KR20230137387A - 세포 신호전달 단백질 활성을 측정하기 위한 시스템 및 방법 - Google Patents

세포 신호전달 단백질 활성을 측정하기 위한 시스템 및 방법 Download PDF

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KR20230137387A
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헨리 찬
애런 쿠퍼
몰리 자넷 가스페리니
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옥탄트, 인크.
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Abstract

본원에서는 효소 활성을 측정하기 위한 시스템이 개시된다. 또한 본원에서는 본원에 개시된 시스템을 이용하여 효소 활성을 측정하거나 스크리닝하는 방법이 개시된다.

Description

세포 신호전달 단백질 활성을 측정하기 위한 시스템 및 방법
교차 참조
본 출원은 2021년 2월 2일에 출원된 미국 가출원 제63/144,766호의 이익을 주장하며, 상기 출원은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되었고 그 전체가 본원에 참조로 통합된 서열 목록을 포함한다. 2021년 1월 24일에 작성된 상기 ASCII 카피는 명칭이 52652-708_601_SL.txt이며, 크기가 56,814 바이트이다.
세포 신호전달 경로 반응을 측정하는 것은 현대 의학의 초석 중 하나이다. 세포 신호전달 경로 반응은 선천적인 세포 활성으로부터 비롯될 수 있다. 세포 신호전달 경로 반응은 세포의 표면에서 발현된 수용체에 결합하는 리간드와 세포를 접촉시키는 것과 같은 외인성 공급원에 의해 자극될 수 있다. 리간드와 세포 표면 수용체 간의 접촉은 세포 신호전달 경로 반응의 변화를 초래하는 세포 내의 신호 캐스케이드를 포함하는 효소 활성의 변화를 개시한다. 이와 같이, 효소 활성을 측정하거나 스크리닝하는 것은 세포 표면 수용체와 접촉하는 리간드에 의해 개시되는 세포 신호전달 경로 반응의 변화를 포착할 수 있다.
본원에서는 세포 신호전달 경로 반응을 조사하고 측정하거나, 세포 신호전달 경로의 길항제, 역 효능제 또는 효능제를 스크리닝하거나, 신규 세포 신호전달 경로를 발견하기 위한 시스템 및 방법이 개시된다. 현재, 방법들은 리포터 분자를 코딩하는 핵산에 근접한 내인성 반응 요소 조절된 프로모터를 이용한다. 이러한 방법들은 세포에서 내인성 반응 요소 결합 프로모터의 "누출" 특성으로 인해 리포터 분자의 높은 수준의 배경 신호로 인한 어려움을 겪는다. 또한, 이러한 방법들은 세포 신호전달 경로의 측정 가능한 활성의 변동 계수, 위양성 또는 위음성의 정도가 높아 어려움을 겪는다. 마지막으로, 이러한 방법들은 리포터 활성화의 절대값이 낮아 배경에 대한 측정 가능한 세포 신호전달 활성의 비율이 낮아지는 문제가 있다.
일 양상에서, 본원에 개시된 시스템 및 방법은 조절 요소 및/또는 세포 신호전달 경로의 이펙터를 코딩하는 적어도 하나의 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 조절 요소는 이펙터의 발현을 상향조절하거나 하향조절한다. 일부 경우에, 조절 요소는 외인성 이펙터의 발현을 상향조절하거나 하향조절한다. 일부 경우에, 조절 요소는 내인성 이펙터의 발현을 상향조절하거나 하향조절한다. 이펙터의 발현을 조정함으로써, 본 시스템 및 방법은 측정 가능한 세포 신호전달 경로 반응을 증가시키고; 배경에 대한 측정 가능한 세포 신호전달 경로 반응의 비율을 증가시키고; 측정 가능한 세포 신호전달 경로의 변동 계수, 위양성 또는 위음성을 감소시킨다.
일부 양상에서, G 단백질 커플링된 수용체(G protein-coupled receptor: GPCR) 활성의 제1 이펙터로서, 상기 GPCR 활성의 제1 이펙터의 발현이 야생형 상태의 GPCR 활성의 제1 이펙터의 발현과 비교하여 상향조절되는 GPCR 활성의 제1 이펙터; 및 GPCR 활성의 제2 이펙터로서, 상기 GPCR 활성의 제2 이펙터의 발현이 야생형 상태의 GPCR 활성의 제2 이펙터의 발현과 비교하여 하향조절되는 GPCR 활성의 제2 이펙터를 포함하는, 포유동물 세포에서 GPCR 활성을 측정하기 위한 시스템이 본원에서 개시된다. 일부 실시양태에서, GPCR 활성은 Gi 알파 서브유닛 활성, Gs 알파 서브유닛 활성, Gq 알파 서브유닛 활성 또는 G12/13 알파 서브유닛 활성을 포함한다. 일부 실시양태에서, GPCR 활성은 Gi 알파 서브유닛 활성을 포함한다. 일부 실시양태에서, Gi 알파 서브유닛 활성은 Gαi1, Gαi2, Gαi3, Gαo, Gαt, Gαg 또는 Gαz의 활성을 포함한다. 일부 실시양태에서, GPCR 활성은 Gs 알파 서브유닛 활성을 포함한다. 일부 실시양태에서, GPCR 활성은 Gq 알파 서브유닛 활성을 포함한다. 일부 실시양태에서, GPCR 활성은 G12/13 알파 서브유닛 활성을 포함한다. 일부 실시양태에서, GPCR 활성의 제1 이펙터는 제1 아데닐릴 사이클라제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 아데닐릴 사이클라제는 ADCY1, ADCY2, ADCY3, ADCY4, ADCY5, ADCY6, ADCY7, ADCY8, ADCY9 및 ADCY10으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제1 아데닐릴 사이클라제는 ADCY6이다. 일부 실시양태에서, 제1 아데닐릴 사이클라제는 야생형 상태와 비교하여 제1 아데닐릴 사이클라제를 과발현하는 프로모터 또는 인핸서에 작동 가능하게 커플링된 핵산에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, GPCR 활성의 제2 이펙터는 제2 아데닐릴 사이클라제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 아데닐릴 사이클라제는 ADCY1, ADCY2, ADCY3, ADCY4, ADCY5, ADCY6, ADCY7, ADCY8, ADCY9 및 ADCY10으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제2 아데닐릴 사이클라제는 ADCY3이다. 일부 실시양태에서, 제2 아데닐릴 사이클라제는 야생형 상태와 비교하여 제2 아데닐릴 사이클라제의 발현을 감소시키는 마이크로RNA, shRNA, siRNA, CRISPR/Cas9 복합체 중 하나 이상에 의해 표적화된다. 일부 실시양태에서, 시스템은 리포터 핵산을 포함하며, 여기서 상기 리포터 핵산은 GPCR 활성에 비례하는 리포터 유전자로부터의 검출 가능한 신호를 생성한다. 일부 실시양태에서, 리포터 핵산은 리포터 유전자에 작동 가능하게 커플링된 cAMP 반응 요소(CRE) 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리포터 유전자는 고유 분자 식별자(unique molecular identifier: UMI) 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리포터 유전자는 고유 분자 식별자의 발현, 형광 신호, 발광 신호 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 HEK 293 세포, CHO-K1 세포, COS-7 세포 및 U2OS 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 시스템은 포유동물 세포의 게놈 내로 통합된다.
일부 양상에서, 세포에서 GPCR 활성을 측정하는 방법으로서, 상기 방법이 본원에 개시된 시스템을 GPCR 리간드와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 리간드가 GPCR과 복합체를 형성하고 GPCR 활성을 개시하거나 억제하는 것인 방법이 본원에서 개시된다. 일부 실시양태에서, GPCR 리간드는 폴리펩티드 및 소분자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 양상에서, G 단백질 커플링된 수용체(GPCR) 활성을 측정하기 위한 시스템으로서, 상기 시스템이 (a) GPCR 활성의 제1 이펙터로서, 상기 제1 이펙터의 발현이 야생형 상태의 제1 이펙터의 발현과 비교하여 상향조절되는 GPCR 활성의 제1 이펙터; 및 (b) GPCR 활성의 제2 이펙터로서, 상기 제2 이펙터의 발현이 야생형 상태의 제2 이펙터의 발현과 비교하여 하향조절되는 GPCR 활성의 제2 이펙터를 포함하는 것인 시스템이 본원에서 개시된다. 특정 실시양태에서, 제1 이펙터의 발현은 GPCR을 GPCR 활성화제와 접촉시킴으로써 상향조절된다. 특정 실시양태에서, GPCR 활성화제는 GPCR 효능제이다. 특정 실시양태에서, GPCR 활성화제는 제1 이펙터의 효능제이다. 특정 실시양태에서, 시스템은 제1 이펙터의 발현을 상향조절하기 위한 조절 요소에 작동 가능하게 커플링된 GPCR 활성의 제1 이펙터를 코딩하는 제1 핵산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 이펙터의 발현은 GPCR을 GPCR 억제제와 접촉시킴으로써 하향조절된다. 특정 실시양태에서, GPCR 억제제는 GPCR 역 효능제이다. 특정 실시양태에서, GPCR 억제제는 GPCR 길항제이다. 특정 실시양태에서, GPCR 억제제는 제2 이펙터의 역 효능제이다. 특정 실시양태에서, GPCR 억제제는 제2 이펙터의 길항제이다. 특정 실시양태에서, 시스템은 제2 이펙터의 발현을 하향조절하는 제2 핵산을 포함한다. 특정 실시양태에서, GPCR 활성은 Gi 알파 서브유닛 활성, Gs 알파 서브유닛 활성, Gq 알파 서브유닛 활성 또는 G12/13 알파 서브유닛 활성을 포함한다. 특정 실시양태에서, GPCR 활성은 Gi 알파 서브유닛 활성을 포함한다. 특정 실시양태에서, Gi 알파 서브유닛 활성은 Gαi1, Gαi2, Gαi3, Gαo, Gαt, Gαg 또는 Gαz의 활성을 포함한다. 특정 실시양태에서, GPCR 활성은 Gs 알파 서브유닛 활성을 포함한다. 특정 실시양태에서, GPCR 활성은 Gq 알파 서브유닛 활성을 포함한다. 특정 실시양태에서, GPCR 활성은 G12/13 알파 서브유닛 활성을 포함한다. 특정 실시양태에서, 조절 요소는 유도성이다. 특정 실시양태에서, 조절 요소는 구성적으로(constitutively) 활성이다. 특정 실시양태에서, 제1 이펙터는 제1 아데닐릴 사이클라제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 아데닐릴 사이클라제는 ADCY1, ADCY2, ADCY3, ADCY4, ADCY5, ADCY6, ADCY7, ADCY8, ADCY9 및 ADCY10으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 제1 아데닐릴 사이클라제는 ADCY6이다. 특정 실시양태에서, 제2 이펙터는 제2 아데닐릴 사이클라제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 아데닐릴 사이클라제는 ADCY1, ADCY2, ADCY3, ADCY4, ADCY5, ADCY6, ADCY7, ADCY8, ADCY9 및 ADCY10으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 제2 아데닐릴 사이클라제는 ADCY3이다. 특정 실시양태에서, 제2 핵산은 마이크로RNA, shRNA, siRNA, gRNA 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 핵산은 마이크로RNA를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 핵산은 gRNA를 포함한다. 특정 실시양태에서, 시스템은 gRNA에 작동 가능하게 커플링된 CRISPR-Cas 시스템을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, GPCR 활성은 사이클릭 AMP(cAMP) 활성을 포함한다. 특정 실시양태에서, GPCR 활성은 cAMP 농도의 변화를 포함한다. 특정 실시양태에서, GPCR 활성은 역 cAMP 활성을 포함한다. 특정 실시양태에서, 시스템은 시스템을 포함하는 세포에서의 cAMP 활성을 시스템이 없는 세포에서의 cAMP 활성과 비교하여 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 50배, 또는 100배 증가시킨다. 특정 실시양태에서, 시스템은 시스템을 포함하는 세포에서의 cAMP 농도를 시스템이 없는 세포에서의 cAMP 농도와 비교하여 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 50배, 또는 100배 증가시킨다. 특정 실시양태에서, 시스템은 시스템을 포함하는 세포에서의 역 cAMP 활성을 시스템이 없는 세포에서의 역 cAMP 활성과 비교하여 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 50배, 또는 100배 증가시킨다. 특정 실시양태에서, 시스템은 Gi 알파 서브유닛의 발현을 상향조절하기 위한 제2 조절 요소를 포함한다. 특정 실시양태에서, 시스템은 적어도 하나의 추가 이펙터를 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 추가 이펙터는 아데닐릴 사이클라제이다. 특정 실시양태에서, 시스템은 적어도 하나의 추가 이펙터의 발현을 상향조절하기 위한 제2 조절 요소를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 시스템은 시스템을 포함하는 세포에서의 GPCR 활성과 배경 사이의 비율을 시스템이 없는 세포에서의 GPCR 활성과 배경 사이의 비율과 비교하여 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 50배, 또는 100배 증가시킨다. 특정 실시양태에서, 시스템은 시스템을 포함하는 세포에서의 GPCR 활성을 시스템이 없는 세포에서의 GPCR 활성과 비교하여 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 50배, 또는 100배 증가시킨다. 특정 실시양태에서, 시스템은 시스템을 포함하는 세포에서의 배경을 시스템이 없는 세포에서의 배경과 비교하여 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 50배, 또는 100배 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 시스템은 리포터 핵산을 포함하고, 여기서 상기 리포터 핵산은 GPCR 활성에 비례하는 검출 가능한 신호를 생성한다. 특정 실시양태에서, 리포터 핵산은 cAMP 반응 요소(CRE) 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 리포터 핵산은 고유 분자 식별자(UMI) 핵산 서열에 작동 가능하게 커플링된다. 특정 실시양태에서, 검출 가능한 신호는 형광 신호를 포함한다. 특정 실시양태에서, 검출 가능한 신호는 발광 신호를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 핵산은 제1 이펙터의 발현을 상향조절하기 위한 유전자 발현 카세트를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 핵산은 제2 이펙터의 발현을 하향조절하기 위한 유전자 발현 카세트를 포함한다. 또한 본원에서는, 본원에 개시된 시스템을 포함하는 세포가 개시된다. 특정 실시양태에서, 세포는 진핵 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 특정 실시양태에서, 포유동물 세포 유래 세포이다. 특정 실시양태에서, 세포는 세포주로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, 세포는 CHO-K1 세포, COS-7 세포 및 U2OS 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 시스템은 세포의 게놈 내로 통합된다. 특정 실시양태에서, 세포는 세포 집단을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포 집단은 진핵 세포 집단을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포 집단은 포유동물 세포 집단을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포 집단은 포유동물 세포 유래 세포 집단을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포 집단은 세포주로부터 유래된 세포 집단을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포 집단은 CHO-K1 세포, COS-7 세포 및 U2OS 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포 집단을 포함한다. 또한 세포 또는 세포 집단에서 GPCR 활성을 측정하는 것을 포함하는 GPCR 활성의 측정 방법이 본원에서 개시된다. 특정 실시양태에서, GPCR 활성은 기초 GPCR 활성이다. 특정 실시양태에서, 세포 또는 세포 집단은 GPCR 리간드와 접촉되지 않는다. 또한, 세포에서 GPCR 활성을 측정하는 방법으로서, 상기 방법이 세포 또는 세포 집단을 GPCR 리간드와 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 상기 리간드가 GPCR과 복합체를 형성하고 GPCR 활성을 개시하거나 억제하는 것인 방법이 본원에서 개시된다. 특정 실시양태에서, GPCR 리간드는 세포에서 발현된다. 특정 실시양태에서, GPCR 리간드는 폴리펩티드, 비펩티드 화합물 및 소분자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 특허 출원은 컬러로 실행된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)이 있는 본 특허 또는 특허 출원의 사본은 요청 및 필요한 수수료 지불 시 특허청에 의해 제공된다.
도 1은 적어도 하나의 아데닐릴 사이클라제(AC) 패밀리 구성원의 발현을 상향조절하거나 하향조절함으로써 G 단백질 커플링된 수용체(GPCR) 활성이 보다 정확하고 강력하게 측정될 수 있는 본원에 개시된 예시적인 실시양태를 예시한다. 아데닐릴 사이클라제의 상향조절 또는 하향조절은 양방향 화살표로 표시된다.
도 2는 아데닐릴 사이클라제(AC)의 발현 수준을 변화시킴으로써 GPCR 활성을 증가시키는 본원에 개시된 유전자 발현 카세트 설계를 예시한다. 도 2A는 AC3 발현은 녹다운될 수 있는 반면 AC6 발현은 증가될 수 있는 예시적인 2세대 유전자 발현 카세트를 예시한다. 도 2B는 AC3를 전사 억제인자를 이용하여 하향조절하기 위한 다수의 가이드 RNA로 AC3을 표적화함으로써 AC3 발현이 녹다운될 수 있는 예시적인 3세대 유전자 발현 카세트를 예시한다. 도 2C는 AC6 발현만이 증가되는 예시적인 1세대 유전자 발현 카세트를 예시한다.
도 3은 AC 발현을 변경함으로써 증가된 GPCR 활성을 예시한다(MADSv2.5 카세트, 예를 들어, 도 2A의 2세대 유전자 발현 카세트).
도 4는 도 2C의 1세대 유전자 발현 카세트를 포함하는 세포로부터 생성된 루시페라제 측정을 예시하며, 단지 AC6 과발현과 함께 증가된 역 CRE 활성을 보여준다.
도 5는 도 2B의 3세대 유전자 발현 카세트(AC3 녹다운을 포함)를 포함하는 세포로부터 생성된 플랫폼 데이터를 예시하며, 본원에 개시된 2세대 유전자 발현 카세트를 포함하는 세포로부터 생성된 플랫폼 데이터에 비해 개선되었음을 보여준다.
본 개시내용의 바람직한 실시양태가 본원에 도시되고 개시되었지만, 이러한 실시양태는 단지 예로서 제공된 것임이 당업자에게 명백할 것이다. 이제 본 개시내용에서 벗어나지 않으면서 수많은 변형, 변경, 및 대체가 당업자에게 안출될 것이다. 본원에 개시된 본 개시내용의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 개시내용을 실시하는 데 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 하기 청구범위는 본 개시내용의 범위를 정의하고 이들 청구범위 내의 방법과 구조 및 이들의 등가물은 이에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
절대적 또는 순차적 용어, 예를 들어 "할 것이다", "하지 않을 것이다", "한다", "하지 않는다", "해야 한다", "하지 않아야 한다", "먼저", "처음에", "다음", "후속적으로", "전", "후", "마지막으로" 및 "최종적으로"의 사용은 본원에 개시된 본 실시양태의 범위를 한정하고자 함이 아니라 예시하고자 하는 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 단수형인 부정관사 및 정관사는 문맥이 명백하게 달리 나타내지 않는 한 복수형도 포함하도록 의도된다. 또한, 용어 "포함되는", "포함되다", "갖는", "갖다", "~와 함께" 또는 이들의 어미변화가 상세한 설명 및/또는 청구범위에서 사용되는 한, 이러한 용어들은 용어 "포함하는"과 유사한 방식으로 포괄적인 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "적어도 하나", "하나 이상", 및 "및/또는"은 동작에서 연결형 및 분리형 둘 모두인 개방형(open-ended) 표현이다. 예를 들어, 표현 "A, B 및 C 중 적어도 하나", "A, B 또는 C 중 적어도 하나", "A, B 및 C 중 하나 이상", "A, B 또는 C 중 하나 이상" 및 "A, B 및/또는 C" 각각은 A 단독, B 단독, C 단독, A와 B 모두, A와 C 모두, B와 C 모두, 또는 A, B 및 C 모두를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "또는"은 "및", "또는" 또는 "및/또는"을 지칭할 수 있고 배타적으로 그리고 포괄적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 용어 "A 또는 B"는 "A 또는 B", "A이지만 B는 아님", "B이지만 A는 아님" 및 "A 및 B"를 지칭할 수 있다. 일부 경우에, 문맥은 특정 의미를 지시할 수 있다.
본원에 개시된 임의의 시스템 및 방법은 모듈식이며 순차적인 단계로 한정되지 않는다. 따라서, "첫 번째" 및 "두 번째"와 같은 용어는 반드시 우선 순위, 중요도 순서 또는 동작 순서를 의미하지 않는다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 내를 의미하며, 이는 값이 어떻게 측정 또는 결정되는지, 예를 들어 측정 시스템의 한계에 부분적으로 의존할 것이다. 예를 들어, "약"은 소정의 값에서 관행에 따라 1 또는 1 초과의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 일부 경우에, "약" 또는 "대략적으로"는 명시된 양에 10% 가까운(플러스 또는 마이너스) 양을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "소분자"는 저분자량(예를 들어, 900 달톤)을 갖는 임의의 분자를 지칭한다. 일부 경우에, 분자는 생물학적 과정 또는 반응을 조절할 수 있는 유기 화합물일 수 있다. 일부 경우에, 소분자는 GPCR 또는 GPCR의 리간드에 결합하여 GPCR 활성을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 일부 경우에, 소분자는 GPCR의 리간드이다. 소분자의 비제한적인 예는 알푸조신, 테라조신, 클로니딘, 비소프롤롤, 베탁솔롤, 메토프롤롤, 아테놀롤, 알부테롤, 나돌롤, 펜부톨롤, 톨테로딘, 아트로핀, 스코폴라민, 칼시마르, 메토클로프라미드, 할로페리돌, 올란자핀, 로피니롤, 프라미펙솔, 로라타딘, 세티리진, 디멘하이드리네이트, 시메티딘, 라니티딘, 트라조돈, 수마트립탄, 엑세나타이드, 펜타닐, 코데인, 메페리딘, 옥시코돈, 몬테루카스트 또는 미소프로스톨을 포함할 수 있다.
본 출원 및 청구범위에 특정 값이 기재되어 있는 경우, 달리 언급되지 않는 한 용어 "약"은 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위를 의미하는 것으로 가정되어야 한다.
용어 "증가된", "증가하는" 또는 "증가하다"는 일반적으로 통계적으로 유의미한 양만큼의 증가를 의미하는 것으로 본원에서 사용된다. 일부 경우에, 용어 "증가된" 또는 "증가하다"는 참조 수준과 비교하여 적어도 10%의 증가, 예를 들어 참조 수준, 표준 또는 대조군과 비교하여 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 또는 100% 이하의 증가, 또는 10 내지 100% 사이의 임의의 증가를 의미한다. "증가"의 다른 예는 참조 수준과 비교하여 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 1000배 이상의 증가를 포함한다.
용어 "감소된", "감소하는" 또는 "감소하다"는 일반적으로 통계적으로 유의미한 양만큼의 감소를 의미하는 것으로 본원에서 사용된다. 일부 경우에, "감소된" 또는 "감소하다"는 참조 수준과 비교하여 적어도 10% 감소, 예를 들어 참조 수준과 비교하여 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40% 감소, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 감소 또는 100% 이하의 감소(예를 들어, 부재 수준 또는 참조 수준과 비교하여 검출 불가능한 수준), 또는 10 내지 100% 사이의 임의의 감소를 의미한다. 마커 또는 증상의 맥락에서, 이들 용어는 이러한 수준의 통계적으로 유의미한 감소를 의미한다. 감소는 예를 들어 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40% 이상일 수 있고, 바람직하게는 소정의 질환이 없는 개체에 대한 정상 범위 내에서 허용되는 수준까지의 감소이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "세포"는 일반적으로 생물학적 세포를 지칭한다. 세포는 살아있는 유기체의 기본적인 구조적, 기능적 및/또는 생물학적 단위이다. 세포는 하나 이상의 세포를 가진 임의의 유기체로부터 기원할 수 있다. 일부 비제한적 예는 원핵 세포, 진핵 세포, 박테리아 세포, 고세균 세포, 단세포 진핵 유기체의 세포, 원생동물 세포, 식물로부터의 세포, 진균 세포(예를 들어, 효모 세포, 버섯의 세포), 동물 세포, 무척추동물(예를 들어, 초파리, 자포동물, 극피동물, 선충류 등)로부터의 세포, 척추동물(예를 들어, 어류, 양서류, 파충류, 조류, 포유동물)로부터의 세포 또는 포유동물(예를 들어, 돼지, 소, 염소, 양, 설치류, 래트, 마우스, 비인간 영장류, 인간 등)로부터의 세포를 포함한다. 때때로 세포는 천연 유기체로부터 기원하지 않는다(예를 들어, 세포는 합성으로 만들어지며 때때로 인공 세포로도 명명된다). 일부 경우에, 세포는 1차 세포이다. 일부 경우에, 세포는 세포주로부터 유래된다.
본원에서 사용되는 용어 "뉴클레오티드"는 일반적으로 염기-당-포스페이트 조합을 지칭한다. 뉴클레오티드는 합성 뉴클레오티드를 포함한다. 뉴클레오티드는 합성 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 뉴클레오티드는 핵산 서열의 단량체 단위(예를 들어, 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA))이다. 용어 뉴클레오티드는 리보뉴클레오시드 트리포스페이트 아데노신 트리포스페이트(ATP), 우리딘 트리포스페이트(UTP), 시토신 트리포스페이트(CTP), 구아노신 트리포스페이트(GTP) 및 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트, 예컨대 dATP, dCTP, dITP, dUTP, dGTP, dTTP 또는 이들의 유도체를 포함할 수 있다. 이러한 유도체는 예를 들어 [αS]dATP, 7-데아자-dGTP 및 7-데아자-dATP, 및 이들을 함유하는 핵산 분자에 뉴클레아제 저항성을 부여하는 뉴클레오티드 유도체를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 뉴클레오티드는 디데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트(ddNTP) 및 이의 유도체를 지칭할 수 있다. 디데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트의 예시적인 예는 ddATP, ddCTP, ddGTP, ddITP 및 ddTTP를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드" 및 "핵산"은 단일 가닥, 이중 가닥 또는 다중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 이들의 유사체인 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭하기 위해 상호교환 가능하게 사용된다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 외인성이다(예를 들어, 이종 폴리뉴클레오티드). 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 세포에 대해 내인성이다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 세포-유리(cell-free) 환경에 존재할 수 있다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 유전자 또는 이의 단편이다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 DNA이다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 RNA이다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있으며 알려진 또는 알려지지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 유사체(예를 들어, 변경된 백본, 당 또는 핵염기)를 포함한다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조의 변형은 중합체 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 유사체의 일부 비제한적 예는 5-브로모우라실, 펩티드 핵산, 제노 핵산, 모르폴리노, 잠금 핵산, 글리콜 핵산, 트레오스 핵산, 디데옥시뉴클레오티드, 코르디세핀, 7-데아자-GTP, 형광단(예를 들어, 당에 연결된 로다민 또는 플루오레세인), 티올 함유 뉴클레오티드, 비오틴 연결된 뉴클레오티드, 형광 염기 유사체, CpG 섬, 메틸-7-구아노신, 메틸화된 뉴클레오티드, 이노신, 티오우리딘, 슈도우리딘, 디하이드로우리딘, 쿠에오신 및 와이오신을 포함한다. 폴리뉴클레오티드의 비제한적 예는 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비코딩 영역, 연관 분석으로부터 정의된 유전자좌들(유전자좌), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA(tRNA), 리보솜 RNA(rRNA), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 비코딩 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 세포-유리 DNA(cfDNA) 및 세포-유리 RNA(cfRNA)를 포함하는 세포-유리 폴리뉴클레오티드, 핵산 프로브 및 프라이머를 포함한다. 일부 경우에, 뉴클레오티드의 서열은 비뉴클레오티드 구성요소에 의해 중단된다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호교환 가능하게 사용되며, 최소 길이로 한정되지 않는다. 제공된 폴리펩티드 사슬 및 다른 펩티드, 예를 들어 링커 및 결합 펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 천연 및/또는 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 상기 용어는 또한 폴리펩티드의 발현 후 변형, 예를 들어 글리코실화, 시알화, 아세틸화, 인산화 등을 포함한다. 일부 양상에서, 폴리펩티드는, 단백질이 원하는 활성을 유지하는 한, 원래의(native) 또는 천연 서열에 대한 변형을 함유할 수 있다. 이러한 변형은 부위 지정 돌연변이유발을 통한 것과 같이 의도적일 수 있거나, 단백질을 생성하는 숙주의 돌연변이를 통한 것 또는 PCR 증폭으로 인한 오류와 같이 우발적일 수 있다. 일부 경우에, 폴리펩티드는 본원에 개시된 바와 같은 유전자 또는 이식유전자를 코딩한다.
본원에서 사용되는 용어 "유전자" 또는 "이식유전자"는 본원에서 임의로 코딩 서열의 상류 또는 하류에 위치하는 프로모터, 오퍼레이터, 터미네이터 등과 같은 관련 조절 요소와 함께, 개별 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산의 세그먼트("코딩 서열" 또는 "코딩 영역"으로도 지칭됨)를 지칭하기 위해 사용된다. 일부 경우에, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 조절 요소는 이식유전자를 코딩하지 않는 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함한다. 대신, 조절 요소의 ORF는 이식유전자를 상향조절할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조절 요소의 ORF는 이식유전자를 하향조절할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조절 요소의 ORF는 이식유전자의 5' 상류에 위치한다. 일부 실시양태에서, 조절 요소의 ORF는 이식유전자의 3' 하류에 위치한다. 용어 "유전자" 또는 "이식유전자"는 광의적으로 해석되어야 하며, 유전자의 mRNA, cDNA, cRNA 및 게놈 DNA 형태를 포함할 수 있다. 일부 용도에서, 용어 "유전자"는 5' 및 3' 비번역 영역(5'-UTR 및 3'-UTR), 엑손 및 인트론을 포함하는 전사된 서열을 포함한다. 일부 유전자에서, 전사된 영역은 폴리펩티드를 코딩하는 "오픈 리딩 프레임"을 포함한다. 상기 용어의 일부 용도에서, "유전자" 또는 "이식유전자"는 폴리펩티드를 코딩하기 위해 필요한 코딩 서열(예를 들어, "오픈 리딩 프레임" 또는 "코딩 영역")만을 포함한다. 일부 양상에서, 유전자 또는 이식유전자는 폴리펩티드, 예를 들어 리보솜 RNA 유전자(rRNA) 및 전달 RNA(tRNA) 유전자를 코딩하지 않는다. 일부 양상에서, 용어 "유전자" 또는 "이식유전자"는 전사된 서열뿐만 아니라, 조절 영역, 인핸서 및 프로모터와 같은 상류 및 하류 조절 요소를 포함하는 비전사된 영역을 또한 포함한다. 용어 "유전자" 또는 "이식유전자"는 mRNA, cDNA 및 유전자의 게놈 형태를 포함할 수 있다.
용어 "역 사이클릭 AMP 활성은 cAMP 활성의 감소 또는 cAMP 농도의 감소를 지칭한다.
용어 "발현"은 일반적으로 폴리뉴클레오티드가 DNA 주형으로부터 (예컨대, mRNA 또는 다른 RNA 전사체로) 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 이후에 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 전사체 및 코딩된 폴리펩티드는 집합적으로 "유전자 산물"로 지칭될 수 있다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래된 경우, 발현은 진핵 세포에서의 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현은 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드의 생물학적 활성을 포함할 수 있다. 발현과 관련하여 "상향조절하다"는 일반적으로 야생형 상태의 발현 수준과 비교하여 증가된 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA와 같은 RNA) 및/또는 폴리펩티드 서열의 발현 수준을 지칭한다. 예를 들어, 유전자 또는 이식유전자의 발현은 본원에 개시된 시스템에 의해 야생형 상태(예를 들어, 유전자 또는 이식유전자의 발현을 상향조절하는 본원에 개시된 시스템이 없는)의 유전자 또는 이식유전자의 발현과 비교하여 적어도 0.1배, 0.2배, 0.3배, 0.4배, 0.5배, 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 50배 이상 상향조절될 수 있다. "하향조절하다"는 일반적으로 야생형 상태의 발현과 비교하여 감소된 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA와 같은 RNA) 및/또는 폴리펩티드 서열의 발현 수준을 지칭한다. 예를 들어, 유전자 또는 이식유전자의 발현은 본원에 개시된 시스템에 의해 야생형 상태(예를 들어, 유전자 또는 이식유전자의 발현을 상향조절하는 본원에 개시된 시스템이 없는)의 유전자 또는 이식유전자의 발현과 비교하여 적어도 0.1배, 0.2배, 0.3배, 0.4배, 0.5배, 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 50배 이상 하향조절될 수 있다. "야생형" 또는 "야생형 상태"는 표적의 발현을 감소시키는 발현 벡터 또는 핵산에 의한 조작 없이 자연에서 발생하는 발현(예를 들어, 돌연변이 또는 조작된 유전자의 산물로서 또는 siRNA 또는 CRISPR/Cas9 시스템에 의한 발현과 반대되는 정상 대립유전자의 산물로서의 발현)의 표현형 또는 생물학적 측정 또는 관찰을 지칭할 수 있다.
참조 폴리펩티드 서열에 대한 "퍼센트(%) 서열 동일성"은, 서열을 정렬시키고 필요한 경우에는 최대 퍼센트 서열 동일성 달성을 위해 갭을 도입한 후의, 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로 간주하지 않으면서 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 공지된 다양한 방법으로, 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈라인(Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성할 수 있다. 비교할 전체 길이의 서열에 대한 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 알고리즘을 포함하여 서열 정렬에 적절한 매개변수를 결정할 수 있다.
용어 "동일성", "동일한" 또는 "퍼센트 동일한"는 참조 서열과 비교하여 핵산 서열을 설명하기 위해 본원에서 사용될 때, 카를린(Karlin) 및 알트슐(Altschul)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990, 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993]에서와 같이 수정됨)에 의해 설명된 공식을 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 공식은 알트슐 등(J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990)의 기본 로컬 정렬 검색 도구(BLAST) 프로그램에 통합되어 있다. 서열의 퍼센트 동일성은 본 출원의 출원일을 기준으로 가장 최신 버전의 BLAST를 사용하여 결정될 수 있다.
본원에 개시된 시스템의 폴리펩티드는 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 핵산은 2개 이상의 뉴클레오티드 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 한 가지 유형이다. 특정 실시양태에서, 핵산은 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 폴리펩티드를 세포 내로 전달하는 데 사용될 수 있는 벡터의 구성요소이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터"는 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 한 가지 유형은 숙주 세포의 염색체 DNA에 통합될 수 있는 게놈 통합 벡터 또는 "통합 벡터"이다. 벡터의 또 다른 유형은 "에피솜" 벡터, 예를 들어 염색체외 복제가 가능한 핵산이다. 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다. 적합한 벡터는 플라스미드, 박테리아 인공 염색체, 효모 인공 염색체, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 일부 경우에, 벡터는 전사 제어에 사용하기 위한 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호와 같은 조절 요소를 포함한다. 조절 요소는 포유동물, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래될 수 있다. 실시양태에서, 벡터는 본원에 개시된 유전자 발현 카세트를 포함한다. 일반적으로 복제 기점에 의해 부여되는, 숙주에서 복제하는 능력 및 형질전환체의 인식을 용이하게 하는 선택 유전자가 추가로 통합될 수 있다. 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스 등과 같은 바이러스로부터 유래된 벡터가 사용될 수 있다. 플라스미드 벡터는 염색체 위치 내로의 통합을 위해 선형화될 수 있다. 벡터는 게놈 내의 정의된 위치 또는 제한된 부위 세트 내로의 부위 특이적 통합(예를 들어, AttP-AttB 재조합)을 지시하는 서열을 포함할 수 있다. 추가로, 벡터는 통합을 위한 전이 요소로부터 유래된 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "형질감염" 또는 "형질감염된"은 실험실에서 통상적으로 사용되는 과정을 통해 외인성 핵산을 의도적으로 세포 내로 도입하는 방법을 지칭한다. 형질감염은 예를 들어 리포펙션, 인산칼슘 침전, 바이러스 형질도입 또는 전기천공에 의해 수행될 수 있다. 형질감염은 일시적이거나 안정적일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "형질감염 효율"은 세포 집단이 외인성 핵산을 혼입한 규모 또는 정도를 지칭한다. 형질감염 효율은 시스템 내의 총 세포 집단과 비교한 외인성 핵산이 통합된 소정의 집단 중 세포의 백분율(%)로 측정될 수 있다. 형질감염 효율은 일시적으로 및 안정하게 형질감염된 세포 둘 모두에서 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생물학적 활성화 폴리펩티드"는 유전자 발현을 조정하는 세포에 의해 발현되는 폴리펩티드를 지칭한다. 생물학적 활성화 폴리펩티드는 직접적으로, 자극에 대한 반응으로 하나 이상의 중간 분자 또는 폴리펩티드를 통한 신호전달을 통해 또는 임의의 다른 메커니즘을 통해 유전자 발현을 조정할 수 있다. 생물학적 활성화 폴리펩티드는 막관통 폴리펩티드(예컨대, 수용체 또는 채널 단백질), 세포내 폴리펩티드(예컨대, 신호전달 중간 매개체), 세포외 폴리펩티드 또는 분비된 폴리펩티드일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "리포터 활성"은 리포터로부터의 실험적 판독값을 지칭한다. 예를 들어, 루시페라제 리포터는 적절한 기질과 함께 인큐베이션될 때 발광 판독값을 가질 것이다. 형광 단백질과 같은 다른 리포터는 기질을 필요로 하지 않을 수 있지만, 예를 들어, 현미경 또는 형광 플레이트 판독기를 통해 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 리포터는 리포터 핵산에 의해 코딩된다. 일부 예에서, 리포터의 발현은 본원에 개시된 조절 요소 또는 프로모터에 의해 구동된다. 일부 실시양태에서, 리포터의 발현은 cAMP 반응 요소 결합 단백질(CREB)과 같은 cAMP 반응 요소에 의해 구동된다.
개요
본원에 개시된 시스템 및 방법은 GPCR 활성과 관련된 반응 요소 결합 프로모터의 존재 및/또는 활성화 수준을 검출함으로써 GPCR 활성을 측정할 수 있다. 또한 GPCR 활성을 증가시키기 위한 시스템 및 방법이 본원에서 개시된다. 일부 경우에, 본원에 개시된 시스템 및 방법은 GPCR 활성을 측정하기 위한 종래의 리포터 시스템 및 방법과 비교하여 GPCR 활성을 측정할 때 감소된 배경을 갖는 GPCR 활성을 허용한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 시스템 및 방법은 GPCR 활성을 측정하기 위한 종래의 리포터 시스템 및 방법과 비교하여 증가된 수준의 cAMP 신호를 갖는 GPCR 활성을 허용한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 시스템 및 방법은 본원에 개시된 이펙터를 코딩하는 적어도 하나의 핵산을 포함한다. 일부 예에서, 적어도 하나의 핵산은 조절 요소를 포함한다. 특정 실시양태에서, 반응 요소 결합 프로모터는 GPCR 활성(예를 들어, GPCR의 신호전달 캐스케이드)의 말단에서 활성화된다. 특정 실시양태에서, 반응 요소 결합 프로모터의 존재는 GPCR와 결합하거나 복합체를 형성하는 펩티드, 거대분자, 화합물 또는 소분자와 같은 외부 자극 전 및 후에 측정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 시스템 또는 방법은 약학적 발견 목적을 위한 스크리닝에 유용하다. 일부 경우에, 시스템 또는 방법은 최소한 리포터의 발현을 구동하는 반응 요소 조절된 프로모터를 포함하는 적어도 하나의 핵산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 리포터는 폴리펩티드이다. 특정 실시양태에서, 리포터는 특정 세포 유형 또는 특정 세포 집단을 식별하는 데 사용되는 고유 핵산 서열과 같은 고유 분자 식별자(UMI)를 추가로 포함할 수 있다.
비제한적 예로서, 생물학적 활성화 폴리펩티드는 특정 G-커플링된 단백질 수용체(GPCR)를 포함할 수 있으며, 그 중 수백 가지가 알려져 있다. 따라서, UMI 요소는 다중화(multiplex) 형식으로 여러 상이한 생물학적 활성화 폴리펩티드의 신호전달을 쉽고 빠르게 조사할 수 있게 한다. 추가로, 본원에 제공된 시스템 및 방법은 반응 요소 조절된 프로모터를 통해 배경을 감소시킨다. 이는 보다 정확한 정량화를 가능하게 하고 생물학적 활성화 폴리펩티드를 활성화할 수 있는 화합물에 대한 다중화 스크리닝에서 위양성 시험 화합물의 수를 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 리포터 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 부재이다. 특정 실시양태에서, UMI를 코딩하는 핵산 서열은 부재이다. 특정 실시양태에서, UMI를 코딩하는 핵산 서열은 리포터 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 5'에 있다. 특정 실시양태에서, 리포터 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 UMI를 코딩하는 핵산 서열의 5'에 있다.
특정 실시양태에서, 리포터를 코딩하는 핵산은 리포터 폴리펩티드를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 리포터 폴리펩티드는 직접 검출될 수 있다. 특정 실시양태에서, 리포터 폴리펩티드는 기질에 대한 단백질의 효소 활성에 따라 검출 가능한 신호를 생성한다. 특정 실시양태에서, 리포터 폴리펩티드의 검출은 정량적으로 달성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 리포터 폴리펩티드는 루시페라제 단백질, 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제, 분비성 태반 알칼리 포스파타제 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 리포터 폴리펩티드는 루시페라제 단백질이고, 기질의 비제한적 예는 반딧불이 루시페린, 라티아 루시페린, 박테리아 루시페린, 코엘렌테라진, 디노플라겔레이트 루시페린, 바르굴린 및 3-하이드록시 히스피딘을 포함한다.
특정 실시양태에서, 리포터를 코딩하는 핵산은 또한 UMI를 코딩할 수 있다. UMI는 핵산에 고유한 짧은 뉴클레오티드 서열을 포함한다. UMI는 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 뉴클레오티드의 길이일 수 있다. UMI는 차세대 시퀀싱 방법과 같이 UMI의 서열 결정을 가능하게 하는 임의의 적합한 방식으로 검출될 수 있다. UMI를 검출하는 방법은 정량적일 수 있으며 차세대 시퀀싱 방법을 포함한다.
특정 실시양태에서, 약물 발견에 사용하기 위한 본원에 개시된 이펙터를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 및 리포터 핵산을 포함하는 본원에 개시된 시스템을 사용하는 방법이 본원에서 개시된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 상기 핵산(들)과 세포 또는 세포 집단을, 핵산(들)이 내재화되고 세포에 의해 발현(예를 들어, 형질감염)되기에 충분한 조건 하에 접촉시키는 단계; 세포를 물리적 또는 화학적 자극과 접촉시키는 단계; 및 리포터의 활성화를 하나 이상의 검정에 의해 결정하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 전사 인자 핵산을 코딩하는 핵산(들) 및 리포터 핵산을 포함하는 세포 또는 세포 집단을 접촉시키는 단계; 및 리포터의 활성화를 하나 이상의 검정에 의해 결정하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 비제한적인 일 실시양태는 도 1에 도시되어 있다. 세포(100)는 GPCR 활성을 측정하기 위한 본원에 개시된 시스템을 포함한다. GPCR(101)은 GPCR 리간드(102)와 접촉된다. GPCR(101)과 GPCR 리간드(102)이 접촉되면, G 단백질(103)의 Gα 서브유닛은 Gβ 및 Gγ로부터 해리되어 다양한 아데닐릴 사이클라제(AC) 패밀리 구성원(104)과 상호작용한다. 다양한 AC 패밀리 구성원(104)의 발현을 상향조절 또는 하향조절함으로써, 본원에 개시된 리포터 작제물(105)의 발현 수준 및 존재를 검출하여 GPCR 활성을 보다 강력하고 정확하게 측정할 수 있다. 일부 경우에, 리포터 작제물(105)는 본원에 개시된 시스템을 포함하는 특정 세포 유형 또는 특정 세포 집단을 식별하는 데 사용되는 고유 분자 식별자(UMI) 핵산 서열을 임의로 포함할 수 있다.
GPCR 활성
일부 실시양태에서, 세포에서 GPCR 활성을 측정하기 위한 시스템 및 방법이 본원에서 개시된다. 일부 경우에, 시스템은 GPCR 활성의 제1 이펙터를 코딩하는 제1 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 제1 핵산은 GPCR 활성의 제1 이펙터를 과발현하도록 구성된 조절 요소에 작동 가능하게 커플링될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조절 요소는 프로모터, 인핸서 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 시스템은 GPCR 활성의 제2 이펙터의 발현을 감소시키는 제2 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, GPCR 활성은 리간드가 세포에 의해 발현된 GPCR과 결합하거나 복합체를 형성함으로써 유발되는 활성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시스템은 추가 이펙터를 포함한다
GPCR은 GPCR 활성을 생성하는 임의의 GPCR일 수 있다. 일부 실시양태에서, GPCR은 본원에 개시된 시스템을 포함하는 세포에 대해 외인성 또는 내인성일 수 있다. 예를 들어, GPCR은 본원에 개시된 시스템을 포함하는 세포 내로 이식유전자로서 도입되는 외인성 GPCR일 수 있다. 일부 경우에, GPCR은 본원에 개시된 시스템을 보유하는 세포에 대한 내인성 GPCR일 수 있다. 일부 경우에, GPCR은 리간드에 의해 자극되어 GPCR 활성을 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, GPCR은 GPCR과 복합체를 형성하거나 결합하는 리간드와 독립적으로 또는 이의 부재 하에 GPCR 활성을 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, GPCR 활성은 고아(orphan) GPCR 활성을 포함하며, 여기서 GPCR 활성은 GPCR와 복합체를 형성하거나 결합하는 추정 리간드 또는 미지의 리간드로부터 생성될 수 있다. 예시적인 GPCR은 아데노신 수용체, β-아드레날린 수용체, 뉴로텐신 수용체, 무스카린산 수용체, 5-하이드록시트립타민 수용체, 아드레날린수용체, 아나필라톡신 수용체, 안지오텐신 수용체, 아펠린 수용체, 봄베신 수용체, 브라디키닌 수용체, 칸나비노이드 수용체, 케모카인 수용체, 콜레시스토키닌 수용체, 도파민 수용체, 엔도텔린 수용체, 유리 지방산 수용체, 담즙산 수용체, 갈라닌 수용체, 모틸린 수용체, 그렐린 수용체, 당단백질 호르몬 수용체, GnRH 수용체, 히스타민 수용체, KiSS1 유래 펩티드 수용체, 류코트리엔 및 리폭신 수용체, 리소인지질 수용체, 멜라닌 농축 호르몬 수용체, 멜라노코르틴 수용체, 멜라토닌 수용체, 뉴로메딘 U 수용체, 신경펩티드 수용체, N-포르밀펩티드 패밀리 수용체, 니코틴산 수용체, 오피오이드 수용체, 옵신 유사 수용체, 오렉신 수용체, P2Y 수용체, 펩티드 P518 수용체, 혈소판 활성화 인자 수용체, 프로키네티신 수용체, 프로락틴 방출 펩티드 수용체, 프로스타노이드 수용체, 프로테아제 활성화 수용체, 릴랙신 수용체, 소마토스타틴 수용체, SPC/LPC 수용체, 타키키닌 수용체, 미량 아미노 수용체, 티로트로핀 방출 호르몬 수용체, 유로텐신 수용체, 바소프레신/옥시토신 수용체, 고아 GPCR, 칼시토닌 수용체, 코르티코트로핀 방출 인자 수용체, 글루카곤 수용체, 부갑상선 수용체, VIP/PACAP 수용체, LNB7TM 수용체, GABA 수용체, 대사성 글루타메이트 수용체 또는 칼슘 센서 수용체를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 GPCR과 복합체를 형성하거나 결합하는 리간드는 알려져 있다. 일부 경우에, GPCR에 대한 리간드는 효능제 또는 부분 효능제일 수 있고 GPCR과 복합체를 형성하거나 결합하고 세포에서 GPCR 활성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 리간드는 역 효능제일 수 있고, GPCR에 결합하거나 복합체를 형성하는 이러한 리간드는 기초 GPCR 활성을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, GPCR과 복합체를 형성하거나 결합하는 리간드는 GPCR에 결합하고 GPCR 효능제의 결합을 차단하는 길항제일 수 있다. 일부 경우에, 리간드는 작은 유기 또는 무기 모이어티이다. 일부 경우에, 리간드는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 천연 발생 GPCR 결합 단백질, 또는 GPCR과 복합체를 형성하거나 결합할 수 있는 다른 단백질, 유도체 또는 이의 단편일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 GPCR에 결합하는 항체일 수 있다. 항체는 Fab, F(ab')2, 단일 사슬 Fv(scFv), Fv, 도메인 항체(dAbs), 나노바디 및 디아바디와 같은 항원 결합 도메인을 포함하는 임의의 면역글로불린 이소타입, 서브클래스, 단클론 항체 및 이의 단편을 포함하는 임의의 면역글로불린일 수 있다. 일부 실시양태에서, 리간드는 GPCR과 공유적으로 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 리간드는 펩티드 모방체, 핵산, 펩티드 핵산(PNA), 거대분자 또는 압타머일 수 있다. 일부 실시양태에서, 리간드는 Na+ 또는 Zn2+와 같은 이온일 수 있다. 일부 실시양태에서, 리간드는 지질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 리간드는 탄수화물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 리간드는 밀리몰(mM) 내지 피코몰(pM)의 해리 상수(Kd)로 GPCR에 결합할 수 있다.
일부 실시양태에서, GPCR 활성은 G 단백질 활성을 포함한다. 일부 경우에, G 단백질 활성은 자극 활성일 수 있다. 일부 경우에, G 단백질 활성이 억제 활성일 수 있다. G 단백질 활성은 G 단백질 알파 서브유닛(Gα), G 단백질 베타 서브유닛(Gβ), G 단백질 감마 서브유닛(Gγ) 및/또는 G 단백질 베타 및 감마 서브유닛(Gβγ)의 활성을 포함할 수 있다. 일부 경우에, G 단백질 활성은 Gα 활성을 포함한다. Gα 활성은 Gi 알파 서브유닛의 활성, Gs 알파 서브유닛 활성, Gq 알파 서브유닛 활성 또는 G12 알파 서브유닛을 포함할 수 있다. 일부 경우에, G 단백질 활성은 Gi 알파 서브유닛 활성을 포함한다. Gi 알파 서브유닛은 Gαi1, Gαi2, Gαi3, Gαo, Gαt, Gαg 또는 Gαz를 포함할 수 있다. Gs 알파 서브유닛은 Gαs 또는 Gαolf를 포함할 수 있고, Gq 알파 서브유닛은 Gαq, Gα11, Gα14 또는 Gα16을 포함할 수 있다. G12 알파 서브유닛은 Gα12 또는 Gα13을 포함할 수 있다. 일부 경우에, Gβ 서브유닛은 Gβ1, Gβ2, Gβ3, Gβ4 또는 Gβ5를 포함할 수 있다. 일부 예에서, Gγ 서브유닛은 Gγ1, Gγ2, Gγ3, Gγ4, Gγ5, Gγ6, Gγ7, Gγ8, Gγ9, Gγ10, Gγ11, 또는 Gγ12를 포함할 수 있다.
일부 경우에, GPCR 활성은 적어도 하나의 GPCR 이펙터의 활성을 포함한다. 일부 경우에, GPCR 이펙터는 G 단백질과 관련된 2차 메신저를 포함한다. 예를 들어, GPCR 활성은 G 단백질 활성과 관련된 2차 메신저인 아데닐릴 사이클, 포스포리파제, 포스포디에스테라제, 키나제 또는 이온 채널과 같은 활성 이펙터를 포함한다. 일부 실시양태에서, GPCR 활성은 사이클릭 AMP(cAMP) 활성을 포함한다. 일부 실시양태에서, GPCR 활성은 역 cAMP 활성을 포함한다. 일부 경우에, GPCR 활성은 G 단백질과 관련된 메신저 또는 분자의 하류 신호전달을 포함한다. 예를 들어, GPCR 활성은 본원에 개시된 리포터 핵산에 결합하는 cAMP 반응 요소의 전사 또는 번역 활성을 포함할 수 있다. 일부 경우에, GPCR 활성은 본원에 개시된 리포터 핵산에 결합하는 cAMP 반응 요소로부터 생성된 검출 가능한 신호로부터 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, GPCR 활성은 본원에 개시된 리포터에 의해 생성된 검출 가능한 신호에 비례한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 시스템은 본원에 개시된 이펙터 중 어느 하나의 발현을 조정하기 위한 적어도 하나의 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 핵산은 본원에 개시된 이펙터 중 어느 하나를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 이펙터의 발현을 조정하는 조절 요소를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 조절 요소는 프로모터, 인핸서 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조절 요소는 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조절 요소는 인핸서를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조절 요소는 이펙터의 발현을 상향조절한다. 일부 실시양태에서, 조절 요소는 이펙터의 발현을 하향조절한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 조절 요소와 이펙터 둘 모두를 코딩하고, 여기서 상기 조절 요소는 핵산에 의해 코딩된 이펙터의 발현을 상향조절한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 조절 요소와 이펙터 둘 모두를 코딩하고, 여기서 상기 조절 요소는 핵산에 의해 코딩된 이펙터의 발현을 하향조절한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 핵산은 본원에 개시된 이펙터 중 어느 하나 및 본원에 개시된 조절 요소 중 어느 하나를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 핵산은 하나의 이펙터 및 하나의 조절 요소를 코딩한다. 예를 들어, 적어도 하나의 핵산은 조절 요소에 작동 가능하게 커플링된 이펙터를 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 시스템은 제1 아데닐릴 사이클라제를 포함하는 적어도 제1 이펙터 및 제2 아데닐릴 사이클라제를 포함하는 적어도 제2 이펙터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 이펙터 및 제2 이펙터는 상이한 조절 요소의 발현 제어 하에 있다. 일부 실시양태에서, 제1 이펙터는 프로모터 또는 인핸서에 작동 가능하게 커플링된 핵산에 의해 코딩되고, 여기서 상기 프로모터 또는 인핸서는 야생형 상태와 비교하여 제1 이펙터의 발현을 증가시키거나 과발현한다. 일부 실시양태에서, 제1 아데닐릴 사이클라제는 프로모터 또는 인핸서에 작동 가능하게 커플링된 핵산에 의해 코딩되고, 여기서 상기 프로모터 또는 인핸서는 야생형 상태와 비교하여 제1 아데닐릴 사이클라제의 발현을 증가시키거나 과발현한다.
일부 실시양태에서, 조절 요소에 의해 조정되는 이펙터는 아데닐릴 사이클라제이다. 일부 실시양태에서, 아데닐릴 사이클라제는 ADCY1, ADCY2, ADCY3, ADCY4, ADCY5, ADCY6, ADCY7, ADCY8, ADCY9 또는 ADCY10이다. 일부 실시양태에서, 조절 요소는 ADCY1, ADCY2, ADCY3, ADCY4, ADCY5, ADCY6, ADCY7, ADCY8, ADCY9 또는 ADCY10 중 어느 하나를 상향조절한다. 일부 실시양태에서, 조절 요소는 ADCY6을 상향조절한다. 일부 실시양태에서, 조절 요소는 ADCY1, ADCY2, ADCY3, ADCY4, ADCY5, ADCY6, ADCY7, ADCY8, ADCY9 또는 ADCY10 중 어느 하나를 하향조절한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 본원에 개시된 이펙터 중 어느 하나의 발현을 하향조절할 수 있는 RNA를 코딩한다. 일부 실시양태에서, RNA는 이펙터의 발현을 하향조절하기 위해 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 가이드 RNA(gRNA) 또는 마이크로RNA(miRNA)를 포함한다. 일부 경우에, gRNA는 동원될 수 있고 gRNA-가이드된 뉴클레아제와의 복합체의 경우에 뉴클레아제가 이펙터의 핵산을 분해하도록 지시할 수 있다. 이펙터의 핵산을 분해하기 위해 동원될 수 있는(그리고 이후 발현을 감소시킬 수 있는) gRNA-가이드된 뉴클레아제의 비제한적 예는 CRISPR 관련(Cas) 단백질 또는 타입 I CRISPR 관련(Cas) 폴리펩티드, 타입 II CRISPR 관련(Cas) 폴리펩티드, 타입 III CRISPR 관련(Cas) 폴리펩티드, 타입 IV CRISPR 관련(Cas) 폴리펩티드, 타입 V CRISPR 관련(Cas) 폴리펩티드 및 타입 VI CRISPR 관련(Cas) 폴리펩티드를 포함하는 CRISPR 관련(Cas) 단백질 또는 Cas 뉴클레아제; 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN); 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN); 메가뉴클레아제; RNA 결합 단백질(RBP); CRISPR 관련 RNA 결합 단백질; 재조합효소; 플립파제; 트랜스포사제; 아르고너트(Argonaute)(Ago) 단백질(예를 들어, 원핵생물 아르고너트(pAgo), 고세균 아르고너트(aAgo) 및 진핵생물 아르고너트(eAgo)); 이들의 임의의 유도체, 이들의 임의의 변이체 및 이들의 임의의 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, gRNA-가이드된 뉴클레아제는 CRISPR 관련(Cas) 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, gRNA-가이드된 뉴클레아제는 CRISPR/Cas9 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, CRISPR/Cas9 단백질과 같은 gRNA-가이드된 뉴클레아제는 gRNA를 또한 코딩하는 동일한 핵산으로부터 코딩될 수 있다. 일부 실시양태에서, CRISPR/Cas9 단백질과 같은 gRNA-가이드된 뉴클레아제는 gRNA를 코딩하는 상이한 핵산으로부터 코딩될 수 있다.
일부 실시양태에서, RNA는 이펙터의 발현을 하향조절하기 위한 마이크로RNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, RNA는 본원에 개시된 아데닐릴 사이클라제(예를 들어, ADCY1, ADCY2, ADCY3, ADCY4, ADCY5, ADCY6, ADCY7, ADCY8, ADCY9, 또는 ADCY10) 중 어느 하나를 하향조절하기 위한 siRNA, shRNA, gRNA 또는 miRNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, RNA는 ADCY3을 하향조절하기 위한 siRNA, shRNA, miRNA, 또는 gRNA를 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 이펙터는 세포를 억제제와 접촉시켜 세포에서 적어도 하나의 이펙터의 활성을 녹다운 또는 녹아웃시킴으로써 하향조절될 수 있다. 일부 경우에, 억제제는 GPCR에 대한 억제제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제제는 아데닐릴 사이클라제에 대한 억제제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제제는 길항제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 길항제는 GPCR에 대한 길항제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 길항제는 아데닐릴 사이클라제에 대한 길항제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제제는 역 효능제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 길항제는 GPCR에 대한 역 효능제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 길항제는 아데닐릴 사이클라제에 대한 역 효능제일 수 있다. 아데닐릴 효능제의 예시적인 억제제는 KH7, MDL12330A, NKY80, SKF 83566, SQ22536 및 ST034307을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 시스템은 제1 조절 요소에 의해 상향조절되는 적어도 하나의 이펙터 및 제2 조절 요소에 의해 하향조절되는 적어도 하나의 다른 상이한 이펙터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 시스템은 제1 조절 요소에 의해 상향조절되는 적어도 하나의 아데닐릴 사이클라제 및 제2 조절 요소에 의해 하향조절되는 적어도 하나의 다른 상이한 아데닐릴 사이클라제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 시스템은 제1 조절 요소에 의해 상향조절되는 ADCY6 및 제2 조절 요소에 의해 하향조절되는 ADCY3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 이펙터는 세포를 활성화제와 접촉시킴으로써 세포에서 상향조절될 수 있다. 일부 경우에, 활성화제는 GPCR에 대한 활성화제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 활성화제는 아데닐릴 사이클라제에 대한 활성화제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 활성화제는 효능제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 효능제는 GPCR에 대한 효능제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 효능제는 아데닐릴 사이클라제에 대한 효능제일 수 있다. 아데닐릴 효능제의 예시적인 활성화제는 포르스콜린(Forskolin), NKH477, PACAP1-27 및 PACAP1-38을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 시스템은 GPCR 활성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 시스템은 측정 가능한 GPCR 활성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 측정 가능한 GPCR 활성은 측정 가능한 G 단백질 활성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 측정 가능한 GPCR 활성은 G 단백질 알파 서브유닛(Gα) 활성, G 단백질 베타 서브유닛(Gβ) 활성, G 단백질 감마 서브유닛(Gγ) 활성, 및/또는 G 단백질 베타 및 감마 서브유닛(Gβγ) 활성을 포함한다. 일부 경우에 G 단백질은 Gα의 활성을 포함한다. Gα 활성은 Gi 알파 서브유닛, Gs 알파 서브유닛 활성, Gq 알파 서브유닛 활성 또는 G12 알파 서브유닛의 활성을 포함할 수 있다. 일부 경우에, G 단백질 활성은 Gi 알파 서브유닛 활성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시스템은 시스템이 없는 세포에서의 Gi 알파 서브유닛 활성과 비교하여 시스템을 포함하는 세포에서의 Gi 알파 서브유닛 활성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 세포에서의 측정 가능한 Gi 알파 서브유닛 활성을 적어도 약 0.1배 내지 약 10,000배 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 세포에서의 측정 가능한 Gi 알파 서브유닛 활성을 적어도 약 0.1배 내지 약 0.5배, 약 0.1배 내지 약 1배, 약 0.1배 내지 약 2배, 약 0.1배 내지 약 5배, 약 0.1배 내지 약 10배, 약 0.1배 내지 약 20배, 약 0.1배 내지 약 50배, 약 0.1배 내지 약 100배, 약 0.1배 내지 약 500배, 약 0.1배 내지 약 1,000배, 약 0.1배 내지 약 10,000배, 약 0.5배 내지 약 1배, 약 0.5배 내지 약 2배, 약 0.5배 내지 약 5배, 약 0.5배 내지 약 10배, 약 0.5배 내지 약 20배, 약 0.5배 내지 약 50배, 약 0.5배 내지 약 100배, 약 0.5배 내지 약 500배, 약 0.5배 내지 약 1,000배, 약 0.5배 내지 약 10,000배, 약 1배 내지 약 2배, 약 1배 내지 약 5배, 약 1배 내지 약 10배, 약 1배 내지 약 20배, 약 1배 내지 약 50배, 약 1배 내지 약 100배, 약 1배 내지 약 500배, 약 1배 내지 약 1,000배, 약 1배 내지 약 10,000배, 약 2배 내지 약 5배, 약 2배 내지 약 10배, 약 2배 내지 약 20배, 약 2배 내지 약 50배, 약 2배 내지 약 100배, 약 2배 내지 약 500배, 약 2배 내지 약 1,000배, 약 2배 내지 약 10,000배, 약 5배 내지 약 10배, 약 5배 내지 약 20배, 약 5배 내지 약 50배, 약 5배 내지 약 100배, 약 5배 내지 약 500배, 약 5배 내지 약 1,000배, 약 5배 내지 약 10,000배, 약 10배 내지 약 20배, 약 10배 내지 약 50배, 약 10배 내지 약 100배, 약 10배 내지 약 500배, 약 10배 내지 약 1,000배, 약 10배 내지 약 10,000배, 약 20배 내지 약 50배, 약 20배 내지 약 100배, 약 20배 내지 약 500배, 약 20배 내지 약 1,000배, 약 20배 내지 약 10,000배, 약 50배 내지 약 100배, 약 50배 내지 약 500배, 약 50배 내지 약 1,000배, 약 50배 내지 약 10,000배, 약 100배 내지 약 500배, 약 100배 내지 약 1,000배, 약 100배 내지 약 10,000배, 약 500배 내지 약 1,000배, 약 500배 내지 약 10,000배, 또는 약 1,000배 내지 약 10,000배 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 세포에서의 측정 가능한 Gi 알파 서브유닛 활성을 적어도 약 0.1배, 약 0.5배, 약 1배, 약 2배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 50배, 약 100배, 약 500배, 약 1,000배, 또는 약 10,000배 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 세포에서의 측정 가능한 Gi 알파 서브유닛 활성을 적어도 약 0.1배, 약 0.5배, 약 1배, 약 2배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 50배, 약 100배, 약 500배, 또는 약 1,000배 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 세포에서의 측정 가능한 Gi 알파 서브유닛 활성을 적어도 최대 약 0.5배, 약 1배, 약 2배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 50배, 약 100배, 약 500배, 약 1,000배, 또는 약 10,000배 증가시킨다.
일부 실시양태에서, GPCR 활성은 측정 가능한 cAMP 활성을 포함한다. 일부 경우에, 측정 가능한 cAMP 활성은 cAMP 농도의 증가 또는 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 시스템은 시스템이 없는 세포에서의 cAMP 활성과 비교하여 시스템을 포함하는 세포에서의 측정 가능한 cAMP 활성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 세포에서의 측정 가능한 cAMP를 적어도 약 0.1배 내지 약 10,000배 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 세포에서의 cAMP를 적어도 약 0.1배 내지 약 0.5배, 약 0.1배 내지 약 1배, 약 0.1배 내지 약 2배, 약 0.1배 내지 약 5배, 약 0.1배 내지 약 10배, 약 0.1배 내지 약 20배, 약 0.1배 내지 약 50배, 약 0.1배 내지 약 100배, 약 0.1배 내지 약 500배, 약 0.1배 내지 약 1,000배, 약 0.1배 내지 약 10,000배, 약 0.5배 내지 약 1배, 약 0.5배 내지 약 2배, 약 0.5배 내지 약 5배, 약 0.5배 내지 약 10배, 약 0.5배 내지 약 20배, 약 0.5배 내지 약 50배, 약 0.5배 내지 약 100배, 약 0.5배 내지 약 500배, 약 0.5배 내지 약 1,000배, 약 0.5배 내지 약 10,000배, 약 1배 내지 약 2배, 약 1배 내지 약 5배, 약 1배 내지 약 10배, 약 1배 내지 약 20배, 약 1배 내지 약 50배, 약 1배 내지 약 100배, 약 1배 내지 약 500배, 약 1배 내지 약 1,000배, 약 1배 내지 약 10,000배, 약 2배 내지 약 5배, 약 2배 내지 약 10배, 약 2배 내지 약 20배, 약 2배 내지 약 50배, 약 2배 내지 약 100배, 약 2배 내지 약 500배, 약 2배 내지 약 1,000배, 약 2배 내지 약 10,000배, 약 5배 내지 약 10배, 약 5배 내지 약 20배, 약 5배 내지 약 50배, 약 5배 내지 약 100배, 약 5배 내지 약 500배, 약 5배 내지 약 1,000배, 약 5배 내지 약 10,000배, 약 10배 내지 약 20배, 약 10배 내지 약 50배, 약 10배 내지 약 100배, 약 10배 내지 약 500배, 약 10배 내지 약 1,000배, 약 10배 내지 약 10,000배, 약 20배 내지 약 50배, 약 20배 내지 약 100배, 약 20배 내지 약 500배, 약 20배 내지 약 1,000배, 약 20배 내지 약 10,000배, 약 50배 내지 약 100배, 약 50배 내지 약 500배, 약 50배 내지 약 1,000배, 약 50배 내지 약 10,000배, 약 100배 내지 약 500배, 약 100배 내지 약 1,000배, 약 100배 내지 약 10,000배, 약 500배 내지 약 1,000배, 약 500배 내지 약 10,000배, 또는 약 1,000배 내지 약 10,000배 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 세포에서의 cAMP를 적어도 약 0.1배, 약 0.5배, 약 1배, 약 2배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 50배, 약 100배, 약 500배, 약 1,000배, 또는 약 10,000배 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 세포에서의 cAMP를 적어도 적어도 약 0.1배, 약 0.5배, 약 1배, 약 2배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 50배, 약 100배, 약 500배, 또는 약 1,000배 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 세포에서의 cAMP를 적어도 최대 약 0.5배, 약 1배, 약 2배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 50배, 약 100배, 약 500배, 약 1,000배, 또는 약 10,000배 증가시킨다.
일부 실시양태에서, GPCR 활성은 측정 가능한 역 cAMP 활성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시스템은 시스템이 없는 세포에서의 역 cAMP 활성과 비교하여 시스템을 포함하는 세포에서의 측정 가능한 역 cAMP 활성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 세포에서의 역 cAMP를 적어도 약 0.1배 내지 약 10,000배 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 역 cAMP를 적어도 약 0.1배 내지 약 0.5배, 약 0.1배 내지 약 1배, 약 0.1배 내지 약 2배, 약 0.1배 내지 약 5배, 약 0.1배 내지 약 10배, 약 0.1배 내지 약 20배, 약 0.1배 내지 약 50배, 약 0.1배 내지 약 100배, 약 0.1배 내지 약 500배, 약 0.1배 내지 약 1,000배, 약 0.1배 내지 약 10,000배, 약 0.5배 내지 약 1배, 약 0.5배 내지 약 2배, 약 0.5배 내지 약 5배, 약 0.5배 내지 약 10배, 약 0.5배 내지 약 20배, 약 0.5배 내지 약 50배, 약 0.5배 내지 약 100배, 약 0.5배 내지 약 500배, 약 0.5배 내지 약 1,000배, 약 0.5배 내지 약 10,000배, 약 1배 내지 약 2배, 약 1배 내지 약 5배, 약 1배 내지 약 10배, 약 1배 내지 약 20배, 약 1배 내지 약 50배, 약 1배 내지 약 100배, 약 1배 내지 약 500배, 약 1배 내지 약 1,000배, 약 1배 내지 약 10,000배, 약 2배 내지 약 5배, 약 2배 내지 약 10배, 약 2배 내지 약 20배, 약 2배 내지 약 50배, 약 2배 내지 약 100배, 약 2배 내지 약 500배, 약 2배 내지 약 1,000배, 약 2배 내지 약 10,000배, 약 5배 내지 약 10배, 약 5배 내지 약 20배, 약 5배 내지 약 50배, 약 5배 내지 약 100배, 약 5배 내지 약 500배, 약 5배 내지 약 1,000배, 약 5배 내지 약 10,000배, 약 10배 내지 약 20배, 약 10배 내지 약 50배, 약 10배 내지 약 100배, 약 10배 내지 약 500배, 약 10배 내지 약 1,000배, 약 10배 내지 약 10,000배, 약 20배 내지 약 50배, 약 20배 내지 약 100배, 약 20배 내지 약 500배, 약 20배 내지 약 1,000배, 약 20배 내지 약 10,000배, 약 50배 내지 약 100배, 약 50배 내지 약 500배, 약 50배 내지 약 1,000배, 약 50배 내지 약 10,000배, 약 100배 내지 약 500배, 약 100배 내지 약 1,000배, 약 100배 내지 약 10,000배, 약 500배 내지 약 1,000배, 약 500배 내지 약 10,000배, 또는 약 1,000배 내지 약 10,000배 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 역 cAMP를 적어도 약 0.1배, 약 0.5배, 약 1배, 약 2배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 50배, 약 100배, 약 500배, 약 1,000배, 또는 약 10,000배 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 역 cAMP를 적어도 적어도 약 0.1배, 약 0.5배, 약 1배, 약 2배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 50배, 약 100배, 약 500배, 또는 약 1,000배 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 역 cAMP를 적어도 최대 약 0.5배, 약 1배, 약 2배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 50배, 약 100배, 약 500배, 약 1,000배, 또는 약 10,000배 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 시스템은 시스템이 없는 세포에서의 GPCR 활성과 배경 사이의 측정 가능한 비율과 비교하여, 시스템을 포함하는 세포에서 GPCR 활성을 측정하는 동안 GPCR 활성과 배경 사이의 측정 가능한 비율을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 세포에서의 GPCR 활성과 배경 사이의 측정 가능한 비율을 적어도 약 0.1배 내지 약 10,000배 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 세포에서의 GPCR 활성과 배경 사이의 측정 가능한 비율을 적어도 약 0.1배 내지 약 0.5배, 약 0.1배 내지 약 1배, 약 0.1배 내지 약 2배, 약 0.1배 내지 약 5배, 약 0.1배 내지 약 10배, 약 0.1배 내지 약 20배, 약 0.1배 내지 약 50배, 약 0.1배 내지 약 100배, 약 0.1배 내지 약 500배, 약 0.1배 내지 약 1,000배, 약 0.1배 내지 약 10,000배, 약 0.5배 내지 약 1배, 약 0.5배 내지 약 2배, 약 0.5배 내지 약 5배, 약 0.5배 내지 약 10배, 약 0.5배 내지 약 20배, 약 0.5배 내지 약 50배, 약 0.5배 내지 약 100배, 약 0.5배 내지 약 500배, 약 0.5배 내지 약 1,000배, 약 0.5배 내지 약 10,000배, 약 1배 내지 약 2배, 약 1배 내지 약 5배, 약 1배 내지 약 10배, 약 1배 내지 약 20배, 약 1배 내지 약 50배, 약 1배 내지 약 100배, 약 1배 내지 약 500배, 약 1배 내지 약 1,000배, 약 1배 내지 약 10,000배, 약 2배 내지 약 5배, 약 2배 내지 약 10배, 약 2배 내지 약 20배, 약 2배 내지 약 50배, 약 2배 내지 약 100배, 약 2배 내지 약 500배, 약 2배 내지 약 1,000배, 약 2배 내지 약 10,000배, 약 5배 내지 약 10배, 약 5배 내지 약 20배, 약 5배 내지 약 50배, 약 5배 내지 약 100배, 약 5배 내지 약 500배, 약 5배 내지 약 1,000배, 약 5배 내지 약 10,000배, 약 10배 내지 약 20배, 약 10배 내지 약 50배, 약 10배 내지 약 100배, 약 10배 내지 약 500배, 약 10배 내지 약 1,000배, 약 10배 내지 약 10,000배, 약 20배 내지 약 50배, 약 20배 내지 약 100배, 약 20배 내지 약 500배, 약 20배 내지 약 1,000배, 약 20배 내지 약 10,000배, 약 50배 내지 약 100배, 약 50배 내지 약 500배, 약 50배 내지 약 1,000배, 약 50배 내지 약 10,000배, 약 100배 내지 약 500배, 약 100배 내지 약 1,000배, 약 100배 내지 약 10,000배, 약 500배 내지 약 1,000배, 약 500배 내지 약 10,000배, 또는 약 1,000배 내지 약 10,000배 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 세포에서의 GPCR 활성과 배경 사이의 비율을 적어도 약 0.1배, 약 0.5배, 약 1배, 약 2배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 50배, 약 100배, 약 500배, 약 1,000배, 또는 약 10,000배 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 세포에서의 GPCR 활성과 배경 사이의 비율을 적어도 적어도 약 0.1배, 약 0.5배, 약 1배, 약 2배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 50배, 약 100배, 약 500배, 또는 약 1,000배 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 세포에서의 GPCR 활성과 배경 사이의 비율을 적어도 최대 약 0.5배, 약 1배, 약 2배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 50배, 약 100배, 약 500배, 약 1,000배, 또는 약 10,000배 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 시스템은 시스템이 없는 세포에서의 배경과 비교하여 시스템을 포함하는 세포에서 GPCR 활성을 측정하는 동안 배경을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, GPCR 활성을 측정하는 동안 시스템을 포함하는 세포에서의 배경은 적어도 약 0.1배 내지 약 10,000배 감소된다. 일부 실시양태에서, GPCR 활성을 측정하는 동안 시스템을 포함하는 세포에서의 배경은 적어도 약 0.1배 내지 약 0.5배, 약 0.1배 내지 약 1배, 약 0.1배 내지 약 2배, 약 0.1배 내지 약 5배, 약 0.1배 내지 약 10배, 약 0.1배 내지 약 20배, 약 0.1배 내지 약 50배, 약 0.1배 내지 약 100배, 약 0.1배 내지 약 500배, 약 0.1배 내지 약 1,000배, 약 0.1배 내지 약 10,000배, 약 0.5배 내지 약 1배, 약 0.5배 내지 약 2배, 약 0.5배 내지 약 5배, 약 0.5배 내지 약 10배, 약 0.5배 내지 약 20배, 약 0.5배 내지 약 50배, 약 0.5배 내지 약 100배, 약 0.5배 내지 약 500배, 약 0.5배 내지 약 1,000배, 약 0.5배 내지 약 10,000배, 약 1배 내지 약 2배, 약 1배 내지 약 5배, 약 1배 내지 약 10배, 약 1배 내지 약 20배, 약 1배 내지 약 50배, 약 1배 내지 약 100배, 약 1배 내지 약 500배, 약 1배 내지 약 1,000배, 약 1배 내지 약 10,000배, 약 2배 내지 약 5배, 약 2배 내지 약 10배, 약 2배 내지 약 20배, 약 2배 내지 약 50배, 약 2배 내지 약 100배, 약 2배 내지 약 500배, 약 2배 내지 약 1,000배, 약 2배 내지 약 10,000배, 약 5배 내지 약 10배, 약 5배 내지 약 20배, 약 5배 내지 약 50배, 약 5배 내지 약 100배, 약 5배 내지 약 500배, 약 5배 내지 약 1,000배, 약 5배 내지 약 10,000배, 약 10배 내지 약 20배, 약 10배 내지 약 50배, 약 10배 내지 약 100배, 약 10배 내지 약 500배, 약 10배 내지 약 1,000배, 약 10배 내지 약 10,000배, 약 20배 내지 약 50배, 약 20배 내지 약 100배, 약 20배 내지 약 500배, 약 20배 내지 약 1,000배, 약 20배 내지 약 10,000배, 약 50배 내지 약 100배, 약 50배 내지 약 500배, 약 50배 내지 약 1,000배, 약 50배 내지 약 10,000배, 약 100배 내지 약 500배, 약 100배 내지 약 1,000배, 약 100배 내지 약 10,000배, 약 500배 내지 약 1,000배, 약 500배 내지 약 10,000배, 또는 약 1,000배 내지 약 10,000배 감소된다. 일부 실시양태에서, GPCR 활성을 측정하는 동안 시스템을 포함하는 세포에서의 배경은 적어도 약 0.1배, 약 0.5배, 약 1배, 약 2배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 50배, 약 100배, 약 500배, 약 1,000배, 또는 약 10,000배 감소된다. 일부 실시양태에서, GPCR 활성을 측정하는 동안 시스템을 포함하는 세포에서의 배경은 적어도 적어도 약 0.1배, 약 0.5배, 약 1배, 약 2배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 50배, 약 100배, 약 500배, 또는 약 1,000배 감소된다. 일부 실시양태에서, GPCR 활성을 측정하는 동안 시스템을 포함하는 세포에서의 배경은 적어도 최대 약 0.5배, 약 1배, 약 2배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 50배, 약 100배, 약 500배, 약 1,000배, 또는 약 10,000배 감소된다.
일부 실시양태에서, 시스템은 시스템이 없는 세포에서의 GPCR 활성 측정치의 측정 가능한 변동 계수와 비교하여 시스템을 포함하는 세포에서의 GPCR 활성 측정치의 측정 가능한 변동 계수를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 세포에서의 GPCR 활성 측정치의 측정 가능한 변동 계수를 적어도 약 0.1배 내지 약 10,000배 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 세포에서의 GPCR 활성 측정치의 측정 가능한 변동 계수를 적어도 약 0.1배 내지 약 0.5배, 약 0.1배 내지 약 1배, 약 0.1배 내지 약 2배, 약 0.1배 내지 약 5배, 약 0.1배 내지 약 10배, 약 0.1배 내지 약 20배, 약 0.1배 내지 약 50배, 약 0.1배 내지 약 100배, 약 0.1배 내지 약 500배, 약 0.1배 내지 약 1,000배, 약 0.1배 내지 약 10,000배, 약 0.5배 내지 약 1배, 약 0.5배 내지 약 2배, 약 0.5배 내지 약 5배, 약 0.5배 내지 약 10배, 약 0.5배 내지 약 20배, 약 0.5배 내지 약 50배, 약 0.5배 내지 약 100배, 약 0.5배 내지 약 500배, 약 0.5배 내지 약 1,000배, 약 0.5배 내지 약 10,000배, 약 1배 내지 약 2배, 약 1배 내지 약 5배, 약 1배 내지 약 10배, 약 1배 내지 약 20배, 약 1배 내지 약 50배, 약 1배 내지 약 100배, 약 1배 내지 약 500배, 약 1배 내지 약 1,000배, 약 1배 내지 약 10,000배, 약 2배 내지 약 5배, 약 2배 내지 약 10배, 약 2배 내지 약 20배, 약 2배 내지 약 50배, 약 2배 내지 약 100배, 약 2배 내지 약 500배, 약 2배 내지 약 1,000배, 약 2배 내지 약 10,000배, 약 5배 내지 약 10배, 약 5배 내지 약 20배, 약 5배 내지 약 50배, 약 5배 내지 약 100배, 약 5배 내지 약 500배, 약 5배 내지 약 1,000배, 약 5배 내지 약 10,000배, 약 10배 내지 약 20배, 약 10배 내지 약 50배, 약 10배 내지 약 100배, 약 10배 내지 약 500배, 약 10배 내지 약 1,000배, 약 10배 내지 약 10,000배, 약 20배 내지 약 50배, 약 20배 내지 약 100배, 약 20배 내지 약 500배, 약 20배 내지 약 1,000배, 약 20배 내지 약 10,000배, 약 50배 내지 약 100배, 약 50배 내지 약 500배, 약 50배 내지 약 1,000배, 약 50배 내지 약 10,000배, 약 100배 내지 약 500배, 약 100배 내지 약 1,000배, 약 100배 내지 약 10,000배, 약 500배 내지 약 1,000배, 약 500배 내지 약 10,000배, 또는 약 1,000배 내지 약 10,000배 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 세포에서의 GPCR 활성 측정치의 변동 계수를 적어도 약 0.1배, 약 0.5배, 약 1배, 약 2배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 50배, 약 100배, 약 500배, 약 1,000배, 또는 약 10,000배 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 세포에서의 GPCR 활성 측정치의 변동 계수를 적어도 적어도 약 0.1배, 약 0.5배, 약 1배, 약 2배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 50배, 약 100배, 약 500배, 또는 약 1,000배 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 세포에서의 GPCR 활성 측정치의 변동 계수를 적어도 최대 약 0.5배, 약 1배, 약 2배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 50배, 약 100배, 약 500배, 약 1,000배, 또는 약 10,000배 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 시스템은 시스템이 없는 세포에서의 GPCR 활성 측정치의 측정 가능한 위양성과 비교하여 시스템을 포함하는 세포에서의 GPCR 활성 측정치의 측정 가능한 위양성을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 세포에서의 GPCR 활성 측정치의 측정 가능한 위양성을 적어도 약 0.1배 내지 약 10,000배 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 세포에서의 GPCR 활성 측정치의 측정 가능한 위양성을 적어도 약 0.1배 내지 약 0.5배, 약 0.1배 내지 약 1배, 약 0.1배 내지 약 2배, 약 0.1배 내지 약 5배, 약 0.1배 내지 약 10배, 약 0.1배 내지 약 20배, 약 0.1배 내지 약 50배, 약 0.1배 내지 약 100배, 약 0.1배 내지 약 500배, 약 0.1배 내지 약 1,000배, 약 0.1배 내지 약 10,000배, 약 0.5배 내지 약 1배, 약 0.5배 내지 약 2배, 약 0.5배 내지 약 5배, 약 0.5배 내지 약 10배, 약 0.5배 내지 약 20배, 약 0.5배 내지 약 50배, 약 0.5배 내지 약 100배, 약 0.5배 내지 약 500배, 약 0.5배 내지 약 1,000배, 약 0.5배 내지 약 10,000배, 약 1배 내지 약 2배, 약 1배 내지 약 5배, 약 1배 내지 약 10배, 약 1배 내지 약 20배, 약 1배 내지 약 50배, 약 1배 내지 약 100배, 약 1배 내지 약 500배, 약 1배 내지 약 1,000배, 약 1배 내지 약 10,000배, 약 2배 내지 약 5배, 약 2배 내지 약 10배, 약 2배 내지 약 20배, 약 2배 내지 약 50배, 약 2배 내지 약 100배, 약 2배 내지 약 500배, 약 2배 내지 약 1,000배, 약 2배 내지 약 10,000배, 약 5배 내지 약 10배, 약 5배 내지 약 20배, 약 5배 내지 약 50배, 약 5배 내지 약 100배, 약 5배 내지 약 500배, 약 5배 내지 약 1,000배, 약 5배 내지 약 10,000배, 약 10배 내지 약 20배, 약 10배 내지 약 50배, 약 10배 내지 약 100배, 약 10배 내지 약 500배, 약 10배 내지 약 1,000배, 약 10배 내지 약 10,000배, 약 20배 내지 약 50배, 약 20배 내지 약 100배, 약 20배 내지 약 500배, 약 20배 내지 약 1,000배, 약 20배 내지 약 10,000배, 약 50배 내지 약 100배, 약 50배 내지 약 500배, 약 50배 내지 약 1,000배, 약 50배 내지 약 10,000배, 약 100배 내지 약 500배, 약 100배 내지 약 1,000배, 약 100배 내지 약 10,000배, 약 500배 내지 약 1,000배, 약 500배 내지 약 10,000배, 또는 약 1,000배 내지 약 10,000배 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 세포에서의 GPCR 활성 측정치의 위양성을 적어도 약 0.1배, 약 0.5배, 약 1배, 약 2배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 50배, 약 100배, 약 500배, 약 1,000배, 또는 약 10,000배 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 세포에서의 GPCR 활성 측정치의 위양성을 적어도 약 0.1배, 약 0.5배, 약 1배, 약 2배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 50배, 약 100배, 약 500배, 또는 약 1,000배 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 세포에서의 GPCR 활성 측정치의 위양성을 적어도 최대 약 0.5배, 약 1배, 약 2배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 50배, 약 100배, 약 500배, 약 1,000배, 또는 약 10,000배 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 시스템은 시스템이 없는 세포에서의 GPCR 활성 측정치의 측정 가능한 위음성과 비교하여 시스템을 포함하는 세포에서 GPCR 활성 측정치의 측정 가능한 위음성을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 세포에서의 GPCR 활성 측정치의 측정 가능한 위음성을 적어도 약 0.1배 내지 약 10,000배 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 세포에서의 GPCR 활성 측정치의 측정 가능한 위음성을 적어도 약 0.1배 내지 약 0.5배, 약 0.1배 내지 약 1배, 약 0.1배 내지 약 2배, 약 0.1배 내지 약 5배, 약 0.1배 내지 약 10배, 약 0.1배 내지 약 20배, 약 0.1배 내지 약 50배, 약 0.1배 내지 약 100배, 약 0.1배 내지 약 500배, 약 0.1배 내지 약 1,000배, 약 0.1배 내지 약 10,000배, 약 0.5배 내지 약 1배, 약 0.5배 내지 약 2배, 약 0.5배 내지 약 5배, 약 0.5배 내지 약 10배, 약 0.5배 내지 약 20배, 약 0.5배 내지 약 50배, 약 0.5배 내지 약 100배, 약 0.5배 내지 약 500배, 약 0.5배 내지 약 1,000배, 약 0.5배 내지 약 10,000배, 약 1배 내지 약 2배, 약 1배 내지 약 5배, 약 1배 내지 약 10배, 약 1배 내지 약 20배, 약 1배 내지 약 50배, 약 1배 내지 약 100배, 약 1배 내지 약 500배, 약 1배 내지 약 1,000배, 약 1배 내지 약 10,000배, 약 2배 내지 약 5배, 약 2배 내지 약 10배, 약 2배 내지 약 20배, 약 2배 내지 약 50배, 약 2배 내지 약 100배, 약 2배 내지 약 500배, 약 2배 내지 약 1,000배, 약 2배 내지 약 10,000배, 약 5배 내지 약 10배, 약 5배 내지 약 20배, 약 5배 내지 약 50배, 약 5배 내지 약 100배, 약 5배 내지 약 500배, 약 5배 내지 약 1,000배, 약 5배 내지 약 10,000배, 약 10배 내지 약 20배, 약 10배 내지 약 50배, 약 10배 내지 약 100배, 약 10배 내지 약 500배, 약 10배 내지 약 1,000배, 약 10배 내지 약 10,000배, 약 20배 내지 약 50배, 약 20배 내지 약 100배, 약 20배 내지 약 500배, 약 20배 내지 약 1,000배, 약 20배 내지 약 10,000배, 약 50배 내지 약 100배, 약 50배 내지 약 500배, 약 50배 내지 약 1,000배, 약 50배 내지 약 10,000배, 약 100배 내지 약 500배, 약 100배 내지 약 1,000배, 약 100배 내지 약 10,000배, 약 500배 내지 약 1,000배, 약 500배 내지 약 10,000배, 또는 약 1,000배 내지 약 10,000배 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 세포에서의 GPCR 활성 측정치의 위음성을 적어도 약 0.1배, 약 0.5배, 약 1배, 약 2배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 50배, 약 100배, 약 500배, 약 1,000배, 또는 약 10,000배 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 세포에서의 GPCR 활성 측정치의 위음성을 적어도 적어도 약 0.1배, 약 0.5배, 약 1배, 약 2배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 50배, 약 100배, 약 500배, 또는 약 1,000배 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 세포에서의 GPCR 활성 측정치의 위음성을 적어도 최대 약 0.5배, 약 1배, 약 2배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 50배, 약 100배, 약 500배, 약 1,000배, 또는 약 10,000배 감소시킨다.
반응 요소 조절된 프로모터
반응 요소는 특정 전사 인자에 의해 결합될 수 있고 유전자의 전사를 조절할 수 있는 유전자 프로모터 영역 내의 DNA의 짧은 서열이다. 특정 반응 요소는 특정 프로모터에 특이적이다. 일부 반응 요소는 내인성 전사 인자에 의해 결합될 수 있다. 동일한 반응 요소의 다수 카피는 뉴클레오티드 서열의 상이한 부분들에 위치하여 동일한 자극에 대한 반응으로 상이한 유전자들을 활성화시킬 수 있다. 본원에 개시된 시스템에 통합될 수 있는 반응 요소의 비제한적 예는 cAMP 반응 요소(CRE), B 인식 요소, AhR-, 다이옥신- 또는 생체이물-반응성 요소, HIF-반응성 요소, 호르몬 반응 요소, 혈청 반응 요소, 레티노산 반응 요소, 퍼옥시좀 증식체 호르몬 반응 요소, 금속-반응성 요소, DNA 손상 반응 요소, IFN-자극된 반응 요소, ROR 반응 요소, 글루코코르티코이드 반응 요소, 칼슘-반응 요소 CaRE1, 항산화제 반응 요소, p53 반응 요소, 갑상선 호르몬 반응 요소, 성장 호르몬 반응 요소, 스테롤 반응 요소, 폴리콤 반응 요소 및 비타민 D 반응 요소를 포함한다.
반응 요소 조절된 프로모터 뉴클레오티드 서열은 프로모터 및 유전자의 전사를 조절하는 다른 분자를 동원하는 데 도움을 주는 하나 이상의 반응 요소를 함유하는 핵산 영역이다. 세포는 유전자의 전사를 조정하기 위해 내인성 단백질을 이용하는 다수의 반응 요소 조절된 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 내인성 반응 요소 조절된 프로모터 뉴클레오티드 서열이 리포터의 전사를 직접 조절하는 상황에서, 내인성 프로모터의 존재로 인해 높은 수준의 배경 신호가 존재한다. 시스템을 함유하는 세포에 내인성이 아닌 전사 인자를 갖는 리포터의 전사를 조절하는 시스템은 내인성 전사 인자를 갖는 리포터의 전사를 조절하는 시스템에 비해 이점을 가질 것이다. 이러한 시스템의 한 가지 이점은 상기 리포터의 배경 생산이 더 낮다는 것이 될 것이다.
리포터
리포터 핵산은 최소한 GPCR 활성과 관련된 전사 인자(예를 들어, cAMP 반응 요소(CRE) 결합 단백질)에 의해 결합될 수 있는 조절 요소 및 리포터를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 리포터를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 GPCR 활성과 관련된 전사 인자에 의해 결합될 수 있는 조절 요소의 하류에 있다. GPCR 활성과 관련된 전사는 리포터의 발현을 조절한다.
특정 실시양태에서, 리포터를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 리포터 유전자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 리포터 유전자는 형광 단백질, 루시페라제 단백질, 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 및 분비성 태반 알칼리 포스파타제로부터 선택된 리포터를 코딩한다. 이들 리포터 단백질은 특정 효소 활성에 대해 검정될 수 있거나, 형광 리포터의 경우 형광 방출에 대해 검정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 형광 단백질은 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein: GFP), 적색 형광 단백질(red fluorescent protein: RFP), 황색 형광 단백질(yellow fluorescent protein: YFP), 또는 청록색 형광 단백질(cyan fluorescent protein: CFP)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 리포터 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 고유 서열 식별자(UMI)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, UMI는 시험 폴리펩티드에 대해 고유한 것이고, 여기서 상기 시험 폴리펩티드는 리포터 핵산에 의해 코딩된다. 일반적으로, UMI는 8 내지 20개 뉴클레오티드의 길이일 것이지만, 더욱 긴 길이일 수 있다. 특정 실시양태에서, UMI는 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 뉴클레오티드의 길이이다. 특정 실시양태에서, 상기 UMI는 8개의 뉴클레오티드의 길이이다. 특정 실시양태에서, UMI는 9개의 뉴클레오티드의 길이이다. 특정 실시양태에서, UMI는 10개의 뉴클레오티드의 길이이다. 특정 실시양태에서, UMI는 11개의 뉴클레오티드의 길이이다. 특정 실시양태에서, UMI는 12개의 뉴클레오티드의 길이이다. 특정 실시양태에서, 상기 UMI는 13개의 뉴클레오티드의 길이이다. 특정 실시양태에서, UMI는 14개의 뉴클레오티드의 길이이다. 특정 실시양태에서, UMI는 15개의 뉴클레오티드의 길이이다. 특정 실시양태에서, UMI는 16개의 뉴클레오티드의 길이이다. 특정 실시양태에서, UMI는 17개의 뉴클레오티드의 길이이다. 특정 실시양태에서, 상기 UMI는 18개의 뉴클레오티드의 길이이다. 특정 실시양태에서, UMI는 19개의 뉴클레오티드의 길이이다. 특정 실시양태에서, UMI는 20개의 뉴클레오티드의 길이이다. 특정 실시양태에서, UMI는 20개 초과의 뉴클레오티드의 길이이다.
본원에 개시된 시스템은 GPCR 활성과 관련된 전사 인자(예를 들어, CREB)의 결합을 통해 리포터 유전자의 활성화를 제어하는 많은 상이한 조절 서열을 이용할 수 있다. 조절 서열은 GPCR 활성과 관련된 전사 인자에 의해 결합될 수 있는 서열이다. 일반적으로, 조절 서열이 UMI, 리포터 유전자 또는 둘 모두에 대해 5'에 있도록 구성될 것이다. 특정 실시양태에서, 조절 서열은 GPCR 활성과 관련된 전사 인자에 의해 결합될 수 있는, Gal4-, PPR1- 또는 LexA-UAS를 포함한다.
특정 실시양태에서, 리포터는 형광 단백질, 루시페라제 단백질, 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 또는 분비성 태반 알칼리 포스파타제 및 UMI를 포함한다. 특정 실시양태에서, UMI는 형광 단백질, 루시페라제 단백질, 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 또는 분비성 태반 알칼리 포스파타제의 5'에 있는 리포터 핵산 상에서 코딩된다. 특정 실시양태에서, 형광 단백질, 루시페라제 단백질, 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 또는 분비성 태반 알칼리 포스파타제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 UMI의 5'에 있다.
UMI의 전사는 특정 시스템과 리포터의 연관성을 나타낼 것이기 때문에, UMI는 동일한 검정 내에서 상이한 시스템들의 다중화를 허용한다. UMI는 충분한 다양성을 통해 동일한 검정 내에서 상이한 시스템들의 다중화된 결정을 허용하는 임의의 길이일 수 있다. 상기 길이는 적어도 100, 500, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000 또는 10,000개의 표적 사이를 구별하기에 충분해야 한다. 특정 실시양태에서, 상이한 시스템은 상이한 세포에 존재할 것이다. 특정 실시양태에서, 상이한 시스템은 동일한 세포에 존재할 것이다. 리포터 요소는 5' UTR, 3'UTR 또는 둘 모두를 추가로 포함할 수 있다. UTR은 리포터 요소에 대해 이종성일 수 있다.
리포터 활성화
리포터 분자의 활성화는 루시페라제 단백질, 베타-갈락토시다제 단백질, 베타-글루쿠로니다제 단백질, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 단백질, 분비성 태반 알칼리 포스파타제 단백질을 검출하기 위한 표준 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 일반적으로, 이들은 검출 가능한 신호가 기질에 대한 단백질 효소 활성에 기반하여 생성되는 것인 효소 검정이다. 예를 들어, 루시페라제 발현은 루시페라제 기질의 존재 하에 발광측정장치에 의해 측정될 수 있다. 형광 리포터는 기질을 필요하지 않으며, 신호는 형광 현미경 또는 형광 플레이트 판독기에 의해 측정될 수 있다. 형광 리포터는 살아있는 세포에서 리포터 활성화를 측정하는 데 특히 유용하다.
일부 실시양태에서, 리포터 분자는 인덱스 서열 또는 바코드 서열로도 지칭되는 고유 분자 식별자(UMI)와 같은 고유 RNA 서열을 포함한다. 리포터 활성화는 고유 RNA 서열의 서열 결정을 허용하는 임의의 적합한 방식으로 측정될 수 있으며, 다중화 방식의 서열 결정을 허용하는 방법이 바람직하다. 이러한 방법은 24시간 기간 내에 적어도 약 100,000, 1,000,000, 10,000,000 또는 100,000,000개의 DNA 또는 RNA 염기에 대한 정보를 생성할 수 있는 고처리량 시퀀싱 방법을 포함한다. 특정 실시양태에서, 차세대 시퀀싱 기술을 사용하여 고유 RNA 서열의 서열을 결정한다. 차세대 시퀀싱은 파이로시퀀싱, 합성에 의한 시퀀싱, 단일 분자 시퀀싱, 차세대 시퀀싱, 나노포어 시퀀싱, 라이게이션(ligation)에 의한 시퀀싱 또는 혼성화에 의한 시퀀싱과 같은 많은 종류의 시퀀싱을 포함한다. 차세대 시퀀싱 플랫폼은 일루미나(Illumina)(RNA-Seq) 및 헬리코스(Helicos)(Digital Gene Expression 또는 "DGE")로부터 상업적으로 이용가능한 것들을 포함한다. 차세대 시퀀싱은 1) 문헌 [Margulies et al., Nature (2005) 437:376-380 (2005)] 및 미국 특허 제7,244,559호; 제7,335,762호; 제7,21 1,390호; 제7,244,567호; 제7,264,929호; 제7,323,305호에 개시된 방법 및 장치를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 454/로슈 라이프사이언시스(454/Roche Lifesciences); 2) 미국 출원 제11/167046호 및 미국 특허 제7501245호; 제7491498호; 제7,276,720호; 및 미국 특허 출원 공개 제US20090061439호; 제US20080087826호; 제US20060286566호; 제US20060024711호; 제US20060024678호; 제US20080213770호; 및 제US20080103058호에 개시된 헬리코스 바이오사이언시스 코포레이션(Helicos Biosciences Corporation)(매사추세츠주 케임브리지); 3) 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)(예를 들어, SOLiD 시퀀싱); 4) 도버 시스템즈(Dover Systems)(예를 들어, Polonator G.007 시퀀싱); 5) 미국 특허 제5,750,341호; 제6,306,597호; 및 제5,969,119호에 개시된 일루미나, 인크.(Illumina, Inc.); 및 6) 미국 특허 제7,462,452호; 제7,476,504호; 제7,405,281호; 제7,170,050호; 제7,462,468호; 제7,476,503호; 제7,315,019호; 제7,302,146호; 제7,313,308호; 및 미국 출원 공개 제US20090029385호; 제US20090068655호; 제US20090024331호; 및 제US20080206764에 개시된 퍼시픽 바이오 사이언시스(Pacific Biosciences)에 의해 상업화된 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
세포
본원에 개시된 시스템 및 방법에 유용한 세포는 일반적으로 본원에 개시된 하나 이상의 핵산으로 쉽게 형질전환될 수 있는 세포이다. 조절 요소, 이펙터 및/또는 리포터 요소를 코딩하는 시스템 핵산(들)은 당업게에 공지된 방법, 예컨대 인산칼슘 형질감염, 지질 기반 형질감염(예를 들어, Lipofectamine™, Lipofectamine-2000™, Lipofectamine-3000™ 또는 Fugene® HD), 전기천공 또는 바이러스 형질도입을 사용하여 적합한 세포주 내로 형질감염 또는 형질도입될 수 있다. 세포는 또한 적절한 조직 배양 용기에서 전면생장(confluency)까지 또는 전면생장에 가깝게 성장한 동일한 유형의 세포 집단일 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 사용된 세포는 조절 요소를 코딩하는 핵산, 이펙터를 코딩하는 핵산, 리포터 요소를 포함하는 핵산 또는 이들의 조합의 안정한 통합을 포함한다. 안정한 세포주는 선형화된 플라스미드의 무작위 통합, 바이러스 또는 트랜스포존 유도 통합, 또는 예를 들어 AttP와 AttB 부위 사이의 부위 특이적 재조합을 사용하여 유도 통합을 사용하여 본원에 개시된 세포로부터 만들어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 핵산 중 하나는 AAVS1 부위와 같은 안전한 랜딩 부위에 통합된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 세포는 세포의 게놈에 안정하게 통합된 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 세포는 세포의 게놈에 안정하게 통합된 조절 요소를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 세포는 세포의 게놈에 안정하게 통합된 본원에 개시된 적어도 하나의 이펙터를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 이펙터는 GPCR 이펙터이다. 일부 경우에, GPCR 이펙터는 ADCY1, ADCY2, ADCY3, ADCY4, ADCY5, ADCY6, ADCY7, ADCY8, ADCY9 또는 ADCY10의 군으로부터 선택된 아데닐릴 사이클라제이다. 일부 실시양태에서, 세포는 이펙터의 발현을 조정하기 위한 조절 요소를 코딩하는 안정하게 통합된 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 세포는 본원에 개시된 이펙터를 상향조절하기 위한 조절 요소를 코딩하는 안정하게 통합된 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 세포는 ADCY6을 상향조절하기 위한 조절 요소를 코딩하는 안정하게 통합된 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 세포는 ADCY6을 코딩하는 안정하게 통합된 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 세포는 본원에 개시된 이펙터를 하향조절하기 위한 조절 요소를 코딩하는 안정하게 통합된 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 세포는 ADCY3을 하향조절하기 위한 조절 요소를 코딩하는 안정하게 통합된 핵산을 포함한다.
특정 실시양태에서, 시스템에서 사용되는 세포 또는 세포 집단은 진핵 세포이다. 특정 실시양태에서, 세포 또는 세포 집단은 포유동물 세포이다. 특정 실시양태에서, 세포 또는 세포 집단은 인간 세포이다. 특정 실시양태에서, 세포 또는 세포 집단은 SH-SY5Y, 인간 신경모세포종; Hep G2, 인간 백인 간세포 암종; 293(HEK293으로서도 알려짐), 인간 배아 신장; RAW 264.7, 마우스 단핵구 대식세포; HeLa, 인간 자궁경부 상피 암종; MRC-5(PD 19), 인간 태아 폐; A2780, 인간 난소 암종; CACO-2, 인간 백인 결장 선암종; THP 1, 인간 단핵구 백혈병; A549, 인간 백인 폐 암종; MRC-5(PD 30), 인간 태아 폐; MCF7, 인간 백인 유방 선암종; SNL 76/7, 마우스 SIM 균주 배아 섬유모세포; C2C12, 마우스 C3H 근육 근모세포; Jurkat E6.1, 인간 백혈병 T 세포 림프모구; U937, 인간 백인 조직구 림프종; L929, 마우스 C3H/An 결합 조직; 3T3 L1, 마우스 배아; HL60, 인간 백인 전골수구성 백혈병; PC-12, 래트 부신 크롬친화세포종; HT29, 인간 백인 결장 선암종; OE33, 인간 백인 식도 암종; OE19, 인간 백인 식도 암종; NIH 3T3, 마우스 스위스 NIH 배아; MDA-MB-231, 인간 백인 유방 선암종; K562, 인간 백인 만성 골수성 백혈병; U-87 MG, 인간 교모세포종 성상세포종; MRC-5(PD 25), 인간 태아 폐; A2780cis, 인간 난소 암종; B9, 마우스 B 세포 하이브리도마; CHO-K1, U2OS, 햄스터 중국 난소; MDCK, 개 코커 스파니엘(Cocker Spaniel) 신장; 1321N1, 인간 뇌 성상세포종; A431, 인간 편평 암종; ATDC5, 마우스 129 기형암종 AT805 유래; RCC4 PLUS VECTOR ALONE, 네오마이신 내성을 부여하는 공(empty) 발현 벡터인 pcDNA3에 의해 안정하게 형질감염된 신장 세포 암종 세포주 RCC4; HUVEC(S200-05n), 인간 미리 스크리닝된 제대 정맥 내피 세포(HUVEC); 신생아; Vero, 아프리카 녹색 원숭이 신장; RCC4 PLUS VHL, pcDNA3-VHL로 안정하게 형질감염된 신장 세포 암종 세포주 RCC4; Fao, 래트 간암종; J774A.1, 마우스 BALB/c 단핵구 대식세포; MC3T3-E1, 마우스 C57BL/6 칼바리아(calvaria); J774.2, 마우스 BALB/c 단핵구 대식세포; PNT1A, SV40에 의해 불멸화된 인간 사춘기 후 전립선 정상; U-2 OS, 인간 골육종; HCT 116, 인간 결장 암종; MA104, 아프리카 녹색 원숭이 신장; BEAS-2B, 인간 기관지 상피, 정상; NB2-11, 래트 림프종; BHK 21(클론 13), 햄스터 시리안 신장; NS0, 마우스 골수종; Neuro 2a, 마우스 알비노 신경모세포종; SP2/0-Ag14, 마우스 x 마우스 골수종, 비생산; T47D, 인간 유방 종양; 1301, 인간 T 세포 백혈병; MDCK-II, 개 코커 스파니엘 신장; PNT2, SV40에 의해 불멸화된 인간 전립선 정상; PC-3, 인간 백인 전립선 선암종; TF1, 인간 적혈백혈병; COS-7, SV40으로 형질전환된 아프리카 녹색 원숭이 신장; MDCK, 개 코커 스파니엘 신장; HUVEC(200-05n), 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC); 신생아; NCI-H322, 인간 백인 기관지폐포 암종; SK.N.SH, 인간 백인 신경모세포종; LNCaP.FGC, 인간 백인 전립선 암종; OE21, 인간 백인 식도 편평 세포 암종; PSN1, 인간 췌장 선암종; ISHIKAWA, 인간 아시아인 자궁내막 선암종; MFE-280, 인간 백인 자궁내막 선암종; MG-63, 인간 골육종; RK 13, 토끼 신장, BVDV 음성; EoL-1 세포, 인간 호산구성 백혈병; VCaP, 인간 전립선암 전이; tsA201, SV40으로 형질전환된 인간 배아 신장; CHO, 중국 햄스터 난소; HT 1080, 인간 섬유육종; PANC-1, 인간 백인 췌장; Saos-2, 인간 원발성 골원성 육종; 섬유모세포 성장 배지(116K-500), 섬유모세포 성장 배지 키트; ND7/23, 마우스 신경모세포종 x 래트 뉴런 하이브리드; SK-OV-3, 인간 백인 난소 선암종; COV434, 인간 난소 과립막 종양; Hep 3B, 인간 간세포 암종; Vero(WHO), 아프리카 녹색 원숭이 신장; Nthy-ori 3-1, 인간 갑상선 여포 상피; U373 MG(Uppsala), 인간 교모세포종 성상세포종; A375, 인간 악성 흑색종; AGS, 인간 백인 위 선암종; CAKI 2, 인간 백인 신장 암종; COLO 205, 인간 백인 결장 선암종; COR-L23, 인간 백인 폐 대세포 암종; IMR 32, 인간 백인 신경모세포종; QT 35, 일본 메추라기 섬유육종(Quail Japanese fibrosarcoma); WI 38, 인간 백인 태아 폐; HMVII, 인간 질 악성 흑색종; HT55, 인간 결장 암종; TK6, 인간 림프모구, 티미딘 키나제 이형접합체; SP2/0-AG14(AC-FREE), 마우스 x 마우스 하이브리도마 비분비, 무혈청, 동물 구성요소(AC) 무함유; AR42J, 또는 래트 외분비 췌장 종양; 또는 이들의 조합이다.
특정 실시양태에서, 세포 또는 세포주는 높은 기초 리포터 활성을 포함한다. 특정 실시양태에서, 높은 기초 리포터 활성은 배경보다 적어도 약 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 더 크고, 여기서 상기 배경은 리포터를 포함하지 않는 세포 또는 세포주에 대해 관찰된 리포터 활성의 수준이다. 특정 실시양태에서, 높은 기초 리포터 활성은 배경보다 적어도 약 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 더 크고, 여기서 상기 배경은 본원에 개시된 시스템을 포함하지 않는 세포 또는 세포주에 대해 관찰된 리포터 활성의 수준이다. 이러한 비교를 위해, 일반적으로 비교군으로서 사용되는 세포 또는 세포주는 시스템을 포함하는 세포주의 모체일 것이다(예를 들어, 시스템을 갖는 HEK293 대 시스템이 없는 HEK293).
특정 실시양태에서, 세포 또는 세포주는 높은 기초 리포터 활성을 포함한다. 특정 실시양태에서, 높은 기초 리포터 활성은 배경보다 적어도 약 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 15x, 20x, 25x, 30x, 32x, 50x, 75x, 100x, 200x, 500x, 750x, 1,000x, 2,000x, 5,000x 10,000x 또는 20,000x 더 크고, 여기서 상기 배경은 리포터를 포함하지 않는 세포 또는 세포주에 대해 관찰된 리포터 활성의 수준이다. 특정 실시양태에서, 높은 기초 리포터 활성은 배경보다 적어도 약 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 15x, 20x, 25x, 30x, 32x, 50x, 75x, 100x, 200x, 500x, 750x, 1,000x, 2,000x, 5,000x 10,000x 또는 20,000x 더 크고, 여기서 상기 배경은 본원에 개시된 시스템을 포함하지 않는 세포 또는 세포주에 대해 관찰된 리포터 활성의 수준이다. 특정 실시양태에서, 세포 또는 세포주는 높은 기초 리포터 활성을 포함한다. 특정 실시양태에서, 높은 기초 리포터 활성은 배경보다 적어도 약 30x 더 크고, 여기서 상기 배경은 리포터를 포함하지 않는 세포 또는 세포주에 대해 관찰되는 리포터 활성의 수준이다. 특정 실시양태에서, 높은 기초 리포터 활성은 배경보다 적어도 약 30x 더 크고, 여기서 상기 배경은 본원에 개시된 시스템을 포함하지 않는 세포 또는 세포주에 대해 관찰되는 리포터 활성의 수준이다. 이러한 비교를 위해, 일반적으로, 비교군으로서 사용되는 세포 또는 세포주는 시스템을 포함하는 세포주의 모체일 것이다(예를 들어, 시스템을 갖는 HEK293 대 시스템이 없는 HEK293).
특정 실시양태에서, 세포 또는 세포주는 기초 리포터 활성의 낮은 변동을 포함한다. 특정 실시양태에서, 기초 리포터 활성의 낮은 변동은 약 0.6 미만의 생물학적 변동 계수이다. 특정 실시양태에서, 기초 리포터 활성의 낮은 변동은 약 0.5 미만의 생물학적 변동 계수이다. 특정 실시양태에서, 기초 리포터 활성의 낮은 변동은 약 0.4 미만의 생물학적 변동 계수이다. 특정 실시양태에서, 기초 리포터 활성의 낮은 변동은 약 0.3 미만의 생물학적 변동 계수이다. 특정 실시양태에서, 기초 리포터 활성의 낮은 변동은 약 0.2 미만의 생물학적 변동 계수이다. 특정 실시양태에서, 기초 리포터 활성의 낮은 변동은 약 0.1 미만의 생물학적 변동 계수이다.
GPCR 활성을 측정하는 방법
본원에 개시된 시스템은 GPCR 활성을 측정하기 위한 다양한 방법을 사용하여 효과적으로 이용될 수 있다. 시스템은 정상 상태에서 그리고 물리적 또는 화학적 자극에 대한 반응으로 세포 신호전달 경로의 GPCR 활성을 측정하는 방법에서 유용하다. 리포터 요소가 특정 리포터 요소에 메이팅된 UMI 서열을 포함할 때, 시스템은 다중화된 검정에서 효율적으로 사용될 수 있다.
하나의 비제한적이고 예시적인 예에서, 복수의 세포를 다중웰 플레이트의 하나의 웰에서 인큐베이션한다. 복수의 세포를 본원에 개시된 핵산 중 적어도 하나로 형질감염시킨다. 일부 실시양태에서, 핵산은 본원에 개시된 조절 요소를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 본원에 개시된 이펙터를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 본원에 개시된 리포터를 코딩한다. 그 다음, 형질감염된 세포를 GPCR에 대한 리간드와 접촉시킨다. 리포터의 발현을 허용하기에 충분한 시간 후에 세포 용해물을 수거할 수 있고 리포터 유전자의 활성화를 측정할 수 있다. 이러한 예에서, 리포터 유전자의 존재 증가는 리간드가 GPCR에 결합하거나 복합체를 형성하여 GPCR 활성의 증가를 유발하였음을 시사하는 것이 될 것이다. 일부 경우에, 리포터 유전자의 존재 증가는 리간드가 GPCR에 결합하거나 복합체를 형성하여 Gi 알파 서브유닛 활성을 포함하는 GPCR 활성의 증가를 유발하였음을 시사하는 것이 될 것이다. 일부 경우에, 리포터 유전자의 존재 증가는 리간드가 GPCR에 결합하거나 복합체를 형성하여 cAMP 활성을 포함하는 GPCR 활성의 증가를 유발하였음을 시사하는 것이 될 것이다. 일부 경우에, 리포터 유전자의 존재 증가는 리간드가 GPCR에 결합하거나 복합체를 형성하여 역 cAMP 활성을 포함하는 GPCR 활성의 증가를 유발하였음을 시사하는 것이 될 것이다. 일부 실시양태에서, 리간드와 접촉된 형질감염된 세포는 본원에 개시된 시스템으로 형질감염되지 않은 세포의 GPCR 활성과 비교하여 증가된 GPCR 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 리간드와 접촉된 형질감염된 세포는 본원에 개시된 시스템으로 형질감염되지 않은 세포의 GPCR 활성과 비교하여 증가된 Gi 알파 서브유닛 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 리간드와 접촉된 형질감염된 세포는 본원에 개시된 시스템으로 형질감염되지 않은 세포의 GPCR 활성과 비교하여 증가된 cAMP 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 리간드와 접촉된 형질감염된 세포는 본원에 개시된 시스템으로 형질감염되지 않은 세포의 GPCR 활성과 비교하여 증가된 역 cAMP 활성을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 리포터 유전자는 기질과의 상호작용 시 검출 가능한 신호를 생성하는 효소를 포함하고, 당업계에 공지된 표준 검정을 이용하여 리포터 유전자의 활성화를 정량화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 리포터 유전자는 형광 분자를 포함하고, 리포터 유전자의 활성화는 형광 현미경 또는 형광 플레이트 판독기에 의해 측정될 수 있고, 세포 용해를 필요로 하지 않을 수 있다. 형광 분자는 살아있는 세포에서 리포터 활성화를 측정하는 데 유용한다. 일부 실시양태에서, 리포터 유전자는 UMI를 포함하고, mRNA는 역전사되며, UMI의 시퀀싱은 차세대 시퀀싱 기술에 의해 수행된다.
특정 실시양태에서, 검정은 6, 12, 24, 48, 96 또는 384-웰 형식과 같은 다중웰 형식으로 수행된다. 특정 실시양태에서, 각각의 웰에 상이한 시험 화학물질(예를 들어, 리간드)가 공급되거나, 시험 화학물질은 2중, 3중 또는 4중 웰로 공급된다. 검정은 또한 하나 이상의 양성 또는 음성 대조군 웰을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 개시된 적어도 하나의 핵산으로 형질감염된 세포 집단에서 GPCR 활성을 측정하는 것을 포함한다. 본 개시내용의 적어도 하나의 핵산으로 형질감염된 세포 집단은 임의의 크기일 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 집단은 1,000개, 10,000개, 100,000개, 1,000,000개, 10,000,000개 이상의 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 약 1,000개 이상의 세포가 본원에 개시된 시스템의 적어도 하나의 핵산으로 형질감염된다. 특정 실시양태에서, 적어도 약 10,000개 이상의 세포가 본원에 개시된 시스템의 적어도 하나의 핵산으로 형질감염된다. 특정 실시양태에서, 적어도 약 100,000개 이상의 세포가 본원에 개시된 시스템의 적어도 하나의 핵산으로 형질감염된다. 특정 실시양태에서, 적어도 약 1,000,000개 이상의 세포가 본원에 개시된 시스템의 적어도 하나의 핵산으로 형질감염된다. 특정 실시양태에서, 적어도 약 10,000,000개 이상의 세포가 본원에 개시된 시스템의 적어도 하나의 핵산으로 형질감염된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 시스템은 다중웰 플레이트 실험에서 이용될 수 있다. 본 개시내용의 시스템과 양립할 수 있는 다중웰 플레이트의 비제한적 예는 6, 12, 24, 48, 96, 384 또는 1,536개의 웰 플레이트를 포함한다. 특정 실시양태에서, 다중웰 플레이트의 각각의 웰은 본원에 개시된 시스템의 적어도 하나의 핵산으로 형질감염된 세포 집단을 포함한다. 특정 실시양태에서, 다중웰 플레이트의 각각의 웰은 본원에 개시된 시스템의 적어도 하나의 핵산으로 형질감염된 세포 집단을 포함한다. 특정 실시양태에서, 각각의 웰은 다수의 세포 집단을 포함하고, 각각의 세포 집단은 본원에 개시된 시스템의 적어도 하나의 핵산으로 형질감염된다. 특정 실시양태에서, 각각의 웰은 다수의 세포 집단을 포함하고, 각각의 세포 집단은 본원에 개시된 시스템의 적어도 하나의 핵산으로 형질감염된다.
현재 시스템의 한 가지 강점은 상이한 표적을 발현하는 세포 라이브러리가 동일한 웰에서 함께 배양되고 동시에, 예를 들어 동일한 실험에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1,000개 이상의 표적을 허용하여 분석될 수 있다는 것이다. 이는 해당 표적에 대해 고유한 UMI와 회합되는 표적에 의해 달성되며 이어서 UMI는 데이터를 디컨볼루션하는 고처리량 시퀀싱으로 분석될 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 복수의 포유동물 세포를 포함하는 시스템이 본원에서 기술되며, 여기서 상기 복수의 포유동물 세포 각각은 상이한 GPCR 표적을 포함하고 복수의 포유동물 세포의 각 세포는 a) GPCR 활성의 제1 이펙터로서, 상기 GPCR 활성의 제1 이펙터의 발현이 야생형 상태의 GPCR 활성의 제1 이펙터의 발현과 비교하여 상향조절되는 GPCR 활성의 제1 이펙터; 및 b) GPCR 활성의 제2 이펙터로서, 상기 GPCR 활성의 제2 이펙터의 발현이 야생형 상태의 GPCR 활성의 제2 이펙터의 발현과 비교하여 하향조절되는 GPCR 활성의 제2 이펙터를 포함한다. 특정 실시양태에서, 복수의 포유동물 세포는 고유 분자 식별자(UMI) 핵산 서열을 포함하는 리포터 유전자를 추가로 포함하고, 상기 리포터 유전자는 GPCR 신호전달에 반응성인 프로모터에 의해 활성화될 수 있다.
따라서, 특정 실시양태에서, 복수의 포유동물 세포를 포함하는 시스템이 본원에 기술되며, 여기서 상기 복수의 포유동물 세포 각각은 상이한 표적을 포함하고 복수의 포유동물 세포의 각 세포는 a) 표적 활성의 제1 이펙터로서, 상기 표적 활성의 제1 이펙터의 발현이 야생형 상태의 표적 활성의 제1 이펙터의 발현과 비교하여 상향조절되는 표적 활성의 제1 이펙터; 및 b) 표적 활성의 제2 이펙터로서, 상기 표적 활성의 제2 이펙터의 발현이 야생형 상태의 표적 활성의 제2 이펙터의 발현과 비교하여 하향조절되는 표적 활성의 제2 이펙터를 포함한다. 특정 실시양태에서, 복수의 포유동물 세포는 고유 분자 식별자(UMI) 핵산 서열을 포함하는 리포터 유전자를 추가로 포함하고, 상기 리포터 유전자는 표적 신호전달에 반응성인 프로모터에 의해 활성화될 수 있다.
특정 실시양태에서, GPCR과 복합체를 형성하거나 결합하는 리간드와 같은 시험 제제가 본원에 개시된 시스템의 적어도 하나의 핵산으로 형질감염된 세포에 적용된다. 특정 실시양태에서, 리포터 분자의 전사 활성화 수준은 세포가 시험 제제와 접촉한 후에 측정된다. 특정 실시양태에서, 시험 제제는 화학물질, 소분자, 생물학적 분자, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 압타머, 또는 이들의 임의의 조합이다. 특정 실시양태에서, 단일 시험 제제가 세포 집단에 적용된다. 특정 실시양태에서, 복수의 시험 제제가 세포 집단에 적용된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 리간드를 본원에 개시된 시스템을 포함하는 세포의 표면 상에 발현된 GPCR과 접촉시킴으로써 GPCR 활성을 측정한다. 일부 실시양태에서, 방법은 복수의 리간드를 본원에 개시된 시스템을 포함하는 세포의 표면 상에 발현된 GPCR과 접촉시킴으로써 GPCR 활성을 측정한다. 일부 실시양태에서, 방법은 리간드를 본원에 개시된 시스템을 포함하는 세포의 표면 상에 발현된 복수의 GPCR과 접촉시킴으로써 GPCR 활성을 측정한다. 일부 실시양태에서, 방법은 복수의 리간드를 본원에 개시된 시스템을 포함하는 세포의 표면 상에 발현된 복수의 GPCR과 접촉시킴으로써 GPCR 활성을 측정한다.
특정 실시양태에서, 시스템은 시험 제제 또는 리간드에 대한 GPCR의 반응을 측정하기 위해 적합화될 수 있다. 본 개시내용의 시스템은 임의의 GPCR 수용체와 함께 사용하기 위해 적합화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 시스템은 cAMP 반응 요소 조절된 프로모터를 이용함으로써 GPCR 수용체와 함께 사용하기 위해 적합화된다. GPCR의 비제한적 예는 5-하이드록시트립타민 수용체, 아세틸콜린 수용체, 아데노신 수용체, 아드레날린 수용체, 안지오텐신 수용체, 아펠린 수용체, 담즙산 수용체, 봄베신 수용체, 브래디키닌 수용체, 칸나비노이드 수용체, 케메린 수용체, 케모카인 수용체, 콜레시스토키닌 수용체, 도파민 수용체, 엔도텔린 수용체, 포르밀펩티드 수용체, 유리 지방산 수용체, 갈라닌 수용체, 그렐린 수용체, 당단백 호르몬 수용체, 성선자극호르몬 방출 호르몬 수용체, GPR18, GPR55, GPR119, G 단백질 커플링된 에스트로겐 수용체, 히스타민 수용체, 하이드록시카복실산 수용체, 키스펩틴 수용체, 류코트리엔 수용체, LPA 수용체, S1P 수용체, 멜라닌 농축 호르몬 수용체, 멜라노코르틴 수용체, 멜라토닌 수용체, 모틸린 수용체, 뉴로메딘 U 수용체, 신경펩티드 FF/신경펩티드 AF 수용체, 신경펩티드 S 수용체, 신경펩티드 W/신경펩티드 B 수용체, 신경펩티드 Y 수용체, 뉴로텐신 수용체, 오피오이드 수용체, 옵신 수용체, 오렉신 수용체, 옥소글루타레이트 수용체, P2Y 수용체, 혈소판 활성화 인자 수용체, 프로키네티신 수용체, 프로락틴 방출 펩티드 수용체, 프로스타노이드 수용체, 프로테이나제 활성화 수용체, QRFP 수용체, 릴랙신 패밀리 펩티드 수용체, 소마토스타틴 수용체, 석시네이트 수용체, 타키키닌 수용체, 갑상선 자극 호르몬 방출 호르몬 수용체, 미량 아민 수용체, 유로텐신 수용체, 바소프레신 및 옥시토신 수용체, 칼시토닌 수용체, 코르티코트로핀 방출 인자 수용체, 글루카곤 수용체 패밀리, 부갑상선 호르몬 수용체, VIP 및 PACAP 수용체, 칼슘 감지 수용체, GABAB 수용체, 대사성 글루타메이트 수용체, 미각 1 수용체, 프리즐드(frizzled) 클래스 수용체, 부착 클래스 GPCR, 고아 수용체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
본 개시내용의 핵산은 당업계에서 통상적인 많은 벡터와 양립할 수 있다. 벡터의 비제한적인 예는 게놈 통합 벡터, 에피솜 벡터, 플라스미드, 바이러스 벡터, 코스미드, 박테리아 인공 염색체, 및 효모 인공 염색체를 포함한다. 본 개시내용의 핵산과 양립할 수 있는 바이러스 벡터의 비제한적인 예는 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스로부터 유래된 벡터를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 핵산은 게놈에서 정의된 위치 또는 제한된 부위 세트로의 부위 특이적 통합을 지시하는 서열을 포함하는 벡터 상에 존재한다(예를 들어, AttP-AttB 재조합).
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 시스템은 단일 벡터 내로 혼입된다. 특정 실시양태에서, 단일 벡터는 일시적으로 세포 내로 형질감염된다. 특정 실시양태에서, 단일 벡터는 세포 내로 안정하게 형질감염된다.
특정 실시양태에서, 시스템은 2개의 벡터에 걸쳐 나뉘어진다. 특정 실시양태에서, 제1 벡터는 제1 조절 요소 및 제1 이펙터를 포함하는 한편, 제2 벡터는 제2 이펙터의 발현을 조정하기 위한 제2 조절 요소를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 벡터 및 제2 벡터는 세포 내로 일시적으로 형질감염된다. 특정 실시양태에서, 제1 벡터 및 제2 벡터는 세포 내로 안정하게 형질감염된다. 특정 실시양태에서, 제1 벡터는 세포 내로 안정하게 형질감염되고, 제2 벡터는 일시적으로 세포 내로 형질감염된다. 특정 실시양태에서, 제1 벡터는 일시적으로 세포 내로 형질감염되고, 제2 벡터는 세포 내로 안정하게 형질감염된다. 일부 실시양태에서, 리포터를 포함하는 별개의 벡터가 세포 내로 형질감염될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 또는 제2 벡터로 형질감염된 세포는 이미 리포터를 포함한다.
본원에 개시된 시스템 또는 그의 일부를 포함하는 벡터는 많은 잘 알려진 분자생물학 기술을 사용하여 작제할 수 있다. 증폭, 클로닝, 돌연변이유발, 형질전환 등을 포함하는 수많은 이러한 절차에 대한 상세한 프로토콜은 예를 들어 문헌[Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (supplemented through 2012) John Wiley & Sons, New York 10 ("Ausubel"); Sambrook et al. Molecular Cloning - A Laboratory Manual (4th Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 2012 ("Sambrook"); 및 Abelson et al. Guide to Molecular Cloning Techniques (Methods in Enzymology) volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA ("Abelson")]에 기술되어 있다.
키트
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 시스템을 포함하는 키트가 본원에서 개시된다. 일부 경우에, 키트는 본원에 개시된 시스템의 적어도 하나의 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 세포를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 키트는 적어도 본원에 개시된 핵산으로 형질감염된 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 적어도 본원에 개시된 핵산으로 형질감염될 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 키트는 세포에서 GPCR 활성을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 키트는 세포에서 GPCR 활성을 조정하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 키트는 세포에서 G 단백질 활성을 조정하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 키트는 세포에서 Gi 알파 서브유닛 활성을 조정하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 키트는 세포에서 cAMP 활성을 조정하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 키트는 세포에서 역 cAMP 활성을 조정하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 키트는 세포에서 GPCR 활성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 키트는 세포에서 G 단백질 활성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 키트는 세포에서 Gi 알파 서브유닛 활성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 키트는 세포에서 cAMP 활성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 키트는 세포에서 역 cAMP 활성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 키트는 세포에서 GPCR 이펙터의 발현을 조정하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 키트는 세포에서 GPCR 이펙터의 발현을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 키트는 세포에서 GPCR 이펙터의 발현을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 키트는 세포에서 제1 GPCR 이펙터의 발현을 증가시키고 세포에서 제2 GPCR 이펙터의 발현을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, GPCR 이펙터는 아데닐릴 사이클라제이다. 아데닐릴 사이클라제는 ADCY1, ADCY2, ADCY3, ADCY4, ADCY5, ADCY6, ADCY7, ADCY8, ADCY9 또는 ADCY10일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 키트는 아데닐릴 사이클라제 중 어느 하나의 발현을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 키트는 ADCY6의 발현을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 키트는 아데닐릴 사이클라제 중 어느 하나의 발현을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 키트는 ADCY3의 발현을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 본원에 개시된 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있는 본원에 개시된 시스템을 포함한다. 키트는 시스템의 구성요소 중 적어도 하나를 포함하는 재료 또는 구성요소의 집합체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 키트는 모든 대조군 및 지침을 포함하여 본원에 개시된 방법을 수행하는 데 필요하고/하거나 충분한 모든 구성요소를 함유한다.
일부 예에서, 본원에 개시된 키트는 본원에 개시된 이식유전자 중 어느 하나의 유전자 활성을 조정하기 위한 본원에 개시된 시스템을 포함한다. 키트에 구성된 구성요소의 정확한 성질은 그 용도에 의해 좌우된다. 예를 들어, 일부 키트는 GPCR에 결합하거나 복합체를 형성하는 리간드의 GPCR 활성을 스크리닝하도록 구성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 특히 미지의 리간드를 스크리닝하기 위해 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 특히 리간드에 의해 자극된 또는 리간드의 부재 하의 GPCR 활성을 측정하기 위해 구성될 수 있다.
일부 경우에, 사용 설명서가 키트에 포함될 수 있다. 임의로, 키트는 또한 기타 유용한 구성요소, 예컨대 희석제, 완충제, 약학적으로 허용되는 담체, 주사기, 카테터, 어플리케이터, 피펫팅 또는 측정 도구, 밴딩용 재료 또는 기타 유용한 용품을 함유한다. 키트에 조립된 재료 또는 구성요소는 작동가능성 및 유용성을 보존하는 임의의 편리하고 적절한 방식으로 보관된 상태로 실무자에게 제공될 수 있다. 예를 들어 구성요소는 용해, 탈수 또는 동결건조된 형태일 수 있다; 실온, 냉장 또는 냉동 온도에서 제공될 수 있다. 구성요소는 전형적으로 적절한 패키징 재료에 포함되어 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "패키징 재료"는 조성물 등과 같은 키트의 내용물을 수용하는 데 사용되는 하나 이상의 물리적 구조를 의미한다. 패키징 재료는 바람직하게는 오염물 무함유 멸균 환경을 제공하도록 잘 알려진 방법에 의해 구성된다. 키트에서 사용되는 패키징 재료는 유전자 발현 검정 및 치료의 수행에서 관례적으로 사용되는 것들이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "패키지"는 개별 키트 구성요소를 수용할 수 있는 적합한 고체 매트릭스 또는 재료, 예컨대 유리, 플라스틱, 종이, 호일 등을 지칭한다. 따라서, 예를 들어, 패키지는 적합한 양의 약학적 조성물을 함유하기 위해 사용되는 유리 바이알 또는 사전 충전식 주사기일 수 있다. 패키징 재료는 키트 및 이의 구성요소의 내용물 및/또는 목적을 나타내는 외부 라벨을 갖는다.
시스템 및 방법의 바람직한 실시양태가 본원에 도시되고 개시되었지만, 이러한 실시양태가 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 시스템 및 방법은 본 명세서 내에 제공된 구체적 예에 의해 제한되지 않는 것으로 의도된다. 시스템 및 방법을 전술한 명세서를 참조하여 개시하였지만, 본원의 실시양태의 설명 및 예시는 제한적인 의미로 해석되지 않는다. 본 개시내용에서 벗어나지 않으면서 다양한 변형, 변경, 및 대체가 당업자에게 안출될 것이다. 게다가, 시스템 및 방법의 모든 양상은 다양한 조건 및 변수에 의존하는 본원에 기재된 구체적 서술, 구성 또는 상대적인 비율로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본원에 개시된 시스템 및 방법의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 개시내용을 실시하는 데 이용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 본원에 개시된 시스템 및 방법이 임의의 이러한 모든 대안, 수정, 변형 또는 등가물을 포함하는 것으로 고려된다. 하기 청구범위가 본원에 개시된 시스템 및 방법의 범위를 한정하고, 본원에 개시된 시스템 및 방법이 이러한 청구범위 및 그에 의해 커버되는 등가물의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
실시양태
실시양태 1. G 단백질 커플링된 수용체(GPCR) 활성을 측정하기 위한 시스템으로서, 상기 시스템이 GPCR 활성의 제1 이펙터로서, 상기 제1 이펙터의 발현이 야생형 상태의 제1 이펙터의 발현과 비교하여 상향조절되는 GPCR 활성의 제1 이펙터; 및 GPCR 활성의 제2 이펙터로서, 상기 제2 이펙터의 발현이 야생형 상태의 제2 이펙터의 발현과 비교하여 하향조절되는 GPCR 활성의 제2 이펙터를 포함하는 것인 시스템.
실시양태 2. 실시양태 1에 있어서, 제1 이펙터의 발현이 GPCR을 GPCR 활성화제와 접촉시킴으로써 상향조절되는 것인 시스템.
실시양태 3. 실시양태 2에 있어서, GPCR 활성화제가 GPCR 효능제인 시스템.
실시양태 4. 실시양태 2에 있어서, GPCR 활성화제가 제1 이펙터의 효능제인 시스템.
실시양태 5. 실시양태 1에 있어서, 시스템이 제1 이펙터의 발현을 상향조절하기 위한 조절 요소에 작동 가능하게 커플링된 GPCR 활성의 제1 이펙터를 코딩하는 제1 핵산을 포함하는 것인 시스템.
실시양태 6. 실시양태 1에 있어서, 제2 이펙터의 발현이 GPCR을 GPCR 억제제와 접촉시킴으로써 하향조절되는 것인 시스템.
실시양태 7. 실시양태 6에 있어서, GPCR 억제제가 GPCR 역 효능제인 시스템.
실시양태 8. 실시양태 6에 있어서, GPCR 억제제가 GPCR 길항제인 시스템.
실시양태 9. 실시양태 6에 있어서, GPCR 억제제가 제2 이펙터의 역 효능제인 시스템.
실시양태 10. 실시양태 6에 있어서, GPCR 억제제가 제2 이펙터의 길항제인 시스템.
실시양태 11. 실시양태 1에 있어서, 시스템이 제2 이펙터의 발현을 하향조절하는 제2 핵산을 포함하는 것인 시스템.
실시양태 12. 실시양태 1에 있어서, GPCR 활성이 Gi 알파 서브유닛 활성, Gs 알파 서브유닛 활성, Gq 알파 서브유닛 활성, 또는 G12/13 알파 서브유닛 활성을 포함하는 것인 시스템.
실시양태 13. 실시양태 12에 있어서, GPCR 활성이 Gi 알파 서브유닛 활성을 포함하는 것인 시스템.
실시양태 14. 실시양태 13에 있어서, Gi 알파 서브유닛 활성이 Gαi1, Gαi2, Gαi3, Gαo, Gαt, Gαg 또는 Gαz의 활성을 포함하는 것인 시스템.
실시양태 15. 실시양태 12에 있어서, GPCR 활성이 Gs 알파 서브유닛 활성을 포함하는 것인 시스템.
실시양태 16. 실시양태 12에 있어서, GPCR 활성이 Gq 알파 서브유닛 활성을 포함하는 것인 시스템.
실시양태 17. 실시양태 12에 있어서, GPCR 활성이 G12/13 알파 서브유닛 활성을 포함하는 것인 시스템.
실시양태 18. 실시양태 5에 있어서, 조절 요소가 유도성인 시스템.
실시양태 19. 실시양태 5에 있어서, 조절 요소가 구성적으로 활성인 시스템.
실시양태 20. 이전 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 제1 이펙터가 제1 아데닐릴 사이클라제를 포함하는 것인 시스템.
실시양태 21. 실시양태 20에 있어서, 제1 아데닐릴 사이클라제가 ADCY1, ADCY2, ADCY3, ADCY4, ADCY5, ADCY6, ADCY7, ADCY8, ADCY9, 및 ADCY10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 시스템.
실시양태 22. 실시양태 21에 있어서, 제1 아데닐릴 사이클라제가 ADCY6인 시스템.
실시양태 23. 이전 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 제2 이펙터가 제2 아데닐릴 사이클라제를 포함하는 것인 시스템.
실시양태 24. 실시양태 23에 있어서, 제2 아데닐릴 사이클라제가 ADCY1, ADCY2, ADCY3, ADCY4, ADCY5, ADCY6, ADCY7, ADCY8, ADCY9, 및 ADCY10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 시스템.
실시양태 25. 실시양태 24에 있어서, 제2 아데닐릴 사이클라제가 ADCY3인 시스템.
실시양태 26. 실시양태 12 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 제2 핵산이 마이크로RNA, shRNA, siRNA, gRNA 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 시스템.
실시양태 27. 실시양태 26에 있어서, 제2 핵산이 마이크로RNA를 포함하는 것인 시스템.
실시양태 28. 실시양태 26에 있어서, 제2 핵산이 gRNA를 포함하는 것인 시스템.
실시양태 29. 실시양태 28에 있어서, gRNA에 작동 가능하게 커플링된 CRISPR-Cas 시스템을 추가로 포함하는 시스템.
실시양태 30. 실시양태 1에 있어서, GPCR 활성이 사이클릭 AMP(cAMP) 활성을 포함하는 것인 시스템.
실시양태 31. 실시양태 1에 있어서, GPCR 활성이 cAMP 농도의 변화를 포함하는 것인 시스템.
실시양태 32. 실시양태 1에 있어서, GPCR 활성이 역 cAMP 활성을 포함하는 것인 시스템.
실시양태 33. 실시양태 20에 있어서, 시스템이 시스템을 포함하는 세포에서의 cAMP 활성을 시스템이 없는 세포에서의 cAMP 활성과 비교하여 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 50배, 또는 100배 증가시키는 것인 시스템.
실시양태 34. 실시양태 31에 있어서, 시스템이 시스템을 포함하는 세포에서의 cAMP 농도를 시스템이 없는 세포에서의 cAMP 농도와 비교하여 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 50배, 또는 100배 증가시키는 것인 시스템.
실시양태 35. 실시양태 32의 시스템에 있어서, 시스템이 시스템을 포함하는 세포에서의 역 cAMP 활성을 시스템이 없는 세포에서의 역 cAMP 활성과 비교하여 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 50배, 또는 100배 증가시키는 것인 시스템.
실시양태 36. 이전 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 시스템이 Gi 알파 서브유닛의 발현을 상향조절하기 위한 제2 조절 요소를 포함하는 것인 시스템.
실시양태 37. 이전 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 시스템이 적어도 하나의 추가 이펙터를 포함하는 것인 시스템.
실시양태 38. 실시양태 37에 있어서, 적어도 하나의 추가 이펙터가 아데닐릴 사이클라제인 시스템.
실시양태 39. 실시양태 37에 있어서, 시스템이 적어도 하나의 추가 이펙터의 발현을 상향조절하기 위한 제2 조절 요소를 추가로 포함하는 것인 시스템.
실시양태 40. 이전 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 시스템이 시스템을 포함하는 세포에서의 GPCR 활성과 배경 사이의 비율을 시스템이 없는 세포에서의 GPCR 활성과 배경 사이의 비율과 비교하여 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 50배, 또는 100배 증가시키는 것인 시스템.
실시양태 41. 실시양태 40에 있어서, 시스템이 시스템을 포함하는 세포에서의 GPCR 활성을 시스템이 없는 세포에서의 GPCR 활성과 비교하여 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 50배 또는 100배 증가시키는 것인 시스템.
실시양태 42. 실시양태 40에 있어서, 시스템이 시스템을 포함하는 세포에서의 배경을 시스템이 없는 세포에서의 배경과 비교하여 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 50배 또는 100배 감소시키는 것인 시스템.
실시양태 43. 이전 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 시스템이 리포터 핵산을 포함하고, 상기 리포터 핵산이 GPCR 활성에 비례하는 검출 가능한 신호를 생성하는 것인 시스템.
실시양태 44. 실시양태 43에 있어서, 리포터 핵산이 cAMP 반응 요소(CRE) 서열을 포함하는 것인 시스템.
실시양태 45. 실시양태 43에 있어서, 리포터 핵산이 고유 분자 식별자(UMI) 핵산 서열에 작동 가능하게 커플링되는 것인 시스템.
실시양태 46. 실시양태 43에 있어서, 검출 가능한 신호기 형광 신호를 포함하는 것인 시스템.
실시양태 47. 실시양태 43에 있어서, 검출 가능한 신호가 발광 신호를 포함하는 것인 시스템.
실시양태 48. 실시양태 5에 있어서, 제1 핵산이 제1 이펙터의 발현을 상향조절하기 위한 유전자 발현 카세트를 포함하는 것인 시스템.
실시양태 49. 실시양태 11에 있어서, 제2 핵산이 제2 이펙터의 발현을 하향조절하기 위한 유전자 발현 카세트를 포함하는 것인 시스템.
실시양태 50. 실시양태 1 내지 49 중 어느 하나의 시스템을 포함하는 세포.
실시양태 51. 실시양태 50에 있어서, 세포가 진핵 세포를 포함하는 것인 세포.
실시양태 52. 실시양태 50에 있어서, 세포가 포유동물 세포를 포함하는 것인 세포.
실시양태 53. 실시양태 50에 있어서, 포유동물 세포 유래 세포를 포함하는 세포.
실시양태 54. 실시양태 50에 있어서, 세포가 세포주로부터 유래된 것인 세포.
실시양태 55. 실시양태 50에 있어서, 세포가 CHO-K1 세포, COS-7 세포 및 U2OS 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 세포.
실시양태 56. 실시양태 50 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 시스템이 세포의 게놈 내로 통합되는 것인 세포.
실시양태 57. 실시양태 52 내지 57 중 어느 하나의 세포를 포함하는 세포 집단.
실시양태 58. 실시양태 57에 있어서, 세포 집단이 진핵 세포 집단을 포함하는 것인 세포 집단.
실시양태 59. 실시양태 57에 있어서, 세포 집단이 포유동물 세포 집단을 포함하는 것인 세포 집단.
실시양태 60. 실시양태 57에 있어서, 세포 집단이 포유동물 세포 유래 세포 집단을 포함하는 것인 세포 집단.
실시양태 61. 실시양태 55에 있어서, 세포 집단이 세포주로부터 유래된 세포 집단을 포함하는 세포 집단.
실시양태 62. 실시양태 55에 있어서, 세포 집단이 CHO-K1 세포, COS-7 세포 및 U2OS 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포의 집단을 포함하는 것인 세포 집단.
실시양태 63. 실시양태 50 내지 56 중 어느 하나의 세포 또는 실시양태 57 내지 62 중 어느 하나의 세포 집단에서 GPCR 활성을 측정하는 것을 포함하는, GPCR 활성을 측정하는 방법.
실시양태 64. 실시양태 63에 있어서, GPCR 활성이 기초 GPCR 활성인 방법.
실시양태 65. 실시양태 63에 있어서, 실시양태 50 내지 56 중 어느 하나의 세포 또는 실시양태 57 내지 62 중 어느 하나의 세포 집단이 GPCR 리간드와 접촉되지 않는 것인 방법.
실시양태 66. 세포에서 GPCR 활성을 측정하는 방법으로서, 상기 방법이 실시양태 50 내지 56 중 어느 하나의 세포 또는 실시양태 57 내지 62 중 어느 하나의 세포 집단을 GPCR 리간드와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 리간드가 GPCR과 복합체화되고 GPCR 활성을 개시하거나 억제하는 것인 방법.
실시양태 67. 실시양태 66에 있어서, GPCR 리간드가 실시양태 50 내지 56 중 어느 하나의 세포에서 발현되는 것인 방법.
실시양태 68. 실시양태 67에 있어서, GPCR 리간드가 폴리펩티드, 비펩티드 화합물 및 소분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
실시예
하기 예시적인 실시예는 본원에 개시된 자극, 시스템 및 방법의 실시양태를 대표하며 어떤 식으로든 제한하려는 의도가 아니다.
실시예 1. GPCR 활성 측정
도 2에 도시된 바와 같은 상이한 플라스미드로 형질감염된 세포로부터 GPCR 활성을 측정하였다. 도 2A에 개시된 플라스미드는 하향조절을 위한 내인성 아데닐릴 사이클라제 3(AC3) mRNA를 표적화하는 miRNA 어레이를 코딩하는 유전자 발현 카세트를 함유하였다. 상기 카세트는 또한 아데닐 사이클라제 6(AC6) 단백질의 생산을 코딩하는 외인성 서열을 함유하였다. 이들 두 요소 모두는 동일한 큐메이트 제어된 프로모터의 제어 하에 있다. 상기 핵산은 또한 항생제 블라스티시딘에 대한 내성을 제공하는 유전자의 생산을 코딩하는 제2 카세트를 함유하였다. 플라스미드를 bxbi 인테그라제와 발현 카세트를 포함하는 제2 플라스미드와 함께 동시 형질감염시킴으로써 HEK 293 세포주에 안정하게 통합시켰다. 세포주 및 플라스미드는 단일 카피에서 게놈 내의 특정 위치에 플라스미드를 통합시킬 수 있도록 하는 bxbi 통합 서열을 함유하였다. 세포주는 또한 큐메이트 제어된 프로모터의 큐메이트 유도성 발현을 가능하게 하는 큐메이트 억제인자 단백질의 생산을 코딩하는 발현 카세트 및 독시사이클린 유도성 발현을 허용하는 역-테트라사이클린-트랜스활성화인자(rTTA) 단백질을 함유하였다. 성공적인 통합은 블라스티시딘 보충된 배지에서 세포를 계대배양하여 선택하였다.
도 2B에 개시된 플라스미드는 dCas9-BFP-KRAB 융합 단백질을 코딩하는 유전자 발현 카세트 및 AC3을 표적화하는 3개의 상이한 RNA 가이드(gRNA)를 코딩하는 다수의 발현 카세트를 함유하였다. 하향조절은 gRNA에 의해 dCas9-BFP-KRAB를 원래의 AC3 게놈 유전자좌로 표적화함으로써 달성하였다. 플라스미드는 또한 하이그로마이신 내성 및 슬리핑 뷰티 트랜스포존(sleeping beauty transposon) 통합 서열을 코딩하는 유전자 발현 카세트를 함유하였다. 각각 AC3에 대한 3개의 가이드(총 5개의 고유 가이드)를 포함하는 2개의 상이한 플라스미드를 슬리핑 뷰티 트랜스포사제의 발현을 코딩하는 플라스미드와 함께 공동 형질감염시켜 상술한 bxbi 통합된 세포주에 안정하게 통합시켰다. 성공적인 통합은 하이그로마이신 보충된 배지에서 세포를 계대배양하여 선택하였다.
도 2C에 개시된 플라스미드는 AC6 단백질의 생산을 코딩하는 큐메이트 제어된 프로모터 하에 유전자 발현 카세트를 함유하였다. 상기 플라스미드는 또한 큐메이트 제어된 프로모터의 큐메이트 유도성 발현을 가능하게 하는 큐메이트 억제인자 단백질의 생산을 코딩하는 제2 유전자 발현 카세트 및 퓨로마이신 내성 유전자를 함유하였다. 상기 플라스미드는 또한 piggybac 트랜스포존 통합 서열을 함유하였다. 상기 플라스미드를 piggybac 트랜스포사제의 발현을 코딩하는 플라스미드와 함께 공동 형질감염시켜 상술한 HEK 293 세포주에 안정하게 통합시켰다. 성공적인 통합은 퓨로마이신 보충된 배지에서 세포를 계대배양하여 선택하였다. 도 2의 플라스미드의 핵산 서열은 서열번호 1 내지 4에서 찾을 수 있다.
2세대 유전자 발현 카세트(도 2A)로 형질감염된 세포를 도파민 및 0.5 μM 포르스콜린(Fsk)과 접촉시켰다(도 3). 도 3에 도시된 바와 같이, ADRA2A, ADRA2C, DRD2, DRD3, DRD4 및 HTR1F의 수용체에 각각 결합하는 아드레날린, 아드레날린, 도파민, 도파민, 도파민 및 세로토닌과 관련된 GPCR 활성은 MADSv2.5 핵산으로 형질감염된 세포에서 증가하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 1세대 유전자 발현 카세트(도 2C)를 포함하는 세포에 의해 생성된 루시페라제 측정치는 단지 AC6 과발현(AC6-OE)과 함께 증가된 역 CRE 활성을 보여준다. 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 3세대 유전자 발현 카세트를 포함하는 세포로부터 생성된 플랫폼 데이터(도 2B, AC3 녹다운 포함, ADCY3-KD)는 2세대 유전자 발현 카세트를 포함하는 세포로부터 생성된 플랫폼 데이터보다 개선되었음을 보여주며, 여기서 ADCY3 녹다운은 측정된 활성의 감소를 유도하였다.
전술한 개시내용은 명확성과 이해를 목적으로 어느 정도 상세하게 개시되었지만, 본 개시 내용을 읽음으로써 당업자에게는 형식 및 세부 사항의 다양한 변경이 본 개시내용의 진정한 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있음이 명백할 것이다. 예를 들어, 상술한 모든 기술 및 장치는 다양한 조합으로 사용될 수 있다. 본 출원에서 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및/또는 기타 문서는 각각의 개별 간행물, 특허, 특허 출원 및/또는 기타 문서가 모든 목적을 위해 참조로 포함되도록 개별적이고 독립적으로 표시된다. 참조로 포함된 텍스트에 포함된 정의는 이들이 본 개시내용의 정의와 모순되는 한 제외된다.
SEQUENCE LISTING <110> OCTANT, INC. <120> SYSTEMS AND METHODS FOR MEASURING ENZYMATIC ACTIVITIES <130> 52652-708.601 <140> <141> <150> 63/144,766 <151> 2021-02-02 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11087 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1 aatctaacgt taataaaata tctttatttt cattacatct gtgtgttggt tttttgtgtg 60 aatcgatagt actaacatac gctctccatc aaaacaaaac gaaacaaaac aaactagcaa 120 aataggctgt ccccagtgca agtgcaggtg ccagaacatt tctcttaaga gactagttat 180 taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca 240 taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca 300 ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg 360 gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg 420 ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc 480 ttacgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg 540 atgcggtttt ggcagtacac caatgggcgt 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 3 gtttaagagc tatgctggaa acagcatagc aagtttaaat aaggctagtc cgttatcaac 60 ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttcgaattta aatcggatcc gcggccgcaa 120 tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc 180 ttttacgcta tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat catgcgttaa ctaaacttgt 240 ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag 300 catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg 360 tctgtaagag gttccaactt tcaccataat gaaataagat cactaccggg cgtatttttt 420 gagttatcga gattttcagg agctaaggaa gctaaaatga gtattcaaca tttccgtgtc 480 gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg 540 gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat 600 ctcaacagcg gtaagatcct tgagagttta cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc 660 acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa 720 ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg aatactcacc agtcacagaa 780 aagcatctca cggatggcat gacagtaaga 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acttcggcag caacaacgtc ctgaccgaca 8400 acggccgcat caccgccgta atcgactggt ccgaagctat gttcggggac agtcagtacg 8460 aggtggccaa catcttcttc tggcggccct ggctggcttg catggagcag cagactcgct 8520 acttcgagcg ccggcatccc gagctggccg gcagccctcg tctgcgagcc tacatgctgc 8580 gcatcggcct ggatcagctc taccagagcc tcgtggacgg caacttcgac gatgctgcct 8640 gggctcaagg ccgctgcgat gccatcgtcc gcagcggggc cggcaccgtc ggtcgcacac 8700 aaatcgctcg ccggagcgca gccgtatgga ccgacggctg cgtcgaggtg ctggccgaca 8760 gcggcaaccg ccggcccagt acacgaccgc gcgctaagga ggtaggtcga gtttaaggcc 8820 cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga 8880 ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt 8940 gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg 9000 attgggagga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggct gaaaactatt 9060 ccggaatggg aatccagggg taggagatgc tttggctcta gatgcaagac atgaagcgtt 9120 tgcttctggc caccaggggg agctgctggg acgcagacgg actccaagga ctggagccag 9180 aagcctggtg ttggtcgagt gtatgtaaac ttctgaccca ctgggaatgt gatgaaagaa 9240 ataaaagctg aaatgaatca ttctctctac tattattctg atatttcaca ttcttaaaat 9300 aaagtggtga tcctaactga cctaagacag ggaattttta ctaggattaa atgtcaggaa 9360 ttgtgaaaaa gtgagtttaa atgtatttgg ctaaggtgta tgtaaacttc cgacttcaac 9420 tgtatagaat aagagacaac gcacctagct atgctgaaag cgagaatccg ggaaggtctg 9480 tacgggcttc tgttatggtg tcaacactac gagaagaaaa tcgatcggaa ttgtcgaatg 9540 aagggaataa tgtcgaggca cagacttcaa cagcaagaaa ggttctgaat tttttcaaaa 9600 gaaggagcat gagggtttga tacagttgaa gtcggaagtt tacatacact taagttggag 9660 tcattaaaac tcgtttttca actactccac aaatttcttg ttaacaaaca atagttttgg 9720 caagtcagtt aggacatcta ctttgtgcat gacacaagtc atttttccaa caattgttta 9780 cagacagatt atttcactta taattcactg tatcacaatt ccagtgggtc agaagtttac 9840 atacactaag ttgactgaaa aaaaaaaaga aaaagaaaac acctactttc ctctccatgg 9900 aaacagcatg ccagaaaatt ttgtggaccc ttgaaatgag cacacatctc acttgcaaaa 9960 gcacagcacc agcgccctct gctgtttcct ggtttgattt agaactcaga gaagctacag 10020 tactttctag actaaaatac catgtagagt tcaggataat tatattctag attagacata 10080 ggcatctaga gctagcggag ggcctatttc ccatgattcc ttcatatttg catatacgat 10140 acaaggctgt tagagagata attagaatta atttgactgt aaacacaaag atattagtac 10200 aaaatacgtg acgtagaaag taataatttc ttgggtagtt tgcagtttta aaattatgtt 10260 ttaaaatgga ctatcatatg cttaccgtaa cttgaaagta tttcgatttc ttggctttat 10320 atatcttgtg gaaaggacga aaggagccag ccgagtccgg gctgtttaag agctatgctg 10380 gaaacagcat agcaagttta aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg 10440 agtcggtgct tttttgaacg ctgacgtcat caacccgctc caaggaatcg cgggcccagt 10500 gtcactaggc gggaacaccc agcgcgcgtg cgccctggca ggaagatggc tgtgagggac 10560 aggggagtgg cgccctgcaa tatttgcatg tcgctatgtg ttctgggaaa tcaccataaa 10620 cgtgaaatgt ctttggattt gggaatctta taagttctgt atgagaccac tctttcccag 10680 cgagggctgg gagatccgtg tttaagagct atgctggaaa cagcatagca agtttaaata 10740 aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt ttctagagat 10800 ccgacgccgc catctctagg cccgcgccgg ccccctcgca cagacttgtg ggagaagctc 10860 ggctactccc ctgccccggt taatttgcat ataatatttc ctagtaacta tagaggctta 10920 atgtgcgata aaagacagat aatctgttct ttttaatact agctacattt tacatgatag 10980 gcttggattt ctataagaga tacaaatact aaattattat tttaaaaaac agcacaaaag 11040 gaaactcacc ctaactgtaa agtaattgtg tgttttgaga ctataaatat gcatgcgaga 11100 aaagccttgt ttgggccctg gggctgaggc tcag 11134 <210> 4 <211> 9557 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 4 ttaaccctag aaagataatc atattgtgac gtacgttaaa gataatcatg tgtaaaattg 60 acgcatgtga ctgaaaaaaa aaaagaaaaa gaaaacacct actttcctct ccatggaaac 120 agcatgccag aaaattttgt ggacccttga aatgagcaca catctcactt gcaaaagcac 180 agcaccagcg ccctctgctg tttcctggtt tgatttagaa ctcagagaag ctacagtact 240 ttctagacta aaataccatg tagagttcag gataattata ttctagatta gacataggca 300 agactagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt 360 tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc 420 cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac 480 gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata 540 tgccaagtcc gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc 600 agtacatgac cttacgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta 660 ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca ccaatgggcg tggatagcgg tttgactcac 720 ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc 780 aacgggactt tccaaaatgt cgtaataccc ccgccccgtt gacgcaaatg ggcaagcttg 840 ccgggtcgag gtaggcgtgt acggtgggag gcctatataa gcaaccggta taatcaaaca 900 gaccagattg tctgtttgtt accggtgttt agtgaaccgg gcgcgcctca tatcgcctgg 960 agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagacacc gggaccgatc cagcctccgc 1020 ggtcactctc ttccgcatcg ctgtctgcga gggccagctg ttgggctcgc ggttgaggac 1080 aaactcttcg cggtctttcc agtactcttg gatcggaaac ccgtcggcct ccgaacggta 1140 ctccgccacc gagggacctg agcgagtccg catcgaccgg atcggaaaac ctctcgagaa 1200 aggcgtctaa ccagtcacag tcgcaaggta ggctgagcac cgtggcgggc ggcagcgggt 1260 ggcggtcggg gttgtttctg gcggaggtgc tgctgatgat gtaattaaag taggcggtct 1320 tgagacggcg gatggtcgag gtgaggtgtg gcaggcttga gatccagctg ttggggtgag 1380 tactccctct caaaagcggg cattacttct gcgctaagat tgtcagtttc caaaaacgag 1440 gaggatttga tattcacctg gcccgatctg gccatacact tgagtgacaa tgacatccac 1500 tttgcctttc tctccacagg tgtccactcc caggtccaag tttggtctag acacttgaca 1560 gccaccatgt catggtttag tggactcctg gtccctaaag tggatgaacg gaaaacagcc 1620 tggggtgaac gaaatggaca gaagcgttcg agaaggcgtg gcactagggc aggtggattc 1680 tgcacgcctc gctatatgag ctgcctcaga gatgcagagc cacccagccc aacccctgct 1740 ggaccaccta gatgcccttg gcaggatgac gccttcatca gaaggggagg accaggtaag 1800 ggtaaggagt tgggtctgag agcagtggct ctgggtttcg aggataccga ggtgacaacg 1860 acagcaggag gtacggctga ggtggcacct gacgcagtgc ccaggagtgg gcgatcctgc 1920 tggagacgtc tggtgcaggt gttccagtcg aagcagttcc gttcggccaa gctggagcgc 1980 ctgtaccagc ggtacttctt ccagatgaac cagagcagcc tgacgctgct gatggcggtg 2040 ctggtgctgc tcacagcggt gctgctggct ttccacgctg cacctgctcg ccctcagcct 2100 gcttatgtgg cactgttggc ctgtgcagca gcactgttcg tgggactcat ggtggtgtgt 2160 aacagacata gcttcagaca ggactccatg tgggtggtga gctacgtggt gctgggcatc 2220 ctggcagcag tgcaggtcgg aggagcactc gcagcagacc ctcgcagccc ctctgcggga 2280 ctctggtgcc ctgtgttctt tgtctacatc gcctacacgc tcctccccat ccgcatgaga 2340 gctgccgtcc tcagcggact gggactctcc accttgcatt tgatcttggc ctggcaactt 2400 aaccgtggtg atgccttcct ctggaagcag ctcggtgcca atgtgctgct gttcctctgc 2460 accaacgtca ttggcatctg cacacactat ccagcagagg tgtctcagcg ccaggccttt 2520 caggagaccc gcggttacat ccaggcccgg ctccacctgc agcatgagaa tcggcagcag 2580 gagcggctgc tgctgtcggt attgccccag cacgttgcca tggagatgaa agaagacatc 2640 aacacaaaaa aagaagacat gatgttccac aagatctaca tacagaagca tgacaatgtc 2700 agcatcctgt ttgcagacat tgagggcttc accagcctgg catcccagtg cactgcgcag 2760 gagctggtca tgaccctgaa tgagctgttt gcccggtttg acaagctggc tgcggagaat 2820 cactgcctga ggatcaagat cttgggggac tgttactact gtgtgtcagg gctgccggag 2880 gcccgggccg accatgccca ctgctgtgtg gagatggggg tagacatgat tgaggccatc 2940 tcgctggtac gtgaggtgac aggtgtgaat gtgaacatgc gcgtgggcat ccacagcggg 3000 cgcgtgcact gcggcgtcct tggcttgcgg aaatggcagt tcgatgtgtg gtccaatgat 3060 gtgaccctgg ccaaccacat ggaggcagga ggccgggctg gccgcatcca catcactcgg 3120 gcaacactgc agtacctgaa cggggactac gaggtggagc caggccgtgg tggcgagcgc 3180 aatgcgtacc tcaaggagca gcacattgag actttcctca tcctgggcgc cagccagaaa 3240 cggaaagagg agaaggccat gctggccaag ctgcagcgga ctcgggccaa ctccatggaa 3300 gggctgatgc cgcgctgggt tcctgatcgt gccttctccc ggaccaagga ctccaaggcc 3360 ttccgccaga tgggcattga tgattccagc aaagacaacc ggggcaccca agatgccctg 3420 aaccctgagg atgaggtgga tgagttcctg agccgtgcca tcgacgcccg cagcattgat 3480 cagctgcgga aggaccatgt gcgccggttt ctgctcacct tccagagaga ggatcttgag 3540 aagaagtact cccggaaggt cgatccccgc ttcggagcct acgttgcctg tgccctgttg 3600 gtcttctgct tcatctgctt catccagctt ctcatcttcc cacactccac cctgatgctt 3660 gggatctatg ccagcatctt cctgctgctg ctaatcaccg tgctgatctg tgctgtgtac 3720 tcctgtggtt ctctgttccc taaggccctg caacgtctgt cccgcagcat tgtccgctca 3780 cgggcacata gcaccgcagt tggcatcttt tccgtcctgc ttgtgtttac ttctgccatt 3840 gccaacatgt tcacctgtaa ccacaccccc atacggagct gtgcagcccg gatgctgaat 3900 ttaacacctg ctgacatcac tgcctgccac ctgcagcagc tcaattactc tctgggcctg 3960 gatgctcccc tgtgtgaggg caccatgccc acctgcagct ttcctgagta cttcatcggg 4020 aacatgctgc tgagtctctt ggccagctct gtcttcctgc acatcagcag catcgggaag 4080 ttggccatga tctttgtctt ggggctcatc tatttggtgc tgcttctgct gggtccccca 4140 gccaccatct ttgacaacta tgacctactg cttggcgtcc atggcttggc ttcttccaat 4200 gagacctttg atgggctgga ctgtccagct gcagggaggg tggccctcaa atatatgacc 4260 cctgtgattc tgctggtgtt tgcgctggcg ctgtatctgc atgctcagca ggtggagagc 4320 actgcccgcc tagacttcct ctggaaacta caggcaacag gggagaagga ggagatggag 4380 gagctacagg catacaaccg gaggctgctg cataacattc tgcccaagga cgtggcggcc 4440 cacttcctgg cccgggagcg ccgcaatgat gaactctact atcagtcgtg tgagtgtgtg 4500 gctgttatgt ttgcctccat tgccaacttc tctgagttct atgtggagct ggaggcaaac 4560 aatgagggtg tcgagtgcct gcggctgctc aacgagatca tcgctgactt tgatgagatt 4620 atcagcgagg agcggttccg gcagctggaa aagatcaaga cgattggtag cacctacatg 4680 gctgcctcag ggctgaacgc cagcacctac gatcaggtgg gccgctccca catcactgcc 4740 ctggctgact acgccatgcg gctcatggag cagatgaagc acatcaatga gcactccttc 4800 aacaatttcc agatgaagat tgggctgaac atgggcccag tcgtggcagg tgtcatcggg 4860 gctcggaagc cacagtatga catctggggg aacacagtga atgtctctag tcgtatggac 4920 agcacggggg tccccgaccg aatccaggtg accacggacc tgtaccaggt tctagctgcc 4980 aagggctacc agctggagtg tcgaggggtg gtcaaggtga agggcaaggg ggagatgacc 5040 acctacttcc tcaatggggg ccccagcagt taagaatcaa cctctggatt acaaaatttg 5100 tgaaagattg actggtattc ttaactatgt tgctcctttt acgctatgtg gatacgctgc 5160 tttaatgcct ttgtatcatg cgttaactaa acttgtttat tgcagcttat aatggttaca 5220 aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt 5280 gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg taagaggttc caactttcac 5340 cataatgaaa taagatcact accgggcgta ttttttgagt tatcgagatt ttcaggagct 5400 aaggaagcta aaatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca 5460 ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat 5520 cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag 5580 agtttacgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc 5640 gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct 5700 cagaatgact tggttgaata ctcaccagtc acagaaaagc atctcacgga tggcatgaca 5760 gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt 5820 ctggcaacca tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat 5880 gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt 5940 gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta 6000 cttactctag cttcccggca acaactgata gactggatgg aggcggataa agttgcagga 6060 tcacttctgc gctcggccct cccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt 6120 gagcgtggct ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgcatc 6180 gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct 6240 gagataggtg cctcactgat taagcattgg taatgagggc cctgaggacc taaatgtaat 6300 cacctggctc accttcgggt gggcctttct gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 6360 ccccctgacg 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catctctcct tcacgcgccc gccgccctac ctgaggccgc catccacgcc 7260 ggttgagtcg cgttctgccg cctcccgcct gtggtgcctc ctgaactgcg tccgccgtct 7320 aggtaagttt aaagctcagg tcgtgaccgg gcctttgtcc ggcgctccct tggagcctac 7380 ctagactcag ccggctctcc acgctttgcc tgaccctgct tgctcaactc tacgtctttg 7440 tttcgttttc tgttctgcgc cgttacagat ccaagctgtg accggcgcct acgctagacg 7500 ccaccatggc ttacccatac gatgttccag attacgctag tttggtgagg cagcagagac 7560 cgatgacatc cactttgcct ttctctccac aggtgtccac tcccaggtcc aagtttggaa 7620 gatctaccat gccaaagaga cccagacccg tgatcatgag tccaaagaga agaacacagg 7680 cagagcgcgc aatggagacc cagggcaagt tgattgcagc ggccctgggg gttttacggg 7740 aaaaaggtta cgcgggattc cggatcgcag atgtgcccgg tgctgcaggt gtctcgagag 7800 gagcgcagag ccatcatttc ccgacaaagc ttgagcttct gcttgccact tttgaatggc 7860 tttacgaaca gatcaccgaa cgcagtcggg ctcgattagc gaaattgaag ccagaggatg 7920 acgtcatcca gcaaatgctg gacgacgccg ccgaattttt cctcgacgat gacttctcta 7980 tcagccttga tttgattgtg gctgccgacc gggatccagc gttacgcgag ggtattcagc 8040 gcacggtaga gaggaatcgg tttgtcgtcg aggatatgtg gcttggtgtt ctggtgagcc 8100 gtggtctttc gcgtgatgat gcagaagata tcctttggtt gatattcaat tcggtgcgtg 8160 ggcttgctgt tcgtagccta tggcagaagg acaaagaacg ctttgagcgt gtcaggaact 8220 cgacactcga aattgcgcga gagcggtacg cgaaattcaa gcgcgcggcc aaaccctctg 8280 gcgcggccgc ggagggcaga ggaagtcttc taacatgcgg tgacgtggag gagaatcccg 8340 gccctatgac cgagtacaag cccacggtgc gcctcgccac ccgcgacgac gtccccaggg 8400 ccgtacgcac cctcgccgcc gcgttcgccg actaccccgc cacgcgccac accgtcgatc 8460 cggaccgcca catcgagcgg gtcaccgagc tgcaagaact cttcctcacg cgcgtcgggc 8520 tcgacatcgg caaggtgtgg gtcgcggacg acggcgccgc ggtggcggtc tggaccacgc 8580 cggagagcgt cgaagcgggg gcggtgttcg ccgagatcgg cccgcgcatg gccgagttga 8640 gcggttcccg gctggccgcg cagcaacaga tggaaggcct cctggcgccg caccggccca 8700 aggagcccgc gtggttcctg gccaccgtcg gcgtgtcgcc cgaccaccag ggcaagggtc 8760 tgggcagcgc cgtcgtgctc cccggagtgg aggcggccga gcgcgccggg gtgcccgcct 8820 tcctggaaac ctccgcgccc cgcaacctcc ccttctacga gcggctcggc ttcaccgtca 8880 ccgccgacgt cgaggtgccc gaaggaccgc gcacctggtg catgacccgc aagcccggtg 8940 cctgaggccc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc 9000 cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg 9060 catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca 9120 agggggagga ttgggaggac aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc tctatggctg 9180 aaaactattc cggaatggga atccaggggt aggagatgct ttggctctag atgcaagaca 9240 tgaagcgttt gcttctggcc accaggggga gctgctggga cgcagacgga ctccaaggac 9300 tggagccaga agcctggtgt tgcatgcgtc aattttacgc agactatctt tctagggtta 9360 atagaataag agacaacgca cctagctatg ctgaaagcga gaatccggga aggtctgtac 9420 gggcttctgt tatggtgtca acactacgag aagaaaatcg atcggaattg tcgaatgaag 9480 ggaataatgt cgaggcacag acttcaacag caagaaaggt tctgaatttt ttcaaaagaa 9540 ggagcatgag ggtttga 9557

Claims (23)

  1. 포유동물 세포에서 G 단백질 커플링된 수용체(G protein-coupled receptor: GPCR) 활성을 측정하기 위한 시스템으로서,
    a) GPCR 활성의 제1 이펙터로서, 상기 GPCR 활성의 제1 이펙터의 발현이 야생형 상태의 GPCR 활성의 제1 이펙터의 발현과 비교하여 상향조절되는 GPCR 활성의 제1 이펙터; 및
    b) GPCR 활성의 제2 이펙터로서, 상기 GPCR 활성의 제2 이펙터의 발현이 야생형 상태의 GPCR 활성의 제2 이펙터의 발현과 비교하여 하향조절되는 GPCR 활성의 제2 이펙터를 포함하는 것인 시스템.
  2. 제1항에 있어서, GPCR 활성이 Gi 알파 서브유닛 활성, Gs 알파 서브유닛 활성, Gq 알파 서브유닛 활성 또는 G12/13 알파 서브유닛 활성을 포함하는 것인 시스템.
  3. 제2항에 있어서, GPCR 활성이 Gi 알파 서브유닛 활성을 포함하는 것인 시스템.
  4. 제3항에 있어서, Gi 알파 서브유닛 활성이 Gαi1, Gαi2, Gαi3, Gαo, Gαt, Gαg 또는 Gαz의 활성을 포함하는 것인 시스템.
  5. 제4항에 있어서, GPCR 활성이 Gs 알파 서브유닛 활성을 포함하는 것인 시스템.
  6. 제4항에 있어서, GPCR 활성이 Gq 알파 서브유닛 활성을 포함하는 것인 시스템.
  7. 제4항에 있어서, GPCR 활성이 G12/13 알파 서브유닛 활성을 포함하는 것인 시스템.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, GPCR 활성의 제1 이펙터가 제1 아데닐릴 사이클라제를 포함하는 것인 시스템.
  9. 제8항에 있어서, 제1 아데닐릴 사이클라제가 ADCY1, ADCY2, ADCY3, ADCY4, ADCY5, ADCY6, ADCY7, ADCY8, ADCY9 및 ADCY10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 시스템.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 제1 아데닐릴 사이클라제가 ADCY6인 시스템.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 아데닐릴 사이클라제가 야생형 상태와 비교하여 제1 아데닐릴 사이클라제를 과발현하는 프로모터 또는 인핸서에 작동 가능하게 커플링된 핵산에 의해 코딩되는 것인 시스템.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, GPCR 활성의 제2 이펙터가 제2 아데닐릴 사이클라제를 포함하는 것인 시스템.
  13. 제12항에 있어서, 제2 아데닐릴 사이클라제가 ADCY1, ADCY2, ADCY3, ADCY4, ADCY5, ADCY6, ADCY7, ADCY8, ADCY9 및 ADCY10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 시스템.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 제2 아데닐릴 사이클라제가 ADCY3인 시스템.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 아데닐릴 사이클라제가 야생형 상태와 비교하여 제2 아데닐릴 사이클라제의 발현을 감소시키는 마이크로RNA, shRNA, siRNA 또는 CRISPR/Cas9 복합체 중 하나 이상에 의해 표적화되는 것인 시스템.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 시스템이 리포터 핵산을 포함하고, 상기 리포터 핵산이 GPCR 활성에 비례하는 리포터 유전자로부터의 검출 가능한 신호를 생성하는 것인 시스템.
  17. 제16항에 있어서, 리포터 핵산이 리포터 유전자에 작동 가능하게 커플링된 cAMP 반응 요소(CRE) 서열을 포함하는 것인 시스템.
  18. 제1항 또는 제17항에 있어서, 리포터 유전자가 고유 분자 식별자(unique molecular identifier: UMI) 핵산 서열을 포함하는 것인 시스템.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 리포터 유전자가 고유 분자 식별자의 발현, 형광 신호 또는 발광 신호 중 하나 이상을 포함하는 것인 시스템.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 세포가 HEK 293 세포, CHO-K1 세포, COS-7 세포 및 U2OS 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 시스템.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 시스템이 포유동물 세포의 게놈 내로 통합되는 것인 시스템.
  22. 포유동물 세포에서 GPCR 활성을 측정하는 방법으로서, 상기 방법이 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 시스템을 GPCR 리간드와 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 리간드가 GPCR과 복합체를 형성하고 GPCR 활성을 개시하거나 억제하는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, GPCR 리간드가 폴리펩티드 및 소분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
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