KR20230143767A - 때죽나무 잎 추출물을 포함하는 근력강화용 조성물 - Google Patents

때죽나무 잎 추출물을 포함하는 근력강화용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 때죽나무 잎 추출물을 포함하는 근력강화용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 때죽나무 잎 추출물은 마이오스타틴 억제 활성에 우수한 효과가 있어, 근력강화, 근육 질병의 예방, 개선 또는 치료에 유용할 수 있다.

Description

때죽나무 잎 추출물을 포함하는 근력강화용 조성물{Composition for strengthening muscle strength comprising extract of Styrax japonicas leaf extract}
본 발명은 때죽나무 잎 추출물을 포함하는 근력강화용 조성물에 관한 것이다.
골격근은 인체에서 가장 큰 부분을 차지하는 기관으로 총 몸무게의 40-50%를 차지하며 에너지 항상성 및 열생성 등을 비롯한 체내 여러 대사 기능에도 중요한 역할을 한다. 사람의 근육은 40세 이후부터 매년 1% 이상씩 감소하며, 80세가 되면 최대 근육량의 50% 수준이 감소되고, 노년의 근육 감소는 전반적인 신체기능을 떨어뜨리는 가장 중요한 요소로 인식되어지고 있다. 노화가 진행될수록 근육과 지방의 함량, 골격 왜곡 등 체형이 변화되는 것을 인지하게 되는데, 노년기 근감소에 의한 비만 유병률은 전 세계적으로 30%이상 수준에서 지속적인 증가 추세를 보이고 있다.
인슐린 분비 이상인 경우 세포에 에너지를 제대로 공급하지 못해 근육발달장애를 일으킬 수 있어, 일반인 보다 당뇨병 환자에게 근감소증이 증가한다. 또한 근육의 감소는 관절염, 허리통증, 만성통증을 더 증가시키는 원인이 되며, 복부비만에 의한 요실금 증세도 악화시킬 수 있고, 골절에 의한 부상은 노년의 우울증을 증가시켜 사망에 이를 수 있기 때문에 노년의 근감소증은 다양한 질환과 연계되어 삶의 질을 떨어뜨리는 주요 원인이 된다.
근감소증은 골다공증, 인슐린저항성 및 관절염과 같은 노인성 만성질환과도 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져, 근감소증의 예방 또는 개선을 통해서 노화로 인한 신체 활동력의 감소를 억제할 수 있다. 세계의 진행성 운동실 조증 및 근력약화 치료제 시장은 2011년 약 140억 달러 규모를 기록했으며 그 이후에는 9.4%의 연평균 복합 성장률로 성장해 2017년에는 약 235억 달러에 이를 것으로 전망되고 있다.
근감소증 환자에서, 근육모세포의 줄기 세포인 위성 세포의 모집, 활성 또는 증식의 장애로 인한 근육모세포(myoblast)의 개수가 감소하며, 근육모세포의 증식 및 분화가 감소하고, 이에 따라 근감소증 환자의 근육은 조직학적인 수준에서 근 섬유의 크기 및 수가 감소하여 근기능이 감소하는 증상이 나타난다.
과거 10여년간 미국 및 유럽을 중심으로 근감소증의 역학에 대한 연구가 활발히 이루어지면서 최근에 근감소증의 임상적 중요성에 대한 관심이 폭증하고 있다. 초기 연구에서는 근감소증이 전신 쇠약, 활동 장애 및 근력 감소에 의해 삶의 질 저하를 유발한다는 결과들이 주류를 이루었지만, 최근 발표되는 연구들에서는 삶의 질 이외에도 골다공증성 골절 위험이 현저히 증가할 수 있음이 보고되었다. 또한, 근감소증 환자에서 당뇨병 및 대사증후군, 비만, 만성 신부전, 만성 간부전 등의 만성 질환이 유발되며, 궁극적으로는 사망률도 증가시키기 때문에, 근감소증은 적절하게 치료받아야 하는 질환으로서 관심이 집중되고 있다.
최근 미국에서는 근감소증 환자에서 신체장애가 발생할 가능성이 약 1.5배 내지 약 3.5배가 증가함으로써 연간 185억 USD의 사회적 비용을 유발한다고 보고된 바 있다. 우리나라에서는 국민건강영양조사에 따르면 근감소증 유병률은 60세 이상 남성의 42.0%와 여성의 42.7%로 매우 흔한 질환이며, 특히 우리나라는 전세계에서도 고령화 속도가 높기 때문에 향후 중요한 사회적 문제가 될 것이 확실하다.
현재 근감소증에는 운동, 단백질 및 칼로리보충이 도움이 된다고 알려져 있으나, 근감소증 환자의 대부분을 차지하는 노인들에서는 크게 도움이 되지 않아 근감소증 치료제가 절실히 필요하다. 그러나, 현재 근감소증에 사용되는 치료제들은 근육감소 개선 및 근육량 증진에 직접적인 효과를 나타내는 약물은 아직까지 임상실험 수준의 단계이며, 현재 최종적으로 FDA 승인을 받은 약제는 없는 상황이다. 때문에 근감소증 치료를 위해서 일부 selective androgen receptor modulator, activin receptor antagonist, fast skeletal muscle troponin inhibitor 등을 근감소증 치료제로 개발하려는 노력들은 있으나, 현재 초기 임상을 시도하는 수준이다.
근감소증 치료제 동향에 대한 리포트들에 따르면 2010년 전세계적인 근감소증 치료제 시장은 약 1000만 달러(USD)이며, 2018년 2000만 달러(USD) 규모로 성장할 것으로 예측된다고 보고되었다("Sarcopenia Therapeutics-Pipeline Assessment and Market Forecasts to 2018", 2011.11.17). 또한, 2013년 EU 산하 민간 보관협력체인 Innovative Meticines Initiative에서는 4대 보건 연구 주제 중 하나로서 노인 근감소증 치료제의 개발에 약 5천만 유로를 투자하기로 발표하여 진행중에 있다.
따라서, 노인이 섭취하기에 안전하고 장기 복용할 수 있는 천연물질을 이용한 근감소증 치료제가 요구되고 있다.
고령화사사회에 대비하기 위한 근감소증에 대표적인 단백질이 마이오스타틴이다. 마이오스타틴은 기능을 억제하게 되면 근력 및 근지구력이 증가하게 된다. 하지만 현재 까지 부작용을 가지지 않고 마이오스타틴의 기능을 억제하는 소재는 보고된 바가 없다. 그러므로, 고령화 사회에 대비한 근감소증 즉, 마이오스타틴의 기능을 정확하게 조절하는 천연물 소재가 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자는 때죽나무 잎 추출물이 마이오스타틴 억제 활성에 우수한 효과가 있음을 확인하고, 근력 강화에 유용할 수 있음을 알아내고 본 발명을 완성하였다.
등록특허공보 10-2366919호
본 발명의 목적은 근력강화용 건강식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 근력강화용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 근육 질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 근육 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 때죽나무(Styrax japonicas) 잎 추출물을 포함하는 근력강화용 건강식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 때죽나무(Styrax japonicas) 잎 추출물을 포함하는 근력강화용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
나아가, 본 발명은 때죽나무(Styrax japonicas) 잎 추출물을 포함하는 근육 질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 때죽나무(Styrax japonicas) 잎 추출물을 포함하는 근육 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
나아가, 본 발명은 때죽나무(Styrax japonicas) 잎 추출물을 포함하는 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 추출물의 추출용매는 물, 탄소수 2 내지 4의 직쇄 또는 측쇄 알콜 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있고, 바람직하게는 에탄올을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 에탄올 수용액을 사용할 수 있고, 특히 바람직하게는 65-75 wt% 에탄올 수용액을 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 근육 질환은 근감소증, 근위축증, 근무력증, 근이영양증, 근경직증, 근긴장저하, 근력약화, 근육퇴행위축, 근위축성 측삭경화증, 무긴장증 등일 수 있고, 2종 이상의 질병이 동시에 적용될 수도 있다.
본 발명에 따른 때죽나무 잎 추출물은 마이오스타틴 억제 활성에 우수한 효과가 있어, 근력강화, 근육 질병의 예방, 개선 또는 치료에 유용할 수 있다.
도 1은 때죽나무 잎 70%에탄올 추출물 농도별 처리에 따른 세포독성을 평가한 그래프이다.
도 2는 때죽나무 잎 100% 에탄올 추출물(도 2A), 70% 에탄올 추출물(도 2B), 물 추출물(도 2C) 농도별 처리에 따른 마이오스타틴 억제 활성을 평가한 그래프이다.
도 3은 때죽나무 잎 70% 에탄올 추출물(SJ-70% Ethanol extract) 농도별 처리에 따른 마이오스타틴 신호 전달억제 활성을 평가한 Western blot 결과이다.
도 4는 때죽나무 잎 70% 에탄올 추출물을 경구투여한 마우스의 체중, 근력 및 근육량을 평가한 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
건강식품 및 건강기능성식품 조성물
식품의 종류에는 특별한 제한은 없으며, 통상적인 의미에서의 건강식품 및 건강기능성식품을 모두 포함한다.
건강식품의 예로는 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올 음료, 껌, 차 등을 들 수 있다.
건강기능식품의 예로는 정제, 캡슐제, 환제, 액제 형태 등의 건강기능성식품을 들 수 있다.
본 발명에 따른 유효물질을 함유하는 건강식품 및 건강기능성식품 조성물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효물질의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 및 건강기능성식품 중의 상기 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 유지를 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 건강식품 및 건강기능성식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명 유효물질을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트라이톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강기능성 식품 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 유효물질을 함유하는 건강식품 및 건강기능성식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강식품 및 건강기능성식품 조성물은 천연 과일쥬스 및 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 유효물질을 함유하는 건강식품 및 건강기능성식품 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
약학적 조성물
본 발명의 유효물질은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 유효물질에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 유효물질의 인체에 대한 효과적인 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 약 0.001-100 mg/kg/일이며, 바람직하게는 0.01-35 mg/kg/일이다. 몸무게가 70㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.07-7000 mg/일이며, 바람직하게는 0.7-2500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 때죽나무 잎 '물' 추출물의 제조
때죽나무(Styrax japonicas) 잎 분말 40mg에 물 1mL를 넣어 추출하였다.
추출은 물을 이용하여 상온, 암실에서 24시간동안 추출하였으며, 3회 반복 추출하였다. 12,000rpm에서 30초간 원심분리한 후, 상등액만을 회수하여 회전 감압 농축기와 원심회전 농축기를 이용하여 물을 제거하였다. 3회 반복 추출한 후 마이오스타틴, GDF11, 그리고 Activin A에 대한 활성억제능을 확인하였다.
<실시예 2> 때죽나무 잎 '100% 에탄올' 추출물의 제조
때죽나무(Styrax japonicas) 잎 분말 40mg에 100% 에탄올 1mL를 넣어 추출하였다.
추출은 100% 에탄올을 이용하여 상온, 암실에서 24시간동안 추출하였으며, 3회 반복 추출하였다. 12,000rpm에서 30초간 원심분리한 후, 상등액만을 회수하여 회전 감압 농축기와 원심회전 농축기를 이용하여 100% 에탄올을 제거하였다. 3회 반복 추출한 후 마이오스타틴, GDF11, 그리고 Activin A에 대한 활성억제능을 확인하였다.
<실시예 3> 때죽나무 잎 '70% 에탄올' 추출물의 제조
때죽나무(Styrax japonicas) 잎 분말 40mg에 70% 에탄올 수용액 1mL를 넣어 추출하였다.
추출은 70% 에탄올 수용액을 이용하여 상온, 암실에서 24시간동안 추출하였으며, 3회 반복 추출하였다. 12,000rpm에서 30초간 원심분리한 후, 상등액만을 회수하여 회전 감압 농축기와 원심회전 농축기를 이용하여 70% 에탄올 수용액을 제거하였다. 3회 반복 추출한 후 마이오스타틴, GDF11, 그리고 Activin A에 대한 활성억제능을 확인하였다.
<실험예 1> 세포독성 평가
세포독성 실험은 96 well plate에 well 당 HEK 293 세포(Human embryonic kidney 293 cells)를 1×104 cell/100 μL (in DMEM with 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin and 1% geneticine) 분주하여, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 24시간 후 때죽나무 가시 70% 에탄올 추출물(실시예 3)을 농도별 (1000, 500, 100, 50, 10, 1 μg/mL)로 처리하여, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 WST reagent (DaeilLab, Korea)를 10 μL 넣고 1시간 동안 반응 후 415 nm에서 흡광도를 측정하여 세포독성을 판단하였다.
도 1은 때죽나무 잎 70%에탄올 추출물 농도별 처리에 따른 세포독성을 평가한 그래프이다.
Control: 아무런 처리를 하지 않은 positive control
H2O2: 세포사멸을 유도하는 과산화수소(0.08M)를 처리한 negative control
Cell viability (%) = (absorbance of positive control - absorbance of treated with extract) × 100 / (absorbance of positive control - absorbance of negative control)
도 1에 나타난 바와 같이, 때죽나무 잎 70% 에탄올 추출물은 HEK 293 세포에서 1000 μg/mL의 농도까지 세포 독성을 나타내지 않았다.
<실험예 2> 마이오스타틴 억제 활성 평가 (Luciferase assay)
세포 수준에서 마이오스타틴 억제 활성은 luciferase reporter assay 시스템을 통해 확인하였다.
구체적으로, HEK 293 세포는 DMEM 배지 (in DMEM with10% FBS, 1% penicillin/streptomycine, 1% geneticine)에서 96 well plate에 well 당 2.0×104 cell로 분주하여 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 24시간 후, 배지는 FBS가 제거된 DMEM으로 교체하였고, 1 nM의 재조합 마이오스타틴 (R&D system, USA)와 실시예 1 내지 3에 따른 때죽나무 잎 추출물을 0.78, 1.56, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 μg/mL 농도별로 처리하여, CO2 배양기에서 배양하였다. 24시간 뒤 배지를 제거하고 65 μL 의 DMEM 배지와 65 μL 의 reagent (Bright-Glo luciferase assay system, USA)를 처리하여 micro plate luminometer에서 발광을 측정하였다. 측정된 수치는 positive와 negative control의 수치를 이용하여 마이오스타틴 억제 활성을 %로 나타내었다.
도 2는 때죽나무 잎 100% 에탄올 추출물(도 2A), 70% 에탄올 추출물(도 2B), 물 추출물(도 2C) 농도별 처리에 따른 마이오스타틴 억제 활성을 평가한 그래프이다.
Inhibition of MSTN activity (%) = (Firefly RLU of 1 nM ligand - Firefly RLU of treated with extract) × 100 / (Firefly RLU of 1 nM ligand - Firefly RLU of no treatment)
도 2에 나타난 바와 같이, 실시예 1 내지 3에 따른 추출물 모두 Luciferase assay를 통해 마이오스타틴 활성을 억제하는 것으로 나타났고, 물 추출물 대비 에탄올 추출물이 마이오스타틴 억제 활성이 우수한 것으로 나타났으며, 마이오스타틴과 동일한 수용체를 이용하고 구조가 유사한 GDF11과 Activin A 보다 마이오스타틴에 대한 선택적 신호차단 효과가 더 높은 것으로 나타났다. 특히, 때죽나무 잎 70% 에탄올 추출물이 GDF11과 Activin A 보다 마이오스타틴에 대한 선택적 억제 특이성이 높은 것으로 나타났다.
<실험예 3> 마이오스타틴 신호 전달 억제 평가
때죽나무 70% 에탄올 추출물(실시예 2)이 마이오스타틴 신호전달 경로에 미치는 영향을 확인하고자 western blot을 통해 Smad3 전사인자의 인산화 정도를 확인하였다.
Western blot은 다음과 같은 방법으로 진행하였다. HepG2 세포는 DMEM 배지 (10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에서 6 well plate에 well 당 2.0×105 cell로 분주하여 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 24시간 후, 배지는 FBS가 제거된 DMEM으로 교체하였고, 4시간 뒤 10 nM 재조합 마이오스타틴과 때죽나무 잎 70% 에탄올 추출물을 1000 μg/mL과 100 μg/mL의 농도로 각각 30분간 처리하였다. 30분 처리한 후, 세포는 PBS로 2회 세척 후 RIPA buffer [20 mM Tris-HCl, pH7.5, 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP-40, 1% sodium deoxychloate, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate, 1 mM NA3VO4, 1 ug/ml leupeptin (cell signaling, USA)]와 protease inhibitor cocktail, phosphatase inhibitor cocktail (Roche, USA)을 처리하였다. 수집한 세포는 sonicator를 이용하여 파쇄하였으며 4℃, 12,000 rpm에서 20분간 원심분리 하여 상등액을 얻었다. 상등액은 BCA assay를 통해 단백질 정량을 하였고, 10% polyacrylamide gel에 전기영동하였다. 전기영동 후 PVDF membrane에 transfer 하였고 5% BSA 또는 5% skim milk를 이용하여 실온에서 2시간 동안 blocking 하였다. Membrane은 TBS-T buffer를 이용하여 상온에서 10분간 3회 washing 하였고, 1차 항체 [Samd3(monoclonal antibody), P-Smad3(monoclonal antibody), β-actin(polyclonal antibody) (Cell signaling, USA)]을 실온에서 2시간 동안 반응하였다. 이후 TBS-T buffer을 이용하여 실온에서 10분간 3회 washing 하였고 2차 항체 [anti-Rabbit IgG for β-actin, anti-Mouse IgG for Smad3 and p-Smad3 (Cell signaling, USA)]를 상온에서 2시간 동안 반응하였다. 반응 후, Membrane은 TBS-T buffer를 이용하여 상온에서 10분간 3회 washing 하였고 SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Scientific, USA)를 이용하여 x-ray 필름에 감광하였다.
도 3은 때죽나무 잎 70% 에탄올 추출물(SJ-70% Ethanol extract) 농도별 처리에 따른 마이오스타틴 신호 전달억제 활성을 평가한 Western blot 결과이다.
Lane 1은 control로서 세포에 아무것도 처리하지 않은 lane이다.
Lane 2는 마이오스타틴만 처리한 lane으로 마이오스타틴의 신호가 전달이 되어 Smade3가 인산화되어 인산화된 Smad3 (p-Smad3)의 발현량이 높아진 것을 확인할 수 있다.
Lane 3은 positive control로서 마이오스타틴과 SB431542 (마이오스타틴이 결합하는 수용체의 인산화를 억제하는 small molecule)를 동시에 처리한 lane으로 마이오스타틴에 의해 높아져야 할 인산화된 Smad3 발현량 (p-smad3)이 높아지지 않는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 마이오스타틴의 신호가 SB431542에 의해서 억제되어 Smad3로 신호가 전달이 되지 않아 인산화가 일어나지 않았다.
Lane 4는 마이오스타틴과 때죽나무 잎 70% 에탄올 추출물 (1000 μg/mL)을 동시에 처리한 lane으로서 추출물이 마이오스타틴 신호를 차단함으로써 Smad3의 인산화 (p-Smad3)가 억제되었다.
Lane 5는 마이오스타틴과 때죽나무 잎 70% 에탄올 추출물 (100 μg/mL)을 동시에 처리한 결과 마이오스타틴의 신호를 차단하지 못하여 Smad3가 마이오스타틴의 신호를 받아 인산화된 것(p-Smad3)을 확인하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, Western blot을 통해서 때죽나무 잎 70% 에탄올 추출물이 농도의존적으로 마이오스타틴 신호 전달을 방해함으로써 세포 안쪽으로 진행되는 신호 (Smad 전사인자의 인산화)를 저해하는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과는 때죽나무 잎 70% 에탄올 추출물이 농도 의존적으로 마이오스타틴과 결합하여 마이오스타틴이 수용체에 결합하는 것을 방해함으로써 Smad3에 신호를 전달하지 못하여 Smad3의 인산화가 억제되었다는 것을 알 수 있다.
Luciferase assay와 western blot의 결과를 종합하면, 때죽나무 잎 70% 에탄올 추출물은 마이오스타틴이 마이오스타틴의 수용체와 결합을 방해하여 신호를 Smad3로 전달하지 못하여 Smad3의 인산화를 억제하는 것을 확인하였다. 따라서, 때죽나무 잎 70% 에탄올 추출물을 ICR마우스에 경구투여하여 근력 및 근육량에 미치는 영향을 확인해 보고자 하였다.
<실험예 4> 때죽나무 잎 70% 에탄올 추출물 경구 투여에 따른 마우스 체중, 근력 및 근육량 평가
In vivo 수준에서 때죽나무 잎 70% 에탄올 추출물이 근력 및 근육량 향상에 미치는 영향을 확인해보기 위해 ICR 마우스에 경구투여 하여 체중, 근력 및 근육량의 변화를 확인하였다.
실험에 사용된 마우스는 4주령 된 수컷 ICR 마우스로서 84일 동안 1일 1회 경구투여 하였다. 0, 14, 28, 42, 56, 70, 그리고 84일에 체중과 근력을 측정하였다. 84일째 날에는 마우스를 해부하여 3가지 근육 [비장근(Soleus), 비복근(Gastroneminus), 대퇴사두근(Quadriceps)] 무게를 측정하였다.
도 4는 때죽나무 잎 70% 에탄올 추출물을 경구투여한 마우스의 체중, 근력 및 근육량을 평가한 그래프이다.
도 4에 나타난 바와 같이,
체중의 경우, 84일째 (day 84)의 대조군 마우스 체중이 0일째(day 0)의 대조군 마우스 체중보다 평균 23% 증가, 84일째 (day 84)의 때죽나무 잎 추출물 경구투여군의 마우스 체중이 0일째(day 0)의 경구투여군 마우스 체중보다 평균 19% 증가하였다. 두 그룹간의 유의적 차이는 나타나지 않았지만, 때죽나무 잎 추출물 경구투여군의 마우스 체중 증가률이 낮은 것으로 확인되었다(도 4A).
근력의 경우, 84일째 (day 84)의 대조군 마우스 근력이 0일째(day 0)의 대조군 마우스 근력보다 평균 4% 증가한 반면, 84일째 (day 84)의 때죽나무잎 추출물 경구투여군 마우스 근력이 0일째(day 0)의 경구투여군 마우스 근력보다 평균 17% 증가하였다. 42일째(day42)부터는 때죽나무잎 추출물 경구투여군이 대조군에 비해서 근력이 평균 10%이상 증가한 것으로 나타났다. 70일째의 경우는 유의적으로 증가하였다(p<0.05, 도 4B).
근육량의 경우, 비장근(Soleus), 비복근(Gastroneminus) 및 대퇴사두근(Quadriceps)의 근육량은 때죽나무잎 추출물 경구투여군이 대조군과 유의적 차이가 없었다(도 4C).
결과를 종합하면, 때죽나무 잎 추출물은 세포독성이 없으며, Luciferase assay을 통한 마이오스타틴 활성억제, Western blot을 통한 마이오스타틴 신호전달 차단(Smad3 인산화 억제), 그리고 마우스 근력 증가를 유도하였다. 그러므로, 때죽나무 잎 추출물은 근력강화 유효성분으로 유용할 수 있음을 확인하였다.
건강식품의 제조예
본 발명에 따른 유효물질은 목적에 따라 여러 형태의 건강식품으로 제조 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 유효물질을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 건강식품의 제조방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
<건강식품 제조예 1> 유제품(dairy products)의 제조
본 발명의 유효물질 0.01-1 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
<건강식품 제조예 2> 선식의 제조
현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다. 검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다. 본 발명의 유효물질을 진공 농축기에서 감압농축하고 건조분말을 얻었다. 상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 유효물질의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.
곡물류(현미 34 중량부, 율무 19 중량부, 보리 20 중량부),
종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),
유효물질 (2 중량부),
영지(1.5 중량부), 및
지황(1.5 중량부).
건강기능식품의 제조예
본 발명에 따른 유효물질은 목적에 따라 여러 형태의 건강기능식품으로 제조 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 유효물질을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 건강기능식품의 제조방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
<건강기능식품 제조예 1> 건강기능식품의 제조
유효물질 100 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 μg
비타민 E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 mg
비타민 B2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 mg
비타민 B12 0.2 μg
비타민 C 10 mg
비오틴 10 μg
니코틴산아미드 1.7 mg
엽산 50 μg
판토텐산 칼슘 0.5 mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 mg
산화아연 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 mg
제1인산칼륨 15 mg
제2인산칼슘 55 mg
구연산칼륨 90 mg
탄산칼슘 100 mg
염화마그네슘 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강기능성 식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능성 식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능성 식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
<건강기능식품 제조예 2> 건강 기능 음료의 제조
유효물질 100 mg
구연산 100 mg
올리고당 100 mg
매실농축액 2 mg
타우린 100 mg
정제수를 가하여 전체 500 mL
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 1 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다. 상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
약제의 제조예
본 발명에 따른 유효물질은 목적에 따라 여러 형태로 제제화가 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 유효물질을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 제제화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
<약제 제조예 1> 산제의 제조
유효물질 2 g
유당 1 g
상기의 성분을 혼합한 후, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<약제 제조예 2> 정제의 제조
유효물질 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<약제 제조예 3> 캡슐제의 제조
유효물질 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<약제 제조예 4> 주사제의 제조
유효물질 10 ㎍/㎖
묽은 염산 BP pH 3.5로 될 때까지
주사용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖
적당한 용적의 주사용 염화나트륨 BP 중에 본 발명에 따른 유효물질을 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 사용하여 pH 3.5로 조절하고, 주사용 염화나트륨 BP를 사용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120 ℃에서 15 분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.
<약제 제조예 5> 경비흡수제 (Nasal spray)의 제조
유효물질 1.0 g
아세트산나트륨 0.3 g
메틸파라벤 0.1 g
프로필파라벤 0.02 g
염화나트륨 적량
HCl 또는 NaOH pH 조정 적량
정제수 적량
통상의 경비흡수제의 제조방법에 따라, 염수 (0.9% NaCl, w/v, 용매는 정제수) 1 mL당 유효물질 3 mg이 포함되도록 제조하고, 이를 불투명한 스프레이 용기에 충진하고 멸균시켜 경비흡수제를 제조하였다.
<약제 제조예 6> 액제의 제조
유효물질 100 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라, 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬 향을 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체 100 mL로 조절한 후 갈색 병에 충진하고 멸균시켜 액제를 제조하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특히 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (14)

  1. 때죽나무(Styrax japonicas) 잎 추출물을 포함하는 근력강화용 건강식품 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 추출물의 추출용매는 물, 탄소수 2 내지 4의 직쇄 또는 측쇄 알콜 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 건강식품 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 추출물의 추출용매는 에탄올 수용액인 것을 특징으로 하는 건강식품 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 추출물의 추출용매는 65-75 wt% 에탄올 수용액인 것을 특징으로 하는 건강식품 조성물.
  5. 때죽나무(Styrax japonicas) 잎 추출물을 포함하는 근력강화용 건강기능식품 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 추출물의 추출용매는 물, 탄소수 2 내지 4의 직쇄 또는 측쇄 알콜 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 추출물의 추출용매는 에탄올 수용액인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 추출물의 추출용매는 65-75 wt% 에탄올 수용액인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
  9. 때죽나무(Styrax japonicas) 잎 추출물을 포함하는 근육 질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 근육 질환은 근감소증, 근위축증, 근무력증, 근이영양증, 근경직증, 근긴장저하, 근력약화, 근육퇴행위축, 근위축성 측삭경화증 및 무긴장증 중 1종 이상인 것을 특징으로 하는 건강식품 조성물.
  11. 때죽나무(Styrax japonicas) 잎 추출물을 포함하는 근육 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 근육 질환은 근감소증, 근위축증, 근무력증, 근이영양증, 근경직증, 근긴장저하, 근력약화, 근육퇴행위축, 근위축성 측삭경화증 및 무긴장증 중 1종 이상인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
  13. 때죽나무(Styrax japonicas) 잎 추출물을 포함하는 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 근육 질환은 근감소증, 근위축증, 근무력증, 근이영양증, 근경직증, 근긴장저하, 근력약화, 근육퇴행위축, 근위축성 측삭경화증 및 무긴장증 중 1종 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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