KR20230142758A

KR20230142758A - 노화-관련 분비 표현형을 하향조절하는 항노화 식물 폴리페놀 약물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20230142758A
Application number: KR1020237029731A
Authority: KR
Inventors: 유 선; 치시아 수; 수구앙 장; 루이쿤 헤
Original assignee: 바이헬스 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2021-02-04
Filing date: 2021-02-23
Publication date: 2023-10-11
Also published as: AU2021425528A1; US20240091193A1; JP2024508644A; CN114306320A; EP4212155A1; WO2022165868A1; AU2021425528A9

Abstract

(a) 프로시아니딘 또는 이의 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 전구약물, 및 (b) 대상체가 노화 세포를 생성하도록 유도할 수 있는 시약, 및 임의로, 제약상 허용되는 부형제를 함유하는 제약 조성물이 개시되어 있다. 노화-관련 분리 표현형 (SASP)의 하향조절, SASP 인자의 발현 또는 활성의 감소, 세포 노화 마커 인자의 발현 또는 활성의 감소, 비증식 세포의 아폽토시스의 유도, 비증식 세포의 감소 또는 제거, 노화의 지연, 대상체의 수명의 연장, 연령-관련 질환 부담의 감소, 비증식성 세포의 감소 또는 제거로부터 이익을 얻는 질환의 예방, 경감 또는 치료, 암 요법에 대한 약물 내성의 감소, 세포 노화를 유도할 수 있는 시약의 효능의 증강, 종양 퇴행의 촉진, 종양 용적의 감소, 암의 예방 또는 치료, 또는 암 생존의 연장, 특히 전립선 암 또는 종양에서 사용하기 위한 약물 또는 제제의 제조에서 프로시아니딘 또는 이의 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 전구약물 및 제약 조성물의 용도가 개시되어 있다.

Description

노화-관련 분비 표현형을 하향조절하는 항노화 식물 폴리페놀 약물 및 이의 용도

본 출원은 생물의약(biomedicine) 분야에 속하며, 보다 구체적으로는, 본 출원은 노화 세포(senescent cell)를 하향조절(downregulating)하거나 청소(clearing)하기 위한 항노화 약물(anti-senescence drug) 및 이의 용도에 관한 것이다.

세포 노화(cell senescence)는 증식하는 세포가 주로 DNA 손상과 같은 스트레스 신호에 의해 유도되는, 성장-촉진 자극에 내성이 생기는, 진핵 세포에서 대개 안정적이고 본질적으로 비가역적 세포 주기 정지 상태를 지칭한다. 노화 세포는 비정상적인 형태(abnormal morphology), 변경된 대사 활동(altered metabolic activity), 염색질 리모델링(chromatin remodeling), 비정상적 유전자 발현(aberrant gene expression), 증가된 리포푸신, 증강된 입도(enhanced granularity), 중증 액포화(severe vacuolization), 및 노화-연관 분비 표현형(senescence-associated secretory phenotype) (SASP) 염증유발성 표현형(pro-inflammatory phenotype)을 특징으로 한다. 노화의 생물학적 역할은 매우 복잡하며, 주로 병태생리학적 환경에 따라, 노화 세포의 보호 효과와 해로운 효과가 둘 다 설명되었다. 예를 들어, 노화는 손상된 세포의 악성 변형을 피하기 위한 메커니즘으로 진화했을 수 있긴 하지만, 노화의 발생은 암, 심혈관 및 뇌혈관 질환(cardiovascular and cerebrovascular disease), 골다공증(osteoporosis), 관절염(arthritis), 대사 질환(metabolic disease), 신경퇴행성 증상(neurological degenerative symptom)과 같은 일련의 임상 문제를 포함하여 많은 연령-관련 병리를 야기할 수 있다.

세포 노화는 핵막의 접힘(infolding of nuclear membrane), 염색질 응축, 증가된 세포 부피, p53, p16^INK4A/Rb, PI3K/Akt, FoxO 전사 인자, 및 미토콘드리아 SIRT1을 포함한 여러 하류 신호전달 경로의 활성화를 특징으로 한다. 영구적인 증식 정지에 진입하는 것 외에도, 노화 세포는 종종 국소 염증 및 조직 분해를 포함한 많은 병리학적 특색과 연관이 있다. 세포 노화는 손상된 세포에서 발생하며 유기체에서 증식하는 것을 방지한다. 다양한 외부 자극 및 내부 요인의 영향 하에, 세포 손상은 명백한 세포 노화 징후를 야기할 수 있다. 손상의 축적이 일정 한계에 도달하는 경우, 조직 수준에서 다양한 조직 퇴행성 변화 및 생리적 노화 표현형을 식별할 수 있다.

특히, 가장 주목할 만한 특색은 노화-연관 분리 표현형 (SASP)으로 알려진 현상인 노화 세포에 의한 염증성 시토카인의 유의하게 증가된 발현이다. SASP의 개념은 2008년에 코페(Coppe) 등에 의해 처음 제안되었다. 이들은 노화 세포가 세포외 기질 단백질(extracellular matrix protein), 염증-관련 인자, 암세포 성장 인자를 분비함으로써 인접한 전암성 세포(precancerous cell)의 증식을 촉진하거나 암세포의 악성종양(malignancy)을 증가시킬 수 있음을 발견하여, 총칭하여 'SASP 인자'라고 한다.

국제적으로 알려진 다양한 SASP 억제제가 SASP를 유의하게 약화시킬 수 있긴 하지만, 이들은 본질적으로 노화 세포를 죽일 수는 없다. 약리학적으로 노화 세포의 부담을 감소시키기 위해, 과학자들은 노화 세포를 선택적으로 죽이는 "세놀리틱스(senolytics)" (노화 세포-제거 약물)로 함께 알려진, 소분자, 펩티드 및 항체를 개발하고 있다. 2015년 세놀리틱 약물 발견 이후, 연구자들은 다른 소분자 세놀리틱 약물을 확인하고 그 작용을 규명하는 데 상당한 진전을 이루었다. 수많은 연구에서 대부분의 세놀리틱스가 제한된 수의 노화 세포 유형에만 효과적인 것으로 나타났다. 예를 들어, 나비토클랙스(Navitoclax)는 HUVEC를 표적으로 할 수 있으나 노화된 인간 지방전구세포(preadipocyte)는 표적으로 삼을 수 없다. 증거는 세놀리틱스의 효능이 한 구체적 세포 유형 내에서도 다를 수 있음을 시사한다. 예를 들어, 인간 폐 섬유모세포에서, 나비토클랙스는 배양에 적응된 IMR90 태아 폐 섬유모세포-유사 세포주에서 노화 세포를 표적으로 하여 죽일 수 있으나, 노화된 일차 인간 폐 섬유모세포에서는 덜 효과적이다.

따라서, 이 분야에서 더 넓은 적용 범위를 가진 더 효과적인 항노화 약물을 찾을 필요가 여전히 존재한다.

본 출원의 제1 측면은 프로시아니딘 또는 이의 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 전구약물(prodrug), 및 임의의 제약상 허용되는 보조 물질을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

하나 이상의 실시양태에서, 프로시아니딘은, 바람직하게는 프로시아니딘 C1을 포함하는, 올리고머성 프로시아니딘(oligomeric procyanidin)이다.

하나 이상의 실시양태에서, 제약 조성물에서, 프로시아니딘 또는 이의 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 전구약물은 적어도 1 μM, 예컨대 적어도 1 μM, 적어도 10 μM, 적어도 20 μM, 적어도 30 μM, 적어도 40 μM, 적어도 50 μM, 적어도 100 μM, 적어도 200 μM, 적어도 500 μM, 적어도 1 mM, 또는 상기 임의의 두 값 사이의 범위 내의 최종 농도를 갖는다.

하나 이상의 실시양태에서, 제약 조성물은 대상체(subject)가 노화 세포를 생성하도록 유도할 수 있는 작용제를 추가로 포함한다.

하나 이상의 실시양태에서, 작용제는 종양 조직에서 노화 세포의 생성을 유도할 수 있다.

하나 이상의 실시양태에서, 작용제는 DNA 손상(damage) 및/또는 아폽토시스(apoptosis), 예를 들어, DNA 이중 가닥 파손(break)을 일으킬 수 있다.

하나 이상의 실시양태에서, 작용제는 MIT 또는 DOX이다.

본 출원은 또한 노화-연관 분리 표현형 (SASP)의 하향조절, SASP 인자의 발현 또는 활성의 감소, 세포 노화 마커 인자(cell senescence marker factor)의 발현 또는 활성의 감소, 비증식 세포(non-proliferating cell)의 아폽토시스의 유도, 비증식 세포의 감소 또는 제거, 노화의 지연, 대상체의 수명의 연장, 대상체의 연령-관련 질환 부담(age-related disease burden)의 감소, 비증식성 세포의 감소 또는 제거로부터 이익을 얻는 질환의 예방, 경감 및 치료, 암 요법(cancer therapy)에 대한 내성(resistance)의 감소, 세포 노화를 유도할 수 있는 작용제의 효능의 증강, 종양 퇴행(tumor regression)의 촉진, 종양 용적(tumor volume)의 감소, 암의 예방 또는 치료, 또는 암 생존의 연장을 위해 사용되는 의약(medicament) 또는 제제(preparation)의 제조에서 프로시아니딘 또는 이의 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 전구약물의 용도를 제공한다.

하나 이상의 실시양태에서, 프로시아니딘은 바람직하게는 프로시아니딘 C1을 포함하는, 올리고머성 프로시아니딘이다.

하나 이상의 실시양태에서, SASP 인자는 세포외 기질 단백질, 염증성 시토카인, 및 암 세포 성장 인자를 포함한다.

하나 이상의 실시양태에서, SASP 인자는 도 6에 도시된 바와 같은 인자를 포함한다.

하나 이상의 실시양태에서, SASP 인자는 IL6, CXCL8, MCP2, CXCL1, GM-CSF, MMP3, AREG, SFRP2, ANGPTL4, IL1a로 이루어진 분자의 군으로부터 선택된다.

하나 이상의 실시양태에서, 세포 노화 마커 인자는 p16^INK4a, p21^CIP1로 이루어진 군으로부터 선택된다.

하나 이상의 실시양태에서, 비증식성 세포는 자연 노화 세포 또는 손상된 세포와 같은 노화 세포이다. 손상된 세포는 조직 미세환경 내의 손상된 세포, 바람직하게는 화학요법 또는 방사선 요법에 의해 유발된 손상된 세포를 포함한다. 하나 이상의 실시양태에서, 방사선 요법은 이온화 방사선, α 방사선 요법, β 방사선 요법 또는 γ 방사선 요법을 포함한다.

하나 이상의 실시양태에서, 비증식성 세포의 감소 또는 제거로부터 이익을 얻는 질환은 암, 심혈관 및 뇌혈관 질환, 골다공증, 연령-관련 퇴행성 관절 질환(age-related degenerative joint disease) (예를 들어, 관절염), 대사 질환, 신경퇴행성 질환(neurodegenerative disease)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 연령-관련 질환이다. 바람직하게는, 암은 전립선암(prostate cancer)이고; 종양은 전립선 종양(prostate tumor)이다.

하나 이상의 실시양태에서, 세포 노화를 유도할 수 있는 작용제는 화학요법제 또는 방사선과 같은 DNA 손상 및/또는 아폽토시스를 유발하는 작용제를 포함한다. 바람직하게는 시약은 MIT 또는 DOX를 포함한다.

하나 이상의 실시양태에서, 대상체는 노인 대상체(elderly subject)이다. 구체적 실시양태에서, 노인 대상체는 적어도 20개월령의 마우스 또는 적어도 60세의 인간에 상응하는 대상이다. 바람직하게는, 노인 대상자는 적어도 24개월령의 마우스 또는 적어도 75세의 인간에 상응하는 대상체이다. 보다 바람직하게는, 노인 대상체는 24 내지 27개월령의 마우스 또는 75 내지 90세령의 대상체에 상응하는 대상체이다.

하나 이상의 실시양태에서, 암 요법은 화학요법 또는 방사선 요법, 예를 들어 MIT 요법, DOX 요법, 이온화 방사선, α 방사선 요법, β 방사선 요법 또는 γ 방사선 요법을 포함한다.

본 출원은 또한 종양 퇴행의 촉진, 종양 용적의 감소, 암의 예방 또는 치료, 암 생존의 연장을 위해 사용되는 의약 또는 제제의 제조에서 (a) 프로시아니딘 또는 이의 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 전구약물, 및 (b) 대상체가 노화 세포를 생성하도록 유도할 수 있는 작용제의 용도를 제공한다.

하나 이상의 실시양태에서, 프로시아니딘은, 바람직하게는 프로시아니딘 C1을 포함하는, 올리고머성 프로시아니딘이다.

하나 이상의 실시양태에서, 작용제는 DNA 손상 및/또는 아폽토시스, 예를 들어 DNA 이중 가닥 파손을 유발할 수 있다.

하나 이상의 실시양태에서, 작용제는 MIT 또는 DOX이다.

하나 이상의 실시양태에서, (a)는 노화 세포를 제거할 수 있다.

하나 이상의 실시양태에서, 종양은 전립선 종양이고; 암은 전립선 암이다.

본 출원의 또 다른 실시양태는 본원의 제1 측면에 기재된 제약 조성물 및 대상체가 노화 세포를 생성하도록 유도할 수 있는 임의적 작용제를 포함하는 의료용 상자(medicinal box) 또는 키트(kit)를 제공한다.

하나 이상의 실시양태에서, 의료용 상자 또는 키트는 용기 1 및 용기 2를 포함하며, 이 용기 각각은 (a) 프로시아니딘 또는 이의 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 전구약물 및 임의적 제약상 허용되는 보조 물질, 및 (b) 대상체가 노화 세포를 생성하도록 유도할 수 있는 작용제 및 임의적 제약상 허용되는 보조 물질을 함유한다.

하나 이상의 실시양태에서, 제약 조성물에 있어서, 의약용 상자 또는 키트, (a) 및 임의적 (b)는 활성 성분으로서 사용되며, 기타 성분은 제약상 허용되는 보조 물질 등이다.

하나 이상의 실시양태에서, 제약 조성물의 투여 형태는 경구 작용제, 주사제, 주입 용액, 정제, 분말, 캡슐, 환제를 포함하며; 바람직한 투여 형태는 경구 작용제이다.

본 출원의 또 다른 측면에서, 비증식성 세포를 프로시아니딘 또는 이의 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 전구약물로 처리하거나 프로시아니딘 또는 이의 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 전구약물을 대상체게게 투여하는 것을 포함하는, 비증식성 제포 또는 대상체에서 변화를 유발하기 위한 방법으로서, 변화가 노화-연관 분리 표현형 (SASP)의 하향조절, SASP 인자의 발현 또는 활성의 감소, 세포 노화 마커 인자의 발현 또는 활성의 감소, 비증식 세포의 아폽토시스의 유도, 비증식 세포의 감소 또는 제거, 노화의 지연, 대상체의 수명의 연장, 대상체의 연령-관련 질환 부담의 감소, 비증식 세포의 감소 또는 제거로부터 이익을 얻을 수 있는 질환의 예방, 완화 및 치료, 세포 노화를 유도할 수 있는 작용제의 세포독성 증강, 또는 암 요법에 대한 내성의 감소로부터 선택된 하나 이상을 포함하는, 방법이 제공된다.

하나 이상의 실시양태에서, 프로시아니딘 또는 이의 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 전구약물은 적어도 1 μM, 예컨대 적어도 10 μM, 적어도 20 μM, 적어도 30 μM, 적어도 40 μM, 적어도 50 μM, 적어도 100 μM, 적어도 200 μM, 적어도 500 μM, 적어도 1 mM, 또는 상기 임의의 두 값 사이의 범위 내의 최종 농도를 갖는다.

본 출원의 또 다른 측면은 세포를 치료하거나 프로시아니딘 또는 이의 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 전구약물을 대상체에게 투여함에 있어서 (a) 프로시아니딘 또는 이의 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 전구약물, 및 (b) 대상체가 노화 세포를 생성하도록 유도할 수 있는 작용제를 사용하는 것을 포함하는, 세포 노화 유도, 종양 퇴행의 촉진, 종양 용적의 감소, 암의 예방 또는 치료, 또는 암 생존의 연장이 가능한 작용제의 세포독성 증강 방법을 제공한다.

하나 이상의 실시양태에서, 제제는 DNA 손상 및/또는 아폽토시스, 예를 들어 DNA 이중 가닥 파손을 유발할 수 있다.

하나 이상의 실시양태에서, 작용제는 MIT 또는 DOX이다.

하나 이상의 실시양태에서, 프로시아니딘 또는 이의 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 전구약물은 적어도 10 μM, 예컨대 적어도 20 μM, 적어도 30 μM, 적어도 40 μM, 적어도 50 μM, 적어도 100 μM, 적어도 200 μM, 적어도 500 μM, 적어도 1 mM, 또는 상기 임의의 두 값 사이의 범위 내의 최종 농도를 갖는다.

하나 이상의 실시양태에서, 본원의 임의의 실시양태 중 어느 하나에 기재된 용도 또는 방법은 임상 질환의 치료를 직접적으로 목표로 하지 않는다.

본 출원의 다른 측면은 본원의 개시내용으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.

도 1은 증식하는 인간 간질 세포(human stromal cell) PSC27 (초기 계대: 예컨대 p10-20)에 화학요법제 블레오마이신 (BLEO)을 50 μg/ml의 농도로 시험관내 처리한지 7-10일 후 SA-β-Gal 염색한 결과로서, 여기서 상부는 대표적인 이미지이고, 하부는 통계 데이터이다. CTRL, 대조군 세포; BLEO, 블레오마이신으로 처리된 세포. **, P < 0.01.
도 2는 화학요법 약물 블레오마이신 (BLEO)으로 처리한 PSC27 세포의 BrdU 염색 결과로서, 여기서 상부는 대표적인 이미지이고, 하부는 통계 데이터를 나타낸다. CTRL, 대조군 세포; BLEO, 블레오마이신으로 처리된 세포. ***, P < 0.001.
도 3은 PSC27 세포를 화학요법 약물 블레오마이신 (BLEO)으로 처리한 후 γH2AX를 사용한 면역형광 염색 결과를 나타낸 것이다. CTRL, 대조군 세포; BLEO, 블레오마이신으로 처리된 세포. ***, P < 0.001. 핵의 형광 스팟의 수에 따라, 이들은 0 초점, 1 내지 3 초점, 4 내지 10 초점, 및 > 10 초점의 단일 세포를 포함하여, 4 가지 범주로 나뉜다.
도 4는 항노화 활성을 가진 식물 원료를 수득하기 위해 천연물 약물 라이브러리를 스크리닝하기 위한 실험 흐름도를 나타낸다.
도 5는 RNA-seq 데이터를 소프트웨어 및 생물정보학 분석에 의해 처리한 후, PCC1이 증식 세포와 비교하여 노화 세포에서 유의하게 상향조절되는 유전자를 유의하게 감소시킬 수 있는 것으로 밝혀졌음을 나타낸다. BLEO 군과 비교하여, BLEO/PCC1 군에서 4406개 유전자가 유의하게 하향조절되고 2766개 유전자가 유의하게 상향조절된다 (배수 변화도(fold change) > 2, P < 0.01).
도 6은 히트맵(heatmap)에서 BLEO 손상으로 인해 유발되는 노화 세포의 매우 다수의 인자의 발현이 상향조절되나, 그 중 다수가 PCC1 처리 후 유의하게 역전됨을 나타낸다. 적색 별표, 전형적인 SASP 외분비 인자.
도 7은 GSEA 분석 결과에서 BLEO-유도 노화 세포에서 SASP 또는 NF-κB 분자 마커-관련 인자의 발현이 집중적으로 상향조절되나, 노화 세포의 PCC1 처리 후에는 유의하게 감소됨을 나타낸다. 좌측, SASP 분자 마커; 우측, NF-κB 분자 마커.
도 8은 단백질-단백질 상호작용 (PPI) 생물정보학 분석 결과에서, PCC1이 유의하게 하향조절된 노화 세포 분자가 네트워크를 형성하고 있으며, 이들 사이에 다중 상호작용이 있음을 나타낸다.
도 9는 KEGG 경로 분석에 따라 노화 세포에서 PCC1에 의해 유발된 유의한 하향조절을 가진 100개의 분자에 대한 생물학적 과정의 대표적인 경로를 나타낸다. 좌측 Y축, 백분율. 우측 Y축, log10 (p값).
도 10은 KEGG 경로 분석에 따라 노화 세포에서 PCC1에 의해 유발된 유의한 하향조절을 가진 100개의 분자에 대한 세포 구성요소의 대표적인 경로를 나타낸다. 좌측 Y축, 백분율. 우측 Y축, log10 (p값).
도 11은 형광 정량적 PCR (qRT-PCR)의 검출 및 분석에 따른 BLEO에 의해 유도되고 상이한 농도의 PCC1로 처리된 노화 세포에서 전형적인 SASP 분자 군의 상대적인 발현 수준을 나타낸다. 모든 데이터는 CTRL 군과 비교하여 정규화된 결과이다. *, P < 0.05; **, P < 0.01.
도 12는 증가하는 PCC1 농도의 조건 하에 SA-β-Gal 염색에 의한 결정에 따라 PSC27의 노화 여부를 나타낸다. ^, P > 0.05; **, P < 0.01; ****, P < 0.0001, 여기서 1 μM, 10 μM, 20 μM, 50 μM, 100 μM, 150 μM 및 200 μM의 농도에서 PCC1에 대한 P 값은 이들 실험군에서 세포의 양성 비율을 0 μM의 데이터와 비교함으로써 수득된 통계적 유의성이다.
도 13은 SA-β-Gal 염색 후 다양한 조건 하에 PSC27의 대표적인 사진을 나타낸다. 위아래로 배열된 그룹당 3회 반복. 스케일 바, 30 μm.
도 14는 CCK8이 증가하는 PCC1 농도 하에 증식하는 세포 및 노화 군의 세포의 생존율을 검출함을 나타낸다. 각각의 PCC1 농도의 P 값은 CTRL 군과 BLEO 그룹을 비교한 후 유의한 차이이다. **, P < 0.01; ***, P < 0.001; ****, P < 0.0001.
도 15는 PSC27의 집단 배가 시험(population doubling test)을 나타낸다. 계대 10 (p10)에서 세포를 BLEO에 의해 손상시킨 다음에, 8일차에 PCC1을 배지에 첨가하였다. 세포 증식 잠재력에 대한 PCC1의 효과는 CTRL 군, BLEO 그룹, PCC1 군 및 BLEO/PCC1 군의 집단 배가 (PD)의 비교 분석에 의해 결정된다. ^ , P > 0.05; ***, P < 0.001.
도 16은 노화 세포의 PCC1 처리 동안 카스파제 3/7 활성이 유도되었음을 나타낸다. PSC27 세포는 배양 조건 하에 BLEO를 12시간 동안 처리한 후 점차 노화기(senescent stage)에 진입하였다. 50 μM PCC1을 7일차부터 시작하여 노화 세포 배지에 첨가하고, 눅라이트 급속 적색(NoucLight Rapid Red) 시약을 사용하여 세포를 표지하고, 카스파제 3/7 시약 (인큐사이트(IncuCyte))을 사용하여 아폽토시스 검출을 수행하였다. 카스파제 3/7 활성을 4시간마다 검출하였다 (n=3).
도 17은 판(pan)-카스파제 억제제 (20 cM QVD-OPh)에 의해 역전된 세놀리틱 활성(senolytic activity)을 나타낸다 (50 μM PCC1을 이 실험에서 사용하였으며, 200 μM ABT263을 양성 대조군으로서 사용하였으며; 후자는 최근 몇 년 동안 보고된 노화 세포 아폽토시스 유도제(inducer)임). 통계적 차이는 이원(two-way) ANOVA (터키 검정(Turkey' test))에 의해 수득된다.
도 18은 유동 세포측정법(flow cytometry)에 의해 측정된 몇몇 조건 하에 PSC27의 아폽토시스를 나타낸다. Q2, 초기 아폽토시스 세포(early apoptotic cell)의 분포 영역; Q3, 후기 아폽토시스 세포(late apoptotic cell)의 분포 영역.
도 19는 BLEO 및/또는 PCC1로 처리한 생존 및 아폽토시스 세포의 수의 비교 분석이다. ***, P < 0.001; ****, P < 0.0001.
도 20은 전임상 시험에서 마우스 투여의 개략도를 나타낸다. 인간 간질 세포 PSC27 및 암세포 PC3을 시험관내에서 혼합한 다음 (1:4)에 마우스에 피하 이식하여 이식된 종양을 형성하였다. 단일 약물 또는 병용 약물 투여 조건 하에 여러 치료 주기 후, 마우스를 최종적으로 희생시키고, 종양 조직에서 관련 분자의 발현 변화를 병리학적으로 분석하였다.
도 21은 CTRL 군 또는 BLEO 손상 군(injury group)의 PSC27 세포와 혼합된 PC3, 또는 PC3 세포 단독을 마우스의 피하 조직에 이식하여 이식된 종양을 형성함을 나타낸다. 8주 말에, 마우스를 해부하여 종양을 수득하고, 각각의 군의 조건 하에 종양의 부피를 검출하고 비교하였다. **, P < 0.01; ***, P < 0.001; ****, P < 0.0001.
도 22는 전임상 시험에서 마우스에 대한 투여 시간 및 투여 방법의 개략도를 나타낸다. 2주 간격으로 투여 주기를 정하였으며, MIT (미토크산트론)를 3/5/7주차 첫째 날 마우스에게 복강내 투여하였다. 5주차 첫날부터, PCC1을 주 1회 복강내 투여하였다. 8주간의 치료 과정 후, 병리학적 식별 및 발현 분석을 위해 마우스를 해부하였다.
도 23은 종양 말단 부피 통계 분석을 나타낸다. 화학요법 약물 MIT 단독 또는 항노화 약물 PCC1과 함께 마우스에 투여하고, 8주 후에, 각각의 군의 종양 용적을 비교하고 분석하였다.
도 24는 전임상 실험에서 PC3/PSC27 종양-보유 동물 병변에서의 세포 노화의 비교를 나타낸다. SA-β-Gal 염색 후 대표 사진. 스케일 바, 100 μm.
도 25는 마우스의 종양 조직에서 SA-β-Gal에 의해 염색된 양성 세포의 백분율의 병렬 분석을 나타낸다. ^ , P > 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001.
도 26은 형광 정량적 PCR (qRT-PCR)에 의해 검출 및 분석된 마우스 병변의 상피암 세포(epithelial cancer cell) 및 간질 세포에서 SASP 전형적인 인자의 발현을 나타낸다. 간질 세포와 암세포는 LCM 기술에 의해 특이적으로 분리되었고, 총 RNA는 준비되어 SASP 발현 검출에 사용되었다. ^ , P > 0.05; *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001.
도 27은 형광 정량적 PCR (qRT-PCR)에 의해 검출 및 분석된 비히클, MIT 및 MIT/PCC1이 투여된 마우스 병변의 간질 세포에서 SASP 인자의 발현을 나타낸다. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001.
도 28은 LCM 기술에 의해 병변 내 암세포의 특이적 분리 후 각각의 군의 마우스에서 DNA 손상과 아폽토시스의 비율을 분석한 것을 나타낸다. ^ , P > 0.05; *, P < 0.05; **, P < 0.01.
도 29는 면역조직화학적 염색 후 이미지 분석을 나타낸다. 마우스의 각각의 군의 병변에서 카스파제 3 절단(카스파제 3 cleaved) (CCL3) 신호는 뚜렷한 대조를 보였다. 스케일 바, 200 μm.
도 30은 다양한 약물 처리 후 NOD/SCID 마우스에서 무병 생존(disease-free survival)의 카플란 마이어(Kaplan Meier) 데이터의 비교를 나타낸다. 비히클, MIT, PCC1 및 MIT/PCC1 군의 종양 용적이 2000 mm³을 초과하면, 중증 질환이 발생한 것으로 간주되며, 마우스를 적시에 죽이고 종양 보유 상태를 검출하여야 한다. ^ , P > 0.05; **, P < 0.01.
도 31은 다양한 투여 조건 하에 치료 과정 종료시 마우스 체중 데이터의 비교 분석을 나타낸다. ^ , P > 0.05.
도 32는 상기 다양한 투여 조건 하에 치료 과정의 종료시 마우스 혈청학적 데이터의 비교 분석을 나타낸다. 크레아티닌, 요소 (신장 지표), ALP 및 ALT (간 지표) 데이터를 병렬로 비교하였다. ^ , P > 0.05.
도 33은 다양한 투여 조건 하에 치료 과정의 종료시 면역 무손상 마우스(immune intact mice) (C57BL/6J)의 체중 데이터의 비교 분석을 나타낸다. ^ , P > 0.05.
도 34는 전임상 시험에서 다양한 투여 조건 하에 치료 과정의 종료시 마우스 혈구 수(blood cell count)의 비교 분석을 나타낸다. WBC, 림프구 및 호중구를 병렬로 비교하였다. ^ , P > 0.05.
도 35는 종양 말단 부피 통계 분석을 나타낸다. 마우스에 화학요법 약물 DOX 단독 또는 항노화 약물 PCC1과 함께 투여하고, 8주의 종료 후 각각의 군의 종양 용적을 비교하고 분석하였다.
도 36은 종양 말단 부피 통계 분석을 나타낸다. 마우스에 화학요법 약물 DOC 단독 또는 항노화 약물 PCC1과 함께 투여하고, 8주의 종료 후 각각의 군의 종양 용적을 비교하고 분석하였다.
도 37은 종양 말단 부피 통계 분석을 나타낸다. 마우스에 화학요법 약물 VIN 단독 또는 항노화 약물 PCC1과 함께 투여하고, 8주 종료 후 각각의 군의 종양 용적을 비교하고 분석하였다.
도 38은 전임상 단계 마우스에 대한 처리 후 생존 곡선을 나타낸다. 24 내지 27개월령부터 시작하여, C57BL/6 마우스는 2주마다 비히클 또는 PCC1을 복강내 투여받았다 (비히클 군의 경우 n = 80; PCC1 군의 경우 n = 91). 각각의 군에서 동물의 평균 생존(median survival)을 계산하고 표시하였다. ****, P < 0.0001.
도 39는 전임상 단계 마우스에 대한 전체 (수명, 또는 전체 길이) 생존 곡선을 나타낸다. 24 내지 27개월령부터 시작하여, C57BL/6 마우스는 2주마다 비히클 또는 PCC1을 복강내 투여받았다 (비히클 군의 경우 n = 80; PCC1 군의 경우 n = 91). 각각의 군에서 동물의 평균 수명 생존율을 계산하고 표시하였다. ****, P < 0.0001.
도 40은 각각의 군의 동물 중 최고 범위의 수명 길이를 가진 암컷 마우스를 선택하여 그룹 간 최고 보행 속도, 체력(stamina) 및 전체 수명(overall lifespan)의 비교 분석을 수행하였다. N=5. ^, P > 0.05; **, P < 0.01.
도 41은 각각의 군의 동물 중 최고 범위의 수명 길이를 가진 암컷 마우스를 선택하여 그룹 간 최고 보행 속도, 체력 및 전체 수명의 비교 분석을 수행하였다. N = 5/군. ^, P > 0.05; ***, P < 0.001.
도 42는 두 군의 동물에서 수명 말기에 각각의 마우스가 겪는 질환 부담의 비교 분석을 나타낸다. N=60/군. 통계 결과는 박스-및-위스커 플롯(box-and-whisker plot)으로서 표시되며, 각각의 박스는 사분위수 범위 내의 중앙값을 나타낸다. ^, P > 0.05.
도 43은 두 군의 동물에서 수명 말기에 각각의 마우스에서 발생된 종양 수의 비교 분석을 나타낸다. N = 60/군. 통계 결과는 박스-및-위스커 플롯으로서 표시되며, 각각의 박스는 사분위수 범위 내의 중앙값을 나타낸다. ^, P > 0.05.

본 발명자들은 프로시아니딘이 체내에서 노화 세포를 하향조절하거나 청소하는 데 탁월한 효과가 있어, 조직 미세환경에서 손상된 세포를 청소하는 데 적용할 수 있으며, 나이가 들면서 자연스럽게 노화되는 세포를 청소하는 데에도 사용할 수 있음을 밝혀냈다.

본 출원에서 사용된 바와 같이, "증식하는 세포"는 연속적이고 활발한 분열 및 지속적인 증식의 상태를 유지할 수 있는 세포를 지칭한다. "비증식세포"는 좁은 의미에서 자연 노화 세포 또는 손상된 세포와 같은 노화 세포를 지칭하며, 손상된 세포는 조직 미세환경에서 손상된 세포, 바람직하게는 화학요법 또는 방사선요법에 의해 손상된 세포를 포함한다. 본 출원에서 사용된 바와 같이, "노화 세포"는 증식 및 분열 능력이 감소되어 생리 기능이 저하된 세포를 지칭한다.

본원에서 언급된 "프로시아니딘"은 올리고머성 프로시아니딘을 포함하는 폴리페놀 화합물에 대한 일반적인 용어이다. 프로시아니딘은 식물 폴리페놀 계열의 중요한 부류이다. 이 플라바놀 화합물의 대부분은 플라반 결합의 C4-C6 및 C4-C8을 통해 카테킨 또는 에피카테킨을 연결함으로써 형성되며, 일부 화합물은 갈레이트이며; 그들의 공통점은 이들이 본질적으로 안토시아닌 단량체로 구성된 올리고머, 대부분 이량체 및 삼량체라는 점이다. 예시적인 올리고머성 프로시아니딘은 화학식 I로 표시되는 단위를 가지며, 단위의 수는 1 초과 내지 6이고, 여기서 물결선은 다른 단위와의 연결을 나타낸다.

일부 실시양태에서, 프로시아니딘은 하기 화학식으로 표시되는 프로시아니딘 C1 (PCC1)이다:

.

PCC1은 식물 폴리페놀 계열의 삼량체이며, 항산화, 항염증, 항암 효과를 가질뿐만 아니라, 노화 세포를 표적으로 하고 청소하는 기능도 가지고 있다.

본 출원에서, "화합물" (프로시아니딘, 이의 염 또는 전구약물 등 포함)은 순수한 형태의 화합물, 또는 순도가 85% 초과 (바람직하게는 90% 초과, 예컨대 95%, 98%, 99%)인 화합물일 수 있다.

관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 출원의 화합물의 구조를 알게 된 후, 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법에 의해, 화학 합성 또는 유기체 (예를 들어, 미생물)로부터의 추출 방법과 같은 관련 기술분야에 공지된 원료를 사용하여 본 출원의 화합물을 수득할 수 있으며, 이들 방법은 모두 본 출원에 포함된다는 것을 이해해야 한다. 게다가, 프로시아니딘이 또한 시판되는 약물이므로, 그 완제품은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 쉽게 입수가능하다.

본 출원에는, 프로시아니딘의 제약상 허용되는 염이 또한, 포함되며, 이는 프로시아니딘의 화학적 활성을 또한 유지한다. 본 출원에서 "제약상 허용되는" 성분은 유해한 부작용(adverse side effect) (예를 들어, 독성, 자극(irritation) 및 알레르기 반응) 없이 인간 및/또는 동물에 사용하기에 적합한 물질, 즉 합당한 이익/위험 비율을 가진 물질이다. "제약상 허용되는 염"은 프로시아니딘의 산성 염 또는 염기성 염일 수 있다.

"제약상 허용되는 산성 염"은 유리 염기의 생물학적 활성 및 특성을 유지할 수 있는 염을 지칭하며, 이러한 염은 바람직하지 않은 생물학적 활성 또는 다른 변화를 갖지 않을 것이다. 이러한 염은 무기산, 예를 들어 염산, 브로민화수소산, 황산, 질산, 인산 등으로부터 형성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 염은 또한 유기 산, 예를 들어 아세트산, 디클로로아세트산, 아디프산, 알긴산, 아스코르브산, 아스파르트산, 벤젠술폰산, 벤조산, 4-아세트아미도벤조산, 캄포르산, 캄포르술폰산, 카프르산, 카프로산, 카프릴산, 탄산, 신남산, 시트르산, 시클라믹산, 도데실술폰산, 1,2-에탄디술폰산, 에탄술폰산, 이세티온산, 포름산, 푸마르산, 갈락타르산, 젠티식산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루쿠론산, 글루탐산, 글루타르산, 2-옥소글루타르산, 글리세로인산, 글리콜산, 히푸르산, 이소부티르산, 락트산, 락토바이오닉산(lactobionic acid), 라우르산 산, 말레산, 말론산, 만델산, 메탄술폰산, 점액산, 나프탈렌-1,5-디술폰산, 2-나프탈렌술폰산, 1-나프톨-2-카르복실산, 니아신, 올레산, 오로트산, 옥살산, 팔미트산, 파모산, 프로피온산, 피로글루탐산, 피루브산, 살리실산, 4-아미노살리실산, 세박산, 스테아르산, 숙신산, 타르타르산, 티오시안산, p-톨루엔술폰산, 트리플루오로아세트산, 운데실렌산 및 유사한 산으로부터 형성될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

"제약상 허용되는 염기성 염"은 유리 산의 생물학적 활성 및 특성을 유지할 수 있는 염을 지칭하며, 이러한 염은 바람직하지 않은 생물학적 활성 또는 다른 변화를 갖지 않을 것이다. 이러한 염은 유리 산에 무기 또는 유기 염기를 첨가하여 제조된다. 무기 염기로부터 유래된 염은 나트륨염, 칼륨염, 리튬염, 암모늄염, 칼슘염, 마그네슘염, 철염, 아연염, 구리염, 망간염, 알루미늄염을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 무기 염은 암모늄염, 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염 및 마그네슘염이다. 유기 염기로부터 유래된 염은 1급, 2급, 및 3급 암모늄 염을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 치환된 아민은 천연 치환된 아민, 시클릭 아민, 및 염기성 이온 교환 수지, 예컨대 암모니아, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 디에탄올아민, 에탄올아민, 데아놀, 2-디메틸아미노에탄올, 2-디에틸아미노에탄올, 디시클로헥실아민, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인, 히드라바민, 콜린, 베타인, N-벤질-2-페닐에틸아민, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 에틸렌디아민, 글루코사민, 메틸글루코사민, 테오브로민, 트리에탄올아민, 트로메타민, 퓨린, 피페라진, 피페리딘, N-에틸피페리딘, 폴리아미드 수지 및 유사한 구조를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 유기 염기는 이소프로필아민, 디에틸아민, 에탄올아민, 트리메틸아민, 디시클로헥실아민, 콜린 및 카페인이다.

본 특허에 개시된 화합물은 1수화물, 2수화물, 반수화물, 세스퀴수화물, 3수화물, 4수화물, 및 유사한 구조를 포함한 수화물로 존재할 수 있다. 본 출원에서는, 프로시아니딘 전구약물이 또한 포함되며, "전구약물"은 대상체의 체내에서 대사 또는 화학반응을 거쳐 적절한 방법으로 섭취한 후 원하는 프로시아니딘으로 전환되는 화합물을 지칭한다.

프로시아니딘

본 발명자들은 프로시아니딘 (이하 PCC1이라 함)이 SASP의 발현을 효과적으로 억제하여 노화 세포의 생존율을 유의하게 감소시킬 수 있음을 밝혀냈다.

따라서, 본 출원은 노화-연관 분리 표현형 (SASP)의 하향조절, SASP 인자의 발현 또는 활성의 감소, 세포 노화 마커 인자의 발현 또는 활성의 감소, 비증식 세포의 아폽토시스의 유도, 비증식 세포의 감소 또는 제거, 노화의 지연, 대상체의 수명의 연장, 대상체의 연령-관련 질환 부담의 감소, 비증식성 세포의 감소 또는 제거로부터 이익을 얻는 질환의 예방, 경감 및 치료, 암 요법에 대한 내성의 감소, 종양 퇴행의 촉진, 종양 용적의 감소, 암의 예방 또는 치료, 또는 암 생존의 연장을 위해 사용되는 의약 또는 제제의 제조에서 프로시아니딘의 용도를 제공한다. 본원에서, "개체", "대상체" 또는 "환자"는 포유동물, 특히 인간을 지칭한다.

이 문서에서, "제거(elimination)" 및 "청소(clearance)"는 상호교환적으로 사용되며, 이는 물질이 세포 자체 메커니즘을 사용하여 비증식 세포 (노화 세포)를 선택적으로 파괴하여 세포 사멸 및 청소 효과를 달성함을 나타낸다. 예시적 실시양태에서, 물질 (예를 들어, PCC1)은 아폽토시스를 유도함으로써 비증식성 세포를 제거하거나 청소할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "SASP 인자"는 세포외 기질 단백질, 염증성 시토카인 및 암 세포 성장 인자를 포함한다. SASP 인자는 도 6에 나타낸 인자이거나 IL6, CXCL8, MCP2, CXCL1, GM-CSF, MMP3, AREG, SFRP2, ANGPTL4, IL1a로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.

본원에 기재된 "비증식성 세포의 감소 또는 제거로부터 이익을 얻는 질환"은 일반적으로 암, 심혈관 및 뇌혈관 질환, 골다공증, 연령-관련 퇴행성 관절 질환 (예를 들어, 관절염), 대사 질환, 신경퇴행성 질환(neurodegenerative disease)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 연령-관련 질환이다. 바람직하게는, 암은 전립선암이다.

본원에서, 프로시아니딘 (예를 들어, PCC1)은 또한 대상체의 수명을 연장하고 대상체의 연령-관련 질환 부담을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 노인 대상체, 예를 들어 적어도 20개월령의 마우스 또는 적어도 60세의 인간에 상응하는 대상체이다. 바람직하게는, 노인 대상체는 적어도 24개월령의 마우스 또는 적어도 75세의 인간에 상응하는 대상체이다. 보다 바람직하게는 상기 노인 대상체는 24-27개월령의 마우스 또는 75-90세의 인간에 상응하는 대상체이다. 구체적인 실시양태에서는 노인 대상체를 연구 대상으로 하였긴 하지만, 이는 결과 분석의 편의를 위한 예시에 불과하다 (예를 들어, 노인 대상체일수록 연령-관련 질환을 더 많이 갖고 있다). 본 출원에서 발견된 노화 세포를 제거하는 프로시아니딘의 효능을 기반으로 하여, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 노화 세포를 제거하고, 수명을 연장하고, 연령-관련 질환의 부담을 감소시키기 위해 임의의 연령의 대상체에서 사용될 수 있음을 알아야 한다.

본원에서, 프로시아니딘 (예를 들어, PCC1)은 또한 환자의 암 요법에 대한 내성을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 암 요법은 화학요법 또는 방사선 요법을 포함하며; 화학요법의 예는 MIT 또는 DOX와 같은 세포독성 요법을 포함하고, 방사선 요법의 예는 이온화 방사선을 포함하며, 주로 양성자 및 중성자 흐름뿐만 아니라 α선, β선, γ선 및 X선을 사용한 요법을 포함한다.

더욱이, 본 발명자들은 프로시아니딘 (예를 들어, PCC1)을 특정 작용제와 조합하여 사용할 경우 세포노화 유도제의 세포독성을 증강시킬 수 있음을 밝혀냈다. 세포 노화 유도제는 DNA 손상 및/또는 아폽토시스를 유발하여 노화 세포 생성을 유도하는 작용제일 수 있으며, 이의 예는 화학요법제 또는 방사선을 포함한다.

따라서, 본 출원은 또한 세포 노화를 유도하는 제제의 효능을 증강시키는 프로시아니딘의 용도, 및 종양 퇴행의 촉진, 종양 용적의 감소, 암의 예방 또는 치료 및 암 생존의 연장에 있어서 세포 노화 유도제와 조합된 프로시아니딘의 용도를 제공한다. 예시적으로, 세포는 종양 세포이고; 종양은 전립선 종양이고; 암은 전립선암이다.

본 출원의 또 다른 측면에서, 상기 용도를 달성하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 본원에 기재된 프로시아니딘 또는 이의 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 전구약물, 및 임의로 (b) 대상체의 노화 세포를 유도할 수 있는 작용제를 사용하여, 노화 세포를 치료하거나 이들을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "투여하다" 또는 "제공하는"은 본 출원의 화합물 또는 제약 조성물을 치료 또는 예방할 질환 또는 병태를 앓고 있거나 질환 또는 병태의 위험에 있는 대상체에게 제공하는 것을 지칭한다.

조성물

본 출원의 조성물은 프로시아니딘 또는 이의 염과 같은 물질을 유효성분으로 사용한다. 상기에 언급된 바와 같이, 프로시아니딘 (예를 들어, PCC1)을 함유하는 조성물은 노화-연관 분리 표현형 (SASP)의 하향조절, SASP 인자의 발현 또는 활성의 감소, 세포 노화 마커 인자의 발현 또는 활성의 감소, 비증식 세포의 아폽토시스의 유도, 비증식 세포의 감소 또는 제거, 노화의 지연, 대상체의 수명의 연장, 대상체의 연령-관련 질환 부담의 감소, 비증식 세포의 감소 또는 제거로부터 이익을 얻을 수 있는 질환의 예방, 완화 및 치료, 세포 노화를 유도할 수 있는 작용제의 세포독성 증강, 또는 암 요법에 대한 내성의 감소를 가능하게 한다.

조성물이 세포 노화-유도제 (예를 들어, 화학요법제 또는 방사선)를 활성 성분으로 추가로 포함하는 경우, 조성물은 종양 퇴행의 촉진, 종양 용적의 감소, 암의 예방 또는 치료, 및 암 생존의 연장을 가능하게 할 수 있다.

본원에 기재된 조성물을 의약으로 사용하는 경우, 이는 또한 제약상 허용되는 보조 물질을 포함한다. "제약상 허용되는 보조 물질"은 본 출원의 조성물 중 활성 성분 (예를 들어, 프로시아니딘 및 임의적 세포 노화-유도제)을 동물 또는 인간에게 전달하는 데 사용될 수 있는 제약상 또는 식품에 허용되는 담체, 용매, 현탁화제 또는 부형제이다. 예시적인 보조 물질은 액체 또는 고체일 수 있으며, pH 조정제, 계면활성제, 탄수화물, 아주반트, 항산화제, 킬레이트제, 이온 강도 증강제, 방부제, 담체, 활택제, 감미제, 염료/착색제, 향미 증강제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 안정제, 등장화제, 용매, 유화제, 분무제, 압축 공기 또는 기타 적합한 가스, 또는 의약 화합물과 조합하여 사용되는 기타 적합한 불활성 성분을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 보다 구체적으로, 적합한 보조 물질은 소분자 화합물의 투여를 위해 관련 기술분야에서 통상적으로 사용되는 것일 수 있다. 보조 물질은 다양한 락토스, 만니톨, 오일 예컨대 옥수수, 완충제 예컨대 PBS, 식염수, 폴리에틸렌글리콜, 글리세롤, 폴리프로필렌글리콜, 디메틸술폭시드, 아미드 예컨대 디메틸아세트아미드, 단백질 예컨대 백색 단백질, 및 세정제 예컨대 트윈 80, 단당류 및 올리고당류 예컨대 글루코스, 락토스, 시클로덱스트린 및 전분을 포함한다.

일반적으로, 조성물은 본원에 기재된 활성 성분의 치료적 유효량을 함유할 것이다. 치료적 유효량은 대상체에서 질환 또는 병태의 치료, 예방, 경감 및/또는 완화를 달성할 수 있는 용량을 지칭한다. 치료적 유효량은 환자의 연령, 성별, 질병 및 그 중증도, 및 환자의 기타 신체적 조건과 같은 요인에 따라 결정될 수 있다. 치료적 유효량은 단일 용량으로서 투여될 수 있거나, 효과적인 치료 요법에 따라 다중 용량으로 투여될 수 있다. 본원에서, 대상체 또는 환자는 일반적으로 포유동물, 특히 인간을 지칭한다. 예시적으로, 조성물은, 예를 들어, 0.001-50 중량%, 바람직하게는 0.01-30 중량%, 보다 바람직하게는 0.05-10 중량%의 활성 성분(예를 들어, 프로시아니딘 및 임의적 세포 노화-유도제)을 포함한다.

본 출원의 제약 조성물 또는 혼합물은 통상적인 방법에 의해 임의의 통상적인 제조 형태로 제조될 수 있다. 투여 형태는 다양할 수 있으며, 활성 성분이 포유동물의 몸에 효과적으로 도달할 수 있는 한, 투여 형태가 허용된다. 예를 들어, 이는 주사제, 수액제(infusion), 정제, 캡슐제, 환제로부터 선택될 수 있다. 여기서, 활성 성분 (예를 들어, 프로시아니딘 및 임의적 세포 노화 유도 시약)은 적합한 고체 또는 액체 담체 또는 희석제에 존재할 수 있다. 활성 성분의 혼합물 또는 본 출원의 제약 조성물은 또한 주사 또는 주입에 적합한 멸균 장치에 보관될 수 있다.

조성물 중 활성 성분 (예를 들어, 프로시아니딘 및 임의적 세포 노화-유도제)의 유효 용량은 투여 방식 및 치료할 질환의 중증도에 따라 달라질 수 있으며, 이는 임상의의 경험 및 권고를 기반으로 할 수 있다.

본 출원의 구체적 실시양태에서, 상이한 몰비 또는 질량비에 따른 프로시아니딘 및 임의적 세포 노화-유도제에 대한 일련의 투여 요법이 제공된다. 본 출원에서는, 마우스가 또한 실험 동물로 사용된다. 마우스에 대한 투여량을 인간에 적합한 투여량으로 전환하는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하다. 예를 들어, 미흐-루브너(Meeh-Rubner) 수학식에 따라 계산할 수 있다.

A=k×(W^2/3)/10000.

상기 수학식에서, A는 신체 표면적을 나타내며, m²로 표시되며; W는 g로 표시되는 체중을 나타내고; K는 상수를 나타내며, 동물 종에 따라 다르며, 즉, 마우스및 래트의 경우 9.1, 기니피이의 경우 9.8, 토끼의 경우 10.1, 고양이의 경우 9.9, 개의 경우 11.2, 원숭이의 경우 11.8, 및 인간의 경우 10.6이다.

프로시아니딘 및 임의적 세포 노화-유도제 또는 제약 조성물은 경구, 정맥내, 근육내 또는 피하 등으로 투여될 수 있다. 경구 투여가 바람직할 수 있다. 경구 투여에 적합한 제약 형태는 정제, 산제, 캡슐, 서방형 제제 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 주사에 적합한 제약 형태는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 이들 형태는 멸균 상태여야 하며 주사기로부터 쉽게 배출할 수 있는 액체이어야 한다.

필요에 따라, 프로시아니딘 및 임의적 세포 노화-유도제를 또한 추가 활성 성분 또는 약물과 조합하여 투여할 수 있다.

본 출원은 또한 노화 세포를 하향조절 또는 청소하거나 유기체의 수명을 연장하기 위한 의약 상자 또는 키트를 제공하고, 의약 상자 또는 키트는 본원에 임의의 실시양태에 기재된 제약 조성물을 포함한다. 대안적으로, 의약 상자 또는 키트는 본원에 기재된 프로시아니딘 및 임의적 세포 노화-유도제의 혼합물을 포함한다. 대안적으로, 의약 상자 또는 키트는 용기 1, 및 용기 1에 배치된 본원에 기재된 프로시아니딘 또는 이의 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 전구약물; 및 용기 2, 및 용기 2에 배치된 세포 노화-유도 시약을 포함한다.

의약 상자 또는 키트는 또한 다양한 투여 형태로 조성물을 사용하거나 투여하기 위해 필요한 측정 도구 및 주사기 등과 같은 용기와 같은 일부 보조 물질을 포함할 수 있다. 의약 상자 또는 키트는 또한 노화 세포를 치료, 하향-조절 또는 제거하거나 신체의 생존 기간을 연장하는 방법을 설명하는 사용 설명서를 포함할 수 있다.

예시적인 실시양태

1. (a) 프로시아니딘 또는 이의 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 전구약물, 및 (b) 대상체가 노화 세포를 생성하도록 유도할 수 있는 작용제, 및 임의로 제약상 허용되는 보조 물질을 포함하는 제약 조성물로서,

바람직하게는, 프로시아니딘이 올리고머성 프로시아니딘인, 제약 조성물.

2. 항목 1에 있어서,

프로시아니딘 또는 이의 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 전구약물이 제약 조성물에서 적어도 1 μM의 최종 농도를 갖고/갖거나,

프로시아니딘이 프로시아니딘 C1이고/이거나,

작용제가 DNA 손상 및/또는 아폽토시스를 유발할 수 있는 작용제를 포함하는, 제약 조성물.

3. 노화-연관 분리 표현 (SASP)의 하향조절, SASP 인자의 발현 또는 활성의 감소, 세포 노화 마커 인자의 발현 또는 활성의 감소, 비증식 세포의 아폽토시스의 유도, 비증식 세포의 감소 또는 제거, 노화의 지연, 대상체의 수명의 연장, 대상체의 연령-관련 질환 부담의 감소, 비증식성 세포의 감소 또는 제거로부터 이익을 얻는 질환의 예방, 경감 및 치료, 암 요법에 대한 내성의 감소, 세포 노화를 유도할 수 있는 작용제의 효능의 증강, 종양 퇴행의 촉진, 종양 용적의 감소, 암의 예방 또는 치료, 또는 암 생존의 연장을 위해 사용되는 의약 또는 제제의 제조에서 프로시아니딘 또는 이의 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 전구약물의 용도로서,

바람직하게는, 프로시아니딘이 올리고머성 프로시아니딘인 용도.

4. 항목 3에 있어서,

프로시아니딘이 프로시아니딘 C1이고/이거나,

SASP 인자가 세포외 기질 단백질, 염증성 시토카인 및 암세포 성장 인자를 포함하고/하거나,

비증식 세포가 노화 세포, 바람직하게는 자연 노화 세포 또는 손상된 세포이고/이거나,

비증식성 세포의 감소 또는 제거로부터 이익을 얻는 질환이 노화-관련 질환, 바람직하게는 암, 심혈관 및 뇌혈관 질환, 골다공증, 연령-관련 퇴행성 관절 질환, 대사 질환, 신경퇴행성 질환이고/이거나,

세포 노화를 유도할 수 있는 작용제가 DNA 손상 및/또는 아폽토시스를 유발할 수 있는 작용제를 포함하고/하거나,

대상체가 노인 대상체이고/이거나,

암 요법이 화학요법 또는 방사선 요법을 포함하는, 용도.

5. 항목 3 또는 4에 있어서, 종양이 전립선 종양이고/이거나 암이 전립선암인, 용도.

6. 의약 또는 제제의 제조에서 물질의 용도로서, 여기서 물질이 (a) 프로시아니딘 또는 이의 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 전구약물, 및 (b) 대상체가 노화 세포를 생성하도록 유도할 수 있는 작용제를 포함하며, 의약 또는 제제가 종양 퇴행의 촉진, 종양 용적의 감소, 암의 예방 또는 치료, 또는 암 생존의 연장을 위해 사용되며,

바람직하게는, 프로시아니딘이 올리고머성 프로시아니딘, 보다 바람직하게는 프로시아니딘 C1이고,

바람직하게는, 대상체가 노화 세포를 생성하도록 유도할 수 있는 작용제가 DNA 손상 및/또는 세포 아폽토시스를 유발할 수 있는 작용제를 포함하는, 용도.

7. 항목 6에 있어서, 종양이 전립선 종양이고/이거나 암이 전립선암인, 용도.

8. 항목 1 또는 2에 기재된 바와 같은 제약 조성물을 포함하는 의약 상자 또는 키트로서,

바람직하게는, 의약 상자 또는 키트가 용기 1 및 용기 2를 포함하며, 이 용기 각각은 (a) 프로시아니딘 또는 이의 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 전구약물 및 임의적 제약상 허용되는 보조 물질, 및 (b) 대상체가 노화 세포를 생성하도록 유도할 수 있는 작용제 및 임의적 제약상 허용되는 보조 물질을 함유하며,

바람직하게는, 프로시아니딘이 올리고머성 프로시아니딘, 보다 바람직하게는 프로시아니딘 C1인, 의약 상자 또는 키트.

9. 비증식성 세포를 프로시아니딘 또는 이의 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 전구약물로 처리하는 단계를 포함하는, 비증식성 세포에서 변화시키는 방법으로서, 변화가 노화-연관 분리 표현형 (SASP)의 하향조절, SASP 인자의 발현 또는 활성의 감소, 세포 노화 마커 인자의 발현 또는 활성의 감소, 비증식 세포의 아폽토시스의 유도, 비증식 세포의 감소 또는 제거, 또는 암 치료적 치료에 대한 세포의 내성의 감소로부터 선택된 하나 이상을 포함하며,

바람직하게는,

프로시아니딘이 올리고머성 프로시아니딘, 보다 바람직하게는 프로시아니딘 C1이고/이거나,

프로시아니딘 또는 이의 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 전구약물이 적어도 1 μM의 최종 농도를 갖는, 방법.

10. (a) 프로시아니딘 또는 이의 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 전구약물, 및 (b) 세포 노화를 유도할 수 있는 작용제를 사용하여 세포를 처리하는 단계를 포함하는, 세포 노화를 유도할 수 있는 작용제의 세포독성을 증강시키기 위한 방법으로서,

바람직하게는,

세포 노화를 유도할 수 있는 작용제가 DNA 손상 및/또는 아폽토시스를 유발할 수 있고/있거나,

프로시아니딘 또는 이의 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 전구약물이 적어도 10 μM의 최종 농도를 갖는, 방법.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 출원이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖다. 본원에 기재된 바와 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 물질이 본 출원의 시행 또는 시험에 사용될 수 있긴 하지만, 바람직한 방법 및 물질이 이제 기재된다. 본원에 구체적으로 언급된 모든 간행물 및 특허는 본 출원과 관련하여 사용될 수 있는 간행물에 보고된 화학물질, 장치, 통계 분석 및 방법론을 기재하고 기술하는 것을 포함하는 모든 목적을 위해 그 전문이 참조로 포함된다. 이 설명에 인용된 모든 참고문헌은 최신 기술을 나타내는 것으로 간주되어야 한다. 본원에 어떤 것도 본 출원이 임의의 선행 출원에 의해 이러한 개시내용보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

본 출원은 특정 실시예와 함께 아래에서 추가로 설명된다. 이들 실시예는 단지 본 출원을 예시하기 위해 사용되며 본 출원의 범위를 제한하려는 의도가 아님을 이해하여야 한다. 하기 실시예에서 구체적 조건을 나타내지 않은 실험 방법은 대개 문헌 [J. Sambrook et al., Molecular Cloning Experiment Guide, the third edition, Science Press, 2002]에 기재된 것들과 같은 통상적인 조건, 또는 제조업체에서 권장하는 조건에 따른다.

실시예

물질 및 방법

1. 세포 배양

(1) 세포주 유지

1차 정상 인간 전립선 간질 세포주 PSC27 (프레드 허친슨 암 연구 센터(Fred HutchinsonCancer Research Center), 미국으로부터 입수)을 37℃ 및 5% CO₂의 인큐베이터에서 배양하고 PSCC 완전 배양 배지에서 증식 및 계대배양하였다.

(2) 세포 동결보존 및 회수

a. 세포 동결보존

로그 성장 단계(logarithmic growth phase)의 세포를 0.25% 트립신으로 수집하고, 1000 rpm에서 2분 동안 원심분리하고, 상청액을 폐기하고, 세포를 신선하게 준비된 동결 용액에 재현탁시켰다. 세포를 라벨이 붙은 멸균 냉동 바이알로 하위포장하였다. 이어서 이들을 구배 방식으로 온도를 낮추어 냉각하고, 최종적으로 장기 보관을 위해 액체 질소로 옮겼다.

b. 세포 회수

액체 질소에 동결된 세포를 꺼내어 신속하게 해동할 수 있도록 37℃ 수조에 즉시 넣었다. 2 mL의 세포 배양 배지를 직접 첨가하여 세포를 고르게 현탁시켰다. 세포가 벽에 부착된 후, 새로운 배양 배지를 사용하여 교체하였다.

(3) 시험관내 실험적 치료

세포 손상을 유발하기 위해, PSC27 세포가 80%까지 성장했을 때 50 μg/mL 블레오마이신 (BLEO)을 배양 배지에 첨가하였다 (PSC27-CTRL로 약칭함). 12시간의 약물 처리 후, 세포를 PBS로 3회 간단히 세척하고, 배양 배지에서 7-10일 동안 방치한 후, 후속 실험을 수행하였다.

2. 천연물 라이브러리 스크리닝

약력학적 분석은 총 41개의 성분이 포함된 천연물 라이브러리 (BY-HEALTH)에서 수행하였으며, 그 중 대부분은 약용 식물 추출물이었고 항노화 가능성이 있었다. 각각의 생성물은 특정 농도 구배에 따라 96-웰 플레이트에 희석되었고, 밀도는 웰당 5000개 세포였다. 배지는 DMEM을 사용하며, 천연물 (또는 화합물)의 작업농도는 일반적으로 1 μM 내지 1 mM으로 조절된다. 약물 처리 3-7일 후, CCK-8 세포 카운팅 키트(Cell Counting Kit) (WST-8 원리, 바짐(Vazyme) 기반)로 세포 증식을 측정하였고, 카스파제 3/7 활성 키트 (프로메가(Promega))로 세포 사멸 활성을 측정하였다.

초기에 확인된 약물 후보는 30일 동안 추가로 스크리닝되었다. 2차 후보 범위에 들어가는 약물을 웰당 20,000개 세포로 6웰 플레이트에 희석하였다. 배지 및 약물 후보를 격일로 변경하였다. 각각의 약물이 세포 표현형 및 생존율 등에 미치는 영향을 결정하기 위해, 약물 농도에 따른 확인 분석(confirmatory analysis)을 수행하였다.

3. 웨스턴 블로팅(Western blotting) 및 면역형광 검출

세포 용해물-유래 단백질을 NuPAGE 4-12% Bis-Tris 겔을 사용하여 분리하고 니트로셀룰로오스 막 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies))으로 옮겼다. 블롯(blot)을 실온에서 1시간 동안 5% 탈지유로 차단하고 제조업체의 프로토콜 농도에서 원하는 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션한 다음에, 호스래디시 페억시다제(horseradish peroxidase)-접합된 2차 항체 (산타 크루즈(Santa Cruz))와 1시간 동안 인큐베이션하고 블롯 신호 검출을 제조업체의 프로토콜에 따라 증강된 화학발광(enhanced chemiluminescence) 검출 시약 (밀리포어(Millipore))으로 수행하고 이미지퀀트(ImageQuant) LAS 400 포스포-이미저(Phospho-Imager) (지이 헬쓰케어(GE Healthcare))를 사용하였다. 표준 단백질 마커로서, 우리는 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)의 페이지룰러(PageRuler) 플러스 프리스테인드 프로테인 래더(Plus Prestained Protein Ladder) (넘버. 26619)를 사용하였다.

면역형광 염색을 위해, 접시에서 배양한 후 적어도 24시간 동안 커버슬립에 표적 세포를 미리 시딩하였다. 간단한 세척 후, 세포를 PBS 중 4% 파라포름알데히드로 8분 동안 고정하고 5% 정상 염소 혈청 (NGS, 써모 피셔)으로 30분 동안 차단하였다. 마우스 모노클로날 항체-항-포스포-히스톤(Histone) H2A.X (Ser139) (클론 JBW301, 밀리포어) 및 마우스 모노클로날 항체-항-BrdU (Cat# 347580, 비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences)), 이차 항체 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)® 488 (또는 594)-유로링크의(Eurolink's) F(ab')2를 고정된 세포가 코팅된 슬라이드에 순차적으로 첨가하였다. 핵은 2 μg/m DAPI로 대비염색되었다. 데이터 분석 및 결과 표시를 위해 세 개의 관찰 필드에서 가장 대표적인 이미지를 선택하였다. FV1000 레이저 스캐닝 공초점 현미경 (올림푸스(Olympus))을 사용하여 세포의 공초점 형광 이미지를 획득하였다.

4. 전체-전사체 시퀀싱(Whole-transcriptome sequencing) 분석 (RNA-sequencing)

전체-전사체 시퀀싱을 상이한 치료 조건 하에 일차 인간 전립선 간질 세포주 PSC27에서 수행하였다. 간질 세포로부터 총 RNA 샘플을 수득하였다. 그들의 무결성은 바이오어넬라이저(Bioanalyzer) 2100 (애질런트(Agilent))에 의해 확인하였고, RNA는 일루미나(Illumina) HiSeq X10에 의해 시퀀싱하였으며, 유전자 발현 수준은 소프트웨어 패키지 rsem (https://deweylab.github.io/rsem/)에 의해 정량화되었다. 간단히 말해서, rRNA는 리보마이너스 유카리오테 키트(RiboMinus Eukaryote Kit) (퀴아젠(Qiagen), 미국 캘리포니아주 발렌시아)를 사용하여 RNA 샘플로부터 고갈시켰고; 제조업체의 지침에 따라, TruSeq 스트랜티드 토털(Stranded Total) RNA 제조 키트(Preparation Kits) (일루미나, 미국 캘리포니아주 샌디에이고)를 사용하여 딥 시퀀싱(deep sequencing) 전에 가닥-특이적 RNA-seq 라이브러리를 구축하였다.

페어드 엔드 전사체 판독(paired-end transcriptomic read)은 참조 게놈 (GRCh38/hg38)에 매핑되었고, 참조-주석(annotation)은 보우타이(Bowtie) 도구를 사용하여 겐코드(Gencode) v27에서 수행하였다. 중복 판독(duplicate read)은 중복을 표시하기 위해 피카드(picard) 도구 (1.98) 스크립트를 사용하여 확인하였으며 (https://github.com/broadinstitute/picard), 중복되지 않은 판독만 유지되었다. 참조 스플라이스 접합(Reference splice junction)은 참조 전사체(reference transcriptome) (Ensembl Build 73)에 의해 제공되었다. FPKM 값은 커프링크(Cufflink)로 계산되었고 커프링크 최대 우도 추정 함수는 차등 유전자 발현을 호출하는 데 사용되었다. 발현에 유의한 변화를 가진 유전자는 위발견율(false discovery rate)-보정된 P-값 < 0.05로 정의되었으며, 상태가 "공지된(Known)"이고 바이오타입(biotype) "코딩"인 단지 앙상블 유전자(Ensembl Gene) 73이 하류 분석에 사용되었다.

다음으로, 트림 갈로어(Trim Galore) (v0.3.0) (http://www.생물정보학.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/)를 사용하여 판독값을 트리밍하고 품질 평가는 FastQC (v0.10.0) (//www.생물정보학.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc/)를 사용하여 수행하였다. 이후, 무료 온라인 플랫폼인 마조르비오(Majorbio) I-생어(Sanger) 클라우드 플랫폼(Cloud Platform) (www.i-sanger.com)에서, DAVID 생물정보학 플랫폼 (https://david.ncifcrf.gov/) 및 인제뉴어티 경로 분석(Ingenuity Pathways Analysis) 프로그램 (http://www.ingenuity.com/index.html)을 이용함으로써, 미가공 데이터(raw data)에 대한 예비 분석을 수행하고, NCBI 유전자 발현 옴니버스(Gene Expression Omnibus) 데이터베이스에 액세스 코드(access code) GSE156448로 기탁하였다.

5. 단백질-단백질 상호작용 네트워크 분석

단백질-단백질 상호작용 (PPI) 분석은 STRING3.0으로 수행되었다. 기준을 충족하는 구체적 단백질을 온라인 분석 소프트웨어 (//www.networkanalyst.ca)로 내수송(import)하고, 최소 상호작용 네트워크를 선택하여 추가 허브(hub) 및 모듈(module) 분석을 수행하였다.

6. 유전자 세트 농축화(enrichment) 분석 (GSEA)

RNA-seq의 예비 분석으로부터 데이터를 기반으로 하여, 각각의 차별적으로 발현된 중요 유전자를 분석 및 비교하고, DESeq2로부터 입수한 "왈드 통계치(wald statistics)"를 사용하여 유전자를 분류했으며, GSEA는 MSigDB (http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb)에서 이용 가능한 모든 계획 유전자 세트의 분류 목록에서 수행되었다. DESeq2 독립 필터링은 매우 낮은 발현 수준을 가진 유전자를 선택하기 위해 정규화된 판독 수의 평균을 기반으로 한다. SASP의 GSEA 서명은 우리의 이전 간행물 (Zhang et al., 2018a)에 기재된 바와 같았다.

7. 정량적 PCR (RT-PCR)에 의한 유전자 발현 측정

(1) 전체 세포 RNA의 추출

성장기 또는 정체기 세포의 총 RNA를 트리졸(Trizol) 시약으로 추출하고, 각 T25 배양 플라스크에 트리졸 1 mL를 첨가한 후, 세포 스크레이퍼로 세포층을 긁어낸 후 원심분리관에 옮기고, 점성이 없어질 때까지 잘 혼합하였다. 트리졸 1 mL마다 0.2 mL의 클로로포름을 첨가하고, 15초 동안 격렬하게 진탕하고 실온에서 5-10분 동안 인큐베이션하고; 4℃에서 15분 동안 11,000 g에서 원심분리하고; 무색 상청액을 새로운 원심분리관에 옮기고, 트리졸 1 mL당 이소프로필 알코올 0.5 mL를 첨가하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고, 11,000 g 및 4℃에서 10분 동안 원심분리하고; 상청액을 폐기하고 75% 에탄올 (트리졸 1 mL당 75% 에탄올 1 mL 이상 사용)로 세척하고, 4℃에서 7,500 g에서 5분 동안 원심분리하였다. RNA 펠릿을 실온에서 5-10분 동안 건조시키고 (RNA는 건조시킬 수 없음), 펠릿을 DEPC-H₂O로 용해시켰다. 분광광도계로 RNA를 정량한 후, 소량의 총 RNA를 취하여 1% 아가로스 전기영동을 하여 RNA의 상태 및 품질을 점검하였다.

(2) 역전사 반응

Oligo-dT₂₃ V_N (50 uM), 1ul; 총 RNA, 1-2 ug; 8ul에 RNase-미함유(free) ddH₂O를 첨가하고 65℃에서 5분 동안 가열한 후, 신속하게 얼음에 넣어 냉각시키고, 2분 동안 정치시켰다.

첫 번째-가닥 cDNA 합성 용액 준비: 2 x RT Mix, 10 ul; HiScript II 효소 믹스, 2 ul. 첫 번째-가닥 cDNA 합성은 25℃에서 5분, 50℃에서 45분, 및 85℃에서 5분의 조건에 따라 수행하였다.

(3) 실시간 정량 PCR 반응

역전사 반응 생성물 cDNA를 주형(template)으로 50배 희석하였다. PCR 반응 용액은 다음과 같이 준비하였다: AceQ SYBR 그린 매스터 믹스(Green Master Mix), 10 ul; 프라이머 1 (10 uM), 0.4 ul; 프라이머 2 (10 uM), 0.4 ul; 록스 참조 염료(Rox Reference Dye), 0.4 ul; 주형, 2 ul; ddH₂O를 20 ul로 추가하였다.

상기 표준에 따라 샘플을 로딩하였고, 반응 조건은 95℃에서 15초 동안 사전-변성(pre-denaturation), 이어서 95℃에서 5초 동안, 60℃에서 31초 동안, 40 사이클(cycle)이었으며; 용융 곡선 조건은 95℃에서 15초, 60℃에서 30초, 95℃에서 15초였다. 샘플은 ABI ViiA7 (ABI) 기기에서 반응하였다. β-액틴의 발현을 내부 기준(internal reference)으로 사용하였다. 반응 종료 후, 소프트웨어 분석으로 각 유전자의 증폭 정도를 점검하고, 해당 역치 사이클 수를 도출하여, 2-ΔΔCt 방법을 이용하여 각 유전자의 상대적 발현을 계산하였다. 용융 곡선의 피크와 파형을 분석하여 수득된 증폭 산물이 특정 단일 표적 단편인지를 결정하였다.

여기서, 사용된 검출 프라이머 서열은 다음과 같았으며, F는 정방향 프라이머를 나타내고, R은 역방향 프라이머를 나타냈다:

IL6 (F: 서열식별번호:1, R: 서열식별번호:2); CXCL8 (F: 서열식별번호:3, R: 서열식별번호:4); SPINK1 (F: 서열식별번호:5, R: 서열식별번호:6); WNT16B (F: 서열식별번호:7, R: 서열식별번호:8); GM-CSF (F: 서열식별번호:9, R: 서열식별번호:10); MMP3 (F : 서열식별번호: 11, R: 서열식별번호: 12); IL-1α (F: 서열식별번호: 13, R: 서열식별번호: 14); p16INK4a (F: 서열식별번호: 15, R: 서열식별번호: 16); IL-1β (F: 서열식별번호: 17, R: 서열식별번호: 18); AREG (F: 서열식별번호:19, R: 서열식별번호:20); CXCL1 (F: 서열식별번호:21, R: 서열식별번호:22); CXCL3 (F: 서열식별번호:23, R: 서열식별번호:24 ); p21CIP1 (F: 서열식별번호:25, R: 서열식별번호:26); BMP6 (F: 서열식별번호:27, R: 서열식별번호:28).

8. SA-β-Gal 염색

노화 관련 β-갈락토시다제 (SA-β-Gal) 염색은 이전에 보고된 절차 (Debacq-Chainiaux et al., 2009)에 따라 수행하였다. 간단히 말해서, 배양 접시의 세포를 PBS로 세척하고 실온에서 고정시켰다. 세포를 2% 포름알데히드 및 0.2% 글루타르알데히드에서 3분 동안 고정시켰다. SA-β-Gal은 37℃에서 밤새 새로 준비한 염색 용액으로 염색하는 데 사용되었다. 다음날 영상을 촬영하여 단위 면적당 양성 세포의 비율을 계산하였다.

9. 클론 확장 실험

단일-세포 클론 확장 실험은 이전에 설명한 대로 수행하였다 (Duan et al., 2015; Wu et al., 2018). 간단히 말해서, 세포를 2000개 세포/웰의 밀도로 젤라틴-코팅된 12-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 크리스탈 바이올렛 염색 후 세포 클론을 계수하였다.

10. 노화세포에서 약물-유도 아폽토시스

PSC27 세포를 96-웰 접시에 플레이팅하고, 세포를 50 μg/mL BLEO 처리 하에 노화를 유도하였다. PCC1 및 ABT263을 각각 50 μM 및 1.0 μM의 농도로 첨가하였다. 세포 배양 배지에 인큐사이트 눅라이트 적색 시약 (에센 바이오사이언스(Essen Bioscience)) 및 인큐사이트 C-3/7 아폽토시스 시약(에센 바이오사이언스)를 보충하였다. 대표 시야를 선택하여 사진을 촬영하였다.

11. 마우스 이종이식 접종 및 전임상 치료 시험

모든 실험용 마우스 실험은 중국 과학 아카데미 상하이 생물 과학 연구소(Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences) 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee) (IACUC)의 관련 규정을 엄격히 준수하여 수행하였다. 본 특허와 관련된 동물 실험에는 6-8주령의 면역결핍 마우스 (NOD-SCID 마우스, ICR) (체중 약 25 g)를 사용하였다. 간질 세포 PSC27과 상피 세포 PC3를 1:4의 미리 결정된 비율로 혼합하였고, 각각의 이식편(graft)은 조직 리모델링을 위해 1.25 × 10⁶개의 세포를 함유하였다. 이종이식 종양을 마우스에 피하 이식으로 이식하고, 이식 수술 종료 8주 후 동물을 안락사시켰다. 종양 용적은 하기 수학식에 따라 계산하였다: V = (π/6) x ((l+w)/2)³ (V, 부피; l, 길이; w, 너비).

전임상 치료 시험에서, 피하 이식된 마우스는 2주 후에 화학요법 약물인 미톡산트론 (MIT, 용량: 0.2 mg/kg) 및/또는 프로시아니딘 C1 (PCC1) (500 μl, 용량: 10 mg/kg)을 복강내 투여를 통해 표준 실험식으로 섭식되었다. 시점은 다음과 같았다: 전자는 3주, 5주 및 7주 첫째 날에 투여하고, 후자는 5주 및 7주 첫째 날에 투여하였다. 치료 기간 동안 총 3 사이클의 MIT 투여를 수행하였으며, 각 주기는 2주 동안 지속되었다. 치료 과정 후, 부피 측정 및 조직학적 분석을 위해 마우스 종양을 수확하였다. 각각의 마우스는 누적적으로 0.6 mg/kg 체중의 MIT와 30 mg/kg 체중의 PCC1을 투여받았다. 화학 요법에 의해 유도된 SASP 인자의 전신적 발현을 유발하기 위해, MIT를 마우스에 상기 단계와 순서에 따라 정맥 주사를 통해 투여하되, 용량을 0.1 mg/kg 체중/매회로 감소시켰다 (약물 관련 독성을 감소시키기 위해 전체 치료 과정에서 받은 MIT 누적 용량은 0.3 mg/kg (체중)이었다). 화학요법 실험은 8주 말에 종료되었고, 희생 직후 마우스를 해부하고, 이종이식 종양을 수집하여 병리학적 시스템 분석에 사용하였다.

12. 마우스 수명에 관한 연구

세포 이식 연구를 위해, 우리는 케이지당 4 내지 5마리의 동물을 SPF 동물 플랫폼에서 연속 사육하여 16개월령 수컷 C57BL/6 마우스를 얻었다. 먼저 마우스를 낮은 체중에서 높은 체중으로 분류한 다음에, 체중이 비슷한 마우스를 선택하였다. 다음으로, 무작위 수 생성기(random number generator)를 사용하여 각각의 간격마다 마우스를 노화 (SEN) 또는 대조군 (CTRL) 이식 처리에 할당하고, 한편 중간 마우스는 다른 처리에 할당하여, 노화 및 대조군 이식 마우스의 체중을 일치시켰다. 세포 이식 1개월 후, 마우스가 18개월령이 되었을 때, 신체 기능 검사를 수행하였다. 그 후, 그들의 케이지를 확인하는 것 외에 마우스에 대한 추가 검사는 수행되지 않았다. 가장 빠른 사망은 마지막 신체 기능 검사 후 대략 2개월 후에 발생하였다. 19 내지 21개월령의 C57BL/6 마우스를 케이지당 3 내지 5마리씩 수용하였다. 이식된 마우스와 마찬가지로, 마우스를 체중별로 분류하고 각각의 군에 무작위로 할당하고, 전임상 시험 설계에 대해 알지 못하는 사람이 대조군 (비히클) 또는 약물 (PCC1) 군으로 처리하였다. 24-27개월령부터 마우스를 2주마다 비히클 또는 PCC1로 처리하고, 매회 연속 3일 동안 경구 위관영양법을 실시하였다. 연구 과정 동안, 단일 케이지에서 장기간 하우징(housing)으로 인한 동물 하우징 스트레스를 최소화하기 위해 일부 마우스를 원래 케이지에서 제거하였다. 로타로드(RotaRod) 및 행잉(hanging) 검사는 민감하고 비침습적이었기 때문에 매월 수행되었다. 실험이 끝나면, 마우스를 안락사시켰으며; 다음 증상 중 하나를 보이는 경우 죽은 것으로 간주하였다: (i) 마시거나 먹을 수 없음; (ii) 자극을 받아도 움직이려 하지 않음; (iii) 급속한 체중 감소; (iv) 중증 균형 장애; 또는 (v) 신체 출혈 또는 궤양성 종양(ulcerated tumor). 실험 동안 싸움, 우발적 사망 또는 피부염(dermatitis)으로 인해 제외된 마우스는 없었다. 생물통계학의 경우, 우리는 생존 분석을 위해 콕스(Cox) 비례 위험 모델을 사용하였다.

13. 전임상 동물의 사후 병리학적 검사

연구원들은 케이지를 매일 점검하고 케이지에서 죽은 마우스를 제거하였다. 동물 사망 후, 24시간 이내에 사체 (복강, 흉강, 및 두개골)를 열어 10% 포르말린에 별도로 적어도 7일 동안 보관하였다. 분해되거나 파괴된 신체는 제외되었다. 보존된 사체는 병리학적 검사를 위해 전용 부검 장소로 이송되었다. 종양 부담 (마우스당 상이한 유형의 종양의 합), 질환 부담 (마우스당 주요 장기의 상이한 조직병리학적 변화의 합), 각각의 병변 및 염증 (림프구 침윤)의 중증도를 평가하였다.

14. 생물발광 이미징

마우스에 3 mg의 플루오레세인 (바이오비젼(BioVision), 캘리포니아주 밀피타스)을 PBS에 200 μl의 부피로 전달하여 복강내 주사하였다. 마우스를 이소플루란으로 마취하고 크세노겐(Xenogen) IVIS 200 시스템 (캘리퍼 라이프 사이언시스(Caliper Life Sciences), 메사추세츠주 홉킨턴)을 사용하여, 생물발광 이미지를 획득하였다.

15. 신체 능력 검사

모든 시험은 마지막 위약 또는 약물 치료 후 5일차에 시작되었다. 가속된 로타로드 시스템 (TSE System(TSE 시스템), 미주리주 체스터필드)을 사용하여 최대 보행 속도를 평가하였다. 마우스는 로타로드에서 4, 6 및 8 r.p.m의 속도로 3일 동안 훈련되었으며, 1일차, 2일차 및 3일차에 200초 동안 지속되었다. 시험 당일, 마우스를 로타로드에 올려놓고, 4 r.p.m의 속도로 시작하여 시험을 수행하였다. 회전 속도는 5분 간격으로 4 내지 40 r.p.m으로 가속하였다. 마우스가 로타로드에서 떨어졌을 때, 속도가 기록되었다. 최종 결과는 3번 또는 4번의 시도에서 평균을 내고 기준선 속도로 정규화하였다. 이전 2개월 이내에 훈련된 마우스는 더 이상 훈련되지 않았다.

앞다리 악력(Forelimb grip strength) (N)은 악력 측정기(Grip Strength Meter) (콜럼버스 인스트루먼츠(Columbus Instruments), 오하이오주 콜럼버스)를 사용하여 측정하였으며, 결과는 10회 이상의 시험에서 평균하였다. 매달리기 견디기(hanging endurance) 시험을 위해, 마우스를 2 mm 두께의 금속 와이어 위에 놓고 후자는 매트 위 35 cm에 두었다. 마우스는 앞다리로만 철사를 잡도록 하였고, 매달린 시간은 체중으로 정규화하여 매달린 시간 (초) × 체중 (g)으로 나타냈다. 결과는 마우스당 평균 2 내지 3회 시도하였다. 동물사육관리시스템(Comprehensive Laboratory Animal Monitoring System) (CLAMS)을 통해 24시간 (12시간의 빛과 12시간의 어둠) 동안 그들의 일일 활동 및 음식 섭취를 모니터링하였다. CLAMS 시스템은 옥시맥스(Oxymax) 개방 회로 열량계 시스템(Oxymax Open Circuit Calorimeter System) (Columbus Instruments)이 장착되었다. 러닝머신 성능을 위해, 마우스를 전기 러닝머신(Columbus Instruments)에서 5° 경사로 3일 동안 매일 5분씩 훈련하고, 2분 동안 5 m/min의 속도로 시작하도록 적응시킨 다음에, 2분 동안 7 m/min으로 가속한 다음에, 1분 동안 9m/min으로 가속하였다. 실험 당일 마우스는 러닝 머신에서 5 m/min의 초기 속도로 2분 동안 달린 다음에, 2분마다 2 m/min의 속도로 마우스가 탈진할 때까지 속도를 높였다. 피로(Fatigue)는 가벼운 전기 및 기계적 자극에도 불구하고 쥐가 러닝머신으로 돌아갈 수 없는 것으로 정의되었다. 시험 후 거리를 기록하고, 다음 화학식으로 총 작업 (KJ)을 계산하였다: 질량 (kg) × g (9.8 m/s²) × 거리 (m) × sin (5°).

16. 생물통계학적 방법

본 특허 출원에서는, 세포 증식률, 생존율 및 SA-β-Gal 염색을 포함하는 모든 시험관내 실험과 마우스 이종이식 종양 및 전임상 약물 치료에 대한 생체내 실험을 3회 이상 반복하였고, 데이터는 평균 ± 표준오차의 형태로 제시하였다. 통계 분석은 원시 데이터를 기반으로 설정되었으며 일원 분산 분석 (ANOVA) 또는 양측(two-tailed) 스튜던트 t-테스트(Student's t-test)로 계산되었으며, 한편 P < 0.05의 결과는 유의하게 상이한 것으로 간주되었다.

요인 간의 상관관계는 피어슨(Pearson)의 상관 계수에 의해 시험되었다. 콕스 비례 위험 모델은 마우스가 여러 코호트에서 획득되고 케이지에 그룹화될 때 생존 분석에 사용되었다. 모델에서, 성별과 연령은 고정 효과로 치료에 사용되었으며, 한편 코호트와 초기 케이지 할당은 무작위 효과로 사용되었다. 연구 중에, 단일 케이지 인클로저의 스트레스를 최소화하기 위해, 일부 마우스를 초기 케이지에서 이동했기 때문에, 우리는 또한 케이지 효과 없이 분석을 수행하였다. 두 분석의 결과는 방향성이나 통계적 유의성이 유의하게 다르지 않아 결과에 대한 신뢰도가 높아졌다. 통계 소프트웨어 R (버전 3.4.1; 라이브러리 'coxme')을 사용하여 생존 분석을 수행하였다. 대부분의 실험 및 결과 평가에서 연구자는 과제에 대해 블라인드 선택을 하였다. 우리는 기준선 체중을 사용하여 마우스를 실험 군에 할당하여 (군 간에 유사한 체중을 달성하기 위해), 무작위화는 체중에 대해 일치하는 군 내에서만 수행되었다. 우리는 이전 실험을 기반으로 하여 샘플 크기를 결정하였으므로, 통계적 검정력 분석(power analysis)을 사용하지 않았다. 이 연구의 모든 복제는 상이한 샘플로부터 유래되었으며, 각각의 샘플은 상이한 실험 동물로부터 유해되었다.

실시예 1: PCC1은 저농도에서 사용시 SASP 발현을 효과적으로 억제할 수 있음

노화 세포의 표현형을 강력하게 조정할 수 있는 혁신적인 화합물을 확인하기 위해, 우리는 41가지 식물 유도체의 식물화학 라이브러리를 사용하여 편향되지 않은 스크리닝을 수행하였다. 이들 약물의 효능과 잠재적인 생물학적 가치를 시험하기 위해, 우리는 1차 정상 인간 전립선 간질 세포주인 PSC27을 시험관내 세포 모델로 사용하기로 결정하였다. PSC27은 주로 섬유모세포로 이루어지며, 비섬유모세포 세포주 (내피 세포 및 평활근 세포 포함)도 존재하지만 그 비율은 더 작고; PSC27은 유전독성 화학 요법 또는 이온화 방사선과 같은 스트레스 요인에 노출된 후 전형적인 SASP를 형성하는, 자연의 인간 1차 간질 세포주이다. 예비 실험에서 최적화된 특정 용량의 블레오마이신 (BLEO)으로 이들 세포를 처리하고, 노화 관련 β-갈락토시다제 (SA-β-Gal) 염색의 양성률이 유의하게 증가하고, BrdU 혼입률이 크게 감소했으며, DNA 손상 복구 초점 (DDR 초점)이 약물 손상 후 며칠 내에 크게 증가한 것으로 관찰되었다 (도 1 내지 도 3). 병렬 모드에서 노화 세포의 발현 프로필에 대한 이들 천연 의약품의 효과를 비교하기 위해 체계적인 스크리닝을 수행하였다 (도 4).

우리는 이들 세포에서 RNA-seq를 수행하였다. 그 후, 얻은 높은 처리량 데이터는 식물 원료인 프로시아니딘 C1 (PCC1)이 노화 세포의 발현 프로파일을 유의하게 변경하였음을 나타냈다. 그 중, 4406개의 유전자가 유의하게 하향조절되었고, 한편 2766개의 유전자가 상향조절되었으며, 히트맵에서 각 유전자의 배수 변화도는 2.0 (P < 0.01)이었다 (도 5). 중요하게는, PCC1 처리 후 노화 세포에서 SASP 인자의 발현이 일반적으로 감소되며, 한편 이들 SASP 인자는 일반적으로 노화 세포에서 유의하게 상향조절되었다는 것이다 (도 6). 일부 SASP 관련 유전자의 발현 프로파일이 일반적인 SASP 인자와 유사한 경향을 보였지만, GSEA 분석의 데이터는 SASP 발현 또는 NF-κB 활성화를 특징짓는 분자 시그니처의 상당한 억제를 추가로 밝혔으며, 이는 염증유발성 SASP의 발달을 매개하는 주요 전사 사건이었다 (도 7). 단백질-단백질 상호작용에 기초한 생물정보학 분석의 결과는 세포 노화 동안 유의하게 상향조절되었지만 일단 세포가 PCC1의 작용하에 있게 되면 하향조절되는 여러 요인을 포함하는 고도로 활동적인 네트워크를 밝혔다 (도 8). 추가 GO 생물 정보학 데이터는 이들 분자가 신호 변환, 세포간 소통, 에너지 조절, 세포 대사, 및 염증 반응을 포함하여 일련의 중요한 생물학적 과정에 기능적으로 관여한다는 것을 밝혔다 (도 9). 이러한 하향조절된 유전자의 대부분은 발현 후 세포외 공간으로 방출되거나 소포체 또는 골지체에 위치하며, 일반적으로 이들 분자의 분비 특성에 특징적으로 상응하는 생물학적 단백질이었다 (도 10).

시험관내 조건에서 SASP 발현에 대한 PCC1의 효과를 추가로 확인하기 위해,일련의 시험관내 농도 구배에서 PSC27 세포를 처리하였다. 데이터는 10 μM의 작동 농도에서 PCC1이 가장 높은 효율로 SASP 발달을 억제한다는 것을 나타냈다 (도 11). 그러나, 약물의 농도가 낮거나 높을수록 효과가 덜했지만, 후자는 약물의 세포 독성 증가로 인한 세포 스트레스 반응과 관련이 있을 수 있다 (도 11). 따라서 식물성 천연물인 PCC1은 특히 상대적으로 낮은 농도에서 노화 세포의 염증유발성 표현형, 즉 SASP를 제어하는 데 사용될 수 있다.

실시예 2: 고농도에서 사용되는 경우 신규 세놀리틱 작용제로서의 PCC1

SASP 발현을 조절하는 PCC1의 놀라운 효능을 감안할 때, 우리는 다음으로 더 높은 농도에서 노화 세포를 죽일 수 있는 이 천연 제품의 가능성을 조사하였다. 이를 위해, 우리는 PCC1의 농도를 증가시키면서 시험관내 조건에서 처리된 노화 세포의 생존율을 측정하였다. SA-β-Gal 염색 데이터는 PCC1 농도가 50 μM에 도달할 때까지 노화 세포가 제거되지 않음을 나타냈다 (도 12). 농도가 증가함에 따라 노화 세포에 대한 PCC1의 살상 효과 (80% 염색 양성)가 추가로 증강되었고, PCC1이 150 μM일 때 임계값에 도달하였다 (노화 세포의 20%가 이 시점에서 남아 있음). 농도가 200 μM로 증가했을 때 PCC1의 살상 효과는 더 이상 증강되지 않았다 (도 12; 도 13).

이러한 문제를 자세히 분석하기 위해, 우리는 확인 실험을 수행하였다. 세포 생존율 검정은 PCC1이 상응하는 대조군 증식 세포와 비교하여 50 μM의 농도에서 시작하여 상당한 노화 세포의 사멸을 유도함을 나타냈다 (도 14). PCC1 농도를 200 μM로 증가시키면 생존하는 노화 세포의 비율이 약 10%로 감소하였다. 그러나, 200 μM의 PCC1에서도 증식 세포는 유의하게 감소하지 않았다. 이러한 결과는 노화 세포에 대한 PCC1의 높은 선택성과 탁월한 특이성을 확인해 주었으며, 이러한 특징은 사실상 세계 유일의 항노화 약물로서 세놀리틱스의 기본적인 기술적 요구 사항이었다.

우리는 다음으로 유전독성 치료 후 간질 세포의 집단 배가 (PD) 가능성을 조사하였다. 손상 치료 후 빠르게 성장 정지 상태에 들어간 BLEO 군의 세포와 비교하여, BLEO 및 PCC1 병합 처리 군의 세포는 PD 능력이 유의하게 증가한 것으로 나타났다 (도 15). 그러나, 흥미롭게도 PCC1 자체는 증식하는 세포의 PD에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으며, 데이터는 노화 세포와 정상 세포 사이의 PCC1의 선택성을 추가로 나타냈다.

PCC1이 아폽토시스를 유도하여 노화세포의 생존율을 상실시키는지 알아보기 위해 PCC1을 배양 조건에서 증식군 세포와 노화군 세포에 각각 처리하였다. 이후에 관찰된 카스파제-3/7 활성의 변화는 PCC1이 노화 세포의 아폽토시스를 유발하며; PCC1을 첨가한 후 16시간째부터 노화군과 대조군 사이에 통계적 차이가 있었는 것을 나타냈다 (도 16). 또한, 판-카스파제 억제제 QVD는 PCC1에 의한 노화 세포의 사멸을 방지할 수 있었고, 이 과정에서의 실제 효과는 노화 세포에 대한 ABT263 (현재 알려져 있고 매우 효과적인 노화 세포의 아폽토시스 유도제)의 효과와 매우 유사하였다 (도 17). 상기 일련의 결과는 PCC1이 아폽토시스를 유도하여 노화 세포가 사멸 프로그램에 진입하도록 촉진하지만, 증식하는 세포는 기본적으로 이 천연 약물의 표적이 되거나 영향을 받지 않는다는 것을 확인해주었다.

노화 세포에 대한 PCC1의 명백한 효과를 감안할 때, 우리는 PCC1이 세포 사멸을 유도할 가능성을 분석하였다. 유동 세포측정법 데이터는 노화된 PSC27 세포의 생존율이 유의하게 감소하였으며, 한편 아폽토시스의 비율은 유의하게 증가했지만 증식하는 세포의 변화는 분명하지 않음을 나타냈다 (도 18; 도 19). 따라서 우리 데이터의 일관성은 PCC1이 시험관내에서 세포 사멸을 유도하여 노화 세포의 제거를 유발하고 이 천연 제품이 노화 세포를 표적으로 하는 데 뛰어난 잠재력을 가지고 있음을 뒷받침하였다.

실시예 3: 종양 퇴행을 촉진하고 화학요법 내성을 효과적으로 감소시키기 위해 노화 세포를 치료적으로 표적화하는 PCC1의 사용

시험관내에서 고농도의 노화 세포를 제거하는 PCC1의 뛰어난 선택성을 고려하여, 다음으로 이 약물이 생체내에서 다양한 연령-관련 질환에 개입하는 데 사용될 수 있는지 여부를 고려하였다. 암은 인간의 생명을 심각하게 위협하고 건강을 위협하는 주요 만성질환 중 하나이다. 또한, 암 세포의 약물 내성은 임상에서 대부분의 항암 치료 효과를 제한하고, 노화 세포는 종종 손상된 종양 병소에서 SASP를 발달시켜 주변 암 세포의 치료 약물 내성 발생을 촉진한다. 그럼에도 불구하고 암의 치료 지표를 촉진하기 위해 원발성 종양에서 노화 세포를 제거하는 가능성과 안전성은 현재까지 대부분 연구되지 않았다.

첫째, 우리는 PSC27 간질세포와 PC3 상피세포를 혼합하여 조직 재조합체를 구축하였으며, PC3 상피세포는 전형적인 고도 악성(highly malignant) 전립선암 세포주이다. 비-비만 당뇨병(non-obese diabetic) 및 중증 복합 면역결핍(severe combined immunodeficiency) (NOD/SCID) 마우스의 후방 넓적다리에 재조합체를 피하 이식하기 전에, 간질 세포 대 상피 세포의 비율은 1:4였다. 종양 용적 (부피)은 동물에 재조합 이식 후 8주 말에 측정되었다 (도 20). PC3 암 세포 및 1차 PSC27 간질 세포로 구성된 종양과 비교하여, PC3 세포 및 노화 PSC27 세포로 구성된 이종이식편의 부피가 유의하게 증가하였으며 (P < 0.001), 이 차이는 종양 진행에서 노화 세포의 중요한 촉진 역할을 추가로 확인해 주었다 (도 21).

임상 조건에 보다 근접하게 접근하기 위해, 우리는 유전독성 화학요법 약물 치료 및/또는 노화 약물 개입을 포함하는 전임상 프로토콜을 구체적으로 설계하였다 (도 22). 피하 이식 2주 후, 생체내에서 안정적인 종양 흡수가 관찰되었을 때, 실험 동물에게 8주 요법이 끝날 때까지 3주, 5주, 7주 첫째 날에 MIT (화학요법제인 미토크산트론) 또는 위약을 1회 투여하였다. MIT 투여는 화학요법제로서 MIT의 효능을 확인한 위약-처리된 군에 비해 종양 성장을 유의하게 지연시켰다 (종양 용적의 44.0% 감소, P < 0.0001) (도 23). 특히, PCC1 자체는 종양 수축을 유발하지 않았긴 하지만, PCC1의 투여는 MIT로 처리된 마우스에서 종양 용적을 유의하게 감소시켰다 (MIT와 비교하여 종양 용적 55.9% 감소, P < 0.001; 위약 치료와 비교하여 종양 용적 74.9% 감소, P < 0.0001) (도 23).

우리는 다음으로 이들 동물의 종양 병변에서 세포 노화가 발생했는지 여부를 추론하였다. 시험 결과는 MIT 투여 과정이 종양 조직에서 많은 수의 노화 세포의 출현을 유도했음을 입증했긴 하지만, 이는 놀라운 일이 아니다. 그러나, PCC1 투여는 이들 화학요법 동물의 병변 내에서 대부분의 노화 세포를 실질적으로 고갈시켰다 (도 24; 도 25). 레이저 포획 미세해부 (LCM) 및 후속 정량적 PCR의 결과는 IL6, CXCL8, SPINK1, WNT16B, GM-CSF, MMP3, IL1α를 포함하는 SASP 인자의 유의하게 증가된 발현을 나타냈고, 이러한 경향은 화학요법 동물에서 노화 마커 p16INK4A의 상향조절을 동반하였다 (도 26). 흥미롭게도, 이들 변화는 주로 간질 세포에서 발생했지만 인접한 암세포에서는 발생하지 않았으며, 이는 잔류 암세포의 재증식 가능성을 암시하며, 잔류 암세포는 치료로 손상된 종양 미세 환경(TME)에서 획득된 내성을 발달시켰다. 그러나, 이러한 변화는 전사 수준 데이터의 분석에 의해 입증된 바와 같이 PCC1이 투여되었을 때 대체로 역전되었다 (도 27).

MIT 투여 마우스에서 SASP의 발현 및 역전과 함께 이러한 노화 관련 패턴을 직접적으로 뒷받침하는 메커니즘을 조사하기 위해, 첫 PCC1 투여 후 7일차에 두 약물 모두를 처리한 동물의 종양을 해부했으며, 주로 이 시점에서 병변의 암세포에서 약물 내성 클론이 형성되지 않았기 때문에 투여 후 7일 시점을 선택하였다. MIT 투여는 위약과 비교하여 DNA 손상 정도와 세포 사멸 모두에서 상당한 증가를 가져왔다. PCC1 단독으로는 DNA 손상을 유도하거나 아폽토시스를 유발할 수 없지만, 화학요법 약물 MIT는 이들 두 지표를 고도로 상향조절할 수 있다 (도 28). 그러나, MIT 처리된 동물에 PCC1을 투여했을 때, DNA 손상 또는 아폽토시스 지표가 크게 향상되었으며, 이는 이러한 노화 약물 처리된 동물의 종양 부위에서 향상된 세포독성을 암시한다. 이를 뒷받침하는 증거로서, PCC1이 처리 동안 적용되었을 때, 카스파제 3 절단 활성이 증가하였고, 이는 전형적인 아폽토시스의 특징이었다 (도 29).

우리는 다음으로 종양 진행의 결과를 평가하기 위해 주로 시간 연장 방식으로 다른 약물 치료 군에서 동물의 생존을 비교하였다. 이 전임상 코호트에서 동물은 전립선 종양 성장에 대해 모니터링되었고, 특정 조건에서 종양 및 기타 질환의 진행을 평가하는 데 사용되는 방법인 마우스의 엔도솜 종양 부담이 두드러지면 (크기 ≥ 2000 mm³), 중중 질환이 발생한 것으로 판단되었다. MIT/PCC1 조합으로 처리한 마우스는 가장 긴 중간 생존율을 나타내어 MIT 단독으로 처리한 군과 비교하여 생존을 적어도 48.1% 연장하였다 (도 30, 녹색 대 청색). 그러나, 종양이 있는 마우스를 PCC1만으로 치료하는 것은 생존율을 약간만 연장했을 뿐 유의미한 이점을 가져오지 못하였다.

현저하게도, 이 연구에서 투여된 치료는 실험용 마우스가 잘 견디는 것으로 나타났다. 우레아, 크레아티닌, 알칼리 포스파타제, 글루탐산-피루브산 트랜스아미나제, 또는 체중의 유의한 변동은 관찰되지 않았다 (도 31; 도 32). 더 중요하게는, 이 연구를 위해 설계된 각 약물 용량에서 사용된 화학요법 및 항노화 약물은 면역적격 야생형 마우스에서도 면역계의 온전성(integrity) 및 핵심 기관의 조직 항상성을 크게 방해하지 않았다 (도 33; 도 34). 이들 결과는 항노화제와 기존의 화학요법제의 조합이 중증 전신 독성을 유발하지 않으면서 일반적인 의미에서 종양 반응을 향상시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있음을 일관되게 나타낸다.

PCC1이 화학 요법의 효과를 개선하는 데 약물 의존성인지 또는 특이적인지 확인하기 위해, 우리는 전임상 시험을 위해 각각 PCC1과 결합하기 위해 독소루비신 (DOX), 도세탁셀 (DOC) 및 빈크리스틴 (VIN)을 사용하기로 선택하였다. 결과는 이러한 화학요법 약물 중 DOX와 PCC1의 조합만이 MIT와 PCC1의 조합 치료에 의해 야기된 유의한 효과를 대략적으로 반복할 수 있음을 나타냈다 (도 35). 그러나, DOC와 VIN이 단독으로 사용되었을 때 종양 용적을 감소시킬 수 있었지만, DOC와 VIN 중 어느 하나를 PCC1과 함께 투여했을 때 더 이상의 종양 수축이 이루어지지 않아 더 이상의 이점을 실현할 수 없었다 (도 36, 도 37). MIT와 DOX는 모두 유전독성 약물로, 전형적인 DNA 이중가닥 파손을 일으켜 세포 노화를 일으킬 수 있다. VIN의 작용 메커니즘은 미세소관에 부착하여 유사분열 과정을 억제하는 것이다. 따라서 생체내 조건에서 화학요법의 치료 효과를 향상시키는 PCC1의 특성은 신체가 노화 세포를 생성하도록 유도하는 약물과 조합하여 약물 유형 의존성을 나타낼 수 있다.

실시예 4: PCC1 처리에 의한 노화 세포의 청소는 노년기(late-life stage)에서 이환률(morbidity)을 증가시키지 않으면서 노화된 마우스에서 노년기 생존을 연장함

PCC1은 노화 세포를 제거하고 종양 약물 내성을 감소시키며 종양 마우스의 미세 환경에서 전반적인 치료 효과를 개선하는 놀라운 효능을 가지고 있기 때문에, 자연 노화 동물의 건강을 증강하거나 질병을 지연시키는 데 상당한 이점이 있는가? 이 질문에 답하기 위해, 우리는 WT 마우스의 남은 수명을 연장할지 여부에 관계없이 아주 오래된 시점에서 간헐적으로 처리하는 노화 세포를 제거하기 위해 잠재적인 번역 접근법을 사용할 수 있는지를 먼저 고려하였다? 이와 관련하여, 일련의 생체내 실험이 그에 따라 수행되었다. 24-27개월령 (인간의 경우 75-90세)에 투여한 PCC1군에서 2주마다 약물을 복용하는 요법에서 치료 후 평균 생존 기간이 비히클군보다 64.2% 더 길었고 사망 위험이 더 낮았다 (HR = 0.35, PCC1군/비히클군; P < 0.0001) (도 38, 도 39). 이 발견은 노화 세포의 PCC1 매개 제거가 노화된 마우스의 사망 위험을 줄이고 이의 생존을 효과적으로 연장할 수 있음을 시사한다.

이 치료 요법이 후기 이환율 증가를 희생시키면서 노화된 마우스의 사망률을 감소시켰는지 여부를 추가로 시험하기 위해, 우리는 이들 마우스의 신체 기능을 평가하였다. PCC1 군 마우스의 남은 수명은 더 길었긴 하지만, 격주로 PCC1로 처리된 마우스는 수컷 및 암컷 둘 다에서 비히클 처리된 군 마우스와 비교하여 생후 마지막 2개월 동안 신체 기능의 현저한 감소를 나타내지 않았다 (도 40, 도 41). 또한, 마우스 부검에서 여러 연령 관련 질환의 유병률 및 종양 부담은 두 군 간에 통계적 차이를 나타내지 않았다 (도 42, 도 43). 따라서, 생물학적 활성 항노화 약물인 PCC1의 간헐적 공급은, 미세환경에서 노화 세포를 청소하여 노화 신체의 질환 부담을 크게 감소시킬 수 있으며, 치료 후 단계에서 신체의 수명을 늘릴 수 있다. 즉, PCC1 투여 대상자는 질병 발병률에 큰 변화가 없었다. 신체에 특정 노화-연관 질환 (예를 들어, 종양)이 나타나면 PCC1은 종양 치료의 효율성을 크게 향상시키거나 종양 퇴행을 가속화할 수 있다. 이 치료 방법은 신체의 이환율을 크게 증가시키지 않았으며 실제로는 삶의 노년기에서 안전하게 사용할 수 있다.

SequenceListing <110> By Health Co Ltd <120> Anti-senescence plant polyphenol drug downregulating senescence-related secretory phenotype and use thereof <130> IEC232051PKR <150> 202110156372.3 <151> 2021-02-04 <160> 28 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL6-F <400> 1 ttctgcgcag ctttaaggag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL6-R <400> 2 aggtgcccat gctacatttg 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCL8-F <400> 3 atgacttcca agctggccgt g 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCL8-R <400> 4 tgtgttggcg cagtgtggtc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPINK1-F <400> 5 ccttggccct gttgagtcta 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPINK1-R <400> 6 gcccagattt ttgaatgagg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WNT16B-F <400> 7 gctcctgtgc tgtgaaaaca 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WNT16B-R <400> 8 tgcattctct gccttgtgtc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GM-CSF-F <400> 9 atgtgaatgc catccaggag 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GM-CSF-R <400> 10 agggcagtgc tgcttgtagt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP3-F <400> 11 agggaacttg agcgtgaatc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP3-R <400> 12 tcacttgtct gttgcacacg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1 alpha-F <400> 13 aatgacgccc tcaatcaaag 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1 alpha-R <400> 14 tgggtatctc aggcatctcc 20 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p16INK4a-F <400> 15 cttcctggac acgctggt 18 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p16INK4a-R <400> 16 atctatgcgg gcatggttac 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1 beta-F <400> 17 tgggtatctc aggcatctcc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1 beta-R <400> 18 ttctgcttga gaggtgctga 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AREG-F <400> 19 agctgccttt atgtctgctg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AREG-R <400> 20 tttcgttcct cagcttctcc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCL1-F <400> 21 caccccaaga acatccaaag 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCL1-R <400> 22 taactatggg ggatgcagga 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCL3-F <400> 23 ggagcaccaa ctgacaggag 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCL3-R <400> 24 cctttccagc tgtccctaga 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p21CIP1-F <400> 25 atgaaattca ccccctttcc 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p21CIP1-R <400> 26 ccctaggctg tgctcacttc 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP6-F <400> 27 aagaaggctg gctggaattt 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP6-R <400> 28 gaagggctgc ttgtcgtaag 20

Claims

(a) 프로시아니딘 또는 이의 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 전구약물(prodrug), 및 (b) 대상체(subject)가 노화 세포(senescent cell)를 생성하도록 유도할 수 있는 작용제(agent), 및 임의의 제약상 허용되는 보조 물질을 포함하는 제약 조성물로서,
바람직하게는, 프로시아니딘이 올리고머성 프로시아니딘(oligomeric procyanidin)인, 제약 조성물.
제1항에 있어서,
프로시아니딘 또는 이의 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 전구약물이 제약 조성물에서 적어도 1 μM의 최종 농도를 갖고/갖거나,
프로시아니딘이 프로시아니딘 C1이고/이거나,
작용제가 DNA 손상 및/또는 아폽토시스(apoptosis)를 유발할 수 있는 작용제를 포함하는, 제약 조성물.
노화-연관 분리 표현형(senescence-associated secretory phenotype) (SASP)의 하향조절, SASP 인자의 발현 또는 활성의 감소, 세포 노화 마커 인자(cell senescence marker factor)의 발현 또는 활성의 감소, 비증식 세포(non-proliferating cell)의 아폽토시스의 유도, 비증식 세포의 감소 또는 제거, 노화의 지연, 대상체의 수명의 연장, 대상체의 연령-관련 질환 부담(age-related disease burde)의 감소, 비증식성 세포의 감소 또는 제거로부터 이익을 얻는 질환의 예방, 경감 및 치료, 암 요법(cancer therapy)에 대한 내성(resistance)의 감소, 세포 노화를 유도할 수 있는 작용제의 효능의 증강, 종양 퇴행(tumor regression)의 촉진, 종양 용적(tumor volume)의 감소, 암의 예방 또는 치료, 또는 암 생존의 연장을 위해 사용되는 의약(medicament) 또는 제제(preparation)의 제조에서 프로시아니딘 또는 이의 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 전구약물의 용도.
제3항에 있어서,
프로시아니딘이 프로시아니딘 C1이고/이거나,
SASP 인자가 세포외 기질 단백질(extracellular matrix protein), 염증성 시토카인 및 암세포 성장 인자를 포함하고/하거나,
비증식 세포가 노화 세포, 바람직하게는 자연 노화 세포 또는 손상된 세포이고/이거나,
비증식성 세포의 감소 또는 제거로부터 이익을 얻는 질환이 노화-관련 질환, 바람직하게는 암, 심혈관 및 뇌혈관 질환(cardiovascular and cerebrovascular disease), 골다공증(osteoporosis), 연령-관련 퇴행성 관절 질환(age-related degenerative joint disease), 대사 질환(metabolic disease), 신경퇴행성 질환(neurodegenerative disease)이고/이거나,
세포 노화를 유도할 수 있는 작용제가 DNA 손상 및/또는 아폽토시스를 유발할 수 있는 작용제를 포함하고/하거나,
대상체가 노인 대상체이고/이거나,
암 요법이 화학요법 또는 방사선 요법을 포함하는, 용도.
제3항 또는 제4항에 있어서, 종양이 전립선 종양(prostate tumor)이고/이거나 암이 전립선암인, 용도.
의약 또는 제제의 제조에서 물질의 용도로서, 여기서 물질이 (a) 프로시아니딘 또는 이의 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 전구약물, 및 (b) 대상체가 노화 세포를 생성하도록 유도할 수 있는 작용제를 포함하며, 의약 또는 제제가 종양 퇴행의 촉진, 종양 용적의 감소, 암의 예방 또는 치료, 또는 암 생존의 연장을 위해 사용되며,
바람직하게는, 프로시아니딘이 올리고머성 프로시아니딘, 보다 바람직하게는 프로시아니딘 C1이고,
바람직하게는, 대상체가 노화 세포를 생성하도록 유도할 수 있는 작용제가 DNA 손상 및/또는 세포 아폽토시스를 유발할 수 있는 작용제를 포함하는, 용도.
제6항에 있어서, 종양이 전립선 종양이고/이거나 암이 전립선암인, 용도.
제1항 또는 제2항에 따른 제약 조성물을 포함하는 의약 상자(medicine box) 또는 키트(kit)로서,
바람직하게는, 의약 상자 또는 키트가 용기 1 및 용기 2를 포함하며, 이 용기 각각은 (a) 프로시아니딘 또는 이의 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 전구약물 및 임의적 제약상 허용되는 보조 물질, 및 (b) 대상체가 노화 세포를 생성하도록 유도할 수 있는 작용제 및 임의적 제약상 허용되는 보조 물질을 함유하며,
바람직하게는, 프로시아니딘이 올리고머성 프로시아니딘, 보다 바람직하게는 프로시아니딘 C1인, 의약 상자 또는 키트.
비증식성 세포를 프로시아니딘 또는 이의 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 전구약물로 처리하는 단계를 포함하는, 비증식성 세포에서 변화를 유발하기 위한 방법으로서, 변화가 노화-연관 분리 표현형 (SASP)의 하향조절, SASP 인자의 발현 또는 활성의 감소, 세포 노화 마커 인자의 발현 또는 활성의 감소, 비증식 세포의 아폽토시스의 유도, 비증식 세포의 감소 또는 제거, 또는 암 치료적 치료에 대한 세포의 내성의 감소로부터 선택된 하나 이상을 포함하며,
바람직하게는,
프로시아니딘이 올리고머성 프로시아니딘, 보다 바람직하게는 프로시아니딘 C1이고/이거나,
프로시아니딘 또는 이의 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 전구약물이 적어도 1 μM의 최종 농도를 갖는, 방법.
(a) 프로시아니딘 또는 이의 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 전구약물, 및 (b) 세포 노화를 유도할 수 있는 작용제를 사용하여 세포를 처리하는 단계를 포함하는, 세포 노화를 유도할 수 있는 작용제의 세포독성을 증강시키기 위한 방법으로서,
바람직하게는,
프로시아니딘이 올리고머성 프로시아니딘, 보다 바람직하게는 프로시아니딘 C1이고/이거나,
세포 노화를 유도할 수 있는 작용제가 DNA 손상 및/또는 아폽토시스를 유발할 수 있고/있거나,
프로시아니딘 또는 이의 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 전구약물이 적어도 10 μM의 최종 농도를 갖는, 방법.