KR20230148017A - 암세포 전이특성 평가용 소자 및 암세포 전이특성 평가 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 암세포의 세포견인력에 기초한 암세포 전이특성 평가용 소자 및 암세포 전이특성 평가 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 암세포 전이특성 평가용 소자 및 암세포 전이특성 평가 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 암세포의 세포견인력에 기초한 암세포 전이특성 평가용 소자 및 암세포 전이특성 평가 방법에 관한 것이다.
전이(metastasis)란, 종양이 발생한 부위에서 물리적으로 분리된 다른 부위로 종양이 퍼진 것이라 정의할 수 있다. 양성 종양의 경우 침습성이 없어 전이가 일어나지 않지만, 거의 모든 악성 종양(암)은 침습성에 의해 전이가 일어날 수 있다. 악성 종양의 전이 경로에는 크게 몸 표면-몸 공간, 혈행성, 림프관이 있으며, 몸 표면과 공간으로 암세포가 '씨를 뿌려놓은 것'과 같이 퍼져 자라는 것을 파종(direct seeding)이라 한다. 혈행성 전이는 암세포가 혈관 벽을 통과하여 혈관으로 들어가고, 혈류를 통해 이동하며 다른 부위에 도착한 다음 해당 부위에서 성장 및 분열하는 것을 의미한다.
암 전이는 암으로 인한 사망의 90% 이상을 차지하는 주된 원인이지만, 안타깝게도 현대의학에서는 여전히 암 전이성을 예측하거나 전이성 암 환자에게 최적화된 치료법을 제안하지 못하고 있는 실정이다. 많은 연구를 통해서 다른 장기로의 전이를 위해서는 암세포의 혈관 내 침습이 필요하며, 이 때, 상피세포의 중간엽 전환, (Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)라는 암전이의 필수적 기작이 암세포의 이동성을 강력하게 증진한다고 알려져 있다. 또한 EMT는 암의 화학 및 면역치료의 주요 저항 메커니즘으로 입증되었고, 강한 EMT를 나타내는 환자군의 예후가 가장 좋지 않은 것으로 보고된 바 있다. 따라서, 차세대 암 면역 치료를 포함한 암 치료기술 개발을 위해 정확하고 효율적인 EMT 평가 플랫폼에 대한 임상적 필요성이 대두되고 있다. 하지만 현재는 암 조직에서 EMT의 수준을 정확하고 효율적으로 평가할 수 있는 임상 평가 방법이 없는 실정이다. 현재 대표적인 EMT 분석 방법인 전사체 분석법은 분석에 많은 시간과 비용, 전문성이 극도로 요구되어 임상 적용이 어렵고, 수 많은 pathway와 signature에서 EMT 관련성이 높은 유전자를 도출하더라도 환자 암 조직마다 상이한 유전체 특성으로 인해 환자 샘플에 대한 분석 정확도가 낮은 실정이다.
암세포의 전이특성 및 EMT 분석을 위한 완전히 새로운 방법으로서 본 발명에서 주목한 점은, 암세포의 전이특성 및 EMT와 세포 견인력과의 상관관계이다. 세포는 세포 외 기질 유전자와 단백질 발현을 변경하여 정상적인 조직 구조와 기능을 유지하거나, 조직의 병리학적 변화를 유발한다. 세포 자체에 작용하는 외부의 힘 외에도 세포는 세포외 기질에 작용하는 자체적인 기계적 힘을 생성하는데, 이 힘을 세포견인력(CTF, Cell Traction Force)이라고 한다. 세포는 세포견인력을 통해 세포 모양 유지, 조직 내 이동, ECM 재구성, 인접 세포와의 통신 등 다양한 작업을 수행할 수 있으며, 세포외 기질을 변형시켜 DNA 합성, ECM 단백질 분비 및 세포 분화를 포함한 세포기능을 조절한다.
세포견인력의 기계적 신호는 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 기능에 중요한 역할을 하며, 암세포는 EMT 과정을 거치면서 세포끼리의 접착력을 잃고, 세포외 기질과의 결합력이 강해지면서 이동성과 침습성을 획득한다. 이 과정을 통해 암세포는 기질에 미치는 세포견인력을 증가시키게 된다. 실제로, EMT를 유도한 세포에서 세포 견인력이 크게 증가함이 보고된 바 있으며, 전이성이 높은 세포들이 그렇지 않은 세포들에 비해 높은 세포견인력을 나타낸다고 보고된 바 있다.
이러한 세포견인력을 정량적으로 측정하기 위한 방법으로서 다양한 방법이 연구되었다. 최근에는 세포견인력 현미경(Traction force microscopy)를 사용하여, 폴리아크릴아미드 젤 매트릭스에 형광 마이크로비드를 내장하고, 세포를 배양하였을 때 세포견인력에 의한 형광 마이크로비드의 변위를 이미지로 촬영하여 세포 투입 전후의 형광 비드의 이동을 바탕으로 데이터 프로세싱을 통해 세포견인력을 계산하는 방법이 발표되었으나, 매우 정교한 소자의 제작이 필수적이고, 이미지 촬영 및 젤 매트릭스의 물리적 특성을 고려한 복잡한 데이터 프로세싱 과정을 거쳐야 하며 하나의 디바이스에 극소수의 세포 분석만 가능하다는 점에서 세포군이 나타내는 통계적인 세포견인력 데이터의 확보가 어려웠다.
또한, 탄성 재료인 PDMS 소재의 마이크로필러를 제작하고, 이에 세포를 배양하여 마이크로필러 윗면에 세포가 부착되도록 하고, 세포의 세포견인력에 의해 마이크로필러가 휘어진 정도 및 마이크로필러의 물리적 특성과의 상관관계를 바탕으로 세포가 가하는 견인력을 계산하는 방법이 발표되었다. 그러나 이러한 방법에 있어서도 마이크로필러의 물리적 특성을 고려하여 휘는 정도를 바탕으로 데이터 프로세싱을 통해 세포견인력을 측정하여야 하는 바, 역시 정교한 소자의 제작 및 이미지 촬영/프로세싱이 필요하며 통계적 데이터 확보가 어려워서 실제 임상 환경 및 약물 스크리닝 분야에 적용이 어려운 문제가 있다.
이에, 암세포의 전이특성을 세포견인력을 기반으로 분석하기 위해서는 기존 측정방법과는 차별화된 새로운 방식의 접근이 필요하다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 암세포의 세포견인력에 기초한 암세포 전이특성 평가용 소자 및 암세포 전이특성 평가 방법을 제공하는 것이다.
다만, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 상기 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 전이성 암세포의 세포견인력에 의해 색상 변화, 형광 변화, 발광 변화 및 이들의 조합 중 어느 하나의 형태로 반응하는 유기분자 화합물을 포함하는 암세포 전이특성 평가용 소자가 제공된다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 유기분자 화합물에 더하여 세포외 기질(Extracellular matrix, ECM) 고분자를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 유기분자 화합물은 탄소수 5 내지 10의 직쇄 또는 분지쇄의 알킬기 및 할로겐기를 포함하는 다이케토피롤로피롤(diketopyrrolopyrrole)계 화합물인 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 암세포 전이특성 평가용 소자는, 전기 공급을 제어하는 전원부; 암세포를 배양하는 세포배양부; 암세포를 적용하는 입력부; 유기분자 화합물, 또는 상기 유기분자 화합물 및 세포외 기질 고분자를 포함하고, 상기 유기분자 화합물이 전이성 암세포의 세포견인력에 의해 나타내는 반응을 출력하는 출력부; 및 상기 출력부의 색상 변화, 형광 변화, 발광 변화 및 이들의 조합 중 어느 하나의 형태의 반응을 증폭시켜 육안 또는 기기로 확인할 수 있는 시각적 정보를 제공하는 증폭부; 상기 출력부가 2개 이상인 경우, 각 출력부의 상기 반응을 통합하여 수치화된 데이터를 나타내는 결과부; 중 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
발명의 일 측면에 따르면, 상기 암세포 전이특성 평가용 소자가 복수 개의 출력부를 포함하는 경우, 상기 복수 개의 출력부는 각각 독립적으로 상이한 종류의 세포외 기질 고분자를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 암세포 전이특성 평가용 소자가 복수 개의 출력부를 포함하는 경우, 상기 복수 개의 출력부는 각각 독립적으로 상이한 농도의 세포외 기질 고분자를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 암세포 전이특성 평가용 소자가 복수 개의 출력부를 포함하는 경우, 상기 복수 개의 출력부는 각각 독립적으로 반응을 출력하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 암세포 전이특성 평가용 소자를 이용하는 암세포 전이특성 평가 방법이 제공된다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 평가 대상인 암세포를 유기분자 화합물 상에 적용하는 단계; 및 상기 유기분자 화합물에 색상 변화, 형광 변화, 발광 변화 및 이들의 조합 중 어느 하나의 형태로 나타나는 반응이 검출되는 경우, 상기 암세포가 전이성 암세포인 것으로 확인하는 단계; 를 포함하는 것인 암세포 전이특성 평가 방법이 제공된다.
본 발명의 일 구현예에 따른 암세포 전이특성 평가용 소자는 암세포의 전이성을 평가함에 있어 간단하고 효율적으로 다수 암세포의 전이성 발현 여부를 통계적으로 평가할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 암세포 전이특성 평가 방법은 간단하고 효율적으로 다수 암세포의 전이성 발현 여부를 통계적으로 평가할 수 있다.
본 발명의 효과는 상술한 효과로 한정되는 것은 아니며, 언급되지 아니한 효과들은 본원 명세서로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 위암 세포주 MKN-1 및 난소암 세포주 SKOV-3을 실시예 2 및 9에서 제조한 암세포 전이특성 평가용 소자에 적용한 결과 도면이다.
도 2는 위암 세포주 MKN-1을 실시예 1 및 4 내지 8에서 제조한 암세포 전이특성 평가용 소자에 적용한 결과 도면이다.
도 3a는 위암 세포주 MKN-1 및 위암 세포주 MKN-45를 실시예 1 내지 3에서 제조한 암세포 전이특성 평가용 소자에 적용한 결과 도면이다.
도 3b는 난소암 세포주 SKOV-3 또는 난소암 세포주 OVCAR-3을 실시예 6, 9 및 10에서 제조한 암세포 전이특성 평가용 소자에 적용한 결과 도면이다.
도 4는 위암 세포주 MKN-1 및 위암 세포주 MKN-45를 실시예 1에서 제조한 암세포 전이특성 평가용 소자에 적용한 결과 도면이다.
도 2는 위암 세포주 MKN-1을 실시예 1 및 4 내지 8에서 제조한 암세포 전이특성 평가용 소자에 적용한 결과 도면이다.
도 3a는 위암 세포주 MKN-1 및 위암 세포주 MKN-45를 실시예 1 내지 3에서 제조한 암세포 전이특성 평가용 소자에 적용한 결과 도면이다.
도 3b는 난소암 세포주 SKOV-3 또는 난소암 세포주 OVCAR-3을 실시예 6, 9 및 10에서 제조한 암세포 전이특성 평가용 소자에 적용한 결과 도면이다.
도 4는 위암 세포주 MKN-1 및 위암 세포주 MKN-45를 실시예 1에서 제조한 암세포 전이특성 평가용 소자에 적용한 결과 도면이다.
본 명세서에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.
이하, 본 발명에 대하여 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 전이성 암세포의 세포견인력에 의해 색상 변화, 형광 변화, 발광 변화 및 이들의 조합 중 어느 하나의 형태로 반응하는 유기분자 화합물을 포함하는 암세포 전이특성 평가용 소자가 제공된다.
본 발명의 일 구현예에 따른 암세포 전이특성 평가용 소자는 매우 작은 물리적 자극에 해당하는 전이성 암세포의 세포견인력을 감지하여, 색상 변화, 형광 변화, 발광 변화 및 이들의 조합 중 어느 하나의 형태로 반응하는 유기분자 화합물을 포함함으로써 효율적이고 통계적으로 악성 종양, 즉 암의 전이성 발현 여부, 즉 전이 가능성을 조기에 진단할 수 있고, 나아가 암세포의 전이특성의 평가가 가능할 수 있다.
구체적으로, 매우 민감한 물리적 자극에 의해 화합물의 구조나 배열이 변화하며, 이에 따라 매우 큰 형광 변화를 나타내는 유기분자 화합물을 이용하여, 발현되는 색상 변화, 형광 변화, 발광 변화와 같은 반응의 유무에 따라 높은 전이성을 나타내는 암세포와 낮은 전이성을 나타내는 암세포를 구별해 낼 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 “색상 변화”란, 가시광선이 해당 화합물로부터 반사 또는 투과되어 나타내는 색깔이 변화하는 것을 의미할 수 있다. 예를 들어, 적색의 유기분자 화합물이 전이성 암세포의 세포견인력에 의해 청색으로 변화하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 “형광(fluoroscence) 변화”란, 형광 색상 및/또는 형광 세기의 변화를 의미할 수 있고, 형광이란 외부의 광 에너지를 흡수하여 이를 빛으로 방출하면서 나타내는 현상으로서, 예를 들어 녹색의 어두운 형광 특성을 갖는 유기분자 화합물이 전이성 암세포의 세포견인력에 의해 녹색의 밝은 형광 특성으로 변화하는 것일 수 있다(형광세기의 변화).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 “발광(luminescence) 변화”란, 자체적으로 빛을 내지 않던 화합물이 외부 자극에 의해 광을 방출하는 것을 의미할 수 있다. 예를 들어, 빛을 내지 않던 유기분자 화합물이 전이성 암세포의 세포견인력에 의해 광을 방출하는 것으로 변화하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 유기분자 화합물은 특별히 제한되지는 않으며, 역학변색 화합물(mechanochromic materials), 압전변색 화합물(piezochromic materials), 마찰변색 화합물(tribochromic materials) 등 물리적 자극에 대하여 색상 변화, 형광 변화, 발광 변화 및 이들의 조합 중 어느 하나의 형태로 반응하는 화합물을 사용할 수 있다.
상기와 같이 색상 변화, 형광 변화, 발광 변화 및 이들의 조합 중 어느 하나의 형태로 반응하는 화합물을 사용하는 경우, 육안 또는 기기로 세포견인력에 따른 유기 화합물의 색상 변화, 형광 변화, 발광 변화를 바탕으로 높은 전이성을 나타내는 암세포와 낮은 전이성을 나타내는 암세포를 구별해 낼 수 있다. 즉, 낮은 전이성의 암세포에서는 변화가 관찰되지 않으나, 높은 전이성의 암세포에서는 뚜렷한 색상 변화, 형광 변화 및/또는 발광 변화를 바탕으로 대상 암세포의 전이성 발현을 판단할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 유기분자 화합물은 탄소수 5 내지 10의 직쇄 또는 분지쇄의 알킬기 및 할로겐기를 포함하는 다이케토피롤로피롤(diketopyrrolopyrrole)계 화합물일 수 있다. 구체적으로, 상기 유기분자 화합물은 옥틸(octyl)기 및 브롬(Br)기를 포함하는 다이케토피롤로피롤계 화합물일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 암세포 전이특성 평가용 소자는 상기 유기분자 화합물과 상호작용하는 세포외 기질(Extracellular matrix, ECM) 고분자를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 세포외 기질 고분자는 세포가 잘 부착될 수 있도록 하는 역할을 수행할 수 있고, 이에 따라 유기분자 화합물에 세포의 세포견인력을 더 잘 전달할 수 있도록 하여 유기분자 화합물의 감도를 향상시킬 수 있는 것으로서, 세포가 잘 부착하는 고분자라면 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴 등의 고분자를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 유기분자 화합물 및 상기 세포외 기질(ECM) 고분자는 특정 조합으로 사용되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 유기분자 화합물은 다양한 세포외 기질 고분자 중에서도 특히 세포견인력에 대한 감도를 향상시킬 수 있는 세포외 기질 고분자와의 조합이 존재할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 암세포 전이특성 평가용 소자는, 전기 공급을 제어하는 전원부; 암세포를 배양하는 세포배양부; 암세포를 적용하는 입력부; 유기분자 화합물, 또는 상기 유기분자 화합물 및 세포외 기질 고분자를 포함하고, 상기 유기분자 화합물이 전이성 암세포의 세포견인력에 의해 나타내는 반응을 출력하는 출력부; 및 상기 출력부의 색상 변화, 형광 변화, 발광 변화 및 이들의 조합 중 어느 하나의 형태의 반응을 증폭시켜 육안 또는 기기로 확인할 수 있는 시각적 정보를 제공하는 증폭부; 상기 출력부가 2개 이상인 경우, 각 출력부의 상기 반응을 통합하여 수치화된 데이터를 나타내는 결과부; 중 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 전원부는 전기 공급이 필요한 경우에 구비되는 것일 수 있고, 이러한 전원부는 외부 전원과 연결되어 있는 형태이거나, 배터리를 내장하는 형태일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 세포배양부는 암세포를 배양하기 위해 구비되는 것일 수 있고, 소량의 암세포에 있어 측정에 필요한 정도의 세포들을 수득하기 위해 세포 배양이 필요한 경우에 구비되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 입력부는 암세포를 적용하는 부분에 해당하며, 상기 입력부에 암세포를 투입, 도포 내지는 배양하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 출력부는 유기분자 화합물을 포함할 수 있고, 상기 유기분자 화합물 및 세포외 기질 고분자를 포함하는 것일 수도 있다. 상기 출력부는 상기 입력부의 암세포에 따른 세포견인력을 물리적 자극으로 감응하여, 색상 변화, 형광 변화, 발광 변화 및 이들의 조합 중 어느 하나의 형태의 반응을 출력하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 암세포 전이특성 평가용 소자가 복수 개의 출력부를 포함하는 경우, 상기 복수 개의 출력부는 각각 독립적으로 상이한 종류의 세포외 기질 고분자를 포함하는 것이거나, 각각 독립적으로 상이한 농도의 세포외 기질 고분자를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 암세포 전이특성 평가용 소자가 복수 개의 출력부를 포함하는 경우, 상기 복수 개의 출력부는 각각 독립적으로 반응을 출력하는 것일 수 있다. 상기 출력부는 세포견인력에 대하여 서로 상이한 정도의 감도를 갖는 것일 수 있다. 상기한 바와 같이, 상이한 종류의 세포외 기질 고분자를 포함하거나, 동일한 유기분자 화합물 및 세포외 기질 고분자를 포함하더라도 상기 세포외 기질 고분자의 농도가 상이하여 각 출력부의 감도가 상이한 것일 수 있다. 이에 따라, 각 출력부는 반응이 출력되는 기준 자극이 서로 상이할 수 있으며, 이에 따라 암세포 전이특성 평가의 정확도가 보다 높을 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 출력부는 제1층 및 제2층을 포함하는 다층 형태일 수 있다. 상기 제1층은 유기분자 화합물을 포함하는 용융액 또는 용해액을 코팅하여 형성되는 것일 수 있다. 상기 용해액의 경우, 유기 용제를 포함할 수 있고, 구체적으로, 상기 코팅은 드랍캐스팅, 블레이딩 또는 스핀코팅 방법으로 수행되는 것일 수 있다.
또한, 상기 제2층은 세포외 기질 고분자를 포함하는 수용액을 제1층 상에 코팅하여 형성되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 입력부와 출력부는 하나의 부분으로 구성되는 것일 수 있다. 즉, 본 발명의 일 구현예에 따른 암세포 전이특성 평가용 소자는 입출력부를 구비하는 것일 수 있다. 입출력부는, 암세포를 유기분자 화합물에 직접 적용하는 것으로서, 입력 및 출력이 동일 부분에서 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 증폭부는 상기 출력부의 반응을 증폭시키기 위해 구비되는 것일 수 있다. 세포 하나의 세포견인력 및 이에 따른 화합물의 반응은 그 정도가 매우 작을 수 있으며, 이러한 반응을 증폭시켜 측정이 가능하도록 할 필요가 있을 때 상기 증폭부가 구비되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 결과부는 다수의 출력부의 반응을 취합하여 나타내는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 출력부가 2개 이상인 경우, 각 출력부의 상기 반응을 통계적으로 처리하여 암세포의 전이특성을 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 암세포 전이특성 평가용 소자를 이용하는 암세포 전이특성 평가 방법이 제공된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 평가 대상인 암세포를 유기분자 화합물 상에 적용하는 단계; 및 상기 유기분자 화합물에 색상 변화, 형광 변화, 발광 변화 및 이들의 조합 중 어느 하나의 형태로 나타나는 반응이 검출되는 경우, 상기 암세포가 전이성 암세포인 것으로 확인하는 단계;를 포함하는 것인 암세포 전이특성 평가 방법이 제공된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 평가 대상인 암세포를 유기분자 화합물 상에 적용하였을 때, 색상 변화, 형광 변화, 발광 변화 및 이들의 조합 중 어느 하나의 형태로 나타나는 반응이 검출되지 않는 경우 상기 암세포는 전이성이 낮은 것으로 확인할 수 있고, 반응이 검출되는 경우, 상기 암세포는 높은 전이성 암세포인 것으로 확인할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 평가 대상인 암세포를 유기분자 화합물 상에 적용하는 단계 이후, 직후 내지 7일 후에 반응이 검출되는지 여부를 확인하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 평가 대상인 암세포의 종류는 한정되지 않는다. 예를 들어, 위암 세포, 폐암 세포, 유방암 세포, 난소암 세포, 대장암 세포 등일 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 기술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되지 않는다. 본 명세서의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1
기판 상에 하기 화학식의 구조를 갖는 다이케토피롤로피롤 화합물을 포함하는 용해액을 활용하여 스핀코팅 방법을 통해 필름을 형성하였다. 상기 코팅층 상에 콜라겐 II를 세포외 기질 고분자로서 200 μg/ml의 수용액을 드랍캐스팅 방법으로 추가적으로 코팅한 뒤, 증류수로 3번 이상 세척하여 암세포 전이특성 평가용 소자를 제조하였다.
[화학식]
실시예 2
상기 실시예 1에 있어서, 콜라겐 II를 세포외 기질 고분자로서 100 μg/ml의 수용액을 코팅한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 암세포 전이특성 평가용 소자를 제조하였다.
실시예 3
상기 실시예 1에 있어서, 콜라겐 II를 세포외 기질 고분자로서 50 μg/ml의 수용액을 코팅한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 암세포 전이특성 평가용 소자를 제조하였다.
실시예 4
상기 실시예 1에 있어서, 콜라겐 II 대신 콜라겐 I를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 암세포 전이특성 평가용 소자를 제조하였다.
실시예 5
상기 실시예 1에 있어서, 콜라겐 II 대신 콜라겐 IV를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 암세포 전이특성 평가용 소자를 제조하였다.
실시예 6
상기 실시예 1에 있어서, 콜라겐 II 대신 피브로넥틴을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 암세포 전이특성 평가용 소자를 제조하였다.
실시예 7
상기 실시예 1에 있어서, 콜라겐 II 대신 라미닌을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 암세포 전이특성 평가용 소자를 제조하였다.
실시예 8
상기 실시예 1에 있어서, 콜라겐 II 대신 비트로넥틴을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 암세포 전이특성 평가용 소자를 제조하였다.
실시예 9
상기 실시예 1에 있어서, 피브로넥틴을 세포외 기질 고분자로서 100 μg/ml의 수용액을 드랍캐스팅 방법으로 코팅한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 암세포 전이특성 평가용 소자를 제조하였다.
실시예 10
상기 실시예 1에 있어서, 피브로넥틴을 세포외 기질 고분자로서 50 μg/ml의 수용액을 드랍캐스팅 방법으로 코팅한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 암세포 전이특성 평가용 소자를 제조하였다.
실험예 1: 세포 부착 기간에 따른 평가
상기 실시예 2 및 9에서 제조한 암세포 전이특성 평가용 소자에, 각각 높은 전이성(EMT high)의 MKN-1 위암 세포주 및 높은 전이성(high EMT)의 SKOV-3 난소암 세포주를 적용하고, 1일, 2일 또는 3일이 경과한 후의 디바이스의 형광 시그널을 관찰하였다.
도 1에 각각 위암 세포주 MKN-1 및 난소암 세포주 SKOV-3를 실시예 2 및 9에서 제조한 암세포 전이특성 평가용 소자에 적용하여 1일, 2일 또는 3일간 배양한 후 현미경을 통해 실제 세포의 형태를 나타내는 명시야상(bright field image)과 소자의 형광 신호를 나타내는 형광 결과 도면을 나타내었다.
Olympus 사의 IX-83 형광현미경을 통해 관찰하였고, 명시야상은 Transmitted DIC Mirror Unit IX3-FDICT 기기를 사용하여 10x 배율로, 형광은 excitation filter 460-495, dichroic mirror DM505, interference barrier filter 510IF를 이용하여 power 25%, 노출시간 200ms, 10x 배율로 관찰하였다. 이하에서도 같다.
도 1을 참조하면, 1일 이후부터 세포 견인력에 의한 다이케토피롤로피롤 화합물의 결정화에 의해 녹황색 형광 변화(turn-on 형광 시그널)가 관찰되기 시작하여, 2일 후의 소자의 경우 세포 견인력에 의한 뚜렷한 형광 변화가 관찰된 것을 확인할 수 있다.
실험예 2: 세포외 기질 고분자의 종류에 따른 최적화
상기 실시예 1 및 4 내지 8에서 제조한 암세포 전이특성 평가용 소자에, 각각 높은 전이성(EMT high)의 MKN-1 위암 세포주를 적용하고, 2일이 경과한 후의 디바이스의 형광 시그널을 관찰하였다.
도 2에 위암 세포주 MKN-1를 실시예 1 및 4 내지 8에서 제조한 암세포 전이특성 평가용 소자에 적용하여 2일간 배양한 후 현미경을 통해 실제 세포의 형태를 나타내는 명시야상(bright field image)과 소자의 형광 신호를 나타내는 형광 결과 도면을 나타내었다.
도 2를 참조하면, 높은 전이성의 MKN-1은 실시예 1 및 4 내지 8 모두에서 형광 변화를 확인할 수 있다.
실험예 3: 세포외 기질 농도에 따른 반응의 관찰 및 평가
상기 실시예 1 내지 3에서 제조한 암세포 전이특성 평가용 소자에, 각각 높은 전이성(EMT high)의 MKN-1 위암 세포주 및 낮은 전이성(low EMT)의 MKN-45 위암 세포주를 적용하고, 2일이 경과한 후의 디바이스의 형광 시그널을 관찰하였다.
도 3a에 각각 위암 세포주 MKN-1 또는 위암 세포주 MKN-45를 실시예 1 내지 3에서 제조한 암세포 전이특성 평가용 소자에 적용하여 2일간 배양한 후 현미경을 통해 실제 세포의 형태를 나타내는 명시야상(bright field image)과 소자의 형광 신호를 나타내는 형광 결과 도면을 나타내었다.
도 3a를 참조하면, 높은 전이성을 나타내는 MKN-1은 세포외 기질 고분자 농도가 높아짐에 따라 형광 변화가 증가하는 반면, 상대적으로 낮은 전이성을 나타내는 MKN-45는 세포외 기질 고분자 농도가 달라짐에 상관 없이 모든 실시예의 소자에서 형광 변화가 나타나지 않았다.
또한, 상기 실시예 6, 9 및 10 에서 제조한 암세포 전이특성 평가용 소자에, 각각 높은 전이성(EMT high)의 SKOV-3 난소암 세포주 및 낮은 전이성(low EMT)의 OVCAR-3 난소암 세포주를 적용하고, 2일이 경과한 후의 디바이스의 형광 시그널을 관찰하였다.
도 3b에 각각 난소암 세포주 SKOV-3 또는 난소암 세포주 OVCAR-3을 실시예 6, 9 및 10에서 제조한 암세포 전이특성 평가용 소자에 적용하여 2일간 배양한 후 현미경을 통해 실제 세포의 형태를 나타내는 명시야상(bright field image)과 소자의 형광 신호를 나타내는 형광 결과 도면을 나타내었다.
도 3b를 참조하면, 높은 전이성을 나타내는 난소암 세포주인 SKOV-3는 도 3a에서의 MKN-1 평가 결과와 유사하게 세포외 기질 고분자의 농도가 높아짐에 따라 형광 변화의 정도가 증가함을 확인하였다. 한편, 상대적으로 낮은 전이성을 나타내는 OVCAR-3의 경우 피브로넥틴의 농도가 낮은 실시예 9 및 10의 소자에서는 형광 변화가 관찰되지 않지만 실시예 6의 소자에서는 일부 세포에서 형광 시그널이 관찰되는 것을 확인할 수 있다.
도 3a 및 도 3b에 따르면, 세포외 기질 고분자의 농도가 증가할수록 세포견인력이 증가한다는 기존 보고들과 일치하며, 서로 다른 전이성을 나타내는 세포들의 세포외 기질 고분자의 농도에 따른 형광 변화의 양상이 다름을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 이를 통해, 세포외 기질 고분자의 농도를 조절하여 복수 개의 출력부를 구비하는 경우의 결과를 세분화할 수 있는 가능성이 있음을 확인할 수 있다.
실시예 4: 암의 전이성 평가
상기 실시예 1에서 제조한 암세포 전이특성 평가용 소자에, 각각 높은 전이성(EMT high)의 MKN-1 위암 세포주 및 낮은 전이성(low EMT)의 MKN-45 위암 세포주를 적용하고, 2일이 경과한 후의 디바이스의 형광 시그널을 관찰하였다.
도 4에 각각 위암 세포주 MKN-1 및 위암 세포주 MKN-45를 실시예 1에서 제조한 암세포 전이특성 평가용 소자에 적용하여 2일간 배양한 후 현미경을 통해 실제 세포의 형태를 나타내는 명시야상(bright field image)과 소자의 형광 신호를 나타내는 형광 결과 도면을 나타내었다.
도 4를 참조하면, 높은 전이성의 MKN-1을 적용한 경우의 뚜렷한 노란색의 형광 신호가 확인되는데 반해, MKN-45에서는 초기의 주황색 형광신호만이 관찰되는 점에서 MKN-1이 나타내는 높은 전이성과 MKN-45의 낮은 전이성을 확인할 수 있다.
공지 사실로서 MKN-1은 높은 전이성 암세포(high EMT)인 점 및 MKN-45는 낮은 전이성 암세포(low EMT)인 점을 고려할 때, 본 발명의 일 실시예에 따른 암세포 전이특성 평가용 소자는 암세포의 전이성을 효과적이고 간단하게 평가할 수 있다는 점을 확인할 수 있다.
이상에서 본 발명은 비록 한정된 실시예에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술사상과 아래에 기재될 특허청구범위의 균등범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.
Claims (9)
- 전이성 암세포의 세포견인력에 의해 색상 변화, 형광 변화, 발광 변화 및 이들의 조합 중 어느 하나의 형태로 반응하는 유기분자 화합물을 포함하는 암세포 전이특성 평가용 소자.
- 제1항에 있어서,
상기 유기분자 화합물에 더하여 세포외 기질(Extracellular matrix, ECM) 고분자를 더 포함하는 것인 암세포 전이특성 평가용 소자.
- 제1항에 있어서,
상기 유기분자 화합물은 탄소수 5 내지 10의 직쇄 또는 분지쇄의 알킬기 및 할로겐기를 포함하는 다이케토피롤로피롤(diketopyrrolopyrrole)계 화합물인 것인 암세포 전이특성 평가용 소자.
- 제1항에 있어서,
상기 암세포 전이특성 평가용 소자는, 전기 공급을 제어하는 전원부; 암세포를 배양하는 세포배양부; 암세포를 적용하는 입력부; 유기분자 화합물, 또는 상기 유기분자 화합물 및 세포외 기질 고분자를 포함하고, 상기 유기분자 화합물이 전이성 암세포의 세포견인력에 의해 나타내는 반응을 출력하는 출력부; 및 상기 출력부의 색상 변화, 형광 변화, 발광 변화 및 이들의 조합 중 어느 하나의 형태의 반응을 증폭시켜 육안 또는 기기로 확인할 수 있는 시각적 정보를 제공하는 증폭부; 상기 출력부가 2개 이상인 경우, 각 출력부의 상기 반응을 통합하여 수치화된 데이터를 나타내는 결과부; 중 하나 이상을 포함하는 것인 암세포 전이특성 평가용 소자.
- 제4항에 있어서,
상기 암세포 전이특성 평가용 소자가 복수 개의 출력부를 포함하는 경우,
상기 복수 개의 출력부는 각각 독립적으로 상이한 종류의 세포외 기질 고분자를 포함하는 것인 암세포 전이특성 평가용 소자.
- 제4항에 있어서,
상기 암세포 전이특성 평가용 소자가 복수 개의 출력부를 포함하는 경우,
상기 복수 개의 출력부는 각각 독립적으로 상이한 농도의 세포외 기질 고분자를 포함하는 것인 암세포 전이특성 평가용 소자.
- 제5항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 암세포 전이특성 평가용 소자가 복수 개의 출력부를 포함하는 경우,
상기 복수 개의 출력부는 각각 독립적으로 반응을 출력하는 것인 암세포 전이특성 평가용 소자.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 암세포 전이특성 평가용 소자를 이용하는 암세포 전이특성 평가 방법.
- 평가 대상인 암세포를 유기분자 화합물 상에 적용하는 단계; 및
상기 유기분자 화합물의 색상 변화, 형광 변화, 발광 변화 및 이들의 조합 중 어느 하나의 형태로 나타나는 반응이 검출되는 경우, 상기 암세포가 전이성 암세포인 것으로 확인하는 단계;
를 포함하는 것인 암세포 전이특성 평가 방법.
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Applications Claiming Priority (1)
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