CN117982479A

CN117982479A - 丹参酚酸e在制备靶向衰老细胞、抑制肿瘤或延长寿命的药物中的应用

Info

Publication number: CN117982479A
Application number: CN202211329119.4A
Authority: CN
Inventors: 孙宇
Original assignee: Shanghai Institute of Nutrition and Health of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Nutrition and Health of CAS
Priority date: 2022-10-27
Filing date: 2022-10-27
Publication date: 2024-05-07

Abstract

本发明提供了丹参酚酸E(SAE)在制备靶向衰老细胞、抑制肿瘤或延长寿命的药物中的应用。本发明人致力于研究筛选靶向作用于肿瘤微环境及有助于增强化疗药物抑瘤效果、清除衰老细胞或抑制细胞衰老的药物，在此揭示了丹参酚酸E通过靶向作用于肿瘤微环境、清除衰老细胞，在与化疗药物联合应用后，可以通过清除衰老的基质细胞而促进肿瘤的抑制，促进效果极其显著。对于衰老相关分泌表型(SASP)，所述SAE也能有效靶向其中的衰老细胞，从而抑制其SASP。并且，所述SAE还能显著延长动物寿命，显著延长老年生存期，提高动物晚期生存质量。

Description

丹参酚酸E在制备靶向衰老细胞、抑制肿瘤或延长寿命的药物中的应用

技术领域

本发明属于细胞生物学和肿瘤学领域，更具体地，本发明人涉及抑制细胞衰老、抑制肿瘤或延长寿命的药物及其应用。

背景技术

细胞衰老是指真核细胞一种相对稳定且通常不可逆的细胞周期停滞的状态，在这种状态下增殖细胞会对促生长刺激产生耐受，通常由DNA损伤等胁迫性信号所引起。上个世纪60年代，Leonard Hayflick和Paul Moorhead首先描述了细胞衰老，他观察到人类胚胎成纤维细胞(WI38)最终会停止分裂，但在长时间培养后仍然具有活力和代谢活性。这一现象后来被称为复制性衰老，是指正常细胞在大约30-50次分裂(即“Hayflick极限”)后会停止连续分裂。复制性衰老本质上由端粒渐进缩短所诱导。在每一轮的DNA复制中，端粒都会逐渐缩短，最终达到一个临界长度，阻止进一步复制，从而停止细胞分裂。较短的无帽端粒会引起DNA损伤应答，从而直接触发衰老。

衰老细胞的特征是形态学异常、代谢活性变化、染色质重构、基因表达改变、脂褐素增加、颗粒性明显、空泡化严重以及出现一种称为衰老相关分泌表型(SASP)的促炎症表型。SASP这一概念是由Coppe等人于2008年首次提出。他们发现衰老细胞能通过分泌胞外基质蛋白、炎症相关因子及癌细胞生长因子促进邻近癌前细胞发生癌变或恶性程度上升，并称这些蛋白为SASP因子。近年大量研究表明在衰老过程中SASP起到核心的病理作用。此外，衰老细胞分泌的这些因子还会影响周围的正常细胞，而抑制SASP则能够延缓机体衰老。典型的SASP因子包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)、白细胞介素1a(IL-1a)、基质金属蛋白酶(MMP)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和纤溶酶原激活物抑制因子-1(PAI1)等，这些因子促进免疫系统激活，导致组织微环境中衰老细胞等异常因素被机体清除，发挥肿瘤抑制功能。

尽管国际已知的多种SASP抑制剂均可显著减弱SASP，但本质上不会杀死衰老细胞。为了在药理学上减轻衰老细胞的负担，科学家们正在开发一类衰老细胞清除药物，即“senolytic(s)”。这种性质的小分子、多肽和抗体可以选择性地清除衰老细胞。研究者们自2015年发现senolytic药物以来，在鉴别其他小分子senolytic药物及其作用方面取得了相当大的进展。

有研究表明在衰老细胞中促凋亡途径上调，衰老细胞依赖于衰老相关的抗凋亡途径(SCAPs)来减轻SASP对自身的伤害，这一假说得到了验证。SCAPs是通过生物信息学方法(基于辐射诱导衰老的人前脂肪细胞的表达谱)来鉴定的。有研究通过体外RNA干扰实验发现衰老细胞对SCAPs具有依赖性，并将SCAPs确认为衰老细胞的致命弱点。这一研究发现最终促成了SCAP网络中潜在的senolytic靶点的发现以及第一种senolytic药物的发现，其中senolytic药物包括达沙替尼(dasatinib)和槲皮素(quercetin)的组合(D+Q)。此外，有研究将BCL-2家族中一种对抗凋亡的蛋白(BCL-XL)鉴定为SASP组分。在这一发现之后，第三种senolytic药物navitoclax也被鉴定出来，它是一种BCL-2家族抑制剂。研究人员目前已经鉴定出越来越多的senolytics，包括其它合成的小分子、从天然产物中提取的化合物以及靶向已知SCAPs肽的抑制剂。此外，SCAPs也作为潜在的senolytic靶点备受瞩目。

衰老细胞存活所需的SCAP在细胞类型之间有所不同。例如，衰老的人类原代脂肪祖细胞存活所需的SCAPs与衰老的人类胚胎静脉内皮细胞(HUVECs)中的SCAPs不同。这种差异意味着靶向单个SCAP的药物可能无法消除多种衰老细胞类型。而且大量研究表明大多数senolytics确实仅对有限的衰老细胞类型有效。例如，navitoclax能够靶向HUVECs，但对衰老的人类脂肪祖细胞无效。有证据表明，即使在一种特定类型的细胞内，senolytics的功效也可能不同。例如，在人肺成纤维细胞中，navitoclax能靶向并杀死适应培养的IMR90肺成纤维细胞样细胞株中的衰老细胞，但对衰老的原代人肺成纤维细胞少有成效。

因此，开发并寻找合适的，具有广谱作用的senolytics，仍需要进行大量研究，该研究将有助于延缓、预防或治疗多种衰老相关的疾病。

发明内容

本发明的目的在于提供丹参酚酸E在制备靶向衰老细胞、抑制肿瘤或延长寿命的药物中的应用。

在本发明的第一方面，提供丹参酚酸E化合物或其药学上可接受的盐、酯、异构体、溶剂合物或前药的应用，用于：与化疗药物联合制备特异性靶向清除肿瘤微环境中衰老细胞及抑制肿瘤的组合物；其中，所述的化疗药物为给药后诱发肿瘤微环境出现衰老相关分泌表型的化疗药物。

在一种或多种实施方案中，所述的肿瘤为在基因毒药物处理后肿瘤微环境中产生衰老相关分泌表型的肿瘤，和/或为在基因毒药物后产生耐药性的肿瘤。

在一种或多种实施方案中，所述的肿瘤包括：前列腺癌，乳腺癌，肺癌，结直肠癌，胃癌，肝癌，胰腺癌，膀胱癌，皮肤癌，肾癌，食管癌、胆管癌、脑癌。

在一种或多种实施方案中，所述衰老相关分泌表型为DNA损伤导致的衰老相关分泌表型。

在一种或多种实施方案中，所述的DNA损伤为化疗药物造成的DNA损伤。

在一种或多种实施方案中，所述的化疗药物为基因毒药物；更佳地包括：米托蒽醌，阿霉素，博莱霉素。

在一种或多种实施方案中，所述化疗药物为米托蒽醌，米托蒽醌与丹参酚酸E的重量比例为1:20～80；较佳地，米托蒽醌与丹参酚酸E的重量比例为1:30～70；更佳地，米托蒽醌与丹参酚酸E的重量比例为1:40～60；或

所述化疗药物为博莱霉素，博莱霉素终浓度30～70ug/mL，较佳地40～60ug/mL更佳地45～55ug/mL；且丹参酚酸E终浓度200～550uM，较佳地250～500uM，更佳地300～420uM；或

所述化疗药物为博莱霉素，博莱霉素终浓度30～70ug/mL，较佳地40～60ug/mL更佳地45～55ug/mL；且丹参酚酸E终浓度700～5000uM，较佳地750～4000uM，更佳地750～3500uM；

所述化疗药物为阿霉素，阿霉素与丹参酚酸E的重量比例为1:4～16；较佳地，阿霉素与丹参酚酸E的重量比例为1:6～14；更佳地，阿霉素与丹参酚酸E的重量比例为1:8～12。

在本发明的第二方面，提供丹参酚酸E或其药学上可接受的盐、酯、异构体、溶剂合物或前药的应用，用于：

制备抑制衰老的组合物；或

制备延长寿命或延长晚年生存期的组合物；或

制备特异性靶向清除肿瘤微环境中衰老细胞的组合物，或

制备抑制衰老相关分泌表型的组合物；较佳地，所述丹参酚酸E特异性靶向诱导肿瘤微环境中衰老细胞进入死亡程序。

在本发明的第三方面，提供丹参酚酸E或其药学上可接受的盐、酯、异构体、溶剂合物或前药在制备药物或制剂中的用途，所述药物或制剂用于：下调衰老相关分泌表型(SASP)、降低SASP因子的表达或活性、降低细胞衰老标志性因子的表达或活性、诱导非增殖态细胞凋亡、减少或消除非增殖态细胞、延缓衰老、延长对象寿命、减少对象的年龄相关疾病负担、预防、缓解和治疗受益于非增殖态细胞减少或消除的疾病、降低对癌症疗法的耐药性、增强能诱导细胞衰老的试剂的功效、促进肿瘤消退、减小肿瘤体积、预防或治疗癌症、或延长癌症存活期。

在本发明的第四方面，提供一种组合物，包括：(a)丹参酚酸E化合物或其药学上可接受的盐、酯、异构体、溶剂合物或前药，和(b)给药后诱发肿瘤微环境发生衰老相关分泌表型的化疗药物。

在一种或多种实施方案中，所述化疗药物是基因毒药物。

在一种或多种实施方案中，所述化疗药物包括：米托蒽醌，阿霉素，博莱霉素。

在本发明的第五方面，提供一种药物组合物，包括：(a)丹参酚酸E化合物或其药学上可接受的盐、酯、异构体、溶剂合物或前药，和(b)给药后诱发肿瘤微环境发生衰老相关分泌表型的化疗药物，和任选的药学上可接受的辅料。

在一种或多种实施方案中，所述化疗药物是基因毒药物。

在本发明的第六方面，提供一种用于特异性靶向清除肿瘤微环境中衰老细胞以及抑制肿瘤的药盒，包括：丹参酚酸E化合物或其药学上可接受的盐、酯、异构体、溶剂合物或前药，以及化疗药物；其中，所述的化疗药物为给药后诱发肿瘤微环境发生衰老相关分泌表型的化疗药物。

在一种或多种实施方案中，所述化疗药物是基因毒药物。

在本发明的第七方面，提供一种制备抑制肿瘤的组合物、药物组合物或药盒的方法，包括：将丹参酚酸E化合物或其药学上可接受的盐、酯、异构体、溶剂合物或前药与化疗药物混合；或将丹参酚酸E化合物或其药学上可接受的盐、酯、异构体、溶剂合物或前药与化疗药物置于同一药盒中。

在一种或多种实施方案中，所述化疗药物是基因毒药物。

在本发明的第八方面，提供一种筛选促进丹参酚酸E清除肿瘤微环境中衰老细胞或抑制肿瘤或延长寿命的潜在物质的方法，所述方法包括：

(1)提供一肿瘤微环境体系，该体系包括肿瘤细胞和基质细胞；

(2)利用化疗药物处理(1)的体系、诱发肿瘤微环境发生衰老相关分泌表型，且在诱发肿瘤微环境发生衰老相关分泌表型之前、之时或之后，以丹参酚酸E进行处理；

(3)将候选物质加入到(2)的体系中，观测其对肿瘤微环境体系的作用，若所述候选物质在统计学上能够促进丹参酚酸E清除肿瘤微环境中衰老细胞，则该候选物质是可与丹参酚酸E联用于清除肿瘤微环境中衰老细胞或抑制肿瘤或延长寿命的潜在物质；

在一种或多种实施方案中，通过观测caspase-3/7活性或SASP因子的表达来评估细胞凋亡情况或衰老相关分泌表型的情况。

在一种或多种实施方案中，所述SASP因子包括但不限于：IL6、CXCL8、SPINK1、WNT16B、GM-CSF、MMP3、CXCL1、CXCL3、IL-1α、IL-1β；或，通过观测化疗动物衰老标记p16INK4A来评估细胞凋亡情况或衰老相关分泌表型的情况。

在本发明的第九方面，提供一种筛选抑制衰老相关分泌表型的潜在物质的方法，所述方法包括：

(1)提供一基质细胞体系，诱导该体系产生衰老相关分泌表型；在诱导该体系产生衰老相关分泌表型之前、之时或之后，以丹参酚酸E进行处理；

(2)将候选物质加入到(1)的体系中，观测其对该基质细胞体系的作用，若其能特异性促进丹参酚酸E对于衰老相关分泌表型的抑制作用，则该候选物质是可与丹参酚酸E联用、抑制衰老相关分泌表型的潜在物质。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1.增殖态人源基质细胞PSC27(早期代数如p10-20)在体外经过化疗药物博来霉素(BLEO)以50μg/ml浓度处理之后第7-10天，通过SA-β-Gal染色之后的结果。上图，代表性图片，下图，统计学数据。CTRL，对照细胞；BLEO，博来霉素处理后细胞。***，P<0.001。

图2.PSC27细胞经过化疗药物博来霉素(BLEO)处理之后，经过BrdU染色之后的结果。上图，代表性图片，下图，统计学数据。CTRL，对照细胞；BLEO，博来霉素处理后的细胞。****，P<0.0001。

图3.PSC27细胞经过化疗药物博来霉素(BLEO)处理之后，使用γH2AX经过免疫荧光染色(immunofluorescence staining)之后的结果。CTRL，对照细胞；BLEO，博来霉素处理后的细胞。***，P<0.001。根据细胞核内荧光点的数量，将其分为4类，包括0病灶,1～3病灶,4～10病灶和>10病灶的单个细胞。

图4.大规模筛选有机化学药库以获得具有抗衰老活性小分子化合物(包括天然和人工合成)的实验流程图。

图5.SAE的化学分子结构简图。

图6.RNA-seq数据分析之后的Heatmap显示BLEO损伤造成的衰老细胞中大量因子表达上调，但经过SAE处理之后有不少出现明显逆转。红星标识，典型SASP外泌因子。

图7.GSEA分析结果显示SASP特异性分子标记或相关因子的表达在BLEO造成的衰老细胞中集中上调，但在SAE处理衰老细胞之后发生显著下降。

图8.GSEA分析结果显示NF-κB分子标记或相关因子的表达在BLEO造成的衰老细胞中集中上调，但在SAE处理衰老细胞之后发生显著下降。

图9.KEGG通路分析SAE在衰老细胞中造成显著下调的100个分子在biologicalprocess上的代表性通路。

图10.KEGG通路分析SAE在衰老细胞中造成显著下调的100个分子在cellularcomponent上的代表性通路。

图11.荧光定量PCR(qRT-PCR)检测分析一组典型SASP分子在BLEO诱导形成的衰老细胞、被不同浓度的SAE处理条件下的相对表达水平。所有数据均为相比于CTRL组后的规范化结果。*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001。

图12.在SAE浓度递增的条件下，用SA-β-Gal染色确定PSC27的衰老与否。^,P>0.05；**,P<0.01；****,P<0.0001。其中，SAE在100μM，200μM，400μM，800μM，1600μM，2000μM和3000μM浓度下的P值为这些实验组的细胞阳性比例同0μM时的数据相比得出的统计学显著性。

图13.SA-β-Gal染色后PSC27在各种条件下的代表性图片。每组3个重复，上下排列。标尺，30μm。

图14.CCK8检测增殖态细胞同衰老组细胞在SAE渐增浓度下的存活率。每一SAE浓度下的P值均为CTRL和BLEO组之间相比后的显著性差异。**,P<0.01；***,P<0.001；****,P<0.0001。

图15.PSC27的群体倍增(population doubling,PD)测试。细胞在第10代(p10)时，受到BLEO损伤性处理，随后SAE在第8天时加入培养基。通过比较分析CTRL组，BLEO组，SAE组和BLEO/SAE组的倍增值(PD)确定SAE对于细胞增殖潜力的影响。^,P>0.05；***,P<0.001。

图16.SAE处理衰老细胞过程中诱导出现caspase 3/7活性。PSC27细胞经BLEO在培养条件下处理12h后逐渐进入衰老阶段。200μM的SAE在第7天开始加入衰老细胞的培养基，NucLight Rapid Red试剂用于标记细胞，而caspase 3/7试剂(IncuCyte)用于apoptosis检测。Caspase 3/7活性以每4小时的间隔检测一次(n＝3)。

图17.Pan-caspase抑制剂(20μM QVD-OPh)逆转SAE的senolytic活性(200μM的SAE用于这一实验,而1.25μM的ABT263作为阳性对照；后者为近年被报导的衰老细胞凋亡诱导剂)。统计学差异通过two-way ANOVA(Turkey”test)获得。

图18.流式细胞仪测定PSC27在几种条件下的细胞凋亡情况。Q2，早期凋亡细胞的分布区域；Q3，晚期凋亡细胞的分布区域。

图19.对比分析细胞经过BLEO和/或SAE处理之后的存活和凋亡数量。***,P<0.001；****,P<0.0001。

图20.预临床试验中小鼠给药方式示意图。人源基质细胞PSC27同癌细胞PC3在体外混合(1:4)之后移植入小鼠皮下形成移植瘤。在单药或组合式给药条件下经过多个治疗周期的处理，最终小鼠处死、病理分析其肿瘤组织有关分子表达变化。

图21.PSC27细胞的CTRL组和BLEO损伤组在体外同PC3混合之后，或者PC3细胞单独移植入小鼠皮下组织形成移植瘤。在第8周结束时解剖并获得肿瘤，检测、对比各组条件下肿瘤的体积。**,P<0.01；***,P<0.001；****,P<0.0001。

图22.预临床试验小鼠给药时间和给药方式示意图。每两周为一次给药周期，在第3/5/7周的第一天分别对小鼠腹腔给药MIT(mitoxantrone，米托蒽醌)。第5周第一天开始对小鼠进行腹腔SAE给药，每周一次。8周疗程结束后，解剖小鼠并进行病理鉴定与表达分析。

图23.肿瘤终端体积统计分析。化疗药物MIT单独或与抗衰老药SAE一起用于对小鼠给药，第8周结束之后对比分析各组肿瘤大小。

图24.临床前试验中PC3/PSC27荷瘤动物病灶中细胞衰老情况对比。SA-β-Gal染色之后代表性图片。标尺，100μm。

图25.小鼠体内肿瘤组织中SA-β-Gal染色阳性细胞百分比平行分析。^,P>0.05；*,P<0.05；****,P<0.0001。

图26.荧光定量PCR(qRT-PCR)检测分析小鼠病灶中上皮癌细胞和基质细胞中SASP典型因子的表达情况。通过LCM技术将基质细胞和癌细胞分别进行特异分离、制备总RNA并用于SASP表达检测。^,P>0.05；*,P<0.05；**,P<0.01。

图27.荧光定量PCR(qRT-PCR)检测分析vehicle、MIT和MIT/SAE给药之后的小鼠病灶中基质细胞SASP因子表达状态。*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001。

图28.用LCM技术将病灶中癌细胞进行特异分离之后分析各组小鼠中DNA损伤和凋亡比例。^,P>0.05；*,P<0.05；**,P<0.01。

图29.NOD/SCID小鼠在经过各种给药处理之后，无病生存期的Kaplan Meier数据对比。Vehicle,MIT,SAE和MIT/SAE组动物在体内肿瘤体积超过2000mm3时，即被认为严重疾病已经出现，小鼠需要及时处死并检测其荷瘤情况。^,P>0.05；**,P<0.01。

图30.各种不同给药处理条件下疗程结束时小鼠体重数据对比分析。^,P>0.05。

图31.以上不同给药处理条件下疗程结束时小鼠血清学数据对比分析。Creatinine,urine(肾脏指标),ALP和ALT(肝脏指标)数据平行对比。^,P>0.05。

图32.各种不同给药处理条件下疗程结束时免疫完整型小鼠(C57BL/6J)体重数据对比分析。^,P>0.05。

图33.预临床中不同给药处理条件下疗程结束时小鼠血细胞计数对比分析。WBC,lymphocyte和neutrophil单位体积数量平行对比。^,P>0.05。

图34.肿瘤终端体积统计分析。化疗药物DOX单独或与抗衰老药SAE一起用于对小鼠给药，第8周结束之后对比分析各组肿瘤大小。

图35.肿瘤终端体积统计分析。化疗药物BLEO单独或与抗衰老药SAE一起用于对小鼠给药，第8周结束之后对比分析各组肿瘤大小。

图36.肿瘤终端体积统计分析。化疗药物DOC单独或与抗衰老药SAE一起用于对小鼠给药，第8周结束之后对比分析各组肿瘤大小。

图37.肿瘤终端体积统计分析。化疗药物VIN单独或与抗衰老药SAE一起用于对小鼠给药，第8周结束之后对比分析各组肿瘤大小。

图38.肿瘤终端体积统计分析。化疗药物MIT单独或与丹参酚酸家族另一分子SAI一起用于对小鼠给药，第8周结束之后对比分析各组肿瘤大小。

图39.肿瘤终端体积统计分析。化疗药物MIT单独或与丹参酚酸家族另一分子SAJ一起用于对小鼠给药，第8周结束之后对比分析各组肿瘤大小。

图40.肿瘤终端体积统计分析。化疗药物MIT单独或与丹参酚酸提取物(SME)或绿茶提取物(GTE)一起用于对小鼠给药，第8周结束之后对比分析各组肿瘤大小。

图41.不同天然植物来源的提取物或小分子化合物在与化疗药物MIT联合治疗荷瘤小鼠时对于降低肿瘤体积效果的综合比较和全面分析。

图42.预临床阶段小鼠的疗后生存曲线。从24至27月龄时开始，C57BL/6J小鼠每两周经受一次Vehicle或SAE腹腔给药(Vehicle组n＝80；SAE组n＝91)。每组动物的中位生存期(median survival)经过计算并予以标明。****，P<0.0001。

图43.预临床阶段小鼠的总体(终生，或全长)生存曲线。从24至27月龄时开始，C57BL/6J小鼠每两周经受一次Vehicle或SAE腹腔给药(Vehicle组n＝80；SAE组n＝91)。每组动物一生中的中位生存期(median survival)经过计算并予以标明。****，P<0.0001。

发明详述

本发明人经过深入的研究，筛选靶向作用于肿瘤微环境、清除衰老细胞的药物，揭示了丹参酚酸E(SAE)通过靶向作用于肿瘤微环境、清除衰老细胞，在与化疗药物联合应用后，可以通过清除衰老的基质细胞而促进化疗药物对肿瘤的抑制，促进效果极其显著。对于衰老相关分泌表型(SASP)，所述SAE也能靶向清除其中的衰老细胞，从而抑制该SASP。并且，所述SAE还能显著延长动物寿命，显著延长老年生存期，提高动物生存质量。

本发明人发现，SAE尽管能够特异性靶向清除肿瘤微环境中衰老细胞，其自身并没有特异性抑制肿瘤细胞的效果；而化疗药物尽管能够抑制肿瘤细胞，其对于肿瘤微环境的影响很大，但能造成显著副作用尤其是SASP的形成和发展，且持续使用后易于导致癌细胞产生耐药性。而令人意外的是，SAE与一些特定化疗药物的联合应用，则可有效地发挥靶向于疾病的良性互补作用，达到出乎意料的增效效果。

丹参酚酸E(salvianolic acid,SAE)

本文所述“丹参酚酸E”，又名“丹酚酸E”、“Salvianolic acid E”、“SalE”、“SAE”，是从传统中药丹参中提取得到的单体化合物。分子式为C36H30O16，CAS号为142998-46-7。丹酚酸E在丹参中的含量很低，几乎没有关于其药理作用的研究报道。其化学结构如图5所示。

在本发明中，“化合物”(包括丹参酚酸E、其盐或前药等)可以是纯净形式存在的化合物，或纯度大于85％(较佳地大于90％，例如95％，98％，99％)的化合物。

本领域人员应理解，在得知了本发明化合物的结构以后，可通过多种本领域熟知的方法、利用公知的原料，来获得本发明的化合物，比如化学合成或从生物(如微生物)中提取的方法，这些方法均包含在本发明中。此外，丹参酚酸E还是商品化的药物，因此其成品是本领域技术人员易于获得的。

本发明还包括丹参酚酸E的药学上可接受的盐、酯、异构体、溶剂合物或前药，只要它们也具有与丹参酚酸E的化合物相同或基本相同的功能。本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。所述的“药学上可接受的盐”可以是丹参酚酸E的酸式盐和碱式盐。

“药学上可接受的酸式盐”是指可保持游离碱的生物活性和性质的盐，该类盐不会出现不理想的生物活性或其它方面的变化。该类盐可由无机酸构成，例如但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及类似的酸。该类盐还可由有机酸构成，例如但不限于乙酸、二氯乙酸、己二酸、褐藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、樟脑酸、樟脑磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基磺酸、1,2-乙二磺酸、乙烷磺酸、羟乙基磺酸、蚁酸、延胡索酸(fumaric acid)、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代戊二酸、甘油磷酸、羟基乙酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、顺丁烯二酸、苹果酸、丙二酸、苦杏仁酸、甲烷磺酸、粘酸、萘-1,5-二磺酸、2-萘磺酸、1-萘酚-2-甲酸、烟酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸、十一烯酸及类似酸。

“药学上可接受的碱式盐”是指可保持游离酸的生物活性和性质的盐，该类盐不会出现不理想的生物活性或其它方面的变化。这些盐通过向游离酸中加入无机碱或有机碱制成。通过无机碱得到的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐及类似盐。优选的无机盐为铵盐、钠盐、钾盐、钙盐以及镁盐。通过有机碱得到的盐包括但不限于一级、二级、三级铵盐，取代的胺包括天然取代的胺、环胺以及碱性离子交换树脂，例如氨气、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、丹醇、2-二甲氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、哈胺、胆碱、甜菜碱、苯乙苄胺、N,N‘-双苄基乙撑二胺、乙二胺、葡萄糖胺、甲葡糖胺、可可碱、三乙醇胺、缓血酸胺、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚酰胺树脂以及类似结构。优选的有机碱为异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。

本专利公开的化合物可以作为溶剂合物(如水合物)的形式存在，包括单水合物、二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物及类似结构。在本发明中，还包括丹参酚酸E的前药，所述的“前药”指当用适当的方法服用后，该前药在对象体内进行代谢或化学反应而转变成所需丹参酚酸E的一种化合物。

在本发明中，还包括丹参酚酸E的异构体。这是由于，化合物具有一个或多个不对称中心，所以这些化合物可以作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、顺式或反式异构体存在。

本领域人员应理解，在得知了本发明化合物的结构以后，可通过多种本领域熟知的方法、利用公知的原料，来获得本发明的化合物，比如化学合成或从生物(如动物或植物)中提取或在提取基础上进行改造的方法，这些方法均包含在本发明中。可以利用公知的方法来合成本发明的化合物；合成的化合物可以进一步通过柱层析法、高效液相色谱法等方式进一步纯化。此外，也可以通过商购的方式获得本发明的化合物。

发明人发现丹参酚酸E(SAE)可以有效抑制SASP的表达，并显著降低衰老细胞存活率。

因此，本发明提供丹参酚酸E在制备药物或制剂中的用途，所述药物或制剂用于：下调衰老相关分泌表型(SASP)、降低SASP因子的表达或活性、降低细胞衰老标志性因子的表达或活性、诱导非增殖态细胞凋亡、减少或消除非增殖态细胞、延缓衰老、延长对象寿命、减少对象的年龄相关疾病负担、预防、缓解和治疗受益于非增殖态细胞减少或消除的疾病、降低对癌症疗法的耐药性、促进肿瘤消退、减小肿瘤体积、预防或治疗癌症、或延长癌症存活期。本文中，“个体”、“对象”或“患者”指哺乳动物，尤其指人。

本文中，“消除”、“清除”和互换使用，表示物质利用细胞自身机制选择性破坏非增殖态细胞(衰老细胞)，达到细胞死亡并被清除的效果。在示例性实施方案中，物质(例如SAE)可通过诱导细胞凋亡来消除或清除非增殖态细胞。

本文所述“SASP因子”包括胞外基质蛋白、炎症性细胞因子及癌细胞生长因子。所述SASP因子可包括图26所示的因子或选自：IL6、CXCL8、MCP2、CXCL1、GM-CSF、MMP3、AREG、SFRP2、ANGPTL4、IL1a中的一种或多种。

本文所述“受益于非增殖态细胞减少或消除的疾病”通常是年龄相关疾病，包括但不限于癌症、心脑血管疾病、骨质疏松、年龄相关的退行性关节疾病(如关节炎)、代谢性疾病、神经退行性疾病。优选地，所述癌症是前列腺癌。

本文中，丹参酚酸E(SAE)还可用于延长对象寿命、减少对象的年龄相关疾病负担。在一些具体实施方案中，所述对象是年长对象，例如对应于至少20月龄小鼠或至少60岁人类的对象。优选地，所述年长对象是对应于至少24月龄小鼠或至少75岁人类的对象。更优选地，所述年长对象是对应于24-27月龄小鼠或75-90岁人类的对象。虽然具体实施例中采用年长对象作为研究对象，但这仅为便于进行结果分析的示例(例如年长对象的年龄相关疾病较多)。基于本发明发现的丹参酚酸E消除衰老细胞的功效，本领域技术人员应知晓它们可用于任何年龄的对象来消除衰老细胞、延长寿命、减少年龄相关疾病负担。

本文中，丹参酚酸E(SAE)还可用于降低患者对癌症疗法的耐药性。所述癌症疗法包括化疗或辐射疗法；化疗例如MIT或DOX等细胞毒疗法，辐射治疗例如电离辐射，主要包括α、β、γ和X射线以及质子、中子流治疗等。

此外，发明人发现，当与某些试剂联用时，丹参酚酸E(SAE)可以增强诱导细胞衰老的试剂的细胞毒性。诱导细胞衰老的试剂可以是通过导致DNA损伤和/或细胞凋亡而诱导产生衰老细胞的试剂，例如化疗剂或放射线。

因此，本发明还提供丹参酚酸E在增强诱导细胞衰老的试剂的功效中的用途，以及丹参酚酸E和诱导细胞衰老的试剂的联用在促进肿瘤消退、减小肿瘤体积、预防或治疗癌症、延长癌症存活期中的用途。示例性的，所述细胞是肿瘤细胞；所述肿瘤是前列腺肿瘤；所述癌症是前列腺癌。

在本发明的另一方面提供一种实现上述用途的方法，所述方法包括用(a)本文所述丹参酚酸E，及其药学上可接受的盐、酯、异构体、溶剂合物或前药，和任选的(b)能诱导对象产生衰老细胞的试剂处理衰老细胞或将其给予有需要的对象。本文所用术语“给予”或“给药”是指向患有待治疗或预防的疾病或病症或具有其风险的对象提供本发明的化合物或药物组合物。

丹参酚酸E(salvianolic acid,SAE)的组合物、药物组合物

本发明的组合物(如，药物组合物)以丹参酚酸E、或其盐、酯、异构体、溶剂合物、前药等物质作为活性组分。如上所述，含有丹参酚酸E(SAE)可以下调衰老相关分泌表型(SASP)、降低SASP因子的表达或活性、降低细胞衰老标志性因子的表达或活性、诱导非增殖态细胞(衰老细胞)凋亡、减少或消除非增殖态细胞(衰老细胞)、延缓衰老、延长对象寿命、减少对象的年龄相关疾病负担、预防、缓解和治疗受益于非增殖态细胞减少或消除的疾病、降低对癌症疗法的耐药性。

本发明中，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

当所述组合物还包含基因毒药物(例如化疗剂)作为活性组分时，所述组合物可促进肿瘤消退、减小肿瘤体积、预防或治疗癌症、延长癌症存活期。

本文所述组合物作为药物使用时，也可以称为药物组合物，其还包含药学上可接受的辅料。“药学上可接受的辅料”是用于将本发明组合物中的活性组分(例如丹参酚酸E和可选的基因毒药物)传送给动物或人的药学上或食品上可接受的载体、溶剂、悬浮剂或赋形剂。示例性的辅料可以是液体或固体，包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，碳水化合物，佐剂，抗氧化剂，螯合剂，离子强度增强剂、防腐剂、载剂、助流剂、甜味剂、染料/着色剂、增味剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂、乳化剂、喷雾剂、压缩空气或其它适宜的气体，或其它适宜的与药效化合物合用的非活性成分。更具体而言，合适的辅料可以是本领域常用于小分子化合物给药的辅料。辅料的示例包括各种乳糖、甘露醇，油类如玉米油，缓冲剂如PBS、盐水、聚乙二醇、甘油、聚丙二醇、二甲亚砜，酰胺如二甲基乙酰胺，蛋白质如白蛋白，和去污剂如吐温80，单糖和低聚多糖如葡萄糖、乳糖、环糊精和淀粉。

通常，组合物中含有治疗有效量的本文所述活性组分。治疗有效量是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解疾病或病症的剂量。本发明所述的SAE的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的SAE的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。可根据患者年龄、性别、所患病症及其严重程度、患者的其它身体状况等因素确定治疗有效量。治疗有效量可作为单一剂量施用，或者可依据有效的治疗方案在多个剂量中给药。本文中，受试者或患者通常指哺乳动物，尤其指人。示例性地，所述组合物含有按照重量比例，例如为0.001-50％，优选0.01-30％，更优选0.05-10％的活性组分(例如丹参酚酸E和可选的基因毒药物)。

在特定条件下，senolytic药物的使用频率可能取决于衰老细胞的积累速度，而衰老细胞的积累速度可能会因细胞衰老发生的环境而异。例如，反复接触破坏DNA的癌症疗法或持续的高脂肪饮食，可能会比自然衰老更迅速地导致衰老细胞的重新累积。间歇性使用senolytics可以降低患者产生不良反应的风险，并允许在健康期间使用senolytics。此外，间歇给药还可以减少senolytics产生的副作用并降低患者产生耐药性的可能性。与抗癌药物或抗生素的情况相反，因为衰老细胞不发生分裂，因此机体无法依赖细胞增殖产生senolytics抗性，从而无法获得有利的突变，这可为临床中广泛使用senolytics创造良好的基础。

本发明的药物组合物或混合物可以通过常规方法制成任何常规的制剂形式。剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物体内的剂型都是可以的。比如可选自：注射剂，输液剂，片剂，胶囊剂，丸剂。其中活性组分(例如丹参酚酸E和可选的基因毒药物)可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中。本发明的活性组分的混合物或药物组合物也可储存在适宜于注射或滴注的消毒器具中。组合物中活性组分(例如丹参酚酸E和可选的基因毒药物)的有效剂量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化，这可以根据临床医师的经验和建议。

本发明的具体实施例中，提出了丹参酚酸E和可选的基因毒药物按照不同摩尔比或质量比的一系列给药方案。本发明中，也运用了小鼠作为实验动物，从小鼠的给药剂量换算为适用于人类的给药剂量是本领域技术人员易于作出的，例如可根据Meeh-Rubner公式来进行计算：

A＝k×(W2/3)/10000。

式中A为体表面积，以m2计算；W为体重，以g计算；K为常数，随动物种类而不同，小鼠和大鼠9.1，豚鼠9.8，兔10.1，猫9.9，狗11.2，猴11.8，人10.6。应理解的是，根据药物以及临床情形的不同，根据有经验的药师的评估，给药剂量的换算是可以变化的。

丹参酚酸E和可选的基因毒药物或药物组合物可通过口服以及静脉、肌肉或皮下等途径给药。优选地可以是口服给药。适应于口服的药物形式包括但不限于片剂、粉剂、胶囊剂、缓释剂等。适应于注射的药物形式包括：无菌水溶液或分散液和无菌粉。在所有情况中，这些形式必须是无菌的且必须是流体以易于注射器排出流体。必要的时候，丹参酚酸E和可选的基因毒药物还可与其它活性成分或药物联合给药。

本发明还提供了一种用于下调或清除衰老细胞，或延长机体生存期的药盒或试剂盒，所述药盒或试剂盒含有本文任一实施方案所述的药物组合物。或者，所述的药盒或试剂盒含有本文所述的丹参酚酸E和可选的基因毒药物的混合物。或者，所述药盒或试剂盒中含有：容器1，以及置于容器1中的本文所述丹参酚酸E或其药学上可接受的盐、水合物或前药；和容器2，以及置于容器2中的基因毒药物。

所述药盒或试剂盒中还可以含有一些辅助用药的材料，例如使用或施用各种剂型的组合物所需的量具、容器例如注射器等。所述药盒或试剂盒中还可含有使用说明书，说明治疗下调或清除衰老细胞或延长机体生存期的方法。

丹参酚酸E(salvianolic acid,SAE)或其与化疗药物的联合应用

如前所述，本发明人发现，丹参酚酸E(SAE)与一些特定化疗药物的联合应用，可有效地发挥靶向于疾病的良性互补作用，达到极其显著的增效效果。

在抑制SASP表达的药物的筛选中，本发明人发现，尽管SASP因子一般会在衰老细胞中明显上调，但SAE处理之后的衰老细胞中SASP因子的表达普遍降低，这一效应非常明显。

在本发明人的研究中还发现，SAE在适当的浓度下对衰老细胞的杀伤效果非常理想。例如，在一些实施例中，本发明人发现，当SAE在2000μM时达到阈值，衰老细胞此时剩余20％或更低。因此，在一定的浓度下，SAE是一种新型的senolytics，且呈现了优异的效果。靶向特异性非常好。

本发明人的研究中还发现，基质细胞经基因毒药物(例如MIT)处理后群体倍增；与损伤性处理之后迅速进入生长停滞状态的细胞相比，基因毒药物和SAE的联合治疗组表现出显著增高的群体倍增(PD)能力。基质细胞经基因毒性处理后的群体倍增，与损伤性处理之后迅速进入生长停滞状态的细胞相比，基因毒药物和SAE的联合治疗组表现出显著增高的PD能力。SAE与基因毒药物联用可以使得基质细胞在短期内迅速恢复增殖潜力，这与基因毒药物单药使用形成鲜明对照，这是令人惊讶的。SAE本身不影响增殖细胞的PD，这一数据进一步表明，SAE在衰老细胞与正常细胞之间具有选择性、靶向特异性。

本发明人的研究中还发现，肿瘤移植于动物体后，同由PC3癌细胞和原代PSC27基质细胞组成的移植肿瘤相比，由PC3细胞和衰老PSC27细胞组成的异种移植物(xenograft)体积显著增加。对单独运用MIT治疗后的治疗组相比，SAE联合MIT给药可显著减小肿瘤；与MIT相比，肿瘤体积减少55.1％；与安慰剂治疗相比，肿瘤体积减少74.6％。这一抑制效果令人意外。

本发明人也发现，MIT给药过程诱导了肿瘤组织中大量衰老细胞的出现。然而，SAE给药则将这些化疗动物病灶内的大多数衰老细胞基本耗尽。MIT给药后，SASP因子的表达显著升高(主要发生在基质细胞中)；然而，在使用SAE给药时，这一变化在很大程度上被逆转。当MIT处理的动物与SAE一起使用时，DNA损伤或凋亡的指数明显增强，这意味着这些衰老药物处理条件下的动物体内肿瘤位点细胞毒性增强；当SAE在治疗上应用时，细胞凋亡的典型标志caspase 3/4活性显著升高。同时，接受MIT/SAE组合治疗的小鼠表现出最长的中位生存期；存活期大大延长。由此可见，SAE治疗性靶向衰老细胞可促进肿瘤的抑制并降低化疗耐药。

本发明人的研究中还发现，小鼠在每两周服用一次药物的治疗方案下，从24-27个月年龄(相当于人类75-90岁的年龄)开始给药的SAE组，其治疗后中位生存期比Vehicle组延长72.8％，同时具有较低的死亡危险，表明SAE介导的衰老细胞清除可以降低老年小鼠的死亡风险，并有效延长其生存期。间歇性提供SAE这种具有生物活性的抗衰老药物，可以通过清除微环境中衰老细胞的方式，显著减少衰老机体的疾病负担，并可以增加治疗后阶段机体的寿命。这种治疗方式，并不会导致显著上升的机体发病率，在现实中可以在生命的晚期阶段安全使用。

基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种SAE的用途，用于制备特异性靶向清除肿瘤微环境中衰老细胞及抑制肿瘤的组合物；或制备抑制衰老相关分泌表型的组合物。

如本发明所用，除非另外说明，所述的“肿瘤”为在基因毒药物处理后肿瘤微环境中产生衰老相关分泌表型的肿瘤，和/或为在基因毒药物后产生耐药性的肿瘤。较佳地包括：前列腺癌，乳腺癌，肺癌，结直肠癌，胃癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、皮肤癌，肾癌，食管癌、胆管癌、脑癌。

如本发明所用，除非另外说明，所述的“化疗药物”为给药后诱发肿瘤微环境发生衰老相关分泌表型(SASP)的化疗药物。

在本发明的一些方式中，所述“衰老相关分泌表型”为DNA损伤情况下发生的衰老相关分泌表型；较佳地，所述的DNA损伤为化疗药物造成的DNA损伤；更佳地，所述化疗药物包括基因毒药物。

药物筛选

在得知了SAE与肿瘤微环境或SASP的密切相关性及其工作机制后，可以基于该特征来筛选进一步优化抑制效果的药物。可从所述的物质中找到靶向作用于肿瘤微环境中的衰老细胞，对于抑制肿瘤、逆转肿瘤耐药性或抑制/延缓衰老相关分泌表型真正有用的药物。或可从所述的物质中找到与SAE联合并发挥增效作用的一种或多种物质。

因此，本发明提供一种筛选促进化疗药物抑制肿瘤的潜在物质的方法，所述方法包括：(1)提供一肿瘤微环境体系，该体系包括肿瘤细胞和基质细胞；(2)利用化疗药物处理(1)的体系，诱发肿瘤微环境发生衰老相关分泌表型；(3)将候选物质加入到(2)的体系中，观测其对肿瘤微环境体系的作用，若其能特异性靶向清除肿瘤微环境中衰老细胞和/或促进基质细胞(为非衰老的细胞)生长(提高基质细胞培增速度)，则其是促进化疗药物抑制肿瘤的潜在物质。在更为优选的方式中，步骤(2)中，还包括：在诱发肿瘤微环境发生衰老相关分泌表型之前、之时或之后，以SAE进行处理；步骤(3)中，还包括：若所述候选物质在统计学上能够促进SAE清除肿瘤微环境中衰老细胞和/或促进基质细胞生长，则该候选物质是可与SAE联用、抑制肿瘤的潜在物质。

本发明也提供了一种筛选抑制衰老相关分泌表型的潜在物质的方法，所述方法包括：(1)提供一基质细胞体系，诱导该体系产生衰老相关分泌表型；(2)将候选物质加入到(1)的体系中，观测其对该基质细胞体系的作用，若其能特异性促进丹参对于衰老相关分泌表型的抑制作用，则该候选物质是可与SAE联用、抑制衰老相关分泌表型的潜在物质。

在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到测试组中相应指标的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质、但其它条件与测试组相同的体系。

作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于抑制肿瘤、逆转肿瘤耐药性或抑制/延缓衰老相关分泌表型真正有用的物质。

另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的抑制肿瘤、逆转肿瘤耐药性或抑制/延缓衰老相关分泌表型的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出真正有用的药物。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

具体实施方式

材料和方法

1.细胞培养

(1)细胞系维持

正常人源前列腺原代基质细胞系PSC27(获自美国Fred Hutchinson Cancer研究Research Center)于37℃和5％ CO2条件的培养箱中培养，在PSCC完全培养液中增殖和传代。

(2)细胞冻存与复苏

a.细胞冻存

以0.25％胰蛋白酶收集对数生长期细胞，1000rpm离心2min，弃去上清，重新悬浮细胞于新鲜配置的冻存液中。分装细胞于已标示的无菌冻存管中。然后经梯度降温，最后转入液氮中长期储存。

b.细胞复苏

取出液氮中冻存的细胞，立即放入37℃水浴，使其快速融化。直接加入2ml细胞培养液，使细胞均匀悬浮。待细胞贴壁后，更换新的培养液。

(3)体外实验处理

为造成细胞损伤，PSC27细胞生长至80％(简称PSC27-CTRL)时培养液中加入50μg/ml博来霉素(bleomycin,BLEO)。药物处理12小时后，细胞被PBS简单洗过3次，留置于培养液中7-10天，然后进行后续实验。

2.天然产物库的筛选

针对一个涵盖1470种小分子化合物、多为药用植物来源并有一定抗衰老潜力物质的有机化学药库(TOPSCIENCE)进行药效学分析。将各种产物分别按照一定浓度梯度稀释至96孔板，密度为每孔5000个细胞。培养基使用DMEM，天然产物(或化合物)的工作浓度一般控制在1μM-l mM。药物处理后3-7天，细胞增殖用CCK-8Cell Counting Kit试剂盒(基于WST-8原理，Vazyme)测定，细胞凋亡活性以Caspase 3/7activity kit(Promega)确定。

初步确定的候选药物进一步筛选30天。将进入第二轮候选范围的药物稀释到6孔板中，每孔20,000个细胞。培养基和候选药物每隔一天更换一次。为确定每种药物对细胞表型和存活率等的影响，项目根据不同浓度的药物进行验证性分析。

3.免疫印记和免疫荧光检测

用NuPAGE 4-12％ Bis-Tris gel分离细胞裂解来源蛋白质，并转移到硝化纤维素膜(Life Technologies)上。用5％脱脂牛奶在室温下阻断印迹1h，在4℃下与所需的一抗在制造商协议的浓度下孵育一夜，然后在室温下与辣根过氧化物酶结合二抗(Santa Cruz)孵育1h，用增强化学发光(ECL)检测试剂(Millipore)按照制造商的协议开展膜印迹信号检测，并使用ImageQuant LAS 400Phospho-Imager(GE Healthcare)。作为一种标准的蛋白质标记，使用Thermo Fisher Scientific公司提供的PageRuler Plus Prestained ProteinLadder(no.26619)。

对于免疫荧光染色，目标细胞在培养皿中培养之后在coverslip上预种至少24h。在短暂洗涤后，用4％多聚甲醛在PBS中固定8min，用5％正常山羊血清(NGS,ThermoFisher)阻断30min。小鼠单克隆抗体anti-phospho-Histone H2A.X(Ser139)(cloneJBW301,Millipore)和小鼠单克隆抗体anti-BrdU(Cat#347580，BD Biosciences)，及二级抗体Alexa488(or 594)-conjugated F(ab‘)2按顺序加入到覆有固定细胞的载玻片上。细胞核用2μg/ml of 4‘,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)进行复染。从3个观察视野中选取最具代表性的一张图像进行数据分析和结果展示。FV1000激光扫描共聚焦显微镜(Olympus)用于获取细胞共聚焦荧光图像。

4.全转录组测序分析(RNA-sequencing)

对不同处理条件下的人源前列腺原代基质细胞系PSC27进行全转录组测序。从基质细胞中获得总RNA样本。其完整性经Bioanalyzer 2100(Agilent)验证，RNA用IlluminaHiSeq X10测序，基因表达水平由软件包rsem(https://deweylab.github.io/rsem/)进行量化。简而言之，以RiboMinus Eukaryote kit(Qiagen,Valencia,CA,USA)消除RNA样品中的rRNA；并根据制造商的指示，在深度测序前用TruSeq Stranded Total RNA preparationkits(Illumina,San Diego,CA,USA)构建链特异性RNA-seq文库。

Paired-end transcriptomic reads取被映射到参考基因组(GRCh38/hg38)，并使用Bowtie工具从Gencode v27进行参考注释。使用picard tools(1.98)脚本标记重复项(https://github.com/broadinstitute/picard)识别重复读取，只保留非重复读取。Reference splice junctions由参考转录组提供(Ensembl build 73)。用Cufflinks计算FPKM值，用Cufflinks,最大似然估计函数调用差异基因表达。表达显著变化的基因由falsediscovery rate(FDR)-corrected P value<0.05定义，仅用状态“Known”和生物型“coding”的ensembl genes 73进行下游分析。

接下来使用Trim Galore(v0.3.0)(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/)修剪Reads，而质量评估使用FastQC(v0.10.0)(http://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc/)。随后，利用DAVIDbioinformatics platform(https://david.ncifcrf.gov/),、Ingenuity PathwaysAnalysis(IPA)program(http://www.ingenuity.com/index.html)。在Majorbio I-SangerCloud Platform(www.i-sanger.com)免费在线平台上对原始数据进行了初步分析，并将原始数据存入NCBI Gene Expression Omnibus(GEO)database数据库，登录代码为GSE156448。

5.蛋白质-蛋白质相互作用网络分析

用STRING3.0进行蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)分析。将符合标准的特定蛋白质导入在线分析软件(http://www.networkanalyst.ca)，选择一个最小交互网络进行进一步的集线器和模块分析。

6.基因集富集分析(GSEA)

基于RNA-seq初步分析所得数据，对于每个差异表达显著基因分析比较，基因是使用从DESeq2获得的“wald statistics”进行排序的，GSEA是在MSigDB(http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb)中可用的所有规划基因集的这些排序列表上进行的)。DESeq2 independent filtering是基于归一化读取计数的平均值，筛选出表达水平很低的基因。SASP和GSEA signature如我们过往发表文献所述(Zhang等人，2018a)。

7.定量PCR(RT-PCR)测定基因表达

(1)细胞总RNA的提取

以Trizol试剂抽提处于生长期或停滞期细胞的总RNA，每T25培养瓶细胞加入1mlTrizol，用细胞刮刀刮下细胞层后将其转移至离心管中，充分混匀至不粘稠。每1ml Trizol加0.2ml氯仿，剧烈震荡15sec，室温孵育5-10min；4℃，11,000g离心15min；将无色上清液移入一新的离心管中，按每1ml Trizol加0.5ml异丙醇，室温孵育10分钟，11,000g，4℃离心10min；倒掉上清，用75％乙醇(每1ml Trizol至少用1ml 75％乙醇)洗涤，4℃，7,500g离心5min；室温干燥RNA沉淀5-10分钟(RNA不能干燥)，用DEPC-H2O溶解沉淀。

分光光度计定量RNA之后，取少量总RNA进行1％琼脂糖电泳，检查RNA状态和质量。

(2)逆转录反应

OligodT23 VN(50uM) 1ul

Total RNA 1-2ug

RNase Free ddH2O to 8ul

65℃加热5min，迅速置于冰上骤冷，并静置2min。

配置第一链cDNA合成液

2x RT Mix 10ul

HiScript II Enzyme Mix 2ul

按照以下条件进行第一链cDNA合成：

25℃ 5min

50℃ 45min

85℃ 5min

(3)实时定量PCR反应

将逆转录反应产物cDNA稀释50倍作为模板。

按照以上标准加样，反应条件为：95℃预变性15sec，然后95℃5sec，60℃31sec，40个循环；融解曲线条件为95℃15sec，60℃30sec，95℃15sec。样品于ABI ViiA7(ABI)仪上进行反应。以β-actin的表达作内参。反应完成后，经软件分析查看每个基因的扩增情况，导出相应的域值循环数，采用2-ΔΔCt方法，计算每个基因的相对表达量。对融解曲线(meltingcurve)的波峰和波形进行分析以确定得到的扩增产物是否为特异性单一目的片段。

8.SA-β-Gal染色

衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色，操作执行以往报道程序(Debacq-Chainiaux等人，2009年)。简单地说，细胞培养皿中经PBS洗涤，在室温下固定。在2％甲醛和0.2％戊二醛中作用3min，用以固定细胞。然后用新制备的染色液对SA-β-Gal进行染色，在37℃下过夜。第二天拍摄图像并计算单位面积内阳性细胞百分比。

9.克隆扩增实验

单细胞克隆扩增实验，按过往文献所述进行(Duan等人，2015年；Wu等人，2018年)。简单地说，细胞被铺板于明胶涂层的12孔板，密度为2000个细胞/孔。结晶紫染色之后计算细胞克隆数。

10.药物诱导衰老细胞凋亡

将PSC27细胞铺板于96孔皿中，在50μg/ml的BLEO处理下诱导细胞衰老。分别以200μM和1.25μM的浓度加入SAE和ABT263。细胞培养基配以Incucyte Nuclight快速红色试剂(Essen Bioscience)和IncucyteC-3/7细胞凋亡试剂(Essen Bioscience)。选取代表性视野进行拍照。

11.小鼠移植瘤接种和预临床治疗试验

所有实验小鼠实验均严格遵循中国科学院上海生命科学研究院实验动物看护和使用委员会(IACUC)的有关规章进行。年龄6-8周的免疫缺陷型小鼠(NOD-SCID mice,ICR)(体重约25g)用于本专利相关动物实验。基质细胞PSC27和上皮细胞PC3以1:4预先确定的比例混合，而每一移植体包含1.25×106细胞，用于组织重构。移植瘤通过皮下移植方式植入小鼠体内，移植手术结束之后8周末动物被执行安乐死。肿瘤体积按照如下公式计算：V＝(/6)x((l+w)/2)3(V,体积；l,长度；w,宽度)。

在预临床治疗试验中，经过皮下移植的小鼠被供给标准实验食谱，2周之后实施化疗药物米托蒽醌(MIT,0.2mg/kg剂量)和/或SAE(500μl,10mg/kg剂量)腹腔给药。时间点为：前者在第3,5,7周的第一天，后者在第5,7周的第一天。整个疗程共进行3次MIT循环给药，每个循环为2周。疗程结束后，小鼠肿瘤被收集用于体积测量和组织学分析。每只小鼠累积性共接受MIT这一药物0.6mg/kg体重，SAE则为30mg/kg体重。为造成全身范围SASP因子在化疗诱导下表达，MIT按照以上步骤和顺序，经过静脉输注方式对小鼠给药，但剂量下降至0.1mg/kg体重/每次(整个疗程累计接受MIT剂量为0.3mg/kg体重)以减轻药物相关毒性。化疗试验进行到第8周末结束，小鼠处死之后立即解剖，其移植瘤被收集并用于病理系统分析。

12.小鼠寿命研究

在细胞移植研究中，发明人在SPF动物平台通过连续饲养获得了16个月大的雄性C57BL/6J小鼠，每个笼子里有4到5只动物。发明人首先按体重从低到高对小鼠进行分类，然后选择了体重相似的小鼠。接下来，衰老(SEN)或对照(CTRL)移植治疗方式，则使用随机数产生器被分配给每间隔一次的小鼠，而中间的小鼠被分配到另一种治疗方式中，从而使衰老和对照移植小鼠的体重匹配。细胞移植1个月后，当小鼠年龄为18个月时，进行身体功能测试。在那之后，除了检查它们的笼子外，没有对这些老鼠进行进一步的测试。最早的死亡发生在上次身体功能测试后大约2个月。19至21个月大的C57BL/6J小鼠，每个笼子里安放有3-5只。与移植小鼠一样，小鼠根据体重进行分类，并随机分配给每一组，由不知道预临床试验设计的人进行对照组(vehicle)或药物组(SAE)组处理。从24-27个月龄开始，小鼠每2周用vehicle或SAE治疗一次，每次连续3天口服灌胃。在研究过程中，一些老鼠被从原来的笼子移走，以尽量避免在单一笼子中长期饲养产生的动物居住压力。RotaRod和hanging测试每月进行，因为这些测试是敏感和无创的。试验结束时，对小鼠进行安乐死；如果它们表现出以下几种症状之一，就认为它们已经死亡：(一)不能饮水或吃饭；(二)即使有刺激也不愿意移动；(三)快速减肥；(四)严重的平衡障碍；或(五)机体出血或出现溃疡肿瘤。试验过程中，没有老鼠因为打架、意外死亡或皮炎而被排除在外。进行生物统计时，采用Coxproportional hazard model进行生存分析。

13.预临床动物死后病理检查

研究人员每天对笼子进行检查，并将死鼠从笼子中取出。在动物死亡24小时内，尸体被打开(腹腔、胸腔和颅骨)，并单独保存在10％福尔马林中至少7天。分解或破坏的身体被排除在外。保存的尸体被运到Autopsy专用地点进行病理检查。评估肿瘤负担(每个小鼠不同类型肿瘤的总和)，疾病负担(每个小鼠主要器官不同组织病理学变化的总和)，每个病变的严重程度和炎症(淋巴细胞浸润)。

14.生物发光成像

小鼠腹腔注射3mg荧光素(BioVision,Milpitas,CA)，以体积200μl的PBS递送。小鼠用异氟烷麻醉，使用Xenogen IVIS 200System(Caliper Life Sciences,Hopkinton,MA)获取生物发光图像。

15.体能检测

所有检测均在最后一次安慰剂或药物处理后的第5天开始。最大步行速度采用加速RotaRod System(TSE System,Chesterfiled,MO)进行评估。在RotaRod上小鼠被训练3天，速度分别为4，6和8r.p.m，第1、2和3天历时200秒。在测试日，小鼠被放置在RotaRod上，在4r.p.m速度下开始。以5分钟为间隔，转速由4加速到40r.p.m。当老鼠从RotaRod上掉下来时，速度被记录下来。最终结果从3或4个试验中取平均值，并规范为基线速度。在前两个月内训练过的小鼠不再接受训练。

前肢握力(N)使用Grip Strength Meter(Columbus Instruments,Columbus,OH)测定，结果来自超过10个试验的平均值。对于悬挂耐力试验，小鼠被放置在一个2毫米厚的金属线上，后者位于垫子上方35厘米处。小鼠只被允许用前肢抓住电线，悬挂时间根据体重进行规范化，表示为悬挂持续时间(sec)×体重(g)。结果取每只小鼠2到3次实验的平均值。通过Comprehensive Laboratory Animal Monitoring System(CLAMS)监测24小时(12小时光照和12小时黑暗)的日常活动和食物摄入量。CLAMS系统配备了Oxymax Open CircuitCalorimeter System(Columbus Instruments)。对于跑步机性能，小鼠在5°倾斜度下适应在电动跑补机(Columbus Instruments)上跑步，经过3天训练，每天持续5分钟，以5米/分钟的速度开始2分钟，继而加速至到7米/分钟2分钟，然后9米/分钟1分钟。在试验当日，小鼠在跑步机上以5米/分钟的初始速度跑步2分钟，然后每2分钟增加2米/分钟的速度，直到小鼠筋疲力尽。疲劳被定义为即便有轻微的电击刺激和机械刺激，小鼠仍无法回到跑步机上。试验结束后记录距离，用下列公式计算总功(KJ)：质量(kg)×g(9.8m/s2)×距离(m)×sin(5°)。

16.生物统计学方法

本专利申请中所有涉及细胞增殖率，存活率和SA-β-Gal染色等的体外实验和小鼠移植瘤及预临床药物处理的体内试验均重复3次以上，数据以均值±标准误的形式呈现。统计学分析建立在原始数据的基础上，通过one-way analysis of variance(ANOVA)or atwo-tailed Student‘s t-test进行计算，而P<0.05的结果认作具有显著性差异。

因素之间的相关性用Pearson”s correlation coefficients检验。当小鼠在几个队列中获得并分组在笼子中时，采用Cox proportional hazard model进行生存分析。该模型将治疗的性别和年龄作为固定效应，队列和初始笼分配作为随机效应。由于在研究中，一些小鼠被从最初的笼子中移动，以尽量减少来自单笼外壳的压力，还进行了没有笼效应的分析。这两种分析的结果在方向性或统计意义上没有很大差异，增强了对结果的自信度。生存分析使用statistical software R(version 3.4.1；library“coxme”)。在大多数实验和结果评估中，研究者对分配采取盲选。发明人使用基线体重将小鼠分配至实验组(以实现组间相似的体重)，因此只在与体重匹配的组内进行随机化。根据过往的实验确定样本量，因此没有使用statistical power analysis。本研究中的所有重复都来自不同的样本，每个样本来自不同的实验动物。

实施例1.SAE在低浓度下使用时可以有效抑制SASP的表达

1.SAE在低浓度下使用时可以有效抑制SASP的表达

为了鉴定能有效调节衰老细胞表型的创新化合物，利用一个由1470种小分子组成的有机化学药库开展了无偏倚性筛选。为了检测这些药物的药效和潜在的生物价值，选择使用原发性正常人前列腺基质细胞系，即PSC27作为体外细胞模型。PSC27主要由成纤维细胞组成，而非成纤维细胞系(包括内皮细胞和平滑肌细胞)也存在，但比例较小，PSC27在性质上是人源原代基质细胞系，在暴露于基因毒化疗(genotoxic chemotherapy)或电离辐射(ionizing radiation)等胁迫因素后形成典型的SASP。用预实验中已经优化过的方式，即特定剂量的博莱霉素(BLEO)处理这些细胞，并观察到衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色阳性率明显升高，BrdU掺入率大幅降低，DNA损伤修复灶(DDR病灶)在药物损伤后的数天内显著升高(图1-3)。通过高通量高内涵系统筛选的方式来平行比较这些天然药物产品对衰老细胞表达谱的影响(图4)。

对这些细胞进行了RNA-seq测序。而随后获得的高通量数据表明，一种小分子化合物，丹参酚酸E(salvianolic acid,SAE)(图5)，显著改变了衰老细胞的表达谱。其中上千个基因出现显著下调，同时多个基因发生上调。重要的是，SAE处理之后的衰老细胞中SASP因子的表达普遍降低，而这些SASP因子一般会在衰老细胞中明显上调(图6)。虽然一些SASP不相关基因的表达情况与那些典型的SASP因子表现出类似的趋势，但GSEA分析的数据进一步揭示了表征SASP表达或NF-KB激活的分子标签的显著抑制，后者是介导促炎SASP发展的主要转录性事件(图7，图8)。进一步的GO生物信息学数据表明，这些分子在功能上参与了一组重要生物过程，包括信号转导、细胞间通讯、细胞代谢、能量调节、核苷酸代谢和蛋白代谢(图9)。这些下调基因中的大多数，除了在细胞核中发挥一定作用，本质上属于表达后即释放至胞外空间的蛋白质，或位于质膜上或细胞质中，总体而言在特征上与这些分子的分泌性质相互呼应(图10)。

为了进一步证实SAE在体外条件下对SASP表达的影响，在一系列体外浓度梯度下处理了PSC27细胞。数据表明，工作浓度在50μM时的SAE以最大的效率抑制了SASP发生发展(图11)。然而，较低或较高浓度的这种药物的疗效却不理想，尽管后者可能与这种药物的细胞毒性增加引起的细胞应激反应有关(图11)。因此，SAE这一植物来源的天然小分子化合物，可用于控制衰老细胞的促炎表型，即SASP，尤其在相对低浓度下使用更彰显其效果。

实施例2.当在高浓度使用时SAE是一种新型的senolytics

鉴于SAE在控制SASP表达方面的显著疗效，接下来探究了这种天然产物在较高浓度下杀死衰老细胞的潜力。为此，测量了随着SAE浓度的增加，体外条件下所处理的衰老细胞的生存百分比。SA-β-Gal染色数据表明，在SAE浓度达到200μM之前，衰老细胞基本不会被消除(图12)。随着浓度的增加，SAE对衰老细胞(80％染色阳性)的杀伤效果进一步增强，而当SAE在2000μM时达到阈值(衰老细胞此时剩余约20％)；当其浓度升高到3000μM时，SAE的杀伤效果没有进一步增强(图12；图13)。

为了进一步剖析这些问题，发明人做了验证性实验。细胞活力测定表明，与其增殖态对照细胞相比较，SAE从200μM浓度开始诱导衰老细胞显著死亡(图14)。当SAE浓度增加到2000μM时，存活衰老细胞的百分比下降到约10％。然而，即使在SAE的3000μM时，增殖细胞也并未明显减少。这些结果，证实了SAE对衰老细胞高度的选择性和突出的特异性，而这种特征实际是senolytics作为一类独特的抗衰老药的基本技术要求。

发明人接下来研究了基质细胞经基因毒性处理后群体倍增(populationdoubling,PD)的潜力。与损伤性处理之后迅速进入生长停滞状态的BLEO这一组细胞相比，BLEO和SAE的联合治疗组表现出显著增高的PD能力(图15)。然而有趣的是，SAE本身似乎不影响增殖细胞的PD，这一数据进一步表明SAE在衰老细胞与正常细胞之间的选择性。

为了探究SAE是否通过诱导凋亡的方式造成衰老细胞丧失存活能力，发明人使用SAE在培养条件下分别处理增殖组细胞和衰老组细胞。随后观察到的caspase-3/7活性变化结果，表明SAE引起衰老细胞发生凋亡；从SAE加入之后的第16小时，衰老组开始与对照组之间出现统计学差异(图16)。此外，泛caspase抑制剂QVD可防止SAE对衰老细胞的杀伤，这一过程中的实际效果跟ABT263(一种目前已知的、十分有效的衰老细胞凋亡诱导剂)对衰老细胞的影响非常相似(图17)。上述一系列结果证实，SAE通过诱导凋亡的方式促使衰老细胞进入死亡程序，但增殖态细胞基本不被这一天然药物所靶向或影响。

鉴于SAE对衰老细胞产生的明显影响，发明人随后分析了SAE诱导细胞凋亡的潜力。流式细胞数据显示衰老PSC27细胞活力显著降低，而其凋亡比例显著升高，但增殖细胞的变化却并不明显(图18，图19)。因此，发明人的数据一致性支持SAE在体外条件下通过诱导细胞凋亡的方式引起衰老细胞的消除，该天然产物在靶向衰老细胞方面具有突出的潜力。

实施例3.使用SAE治疗性靶向衰老细胞可促进肿瘤消退并能有效降低化疗耐药

鉴于SAE在体外较高浓度条件下清除衰老细胞中的突出选择性，接下来考虑这种药物是否可以被利用来干预体内与增龄相关的多种疾病。在众多人类病理中，癌症是严重威胁人类寿命和危害健康的主要慢性疾病之一。此外，临床中癌细胞耐药性限制了大多数抗癌治疗的效果，而衰老细胞往往通过在受损肿瘤灶中发展SASP来促进其周边癌细胞治疗性耐药的发生。即便如此，从原发肿瘤中清除衰老细胞以促进癌症治疗指数的可行性与安全性，至今几乎未被科学家们探索过。

首先，发明人通过将PSC27基质细胞与PC3上皮细胞混合构建成组织重组体，后者是一种典型的高度恶性前列腺癌细胞系。在非肥胖糖尿病和严重联合免疫缺陷(NOD/SCID)实验小鼠大腿后侧皮下植入重组体之前，基质细胞与上皮细胞的数量比例为1：4。动物在重组体植入体内之后8周结束时，测量肿瘤大小(体积)(图20)。同由PC3癌细胞和原代PSC27基质细胞组成的肿瘤相比，由PC3细胞和衰老PSC27细胞组成的异种移植物(xenograft)体积显著增加(P<0.0001)，这一差异再次证实了衰老细胞在肿瘤进展中的关键促进作用(图21)。

为了在技术上更加接近临床条件和相关背景，发明人特别设计了一种临床前方案，其中涉及基因毒化疗药物治疗和/或衰老药物干预(图22)。在皮下植入两周后，当观察到体内肿瘤已经稳定被摄取时，在第3、第5和第7周的第一天分别向实验动物提供单次剂量的MIT(Mitoxantrone，MIT；一种化疗剂)或安慰剂，直到8周方案全部结束。同安慰剂治疗组相比，MIT给药可显著延缓肿瘤生长，这证实了MIT作为化疗药物的疗效(肿瘤大小减少44.1％，P<0.0001)(图23)。值得注意的是，虽然SAE本身并不会引起肿瘤收缩，但对治疗MIT后的小鼠，SAE给药却可显著减小肿瘤(与MIT相比，肿瘤体积减少32.0％，P<0.01；与安慰剂治疗相比，肿瘤体积减少62.0％，P<0.0001)(图23)。

接下来，发明人推断细胞衰老是否发生在这些动物的肿瘤灶中。检测结果证明，MIT给药过程诱导了肿瘤组织中大量衰老细胞的出现，尽管这似乎毫不奇怪。然而，SAE给药则将这些化疗动物病灶内的大多数衰老细胞基本耗尽(图24；图25)。激光捕获显微解剖(LCM)和随后的定量PCR结果表明，SASP因子的表达显著升高，包括IL6、CXCL8、SPINK1、WNT16B、GM-CSF、MMP3、IL1Α，这一趋势伴随着化疗动物衰老标记p16INK4A的上调(图26)。有趣的是，这些变化主要发生在基质细胞中，而不是它们邻近的癌细胞，这意味着残留癌细胞再增殖的可能性，而这些细胞在治疗损伤的TME中产生了获得性耐药。然而，在使用SAE给药时，这一变化在很大程度上被逆转，正如转录水平数据分析结果所展示的那样(图27)。

为了研究直接支持在MIT给药的小鼠中SASP的表达和逆转这种衰老相关模式的机制，发明人在第一次SAE给药7天后即解剖了这两种药物治疗的动物体内的肿瘤，选择给药7天后这一时间点主要是因为这时病灶中癌细胞耐药克隆尚未形成。与安慰剂相比，MIT给药导致DNA损伤和凋亡程度均显著增加。虽然SAE单独不能诱导DNA损伤或造成凋亡，但化疗药物MIT却可以高度上调这两个指标(图28)。然而，当MIT处理的动物与SAE一起使用时，DNA损伤或凋亡的指数明显增强，这意味着这些衰老药物处理条件下的动物体内肿瘤位点细胞毒性增强。作为支持性证据，当SAE在治疗过程中应用时，caspase 3cleavage活性升高，这是细胞凋亡的一个典型标志。

接下来比较了不同药物处理组动物的生存情况，主要以一种时间延长的方式来评估肿瘤进展的后果。在这一临床前队列中，对动物进行了肿瘤生长监测，一旦小鼠内体肿瘤负担突出(大小≥2000mm3)，就会判断为严重疾病已经发生，这是一种用于某些情况下肿瘤等疾病的病情进展的方法。接受MIT/SAE组合治疗的小鼠表现出最长的中位生存期，与仅接受MIT治疗的组相比，存活期延长了至少35.9％(图29，绿色与蓝色相比)。然而，仅用SAE治疗荷瘤小鼠并没有造成显著的好处，只有边际性生存延伸。

值得注意的是，在这些研究中进行的治疗似乎被实验小鼠很好地耐受。没有观察到尿素、肌酐、肝酶或体重的显著波动(图30；图31)。更重要的是，在本研究设计的各药物剂量下使用的化疗和抗衰老药物不会显著干扰免疫系统的完整性和关键器官的组织稳态，即使在免疫完整型的野生小鼠中也是如此(图32；图33)。这些结果一致证实，抗衰老剂结合常规化疗药物有可能在普遍意义上增强肿瘤反应，而不引起严重的全身毒性。

为了确定SAE在提高化疗治疗效果方面是否具有药物依赖性或特异性，继而选择使用阿霉素(doxorubicin,DOX)、博来霉素(bleomycin,BLEO)、多西紫杉醇(docetaxel,DOC)与长春新碱(vincristine,VIN)，分别与SAE进行组合并用于预临床试验。结果表明，在这些化疗药物中，只有DOX或BLEO与SAE联用可以大致重复MIT与SAE联合治疗所造成的显著效果(图34，图35)。而DOC与VIN尽管在单独使用时可以降低肿瘤体积，但当SAE与其共同给药时并未引起肿瘤进一步收缩，即未能带来更多益处(图36，图37)。因此，SAE在体内条件下提高化疗治疗效果这一特征，仅限于同特定基因毒药物的联用，具有药物类型依赖性。值得注意的是，当丹参酚酸家族其它分子如丹参酚酸I(salvianolic acid I,SAI)和丹参酚酸J(salvianolic acid J,SAJ)与MIT联合治疗均未能造成显著效果(图38，图39)。此外，若果将丹参提取物(salvia miltiorrhiza extract,SME)(含各种丹参酚酸家族分子)与MIT联合治疗，并未能产生显著效果(图40)。同样，使用通常具有对人体具一定抗衰效果的绿茶提取物(green tea extrct,GTE)与MIT联合治疗，也不能产生显著的治疗结果(图40)。这些结果说明，SAE在整个丹参酚酸家族中具有特殊的生物学活性和靶向衰老细胞的作用，使其在将来干预机体衰老和控制衰老相关疾病方面具有十分突出的价值。当多种不同天然植物来源的提取物或者作为植物次生代谢产物的小分子化合物用于类似的动物实验时，普遍未能在与化疗药物联合治疗肿瘤中取得有效的治疗结果(图41)。

实施例4.SAE治疗造成的衰老细胞清除可以延长老龄小鼠的晚年生存期，而不增加其在生命晚期阶段的发病率

既然SAE具有在肿瘤小鼠的微环境中清除衰老细胞、降低肿瘤耐药性和提高总体治疗效果的惊人药效，那么对于自然衰老的动物是否也有某种促进健康或延缓疾病的显著益处？为回答这一问题，首先考虑是否可以使用一种具有潜在转化价值的方法来消除衰老细胞，即：从非常老龄的某一时间点开始进行间歇治疗，能否延长WT小鼠的剩余寿命？对此，一系列体内试验得以相应开展。值得注意、也十分令人惊讶的是，在每两周服用一次药物的治疗方案下，从24-27个月年龄(相当于人类75-90岁的年龄)开始给药的SAE组，其治疗后中位生存期比Vehicle组延长了66.2％，同时具有较低的死亡危险(HR＝0.3249，SAE组/Vehicle组；P<0.0001)(图42，图43)。这一发现，表明SAE介导的衰老细胞清除可以降低老年小鼠的死亡风险，并有效延长其生存期。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

Claims

1.丹参酚酸E化合物或其药学上可接受的盐、酯、异构体、溶剂合物或前药的应用，用于：与化疗药物联合制备特异性靶向清除肿瘤微环境中衰老细胞及抑制肿瘤的组合物；其中，所述的化疗药物为给药后诱发肿瘤微环境出现衰老相关分泌表型的化疗药物。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为在基因毒药物处理后肿瘤微环境中产生衰老相关分泌表型的肿瘤，和/或为在基因毒药物后产生耐药性的肿瘤；较佳地，所述的肿瘤包括：前列腺癌，乳腺癌，肺癌，结直肠癌，胃癌，肝癌，胰腺癌，膀胱癌，皮肤癌，肾癌，食管癌、胆管癌、脑癌；或

所述衰老相关分泌表型为DNA损伤导致的衰老相关分泌表型；较佳地，所述的DNA损伤为化疗药物造成的DNA损伤。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的化疗药物为基因毒药物；更佳地包括：米托蒽醌，阿霉素，博莱霉素。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述化疗药物为米托蒽醌，米托蒽醌与丹参酚酸E的重量比例为1:20～80；较佳地，米托蒽醌与丹参酚酸E的重量比例为1:30～70；更佳地，米托蒽醌与丹参酚酸E的重量比例为1:40～60；或

5.丹参酚酸E或其药学上可接受的盐、酯、异构体、溶剂合物或前药的应用，用于：

制备抑制衰老的组合物；或

制备延长寿命或延长晚年生存期的组合物；或

制备特异性靶向清除肿瘤微环境中衰老细胞的组合物，或

6.丹参酚酸E或其药学上可接受的盐、酯、异构体、溶剂合物或前药在制备药物或制剂中的用途，所述药物或制剂用于：下调衰老相关分泌表型(SASP)、降低SASP因子的表达或活性、降低细胞衰老标志性因子的表达或活性、诱导非增殖态细胞凋亡、减少或消除非增殖态细胞、延缓衰老、延长对象寿命、减少对象的年龄相关疾病负担、预防、缓解和治疗受益于非增殖态细胞减少或消除的疾病、降低对癌症疗法的耐药性、增强能诱导细胞衰老的试剂的功效、促进肿瘤消退、减小肿瘤体积、预防或治疗癌症、或延长癌症存活期。

7.一种组合物，包括：(a)丹参酚酸E化合物或其药学上可接受的盐、酯、异构体、溶剂合物或前药，和(b)给药后诱发肿瘤微环境发生衰老相关分泌表型的化疗药物；

较佳地，所述化疗药物是基因毒药物；更佳地包括：米托蒽醌，阿霉素，博莱霉素。

8.一种药物组合物，包括：(a)丹参酚酸E化合物或其药学上可接受的盐、酯、异构体、溶剂合物或前药，和(b)给药后诱发肿瘤微环境发生衰老相关分泌表型的化疗药物，和任选的药学上可接受的辅料；

9.一种用于特异性靶向清除肿瘤微环境中衰老细胞以及抑制肿瘤的药盒，包括：丹参酚酸E化合物或其药学上可接受的盐、酯、异构体、溶剂合物或前药，以及化疗药物；其中，所述的化疗药物为给药后诱发肿瘤微环境发生衰老相关分泌表型的化疗药物；

10.一种制备抑制肿瘤的组合物、药物组合物或药盒的方法，包括：将丹参酚酸E化合物或其药学上可接受的盐、酯、异构体、溶剂合物或前药与化疗药物混合；或将丹参酚酸E化合物或其药学上可接受的盐、酯、异构体、溶剂合物或前药与化疗药物置于同一药盒中；

11.如权利要求7-10任一项所述，其特征在于，所述化疗药物为米托蒽醌，米托蒽醌与丹参酚酸E的重量比例为1:20～80；较佳地，米托蒽醌与丹参酚酸E的重量比例为1:30～70；更佳地，米托蒽醌与丹参酚酸E的重量比例为1:40～60；或

12.一种筛选促进丹参酚酸E清除肿瘤微环境中衰老细胞或抑制肿瘤或延长寿命的潜在物质的方法，所述方法包括：

较佳地，通过观测caspase-3/7活性或SASP因子的表达来评估细胞凋亡情况或衰老相关分泌表型的情况；较佳地，所述SASP因子包括但不限于：IL6、CXCL8、SPINK1、WNT16B、GM-CSF、MMP3、CXCL1、CXCL3、IL-1α、IL-1β；或，通过观测化疗动物衰老标记p16INK4A来评估细胞凋亡情况或衰老相关分泌表型的情况。

13.一种筛选抑制衰老相关分泌表型的潜在物质的方法，所述方法包括：