관 공여자이거나, 되도록 의도되는 것인, 백신 조성물, 방법, 사용하기 위한 백신 조성물, 또는 용도.
  62. 대상체 및/또는 생체외 생물학적 물질의 하나 이상의 생물학적 조건 및/또는 생물학적 특성을 평가하는 방법으로서,
    (a) 대상체 및/또는 생체외 생물학적 물질을 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 결합 분자, 또는 제38항 내지 제40항, 제43항 또는 제44항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 접합체와 접촉시키는 단계; 및
    (b) 대상체 및/또는 생체외 생물학적 물질에 대한 결합 분자 또는 접합체의 결합의 직접 및/또는 간접 측정에 기반하여 대상체 및/또는 생체외 생물학적 물질을 평가하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 방법이 ELISA 방법을 포함하고, 임의적으로 상기 방법이 생체외 생물학적 물질, 예컨대 하나 이상의 체액에서 수행되는 것인, 방법.
  64. 제62항에 있어서, 상기 방법이 유세포 분석 방법을 포함하고, 임의적으로 상기 방법이 대상체의 생체외 혈액 샘플 및/또는 생체외 골수 샘플을 평가하는 방법인, 방법.
  65. 제62항에 있어서, 상기 방법이 제38항 내지 제40항, 제43항 또는 제44항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 접합체의 사용을 포함하고,
    상기 접합체가 검출가능한 모이어티, 예컨대 방사성 모이어티를 포함하고, 상기 방법이 대상체 및/또는 생체외 생물학적 물질에서 방사성 모이어티의 검출을 포함하며,
    예를 들어, 상기 방법이 면역 양전자 방출(PET) 영상화 방법인, 방법.
  66. 제62항에 있어서, 상기 방법이 생체외 생물학적 물질의 샘플에서 수행된 면역조직화학의 방법인, 방법.
  67. 제62항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 대상체에서 HCMV와 연관된 질환 또는 병태의 진단적 또는 예후적 평가를 위한 목적을 위해 대상체, 또는 대상체로부터 수득된 생체외 생물학적 물질에서 수행되는 것인, 방법.
  68. 제67항에 있어서,
    i. 질환 또는 병태가 HCMV 감염이거나 HCMV 감염과 연관되고, 임의적으로 상기 HCMV 감염이 다중 균주 HCMV 감염을 포함하며, 상기 다중 균주 HCMV 감염은 HCMV의 하나 초과의 상이한 균주, 예를 들어 US28의 ECD3의 4N-변이체를 암호화하는 하나 이상의 HCMV 균주 및 US28의 ECD3의 4D-변이체를 암호화하는 하나 이상의 HCMV 균주를 포함하고/하거나;
    ii. 질환 또는 병태가 잠복성 HCMV 감염(임의적으로 다중 균주 잠복성 HCMV 감염)이거나 잠복성 HCMV 감염(임의적으로 다중 균주 잠복성 HCMV 감염)과 연관되고/되거나;
    iii. 질환 또는 병태가 용해성 HCMV 감염(임의적으로 다중 균주 용해성 HCMV 감염)이거나 용해성 HCMV 감염(임의적으로 다중 균주 용해성 HCMV 감염)과 연관되고/되거나;
    iv. 질환 또는 병태가 선천성 단일 또는 다중 균주 HCMV 감염, 예컨대 잠복성 선천성 단일 또는 다중 균주 HCMV 감염 또는 용해성 선천성 단일 또는 다중 균주 HCMV 감염이고/이거나;
    v. 질환 또는 병태가 암이고/이거나;
    vi. 질환 또는 병태가 HCMV-감염된 암(임의적으로 다중 균주 HCMV 감염된 암), 예컨대 잠복성 HCMV-감염된 암(임의적으로 다중 균주 잠복성 HCMV 감염된 암)이고/이거나;
    vii. 질환 또는 병태가 상피암이고; 임의적으로 상기 상피암은 유방암이며; 예를 들어, 상기 유방암은 삼중 음성 유방암(TNBC), 또는 HER2-양성 유방암(예컨대 삼중 양성 유방암 "TPBC")이고/이거나;
    viii. 질환 또는 병태가 암의 전이성 및/또는 공격성 형태, 예컨대 HCMV-감염된 암(예를 들어 잠복성 HCMV 감염 및/또는 다중 균주 HCMV 감염을 갖는 암)의 전이성 및/또는 공격성 형태이고/이거나;
    ix. 질환 또는 병태가 교모세포종이 아니고/아니거나;
    x. 이를 필요로 하는 대상체가 HCMV-감염된 암 세포, 예컨대 잠복성 HCMV-감염된 암 세포 또는 생산적 HCMV 감염을 갖는 암 세포(생산적 HCMV 감염을 갖는 대식세포와 연관된 종양을 포함하나 이에 제한되지 않음), 및/또는 다중 균주 HCMV 감염된 암 세포로 진단받았고/받았거나;
    xi. 대상체가 기관 기증의 수용자, 또는 기관 공여자이거나, 되도록 의도되는 것인, 방법.
  69. 살아있는 생체외 생물학적 물질에서 HCMV 감염(예컨대 잠복성 HCMV 감염 및/또는 용해성 HCMV 감염 및/또는 다중 균주 HCMV 감염)을 퇴치하는 방법으로서, 살아있는 생체외 생물학적 물질을
    i. 제1항 내지 제11항 또는 제13항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자,
    ii. 제12항 또는 제13항에 정의된 바와 같은 상기 결합 분자의 기능적 단편,
    iii. 제37항에 따른 단리된 결합 분자,
    iv. 제23항에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합,
    v. 제24항 또는 제25항에 따른 벡터,
    vi. 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 세포,
    vii. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 접합체, 및
    viii. 제44항에 따른 단리된 접합체
    로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  70. 제69항의 방법에 의해 수득되거나, 수득가능한 살아있는 생체외 생물학적 물질.
  71. 제69항 또는 제70항에 있어서, 상기 생체외 살아있는 생물학적 물질이 하나 이상의 유형의 생체외 세포; 하나 이상의 유형의 생체외 세포 배양물; 하나 이상의 유형의 생체외 조직; 하나 이상의 유형의 생체외 조직 배양물; 하나 이상의 유형의 생체외 오가노이드(organoid); 하나 이상의 유형의 생체외 오가노이드 배양물; 하나 이상의 유형의 생체외 기관; 및/또는 하나 이상의 유형의 생체외 기관 배양물을 포함하는 군으로부터 선택된 살아있는 생체외 생물학적 물질을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어지는 것인, 방법, 또는 살아있는 생체외 생물학적 물질.
  72. 대상체에게 제60항 또는 제61항에 정의된 바와 같은 생체외 살아있는 생물학적 물질을 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 방법이 생체외 살아있는 생물학적 물질, 예컨대 기관 또는 조직 이식물의 이식 방법인, 방법.
  74. 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 US28 단백질의 세포외 도메인 3(ECD3) 내의 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 결합 분자를 스크리닝하는 방법으로서,
    상기 US28 단백질의 ECD3이 서열번호: 5에 제시된 바와 같은 HCMV에 의해 암호화된 US28 단백질의 위치 167 내지 183에 상응하는 위치에서 US28 단백질에 제시된 아미노산 서열을 포함하며,
    (a) US28 단백질의 ECD3에 존재하는 아미노산 서열에 상응하는 하나 이상의 펩티드를 제공하며, 임의적으로 상기 하나 이상의 펩티드는 제84항 내지 제88항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드, 제89항에 따른 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합, 제90항에 따른 하나 이상의 융합 단백질, 제91항에 따른 적어도 2개의 별개의 융합 단백질의 조합, 제92항 내지 제94항 중 어느 한 항에 따른 접합체, 또는 제95항에 따른 적어도 2개의 별개의 접합체의 조합의 형태로 제공되는, 단계;
    (b) 하나 이상의 후보 결합 분자를 제공하는 단계;
    (c) 하나 이상의 펩티드에 대한 하나 이상의 후보 결합 분자의 결합 특이성 및/또는 결합 친화성을 결정하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 또는 각각의 하나 이상의 펩티드가 폴리펩티드 서열 TKKDNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 7) 및/또는 TKKNNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 6), 및/또는 어느 하나 또는 둘 다의 면역원성 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어지며;
    임의적으로 상기 하나 이상의 펩티드가 제84항 내지 제88항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드, 제89항에 따른 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합, 제90항에 따른 하나 이상의 융합 단백질, 제91항에 따른 적어도 2개의 별개의 융합 단백질의 조합, 제92항 내지 제94항 중 어느 한 항에 따른 접합체, 또는 제95항에 따른 적어도 2개의 별개의 접합체의 조합의 형태로 제공되는 것인, 방법.
  76. 제74항 또는 제75항에 있어서, 상기 하나 이상의 후보 결합 분자가 항체 및/또는 CAR, 예컨대 하기 중 임의의 하나 이상인, 방법:
    (a) 2가 항체, 예컨대 IgG-scFv 항체(예를 들어, 여기서 제1 결합 도메인은 온전한 IgG이고 제2 결합 도메인은 IgG의 경쇄의 N-말단 및/또는 경쇄의 C-말단 및/또는 중쇄의 N-말단 및/또는 중쇄의 C-말단에서 제1 결합 도메인에 부착된 scFv이거나, 반대의 경우도 마찬가지임);
    (b) 1가 항체, 예컨대 DuoBody ® 또는 '놉-인-홀' 이중특이적 항체(예를 들어, scFv-KIH, scFv-KIHr, BiTE-KIH 또는 BiTE-KIHr);
    (c) scFv2-Fc 항체;
    (d) 이중특이적 항체, 예컨대 이중특이적 T-세포 관여(BiTE) 항체;
    (e) 이중 가변 도메인(DVD)-Ig 항체;
    (f) 이중-친화성 재표적화(DART)-기반 항체(예를 들어, DART2-Fc 또는 DART);
    (g) 삼중특이적 항체, 예컨대 DNL-Fab3 항체;
    (h) scFv-HSA-scFv 항체; 및
    (i) 키메라 항원 수용체(CAR).
  77. 제74항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 펩티드에 대한 결합 특이성 및/또는 결합 친화성에 기반하여 후보 결합 분자를 선택하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  78. 제77항에 있어서, 상기 선택된 후보 결합 분자가
    (a) HCMV의 US28 단백질의 세포외 도메인 3(ECD3) 내에 완전히 제시된 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖고/갖거나;
    (b) US28 단백질의 ECD3 내의 선형 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖고/갖거나;
    (c) HCMV 균주 불가지론적인 HCMV의 US28 단백질의 ECD3 내의 에피토프에 대한 결합 특이성, 예를 들어, DB, Towne, AD169, DAVIS, BL, JP, Merlin, PH, TB40/E, Toledo, VHL/E, TR 및 VR1814(FIX)로 이루어진 군으로부터 선택된 HCMV 균주 중 2개 이상(예컨대 모두)에 대해 불가지론적인 HCMV의 US28 단백질의 ECD3 내의 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖고/갖거나;
    (d) US28 단백질의 ECD3이 TKKDNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 7) 또는 TKKNNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 6)의 서열을 포함하는지 여부에 관계없이, HCMV의 US28 단백질의 ECD3 내의 에피토프에 대한 특이성을 갖는 것인, 방법.
  79. 제77항 또는 제78항에 있어서, 상기 선택된 후보 결합 분자가 서열번호: 12의 서열로 이루어진 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드 및 서열번호: 18의 서열로 이루어진 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드를 포함하는 항체에 의해 입증된 것과 동일한 하나 이상의 펩티드에 대한 결합 특이성 및/또는 결합 친화성과 동등한 하나 이상의 펩티드에 대한 결합 특이성 및/또는 결합 친화성을 갖는 것인, 방법.
  80. 제77항, 제78항 또는 제79항 중 어느 한 항의 방법에 따라 선택된 선택된 후보 결합 분자의 재생산을 야기하는 단계를 포함하는, 결합 분자의 다중 카피를 포함하는 조성물을 생산하는 방법.
  81. 제77항, 제78항 또는 제79항 중 어느 한 항의 방법에 따라 선택된 선택된 후보 결합 분자를 평가하는 방법으로서, 결합 특성을 제공하는 선택된 후보 결합 분자 내의 구조(들)를 포함하고 식별하는 단계,
    예를 들어, 항체 또는 CAR인 선택된 후보 결합 분자에서 상기 또는 각각의 CDR 서열을 식별하는 단계를 포함하는 방법.
  82. 결합 분자의 다중 카피를 포함하는 조성물을 생산하는 방법으로서, 상기 결합 분자가 제81항의 방법에 따라 결합 특성을 제공하는 것으로서 선택된 후보 결합 분자 내에서 식별된 상기 또는 각각의 구조(들)를 포함하며,
    상기 방법은 결합 분자의 재생산을 야기하는 단계를 포함하는, 방법.
  83. 제80항 또는 제82항의 방법에 의해 수득된 결합 분자의 조성물.
  84. 서열 TKKNNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 6)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어지거나, 서열번호: 6의 면역원성 단편의 서열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드로서, 상기 펩티드 또는 폴리펩티드가 US28 단백질이 아니고, 바람직하게는 상기 펩티드 또는 폴리펩티드에서 유일한 US28-유래된 서열이 서열번호: 6의 서열 또는 서열번호: 6의 면역원성 단편의 서열인, 펩티드 또는 폴리펩티드.
  85. 서열 TKKDNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 7)를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어지거나, 서열번호: 7의 면역원성 단편의 서열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드로서, 상기 펩티드 또는 폴리펩티드가 US28 단백질이 아니고, 바람직하게는 상기 펩티드 또는 폴리펩티드에서 유일한 US28-유래된 서열이 서열번호: 7의 서열 또는 서열번호: 7의 면역원성 단편의 서열인, 펩티드 또는 폴리펩티드.
  86. 제84항 또는 제85항에 있어서, 상기 참조 서열 서열번호: 6 또는 7의 면역원성 단편이 참조 서열의 전체 서열 미만을 포함하고, 참조 서열의 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16개의 연속 아미노산을 포함하는 것인, 펩티드 또는 폴리펩티드.
  87. 제84항, 제85항 또는 제86항에 있어서, 상기 면역원성 단편이 서열번호: 6 및 서열번호: 7 둘 다에 공통이고, 그 내에 존재하는 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것인, 펩티드 또는 폴리펩티드.
  88. TKKNNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 6) 또는 TKKDNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 7)의 면역원성 단편 또는 변이체의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어진 펩티드 또는 폴리펩티드로서, 상기 면역원성 단편 또는 변이체가 항체 1D3, 1C10, 1A10, 1G9, 및/또는 1E8에 의해 결합된 US28의 ECD3 내의 에피토프의 서열을 포함하는 것인, 펩티드 또는 폴리펩티드.
  89. 제1 펩티드 또는 폴리펩티드 및 제2 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합으로서,
    상기 제1 펩티드 또는 폴리펩티드가 서열 TKKNNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 6), 또는 이의 면역원성 단편, 예컨대 제86항 또는 제88항에 의해 정의된 바와 같은 면역원성 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것을 포함하며, 단 상기 면역원성 단편은 적어도 서열번호: 6의 4N 아미노산을 포함하고;
    상기 제2 펩티드 또는 폴리펩티드가 서열 TKKDNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 7), 또는 이의 면역원성 단편, 예컨대 제86항 또는 제88항에 정의된 바와 같은 면역원성 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 것을 포함하며, 단 상기 면역원성 단편은 적어도 서열번호: 7의 4D 아미노산을 포함하는 것인, 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합.
  90. 제2 아미노산 서열에 직접적으로 또는 하나 이상의 링커 아미노산 서열을 통해 융합된 제1 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 융합 단백질로서,
    상기 제1 아미노산 서열이 제84항 내지 제88항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드의 서열이고;
    상기 제2 아미노산 서열이 융합 파트너이고, 임의적으로 상기 융합 파트너가 담체 단백질, 예컨대 제1 아미노산 서열에 대한 항체의 면역화 및 생성에 적합한 융합 단백질을 제공하도록 선택된 담체 단백질이며,
    임의적으로 상기 담체 단백질이 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), HSA(인간 혈청 알부민), BSA(소 혈청 알부민), OVA(오브알부민), 파상풍 톡소이드(TT), 디프테리아 톡소이드(DT), 디프테리아 독소의 유전적으로 변형된 교차 반응 물질(CRM), 메닝고코커스 외부 막 단백질 복합체(OMPC) 및　에이치. 인플루엔자에　단백질 D(HiD)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 융합 단백질.
  91. 제1 융합 단백질, 및 제2 융합 단백질을 포함하는, 적어도 2개의 별개의 융합 단백질의 조합으로서,
    제90항에 따른 제1 융합 단백질이 제1 융합 단백질의 제1 아미노산 서열로서, 서열 TKKNNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 6), 또는 이의 면역원성 단편, 예컨대 제86항 또는 제88항에 의해 정의된 바와 같은 면역원성 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 서열을 포함하며, 단 상기 면역원성 단편은 적어도 서열번호: 6의 4N 아미노산을 포함하고;
    제90항에 따른 제2 융합 단백질이 제2 융합 단백질의 제1 아미노산 서열로서, 서열 TKKDNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 7), 또는 이의 면역원성 단편, 예컨대 제86항 또는 제88항에 의해 정의된 바와 같은 면역원성 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 서열을 포함하며, 단 상기 면역원성 단편은 적어도 서열번호: 7의 4D 아미노산을 포함하는 것인, 적어도 2개의 별개의 융합 단백질의 조합.
  92. 제84항 내지 제88항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 제90항에 정의된 바와 같은 융합 단백질에 접합된 모이어티를 포함하는 접합체.
  93. 제92항에 있어서,
    (i) 모이어티가 제84항 내지 제88항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 제90항에 정의된 바와 같은 융합 단백질에 직접적으로 접합되거나;
    (ii) 모이어티가 제84항 내지 제88항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 제90항에 정의된 바와 같은 융합 단백질에 간접적으로, 예컨대 링커를 통해 접합되는 것인, 접합체.
  94. 제92항 또는 제93항에 있어서, 상기 모이어티가 담체, 예를 들어 담체 단백질, 예를 들어 KLH(키홀 림펫 헤모시아닌), HSA(인간 혈청 알부민), BSA(소 혈청 알부민), OVA(오브알부민), 파상풍 톡소이드(TT), 디프테리아 톡소이드(DT), 디프테리아 독소의 유전적으로 변형된 교차 반응 물질(CRM), 메닝고코커스 외부 막 단백질 복합체(OMPC) 및　에이치. 인플루엔자에　단백질 D(HiD)로부터 선택된 담체인, 접합체.
  95. 적어도 2개의 별개의 접합체의 조합으로서, 상기 조합이
    서열 TKKNNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 6), 또는 이의 면역원성 단편, 예컨대 제86항 또는 제88항에 의해 정의된 바와 같은 면역원성 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어지며, 단 상기 면역원성 단편은 적어도 서열번호: 6의 4N 아미노산을 포함하는 것인, 펩티드 또는 폴리펩티드에 접합된 모이어티를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진, 제92항 내지 제94항 중 어느 한 항에 따른 제1 접합체; 및
    서열 TKKDNQCMTDYDYLEVS(서열번호: 7), 또는 이의 면역원성 단편, 예컨대 제86항 또는 제88항에 의해 정의된 바와 같은 면역원성 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어지며, 단 상기 면역원성 단편은 적어도 서열번호: 7의 4D 아미노산을 포함하는 것인, 펩티드 또는 폴리펩티드에 접합된 모이어티를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진, 제92항 내지 제94항 중 어느 한 항에 따른 제2 접합체
    를 포함하는 것인, 적어도 2개의 별개의 접합체의 조합.
  96. 제92항 내지 제94항 중 어느 한 항에 따른 접합체를 생산하는 방법으로서,
    (a) 제84항 내지 제88항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 제90항에 정의된 바와 같은 융합 단백질을 제공하는 단계; 및
    (b) 제84항 내지 제88항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 제90항에 정의된 바와 같은 융합 단백질에 모이어티를 접합시키는 단계
    를 포함하는, 방법.
  97. 제95항에 정의된 바와 같은 적어도 2개의 별개의 접합체의 조합을 생산하는 방법으로서,
    (a) 제95항에 따른 방법에 의해 제90항에 정의된 바와 같은 제1 접합체를 생산하는 단계;
    (b) 제95항에 따른 방법에 의해 제90항에 정의된 바와 같은 제2 접합체를 생산하는 단계; 및
    (c) 제1 및 제2 접합체를 조합하여, 제95항에 따른 조합을 형성하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  98. 제95항에 정의된 바와 같은 적어도 2개의 별개의 접합체의 조합을 생산하는 방법으로서,
    (a) 제89항에 따른 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합, 또는 제91항에 따른 적어도 2개의 별개의 융합 단백질의 조합을 제공하는 단계; 및
    (b) 제89항에 따른 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합, 또는 제91항에 따른 적어도 2개의 별개의 융합 단백질의 조합에 모이어티를 접합시켜, 제95항에 따른 조합을 형성하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  99. 제96항, 제97항 또는 제98항에 있어서, 이렇게 생산된 접합체 또는 접합체의 조합을 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
  100. 제97항 내지 제99항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득되거나, 수득가능한 단리된 접합체, 또는 접합체의 조합으로서,
    임의적으로, 상기 단리된 접합체가 대상체에게 투여하기 위해 추가로 제형화되는 것인, 단리된 접합체, 또는 접합체의 조합.
  101. 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합으로서,
    상기 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합이 집합적으로, 개별적으로 또는 조합하여 제84항 내지 제88항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 펩티드 및/또는 폴리펩티드, 제89항에 따른 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합, 제90항에 따른 융합 단백질, 및/또는 제91항에 따른 적어도 2개의 별개의 융합 단백질의 조합을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 것인, 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합.
  102. 제101항에 있어서, 상기 또는 각각의 핵산 분자가 DNA 또는 RNA 분자로부터 독립적으로 선택되는 것인, 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합.
  103. 제101항 또는 제102항에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합을 포함하는 벡터.
  104. 제103항에 있어서, 상기 벡터가 레트로바이러스 벡터, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 및 아데노바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 벡터.
  105. 제101항 또는 제102항에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합, 또는 제103항 또는 제104항에 따른 벡터를 포함하는 세포로서,
    임의적으로 상기 세포가 제84항 내지 제88항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드, 제89항에 따른 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합, 제90항에 따른 융합 단백질, 또는 제91항에 따른 적어도 2개의 별개의 융합 단백질의 조합을 발현하는 것인, 세포.
  106. 제84항 내지 제88항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드, 제89항에 따른 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합, 제90항에 따른 융합 단백질, 제91항에 따른 적어도 2개의 별개의 융합 단백질의 조합, 제92항 내지 제94항 중 어느 한 항에 따른 접합체, 제95항에 따른 적어도 2개의 별개의 접합체의 조합, 제101항 또는 제102항에 따른 핵산 분자, 또는 다수의 별개의 핵산 분자의 조합, 또는 제103항 또는 제104항에 따른 벡터에 노출되고/되거나 포함하는 세포.
  107. US28의 ECD3 내의 에피토프에 대한 특이성을 갖는 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 세포(예를 들어 자연 발생 T 세포, 또는 제14항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 CAR을 발현하는 재조합 세포, 예를 들어 CAR T-세포, CAR NK-세포 및/또는 CAR-대식세포)를 단리 및/또는 풍부화하는 방법으로서,
    상기 방법이 서열번호: 6 및/또는 7의 서열 중 하나 또는 둘 다에 대한 결합 특이성을 갖는 세포를 단리 및/또는 풍부화하기 위해 제제를 사용하는 단계를 포함하며,
    상기 제제는 제84항 내지 제88항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 폴리펩티드, 제89항에 따른 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합, 제90항에 따른 융합 단백질, 제91항에 따른 적어도 2개의 별개의 융합 단백질의 조합, 제92항 내지 제94항 중 어느 한 항에 따른 접합체, 및/또는 제95항에 따른 적어도 2개의 별개의 접합체의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  108. 제107항에 있어서, 상기 서열이 MHC 사량체, 예를 들어 항원-특이적 CD8+　T 세포 검출을 위한 클래스 I MHC 사량체, 항원-특이적 CD4+　T 세포 검출을 위한 클래스 II MHC 사량체, 유세포 분석법 또는 형광 현미경 검사를 위한 형광단 표지된 사량체로서 제형화되는 것인, 방법.
  109. 제107항 또는 제108항에 있어서, 상기 T-세포가 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 효과기 T 세포, 헬퍼 T 세포, 기억 T 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), EBV-특이적 T 세포 수용체(TCR) 또는 γδ-T 세포 하위유형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  110. 제84항 내지 제88항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 폴리펩티드, 제89항에 따른 적어도 2개의 별개의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 조합을 포함하는 MHC 사량체로서, 임의적으로 상기 펩티드가 서열번호: 6 또는 서열번호: 7, 또는 어느 하나 또는 둘 다의 면역원성 단편을 포함하거나 이에 상응하며,
    예를 들어 상기 MHC 사량체가 항원-특이적 CD8+　T 세포 검출을 위한 클래스 I MHC 사량체, 항원-특이적 CD4+　T 세포 검출을 위한 클래스 II MHC 사량체, 유세포 분석법 또는 형광 현미경 검사를 위한 형광단 표지된 사량체인, MHC 사량체.
  111. 제110항에 있어서, US28의 ECD3 내의 에피토프에 대한 특이성을 갖는 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 세포, 예를 들어, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 효과기 T 세포, 헬퍼 T 세포, 기억 T 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), EBV-특이적 T 세포 수용체(TCR) 또는 γδ-T 세포 하위유형으로 이루어진 군으로부터 선택된 T-세포 및/또는 제14항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 CAR을 발현하는 재조합 세포, 예를 들어 CAR T-세포, CAR NK-세포 및/또는 CAR-대식세포를 단리 및/또는 풍부화하는 데 사용하기 위한, MHC 사량체.
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