CN116549471A - 芦丁及雷帕霉素在制备协同化疗剂抑制肿瘤的药物中的应用 - Google Patents

芦丁及雷帕霉素在制备协同化疗剂抑制肿瘤的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了芦丁及雷帕霉素在制备协同化疗剂抑制肿瘤的药物中的应用。本发明揭示了芦丁可以特异性靶向抑制衰老相关分泌表型(SASP)，其可与雷帕霉素协同作用，芦丁及雷帕霉素在与化疗药物联合应用后，呈现显著的协同增效，可以促进肿瘤的抑制，其促进效果令人意外。

Description

芦丁及雷帕霉素在制备协同化疗剂抑制肿瘤的药物中的应用
技术领域
本发明属于药学领域，更具体地，本发明涉及芦丁及雷帕霉素在制备协同化疗剂抑制肿瘤的药物中的应用。
背景技术
细胞衰老是指真核细胞一种相对稳定且通常不可逆的细胞周期停滞的状态，在这种状态下增殖细胞会对促生长刺激产生耐受，通常由DNA损伤等胁迫性信号所引起。衰老细胞中炎症性细胞因子的表达水平显著升高，这一现象被称为衰老相关分泌表型(Senescence-Associated Secretory Phenotype，SASP)。衰老细胞能通过分泌胞外基质蛋白、炎症相关因子及癌细胞生长因子促进邻近癌前细胞发生癌变或恶性程度上升，这些蛋白被称为SASP因子。
衰老细胞主要通过3个途径参与机体的各种生理和病理过程：(1)衰老细胞基因表达和形态改变逐步累积可影响相应组织的功能；(2)衰老细胞限制干细胞和未分化祖细胞的再生潜能，导致细胞再生能力下降；(3)衰老细胞不仅表现为生长周期停滞，还通过自分泌和旁分泌途径释放大量的细胞因子、趋化因子、生长因子和蛋白酶等，影响邻近细胞和组织的微环境，导致和加速衰老及相关疾病。
DNA损伤、端粒功能障碍、癌基因激活、氧化应激等刺激均可诱导细胞出现SASP，其机制与转录级联、自分泌环路和持续DNA损伤反应密切相关。但是，过表达或者抑制衰老经典通路p53和p16INK4A/Rb不能影响SASP的表达，表明尽管衰老细胞的周期停滞和SASP经常协同发生，两者的调控通路并不完全重叠。据报道，DNA损伤反应通过激活毛细血管扩张共济失调突变基因、奈梅亨断裂综合征蛋白1和检测点激酶2增加SASP因子IL-6和IL-8的分泌。DNA损伤反应(DDR)在细胞受损后立即被激活，衰老细胞出现成熟SASP则需要约1周甚至更长的时间，并且短暂的DNA损伤反应并不能诱导细胞衰老，也不能诱导SASP，表明除了DNA损伤反应外还存在其它机制共同诱导SASP。
研究表明，DDR、p38MAPK和mTOR信号作为上游驱动因子，NF-κB和c/EBPβ作为下游转录因子，均参与到衰老细胞SASP的调节过程中。NF-κB和c/EBPβ转录因子在细胞衰老时活性增加，参与调节细胞应激和炎症信号的细胞因子表达。细胞衰老时磷酸化的NF-κB/RelA亚基入核，与SASP启动基因结合，调控SASP因子表达，因此NF-κB通常被称为SASP的主调节器。小鼠肝脏、肾脏及老年人大脑组织的衰老细胞中锌指转录因子4(GATA4)水平较高，GATA4可以通过调节衰老细胞中NF-κB的活性影响SASP相关基因IL-6、IL-8、CXCL1的表达。p38MAPK是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员之一，是重要的信号转导分子，激活或者阻断p38MAPK足以影响衰老细胞SASP形成。p38MAPK在衰老程序开始几天后被激活，通过活化丝裂原和应激激活的蛋白激酶-MSK1和MSK2，间接激活NF-κB，使得p65和p50在核内聚集，这与SASP早期发展过程相一致。衰老细胞不直接分泌促炎因子IL-1α，但衰老细胞表面分布大量的IL-1α，与NF-κB共同形成正前馈环路促进炎性因子的编码转录，建立和维持SASP。mTOR通过调节IL-1α水平促进SASP因子分泌，而雷帕霉素不影响IL-1αmRNA水平，却明显降低衰老细胞表面IL-1α蛋白的表达。mTOR也能够调节p38MAPK下游信号MAPKAPK2影响SASP因子分泌，细胞衰老期间，MAPKAPK2磷酸化RNA结合蛋白ZFP36L1，从而限制其对SASP因子转录产物的降解能力。转录因子c/EBPβ与肿瘤基因激活诱导的细胞衰老有关，衰老时c/EBPβ募集到IL-6启动子上，直接促进SASP因子转录，c/EBPβ也是IL-6正前馈自分泌环路的重要组成部分，可以激活SASP的炎症网络，是SASP早期扩散的重要调节器。HMGB2靶向作用于c/EBPβ调控SASP，通过抑制异染色质的扩散来促进SASP基因的表达，细胞衰老期间大量HMGB2与染色质结合，消除了衰老相关异染色质位点(SAHF)对SASP基因的沉默作用，导致IL-8、IL-6等表达增加。
表观遗传改变通过影响DNA损伤修复、端粒长度和代谢途径或激活衰老相关基因和miRNAs的表达而影响衰老。多种证据表明染色质状态的改变与细胞衰老的控制密切相关。细胞可以感觉到不同的衰老刺激，这些刺激会激活信号通路，驱动染色质状态的改变。然而，衰老信号引起这种改变的途径仍然很大程度上是未知的。因此，从表观遗传角度揭示细胞衰老及其特定表型发生发展的调控机制，从进而揭示具有靶向价值的关键分子及其信号通路，是将来衰老生物学和老年医学的一个新兴方向，亟需深入开展相关探索，为临床医学提供重要科学依据和潜在的干预措施。
尽管越来越多的实验支持靶向细胞衰老可以同时治疗多种衰老相关疾病如肿瘤，但还有待严谨的人体临床试验以帮助人们更好地评估延缓衰老药物的益处和风险。尽管国际已知的多种SASP抑制剂均可显著减弱SASP，但本质上不会杀死衰老细胞。为了在药理学上减轻衰老细胞的负担，科学家们正在开发“senolytics”(衰老细胞清除药物)这种性质的小分子、多肽和抗体来选择性地清除衰老细胞。
除了“senolytics”药物，本领域还关注“senomorphics”药物。“senolytics”主要是通过消除衰老的细胞来发挥功效，而“senomorphics”的功能实现则是通过调节衰老细胞的生物特性而非消除它们。
综上，本领域还需要挖掘更多的影响SASP的药物，以期为细胞衰老以及肿瘤的防治提供更多的途径。
发明内容
本发明的目的在于提供芦丁及雷帕霉素在制备协同化疗剂抑制肿瘤的药物中的应用。
在本发明的第一方面，提供芦丁及雷帕霉素或它们的衍生物的应用，用于与化疗药物联合使用，制备特异性靶向抑制衰老相关分泌表型(SASP)及抑制肿瘤和/或逆转肿瘤耐药性的组合物；其中，所述的化疗药物为给药后诱发衰老相关分泌表型的化疗药物，包括米托蒽醌或博莱霉素；所述衍生物包括芦丁及雷帕霉素的药学上可接受的盐、酯、异构体、溶剂合物或前药。
在一种或多种实施方式中，所述抑制肿瘤包括抑制肿瘤本身，以及抑制肿瘤的迁移和侵袭。
在一种或多种实施方式中，所述衰老相关分泌表型为DNA损伤导致的衰老相关分泌表型。
在一种或多种实施方式中，所述的DNA损伤为化疗药物造成的DNA损伤。
在一种或多种实施方式中，所述组合物中，所述芦丁或雷帕霉素或它们的衍生物还用于：抑制广谱衰老相关分泌表型的表达；较佳地，其在不影响细胞衰老的情况下抑制广谱衰老相关分泌表型的表达；干扰ATM与HIF1α和TRAF6的相互作用，抑制急性应激相关表型(ASAP)；消除衰老基质细胞以旁分泌的方式赋予癌细胞的恶性；增加肿瘤细胞凋亡率；和/或，抑制衰老相关分泌表型的组分IL8、IL6、IL1a、IL1b、CXCL3、MMP3、GM-CSF。
在一种或多种实施方式中，所述的肿瘤包括：前列腺癌，乳腺癌，肺癌，结直肠癌，胃癌，肝癌，胰腺癌，膀胱癌，皮肤癌，肾癌，食管癌、胆管癌、脑癌。
在一种或多种实施方式中，所述的化疗药物为米托蒽醌；所述组合物中(或联合使用时)，米托蒽醌、芦丁、雷帕霉素的重量比例为1:20～80:20～80；较佳地，米托蒽醌、芦丁、雷帕霉素的重量比例为1:30～70:30～70；更佳地，米托蒽醌、芦丁、雷帕霉素的重量比例为1:40～60(如1:45:45，1:50:50，1:55:55等比例)。
在本发明的另一方面，提供一种用于特异性靶向抑制衰老相关分泌表型以及抑制肿瘤和/或逆转肿瘤耐药性的药物组合物或药盒，包括：芦丁及雷帕霉素或它们的衍生物，以及化疗药物；其中，所述的化疗药物为给药后诱发衰老相关分泌表型的化疗药物，包括米托蒽醌或博莱霉素；所述衍生物包括芦丁及雷帕霉素的药学上可接受的盐、酯、异构体、溶剂合物或前药。
在一种或多种实施方式中，米托蒽醌与芦丁及雷帕霉素组合时，米托蒽醌、芦丁、雷帕霉素的重量比例为1:20～80:20～80；较佳地，米托蒽醌、芦丁、雷帕霉素的重量比例为1:30～70:30～70；更佳地，米托蒽醌、芦丁、雷帕霉素的重量比例为1:40～60(如1:45:45，1:50:50，1:55:55等比例)。
在本发明的另一方面，提供一种制备抑制肿瘤和/或逆转肿瘤耐药性的药物组合物或药盒的方法，包括：将芦丁及雷帕霉素或它们的衍生物与化疗药物混合；或将芦丁及雷帕霉素或它们的衍生物与化疗药物置于同一药盒中；其中，所述的化疗药物为给药后诱发衰老相关分泌表型的化疗药物，包括米托蒽醌或博莱霉素；较佳地，将米托蒽醌与芦丁及雷帕霉素混合或组合时，米米托蒽醌、芦丁、雷帕霉素的重量比例为1:20～80:20～80；较佳地，米托蒽醌、芦丁、雷帕霉素的重量比例为1:30～70:30～70；更佳地，米托蒽醌、芦丁、雷帕霉素的重量比例为1:40～60(如1:45:45，1:50:50，1:55:55等比例)；所述衍生物包括芦丁及雷帕霉素的药学上可接受的盐、酯、异构体、溶剂合物或前药。
在一种或多种实施方式中，将芦丁及雷帕霉素或它们的衍生物与化疗药物混合，根据用药疗程分为单位剂型。
在本发明的另一方面，提供芦丁及雷帕霉素或它们的衍生物的用途，用于制备特异性靶向抑制衰老相关分泌表型的组合物；较佳地，所述芦丁及雷帕霉素或它们的衍生物干扰ATM与HIF1α和TRAF6的相互作用，抑制急性应激相关表型；消除衰老基质细胞以旁分泌的方式赋予癌细胞的恶性；和/或，增加肿瘤细胞凋亡率；所述衍生物包括芦丁及雷帕霉素的药学上可接受的盐、酯、异构体、溶剂合物或前药。
在本发明的另一方面，提供一种筛选促进芦丁及雷帕霉素(或它们的衍生物)靶向抑制衰老相关分泌表型及抑制肿瘤和/或逆转肿瘤耐药性的潜在物质的方法，所述方法包括：
(1)提供一肿瘤微环境体系，该体系包括肿瘤细胞(较佳地还可包括基质细胞)；
(2)利用化疗药物处理(1)的体系，诱发肿瘤微环境发生衰老相关分泌表型；其中，所述的化疗药物为给药后诱发衰老相关分泌表型(SASP)的化疗药物，包括米托蒽醌或博莱霉素；在诱发肿瘤微环境发生衰老相关分泌表型之前、之时或之后，以芦丁及雷帕霉素进行处理；和
(3)将候选物质加入到(2)的体系中，观测其对肿瘤微环境体系的作用，若所述候选物质在统计学上能够促进(显著促进，如促进10％、20％、30％、50％以上或更高)芦丁及雷帕霉素抑制衰老相关分泌表型及抑制肿瘤和/或逆转肿瘤耐药性，则该候选物质是可与芦丁及雷帕霉素联用、抑制肿瘤的潜在物质。
在一种或多种实施方式中，通过观测caspase 3cleavage活性或SASP因子的表达来评估细胞凋亡情况或衰老相关分泌表型的情况。较佳地，所述SASP因子包括但不限于：IL6、IL8、IL1a、IL1b、CXCL3、MMP3、GM-CSF。
在一种或多种实施方式中，通过观测ATM与HIF1α和TRAF6的相互作用(抑制急性应激相关表型)来评估，若芦丁及雷帕霉素干扰ATM与HIF1α和TRAF6的相互作用的能力(抑制急性应激相关表型)被促进(显著促进，如促进10％、20％、30％、50％以上或更高)，则该候选物质是可与芦丁及雷帕霉素联用、抑制肿瘤的潜在物质。
在一种或多种实施方式中，通过观测衰老基质细胞以旁分泌的方式赋予癌细胞的恶性的情况来评估，若候选物质产生衰老基质细胞并使其以旁分泌的方式赋予癌细胞的恶性的能力，则该候选物质是可与芦丁及雷帕霉素联用、抑制肿瘤的潜在物质。
在本发明的另一方面，提供一种筛选抑制衰老相关分泌表型的潜在物质的方法，所述方法包括：(1)提供一基质细胞体系，诱导该体系产生衰老相关分泌表型；在衰老相关分泌表型之前、之时或之后，以芦丁及雷帕霉素进行处理；(2)将候选物质加入到(1)的体系中，观测其对该基质细胞体系的作用，若其能特异性促进芦丁及雷帕霉素对于衰老相关分泌表型的抑制作用，则该候选物质是可与芦丁及雷帕霉素联用、抑制衰老相关分泌表型的潜在物质。
在一种或多种实施方式中，还包括设置对照组，从而明确分辨测试组中肿瘤微环境体系与对照组的差异，或芦丁靶向抑制衰老相关分泌表型及抑制肿瘤和/或逆转肿瘤耐药性与对照组的差异。
在一种或多种实施方式中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对性设计的或存在于广谱化合物库/生物分子库中的小分子化合物，混合物(如植物提取物)，生物大分子、信号通路调控试剂等。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1.规模性筛选天然产物(NMA)库以获得具有抗衰老潜力的药物或原料的实验流程总图和技术路线概览。
图2.使用人源基质细胞PSC27在体外条件下对天然库的各种成分进行筛选，分析特定药物对于增殖细胞和衰老细胞存活率的影响。粉红色矩形区域内的蓝点，符合senolytics特征的药物。
图3.NMA库18种成分对PSC27细胞处理之后，增殖细胞和衰老细胞存活计数结果。CTRL，增殖细胞。SEN，衰老细胞。PCC1，procyanidin C1，作为senolytics阳性对照。
图4.NMA库19种成分(各个成分的终浓度分别3μg/ml如不同浓度建议标在图中，后同)对PSC27细胞处理之后，增殖细胞和衰老细胞存活计数结果。CTRL，增殖细胞。SEN，衰老细胞。
图5.NMA库19种成分(各个成分的终浓度分别1μg/ml)对PSC27细胞处理之后，增殖细胞和衰老细胞中SASP标记因子IL8(白介素8)的表达水平分析。所有数据均为相比于CTRL组后的规范化结果。^，P>0.05；*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。
图6.NMA库18种成分(各个成分的终浓度分别1μg/ml)对PSC27细胞处理之后，增殖细胞和衰老细胞中SASP标记因子IL8的表达水平分析。所有数据均为相比于CTRL组后的规范化结果。^，P>0.05；*，P<0.05；**，P<0.01。
图7.天然植物化学成分芦丁的分子式。
图8.HPLC-ESI-QTOF-MS之后分析获得总离子色谱(TIC，上)和基峰色谱(BPC，下)的高分辨质谱图。
图9.增殖态人源基质细胞PSC27(早期代数p10左右)在体外经过化疗药物博莱霉素(BLEO)以50μg/ml浓度处理之后第7-10天，通过SA-β-Gal染色之后的结果。左图，代表性图片；右图，统计学结果。CTRL，对照细胞；BLEO，博莱霉素处理后细胞。DMSO，溶剂；Rutin，芦丁。^，P>0.05；****，P<0.0001。
图10.PSC27细胞经过化疗药物博莱霉素(BLEO)处理(50μg/ml)之后，经过BrdU染色之后的结果。左图，代表性图片；右图，统计学数据。CTRL，对照细胞；BLEO，博莱霉素处理后的细胞。DMSO，溶剂；Rutin，芦丁。^，P>0.05；***，P<0.001。
图11.荧光定量PCR(qRT-PCR)检测分析SASP典型因子在BLEO诱导形成的衰老细胞、被不同浓度下的芦丁(20-100μM)处理后的相对表达水平。所有数据均为相比于CTRL组后的规范化结果。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。
图12.生信分析PSC27细胞在3种条件下的转录组表达差异并以热图显示。CTRL，对照细胞；BLEO，博莱霉素处理后的细胞；B/R，芦丁处理后的衰老细胞。红星，SASP组分蛋白因子。
图13.GSEA分析结果显示SASP标记性因子的表达在BLEO造成的衰老细胞中集中上调，但在芦丁处理之后发生显著下降。SASP signature，SASP分子标签。
图14.生信分析PSC27细胞在衰老状态和芦丁处理的衰老状态下的全转录组表达差异并以热图显示。注意，共有3733和886个基因分别出现下调或上调(P<0.01，Foldchange>4)。
图15.KEGG通路分析芦丁在衰老细胞中造成显著下调的100个分子在molecularfunction中的代表性功能。
图16.KEGG通路分析芦丁在衰老细胞中造成显著下调的100个分子在cellularcomponent上的代表性组分。
图17.KEGG通路分析芦丁在衰老细胞中造成显著下调的100个分子在biologicalprocess上的代表性过程。
图18.免疫印迹分析PSC27细胞在BLEO和/或芦丁作用下的DDR信号通路和SASP表达情况。GAPDH，蛋白上样对照。
图19.免疫共沉淀(TAK1抗体介导)和印迹分析PSC27细胞在BLEO和/或芦丁作用下的蛋白相互作用。Input，总蛋白裂解物。GAPDH，蛋白对照。
图20.免疫共沉淀(ATM抗体介导)和印迹分析PSC27细胞在BLEO和/或芦丁作用下的蛋白相互作用。Input，总蛋白裂解物。GAPDH，蛋白对照。
图21.PSC27细胞在BLEO和/或芦丁作用下的细胞裂解物经过核质分离之后的免疫印迹分析。C，cytoplasmic；N，nuclear。Lamin A/C，核蛋白对照。GAPDH，胞质蛋白对照。
图22.荧光定量PCR(qRT-PCR)检测分析一组典型SASP分子在BLEO诱导形成的衰老细胞、以及经过PX-478或C25-140处理之后的相对表达水平。所有数据均为相较于CTRL组的规范化结果。^，P>0.05；*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；****，P<0.0001。
图23.使用荧光试剂DCFH-DA检测不同条件下PSC27细胞水平活性氧(ROS)的生成量变化。左侧，代表性图片，标尺，20μm；右侧，统计学分析。
图24.前列腺癌细胞体外培养条件下的增殖能力检测。PSC27细胞在各种情况下的条件性培养基(conditioned media)收集之后分别用于培养PC3，DU145，M12和LNCaP。**，P<0.01；***，P<0.001。标尺，100μm。Rapamycin，雷帕霉素。RR，Rutin/Rapamycin。
图25.前列腺癌细胞体外培养条件下的迁移能力衡量。PSC27细胞在各种情况下的条件性培养基(conditioned media)收集之后分别用于培养PC3，DU145，M12和LNCaP。**，P<0.01；***，P<0.001；****，P<0.0001。标尺，100μm。RR，Rutin/Rapamycin。
图26.前列腺癌细胞体外培养条件下的侵袭能力测定。PSC27细胞在各种情况下的条件性培养基(conditioned media)收集之后分别用于培养PC3，DU145，M12和LNCaP。**，P<0.01；***，P<0.001；****，P<0.0001。标尺，100μm。RR，Rutin/Rapamycin。
图27.前列腺癌细胞体外培养条件下的耐药潜力确定。PSC27细胞在各种情况下的条件性培养基(conditioned media)收集之后分别用于培养PC3，DU145，M12和LNCaP。**，P<0.01；***，P<0.001；****，P<0.0001。IC50，半抑制浓度。RR，Rutin/Rapamycin。
图28.剂量-反应曲线(非线性回归/曲线拟合)。基于化疗药物的PSC27天然或BLEO诱导衰老的PC3细胞培养，随后使用较大范围浓度的芦丁处理。
图29.PSC27细胞的CTRL组和BLEO损伤组在体外同PC3混合之后，作为重构组织移植入小鼠皮下组织形成移植瘤。在第8周结束时解剖并获得肿瘤，检测、对比各组条件下肿瘤的体积。^，P>0.05；***，P<0.001；****，P<0.0001。
图30.预临床试验小鼠给药方式示意图。人源基质细胞PSC27同癌细胞PC3在体外混合(1:4)之后移植入小鼠皮下形成移植瘤。在单药或组合式给药条件下经过多个治疗周期的处理，最终小鼠处死、病理分析其肿瘤组织有关分子表达水平变化和其它指标情况。
图31.预临床试验小鼠给药时间和给药方式示意图。每2周为一次给药周期，在第3/5/7周的第一天分别对小鼠腹腔给药MIT(mitoxantrone，米托蒽醌)。第5周第一天开始对小鼠进行腹腔芦丁给药，每周一次。8周疗程结束后，解剖小鼠并进行病理鉴定与表达分析。
图32.基于肿瘤终端体积的统计分析。化疗药物MIT单独或与抗衰老药芦丁一起用于对小鼠给药，第8周结束之后对比分析各组肿瘤大小。左侧，统计分析。右侧，代表性各组肿瘤图片。
图33.荧光定量PCR(qRT-PCR)检测分析一组典型SASP因子在小鼠荷瘤部位的转录本表达水平在各组之间的变化情况。各组数据均针对组内表达数值最低的样本进行规范化。包括IL6，IL8，AREG和IL1a。
图34.荧光定量PCR(qRT-PCR)检测分析另一组典型SASP因子在小鼠荷瘤部位的转录本表达水平在各组之间的变化情况。各组数据均针对组内表达水平最低的样本进行规范化。包括MMP1，MMP3，ANGPTL4和SPINK1。
图35.荧光定量PCR(qRT-PCR)检测分析一组细胞衰老特异性biomarker在小鼠荷瘤部位的转录本表达水平在各组之间的变化情况。各组数据均针对组内表达水平最低的样本进行规范化。包括p16INK4a和p21CIP1。
图36.临床前试验中PC3/PSC27荷瘤动物病灶中细胞衰老情况对比。SA-β-Gal染色之后代表性图片。左侧，代表性图片。右侧，统计学分析。标尺，100μm。
图37.系统性肿瘤终端体积统计分析。化疗药物MIT单独或与芦丁及抗衰老药物Rapamycin共同用于对小鼠给药，第8周结束之后对比分析各组肿瘤大小。左侧6组，PC3细胞only；右侧6组，PC3细胞和PSC27细胞共同形成重构组织并移植。^，P>0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；****，P<0.0001。
图38.系统性肿瘤终端体积统计分析。化疗药物MIT单独或与芦丁及传统抗衰老药物Vitamin C共同用于对小鼠给药，第8周结束之后对比分析各组肿瘤大小。左侧6组，PC3细胞only；右侧6组，PC3细胞和PSC27细胞共同形成重构组织并移植。^，P>0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；****，P<0.0001。
图39.系统性肿瘤终端体积统计分析。化疗药物VCR单独或与芦丁及传统抗衰老药物Vitamin C共同用于对小鼠给药，第8周结束之后对比分析各组肿瘤大小。左侧6组，PC3细胞only；右侧6组，PC3细胞和PSC27细胞共同形成重构组织并移植。^，P>0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；****，P<0.0001。VCR，vincristine(长春新碱)。
图40.使用LCM技术在切片上将病灶中癌细胞进行特异分离之后分析各组小鼠中DNA损伤和细胞凋亡比例(Caspase 3 cleaved)。^，P>0.05；*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。RR，Rutin/Rapamycin。
图41.使用ELISA检测小鼠体内循环状态SASP典型因子的血清蛋白含量。左侧，AREG。右侧，EREG。RR，Rutin/Rapamycin。
图42.系统性肿瘤终端体积统计分析(乳腺癌细胞MDA-MB-231和乳腺基质细胞HBF1203形成重构组织)。化疗药物MIT单独或与芦丁及抗衰老药Rapamycin共同用于对小鼠给药，第8周结束之后对比分析各组肿瘤大小。左侧6组，MDA-MB-2313细胞only；右侧6组，MDA-MB-231细胞和HBF1203细胞共同形成重构组织并移植。^，P>0.05；*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；****，P<0.0001。DOX，doxorubicin(阿霉素)。
图43.系统性肿瘤终端体积统计分析(乳腺癌细胞MDA-MB-231和乳腺基质细胞HBF1203形成重构组织)。化疗药物MIT单独或与芦丁及抗衰老药Rapamycin共同用于对小鼠给药，第8周结束之后对比分析各组肿瘤大小。左侧6组，MDA-MB-2313细胞only；右侧6组，MDA-MB-231细胞和HBF1203细胞共同形成重构组织并移植。^，P>0.05；*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；****，P<0.0001。VIN，vinblastine(长春碱)。
图44.预临床各种不同给药处理条件下疗程结束时PCa小鼠体重数据对比分析。^，P>0.05。RR，Rutin/Rapamycin。
图45.以上不同给药处理条件下疗程结束时PCa小鼠血清学数据对比分析。Creatinine，urine(肾脏指标)，ALP和ALT(肝脏指标)数据平行对比。^，P>0.05。RR，Rutin/Rapamycin。
图46.各种不同给药处理条件下疗程结束时免疫完整型小鼠(C57BL/6J)体重数据对比分析。^，P>0.05。RR，Rutin/Rapamycin。
图47.以上不同给药处理条件下疗程结束时免疫完整型小鼠(C57BL/6J)血清学数据对比分析。Creatinine，urine(肾脏指标)，ALP和ALT(肝脏指标)数据平行对比。^，P>0.05。RR，Rutin/Rapamycin。
图48.预临床中不同给药处理条件下疗程结束时免疫完整型小鼠(C57BL/6J)主要类型的血细胞计数对比分析。WBC，lymphocyte和neutrophil单位体积数量平行对比。^，P>0.05。RR，Rutin/Rapamycin。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，揭示了芦丁可以特异性靶向抑制衰老相关分泌表型(SASP)，其可与雷帕霉素协同作用，芦丁及雷帕霉素在与化疗药物联合应用后，呈现显著的协同增效，可以促进肿瘤的抑制，其促进效果令人意外。
本发明中，所述“个体”、“对象”或“患者”指哺乳动物，尤其指人。
本发明中，典型的一些“SASP因子”包括IL6，IL8，AREG，IL1α，MMP1，MMP3，ANGPTL4和SPINK1等。
本文中，芦丁及雷帕霉素还可用于降低患者对癌症疗法的耐药性。所述癌症疗法包括化疗或辐射疗法；化疗例如MIT疗法，辐射治疗例如电离辐射，主要包括α、β、γ和X射线以及质子、中子流治疗等。
本发明中所用术语“给予”或“给药”是指向患有待治疗或预防的疾病或病症或具有其风险的对象提供本发明的化合物或药物组合物。
本发明中，术语“含有”或“包括”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
芦丁(Rutin)/雷帕霉素(Rapamycin)
本发明人经过前期深入的筛选研究后，发现芦丁可抑制广谱SASP的表达，其抑制SASP组分IL6、IL8、IL1a、IL1b、CXCL3、MMP3和GM-CSF，在抑制与衰老细胞促炎反应和分泌活性密切相关的基因表达方面具有显著的应用潜力。同时，芦丁通过干扰ATM与HIF1α和TRAF6的相互作用来抑制急性应激相关表型(ASAP)。研究也显示，芦丁能够消除衰老基质细胞以旁分泌的方式赋予癌细胞的恶性。
进一步地，本发明人发现，芦丁与雷帕霉素能够协同作用，当它们与化疗药物进行联合应用，则可有效地发挥靶向病灶的良性互补作用，达到令人惊讶的增效效果。
所述芦丁的结构式如下：
雷帕霉素的分子式为C51H79NO13，其结构式如下：
在本发明中，“化合物”(包括芦丁、雷帕霉素、其盐或前药等)可以是纯净形式存在的化合物，或纯度大于85％(较佳地大于90％，例如95％，98％，99％)的化合物。
本领域人员应理解，在得知了本发明化合物的结构以后，可通过多种本领域熟知的方法、利用公知的原料，来获得本发明的化合物，比如化学合成或从生物中提取的方法，这些方法均包含在本发明中。此外，芦丁或雷帕霉素还可以是商品化的产品。
本发明还包括芦丁或雷帕霉素的药学上可接受的盐、酯、异构体、溶剂合物或前药，只要它们也具有与芦丁或雷帕霉素的化合物相同或基本相同的功能。本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。所述的“药学上可接受的盐”可以是芦丁或雷帕霉素的酸式盐和碱式盐。
“药学上可接受的酸式盐”是指可保持游离碱的生物活性和性质的盐，该类盐不会出现不理想的生物活性或其它方面的变化。该类盐可由无机酸构成，例如但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及类似的酸。该类盐还可由有机酸构成，例如但不限于乙酸、二氯乙酸、己二酸、褐藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、樟脑酸、樟脑磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基磺酸等。
“药学上可接受的碱式盐”是指可保持游离酸的生物活性和性质的盐，该类盐不会出现不理想的生物活性或其它方面的变化。这些盐通过向游离酸中加入无机碱或有机碱制成。通过无机碱得到的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐及类似盐。优选的无机盐为铵盐、钠盐、钾盐、钙盐以及镁盐。通过有机碱得到的盐包括但不限于一级、二级、三级铵盐，取代的胺包括天然取代的胺、环胺以及碱性离子交换树脂，例如氨气、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、丹醇、2-二甲氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、哈胺、胆碱、甜菜碱、苯乙苄胺、N,N’-双苄基乙撑二胺、乙二胺、葡萄糖胺、甲葡糖胺、可可碱、三乙醇胺、缓血酸胺、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚酰胺树脂以及类似结构。优选的有机碱为异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。
本专利公开的化合物可以作为溶剂合物(如水合物)的形式存在，包括单水合物、二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物及类似结构。在本发明中，还包括芦丁或雷帕霉素的前药，所述的“前药”指当用适当的方法服用后，该前药在对象体内进行代谢或化学反应而转变成所需芦丁或雷帕霉素的一种化合物。
在本发明中，还包括芦丁或雷帕霉素的异构体。这是由于，化合物具有一个或多个不对称中心，所以这些化合物可以作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、顺式或反式异构体存在。
本领域人员应理解，在得知了本发明化合物的结构以后，可通过多种本领域熟知的方法、利用公知的原料，来获得本发明的化合物，比如化学合成或从生物(如动物或植物)中提取或在提取基础上进行改造的方法，这些方法均包含在本发明中。可以利用公知的方法来合成本发明的化合物；合成的化合物可以进一步通过柱层析法、高效液相色谱法等方式进一步纯化。此外，也可以通过商购的方式获得本发明的化合物。
芦丁及雷帕霉素与化疗药物的联合应用
如前所述，本发明人发现，芦丁及雷帕霉素与特定化疗药物的联合应用，可有效地发挥靶向于疾病的良性互补作用，达到令人惊讶的增效效果。优选地，所述的化疗药物为给药后诱发衰老相关分泌表型的化疗药物，包括米托蒽醌或博莱霉素；所述衍生物包括芦丁或雷帕霉素的药学上可接受的盐、酯、异构体、溶剂合物或前药。
在抑制SASP表达的药物的筛选中，本发明人发现，少数NMA成分表现出显著的senomorphics潜能，而其中芦丁是突出的。进一步的筛选发现，芦丁与雷帕霉素协同作用则更为突出。
目前现有技术中主要将雷帕霉素或其衍生物用作免疫抑制药物。通过与相应免疫嗜素RMBP结合抑制细胞周期G0期和G1期，阻断G1进入S期而发挥作用，其效应为：①抑制T和B细胞增殖；②抑制IL-1、IL-2、IL-6和IFN-γ诱导的淋巴细胞增殖；③抑制IgG和供者特异性抗体(细胞毒抗体)产生；④抑制单核细胞增殖。本发明人以往的工作中也有将其用于肿瘤的研究。但是，本领域中，也发现了它对于肿瘤有相反作用，有研究发现其促癌，例如认为其通过激活Akt促癌(通过IGF-1R、mTORC2促多种癌细胞Akt激活，恶化胶质瘤等)；也有研究认为其恶化胰腺癌、肝癌病情；也有研究认为雷帕霉素通过MAPK/ERK通路促癌、通过PDGFRβ/MAPK促癌、通过MAPK/Mnk/eIF4E促癌等。因此以往的研究中关于雷帕霉素对于肿瘤的作用存在较大的争议。
芦丁可抑制广谱SASP的表达而不影响细胞衰老本身。芦丁对抑制典型SASP组分的表达产生显著的抑制效果，包括IL6、IL8、IL1a、IL1b、CXCL3、MMP3和GM-CSF。RNA-seq数据集的分析，分析PSC27的转录组表达模式表明，令人惊讶的是，大多数SASP因子确实被芦丁下调，尽管一些与细胞衰老或SASP的表达状态不直接相关的基因也发生了改变。GSEA输出结果图很大程度上证实了芦丁对衰老细胞表达的影响，表明特异性显著抑制了SASP。因此，芦丁及雷帕霉素在抑制与衰老细胞促炎反应和分泌活性密切相关的基因表达方面具有显著的应用潜力。
芦丁通过干扰ATM与HIF1α和TRAF6的相互作用来抑制ASAP。芦丁的潜在靶标在ATM下游，但却位于TAK1，p38MAPK和其它调控因子的上游，这样一个靶标在功能上会涉及诱导细胞衰老的急性反应。来自p-ATM介导的IP和相应的免疫印迹分析的数据表明，ATM和TRAF6可以相互作用，但芦丁显著削弱了这种相互作用。更重要的是，ATM和HIF1α之间存在相互作用，这也会受到芦丁的干扰。通过天然制剂芦丁调节ATM与其关键靶点HIF1α和TRAF6之间的相互作用，将可抑制SASP的表达、同时维持细胞衰老。虽然芦丁没有改变增殖细胞中ROS的产生，但它显著抑制了衰老细胞产生ROS的能力，因此与其清除自由基的能力基本相互一致。
芦丁能够消除衰老基质细胞以旁分泌的方式赋予癌细胞的恶性。发明人研究了芦丁对人类前列腺癌(PCa)细胞行为的影响，在使用衰老PSC27细胞的CM处理后，观察到几种PCa细胞系PC3、DU145、M12和LCaP的增殖显著增加，并伴有迁移和侵袭的增强。然而，用芦丁治疗癌细胞后，这些获得性功能(迁移和侵袭)则几乎完全消失。暴露于衰老基质细胞来源的CM后，癌细胞的耐药活力显著增加，但在加入芦丁后，耐药性降低了大约80％。因此，芦丁可以显著剥夺衰老基质细胞赋予癌细胞对化疗药物的耐药性。当芦丁与雷帕霉素联合使用时，可以在芦丁产生的抑制效果基础上进一步造成癌细胞恶性活性出现更加显著的下降。
芦丁联合化疗可提高抗癌治疗的疗效。虽然MIT本身导致了仅含有PC3细胞的肿瘤收缩，但senomorphics的给药并没有呈现出显著的效果；即使这些药物与MIT联合使用，也没有带来进一步的好处，这意味着PC3肿瘤生长独立于组织水平的SASP，特别是在没有基质细胞的情况下。引人注目的是，当PC3细胞与其基质细胞结合并形成组织重构体后，发明人观察到肿瘤体积显著增加(p<0.0001)，进一步验证了基质细胞在体内的促瘤作用。当载有PC3/PSC27肿瘤的动物暴露于MIT时，肿瘤体积显著减少(35.5％，p<0.001)。在雷帕霉素或芦丁与MIT双重治疗联合使用后，肿瘤呈现进一步缩小，这一体积的缩小极其显著。其中雷帕霉素与MIT双重治疗比之单用MIT使得肿瘤体积进一步缩小34.1％(p<0.01)；而芦丁与MIT双重治疗比之单用MIT使得肿瘤体积进一步缩小达48.9％(p<0.0001)。说明芦丁与MIT的联用比雷帕霉素与MIT的联用具有更为优异的效果。而当雷帕霉素和芦丁共同用于跟化疗药物MIT治疗肿瘤时，干预则达到最佳效果，肿瘤体积在MIT单药治疗基础上进一步缩小(68.3％，p<0.0001)，这是出乎意料的。芦丁与其它的一些药物例如抗氧化剂维生素C共用时没有观测到此类效果。芦丁及雷帕霉素并非与所有化疗药物联合均能实现这一效果，如长春碱(VIN)作为化疗药物时并没有出现受益现象。
MIT本身会导致癌细胞出现显著的DNA损伤和凋亡。在PC3/PSC27异种移植物中，单独使用芦丁治疗既不能引起典型的DDR，也不会增强细胞死亡，这表明当动物仅暴露于芦丁时，这些肿瘤的反应有限。而芦丁与MIT联合使用后，显著增加了细胞凋亡率。当芦丁与雷帕霉素同时跟MIT联合使用时，则能在芦丁与MIT联合使用的基础上进一步提升DNA损伤和细胞凋亡的指数，这种情况下病灶中癌细胞的清除达到最佳效果。
当芦丁与MIT一起使用时，Caspase 3的自我裂解出现增强。MIT介导的化疗导致动物循环血液中AREG和EREG蛋白水平升高，而这一模式在使用芦丁的情况下则被基本逆转。芦丁一旦同雷帕霉素联合使用则可以在芦丁单独与MIT使用的基础上进一步降低小鼠血液中AREG和ERE的蛋白水平。
多类型肿瘤的研究结果也显示，SASP靶向策略对于肿瘤耐药性的干预效果不局限于特定的癌症类型，还可能适用于更加广泛的、多种实体恶性肿瘤。
基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种芦丁及雷帕霉素的用途，用于制备特异性靶向抑制衰老相关分泌表型(SASP)及抑制肿瘤和/或逆转肿瘤耐药性的组合物。
如本发明所用，除非另外说明，所述的“肿瘤”为在基因毒药物处理后肿瘤微环境中产生衰老相关分泌表型的肿瘤，和/或为在基因毒药物后产生耐药性的肿瘤。例如包括：前列腺癌，乳腺癌，肺癌，结直肠癌，胃癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、皮肤癌，肾癌，食管癌、胆管癌、脑癌。
如本发明所用，除非另外说明，所述的“化疗药物”为给药后诱发肿瘤微环境发生衰老相关分泌表型(SASP)的化疗药物。优选地为米托蒽醌，或为博莱霉素。
在本发明的一些方式中，所述“衰老相关分泌表型”为DNA损伤情况下发生的衰老相关分泌表型；较佳地，所述的DNA损伤为化疗药物造成的DNA损伤；更佳地，所述化疗药物包括基因毒药物。
药物筛选
在得知了芦丁及雷帕霉素与肿瘤微环境或SASP的密切相关性及其工作机制后，可以基于该特征来筛选进一步优化抑制效果的药物。可从所述的物质中找到靶向作用于肿瘤微环境中的衰老细胞，对于抑制肿瘤、逆转肿瘤耐药性或抑制/延缓衰老相关分泌表型真正有用的药物。或可从所述的物质中找到与芦丁及雷帕霉素联合并发挥增效作用的一或多种物质。
因此，本发明提供一种筛选促进化疗药物抑制肿瘤的潜在物质的方法，所述方法包括：(1)提供一肿瘤微环境体系，该体系包括肿瘤细胞和基质细胞；(2)利用化疗药物处理(1)的体系，诱发肿瘤微环境发生衰老相关分泌表型；(3)将候选物质加入到(2)的体系中，观测其对肿瘤微环境体系的作用，若其能特异性靶向抑制衰老相关分泌表型和/或促进基质细胞(为非衰老的细胞)生长(提高基质细胞培增速度)，则其是促进化疗药物抑制肿瘤的潜在物质。步骤(2)中，还包括：在诱发肿瘤微环境发生衰老相关分泌表型之前、之时或之后，以芦丁及雷帕霉素进行处理；步骤(3)中，还包括：若所述候选物质在统计学上能够促进芦丁及雷帕霉素清除肿瘤微环境中衰老细胞和/或促进基质细胞生长，则该候选物质是可与芦丁及雷帕霉素联用、抑制肿瘤的潜在物质。
本发明也提供了一种筛选抑制衰老相关分泌表型的潜在物质的方法，所述方法包括：(1)提供一基质细胞体系，诱导该体系产生衰老相关分泌表型；在衰老相关分泌表型之前、之时或之后，以芦丁及雷帕霉素进行处理；(2)将候选物质加入到(1)的体系中，观测其对该基质细胞体系的作用，若其能特异性促进芦丁及雷帕霉素对于衰老相关分泌表型的抑制作用，则该候选物质是可与芦丁及雷帕霉素联用、抑制衰老相关分泌表型的潜在物质。
在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到测试组中相应指标的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质、但其它条件与测试组相同的体系。
作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于抑制肿瘤、逆转肿瘤耐药性或抑制/延缓衰老相关分泌表型真正有用的物质。
另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的抑制肿瘤、逆转肿瘤耐药性或抑制/延缓衰老相关分泌表型的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出真正有用的药物。
药物组合
本发明提供了一种药物组合物，它含有有效量(如0.00001-50wt％；较佳的0.0001-20wt％；更佳的，0.001-10wt％)的所述的芦丁及雷帕霉素、化疗药物(如0.000001-20wt％；较佳的0.00001-10wt％；更佳的，0.0001-2wt％)，以及药学上可接受的载体。此外，应理解，从便于临床给药或根据临床治疗方案所需出发，所述的芦丁及雷帕霉素和化疗药物的混合并非是必需的，它们也可被独立地分置于独立的容器中，置于试剂盒或药盒中，在需要时进行联合应用。所述的化疗药物为给药后诱发衰老相关分泌表型的化疗药物，较佳地包括米托蒽醌或博莱霉素。
如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。适应于注射的药物形式包括：无菌水溶液或分散液和无菌粉(用于临时制备无菌注射溶液或分散液)。在所有情况中，这些形式必须是无菌的且必须是流体以易于注射器排出流体。在制造和储存条件下必须是稳定的，且必须能防止微生物(如细菌和真菌)的污染影响。
如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。术语“基本上由……构成”指在组合物中，除了含有主要活性成分(如芦丁及雷帕霉素、化疗药物)之外，还可含有少量的且不影响有效成分的次要成分和/或杂质。例如，可以含有甜味剂以改善口味、抗氧化剂以防止氧化，以及其它本领域常用的添加剂。
应理解，在得知了所述芦丁及雷帕霉素的用途及其在肿瘤微环境或SASP环境中的工作机制后，可以采用本领域熟知的多种方法来使用芦丁及雷帕霉素和/或化疗药物给药于哺乳动物或人。这些方法均可被涵盖于本发明中。
本发明所述的组合物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物体内的剂型都是可以的。比如可选自：注射剂、片剂、胶囊剂、粉末、颗粒剂、糖浆、溶液、悬浮液、酊剂、口服液、或气雾剂。
本发明所述的芦丁及雷帕霉素的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的芦丁及雷帕霉素的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。
本发明的具体实施例中，给出了一些针对动物如鼠的给药方案。从动物如鼠的给药剂量换算为适用于人类的给药剂量是本领域技术人员易于作出的，例如可根据Meeh-Rubner公式来进行计算：Meeh-Rubner公式：A＝k×(W2/3)/10,000。式中A为体表面积，以m2计算；W为体重，以g计算；K为常数，随动物种类而不同，一般而言，小鼠和大鼠9.1，豚鼠9.8，兔10.1，猫9.9，狗11.2，猴11.8，人10.6。应理解的是，根据药物以及临床情形的不同，根据有经验的药师的评估，给药剂量的换算是可以变化的。
本发明的药物组合物还可被配制成单元剂型的方式，以便于按期、定量地用药。
如本文所用，术语“单元剂型”、“单位剂型”是指为了服用方便，将本发明的组合物制备成单次服用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂。所述的单元剂型中含适于单次、单日或单位时间服用量的本发明的组合物。
在本发明的一些优选方式中，所述的组合物为单元剂型。当将组合物制备成单元剂型时，每个几日或几周服用所述单元剂型的组合物1剂。
本发明还提供了含有所述的药物组合物或直接含有所述的芦丁及雷帕霉素和/或化疗药物的药盒。此外，所述的药盒中还可包括说明药盒中药物的使用方法的说明书。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料和方法
1.细胞培养
(1)细胞系维持
正常人源前列腺原代基质细胞系PSC27(获自美国Fred Hutchinson CancerResearch Center)于37℃和5％ CO2条件的培养箱中培养，在PSCC完全培养液(美国Gibco，也可使用Thermo Fisher同名产品)中增殖和传代。
(2)细胞冻存与复苏
a.细胞冻存
以0.25％胰蛋白酶收集对数生长期细胞，1000rpm离心2min，弃去上清，重新悬浮细胞于新鲜配置的冻存液中。分装细胞于已标示的无菌冻存管中。然后经梯度降温，最后转入液氮中长期储存。
b.细胞复苏
取出液氮中冻存的细胞，立即放入37℃水浴，使其快速融化。直接加入2ml细胞培养液，使细胞均匀悬浮。待细胞贴壁后，更换新的培养液。
(3)体外实验处理
为造成细胞损伤，PSC27细胞生长至80％(简称PSC27-CTRL)时培养液中加入50μg/ml博莱霉素(bleomycin，BLEO)。药物处理12小时后，细胞被PBS简单洗过3次，留置于培养液中7-10天，然后进行后续实验。
2.天然产物库的筛选
针对一个共有大量各种成分、多为药用植物提取物(含个别动物来源的物质)并有抗衰老潜力的天然产物库(NMA)(Shyuanye Biotechnology)进行药效学分析。将各种产物分别按照一定浓度梯度稀释至96孔板，密度为每孔5000个细胞。培养基使用DMEM，天然产物(或化合物)的工作浓度一般控制在1μM-l mM。药物处理后3-7天，细胞增殖用CCK-8CellCounting Kit试剂盒(基于WST-8原理，Vazyme)测定，细胞凋亡活性以Caspase 3/7activity kit(Promega)确定。
初步确定的候选药物进一步筛选30天。将进入第二轮候选范围的药物稀释到6孔板中，每孔20,000个细胞。培养基和候选药物每隔一天更换一次。为确定每种药物对细胞表型和存活率等的影响，项目根据不同浓度的药物进行验证性分析。
3.免疫印迹和免疫荧光检测
用NuPAGE 4-12％ Bis-Tris gel分离细胞裂解来源蛋白质，并转移到硝化纤维素膜(Life Technologies)上。用5％脱脂牛奶在室温下阻断印迹1h，在4℃下与所需的一抗在制造商协议的浓度下孵育一夜，然后在室温下与辣根过氧化物酶结合二抗(Santa Cruz)孵育1h，用增强化学发光(ECL)检测试剂(Millipore)按照制造商的协议开展膜印迹信号检测，并使用ImageQuant LAS 400Phospho-Imager(GE Healthcare)。作为一种标准的蛋白质标记，发明人使用Thermo Fisher Scientific公司提供的PageRuler Plus PrestainedProtein Ladder(no.26619)。
对于免疫荧光染色，目标细胞在培养皿中培养之后在coverslip上预种至少24h。在短暂洗涤后，用4％多聚甲醛在PBS中固定8min，用5％正常山羊血清(NGS，ThermoFisher)阻断30min。小鼠单克隆抗体anti-phospho-Histone H2A.X(Ser139)(cloneJBW301，Millipore)和小鼠单克隆抗体anti-BrdU(Cat#347580，BD Biosciences)，及二级抗体Alexa488(or 594)-conjugated F(ab’)2按顺序加入到覆有固定细胞的载玻片上。细胞核用2μg/ml of 4’，6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)进行复染。从3个观察视野中选取最具代表性的一张图像进行数据分析和结果展示。FV1000激光扫描共聚焦显微镜(Olympus)用于获取细胞共聚焦荧光图像。
4.全转录组测序分析(RNA-sequencing)
对不同处理条件下的人源前列腺原代基质细胞系PSC27进行全转录组测序。从基质细胞中获得总RNA样本。其完整性经Bioanalyzer 2100(Agilent)验证，RNA用IlluminaHiSeq X10测序，基因表达水平由软件包rsem(https://deweylab.github.io/rsem/)进行量化。简而言之，以RiboMinus Eukaryote kit(Qiagen，Valencia，CA，USA)消除RNA样品中的rRNA；并根据制造商的指示，在深度测序前用TruSeq Stranded Total RNA preparationkits(Illumina，San Diego，CA，USA)构建链特异性RNA-seq文库。
Paired-end transcriptomic reads取被映射到参考基因组(GRCh38/hg38)，并使用Bowtie工具从Gencode v27进行参考注释。使用picard tools(1.98)脚本标记重复项(https://github.com/broadinstitute/picard)识别重复读取，只保留非重复读取。Reference splice junctions由参考转录组提供(Ensembl build 73)。用Cufflinks计算FPKM值，用Cufflinks，最大似然估计函数调用差异基因表达。表达显著变化的基因由falsediscovery rate(FDR)-corrected P value<0.05定义，仅用状态“Known”和生物型“coding”的ensembl genes 73进行下游分析。
接下来使用Trim Galore(v0.3.0)(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/)修剪Reads，而质量评估使用FastQC(v0.10.0)(http://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc/)。随后，利用DAVIDbioinformatics platform(https://david.ncifcrf.gov/)，Ingenuity PathwaysAnalysis(IPA)program(http://www.ingenuity.com/index.html)。在Majorbio I-SangerCloud Platform(www.i-sanger.com)免费在线平台上对原始数据进行了初步分析，并将原始数据存入NCBI Gene Expression Omnibus(GEO)database数据库，登录代码为GSE156448。
5.蛋白质-蛋白质相互作用网络分析
用STRING3.0进行蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)分析。将符合标准的特定蛋白质导入在线分析软件(http://www.networkanalyst.ca)，选择一个最小交互网络进行进一步的集线器和模块分析。
6.基因集富集分析(GSEA)
基于RNA-seq初步分析所得数据，对于每个差异表达显著基因分析比较，基因是使用从DESeq2获得的“wald statistics”进行排序的，GSEA是在MSigDB(http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb)中可用的所有规划基因集的这些排序列表上进行的)。DESeq2 independent filtering是基于归一化读取计数的平均值，筛选出表达水平很低的基因。SASP和GSEA signature如发明人过往发表文献所述(Zhang等人，2018a)。
7.定量PCR(RT-PCR)测定基因表达
(1)细胞总RNA的提取
以Trizol试剂抽提。分光光度计定量RNA之后，取少量总RNA进行1％琼脂糖电泳，检查RNA状态和质量。
(2)逆转录反应
(3)实时定量PCR反应
反应完成后，经软件分析查看每个基因的扩增情况，导出相应的域值循环数，采用2-ΔΔCt方法，计算每个基因的相对表达量。对融解曲线(melting curve)的波峰和波形进行分析以确定得到的扩增产物是否为特异性单一目的片段。
8.SA-β-Gal染色
衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色，操作执行以往报道程序(Debacq-Chainiaux等人，2009年)。简单地说，细胞培养皿中经PBS洗涤，在室温下固定。在2％甲醛和0.2％戊二醛中作用3min，用以固定细胞。然后用新制备的染色液对SA-β-Gal进行染色，在37℃下过夜。第二天拍摄图像并计算单位面积内阳性细胞百分比。
9.克隆扩增实验
单细胞克隆扩增实验。简单地说，细胞被铺板于明胶涂层的12孔板，密度为2000个细胞/孔。结晶紫染色之后计算细胞克隆数。
10.药物诱导衰老细胞凋亡
将PSC27细胞铺板于96孔皿中，在50μg/ml的BLEO处理下诱导细胞衰老。分别以100μM和50μM的浓度加入芦丁(Rutin)和PCC1。细胞培养基配以Incucyte Nuclight快速红色试剂(Essen Bioscience)和IncucyteC-3/7细胞凋亡试剂(Essen Bioscience)。选取代表性视野进行拍照。
11.小鼠移植瘤接种和预临床治疗试验
所有实验小鼠实验均严格遵循实验动物的有关规章进行。年龄6-8周的免疫缺陷型小鼠(NOD-SCID mice，ICR)(体重约25g)用于本发明相关动物实验。基质细胞PSC27和上皮细胞PC3以1:4预先确定的比例混合，而每一移植体包含1.25×106细胞，用于组织重构。移植瘤通过皮下移植方式植入小鼠体内，移植手术结束之后8周末动物被执行安乐死。肿瘤体积按照如下公式计算：V＝(π/6)x((l+w)/2)3(V，体积；l，长度；w，宽度)。
在预临床治疗试验中，经过皮下移植的小鼠被供给标准实验食谱，2周之后实施化疗药物米托蒽醌(MIT，0.2mg/kg剂量)和/或芦丁(Rutin)(500μl，10mg/kg剂量)、雷帕霉素(Rapamycin)(500μl，10mg/kg剂量)腹腔给药。时间点为：三种药物均在第3，5，7周的第一天对小鼠进行给药。整个疗程共进行3次循环给药，每个循环为2周。疗程结束后，小鼠肿瘤被收集用于体积测量和组织学分析。每只小鼠累积性共接受MIT这一药物0.6mg/kg体重，芦丁30mg/kg体重，雷帕霉素30mg/kg体重。为造成全身范围SASP因子在化疗诱导下表达，MIT按照以上步骤和顺序，经过静脉输注方式对小鼠给药，但剂量下降至0.1mg/kg体重/每次(整个疗程累计接受MIT剂量为0.3mg/kg体重)以减轻药物相关毒性。化疗试验进行到第8周末结束，小鼠处死之后立即解剖，其移植瘤被收集并用于病理系统分析。对于乳腺癌荷瘤小鼠，预临床步骤同上，化疗药物阿霉素(DOX，1.0mg/kg剂量)和/或芦丁(Rutin)(500μl，10mg/kg剂量)、雷帕霉素(Rapamycin)(500μl，10mg/kg剂量)腹腔给药。对于替代性化疗药物，长春新碱(vincristine)或长春碱(vinblastine)(1.0mg/kg剂量)经腹腔给药。
12.生物统计学方法
本发明中所有涉及细胞增殖率，存活率和SA-β-Gal染色等的体外实验和小鼠移植瘤及预临床药物处理的体内试验均重复3次以上，数据以均值±标准误的形式呈现。统计学分析建立在原始数据的基础上，通过one-way analysis of variance(ANOVA)or a two-tailed Student’s t-test进行计算，而P<0.05的结果认作具有显著性差异。
因素之间的相关性用Pearson’s correlation coefficients检验。当小鼠在几个队列中获得并分组在笼子中时，采用Cox proportional hazard model进行生存分析。该模型将治疗的性别和年龄作为固定效应，队列和初始笼分配作为随机效应。由于在研究中，一些小鼠被从最初的笼子中移动，以尽量减少来自单笼外壳的压力，发明人还进行了没有笼效应的分析。这两种分析的结果在方向性或统计意义上没有很大差异，增强了对发明人结果的自信度。生存分析使用statistical software R(version 3.4.1；library‘coxme’)。在大多数实验和结果评估中，研究者对分配采取盲选。发明人使用基线体重将小鼠分配至实验组(以实现组间相似的体重)，因此只在与体重匹配的组内进行随机化。本发明中的所有重复都来自不同的样本，每个样本来自不同的实验动物。
实施例1、药物筛选显示芦丁是一种潜在的抗衰老小分子药物
为了鉴定能够有效靶向衰老细胞的新化合物，发明人利用一个由许多种天然成分(NMAs)库组成的文库进行了无偏倚的药物筛选，其中大部分是植物化学产物。为此，发明人选择了一个人类原代前列腺基质细胞系PSC27，作为一个细胞模型。PSC27主要由成纤维细胞组成，但也含有少量非成纤维细胞如平滑肌细胞和内皮细胞。该细胞系在暴露于基因毒性化疗和电离辐射等应激源时形成典型的SASP。为了诱导衰老，用预先优化和建立的亚致死剂量博莱霉素(BLEO)(50μg/ml)处理细胞，并观察到衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-GAL)染色阳性升高，BrdU掺入减少，DNA损伤反应(DDR)增强。建立了一种筛选策略来比较所检测的个别药物对衰老细胞存活和表达谱的影响(图1)。
发明人首先确定了NMA库中的这些药物成分对衰老PSC27的疗效，并探索了其作为规模性药物筛选的实验细胞模型的潜力。发明人的初步数据表明，许多化合物能够改变衰老细胞(SEN)的生物活性，但不能影响增殖细胞(图2-4)。这一特性意味着PSC27是开展后续实验探索的十分理想、合格的模型，因为它允许选择性地靶向衰老细胞群，而不是生长的对照组细胞群，很大程度上确保了使用这一人源基质系进行进一步深入研究的可行性。在对NMA库的大规模筛选中，发明人甚至没有鉴定出单一的senolytics，它被认为具有选择性杀死培养中的衰老细胞的潜力，如阳性对照原花青素C1(图2、3)，这表明自然界中天然抗衰老药物的及其匮乏，并且现实中难以扩大这一类特定的抗衰老药物的物质贮备。
然而，发明人观察到，少数NMA成分表现出显著的senomorphics潜能，这确实值得继续研究(图5、6)。而其中芦丁是尤为突出的(图5、7)。
在下调SASP的一种标记因子，即白细胞介素的8(IL8)表达方面有显著作用的衰老制剂中，发明人选择芦丁进行深入分析(图7、8)。芦丁作为一种从野生植物中提取的类黄酮，具有广泛的生物活性，其作用主要被聚焦于对高血糖、肾病、神经病变和心血管疾病的保护作用。然而，其医学意义，包括调节衰老细胞的活性，特别是SASP表达，以及相关的治疗能力和功能机制，至今仍然属于一个未知、基本空白的领域。
实施例2、芦丁可抑制广谱SASP的表达而不影响细胞衰老本身
如前述，芦丁抑制了SASP标志因子IL8的表达，但它是否影响细胞衰老和广泛意义上的SASP，或者绝大多数其它SASP因子，仍不清楚。为了回答这些问题，发明人进行了体外检测，发现SA-β-GAL染色和BrdU掺入基本保持不变，无论细胞增殖或衰老，后者由博莱霉素(BLEO)诱导，这是临床肿瘤学中经常给癌症患者使用的基因毒药物(图9、10)。
在发明人使用的不同浓度的培养中，100μM的芦丁对抑制典型SASP组分的表达产生了最佳的抑制效果，包括IL6、IL8、IL1a、IL1b、CXCL3、MMP3和GM-CSF(图11)。
此外，对RNA-seq数据集的分析，分析PSC27的转录组表达模式表明，令人惊讶的是，大多数SASP因子确实被芦丁下调，尽管一些与细胞衰老或SASP的表达状态不直接相关的基因也发生了改变(图12)。
作为支持性证据，GSEA输出结果图很大程度上证实了芦丁对衰老细胞表达的影响，表明特异性显著抑制了SASP(图13)。
生物信息学进一步分析显示，在培养条件下，芦丁暴露于衰老的PSC27细胞中有4619个转录本被显著修饰(基于log2的2倍变化，p<0.01)(3733个下调，886个上调)(图14)。
将转录本映射到包含HPRD、Entrez基因和UniPROT登录标识符的基因本体(GO)数据库后，发明人注意到上调基因最普遍的分子功能(代表性的前100名)是细胞因子活性、金属肽酶活性、结构分子活性和受体活性(图15)。
这些基因编码的蛋白，生物活性中最典型的细胞成分是那些被运输到细胞外空间的，其次是那些位于细胞质和细胞核中的，尽管许多产物确实属于可溶性组分、细胞外空间、细胞外区域和外泌体的亚类(图16)。此外，与上调基因相关的最主要的生物学过程是细胞间通信、炎症反应、细胞生长和/或维持、碱基、核苷、核苷酸和核酸代谢的调节(图17)。
总之，发明人的数据表明，芦丁在抑制与衰老细胞促炎反应和分泌活性密切相关的基因表达方面具有显著的应用潜力。
实施例3、芦丁通过干扰ATM与HIF1α和TRAF6的相互作用来抑制ASAP
接下来，发明人探究了支持芦丁对细胞衰老相关表型的发展产生影响的分子机制，特别是SASP。为了评估芦丁对细胞内DDR信号传导的潜在作用(这是一个允许基因组DNA损伤激活下游炎症反应的事件)。
发明人首先收集了芦丁处理增殖或衰老细胞前后的PSC27细胞的总裂解物。免疫印迹结果显示，ATM(DDR信号的中枢调节因子之一)，在BLEO诱导衰老时被显著激活(图18)。
在应对固有或环境刺激时，增殖细胞倾向于首先表现出急性应激相关表型(ASAP)，包括涉及ATM激活和核到质易位，TRAF6介导的单泛素化和TAK1磷酸化，这一过程可以在细胞暴露后2-3天内观察到的胁迫损伤过程中出现。作为遗传毒性应激诱导的细胞反应的一个重要组成部分，也是ASAP的一个关键调节器，在实验中，细胞质激酶TAK1明显被磷酸化，这一变化在功能上启动了它，以便随后参与双前馈机制来协调SASP的发育。
发明人进一步注意到，TAK1下游靶点p38MAPK的激活，PI3K/AKT/mTOR信号轴(持续SASP信号的中介，由mTOR和AKT磷酸化表示)，以及ASAP标记分子IL8的上调(在大多数细胞系中也作为SASP的标记)，在BLEO治疗后以急性方式发生(图18)。
然而，当芦丁存在时，这些显著的变化通常减少，除了ATM磷酸化在很大程度上不受影响，这表明芦丁的潜在靶标在ATM下游，但却位于TAK1，p38MAPK和其它调控因子的上游，这样一个靶标在功能上会涉及诱导细胞衰老的急性反应(图18)。
在此过程中，激活的TRAF6和TAK1之间存在直接相互作用联系，这种现象在DNA损伤后不久出现，但受到TAK1抑制剂5Z-7-oxozeaenol的抑制。然而，芦丁是否破坏这一过程尚不清楚。发明人选择进行磷酸化TAK1(p-TAK1)介导的IP和随后的免疫印迹分析，发现TAK1的激活和TRAF6-TAK1的相互作用都受到芦丁的显著抑制(图19)。这些数据证实了芦丁的直接靶点应该超出了TRAF6和TAK1的相互关联。
为了查明芦丁在快速过程中的影响机制，早期反应最终导致SASP形成作为一种慢性现象，发明人对有可能与ATM相互作用的分子进行了全基因组定位。生物信息学分析显示，人类细胞中有279个独特的ATM相互作用子和379个独特的TRAF6相互作用子，最终输出中有22个ATM和TRAF6相互作用分子共享。进一步的研究排除了探索绝大多数可以与ATM和TRAF6相互作用的分子的必要性，缺氧诱导因子1α(HIF1α)是一个值得继续研究的候选分子。
来自p-ATM介导的IP和相应的免疫印迹分析的数据表明，ATM和TRAF6可以相互作用，但芦丁无疑显著削弱了这种相互作用。更重要的是，ATM和HIF1α之间存在相互作用，这也会受到芦丁的干扰(图20)。
作为进一步的证据，发明人观察到在细胞衰老时NF-κB转录复合物的两个主亚基p65和p50出现显著的细胞质-细胞核易位，尽管这种趋势在芦丁的存在下很大程度上被消除(图21)。值得注意的是，HIF1α表现出与p65和p50大致相似的核易位(图21)，这提示该因子参与调节与衰老和/或衰老相关表型相关的基因的表达，特别是SASP。与转录复合物NF-κB一样，HIF1α是适应性反应过程中的关键转录因子，协调了许多参与血管生成、红细胞生成、糖酵解代谢和炎症的基因的转录，而其在衰老中的意义仍未得到充分的探索。HIF1α作为将ATM传递的损伤信号进而递送到细胞核的中心因子，负责一系列对衰老维持和SASP发育至关重要的因子的上调。
为了证实这一推测，发明人评估了编码SASP因子或衰老特异性标记的一个基因子集的表达。数据表明，无论是选择性HIF-1α抑制剂PX-478，还是C25-140，一种能减少TRAF6介导的泛素链形成的小分子化合物，都能显著降低实验中检测的典型SASP因子的表达(图22)。然而，p16INK4A和p21CIP1的表达似乎不受影响。通过天然制剂芦丁调节ATM与其关键靶点HIF1α和TRAF6之间的相互作用，可抑制SASP的表达，同时维持细胞衰老，这一独特的特征在很大程度上与衰老形态的标准一致。
在对BLEO造成的基因毒性损伤中，PSC27细胞表现出显著升高的ROS水平(图23)。虽然芦丁没有改变增殖细胞中ROS的产生，但它显著抑制了衰老细胞产生ROS的能力，因此与其清除自由基的能力基本相互一致。
实施例4、芦丁能够消除衰老基质细胞以旁分泌的方式赋予癌细胞的恶性
在使用衰老PSC27细胞的CM处理后，发明人观察到几种PCa细胞系PC3、DU145、M12和LCaP的增殖显著增加(p<0.01)(图24)，并伴有迁移和侵袭的增强(图25、图26)。然而，用芦丁治疗癌细胞后，这些获得性功能则显著消减(图24-图26)。实验中芦丁终浓度均为100μM。为了进一步提高抑制效果，发明人进一步进行了药物筛选，经过针对大量的候选药物的分析研究，最终聚焦于雷帕霉素，发现其与芦丁的联合产生协同增效作用是明显的。当芦丁与雷帕霉素联合使用时，可以在芦丁产生的抑制效果基础上进一步造成癌细胞恶性活性的更加显著的下降(图24-26)。
SASP的一些因子，如WNT16B、SFRP2、SPINK1和AREG可以对癌细胞造成显著的耐药性。然而，SASP的抗性促进能力是否能被芦丁阻止，仍不确定。发明人发现，暴露于衰老基质细胞来源的CM后，癌细胞的耐药活力显著增加，但在加入芦丁(终浓度为100μM)后，耐药性降低了大约80％(图27)。
尽管PSC27-BLEO CM增加了暴露于0.1-1.0μM化疗药物MIT的PC3的存活力，而MIT在此实验条件下接近临床背景的患者血清浓度，芦丁(终浓度为100μM)能够显著抑制衰老基质细胞CM赋予的癌细胞抗性(图28)。进一步地，令人惊讶的是，雷帕霉素与芦丁联合使用时则能产生更佳的效果，甚至将癌细胞的获得性耐药特征基本回复到对照组(即PSC27原代细胞组)的状态(根据图28可见其曲线与PSC组的曲线基本重合)，这是十分出乎意料的。
因此，芦丁可以显著剥夺衰老基质细胞赋予癌细胞对化疗药物的耐药性，而雷帕霉素与芦丁联合使用时发生协同增效，即使得这种剥夺能力出现更大的提高，为开发新的治疗方案以改善抗癌效果提供了基础。
实施例5、在临床前试验中芦丁联合化疗可提高抗癌治疗的疗效
鉴于芦丁对癌细胞表达谱和体外表型的影响，发明人接下来询问了芦丁在体内条件下可能显示出的治疗效果。为了解决这一问题，发明人在皮下植入严重联合免疫缺陷(SCID)实验小鼠的后腹之前，以预先优化的比例(1：4)将PSC27细胞与PC3细胞混合，生成了组织重构体。在8周的期间结束后，测量动物的肿瘤大小。与由PC3和PSC27原代幼稚细胞(PSC27SNaive)生成的肿瘤相比，由PC3和PSC27SEN组成的异种移植物显示出明显增大(图29)。然而，预处理PSC27SEN细胞体外生成的组织重构则表现出显著减少的肿瘤体积(p<0.0001)，这一点同雷帕霉素治疗肿瘤的有效性很相似，即对人类衰老细胞只进行一次体外靶向用药却可以产生长期体内后果。
为了密切模拟化疗条件下的临床情况，发明人设计了一个包含基因毒药物和/或芦丁的临床前方案(图30、图31)。人类细胞植入小鼠体内两周后，通常观察到宿主动物对肿瘤的稳定摄取，在第3周、第5周和第7周的第1天给予单剂量MIT或安慰剂，直到8周方案结束(图31)。与安慰剂相比，MIT治疗导致肿瘤大小显著缩小，验证了MIT作为一种细胞毒药物的有效性(图32)。值得注意的是，SASP典型因子包括IL6，IL8，AREG，IL1α，MMP1，MMP3，ANGPTL4和SPINK1，普遍出现显著上调，同时一组典型的衰老标记包括p16INK4A，p21CIP1和SA-β-GAL均升高，这意味着响应MIT治疗的体内衰老和SASP的发展(图33、图34、图35)。有趣的是，MIT治疗造成基质和癌细胞群普遍出现的某些SASP因子如MMP3的表达，和典型衰老标记包括p16INK4A和p21CIP1，表明化疗引起全面体内衰老，尽管SASP在这两个细胞群之间似乎呈现不同的发展趋势(图34、图35)。SA-β-GAL染色结果证实了MIT引起的相当程度的组织层面的衰老，与芦丁形成鲜明对比；而芦丁似乎既不促进也不抑制衰老(图36)，这一特征与发明人的体外观察结果基本一致。
发明人接下来询问了在技术上抑制治疗性损伤造成的广谱SASP的发展是否可以进一步增强肿瘤对于治疗的反应。为此，自第一剂临床前治疗开始，使用了雷帕霉素，这是一个非常成熟的抗衰老药物，尤其在靶向SASP发生发展方面；同时发明人也采用了芦丁，作为平行给药并比较二者的干预效果。虽然MIT本身导致了仅含有PC3细胞的肿瘤收缩(p<0.001)，但senomorphics的给药并没有呈现出显著的效果(p>0.05)(图37)。
值得注意的是，即使这些药物与MIT联合使用，也没有带来进一步的好处(p>0.05)，这意味着PC3肿瘤生长独立于组织水平的SASP，特别是在没有基质细胞的情况下。引人注目的是，当PC3细胞与其基质细胞结合并形成组织重构体后，发明人观察到肿瘤体积显著增加(p<0.0001)，进一步验证了基质细胞在体内的促瘤作用(图37)。然而，当载有PC3/PSC27肿瘤的动物暴露于MIT时，肿瘤体积显著减少(35.5％，p<0.001)。在雷帕霉素或芦丁与MIT双重治疗联合使用后，肿瘤呈现进一步缩小，这一体积的缩小极其显著。其中雷帕霉素与MIT双重治疗比之单用MIT使得肿瘤体积进一步缩小34.1％(p<0.01)；而芦丁与MIT双重治疗比之单用MIT使得肿瘤体积进一步缩小达48.9％(p<0.0001)(图37)。该结果说明，芦丁与MIT的联用比雷帕霉素与MIT的联用具有相对更优异的效果。
需要注意的是，当雷帕霉素和芦丁共同用于跟化疗药物MIT治疗肿瘤时，干预达到最佳效果，肿瘤体积在MIT单药治疗基础上进一步缩小(68.3％，p<0.0001)(图37)，这是出乎意料的。
然而当发明人使用维生素C(Vitamin C)，一种天然抗氧化剂，也是一种SASP抑制剂、代替雷帕霉素与芦丁、MIT治疗肿瘤时，则未能重复出这些干预效果，肿瘤体积却出现上升，基本回到了MIT单药治疗时的效果(图38)。因此，即便都是衰老领域经常使用的、有效的SASP抑制剂，芦丁与不同小分子化合物联合使用并跟化疗药物联合干预肿瘤时可以出现截然不同的效果。其中，芦丁和雷帕霉素共同使用的条件下造成的协同作用，为将来抗癌治疗提供了全新的选项和思路。
在此基础上，发明人研究了其它化疗药物的治疗效果是否都会在结合芦丁和/或雷帕霉素使用的条件下得以显著提高。结果表明，事实并非如此，多种化疗药物的抗肿瘤治疗即未能从芦丁和/或雷帕霉素联合用药中获益，如长春新碱(VCR)即是如此(图39)。
为了揭示SASP诱导的癌症耐药性的内在机制，发明人选择在治疗开始后第7天从动物身上获取并解剖肿瘤，这是耐药性克隆发展之前的一个时间点。与安慰剂相比，MIT本身会导致癌细胞出现显著的DNA损伤和凋亡(图40)。在PC3/PSC27异种移植物中，单独使用芦丁治疗既不能引起典型的DDR，也不会增强细胞死亡，这表明当动物仅暴露于芦丁时，这些肿瘤的反应十分有限。
芦丁与MIT联合使用后，进一步增加了细胞凋亡率，提示与MIT联合使用时具有协同性细胞毒性。体内细胞凋亡模式与不同药物治疗后肿瘤消退模式基本一致。基于Caspase3自我裂解程度的IHC染色结果表明，当芦丁与MIT一起使用时，细胞凋亡指数显著上升(图40)。当芦丁与雷帕霉素同时跟MIT联合使用时，则能在芦丁与MIT联合使用的基础上进一步提升DNA损伤和细胞凋亡的指数(图40)，说明这种情况下病灶中癌细胞的清除可以达到最佳效果。
ELISA数据表明，MIT介导的化疗导致动物循环血液中AREG和EREG蛋白水平升高，而这一模式在使用芦丁的情况下则被显著逆转(图41)。而芦丁一旦同雷帕霉素联合使用则可以在芦丁单独与MIT使用的基础上进一步降低小鼠血液中AREG和EREG的蛋白水平(图41)。
鉴于联合治疗在癌症治疗中造成的显著疗效，发明人进一步扩展了该类药物和肿瘤干预相关研究。通过生成由MDA-MB-231(恶性乳腺癌细胞)和HBF1203(乳腺间质细胞)组成的异种移植物来确认乳腺癌的进展和治疗结果，这是发明人之前用于癌症研究的人类乳腺来源细胞的一种组合。同样，MDA-MB-231/HBF1203肿瘤在特定化疗药物如阿霉素(DOX)的干预下基本复制了PCa的临床前实验结果(图42)。然而，并非所有的化疗药物干预均能出现这种效果，如长春碱(VIN)则不具备药物联合治疗的特征(图43)。
结果表明，SASP靶向策略对于肿瘤耐药性的干预效果虽然并不局限于特定的癌症类型，并可能适用于更加广泛的、多种实体恶性肿瘤，但实际适用性仅适用于某些化疗药物。总体而言，决定这一干预效果差异的深层机制，需要后续研究予以深入解析。
作为现代药物走向转化医学、进入临床实践之前的一个重要环节，发明人进而检测了芦丁这一新型的senomorphics药物以及雷帕霉素用于跟传统化疗制剂联合抗癌时的安全性。结果发现，实验小鼠的各项生理数据，包括日常体重、肝肾毒性指标(如肌酐、尿素，ALP、ALT等)和血液成分(如球蛋白、白细胞、淋巴细胞和血小板等)，均未出现显著波动(图44-48)。
这些结果表明，芦丁是一种非常有效、也很安全的天然小分子senomorphics药物，雷帕霉素与芦丁能够发挥协同作用，大大促进化疗药物的作用，将来在临床治疗方面的应用前景十分可观。
实施例6、各种药物联合应用于抗肿瘤的效果分析
本发明人的前期大量的筛选研究中，比对了各种药物联合应用于抗肿瘤的效果，有的药物联用后并没有显著呈现更有效果，而有的药物连用后反而导致抑瘤作用的下降。
药物联合应用后导致抑瘤作用下降的化合物组合及抑瘤测定结果列于表1中。实验中给药方法同前述预临床治疗试验，表中未标注用量的组分按照前述预临床治疗试验中给出的用量。
表1
因此，绝大多数药物的组合并没有达到药学意义的提高。而经由大量筛选、组合联用研究后，本发明中得到了具有协同增效作用的组合芦丁、雷帕霉素及米托蒽醌组合。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

Claims (10)

1.芦丁及雷帕霉素或它们的衍生物的应用，用于与化疗药物联合使用，制备特异性靶向抑制衰老相关分泌表型及抑制肿瘤和/或逆转肿瘤耐药性的组合物；其中，所述的化疗药物为给药后诱发衰老相关分泌表型的化疗药物，包括米托蒽醌或博莱霉素；所述衍生物包括芦丁及雷帕霉素的药学上可接受的盐、酯、异构体、溶剂合物或前药。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述衰老相关分泌表型为DNA损伤导致的衰老相关分泌表型；较佳地，所述的DNA损伤为化疗药物造成的DNA损伤。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合物中，所述芦丁或雷帕霉素或它们的衍生物还用于：
抑制广谱衰老相关分泌表型的表达；较佳地，其在不影响细胞衰老的情况下抑制广谱衰老相关分泌表型的表达；
干扰ATM与HIF1α和TRAF6的相互作用，抑制急性应激相关表型；
消除衰老基质细胞以旁分泌的方式赋予癌细胞的恶性；
增加肿瘤细胞凋亡率；和/或
抑制衰老相关分泌表型的组分IL8、IL6、IL1a、IL1b、CXCL3、MMP3、GM-CSF。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤包括：前列腺癌，乳腺癌，肺癌，结直肠癌，胃癌，肝癌，胰腺癌，膀胱癌，皮肤癌，肾癌，食管癌、胆管癌、脑癌。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的化疗药物为米托蒽醌；所述组合物中，米托蒽醌、芦丁、雷帕霉素的重量比例为1:20～80:20～80；较佳地，米托蒽醌、芦丁、雷帕霉素的重量比例为1:30～70:30～70；更佳地，米托蒽醌、芦丁、雷帕霉素的重量比例为1:40～60。
6.一种用于特异性靶向抑制衰老相关分泌表型以及抑制肿瘤和/或逆转肿瘤耐药性的药物组合物或药盒，包括：芦丁及雷帕霉素或它们的衍生物，以及化疗药物；其中，所述的化疗药物为给药后诱发衰老相关分泌表型的化疗药物，包括米托蒽醌或博莱霉素；所述衍生物包括芦丁及雷帕霉素的药学上可接受的盐、酯、异构体、溶剂合物或前药；
较佳地，米托蒽醌与芦丁及雷帕霉素组合时，米托蒽醌、芦丁、雷帕霉素的重量比例为1:20～80:20～80；较佳地，米托蒽醌、芦丁、雷帕霉素的重量比例为1:30～70:30～70；更佳地，米托蒽醌、芦丁、雷帕霉素的重量比例为1:40～60。
7.一种制备抑制肿瘤和/或逆转肿瘤耐药性的药物组合物或药盒的方法，包括：将芦丁及雷帕霉素或它们的衍生物与化疗药物混合；或将芦丁及雷帕霉素或它们的衍生物与化疗药物置于同一药盒中；其中，所述的化疗药物为给药后诱发衰老相关分泌表型的化疗药物，包括米托蒽醌或博莱霉素；较佳地，将米托蒽醌与芦丁及雷帕霉素混合或组合时，米米托蒽醌、芦丁、雷帕霉素的重量比例为1:20～80:20～80；较佳地，米托蒽醌、芦丁、雷帕霉素的重量比例为1:30～70:30～70；更佳地，米托蒽醌、芦丁、雷帕霉素的重量比例为1:40～60；所述衍生物包括芦丁及雷帕霉素的药学上可接受的盐、酯、异构体、溶剂合物或前药。
8.芦丁及雷帕霉素或它们的衍生物的用途，用于制备特异性靶向抑制衰老相关分泌表型的组合物；较佳地，所述芦丁及雷帕霉素或它们的衍生物干扰ATM与HIF1α和TRAF6的相互作用，抑制急性应激相关表型；消除衰老基质细胞以旁分泌的方式赋予癌细胞的恶性；和/或，增加肿瘤细胞凋亡率；所述衍生物包括芦丁及雷帕霉素的药学上可接受的盐、酯、异构体、溶剂合物或前药。
9.一种筛选促进芦丁及雷帕霉素靶向抑制衰老相关分泌表型及抑制肿瘤和/或逆转肿瘤耐药性的潜在物质的方法，所述方法包括：
(1)提供一肿瘤微环境体系，该体系包括肿瘤细胞；
(2)利用化疗药物处理(1)的体系，诱发肿瘤微环境发生衰老相关分泌表型；其中，所述的化疗药物为给药后诱发衰老相关分泌表型的化疗药物，包括米托蒽醌或博莱霉素；在诱发肿瘤微环境发生衰老相关分泌表型之前、之时或之后，以芦丁及雷帕霉素进行处理；和
(3)将候选物质加入到(2)的体系中，观测其对肿瘤微环境体系的作用，若所述候选物质在统计学上能够促进芦丁及雷帕霉素抑制衰老相关分泌表型及抑制肿瘤和/或逆转肿瘤耐药性，则该候选物质是可与芦丁及雷帕霉素联用、抑制肿瘤的潜在物质。
10.一种筛选抑制衰老相关分泌表型的潜在物质的方法，所述方法包括：
(1)提供一基质细胞体系，诱导该体系产生衰老相关分泌表型；在衰老相关分泌表型之前、之时或之后，以芦丁及雷帕霉素进行处理；
(2)将候选物质加入到(1)的体系中，观测其对该基质细胞体系的作用，若其能特异性促进芦丁及雷帕霉素对于衰老相关分泌表型的抑制作用，则该候选物质是可与芦丁及雷帕霉素联用、抑制衰老相关分泌表型的潜在物质。
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