CN109248318B - Shank2基因的功能与用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生命科学研究领域，本发明首次发现Shank2扩增能够抑制Hippo通路并且转化原代细胞；然而在Hippo通路已经异常的肿瘤细胞系里，Shank2的抑制又能恢复Hippo通路的调控并且抑制细胞的增值。Shank2能够通过竞争性结合Lats1的激活因子而抑制Hippo通路，并且作为一个潜在的癌基因，Shank2在体内能够促进细胞的转化及肿瘤的生长。因此，这些证据都表明Shank2作为进化上高度保守的Hippo通路的一个新的调控因子，代表了一个新的人类癌基因和一个潜在的治疗肿瘤的靶点。

Description

Shank2基因的功能与用途

技术领域

本发明属于生命科学研究领域，具体涉及Shank2基因的功能与用途。

背景技术

为了阻止细胞的恶性增殖，器官和组织中的细胞数量受严格的控制。对于正常细胞，当细胞密度达到彼此互相接触时细胞增殖就会停止。这种“接触抑制”现象对于组织自稳态是十分重要的。细胞失去接触抑制是肿瘤发生的一个标志。

Hippo通路是细胞出现接触抑制的首要效应器。Hippo通路首先是在果蝇体内被发现，已经被研究证实能够在很大程度上影响细胞数量和器官大小。之后在哺乳动物体内的研究也得到类似的结论，Hippo通路的异常会导致肿瘤的发生。Hippo通路的核心元件包括上游的激酶MST1/2和LATS1/2，以及转录共激活因子YAP和TAZ，YAP/TAZ能够促进细胞的生长。在细胞出现接触抑制的时候，MST1/2会被上游调控信号磷酸化激活然后磷酸化激活LATS1/2，活化的LATS1/2又会磷酸化YAP/TAZ使其滞留在胞质中，随后被泛素化降解，从而抑制细胞的生长和增殖。

接触抑制的逃脱能够给肿瘤细胞提供巨大的优势，促进肿瘤的形成。然而，对人类肿瘤基因组的分析发现，已知的Hippo通路调控分子的异常包括GNAQ,GNA11和NF2的突变、VGLL4,MST1和LATS1的缺失以及YAP和TAZ的扩增，都发生在一小部分人类肿瘤细胞中。因此，是否存在其他调控Hippo通路的分子以及这些调控分子的异常是否存在人类肿瘤中并且会导致肿瘤的发生，这些都尚不清楚。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供Shank2基因的功能与用途。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供Shank2抑制剂在制备肿瘤治疗药物中的用途。

所述肿瘤治疗药物至少具有以下功用之一：抑制肿瘤细胞的增殖；抑制肿瘤的生长。

所述肿瘤为过表达Shank2的肿瘤。

所述肿瘤包括：肝癌、乳腺癌。

优选地，所述Shank2抑制剂是指对Shank2具有抑制效果的分子。

对于Shank2具有抑制效果包括但不限于：抑制Shank2活性，或抑制Shank2基因转录或表达。

所述Shank2抑制剂可以为siRNA、shRNA、抗体、小分子化合物。

如本发明的一些实施方式中所例举的：所述Shank2抑制剂可以为siRNA或shRNA。所述siRNA或shRNA的靶序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示。

所述肿瘤治疗药物必然包含Shank2抑制剂，并以Shank2抑制剂作为前述功用的有效成分。

所述肿瘤治疗药物中，发挥前述功用的有效成分可以仅为Shank2抑制剂，亦可包含其他可起到类似功用的分子。也就是说，Shank2抑制剂是所述肿瘤治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。

所述肿瘤治疗药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质。。

所述肿瘤治疗药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

本发明的第二方面，提供一种治疗肿瘤的方法，为向对象施用Shank2抑制剂。

所述肿瘤治疗药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。

所述的对象为哺乳动物或所述哺乳动物的肿瘤细胞。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或者人。

所述对象可以是罹患肿瘤的患者或期待治疗肿瘤的个体，或者所述对象为肿瘤患者或期待治疗肿瘤的个体的离体肿瘤细胞。

所述Shank2抑制剂可以在接受肿瘤治疗前、中、后向对象施用。

所述肿瘤为过表达Shank2的肿瘤。所述肿瘤包括：肝癌、乳腺癌。

本发明的第三方面提供一种肿瘤治疗药物，包括有效量的Shank2抑制剂和药用载体。

本发明的第四方面提供一种肿瘤治疗药物组合，包括有效量的Shank2抑制剂和至少一种其他肿瘤治疗药物。

所述其他肿瘤治疗药物是指除了Shank2抑制剂以外的肿瘤治疗药物。

所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：

一)将Shank2抑制剂和其他肿瘤治疗药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同。

当其他肿瘤治疗药物为抗肿瘤抗体时，一般采用胃肠外给药型。当其他肿瘤治疗药物为化疗药物时，给药形式可以比较丰富，可以是胃肠道给药亦可以是非胃肠道给药。一般推荐针对各化疗药物的已知给药途径给药。

二)将Shank2抑制剂和其他肿瘤治疗药物配置成复方制剂。在将Shank2抑制剂和其他肿瘤治疗药物采用相同给药途径给药并同时施加时，可采用将两者配置成复方制剂的形式。

本发明第五方面，提供了一种肿瘤治疗方法，为向对象施用有效量的Shank2抑制剂，以及向对象施用有效量的其他肿瘤治疗药物和/或向对象实施其他肿瘤治疗手段。

可以同步地或顺序地给予有效量的Shank2抑制剂和至少一种有效量的其他肿瘤治疗药物。

基于Shank2为本发明首次新发现的肿瘤治疗靶点，在与Shank2抑制剂以外的其他肿瘤治疗药物联合用药中，至少可以起到疗效相加的效果，进一步增强对于肿瘤的抑制。

所述其他肿瘤治疗药物包括但不限于：抗肿瘤抗体、化疗药物或靶向型药物等。

所述Shank2抑制剂可以是胃肠道给药或者胃肠外给药。所述其他肿瘤治疗药物可以是胃肠道给药或者胃肠外给药。对于抗肿瘤抗体或化疗药物，一般采用胃肠外给药。

本发明的第六方面，提供Shank2抑制剂在制备至少具有以下任一功用的药物中的用途：激活肿瘤细胞中的Hippo通路；促进肿瘤细胞中YAP1的磷酸化。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

Hippo通路的功能紊乱能够促使细胞逃脱接触抑制从而给癌化的细胞提供过度增长的优势。但是在一大部分人类肿瘤中，Hippo通路如何被阻滞还不是很清楚。在果蝇体内使用全基因组筛选技术筛选影响果蝇Hippo通路的基因，我们发现prosap作为Hippo通路的一个新的调控因子。有趣的是，prosap在哺乳动物中的同源基因Shank2，位于人类染色体11q.13，在大约20％的人类肿瘤中存在扩增。对11q13扩增区的分析说明Shank2的扩增存在选择性压力。在人类不同肿瘤细胞系的研究进一步证明Shank2扩增能够抑制Hippo通路并且转化原代细胞；然而在Hippo通路已经异常的肿瘤细胞系里，Shank2的抑制又能恢复Hippo通路的调控并且抑制细胞的增值。Shank2能够通过竞争性结合Lats1的激活因子而抑制Hippo通路，并且作为一个潜在的癌基因，Shank2在体内能够促进细胞的转化及肿瘤的生长。因此，这些证据都表明Shank2作为进化上高度保守的Hippo通路的一个新的调控因子，代表了一个新的人类癌基因和一个潜在的治疗肿瘤的靶点。

附图说明

图1A：在果蝇眼中过表达prosap会出现眼异常增大的表型。

图1B：在果蝇翅中过表达prosap会出现翅异常增大的表型。

图1C：prosap过表达还会引起yki下游靶基因diap和expanded表达的上调。

图1D：yki突变或RNAi敲低yki的表达会废除prosap促进果蝇翅增大的表型，prosap 作用于yki的上游。

图1E：prosap的敲低会导致果蝇翅的减小。

图2A：利用COSMIC肿瘤细胞系分析11q13扩增区的基因扩增情况。

图2B：对所有COSMIC样本的分析也说明肿瘤样本中携带Shank2扩增明显多于携带Ccnd1and Fgf3/4/19扩增。

图2C：20个扩增区中，有19个扩增区中的预想中的癌基因，如Myc,EGFR,Erbb2,KRas, Mdm2和Skp2位于扩增区的扩增峰。

图2D：在每种癌症类型的11q13扩增区中，如食管癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌和头颈癌中，Shank2的扩增频率都明显高于Ccnd1和Fgf3/4/19。

图2E：Shank2在食管癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌和头颈癌中存在过表达。

图3A：细胞不同密度时YAP被磷酸化情况，其中，左侧代表细胞低密度，右侧代表细胞高密度。

图3B：细胞在不同密度时YAP的出核情况。

图3C：在Hippo通路正常的细胞系里的Shank2的表达量明显低于Hippo通路异常的细胞系。

图3D：在Hippo通路正常的细胞系里过表达Shank2会抑制细胞高密度时YAP1的磷酸化。

图3E：在Hippo通路正常的细胞系里过表达Shank2会抑制细胞高密度时YAP1的磷酸化，YAP1仍然滞留在核里。

图3F：Shank2的过表达会促进人原代细胞在Soft agar中克隆的形成图。

图3G：Shank2的过表达会促进裸鼠肿瘤的生长。

图3H：Shank2过表达的肿瘤CTGF和CYR61的表达量也会上调。

图4A：LATS1和ARHGEF7能够相互结合。

图4B：Shank2与ARHGEF7能够相互结合。

图4C：Shank2的过表达能够明显抑制ARHGEF7和LATS1的结合。

图4D：利用shRNA敲低Shank2的表达会恢复Hippo通路，在细胞高密度时YAP1会被磷酸化并且出核滞留在胞质中。

图4E：利用shRNA敲低Shank2的表达会恢复Hippo通路，在细胞高密度时YAP1会被磷酸化并且出核滞留在胞质中。

图4F：Shank2的敲低也会彻底抑制过表达Shank2的肿瘤细胞系的增殖。

具体实施方式

本发明在研究中发现，SHANK2可作为肿瘤治疗靶点，抑制SHANK2的表达能够抑制肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞的凋亡、抑制肿瘤细胞克隆形成能力、抑制肿瘤细胞成瘤能力、减缓肿瘤瘤体生长。

Shank2抑制剂

指对于Shank2具有抑制效果的分子。对于Shank2，具有抑制效果包括但不限于：抑制 Shank2，活性，或者抑制Shank2基因转录或表达。所述Shank2，抑制剂包括但不限于siRNA、shRNA、抗体、小分子化合物。

抑制Shank2活性是指使Shank2活力下降。优选地，相比抑制前，Shank2活力下降至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，最佳的降低至少90％。

抑制Shank2基因转录或表达是指：使Shank2的基因不转录，或降低Shank2的基因的转录活性，或者使Shank2的基因不表达，或降低Shank2的基因的表达活性。

本领域技术人员可以使用常规方法对Shank2的基因转录或表达进行调节，如基因敲除、同源重组，干扰RNA等。

Shank2的基因转录或表达的抑制可以通过PCR及Western Blot检测表达量验证。

优选地，与野生型相比，Shank2基因转录或表达降低至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，又佳的降低至少90％，最佳地Shank2基因完全没有表达。

小分子化合物

本发明中指由几个或几十个原子组成，分子质量在1000以下的化合物。

Shank2抑制剂制备药物

以Shank2抑制剂为主要活性成分或主要活性成分之一制备药物。通常，药物中除了有效成分外，根据不同剂型的需要，还会包括一种或多种药学上可接受的载体或辅料。

“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。

“药学上可接受的载体或辅料”应当与Shank2抑制剂相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醉、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。

本发明中，除非特别说明，药物剂型并无特别限定，可以被制成针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂等剂型，可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。

联合治疗药物组合和施用方法

所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：

一)将Shank2抑制剂及其他抗肿瘤药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同。使用时，可几种药同时使用，也可几种药先后使用。先后给药时，应当在先用药物仍对机体有效的期间内向机体施加其他药物。

二)将SHANK2抑制剂及其他抗肿瘤药物配置成复方制剂。在将Shank2抑制剂及其他抗肿瘤药物采用相同给药途径给药并同时施加时，可采用将两者配置成复方制剂的形式。

抗体常用的用药方法为静脉注射、静脉滴注或动脉灌注。其用法用量可参考现有技术。

小分子化合物常用的用药方法可以是胃肠道给药或者是胃肠外给药。siRNA、shRNA、抗体则一般采用胃肠外给药。可以是局部给药亦可以为全身给药。

可以同步的或顺序地给予有效量的SHANK2抑制剂及有效量的其他肿瘤药物。使用时，可将有效量的Shank2抑制剂及有效量的其他肿瘤药物同时使用，也可将有效量的Shank2 抑制剂及有效量的其他肿瘤药物先后使用。先后给药时，应当在先用药物仍对生物体有效的期间内向生物体施加其他药物。

化疗药物包括烷化剂(如尼莫司汀、卡莫司汀、洛莫司汀、环磷酰胺、异环磷酰胺和甘磷酰芥等)、抗代谢药(如去氧氟鸟苷、多西弗鸟啶、氟尿嘧啶、巯嘌呤、甲氨蝶呤等核苷酸类似物)、抗肿瘤抗生素(如放线菌素D、阿霉素和柔红霉素等抗生素)、抗肿瘤动植物成分药(如长春瑞滨、紫杉醇、三尖杉酯碱、伊立替康、泰索帝和长春碱等)、抗肿瘤激素药(如阿他美坦、阿那曲唑、氨鲁米特、来曲唑、福美坦和他莫昔芬等)以及如顺铂、达卡巴嗪、奥沙利铂、乐沙定、可铂奥沙、米托蒽醌和丙卡巴肼等常用化疗药。

靶向型药物包括EGFR阻断剂如吉非替尼(Gefitinib、Iressa和易瑞沙)和埃罗替尼 (Erlotinib、Tarceva)、特定细胞标志物的单克隆抗体如西妥昔单抗(Cetuximab、Erbitux) 和抗HER-2单抗(赫赛汀，Trastuzumab、Herceptin)、酪氨酸激酶受体抑制剂如克唑替尼 (Crizotinib、Xalkori)、抗肿瘤血管生成药物如Bevacizumab、endostatin和Bevacizumab 等、Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂如Imatinib和Dasatinib、抗CD20单抗如Rituximab、IGFR-1 激酶抑制剂如NVP-AEW541、mTOR激酶抑制剂如CCI-779、泛素-蛋白酶体抑制剂如 Bortezomib等。

其他肿瘤治疗手段可选自手术切除、射频消融、氩氦超导手术治疗、激光消融治疗、高强度聚焦超声以及放射治疗包括X-刀、R-刀、3D-CRT和IMRT中的一种或多种。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例

我们在果蝇体内通过全基因组筛选技术筛选新的调控Hippo通路的分子，并且通过对照筛选结果对比人类癌症基因组数据，寻找调控Hippo通路的潜在的癌基因。在果蝇的眼中，yki(Yap1的同源基因)的过表达会导致果蝇眼异常增大的表型的出现，这给我们提供一个很好的筛选其他Hippo通路调控元件的平台。12000p-element inserted果蝇与眼中yki 过表达的果蝇杂交，杂交后代中寻找能够逆转yki过表达眼异常增大表型的基因。从这些筛选的基因中，prosap被进一步分析，发现prosap在哺乳动物中的同源基因Shank2，在人类肿瘤中高度扩增。

为了进一步证明prosap对Hippo通路的影响，我们构建了prosap过表达的果蝇。在果蝇眼中过表达prosap会出现眼异常增大的表型，这与过表达yki表型类似(图1A)。在果蝇翅中过表达prosap会出现翅异常增大的表型(图1B)，这是果蝇中与Hippo通路有关的另外一个经典表型。此外，prosap过表达还会引起yki下游靶基因diap和expanded表达的上调(图 1C)。因为yki突变或RNAi敲低yki的表达会废除prosap促进果蝇翅增大的表型，因此prosap 作用于yki的上游(图1D)。最后，prosap的敲低会导致果蝇翅的减小(图1E)。这些证据都说明在果蝇中prosap作为Hippo通路的一个新的调控因子，它的过表达会导致果蝇器官的异常增大。

在哺乳动物中存在三个prosap的同源基因：Shank1，Shank2，Shank3。在这三个基因中，Shank2在人类肿瘤中高频扩增。在包含Shank2的人类染色体区段11q.13，在大约20％的人类肿瘤中扩增。通过对COSMIC数据库的分析发现这段染色体区域是在人类肿瘤中扩增频率最高的区段之一，扩增频率超过那些包含Mdm2,Skp2,Mcl1,Mycl和许多其他潜在癌基因的区段。在11q13扩增区，我们一般将Cyclin D1(Ccnd1),Fgf19,Fgf3和Fgf4作为这个区段的主要的癌基因。因为我们的筛选结果发现prosap/Shank2可能具有促增长的功能，因此我们具体分析了11q13扩增区。我们首先利用COSMIC肿瘤细胞系分析这段区域的基因扩增情况(图2A)。有趣的是，有23个细胞系携带Shank2扩增，然而分别只有17个和 16个细胞系携带Ccnd1和Fgf3/4/19扩增。这些细胞系中的扩增范围清楚的说明了Shank2 扩增的选择性压力。对所有COSMIC样本的分析也说明肿瘤样本中携带Shank2扩增明显多于携带Ccnd1and Fgf3/4/19扩增(图2B)。

为了弄清楚这段扩增区上基因不同扩增频率的分布以及证明Shank2是否可以作为一个潜在的癌基因，我们在人类肿瘤中分析了所有的主要扩增区。在这20个扩增区中，有19 个扩增区中的预想中的癌基因，如Myc,EGFR,Erbb2,KRas,Mdm2和Skp2位于扩增区的扩增峰(图2C)。唯一的例外就是11q13扩增区，这段区域的扩增峰是Shank2所在的区域，而不是预想中的Ccnd1和Fgf3/4/19区域(图2C)。这个现象，结合prosap/Shank2潜在的促增长的功能，说明Shank2可能在人类肿瘤中通过高频扩增起到癌基因的作用。值得注意的是，在每种癌症类型的11q13扩增区中，如食管癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌和头颈癌中，Shank2的扩增频率都明显高于Ccnd1和Fgf3/4/19(图2D)。Shank2在这些癌症类型中也是存在过表达的(图2E)。

在果蝇中，prosap的过表达会导致Hippo通路的异常和组织的过度增殖。为了验证Shank2在哺乳动物中是否也会有类似的调控Hippo通路和促进肿瘤形成的功能，根据Hippo通路状态和Shank2的表达水平，我们首先分析了一些人类细胞系。如果细胞在高密度出现接触抑制以后，YAP1能够被磷酸化并且出核聚集在胞质中，则这个细胞系被认定为Hippo通路正常的细胞系(图3A、图3B)；相反，如果细胞在高密度，YAP1未能被磷酸化并且滞留在核中，则这个细胞系被认定为Hippo通路异常的细胞系(图3A、图3B)。有趣的是，在 Hippo通路正常的细胞系里的Shank2的表达量明显低于Hippo通路异常的细胞系(图3C)。这非常符合我们的假设：Shank2作为一个癌基因，过表达会抑制Hippo通路。

接着，我们分析了Shank2过表达会Hippo通路和细胞增殖的影响。我们发现在Hippo 通路正常的细胞系里过表达Shank2会抑制细胞高密度时YAP1的磷酸化(图3D)，YAP1仍然滞留在核里(图3E)。Shank2的过表达会促进人原代细胞在Soft agar中克隆的形成图(3F)，并且能够促进裸鼠肿瘤的生长(图3G)。此外，Shank2过表达的肿瘤CTGF和CYR61的表达量也会上调(图3H)，这说明YAP1的活性也出现上调。这些证据都说明Shank2作为一个新的癌基因会通过抑制Hippo通路促进肿瘤的形成。

Hippo通路被激活以后，YAP1能够被LATS1/2磷酸化。我们疑惑过表达的Shank2如何会抑制YAP1的磷酸化。Shank2是一个actin相关的骨架蛋白，主要在神经系统里表达。以前的研究已经证明Shank2在培养的神经突触里能够与beta-PIX/ARHGEF7结合。有趣的是，最近有研究报道ARHGEF7能够与LATS1结合，可作为LATS1的一个激活蛋白。因此，我们假设：在肿瘤细胞里，过表达的Shank2能够结合并隔离ARHGEF7，从而抑制ARHGEF7 与LATS1的结合，进而导致YAP1磷酸化的减少以及细胞的过度增殖。我们首先证明了 ARHGEF7能够分别与LATS1和Shank2结合(图4A、图4B)。与我们的假设一致，Shank2 的过表达能够明显抑制ARHGEF7和LATS1的结合(图4C)。这些证据表明过表达的Shank2 会通过隔离LATS1的激活蛋白ARHGEF7而抑制Hippo通路。

我们进一步研究证明那些过表达Shank2的肿瘤细胞系具有Shank2癌基因的依赖性。在过表达Shank2的各种人类肿瘤细胞系中，利用shRNA敲低Shank2的表达会恢复Hippo通路，在细胞高密度时YAP1会被磷酸化并且出核滞留在胞质中(图4D、图4E)。Shank2 的敲低也会彻底抑制这些细胞系的增殖(图4F)。这些证据进一步说明Shank2对Hippo通路的调控作用，也暗示Shank2可能代表了肿瘤治疗的一个新的靶点。

用于敲低Shank2的表达的shRNA-1所针对的靶序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：GCCAATCTCAAATAAGCCTTT。

所述shRNA-1对应的siRNA的序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：

5'-GCCAATCTCAAATAAGCCTTT-3'。

所述shRNA-1的序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：

5'-CCGGGCCAATCTCAAATAAGCCTTTCTCGAGAAAGGCTTATTTGAGATTGGCTTTTT G-3'。

用于敲低Shank2的表达的shRNA-2所针对的靶序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：CGACCTCAACAAACCTCTTTA。

所述shRNA-2对应的siRNA的序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：

5'-CGACCTCAACAAACCTCTTTA-3'。

所述shRNA-2的序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：

5'-CCGGCGACCTCAACAAACCTCTTTACTCGAGTAAAGAGGTTTGTTGAGGTCGTTTTT G-3'。

我们关于Shank2作为一个新的癌基因的发现提供了一种治疗肿瘤的新的潜在的靶点。有趣的是，近几年研究表明Shank2突变与孤独症有很大的关系，它的表达也只限于神经系统。通过对小鼠不同器官蛋白样品的检测发现，Shank2在非神经组织里的表达量很低或没有，包括在目前的肿瘤治疗手段中伤害最大的两个组织骨髓和肠。这提出一种可能性：Shank2只对存在Shank2扩增的肿瘤的增殖是必须的，因此靶向Shank2的肿瘤疗法可能会对机体的损害降到最低。由于Shank2是一个骨架蛋白，通过化学手段抑制它的功能在技术上可能存在困难。然而，利用AAV病毒可以将靶向Shank2的shRNA或CRISPR-sgRNA递送到肿瘤组织，而不损害神经系统。此外，将来可以设计一款既能靶向Shank2又不能穿过血脑屏障的药物，这样既能靶向治疗Shank2扩增的肿瘤，又对其他Shank2表达很低的正常组织和大脑没有损害。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> Shank2基因的功能与用途

<130> 173427

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> shRNA-1所针对的靶序列

<400> 1

gccaatctca aataagcctt t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> shRNA-1对应的siRNA的序列

<400> 2

gccaatctca aataagcctt t 21

<210> 3

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> shRNA-1的序列

<400> 3

ccgggccaat ctcaaataag cctttctcga gaaaggctta tttgagattg gctttttg 58

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> shRNA-2所针对的靶序列

<400> 4

cgacctcaac aaacctcttt a 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> shRNA-2对应的siRNA序列

<400> 5

cgacctcaac aaacctcttt a 21

<210> 6

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> shRNA-2的序列

<400> 6

ccggcgacct caacaaacct ctttactcga gtaaagaggt ttgttgaggt cgtttttg 58

Claims (7)

1.Shank2抑制剂在制备肝癌或乳腺癌治疗药物中的用途，所述Shank2抑制剂为siRNA或shRNA。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肿瘤治疗药物至少具有以下功用之一：抑制肿瘤细胞的增殖；抑制肿瘤的生长。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为过表达Shank2的肿瘤。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述Shank2抑制剂抑制Shank2活性，或抑制Shank2基因转录或表达。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述Shank2抑制剂为所述肿瘤治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。

6.Shank2抑制剂在制备至少具有以下任一功用的药物中的用途：激活肿瘤细胞中的Hippo通路；促进肿瘤细胞中YAP1的磷酸化，所述肿瘤为肝癌或者乳腺癌，所述Shank2抑制剂为siRNA或shRNA。

7.一种肿瘤治疗药物组合，包括有效量的Shank2抑制剂和至少一种其他肿瘤治疗药物，所述肿瘤为肝癌或者乳腺癌，所述Shank2抑制剂为siRNA或shRNA。

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