CN117205198B - 丹参酚酸c(sac)作为新型抗衰老药物原料在细胞衰老、肿瘤治疗与延长寿命中的应用 - Google Patents

丹参酚酸c(sac)作为新型抗衰老药物原料在细胞衰老、肿瘤治疗与延长寿命中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了丹参酚酸C作为新型抗衰老药物原料在细胞衰老、肿瘤治疗与延长寿命中的应用。本发明发现了丹参酚酸C(SAC)能够特异性靶向衰老细胞，具有抑制衰老相关分泌表型(SASP)的表达、清除衰老细胞、恢复衰老细胞增殖活力的效果。并且，其可在基因毒化疗药物治疗后的肿瘤微环中清除衰老的基质细胞、逆转其SASP表达趋势，从而降低肿瘤对化疗药物的耐药性，显著促进化疗药物的实际抗肿瘤效果。同时，SAC还能显著延长实验动物在晚年阶段的生存期。

Description

丹参酚酸C(SAC)作为新型抗衰老药物原料在细胞衰老、肿瘤 治疗与延长寿命中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域。具体地说，本发明涉及丹参酚酸C(SAC)作为新型抗衰老药物原料在细胞衰老、肿瘤治疗与延长寿命中的应用。
背景技术
细胞衰老是指真核细胞一种相对稳定且通常不可逆的细胞周期停滞的状态，在这种状态下增殖细胞会对促生长刺激产生耐受，通常由DNA损伤等胁迫性信号所引起。复制性衰老是指正常细胞在大约30-50次分裂(即“Hayflick 极限”)后会停止连续分裂。复制性衰老本质上由端粒渐进缩短所诱导。在每一轮的DNA复制中，端粒都会逐渐缩短，最终达到一个临界长度，阻止进一步复制，从而停止细胞分裂。较短的无帽端粒会引起DNA损伤应答，从而直接触发衰老。
现在普遍认为，除了具有干细胞样特性的细胞类型外，只有转化的恶性细胞会无限复制，而非转化细胞则不会。衰老细胞与静息细胞和终末分化细胞均不同，其中静息细胞能够重新进入细胞周期。衰老细胞的特征是形态学异常、代谢活性变化、染色质重构、基因表达改变、脂褐素增加、颗粒性明显、空泡化严重以及出现一种称为衰老相关分泌表型(SASP)的促炎症表型。由于核纤层lamin B1表达丧失，可观察到核膜完整性破坏。衰老细胞积累功能失调的线粒体，并表现出活性氧种属(ROS)水平升高。还可观察到溶酶体内含物增加和溶酶体活性改变，表现为pH为6.0时β-半乳糖苷酶染色阳性率上升，使其成为广被采用的细胞衰老标志物。衰老的生物学作用比较复杂，衰老细胞的保护作用和有害作用均已有描述，主要取决于病理生理学环境。例如，尽管衰老可能作为避免受损细胞恶性转化的机制进化而来，但衰老的发生可能会导致许多年龄相关病变，包括癌症、心脑血管疾病、骨质疏松、关节炎、代谢性疾病、神经退行性症状等一系列临床问题。
细胞衰老表现为核膜内折，染色质固缩，细胞体积增大，激活下游包括p53、p16INK4A/Rb、PI3K/Akt、FoxO转录因子和线粒体SIRT1等在内的多条信号通路。除了进入永久性增殖停滞，衰老细胞常关系到许多病理学特征，包括局部炎症。细胞衰老发生于受损细胞，并防止其在生物体内增殖。在各种外界刺激和内部因素影响下，细胞损伤可以导致明显的细胞衰老迹象。当损伤累积达到一定的限度，组织中呈现各种肉眼可辨的组织退行变化和生理上的衰老表型。
尤其值得注意的是，衰老细胞中炎症性细胞因子的表达水平显著升高，这一现象被称为衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype, SASP)。SASP这一概念是由Coppe等人于2008年首次提出。他们发现衰老细胞能通过分泌胞外基质蛋白、炎症相关因子及癌细胞生长因子促进邻近癌前细胞发生癌变或恶性程度上升，并称这些蛋白为SASP因子。
衰老细胞主要通过3个途径参与机体的各种生理和病理过程：(1)衰老细胞基因表达和形态改变逐步累积可影响相应组织的功能；(2)衰老细胞限制干细胞和未分化祖细胞的再生潜能，导致细胞再生能力下降；(3)衰老细胞不仅表现为生长周期停滞，还通过自分泌和旁分泌途径释放大量的细胞因子、趋化因子、生长因子和蛋白酶等，影响邻近细胞和组织的微环境，导致和加速衰老及相关疾病，近年大量研究表明在这一过程中SASP起到核心的病理作用。此外，衰老细胞分泌的这些因子还会影响周围的正常细胞，而抑制SASP则能够延缓机体衰老。典型的SASP因子包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)、白细胞介素1a(IL-1a)、基质金属蛋白酶(MMP)、粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和纤溶酶原激活物抑制因子-1(PAI1)等，这些因子促进免疫系统激活，导致组织微环境中衰老细胞等异常因素被机体清除，发挥肿瘤抑制功能。然而，十分矛盾的是，SASP尚可通过特定分泌因子(如 VEGF,ANGPTL4)促进血管生成、细胞外基质重塑或上皮-间质转化(EMT)的因子来促进肿瘤发展。此外，衰老诱导的慢性炎症可引起系统性免疫抑制，这种慢性炎症还可促进衰老相关的组织损伤和变性、器官功能失调和癌症等多种衰老相关疾病的发生和发展。
DNA损伤、端粒功能障碍、癌基因激活、氧化应激等刺激均可诱导细胞出现SASP，其机制与转录级联、自分泌环路和持续DNA损伤反应密切相关。但是，过表达或者抑制衰老经典通路p53和p16INK4A/Rb不能影响SASP的表达，表明尽管衰老细胞的周期停滞和SASP经常协同发生，两者的调控通路并不完全重叠。据报道，DNA损伤反应通过激活毛细血管扩张共济失调突变基因、奈梅亨断裂综合征蛋白1和检测点激酶2增加SASP因子IL-6和IL-8的分泌。 DNA损伤反应(DDR)在细胞受损后立即被激活，衰老细胞出现成熟SASP则需要约1周甚至更长的时间，并且短暂的DNA损伤反应并不能诱导细胞衰老，也不能诱导SASP，表明除了DNA损伤反应外还存在其它机制共同诱导SASP。
表观遗传学近年在SASP研究领域取得不少进展。Sirtuins是一种代谢相关、 NADH依赖的去乙酰化酶，在不同模型中已发现SIRT1有寿命延长的效应。衰老细胞中SIRT1通过脱乙酰化IL-6和IL-8启动子区组蛋白H3K9和H4K16实现对SASP因子的表达抑制，当敲除SIRT1后，细胞衰老期间这些区域乙酰化水平高于对照组细胞。microRNAs是一类高度保守的单链非编码RNA，长度大约为20～26个核苷酸，在真核细胞中调节基因的表达。研究结果表明，miR-146、 miR-34、miR-21和miR-183等可以调节衰老细胞SASP，并能够有效地抑制炎性细胞因子的过度生成。miR-146a/b可以降低人脐静脉内皮细胞中IL-1受体相关激酶的产生；相反抑制miR-146a/b可以提高IL-1受体相关激酶的活性，激活转录因子NF-κB，诱导IL-6和IL-8产生。
表观遗传改变通过影响DNA损伤修复、端粒长度和代谢途径或激活衰老相关基因和miRNAs的表达而影响衰老。多种证据表明染色质状态的改变与细胞衰老的控制密切相关。细胞可以感觉到不同的衰老刺激，这些刺激会激活信号通路，驱动染色质状态的改变。然而，衰老信号引起这种改变的途径仍然很大程度上是未知的。因此，从表观遗传角度揭示细胞衰老及其特定表型发生发展的调控机制，从进而揭示具有靶向价值的关键分子及其信号通路，是将来衰老生物学和老年医学的一个新兴方向，亟需深入开展相关探索，为临床医学提供重要科学依据和潜在的干预措施。
随着全球人口老龄化的日益加剧，人们对“主动健康、延缓衰老”的兴趣与日俱增，主要是基于一系列靶向衰老的基本机制可以延缓多种衰老相关慢性或非传染性疾病的发生或加剧的科学证据。因此，细胞衰老作为预防或治疗多种衰老相关疾病和提高健康寿命的潜在靶点已获得诸多关注。
延缓衰老的药物主要是通过短暂性阻断生存途径(衰老细胞抗凋亡途径 SCAPs)选择性清除衰老细胞，该生存途径可保护衰老细胞免受环境中凋亡诱导信号的调控。临床前研究表明有一类药物，即senolytics有望将来应用于延缓、预防或治疗多种衰老相关的疾病。
尽管越来越多的实验支持靶向细胞衰老可以同时治疗多种衰老相关疾病，但还有待严谨的人体临床试验以帮助人们更好地评估延缓衰老药物的益处和风险。尽管国际已知的多种SASP抑制剂均可显著减弱SASP，但本质上不会杀死衰老细胞。为了在药理学上减轻衰老细胞的负担，科学家们正在开发“senolytics”(衰老细胞清除药物)这种性质的小分子、多肽和抗体来选择性地清除衰老细胞。研究者们自2015年发现senolytic药物以来，在鉴别其他小分子senolytic药物及其作用方面取得了相当大的进展。研究发现首个senolytic 药物的文章是基于衰老细胞抵抗凋亡的假说，尽管衰老细胞会产生促凋亡SASP因子来触发自身死亡。
事实上，有研究表明在衰老细胞中促凋亡途径确实上调。因此，衰老细胞依赖于衰老相关的抗凋亡途径(SCAPs)来减轻SASP对自身的伤害，这一假说得到了验证。SCAPs是通过生物信息学方法(基于辐射诱导衰老的人前脂肪细胞的表达谱)来鉴定的。有研究通过体外RNA干扰实验发现衰老细胞对 SCAPs具有依赖性，并将SCAPs确认为衰老细胞的致命弱点。这一研究发现最终促成了SCAP网络中潜在的senolytic靶点的发现以及第一种senolytic药物的发现，其中senolytic药物包括达沙替尼(dasatinib)(一种FDA批准的酪氨酸激酶抑制剂)和槲皮素(quercetin)(一种存在于许多水果和蔬菜中的黄烷醇)的组合(D+Q)。此外，有研究将BCL-2家族中一种对抗凋亡的蛋白 (BCL-XL)鉴定为SASP组分。在这一发现之后，第三种senolytic药物navitoclax 也被鉴定出来，它是一种BCL-2家族抑制剂。研究人员目前已经鉴定出越来越多的senolytics，包括其它合成的小分子、从天然产物中提取的化合物以及靶向已知SCAPs肽的抑制剂。此外，SCAPs也作为潜在的senolytic靶点备受瞩目。
衰老细胞存活所需的SCAP在细胞类型之间有所不同。例如，衰老的人类原代脂肪祖细胞存活所需的SCAPs与衰老的人类胚胎静脉内皮细胞(HUVECs) 中的SCAPs不同。这种差异意味着靶向单个SCAP的药物可能无法消除多种衰老细胞类型。而且大量研究表明大多数senolytics确实仅对有限的衰老细胞类型有效。例如，navitoclax能够靶向HUVECs，但对衰老的人类脂肪祖细胞无效。有证据表明，即使在一种特定类型的细胞内，senolytics的功效也可能不同。例如，在人肺成纤维细胞中，navitoclax能靶向并杀死适应培养的IMR-90肺成纤维细胞样细胞株中的衰老细胞，但对衰老的原代人肺成纤维细胞少有成效。因此，为确定senolytics的广谱作用，仍需要进行针对一系列细胞类型的广泛测试。
在特定条件下，senolytic药物的使用频率可能取决于衰老细胞的积累速度，而衰老细胞的积累速度可能会因细胞衰老发生的环境而异。例如，反复接触破坏DNA的癌症疗法或持续的高脂肪饮食，可能会比自然衰老更迅速地导致衰老细胞的重新累积。间歇性使用senolytics可以降低患者产生不良反应的风险，并允许在健康期间使用senolytics。此外，间歇给药还可以减少senolytics产生的副作用并降低患者产生耐药性的可能性。与抗癌药物或抗生素的情况相反，因为衰老细胞不发生分裂，因此机体无法依赖细胞增殖产生senolytics抗性，从而无法获得有利的突变，这为将来临床中广泛使用senolytics创造了良好的基础。
发明内容
本发明的目的就是提供丹参酚酸C(SAC)作为新型抗衰老药物原料在细胞衰老、肿瘤治疗与延长寿命中的应用。
本发明提供了一种在细胞衰老、肿瘤治疗与延长寿命中均发挥重要作用的新型抗衰老药物原料。
在本发明的第一方面，提供了丹参酚酸C的用途，用于制备制剂或药物组合物，所述制剂或药物组合物用于：
A)抑制衰老相关分泌表型(SASP)表达；
B)抗衰老或清除衰老细胞；
C)降低肿瘤对化疗药物的耐药性；和/或
D)延长寿命或晚年生存期。
在另一优选例中，所述衰老相关分泌表型为DNA损伤导致的衰老相关分泌表型；优选地为化疗药物或电离辐射造成的DNA损伤。
在另一优选例中，所述的用于抑制SASP表达的制剂或药物组合物中丹参酚酸C浓度为10-200μM，优选为20-100μM，更优选为40-60μM(例如40、45、 50、55或60μM)。
在另一优选例中，所述的抗衰老包括诱导衰老细胞恢复生长和/或增殖能力。
在另一优选例中，所述的清除衰老细胞包括诱导衰老细胞进入死亡程序。
在另一优选例中，所述的用于清除衰老细胞的制剂或药物组合物中丹参酚酸C浓度为＞100μM，优选为200-3000μM，更优选为200-2000μM(例如200、 300、400、500、600、7000、800、9000、1000、1100、1200、1300、1400、 1500、1600、1700、1800、1900、或2000μM)。
在另一优选例中，所述丹参酚酸C通过诱导肿瘤微环境中衰老细胞进入死亡程序降低肿瘤对化疗药物的耐药，优选通过caspase-3/7介导诱导肿瘤微环境中衰老细胞进入死亡程序。
在另一优选例中，所述的化疗药物为基因毒药物。
在另一优选例中，所述的化疗药物选自下组：米托蒽醌、博来霉素、阿霉素、或其组合。
在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：前列腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、肾脏肿瘤、小肠癌、骨癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、脑癌、子宫内膜癌、睾丸癌、甲状腺癌、或其组合。
在另一优选例中，所述的丹参酚酸C不影响或基本不影响增殖态细胞。
在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物或药物组合，包括治疗有效量的：
C1)作为第一活性成分的丹参酚酸C、或其药学上可接受的盐；
C2)作为第二活性成分的化疗药物，
其中，所述化疗药物能够诱发肿瘤微环境中衰老细胞出现。
在另一优选例中，所述的化疗药物能够诱导肿瘤微环境中SASP表达；或能够诱导衰老标记p16INK4A上调。
在另一优选例中，所述的化疗药物选自下组：米托蒽醌、博来霉素、阿霉素、或其组合。
在另一优选例中，所述化疗药物为米托蒽醌，并且米托蒽醌与丹参酚酸C 的重量比为1:10-100；优选为1:25-75；更优选为1:40-60(例如1:45、1:50或 1:55，更优选为1:50)。
在另一优选例中，所述化疗药物为博来霉素，并且博来霉素的浓度为1-100 μg/ml；优选为20-70μg/ml；更优选为40-60μg/ml(例如45、50或55μg/ml，更优选为50μg/ml)。
在另一优选例中，所述化疗药物为阿霉素，并且阿霉素与丹参酚酸C的重量比为1:20-200；优选为1:50-150；更优选为1:80-120。
在另一优选例中，所述的药物组合物中丹参酚酸C浓度为10-200μM，优选为20-100μM，更优选为40-60μM(例如40、45、50、55或60μM)，其中丹参酚酸C用于抑制SASP表达。
在另一优选例中，所述的药物组合物中丹参酚酸C浓度为＞100μM，优选为200-3000μM，更优选为200-2000μM(例如200、300、400、500、600、7000、 800、9000、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、或2000μM)，其中丹参酚酸C用于诱导衰老细胞进入死亡程序。
在本发明的第三方面，提供了一种筛选能够与丹参酚酸C协同抗肿瘤的物质的方法，包括步骤：
(S1)提供一肿瘤组织，使用候选物质处理所述肿瘤组织；
(S2)检测经处理的肿瘤组织中细胞衰老情况，从而筛选能够与丹参酚酸 C协同抗肿瘤的物质。
在另一优选例中，所述的抗肿瘤包括：促进肿瘤消退，优选地包括清除肿瘤微环境中衰老细胞。
在另一优选例中，所述的检测细胞衰老情况包括：
(i)检测衰老细胞数量；
(ii)检测SASP因子表达；
(iii)检测衰老标记p16INK4A。
在另一优选例中，如检测到候选物质处理能够提高(如提高10％、20％、 30％、40％、50％以上或更高)肿瘤组织中衰老细胞数量、SASP因子表达、和/ 或衰老标记p16INK4A，则认为该物质是能够与丹参酚酸C协同抗肿瘤的物质。
在另一优选例中，所述的SASP因子包括IL6、CXCL8、SPINK1、WNT16B、 GM-CSF、MMP3、IL1Α，但不限于此。
在另一优选例中，所述的肿瘤组织含有肿瘤细胞和基质细胞。
在另一优选例中，所述的检测细胞衰老情况为检测基质细胞衰老情况。
在另一优选例中，所述的方法为体内筛选或体外筛选。
在另一优选例中，所述的抗肿瘤效果包括：肿瘤细胞杀伤率、肿瘤组织体积缩小率、荷瘤动物生存率，但不限于此。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：设置一对照组，所述对照组可以为无处理对照组。
在另一优选例中，所述的物质包括小分子化合物、生物大分子，但不限于此。
在另一优选例中，所述的候选物质为化疗药物。
在另一优选例中，所述的方法为非诊断非治疗方法。
在本发明的第四方面，提供了一种体外非治疗性地抑制细胞SASP表达、清除衰老细胞、和/或降低肿瘤细胞对化疗药物耐药性的方法，包括步骤：
将丹参酚酸C与所述的细胞接触，从而抑制其SASP表达、清除所述衰老细胞、和/或降低所述肿瘤细胞对化疗药物耐药性。
在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：前列腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、肾脏肿瘤、小肠癌、骨癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、脑癌、子宫内膜癌、睾丸癌、甲状腺癌、或其组合。
在本发明的第五方面，提供了一种在有需要的受试者中抑制SASP表达、抗衰老或清除衰老细胞、降低肿瘤对化疗药物的耐药性、或延长寿命或晚年生存期的方法，包括步骤：
给有需要的受试者施用丹参酚酸C，从而抑制SASP表达、抗衰老或清除衰老细胞、降低肿瘤对化疗药物的耐药性、或延长寿命或晚年生存期。
在本发明的第六方面，提供了一种在有需要的受试者中治疗肿瘤的方法，包括步骤：
给有需要的受试者施用治疗有效量的：化疗药物、以及丹参酚酸C。
在另一优选例中，所述的化疗药物为基因毒药物，优选地所述化疗药物能够提高肿瘤微环境中SASP表达。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1显示了增殖态人源基质细胞PSC27(早期代数如p10-20)在体外经过化疗药物博来霉素(BLEO)以50μg/ml浓度处理之后第7-10天，通过 SA-β-Gal染色之后的结果。上图，代表性图片，下图，统计学数据。CTRL，对照细胞；BLEO，博来霉素处理后细胞。***，P<0.001。
图2显示了PSC27细胞经过化疗药物博来霉素(BLEO)处理之后，经过 BrdU染色之后的结果。上图，代表性图片，下图，统计学数据。CTRL，对照细胞；BLEO，博来霉素处理后的细胞。****，P<0.0001。
图3显示了PSC27细胞经过化疗药物博来霉素(BLEO)处理之后，使用γH2AX经过免疫荧光染色(immunofluorescence staining)之后的结果。CTRL，对照细胞；BLEO，博来霉素处理后的细胞。***，P<0.001。根据细胞核内荧光点的数量，将其分为4类，包括0foci,1～3foci,4～10foci和>10foci的单个细胞。
图4显示了大规模筛选有机化学药库以获得具有抗衰老活性小分子化合物 (包括天然和人工合成)的实验流程图。
图5显示了SAC的化学分子结构简图。
图6显示了RNA-seq数据分析之后的Heatmap显示BLEO损伤造成的衰老细胞中大量因子表达上调，但经过SAC处理之后有不少出现明显逆转。红星标识，典型SASP外泌因子。
图7显示了GSEA分析结果显示SASP特异性分子标记或相关因子的表达在BLEO造成的衰老细胞中集中上调，但在SAC处理衰老细胞之后发生显著下降。
图8显示了GSEA分析结果显示NF-κB分子标记或相关因子的表达在 BLEO造成的衰老细胞中集中上调，但在SAC处理衰老细胞之后发生显著下降。
图9显示了KEGG通路分析SAC在衰老细胞中造成显著下调的100个分子在biological process上的代表性通路。
图10显示了KEGG通路分析SAC在衰老细胞中造成显著下调的100个分子在cellular component上的代表性通路。
图11显示了荧光定量PCR(qRT-PCR)检测分析一组典型SASP分子在 BLEO诱导形成的衰老细胞、被不同浓度的SAC处理条件下的相对表达水平。所有数据均为相比于CTRL组后的规范化结果。*,P<0.05；**,P<0.01；***, P<0.001。
图12显示了在SAC浓度递增的条件下，用SA-β-Gal染色确定PSC27的衰老与否。^,P>0.05；**,P<0.01；****,P<0.0001。其中，SAC在100μM， 200μM，400μM，800μM，1600μM，2000μM和3000μM浓度下的P值为这些实验组的细胞阳性比例同0μM时的数据相比得出的统计学显著性。
图13显示了SA-β-Gal染色后PSC27在各种条件下的代表性图片。每组3 个重复，上下排列。标尺，30μm。
图14显示了CCK8检测增殖态细胞同衰老组细胞在SAC渐增浓度下的存活率。每一SAC浓度下的P值均为CTRL和BLEO组之间相比后的显著性差异。**,P<0.01；***,P<0.001；****,P<0.0001。
图15显示了PSC27的群体倍增(population doubling,PD)测试。细胞在第 10代(p10)时，受到BLEO损伤性处理，随后SAC在第8天时加入培养基。通过比较分析CTRL组，BLEO组，SAC组和BLEO/SAC组的倍增值(PD)确定 SAC对于细胞增殖潜力的影响。^,P>0.05；***,P<0.001。
图16显示了SAC处理衰老细胞过程中诱导出现caspase 3/7活性。PSC27 细胞经BLEO在培养条件下处理12h后逐渐进入衰老阶段。200μM的SAC在第7天开始加入衰老细胞的培养基，NucLight Rapid Red试剂用于标记细胞，而caspase 3/7试剂(IncuCyte)用于apoptosis检测。Caspase 3/7活性以每4小时的间隔检测一次(n＝3)。
图17显示了Pan-caspase抑制剂(20μM QVD-OPh)逆转SAC的senolytic活性(200μM的SAC用于这一实验,而1.25μM的ABT263作为阳性对照；后者为近年被报导的衰老细胞凋亡诱导剂)。统计学差异通过two-way ANOVA (Turkey’test)获得。
图18显示了流式细胞仪测定PSC27在几种条件下的细胞凋亡情况。Q2，早期凋亡细胞的分布区域；Q3，晚期凋亡细胞的分布区域。
图19显示了对比分析细胞经过BLEO和/或SAC处理之后的存活和凋亡数量。***,P<0.001；****,P<0.0001。
图20显示了预临床试验中小鼠给药方式示意图。人源基质细胞PSC27同癌细胞PC3在体外混合(1:4)之后移植入小鼠皮下形成移植瘤。在单药或组合式给药条件下经过多个治疗周期的处理，最终小鼠处死、病理分析其肿瘤组织有关分子表达变化。
图21显示了PSC27细胞的CTRL组和BLEO损伤组在体外同PC3混合之后，或者PC3细胞单独移植入小鼠皮下组织形成移植瘤。在第8周结束时解剖并获得肿瘤，检测、对比各组条件下肿瘤的体积。**,P<0.01；***,P<0.001； ****,P<0.0001。
图22显示了预临床试验小鼠给药时间和给药方式示意图。每两周为一次给药周期，在第3/5/7周的第一天分别对小鼠腹腔给药MIT(mitoxantrone，米托蒽醌)。第5周第一天开始对小鼠进行腹腔SAC给药，每周一次。8周疗程结束后，解剖小鼠并进行病理鉴定与表达分析。
图23显示了肿瘤终端体积统计分析。化疗药物MIT单独或与抗衰老药SAC 一起用于对小鼠给药，第8周结束之后对比分析各组肿瘤大小。
图24显示了临床前试验中PC3/PSC27荷瘤动物病灶中细胞衰老情况对比。 SA-β-Gal染色之后代表性图片。标尺，100μm。
图25显示了小鼠体内肿瘤组织中SA-β-Gal染色阳性细胞百分比平行分析。 ^,P>0.05；*,P<0.05；****,P<0.0001。
图26显示了荧光定量PCR(qRT-PCR)检测分析小鼠病灶中上皮癌细胞和基质细胞中SASP典型因子的表达情况。通过LCM技术将基质细胞和癌细胞分别进行特异分离、制备总RNA并用于SASP表达检测。^,P>0.05；*,P<0.05； **,P<0.01。
图27显示了荧光定量PCR(qRT-PCR)检测分析vehicle、MIT和MIT/SAC 给药之后的小鼠病灶中基质细胞SASP因子表达状态。*,P<0.05；**,P<0.01； ***,P<0.001。
图28显示了NOD/SCID小鼠在经过各种给药处理之后，无病生存期的Kaplan Meier数据对比。Vehicle,MIT,SAC和MIT/SAC组动物在体内肿瘤体积超过2000mm3时，即被认为严重疾病已经出现，小鼠需要及时处死并检测其荷瘤情况。^,P>0.05；**,P<0.01。
图29显示了各种不同给药处理条件下疗程结束时小鼠体重数据对比分析。^,P>0.05。
图30显示了以上不同给药处理条件下疗程结束时小鼠血清学数据对比分析。Creatinine,urine(肾脏指标),ALP和ALT(肝脏指标)数据平行对比。^,P>0.05。
图31显示了各种不同给药处理条件下疗程结束时免疫完整型小鼠(C57BL/6J)体重数据对比分析。^,P>0.05。
图32显示了预临床中不同给药处理条件下疗程结束时小鼠血细胞计数对比分析。WBC,lymphocyte和neutrophil单位体积数量平行对比。^,P>0.05。
图33显示了肿瘤终端体积统计分析。化疗药物DOX单独或与抗衰老药SAC一起用于对小鼠给药，第8周结束之后对比分析各组肿瘤大小。
图34显示了肿瘤终端体积统计分析。化疗药物DOC单独或与抗衰老药SAC一起用于对小鼠给药，第8周结束之后对比分析各组肿瘤大小。
图35显示了肿瘤终端体积统计分析。化疗药物VIN单独或与抗衰老药SAC一起用于对小鼠给药，第8周结束之后对比分析各组肿瘤大小。
图36显示了预临床阶段小鼠的疗后生存曲线。从24至27月龄时开始，C57BL/6小鼠每两周经受一次Vehicle或SAC腹腔给药(Vehicle组n＝80；SAC组n＝91)。每组动物的中位生存期(median survival)经过计算并予以标明。****，P<0.0001。
图37显示了预临床阶段小鼠的总体(终生，或全长)生存曲线。从24至27月龄时开始，C57BL/6小鼠每两周经受一次Vehicle或SAC腹腔给药(Vehicle组n＝80；SAC组n＝91)。每组动物一生中的中位生存期(median survival)经过计算并予以标明。****，P<0.0001。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了丹参酚酸C(SAC)作为新型抗衰老药物原料在细胞衰老、肿瘤治疗与延长寿命中的应用。本发明中，通过实验发现丹参酚酸C(SAC)能够特异性靶向衰老细胞，具有抑制衰老相关分泌表型(SASP)的表达、清除衰老细胞、恢复衰老细胞增殖活力的效果。并且，其可在基因毒化疗药物治疗后的肿瘤微环中清除衰老的基质细胞、逆转其 SASP表达，从而降低肿瘤对化疗药物的耐药性，显著促进化疗药物的抗肿瘤效果。同时，SAC还能显著延长老龄动物的晚期生存期。在此基础上，完成了本发明。
术语
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101 和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“含有”可互换使用，不仅包括封闭式定义，还包括半封闭、和开放式的定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”的成分是指适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。
如本文所用，术语“治疗有效量”或“有效量”，是指对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。本领域的普通技术人员应该理解，所述的“治疗有效量”可随着药物组合物的形式、给药途径、所用药物的辅料、疾病的严重程度以及与其他药物联合用药等情况的不同而有所不同。
丹参酚酸C(SAC)
丹参酚酸C(Salvianolic acid C,SAC)为唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhizaBge.)的根提取并精制而成，无定形黄色化合物。分子式为C26H20O10，溶于乙醇、乙醚。具有明显的抗血小板聚集作用。
本发明发现的SAC效果包括：
1.抑制SASP表达：在高表达SASP因子的衰老细胞中，经过SAC处理后，SASP因子的表达显著下调。在某些实施例中，验证了该效果在SAC浓度约50μM时最佳。
2.抗衰老或清除衰老细胞：SAC能够通过通过诱导凋亡的方式促使衰老细胞进入死亡程序。在某些实施例中，在体外条件下验证了该效果具有浓度依赖性，在SAC浓度约为＞200μM时表现出显著效果，并且当SAC浓度在约 2000μM时达到阈值，能够使存活衰老细胞的百分比下降到约10％。实施例还验证了SAC在3000μM浓度下也基本不影响增殖态细胞，具有优秀的特异性。
并且，SAC能够显著提升经基因毒性处理(例如BLEO处理)后生长停滞的基质细胞的群体倍增能力(PD)，提高其增殖能力，并对增殖细胞的PD基本无影响，表现出良好的选择性。
3.降低肿瘤对化疗药物的耐药性：本发明通过研究发现，某些化疗药物(如 MIT)给药后能够诱导肿瘤组织中大量衰老细胞出现、以及主要发生在基质细胞中的SASP因子表达上调，这种SASP因子增加将促进其周边癌细胞治疗性耐药。而SAC能够很大程度上逆转这一变化。动物实验也证明，对于PC3癌细胞和原代PSC27基质细胞组成的移植肿瘤，SAC单独应用对肿瘤体积无显著影响，但出乎意料地在MIT治疗后的小鼠中能够显著减小肿瘤体积，与MIT 相比，肿瘤体积减少55.1％。生存期实验显示，SAC单独应用对荷瘤小鼠生存期无显著延长效果，但出乎意料地，接受MIT/SAC组合治疗的小鼠与仅接受 MIT治疗的组相比，存活期延长了至少48.1％。同时，实验小鼠的尿素、肌酐、肝酶或体重未发生显著波动，免疫系统完整性和关键器官的组织稳态也未受干扰，证实了抗衰老剂结合常规化疗药物有可能在普遍意义上增强肿瘤反应，而不引起严重的全身毒性。
4.延长寿命或晚年生存期：本发明通过实验发现，从WT小鼠非常老龄的某一时间点(例如24-27个月龄)开始进行每两周给药一次的间歇治疗，令人惊讶地能够使治疗后中位生存期较Vehicle组延长72.8％，同时具有较低的死亡危险。这一发现表明SAC介导的衰老细胞清除可以降低老年小鼠的死亡风险，并有效延长其生存期。
基于此，本发明提供了SAC用于制备制剂或药物组合物的用途，所述制剂或药物组合物用于：
A)抑制衰老相关分泌表型(SASP)表达；
B)抗衰老或清除衰老细胞；
C)降低肿瘤对化疗药物的耐药性；
D)延长寿命或晚年生存期。
在一些实施方式中，所述的降低肿瘤对化疗药物耐药性是通过清除肿瘤微环境中衰老细胞和/或抑制肿瘤微环境中SASP表达进行的。所述的肿瘤包括：前列腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、肾脏肿瘤、小肠癌、骨癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、脑癌、子宫内膜癌、睾丸癌、甲状腺癌、或其组合。在优选的实施方式中，所述的肿瘤为经过基因毒化疗药物处理后、肿瘤微环境中衰老细胞增加和/或高表达 SASP的肿瘤，该类肿瘤易对化疗产生耐药性。所述的“化疗药物”优选为能够诱导肿瘤微环境中衰老细胞增加和/或SASP高表达的化疗药物。
药物组合物及施用方法
基于本发明发现的SAC与化疗药物的协同作用，本发明还提供了一种药物组合物或药盒，其包括治疗有效量的：
C1)作为第一活性成分的丹参酚酸C、或其药学上可接受的盐；
C2)作为第二活性成分的化疗药物，
其中，所述化疗药物能够诱发肿瘤微环境中衰老细胞出现。该药物组合物还可以包含药学上可接受的载体。
在本发明中，与SAC联用的化疗药物优选为基因毒药物，其能够诱发肿瘤微环境中衰老细胞出现，更优选地能够诱发肿瘤微环境中SASP表达升高或能够诱导衰老标记p16INK4A上调。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。
本发明发现，用于不同用途时SAC的有效量可以是不同的。例如，在一些实施方式中，当SAC用于抑制SASP表达时，其浓度可以是10-200μM，优选为20-100μM，更优选为40-60μM(例如40、45、50、55或60μM)。
在另一些实施方式中，当SAC用于诱导衰老细胞进入死亡程序时，其浓度可以是＞100μM，优选为200-3000μM，更优选为200-2000μM(例如200、 300、400、500、600、7000、800、9000、1000、1100、1200、1300、1400、 1500、1600、1700、1800、1900、或2000μM)。
并且，本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
在特定条件下，senolytic药物的使用频率可能取决于衰老细胞的积累速度，而衰老细胞的积累速度可能会因细胞衰老发生的环境而异。例如，反复接触破坏DNA的癌症疗法或持续的高脂肪饮食，可能会比自然衰老更迅速地导致衰老细胞的重新累积。间歇性使用senolytics可以降低患者产生不良反应的风险，并允许在健康期间使用senolytics。此外，间歇给药还可以减少senolytics产生的副作用并降低患者产生耐药性的可能性。与抗癌药物或抗生素的情况相反，因为衰老细胞不发生分裂，因此机体无法依赖细胞增殖产生senolytics抗性，从而无法获得有利的突变，这可为临床中广泛使用senolytics创造良好的基础。
抗肿瘤物质筛选
基于本发明发现的SAC与化疗药物联合抗肿瘤的机制，本发明提供了一种筛选能够与丹参酚酸C协同抗肿瘤的物质的方法。该方法可以是针对已知化疗药物进行的筛选，或可以是针对未明确抗癌效果的物质进行的筛选。该方法通过检测候选物质对肿瘤微环境中细胞衰老的影响，来筛选其是否适合与SAC 协同抗肿瘤。
本发明的筛选方法包括步骤：
(S1)提供一肿瘤组织，使用候选物质处理所述肿瘤组织；
(S2)检测经处理的肿瘤组织中细胞衰老情况，从而筛选能够与丹参酚酸 C协同抗肿瘤的物质。
其中，所述的检测细胞衰老情况包括：(i)检测衰老细胞数量；(ii)检测SASP因子表达；(iii)检测衰老标记p16INK4A。基于前述研究结果，如检测到候选物质处理能够提高(如提高10％、20％、30％、40％、50％以上或更高) 肿瘤组织中衰老细胞数量、SASP因子表达、和/或衰老标记p16INK4A，则认为丹参酚酸C与该物质联用时能够发挥清除肿瘤微环境中衰老细胞、或降低肿瘤微环境中SASP因子表达的作用，从而确定该物质是能够与丹参酚酸C协同抗肿瘤的物质。
本发明的筛选方法可以通过体外实验或体内实验进行，但不限于此。
本发明的主要优点包括：
1)提供了丹参酚酸C在细胞衰老、肿瘤治疗与延长寿命中的应用。
2)提供了丹参酚酸C与基因毒化疗药物联用抗肿瘤的联合疗法，并验证了其具有显著的协同效果。
3)丹参酚酸C是临床较为广泛应用的药物，具有较高的安全性。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和分数是重量百分比和重量分数。
材料与方法
1.细胞培养
(1)细胞系维持
正常人源前列腺原代基质细胞系PSC27(获自美国Fred Hutchinson Cancer 研究Research Center)于37℃和5％CO2条件的培养箱中培养，在PSCC完全培养液中增殖和传代。
(2)细胞冻存与复苏
a.细胞冻存
以0.25％胰蛋白酶收集对数生长期细胞，1000rpm离心2min，弃去上清，重新悬浮细胞于新鲜配置的冻存液中。分装细胞于已标示的无菌冻存管中。然后经梯度降温，最后转入液氮中长期储存。
b.细胞复苏
取出液氮中冻存的细胞，立即放入37℃水浴，使其快速融化。直接加入2 ml细胞培养液，使细胞均匀悬浮。待细胞贴壁后，更换新的培养液。
(3)体外实验处理
为造成细胞损伤，PSC27细胞生长至80％(简称PSC27-CTRL)时培养液中加入50μg/ml博来霉素(bleomycin,BLEO)。药物处理12小时后，细胞被PBS简单洗过3次，留置于培养液中7-10天，然后进行后续实验。
2.天然产物库的筛选
针对一个共有1470种小分子化合物、多为药用植物来源分子并有抗衰老潜力的有机化学药库(TOPSCIENCE)进行药效学分析。将各种产物分别按照一定浓度梯度稀释至96孔板，密度为每孔5000个细胞。培养基使用DMEM，天然产物(或化合物)的工作浓度一般控制在1μM-l mM。药物处理后3-7天，细胞增殖用CCK-8Cell Counting Kit试剂盒(基于WST-8原理，Vazyme)测定，细胞凋亡活性以Caspase 3/7 activity kit(Promega)确定。
初步确定的候选药物进一步筛选30天。将进入第二轮候选范围的药物稀释到6孔板中，每孔20,000个细胞。培养基和候选药物每隔一天更换一次。为确定每种药物对细胞表型和存活率等的影响，项目根据不同浓度的药物进行验证性分析。
3.免疫印记和免疫荧光检测
用NuPAGE 4-12％Bis-Tris gel分离细胞裂解来源蛋白质，并转移到硝化纤维素膜(Life Technologies)上。用5％脱脂牛奶在室温下阻断印迹1h，在4℃下与所需的一抗在制造商协议的浓度下孵育一夜，然后在室温下与辣根过氧化物酶结合二抗(Santa Cruz)孵育1h，用增强化学发光(ECL)检测试剂 (Millipore)按照制造商的协议开展膜印迹信号检测，并使用ImageQuant LAS 400 Phospho-Imager(GE Healthcare)。作为一种标准的蛋白质标记，本发明人使用Thermo Fisher Scientific公司提供的PageRuler PlusPrestained Protein Ladder(no. 26619)。
对于免疫荧光染色，目标细胞在培养皿中培养之后在coverslip上预种至少 24h。在短暂洗涤后，用4％多聚甲醛在PBS中固定8min，用5％正常山羊血清(NGS,ThermoFisher)阻断30min。小鼠单克隆抗体anti-phospho-Histone H2A.X(Ser139)(cloneJBW301,Millipore)和小鼠单克隆抗体anti-BrdU(Cat#347580，BD Biosciences)，及二级抗体Alexa488(or 594)-conjugated F(ab')2按顺序加入到覆有固定细胞的载玻片上。细胞核用2μg/ml of 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)进行复染。从3个观察视野中选取最具代表性的一张图像进行数据分析和结果展示。FV1000激光扫描共聚焦显微镜 (Olympus)用于获取细胞共聚焦荧光图像。
4.全转录组测序分析(RNA-sequencing)
对不同处理条件下的人源前列腺原代基质细胞系PSC27进行全转录组测序。从基质细胞中获得总RNA样本。其完整性经Bioanalyzer 2100(Agilent)验证，RNA用IlluminaHiSeq X10测序，基因表达水平由软件包 rsem(https://deweylab.github.io/rsem/)进行量化。简而言之，以RiboMinus Eukaryote kit(Qiagen,Valencia,CA,USA)消除RNA样品中的rRNA；并根据制造商的指示，在深度测序前用TruSeq Stranded Total RNA preparationkits(Illumina,San Diego,CA,USA)构建链特异性RNA-seq文库。
Paired-end transcriptomic reads取被映射到参考基因组(GRCh38/hg38)，并使用Bowtie工具从Gencode v27进行参考注释。使用picard tools(1.98)脚本标记重复项(https://github.com/broadinstitute/picard)识别重复读取，只保留非重复读取。Reference splice junctions由参考转录组提供(Ensembl build 73)。用 Cufflinks计算FPKM值，用Cufflinks,最大似然估计函数调用差异基因表达。表达显著变化的基因由falsediscovery rate(FDR)-corrected P value<0.05定义，仅用状态“Known”和生物型“coding”的ensembl genes 73进行下游分析。
接下来使用Trim Galore(v0.3.0)(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk /projects/trim_galore/)修剪Reads，而质量评估使用FastQC(v0.10.0)(http://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc/)。随后，利用DAVIDbioinformatics platform(https://david.ncifcrf.gov/),、Ingenuity PathwaysAnalysis(IPA)program(http://www.ingenuity.com/index.html)。在Majorbio I-SangerCloud Platform(www.i-sanger.com)免费在线平台上对原始数据进行了初步分析，并将原始数据存入NCBI Gene Expression Omnibus(GEO)database数据库，登录代码为GSE156448。
5.蛋白质-蛋白质相互作用网络分析
用STRING3.0进行蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)分析。将符合标准的特定蛋白质导入在线分析软件(http://www.networkanalyst.ca)，选择一个最小交互网络进行进一步的集线器和模块分析。
6.基因集富集分析(GSEA)
基于RNA-seq初步分析所得数据，对于每个差异表达显著基因分析比较，基因是使用从DESeq2获得的“wald statistics”进行排序的，GSEA是在 MSigDB(http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb)中可用的所有规划基因集的这些排序列表上进行的)。DESeq2 independent filtering是基于归一化读取计数的平均值，筛选出表达水平很低的基因。SASP和GSEA signature如本发明人过往发表文献所述(Zhang等人，2018a)。
7.定量PCR(RT-PCR)测定基因表达
(1)细胞总RNA的提取
以Trizol试剂抽提处于生长期或停滞期细胞的总RNA，每T25培养瓶细胞加入1mlTrizol，用细胞刮刀刮下细胞层后将其转移至离心管中，充分混匀至不粘稠。每1ml Trizol加0.2ml氯仿，剧烈震荡15sec，室温孵育5-10min；4℃， 11,000g离心15min；将无色上清液移入一新的离心管中，按每1ml Trizol加0.5 ml异丙醇，室温孵育10分钟，11,000g，4℃离心10min；倒掉上清，用75％乙醇(每1ml Trizol至少用1ml 75％乙醇)洗涤，4℃，7,500g离心5min；室温干燥RNA沉淀5-10分钟(RNA不能干燥)，用DEPC-H2O溶解沉淀。
分光光度计定量RNA之后，取少量总RNA进行1％琼脂糖电泳，检查RNA 状态和质量。
(2)逆转录反应
OligodT23 VN(50uM) 1ul
Total RNA 1-2ug
RNase Free ddH2O to 8ul
65℃加热5min，迅速置于冰上骤冷，并静置2min。
配置第一链cDNA合成液
2x RT Mix 10ul
HiScript II Enzyme Mix 2ul
按照以下条件进行第一链cDNA合成：
25℃ 5min
50℃ 45min
85℃ 5min
(3)实时定量PCR反应
将逆转录反应产物cDNA稀释50倍作为模板。
按照以上标准加样，反应条件为：95℃预变性15sec，然后95℃5sec， 60℃31sec，40个循环；融解曲线条件为95℃15sec，60℃30sec，95℃15 sec。样品于ABI ViiA7(ABI)仪上进行反应。以β-actin的表达作内参。反应完成后，经软件分析查看每个基因的扩增情况，导出相应的域值循环数，采用 2-ΔΔCt方法，计算每个基因的相对表达量。对融解曲线(melting curve)的波峰和波形进行分析以确定得到的扩增产物是否为特异性单一目的片段。
8.SA-β-Gal染色
衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色，操作执行以往报道程序 (Debacq-Chainiaux等人，2009年)。简单地说，细胞培养皿中经PBS洗涤，在室温下固定。在2％甲醛和0.2％戊二醛中作用3min，用以固定细胞。然后用新制备的染色液对SA-β-Gal进行染色，在37℃下过夜。第二天拍摄图像并计算单位面积内阳性细胞百分比。
9.克隆扩增实验
单细胞克隆扩增实验，按过往文献所述进行(Duan等人，2015年；Wu等人，2018年)。简单地说，细胞被铺板于明胶涂层的12孔板，密度为2000个细胞/孔。结晶紫染色之后计算细胞克隆数。
10.药物诱导衰老细胞凋亡
将PSC27细胞铺板于96孔皿中，在50μg/ml的BLEO处理下诱导细胞衰老。分别以200μM和1.25μM的浓度加入SAC和ABT263。细胞培养基配以Incucyte Nuclight快速红色试剂(Essen Bioscience)和IncucyteC-3/7细胞凋亡试剂(Essen Bioscience)。选取代表性视野进行拍照。
11.小鼠移植瘤接种和预临床治疗试验
所有实验小鼠实验均严格遵循中国科学院上海生命科学研究院实验动物看护和使用委员会(IACUC)的有关规章进行。年龄6-8周的免疫缺陷型小鼠 (NOD-SCID mice,ICR)(体重约25g)用于本专利相关动物实验。基质细胞PSC27 和上皮细胞PC3以1:4预先确定的比例混合，而每一移植体包含1.25×106细胞，用于组织重构。移植瘤通过皮下移植方式植入小鼠体内，移植手术结束之后8 周末动物被执行安乐死。肿瘤体积按照如下公式计算：V＝(π/6)x((l+w)/2)3(V, 体积；l,长度；w,宽度)。
在预临床治疗试验中，经过皮下移植的小鼠被供给标准实验食谱，2周之后实施化疗药物米托蒽醌(MIT,0.2mg/kg剂量)和/或SAC(500μl,10mg/kg 剂量)腹腔给药。时间点为：前者在第3,5,7周的第一天，后者在第5,7周的第一天。整个疗程共进行3次MIT循环给药，每个循环为2周。疗程结束后，小鼠肿瘤被收集用于体积测量和组织学分析。每只小鼠累积性共接受MIT这一药物0.6 mg/kg体重，SAC则为30mg/kg体重。为造成全身范围SASP因子在化疗诱导下表达，MIT按照以上步骤和顺序，经过静脉输注方式对小鼠给药，但剂量下降至0.1mg/kg体重/每次(整个疗程累计接受MIT剂量为0.3mg/kg体重)以减轻药物相关毒性。化疗试验进行到第8周末结束，小鼠处死之后立即解剖，其移植瘤被收集并用于病理系统分析。
12.小鼠寿命研究
在细胞移植研究中，本发明人在SPF动物平台通过连续饲养获得了16个月大的雄性C57BL/6小鼠，每个笼子里有4到5只动物。本发明人首先按体重从低到高对小鼠进行分类，然后选择了体重相似的小鼠。接下来，衰老(SEN)或对照(CTRL)移植治疗方式，则使用随机数产生器被分配给每间隔一次的小鼠，而中间的小鼠被分配到另一种治疗方式中，从而使衰老和对照移植小鼠的体重匹配。细胞移植1个月后，当小鼠年龄为18个月时，进行身体功能测试。在那之后，除了检查它们的笼子外，没有对这些老鼠进行进一步的测试。最早的死亡发生在上次身体功能测试后大约2个月。19至21个月大的C57BL/6小鼠，每个笼子里安放有3-5只。与移植小鼠一样，小鼠根据体重进行分类，并随机分配给每一组，由不知道预临床试验设计的人进行对照组(vehicle)或药物组(SAC)组处理。从24-27个月龄开始，小鼠每2周用vehicle或SAC治疗一次，每次连续3天口服灌胃。在研究过程中，一些老鼠被从原来的笼子移走，以尽量避免在单一笼子中长期饲养产生的动物居住压力。RotaRod和hanging测试每月进行，因为这些测试是敏感和无创的。试验结束时，本发明人对小鼠进行安乐死；如果它们表现出以下几种症状之一，本发明人就认为它们已经死亡：(一)不能饮水或吃饭；(二)即使有刺激也不愿意移动；(三)快速减肥；(四)严重的平衡障碍；或(五)机体出血或出现溃疡肿瘤。试验过程中，没有老鼠因为打架、意外死亡或皮炎而被排除在外。进行生物统计时，本发明人采用Cox proportional hazard model进行生存分析。
13.预临床动物死后病理检查
研究人员每天对笼子进行检查，并将死鼠从笼子中取出。在动物死亡24 小时内，尸体被打开(腹腔、胸腔和颅骨)，并单独保存在10％福尔马林中至少7天。分解或破坏的身体被排除在外。保存的尸体被运到Autopsy专用地点进行病理检查。评估肿瘤负担(每个小鼠不同类型肿瘤的总和)，疾病负担(每个小鼠主要器官不同组织病理学变化的总和)，每个病变的严重程度和炎症(淋巴细胞浸润)。
14.生物发光成像
小鼠腹腔注射3mg荧光素(BioVision,Milpitas,CA)，以体积200μl的PBS递送。小鼠用异氟烷麻醉，使用Xenogen IVIS 200System(Caliper Life Sciences, Hopkinton,MA)获取生物发光图像。
15.体能检测
所有检测均在最后一次安慰剂或药物处理后的第5天开始。最大步行速度采用加速RotaRod System(TSE System,Chesterfiled,MO)进行评估。在RotaRod 上小鼠被训练3天，速度分别为4，6和8r.p.m，第1、2和3天历时200秒。在测试日，小鼠被放置在RotaRod上，在4r.p.m速度下开始。以5分钟为间隔，转速由4 加速到40r.p.m。当老鼠从RotaRod上掉下来时，速度被记录下来。最终结果从 3或4个试验中取平均值，并规范为基线速度。在前两个月内训练过的小鼠不再接受训练。
前肢握力(N)使用Grip Strength Meter(Columbus Instruments,Columbus,OH)测定，结果来自超过10个试验的平均值。对于悬挂耐力试验，小鼠被放置在一个2毫米厚的金属线上，后者位于垫子上方35厘米处。小鼠只被允许用前肢抓住电线，悬挂时间根据体重进行规范化，表示为悬挂持续时间(sec)×体重(g)。结果取每只小鼠2到3次实验的平均值。通过Comprehensive Laboratory Animal Monitoring System(CLAMS)监测24小时(12小时光照和12小时黑暗)的日常活动和食物摄入量。CLAMS系统配备了Oxymax Open CircuitCalorimeter System (Columbus Instruments)。对于跑步机性能，小鼠在5°倾斜度下适应在电动跑补机(Columbus Instruments)上跑步，经过3天训练，每天持续5分钟，以5米/分钟的速度开始2分钟，继而加速至到7米/分钟2分钟，然后9米/分钟1分钟。在试验当日，小鼠在跑步机上以5米/分钟的初始速度跑步2分钟，然后每2分钟增加 2米/分钟的速度，直到小鼠筋疲力尽。疲劳被定义为即便有轻微的电击刺激和机械刺激，小鼠仍无法回到跑步机上。试验结束后记录距离，用下列公式计算总功(KJ)：质量(kg)×g(9.8m/s2)×距离(m)×sin(5°)。
16.生物统计学方法
本专利申请中所有涉及细胞增殖率，存活率和SA-β-Gal染色等的体外实验和小鼠移植瘤及预临床药物处理的体内试验均重复3次以上，数据以均值±标准误的形式呈现。统计学分析建立在原始数据的基础上，通过one-way analysis of variance(ANOVA)or atwo-tailed Student's t-test进行计算，而P<0.05的结果认作具有显著性差异。
因素之间的相关性用Pearson’s correlation coefficients检验。当小鼠在几个队列中获得并分组在笼子中时，采用Cox proportional hazard model进行生存分析。该模型将治疗的性别和年龄作为固定效应，队列和初始笼分配作为随机效应。由于在研究中，一些小鼠被从最初的笼子中移动，以尽量减少来自单笼外壳的压力，本发明人还进行了没有笼效应的分析。这两种分析的结果在方向性或统计意义上没有很大差异，增强了对本发明人结果的自信度。生存分析使用 statistical software R(version 3.4.1；library‘coxme’)。在大多数实验和结果评估中，研究者对分配采取盲选。本发明人使用基线体重将小鼠分配至实验组(以实现组间相似的体重)，因此只在与体重匹配的组内进行随机化。本发明人根据过往的实验确定样本量，因此没有使用statistical power analysis。本研究中的所有重复都来自不同的样本，每个样本来自不同的实验动物。
实施例1SAC在低浓度下使用时可以有效抑制SASP的表达
为了鉴定能有效调节衰老细胞表型的创新化合物，本发明人利用一个由 1470种小分子组成的有机化学药库开展了无偏倚性筛选。为了检测这些药物的药效和潜在的生物价值，本发明人选择使用原发性正常人前列腺基质细胞系，即PSC27作为体外细胞模型。PSC27主要由成纤维细胞组成，而非成纤维细胞系(包括内皮细胞和平滑肌细胞)也存在，但比例较小，PSC27在性质上是人源原代基质细胞系，在暴露于基因毒化疗(genotoxicchemotherapy)或电离辐射 (ionizing radiation)等胁迫因素后形成典型的SASP。本发明人用预实验中已经优化过的方式，即特定剂量的博来霉素(BLEO)处理这些细胞，并观察到衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色阳性率明显升高，BrdU掺入率大幅降低，DNA 损伤修复灶(DDR foci)在药物损伤后的数天内显著升高(图1-3)。本发明人通过高通量高内涵系统筛选的方式来平行比较这些天然药物产品对衰老细胞表达谱的影响(图4)。
本发明人对这些细胞进行了RNA-seq测序。而随后获得的高通量数据表明，一种小分子化合物，丹参酚酸C(salvianolic acid,SAC)(图5)，显著改变了衰老细胞的表达谱。其中上千个基因出现显著下调，同时多个基因发生上调。重要的是，SAC处理之后的衰老细胞中SASP因子的表达普遍降低，而这些SASP 因子一般会在衰老细胞中明显上调(图6)。虽然一些SASP不相关基因的表达情况与那些典型的SASP因子表现出类似的趋势，但GSEA分析的数据进一步揭示了表征SASP表达或NF-KB激活的分子标签的显著抑制，后者是介导促炎SASP发展的主要转录性事件(图7，图8)。进一步的GO生物信息学数据表明，这些分子在功能上参与了一组重要生物过程，包括信号转导、细胞间通讯、细胞代谢、能量调节、核苷酸代谢和蛋白代谢(图9)。这些下调基因中的大多数，除了在细胞核中发挥一定作用，本质上属于表达后即释放至胞外空间的蛋白质，或位于质膜上或细胞质中，总体而言在特征上与这些分子的分泌性质相互呼应 (图10)。
为了进一步证实SAC在体外条件下对SASP表达的影响，本发明人在一系列体外浓度梯度下处理了PSC27细胞。数据表明，工作浓度在50μM时的SAC 以最大的效率抑制了SASP发生发展(图11)。然而，较低或较高浓度的这种药物的疗效却不理想，尽管后者可能与这种药物的细胞毒性增加引起的细胞应激反应有关(图11)。因此，SAC这一植物来源的天然小分子化合物，可用于控制衰老细胞的促炎表型，即SASP，尤其在相对低浓度下使用更彰显其效果。
实施例2当在高浓度使用时SAC是一种新型的senolytics
鉴于SAC在控制SASP表达方面的显著疗效，本发明人接下来探究了这种天然产物在较高浓度下杀死衰老细胞的潜力。为此，本发明人测量了随着SAC 浓度的增加，体外条件下所处理的衰老细胞的生存百分比。SA-β-Gal染色数据表明，在SAC浓度达到200μM之前，衰老细胞基本不会被消除(图12)。随着浓度的增加，SAC对衰老细胞(80％染色阳性)的杀伤效果进一步增强，而当SAC在2000μM时达到阈值(衰老细胞此时剩余约20％)；当其浓度升高到3000μM时，SAC的杀伤效果没有进一步增强(图12；图13)。
为了进一步剖析这些问题，本发明人做了验证性实验。细胞活力测定表明，与其增殖态对照细胞相比较，SAC从200μM浓度开始诱导衰老细胞显著死亡 (图14)。当SAC浓度增加到2000μM时，存活衰老细胞的百分比下降到约10％。然而，即使在SAC的3000μM时，增殖细胞也并未明显减少。这些结果，证实了SAC对衰老细胞高度的选择性和突出的特异性，而这种特征实际是 senolytics作为一类独特的抗衰老药的基本技术要求。
本发明人接下来研究了基质细胞经基因毒性处理后群体倍增(populationdoubling,PD)的潜力。与损伤性处理之后迅速进入生长停滞状态的BLEO这一组细胞相比，BLEO和SAC的联合治疗组表现出显著增高的PD能力(图15)。然而有趣的是，SAC本身似乎不影响增殖细胞的PD，这一数据进一步表明SAC 在衰老细胞与正常细胞之间的选择性。
为了探究SAC是否通过诱导凋亡的方式造成衰老细胞丧失存活能力，本发明人使用SAC在培养条件下分别处理增殖组细胞和衰老组细胞。随后观察到的caspase-3/7活性变化结果，表明SAC引起衰老细胞发生凋亡；从SAC加入之后的第16小时，衰老组开始与对照组之间出现统计学差异(图16)。此外，泛caspase抑制剂QVD可防止SAC对衰老细胞的杀伤，这一过程中的实际效果跟ABT263(一种目前已知的、十分有效的衰老细胞凋亡诱导剂)对衰老细胞的影响非常相似(图17)。上述一系列结果证实，SAC通过诱导凋亡的方式促使衰老细胞进入死亡程序，但增殖态细胞基本不被这一天然药物所靶向或影响。
鉴于SAC对衰老细胞产生的明显影响，本发明人随后分析了SAC诱导细胞凋亡的潜力。流式细胞数据显示衰老PSC27细胞活力显著降低，而其凋亡比例显著升高，但增殖细胞的变化却并不明显(图18，图19)。因此，本发明的数据一致性支持SAC在体外条件下通过诱导细胞凋亡的方式引起衰老细胞的消除，该天然产物在靶向衰老细胞方面具有突出的潜力。
实施例3使用SAC治疗性靶向衰老细胞可促进肿瘤消退并能有效降低化疗耐药
鉴于SAC在体外较高浓度条件下清除衰老细胞中的突出选择性，本发明人接下来考虑这种药物是否可以被利用来干预体内与增龄相关的多种疾病。在众多人类病理中，癌症是严重威胁人类寿命和危害健康的主要慢性疾病之一。此外，临床中癌细胞耐药性限制了大多数抗癌治疗的效果，而衰老细胞往往通过在受损肿瘤灶中发展SASP来促进其周边癌细胞治疗性耐药的发生。即便如此，从原发肿瘤中清除衰老细胞以促进癌症治疗指数的可行性与安全性，至今几乎未被科学家们探索过。
首先，本发明人通过将PSC27基质细胞与PC3上皮细胞混合构建成组织重组体，后者是一种典型的高度恶性前列腺癌细胞系。在非肥胖糖尿病和严重联合免疫缺陷(NOD/SCID)实验小鼠大腿后侧皮下植入重组体之前，基质细胞与上皮细胞的数量比例为1：4。动物在重组体植入体内之后8周结束时，测量肿瘤大小(体积)(图20)。同由PC3癌细胞和原代PSC27基质细胞组成的肿瘤相比，由PC3细胞和衰老PSC27细胞组成的异种移植物(xenograft)体积显著增加(P<0.001)，这一差异再次证实了衰老细胞在肿瘤进展中的关键促进作用 (图21)。
为了在技术上更加接近临床条件和相关背景，本发明人特别设计了一种临床前方案，其中涉及基因毒化疗药物治疗和/或衰老药物干预(图22)。在皮下植入两周后，当观察到体内肿瘤已经稳定被摄取时，本发明人在第3、第5和第7周的第一天分别向实验动物提供单次剂量的MIT(Mitoxantrone，MIT；一种化疗剂)或安慰剂，直到8周方案全部结束。同安慰剂治疗组相比，MIT给药可显著延缓肿瘤生长，这证实了MIT作为化疗药物的疗效(肿瘤大小减少43.1％，P<0.0001)(图23)。值得注意的是，虽然SAC本身并不会引起肿瘤收缩，但对治疗MIT后的小鼠，SAC给药却可显著减小肿瘤(与MIT相比，肿瘤体积减少28％，P<0.001；与安慰剂治疗相比，肿瘤体积减少59％，P<0.0001) (图23)。接下来，本发明人推断细胞衰老是否发生在这些动物的肿瘤灶中。检测结果证明，MIT给药过程诱导了肿瘤组织中大量衰老细胞的出现，尽管这似乎毫不奇怪。然而，SAC给药则将这些化疗动物病灶内的大多数衰老细胞基本耗尽(图24；图25)。激光捕获显微解剖(LCM)和随后的定量PCR结果表明，SASP因子的表达显著升高，包括IL6、CXCL8、SPINK1、WNT16B、GM-CSF、 MMP3、IL1Α，这一趋势伴随着化疗动物衰老标记p16INK4A的上调(图26)。有趣的是，这些变化主要发生在基质细胞中，而不是它们邻近的癌细胞，这意味着残留癌细胞再增殖的可能性，而这些细胞在治疗损伤的TME中产生了获得性耐药。然而，在使用SAC给药时，这一变化在很大程度上被逆转，正如转录水平数据分析结果所展示的那样(图27)。
为了研究直接支持在MIT给药的小鼠中SASP的表达和逆转这种衰老相关模式的机制，本发明人在第一次SAC给药7天后即解剖了这两种药物治疗的动物体内的肿瘤，选择给药7天后这一时间点主要是因为这时病灶中癌细胞耐药克隆尚未形成。与安慰剂相比，MIT给药导致DNA损伤和凋亡程度均显著增加。虽然SAC单独不能诱导DNA损伤或造成凋亡，但化疗药物MIT却可以高度上调这两个指标。然而，当MIT处理的动物与SAC一起使用时，DNA损伤或凋亡的指数明显增强，这意味着这些衰老药物处理条件下的动物体内肿瘤位点细胞毒性增强。作为支持性证据，当SAC在治疗过程中应用时，caspase 3cleavage活性升高，这是细胞凋亡的一个典型标志。
接下来本发明人比较了不同药物处理组动物的生存情况，主要以一种时间延长的方式来评估肿瘤进展的后果。在这一临床前队列中，本发明人对动物进行了肿瘤生长监测，一旦小鼠内体肿瘤负担突出(大小≥2000mm3)，就会判断为严重疾病已经发生，这是一种用于某些情况下肿瘤等疾病的病情进展的方法。接受MIT/SAC组合治疗的小鼠表现出最长的中位生存期，与仅接受MIT治疗的组相比，存活期延长了至少49.5％(图28，青色与蓝色相比)。然而，仅用SAC治疗荷瘤小鼠并没有造成显著的好处，只有边际性生存延伸。值得注意的是，在这些研究中进行的治疗似乎被实验小鼠很好地耐受。本发明人没有观察到尿素、肌酐、肝酶或体重的显著波动(图29；图30)。更重要的是，在本研究设计的各药物剂量下使用的化疗和抗衰老药物不会显著干扰免疫系统的完整性和关键器官的组织稳态，即使在免疫完整型的野生小鼠中也是如此(图31；图32)。这些结果一致证实，抗衰老剂结合常规化疗药物有可能在普遍意义上增强肿瘤反应，而不引起严重的全身毒性。
为了确定SAC在提高化疗治疗效果方面是否具有药物依赖性或特异性，本发明人继而选择使用阿霉素(doxorubicin,DOX)、多西紫杉醇(docetaxel,DOC)与长春新碱(vincristine,VIN)，分别与SAC进行组合并用于预临床试验。结果表明，在这些化疗药物中，只有DOX与SAC联用可以大致重复MIT与SAC联合治疗所造成的显著效果(图33)。而DOC与VIN尽管在单独使用时可以降低肿瘤体积，但当SAC与其共同给药时并未引起肿瘤进一步收缩，即未能带来更多益处(图34，图35)。因此，SAC在体内条件下提高化疗治疗效果这一特征，仅限于同特定基因毒药物的联用，具有药物类型依赖性。
实施例4SAC治疗造成的衰老细胞清除可以延长老龄小鼠的晚年生存期
基于SAC具有在肿瘤小鼠的微环境中清除衰老细胞、降低肿瘤耐药性和提高总体治疗效果的惊人药效，本发明进一步研究其对于自然衰老的动物是否也有某种促进健康或延缓疾病的显著益处。本发明人首先考虑是否可以使用一种具有潜在转化价值的方法来消除衰老细胞，即：从非常老龄的某一时间点开始进行间歇治疗，探究能否延长WT小鼠的剩余寿命。基于此开展了一系列体内试验。令人惊讶的是，在每两周服用一次药物的治疗方案下，从24-27个月年龄(相当于人类75-90岁的年龄)开始给药的SAC组，其治疗后中位生存期比Vehicle组延长了60.8％，同时具有较低的死亡危险(HR＝0.32，SAC组/Vehicle组；P<0.0001)(图36，图37)。这一发现表明SAC介导的衰老细胞清除可以降低老年小鼠的死亡风险，并有效延长其生存期。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (12)

1.丹参酚酸C的用途，其特征在于，用于制备制剂或药物组合物，所述制剂或药物组合物用于：
A)抗衰老；
B)降低肿瘤对基因毒性化疗药物的耐药性；和/或
C)延长寿命或晚年生存期。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的化疗药物选自下组：米托蒽醌、博来霉素、阿霉素、或其组合。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤为前列腺癌。
4.一种药物组合物或药物组合，其特征在于，其活性成分由治疗有效量的下述活性成分组成：
C1)作为第一活性成分的丹参酚酸C、或其药学上可接受的盐；
C2)作为第二活性成分的基因毒性化疗药物，
其中，所述基因毒性化疗药物能够诱发肿瘤微环境中衰老细胞出现。
5.如权利要求4所述的药物组合物或药物组合，其特征在于，所述的化疗药物能够诱导肿瘤微环境中SASP表达、或能够诱导衰老标记p16INK4A上调。
6.如权利要求4所述的药物组合物或药物组合，其特征在于，所述的化疗药物选自下组：米托蒽醌、博来霉素、阿霉素、或其组合。
7.如权利要求4所述的药物组合物或药物组合，其特征在于，所述化疗药物为米托蒽醌，并且米托蒽醌与丹参酚酸C的重量比为1:10-100。
8.如权利要求4所述的药物组合物或药物组合，其特征在于，所述化疗药物为博来霉素，并且博来霉素的浓度为1-100μg/ml。
9.如权利要求4所述的药物组合物或药物组合，其特征在于，所述化疗药物为阿霉素，并且阿霉素与丹参酚酸C的重量比为1:20-200。
10.如权利要求4所述的药物组合物或药物组合，其特征在于，所述的药物组合物中丹参酚酸C浓度为10-200μM，其中丹参酚酸C用于抑制SASP表达。
11.如权利要求4所述的药物组合物或药物组合，其特征在于，所述的药物组合物中丹参酚酸C浓度为＞100μM，其中丹参酚酸C用于诱导衰老细胞进入死亡程序。
12.一种体外非治疗性地降低肿瘤细胞对基因毒性化疗药物耐药性的方法，其特征在于，包括步骤：
将丹参酚酸C与所述的肿瘤细胞接触，从而降低所述肿瘤细胞对基因毒性化疗药物的耐药性。
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