JP2024505559A - 細胞シグナル伝達タンパク質活性を測定するための系および方法 - Google Patents

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クーパー，アーロン
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Abstract

【解決手段】本明細書には、酵素活性を測定するための系が記載される。本明細書にはまた、本明細書に記載の系を利用して酵素活性を測定またはスクリーニングするための方法が記載される。【選択図】図１

Description

相互参照
本出願は、２０２１年２月２日出願の米国仮特許出願第６３／１４４，７６６号の利益を主張し、当該出願の全体は、引用によって本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照により全体として本明細書に組み込まれる配列表を含んでいる。２０２１年１月２４日に作成された上記ＡＳＣＩＩのコピーは、５２６５２－７０８＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔのファイル名であり、５６，８１４バイトのサイズである。
細胞シグナル伝達経路の応答を測定することは、現代医学の基礎の１つである。細胞シグナル伝達経路の応答は、細胞の生来の活性に由来する場合がある。細胞シグナル伝達経路の応答は、細胞を、細胞の表面に発現した受容体に結合するリガンドと接触させるなどして、外因性源によって刺激することができる。リガンドと細胞表面受容体との間で接触させることによって、細胞内にシグナル伝達カスケードを含む酵素活性の変化を開始させ、細胞シグナル伝達経路の応答の変化につなげる。したがって、酵素活性を測定またはスクリーニングすることで、細胞表面受容体に接触したリガンドによって開始された細胞シグナル伝達経路の応答の変化を捉えることができる。
本明細書には、細胞シグナル伝達経路の応答の照合および測定、細胞シグナル伝達経路のアンタゴニスト、インバースアゴニスト、またはアゴニストのスクリーニング、あるいは新規の細胞シグナル伝達経路の発見のための系および方法が記載される。現在の方法は、レポーター分子をコードする核酸の近位にある内因性応答エレメント調節プロモーターを利用している。これらの方法は、細胞の内因性応答エレメント結合プロモーターの「漏出性」の性質により、レポーター分子のバックグラウンドシグナルの度合いが高いという欠点がある。また、これらの方法は、細胞シグナル伝達経路において測定可能な活性の変動係数、偽陽性、または偽陰性が高いという欠点がある。最後に、このような方法は、レポーター活性化の絶対値が低く、結果として、バックグラウンドに対して測定可能な細胞シグナル伝達の活性の比が低いという欠点がある。
一態様において、本明細書に記載の系および方法は、細胞シグナル伝達経路の調節エレメントおよび／またはエフェクターをコードする少なくとも１つの核酸を含む。場合によっては、調節エレメントは、エフェクターの発現を上方制御または下方制御する。場合によっては、調節エレメントは、外因性エフェクターの発現を上方制御または下方制御する。場合によっては、調節エレメントは、内因性エフェクターの発現を上方制御または下方制御する。エフェクターの発現を調整することによって、系および方法は、測定可能な細胞シグナル伝達経路の応答を増加させ、バックグラウンドに対する測定可能な細胞シグナル伝達経路の応答の割合を増加させ、測定可能な細胞シグナル伝達経路の変動係数、偽陽性、または偽陰性を減少させる。
本明細書には、いくつかの態様において、哺乳動物細胞におけるＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）活性を測定するための系が記載され、該系は、発現が野生型の状態でのＧＰＣＲ活性の第１のエフェクターの発現と比較して上方制御される、ＧＰＣＲ活性の第１のエフェクターと、発現が野生型の状態でのＧＰＣＲ活性の第２のエフェクターの発現と比較して下方制御される、ＧＰＣＲ活性の第２のエフェクターとを含む。いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲ活性は、Ｇｉαサブユニット活性、Ｇｓαサブユニット活性、Ｇｑαサブユニット活性、またはＧ１２／１３αサブユニット活性を含む。いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲ活性は、Ｇｉαサブユニット活性を含む。いくつかの実施形態では、Ｇｉαサブユニット活性は、Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｏ、Ｇαｔ、Ｇαｇ、またはＧαｚの活性を含む。いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲ活性は、Ｇｓαサブユニット活性を含む。いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲ活性は、Ｇｑαサブユニット活性を含む。いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲ活性は、Ｇ１２／１３αサブユニット活性を含む。いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲ活性の第１のエフェクターは、第１のアデニリルシクラーゼを含む。いくつかの実施形態では、第１のアデニリルシクラーゼは、ＡＤＣＹ１、ＡＤＣＹ２、ＡＤＣＹ３、ＡＤＣＹ４、ＡＤＣＹ５、ＡＤＣＹ６、ＡＤＣＹ７、ＡＤＣＹ８、ＡＤＣＹ９、およびＡＤＣＹ１０からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、第１のアデニリルシクラーゼは、ＡＤＣＹ６である。いくつかの実施形態では、第１のアデニリルシクラーゼは、野生型の状態と比較して第１のアデニリルシクラーゼを過剰発現するプロモーターまたはエンハンサーに作動可能に連結された核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲ活性の第２のエフェクターは、第２のアデニリルシクラーゼを含む。いくつかの実施形態では、第２のアデニリルシクラーゼは、ＡＤＣＹ１、ＡＤＣＹ２、ＡＤＣＹ３、ＡＤＣＹ４、ＡＤＣＹ５、ＡＤＣＹ６、ＡＤＣＹ７、ＡＤＣＹ８、ＡＤＣＹ９、およびＡＤＣＹ１０からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、第２のアデニリルシクラーゼは、ＡＤＣＹ３である。いくつかの実施形態では、第２のアデニリルシクラーゼは、野生型の状態と比較して第２のアデニリルシクラーゼの発現を減少させるマイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体のうちの１つまたは複数によって標的化される。いくつかの実施形態では、系は、レポーター核酸を含み、レポーター核酸は、レポーター遺伝子から、ＧＰＣＲ活性に比例した検出可能なシグナルを生成する。いくつかの実施形態では、レポーター核酸は、レポーター遺伝子に作動可能に連結されたｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）配列を含む。いくつかの実施形態では、レポーター遺伝子は、固有の分子識別子（ＵＭＩ）核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、レポーター遺伝子は、固有の分子識別子、蛍光シグナル、発光シグナルの発現のうちの１つまたは複数を含む。いくつかの態様では、哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＯＳ－７細胞、およびＵ２ＯＳ細胞からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、系は、哺乳動物細胞のゲノムに組み込まれる。
本明細書において、いくつかの態様では、細胞におけるＧＰＣＲ活性を測定するための方法が記載され、該方法は、本明細書に記載の系とＧＰＣＲリガンドを接触させる工程を含み、リガンドは、ＧＰＣＲと複合体形成し、ＧＰＣＲ活性を開始または阻害する。いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲリガンドは、ポリペプチドおよび小分子からなる群より選択される。
一態様では、本明細書には、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）活性を測定するための系が記載され、該系は、（ａ）発現が野生型の状態での第１のエフェクターの発現と比較して上方制御される、ＧＰＣＲ活性の第１のエフェクターと、（ｂ）発現が野生型の状態での第２のエフェクターの発現と比較して下方制御される、ＧＰＣＲ活性の第２のエフェクターとを含む。ある特定の実施形態では、第１のエフェクターの発現は、ＧＰＣＲとＧＰＣＲ活性化因子を接触させることによって上方制御される。ある特定の実施形態では、ＧＰＣＲ活性化因子は、ＧＰＣＲアゴニストである。ある特定の実施形態では、ＧＰＣＲ活性化因子は、第１のエフェクターのアゴニストである。ある特定の実施形態では、系は、ＧＰＣＲ活性の第１のエフェクターをコードする第１の核酸を含み、第１のエフェクターの発現を上方制御するために調節エレメントに作動可能に連結される。ある特定の実施形態では、第２のエフェクターの発現は、ＧＰＣＲとＧＰＣＲ阻害因子を接触させることによって下方制御される。ある特定の実施形態では、ＧＰＣＲ阻害因子は、ＧＰＣＲインバースアゴニストである。ある特定の実施形態では、ＧＰＣＲ阻害因子は、ＧＰＣＲアンタゴニストである。ある特定の実施形態では、ＧＰＣＲ阻害因子は、第２のエフェクターのインバースアゴニストである。ある特定の実施形態では、ＧＰＣＲ阻害因子は、第２のエフェクターのアンタゴニストである。ある特定の実施形態では、該系は、第２のエフェクターの発現を下方制御する第２の核酸を含む。ある特定の実施形態では、ＧＰＣＲ活性は、Ｇｉαサブユニット活性、Ｇｓαサブユニット活性、Ｇｑαサブユニット活性、またはＧ１２／１３αサブユニット活性を含む。ある特定の実施形態では、ＧＰＣＲ活性は、Ｇｉαサブユニット活性を含む。ある特定の実施形態では、Ｇｉαサブユニット活性は、Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｏ、Ｇαｔ、Ｇαｇ、またはＧαｚの活性を含む。ある特定の実施形態では、ＧＰＣＲ活性は、Ｇｓαサブユニット活性を含む。ある特定の実施形態では、ＧＰＣＲ活性は、Ｇｑαサブユニット活性を含む。ある特定の実施形態では、ＧＰＣＲ活性は、Ｇ１２／１３αサブユニット活性を含む。ある特定の実施形態では、調節エレメントは、誘導型である。ある特定の実施形態では、調節エレメントは、構成的活性型である。ある特定の実施形態では、第１のエフェクターは、第１のアデニリルシクラーゼを含む。ある特定の実施形態では、第１のアデニリルシクラーゼは、ＡＤＣＹ１、ＡＤＣＹ２、ＡＤＣＹ３、ＡＤＣＹ４、ＡＤＣＹ５、ＡＤＣＹ６、ＡＤＣＹ７、ＡＤＣＹ８、ＡＤＣＹ９、およびＡＤＣＹ１０からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、第１のアデニリルシクラーゼは、ＡＤＣＹ６である。ある特定の実施形態では、第２のエフェクターは、第２のアデニリルシクラーゼを含む。ある特定の実施形態では、第２のアデニリルシクラーゼは、ＡＤＣＹ１、ＡＤＣＹ２、ＡＤＣＹ３、ＡＤＣＹ４、ＡＤＣＹ５、ＡＤＣＹ６、ＡＤＣＹ７、ＡＤＣＹ８、ＡＤＣＹ９、およびＡＤＣＹ１０からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、第２のアデニリルシクラーゼは、ＡＤＣＹ３である。ある特定の実施形態では、第２の核酸は、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ、またはそれらの組合せを含む。ある特定の実施形態では、第２の核酸は、マイクロＲＮＡを含む。ある特定の実施形態では、第２の核酸は、ｇＲＮＡを含む。ある特定の実施形態では、系は、ｇＲＮＡに作動可能に連結されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系をさらに含む。ある特定の実施形態では、ＧＰＣＲ活性は、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）活性を含む。ある特定の実施形態では、ＧＰＣＲ活性は、ｃＡＭＰ濃度の変化を含む。ある特定の実施形態では、ＧＰＣＲ活性は、逆ｃＡＭＰ活性を含む。ある特定の実施形態では、系は、系を含まない細胞におけるｃＡＭＰ活性と比較して、系を含む細胞におけるｃＡＭＰ活性を少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍増加させる。ある特定の実施形態では、系は、系を含まない細胞におけるｃＡＭＰ濃度と比較して、系を含む細胞におけるｃＡＭＰ濃度を少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍増加させる。ある特定の実施形態では、系は、系を含まない細胞における逆ｃＡＭＰ活性と比較して、系を含む細胞における逆ｃＡＭＰ活性を少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍増加させる。ある特定の実施形態では、系は、Ｇｉαサブユニットの発現を上方制御するための第２の調節エレメントを含む。ある特定の実施形態では、系は、少なくとも１つのさらなるエフェクターを含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのさらなるエフェクターは、アデニリルシクラーゼである。ある特定の実施形態では、系は、少なくとも１つのさらなるエフェクターの発現を上方制御するための第２の調節エレメントをさらに含む。ある特定の実施形態では、系は、系を含まない細胞におけるＧＰＣＲ活性対バックグラウンド比と比較して、系を含む細胞におけるＧＰＣＲ活性とバックグラウンドとの間の比を少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍増加させる。ある特定の実施形態では、系は、系を含まない細胞におけるＧＰＣＲ活性と比較して、系を含む細胞におけるＧＰＣＲ活性を少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍増加させる。ある特定の実施形態では、系は、系を含まない細胞におけるバックグラウンドと比較して、系を含む細胞におけるバックグラウンドを少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍減少させる。ある特定の実施形態では、系は、レポーター核酸を含み、ここで、レポーター核酸は、ＧＰＣＲ活性に比例した検出可能なシグナルを生成する。ある特定の実施形態では、レポーター核酸は、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）配列を含む。ある特定の実施形態では、レポーター核酸は、固有の分子識別子（ＵＭＩ）核酸配列に作動可能に連結される。ある特定の実施形態では、検出可能なシグナルは、蛍光シグナルを含む。ある特定の実施形態では、検出可能なシグナルは、発光シグナルを含む。ある特定の実施形態では、第１の核酸は、第１のエフェクターの発現を上方制御するための遺伝子発現カセットを含む。ある特定の実施形態では、第２の核酸は、第２のエフェクターの発現を下方制御するための遺伝子発現カセットを含む。また、本明細書には、記載される系を含む細胞が記載される。ある特定の実施態様では、細胞は、真核細胞を含む。ある特定の実施態様では、細胞は、哺乳動物細胞である。ある特定の実施態様では、哺乳動物細胞由来の細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、細胞株由来である。ある特定の実施形態では、細胞は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＯＳ－７細胞、およびＵ２ＯＳ細胞からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、系は、細胞のゲノムに組み込まれる。ある特定の実施態様では、細胞は、細胞集団を含む。ある特定の実施態様では、細胞集団は、真核細胞の集団を含む。ある特定の実施態様では、細胞集団は、哺乳動物細胞の集団を含む。ある特定の実施態様では、細胞集団は、哺乳動物細胞由来の細胞の集団を含む。ある特定の実施態様では、細胞集団は、細胞株由来の細胞の集団を含む。ある特定の実施形態では、細胞集団は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＯＳ－７細胞、およびＵ２ＯＳ細胞からなる群より選択される細胞の集団を含む。また、本明細書には、ＧＰＣＲ活性を測定するための方法が記載され、該方法は、細胞または細胞集団におけるＧＰＣＲ活性を測定する工程を含む。ある特定の実施形態では、ＧＰＣＲ活性は、定常ＧＰＣＲ活性である。ある特定の実施形態では、細胞または細胞集団は、ＧＰＣＲリガンドと接触させない。また、本明細書には、細胞におけるＧＰＣＲ活性を測定するための方法が記載され、該方法は、細胞または細胞集団とＧＰＣＲリガンドを接触させる工程を含み、リガンドは、ＧＰＣＲと複合体形成し、ＧＰＣＲ活性を開始または阻害する。ある特定の実施形態では、ＧＰＣＲリガンドは、細胞に発現する。ある特定の実施形態では、ＧＰＣＲリガンドは、ポリペプチド、非ペプチド化合物、および小分子からなる群より選択される。
本特許出願は、少なくとも１枚のカラー図面を含む。カラー図面が添付されたこの特許または特許出願公報の写しは、申請および必要な料金の支払いを行うことで、特許庁から提供される。
アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）のうちの少なくとも１つのファミリーメンバーの発現を上方制御または下方制御することによってＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）活性をより正確かつロバストに測定することができる、本明細書に記載の例示的な実施形態を示す。アデニリルシクラーゼの上方制御または下方制御は、両矢印で示される。 アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）の発現量を変化させることによってＧＰＣＲ活性を増加させるための、本明細書に記載の遺伝子発現カセットの設計を示す。図２Ａは、ＡＣ３発現をノックダウンできる一方で、ＡＣ６発現を増加させることができる、例示的な第２世代遺伝子発現カセットを示す。 アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）の発現量を変化させることによってＧＰＣＲ活性を増加させるための、本明細書に記載の遺伝子発現カセットの設計を示す。図２Ｂは、転写抑制因子でＡＣ３を下方制御するために複数のガイドＲＮＡを有するＡＣ３を標的化することによってＡＣ３発現をノックダウンすることができる、例示的な第３世代遺伝子発現カセットを示す。 アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）の発現量を変化させることによってＧＰＣＲ活性を増加させるための、本明細書に記載の遺伝子発現カセットの設計を示す。図２Ｃは、ＡＣ６発現のみを増加させる、例示的な第１世代遺伝子発現カセットを示す。 ＡＣ発現（ＭＡＤＳｖ２．５カセット、例えば、図２Ａの第２世代遺伝子発現カセット）を変化させることによってＧＰＣＲ活性が増加したことを示す。 図２Ｃの第１世代遺伝子発現カセットを含む細胞から生成したルシフェラーゼ測定値を示し、これによって、ＡＣ６過剰発現のみによって逆ＣＲＥ活性が増加したことを示す。 図２Ｂの（ＡＣ３ノックダウンを含む）第３世代遺伝子発現カセットを含む細胞から生成したプラットフォームデータを示し、これによって、本明細書に記載の第２世代遺伝子発現カセットを含む細胞から生成したプラットフォームデータと比べて改善したことを示す。
本開示の好ましい実施形態が本明細書で示され、記載されてきたが、このような実施形態はほんの一例として提供されているに過ぎないことが当業者には明らかであろう。当業者であれば、ここで、本開示から逸脱することなく多数の変形、変更および置換を思いつくであろう。本明細書に記載の本開示の実施形態の様々な代替が、本開示の実施において用いられ得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は、本開示の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造、ならびに、それらの均等物がそれによって網羅されることを意図している。
絶対的な意味を持つ用語や順序を示す用語、例えば「するだろう（ｗｉｌｌ）」、「しないだろう（ｗｉｌｌ ｎｏｔ）」、「すべきである（ｓｈａｌｌ）」、「すべきでない（ｓｈａｌｌ ｎｏｔ）」、「しなければならない（ｍｕｓｔ）」、「してはならない（ｍｕｓｔ ｎｏｔ）」、「第１に」、「最初に」、「次に」、「その後」、「前に」、「後に」、「最後に」および「最終的に」の使用は、本明細書に開示される本実施形態の範囲を限定することを意図するものではなく、例示的なものである。
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈によりそうでないことが明白に示されない限り、複数の形態も含むことが意図されている。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「備える（ｗｉｔｈ）」という用語またはその変形が詳細な説明および／または特許請求の範囲のいずれかにおいて使用される限りでは、そのような用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と同様に包括的であることが意図されている。
本明細書で使用される場合、「少なくとも１つ」、「１つまたは複数」、ならびに「および／または」という語句は、使用時（ｉｎ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）に接続的かつ弁別的な幅広い解釈のできる表現である。例えば、「Ａ、Ｂ、およびＣのうち少なくとも１つ」、「Ａ、Ｂ、またはＣのうち少なくとも１つ」、「Ａ、Ｂ、およびＣのうちの１つまたは複数」、「Ａ、Ｂ、またはＣのうちの１つまたは複数」、ならびに「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」という表現はそれぞれ、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡおよびＢ、ＡおよびＣ、ＢおよびＣ、あるいはＡ、Ｂ、およびＣを意味する。
本明細書で使用される場合、「または」は、「および」、「または」、または「および／または」を指す場合があり、排他的および包含的の両方で使用される場合がある。例えば、「ＡまたはＢ」という用語は、「ＡまたはＢ」、「ＢではなくＡ」、「ＡではなくＢ」、ならびに「ＡおよびＢ」を指す場合がある。場合によっては、文脈により、特定の意味が規定される場合がある。
本明細書に記載の系および方法はいずれも、モジュール式であり、順序のある工程に限定されるものではない。よって、「第１」および「第２」などの用語は、必ずしも優先順序、重要順序、または動作順序を意味していない。
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される、特定の値について許容可能な誤差範囲内を意味し、これは、例えば測定系の限界など、どのようにその値が測定されるか、または決定されるかに部分的に左右される。例えば、「約」は、ある値について、慣習に従って１または１を超える標準偏差以内であることを意味してもよい。場合によっては、「約」または「およそ」は、記載の量から１０％（プラスまたはマイナス）付近の量を指す。
本明細書で使用される場合、「小分子」という語句は、低分子量（例えば９００ダルトン）のいずれかの分子を指す。場合によっては、分子は、生物過程または生物反応を調節することができる有機化合物であってもよい。場合によっては、小分子は、ＧＰＣＲまたはＧＰＣＲのリガンドに結合して、ＧＰＣＲ活性を増加または減少させることができる。場合によっては、小分子は、ＧＰＣＲに対するリガンドである。小分子の非限定的な例としては、アルフゾシン、テラゾシン、クロニジン、ビソプロロール、ベタキソロール、メトプロロール、アテノロール、アルブテロール、ナドロール、ペンブトロール、トルテロジン、アトロピン、スコポラミン、カルシマー、メトクロプラミド、ハロペリドール、オランザピン、ロピニロール、プラミペキソール、ロラタジン、セチリジン、ジメンヒドリネート、シメチジン、ラニチジン、トラゾドン、スマトリプタン、エキセナチド、フェンタニル、コデイン、メペリジン、オキシコドン、モンテルカスト、またはミソプロストールを挙げることができる。
本出願および特許請求の範囲において特定の値が記載されている場合、別に述べられていない限り、「約」という用語は、その特定の値について許容可能な誤差範囲内を意味していると想定されるべきである。
「増加した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」、「増加する（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ）」、または「増加する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」という用語は、本明細書では、概して統計的に有意な量の増加を意味するように使用される。場合よっては、「増加した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」または「増加する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」という用語は、基準値と比較して少なくとも１０％の増加、例えば、基準値、標準、または対照と比較して少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または１００％の増加を含む最大１００％の増加、あるいは１０～１００％の間のいずれかの増加を意味する。他の「増加する」の例として、基準値と比較して少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、またはそれより大きい増加が挙げられる。
「減少した（ｄｅｃｒｅａｓｅｄ）」、「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ）」、または「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」という用語は、本明細書では、概して統計的に有意な量の減少を意味するように使用される。場合によっては、「減少した（ｄｅｃｒｅａｓｅｄ）」または「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」という用語は、基準値と比較して少なくとも１０％の減少、例えば、基準値と比較して少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または１００％の減少を含む最大１００％の減少（例えば、基準値と比較して存在しないか検出不能な値）、あるいは１０～１００％の間のいずれかの減少を意味する。マーカーまたは症状の文脈では、これらの用語は、係る値の統計的に有意な減少を意味する。この減少は、例えば少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、またはそれより大きくてもよく、好ましくは所与の疾患がない個体に対して正常な範囲内として容認される値まで減少する。
本明細書で使用される場合、「細胞」は、概して生物学的な細胞を指す。細胞は、生体の塩基の構造的、機能的、および／または生物学的な単位である。細胞は、１つまたは複数の細胞を有するいずれかの生物体に由来してもよい。いくつかの非限定的な例として、原核細胞、真核細胞、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、原虫類細胞、植物由来の細胞、真菌細胞（例えば、酵母菌、キノコ由来の細胞）、動物細胞、無脊髄動物（例えば、ショウジョウバエ、刺胞動物、棘皮動物、線虫など）由来の細胞、脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物）由来の細胞、または哺乳動物（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯類、ラット、マウス、非ヒト霊長類、ヒトなど）由来の細胞が挙げられる。時折、細胞は、天然の生物体に由来するものではない（例えば、細胞は、合成され、人工細胞と称される場合がある）。場合によっては、細胞は、初代細胞である。場合によっては、細胞は、細胞株由来である。
「ヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合、概して塩基－糖－リン酸塩の組合せを指す。ヌクレオチドは、合成ヌクレオチドを含む。ヌクレオチドは、合成ヌクレオチドアナログを含む。ヌクレオチドは、核酸配列（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ））の単量体単位である。ヌクレオチドという用語は、リボヌクレオシド三リン酸アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シトシン三リン酸（ＣＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、およびｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、またはそれらの誘導体などのデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含んでもよい。係る誘導体として、例えば、［αＳ］ｄＡＴＰ、７－デアザ－ｄＧＴＰ、および７－デアザ－ｄＡＴＰ、ならびにこれらを含む核酸分子にヌクレアーゼ耐性を与えるヌクレオチド誘導体を挙げることができる。ヌクレオチドという用語は、本明細書で使用される場合、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）およびそれらの誘導体を指してもよい。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の例示的な例として、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、およびｄｄＴＴＰを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、一本鎖、二本鎖、または多重鎖の形態のいずれかにある任意の長さのヌクレオチド、すなわち、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか、あるいはそれらのアナログの高分子形態を指すように交換可能に使用される。場合によっては、ポリヌクレオチドは、外来性である（例えば、異種ポリヌクレオチド）。場合によっては、ポリヌクレオチドは、細胞に内在性に存在している。場合によっては、ポリヌクレオチドは、無細胞環境に存在する場合がある。場合によっては、ポリヌクレオチドは、遺伝子またはそのフラグメントである。場合によっては、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。場合によっては、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。ポリヌクレオチドは、いずれかの三次元構造を有し、既知または未知のいずれかの機能を実施することができる。場合によっては、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のアナログ（例えば改変された主鎖、糖、または核酸塩基）を含む。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの集合前または集合後に与えられてもよい。アナログのいくつかの非限定的な例として、５－ブロモウラシル、ペプチド核酸、ゼノ核酸、モルホリノ、ロックド核酸、グリコール核酸、トレオース核酸、ジデオキシヌクレオチド、コルジセピン、７－デアザ－ＧＴＰ、フルオロフォア（例えば、糖に結合したローダミンまたはフルオレセイン）、チオール含有ヌクレオチド、ビオチン結合ヌクレオチド、蛍光塩基アナログ、ＣｐＧ島、メチル－７－グアノシン、メチル化ヌクレオチド、イノシン、チオウリジン、シュードウリジン、ジヒドロウリジン、キューオシン、およびワイオシンが挙げられる。ポリヌクレオチドの非限定的な例として、遺伝子または遺伝子フラグメントのコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義された座位、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、非コードＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、いずれかの配列から単離されたＤＮＡ、いずれかの配列から単離されたＲＮＡ、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）および無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）を含む無細胞ポリヌクレオチド、核酸プローブ、およびプライマーが挙げられる。場合によっては、ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断される。
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すように交換可能に使用され、最小長に限定されるものではない。提示のポリペプチド鎖および他のペプチド、例えば、リンカーおよび結合ペプチドを含むポリペプチドは、天然アミノ酸残基および／または非天然アミノ酸残基を含むアミノ酸残基を含んでもよい。この用語はまた、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化等、ポリペプチドの発現後修飾を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドは、タンパク質が所望される活性を維持する限り、生来または天然の配列に対する修飾を含んでもよい。これらの修飾は、部位特異的突然変異生成によるものなど、意図的なものであってもよく、あるいはタンパク質を産生する宿主の突然変異またはＰＣＲ増幅に起因するエラーによるものなど、偶発的なものであってもよい。場合によっては、ポリペプチドは、本明細書に記載のように遺伝子または導入遺伝子をコードする。
本明細書で使用される場合、「遺伝子」または「導入遺伝子」という用語は、個々のタンパク質またはＲＮＡをコードする核酸セグメント（「コード配列」または「コード領域」とも称される）を指し、任意選択で、コード配列の上流または下流に位置するプロモーター、オペレーター、ターミネーターなどの関連調節エレメントを伴う。場合によっては、プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、導入遺伝子をコードしない少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。代わりに、調節エレメントのＯＲＦは、導入遺伝子を上方制御することができる。いくつかの実施形態では、調節エレメントのＯＲＦは、導入遺伝子を下方制御することができる。いくつかの実施形態では、調節エレメントのＯＲＦは、導入遺伝子の５’上流に位置する。いくつかの実施形態では、調節エレメントのＯＲＦは、導入遺伝子の３’下流に位置する。「遺伝子」または「導入遺伝子」という用語は、広く解釈されるべきであり、遺伝子のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ、およびゲノムＤＮＡの形態を包含してもよい。用途によっては、「遺伝子」という用語は、５’および３’の非翻訳領域（５’－ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ）、エクソン、ならびにイントロンを含む転写された配列を包含する。いくつかの遺伝子では、転写された領域は、ポリペプチドをコードする「オープンリーディングフレーム」含むであろう。この用語の用途によっては、「遺伝子」または「導入遺伝子」は、ポリペプチドをコードするのに必要なコード配列（例えば、「オープンリーディングフレーム」または「コード配列」）のみを含む。いくつかの態様では、遺伝子または導入遺伝子は、ポリペプチドをコードせず、これには、例えば、リボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＲＮＡ）およびトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）遺伝子が挙げられる。いくつかの態様では、「遺伝子」または「導入遺伝子」という用語は、転写された配列のみならず、加えて、制御領域、エンハンサー、およびプロモーターを含む上流および下流の制御エレメントを含む非転写領域も含む。「遺伝子」または「導入遺伝子」という用語は、遺伝子のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、およびゲノムの形態を包含してもよい。
「逆環状ＡＭＰ活性」という用語は、ｃＡＭＰ活性の減少またはｃＡＭＰ濃度の減少を指す。
「発現」という用語は概して、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写産物などに）転写される１つまたは複数のプロセス、および／または、転写されたｍＲＮＡが引き続きペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写産物およびコードされたポリペプチドは総じて、「遺伝子産物」と称されてもよい。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞中のｍＲＮＡのスプライシングを含んでもよい。いくつかの実施形態では、発現には、本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドの生物学的な活性を含んでもよい。発現に関して、「上方制御」は概して、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）および／またはポリペプチド配列の発現レベルが、野生型の状態での発現レベルと比較して増加することを指す。例えば、遺伝子または導入遺伝子の発現は、本明細書に記載される系によって、野生型の状態での遺伝子または導入遺伝子の発現（例えば、本明細書に記載される系によって遺伝子または導入遺伝子の発現が上方調節されない場合）と比較して少なくとも０．１倍、０．２倍、０．３倍、０．４倍、０．５倍、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、またはそれより大きく上方調節されてもよい。「下方制御」は概して、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）および／またはポリペプチド配列の発現レベルが、野生型の状態での発現と比較して減少することを指す。例えば、遺伝子または導入遺伝子の発現は、本明細書に記載の系によって、野生型の状態での遺伝子または導入遺伝子の発現（例えば、本明細書に記載の系によって遺伝子または導入遺伝子の発現が上方調節されない場合）と比較して少なくとも０．１倍、０．２倍、０．３倍、０．４倍、０．５倍、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、またはそれより大きく下方調節されてもよい。「野生型」または「野生型の状態」は、標的の発現（例えば、突然変異体または操作遺伝子の産物としての発現とは対照的な正常対立遺伝子の産物としての発現、あるいはｓｉＲＮＡまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系による発現）を減少させる発現ベクターまたは核酸による操作なしに、天然で生じる発現の表現型または生物学的な測定または観察を指してもよい。
基準ポリペプチド配列に関する配列同一性パーセント（％）は、配列をアライメントし、最大の配列同一性パーセントが得られるように必要に応じてギャップを導入した後に、基準ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合であり、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と見なさない。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のアライメントは、公知の様々な手段、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアといった公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、達成することができる。比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要なアルゴリズムを含む、配列をアライメントするのに適切なパラメータを決定することができる。
「同一性」、「同一」、または「同一パーセント」という用語は、基準配列と比較して核酸配列を説明するために本明細書で使用される場合、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７巻：２２６４～２２６８頁、１９９０年、ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｓ ｉｎ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０巻：５８７３～５８７７頁、１９９３年）に記載される式を使用して決定することができる。係る式は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５巻：４０３～４１０頁、１９９０年）のｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）プログラムに組み入れられる。配列の同一性パーセントは、本出願の出願日時点で最新版のＢＬＡＳＴを使用して決定ですることができる。
本明細書に記載の系のポリペプチドは、核酸によってコードすることができる。核酸は、２つ以上のヌクレオチド塩基を含むポリヌクレオチドの一種である。ある特定の実施形態では、核酸は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞に転写するために使用できるベクターの成分である。本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、結合している別の核酸を輸送可能な核酸分子を指す。ベクターの一種としては、宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込むことができるゲノム組み込み型ベクターまたは「組み込み型ベクター」がある。ベクターの別の一種としては、「エピソーマル」ベクター、例えば、染色体外で複製可能な核酸がある。作動可能に結合している遺伝子の発現を導くことが可能なベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。好適なベクターは、プラスミド、細菌人工染色体、酵母人工染色体、ウイルスベクターなどを含む。場合によっては、ベクターは、転写を制御するのに使用するためのプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどの調節エレメントを含む。調節エレメントは、哺乳動物、細菌、ウイルス、または昆虫の遺伝子に由来してもよい。実施形態では、ベクターは、本明細書に記載される遺伝子発現カセットを含む。通常、複製起点によって付与される宿主中での複製能や、形質転換体の認識を容易にするための選択遺伝子をさらに取り込むことができる。ウイルス、例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどに由来するベクターを用いてもよい。プラスミドベクターは、染色体位置への組み込みのために線形化することができる。ベクターは、ゲノム内の規定された位置または制限された部位のセットに部位特異的な組み込み（例えば、ＡｔｔＰ－ＡｔｔＢ組み換え）を導く配列を含んでもよい。さらに、ベクターは、組み込みのために転移因子に由来する配列を含んでもよい。
本明細書で使用される場合、「トランスフェクション」または「トランスフェクトされる」という用語は、実験で一般的に使用されるプロセスを通して、意図的に細胞に外因性の核酸を導入する方法を指す。トランスフェクションは、例えば、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿反応、ウイルス形質導入、またはエレクトロポレーションによって達成することができる。トランスフェクションは、一過性のものであるか、あるいは安定的なものであるかのいずれかであってもよい。
本明細書で使用される場合、「トランスフェクション効率」という用語は、細胞集団が外因性の核酸を取り込む程度あるいは割合を指す。トランスフェクション効率は、系の全細胞集団と比較して、外因性の核酸を取り込む所与の細胞集団のパーセント（％）として測定することができる。トランスフェクション効率は、一過的または安定的にトランスフェクトされた細胞の両方で測定することができる。
本明細書で使用される場合、「生理活性ポリペプチド」という用語は、遺伝子の発現を調整する細胞によって発現するポリペプチドを指す。生理活性ポリペプチドは、刺激に応じて、またはいずれかの他の機構によって、１つまたは複数の仲介分子またはポリペプチドを介するシグナル伝達によって、遺伝子の発現を直接調整することができる。生理活性ポリペプチドは、膜貫通型ポリペプチド（受容体またはチャネルタンパク質など）、細胞内ポリペプチド（シグナル形質導入仲介体）、細胞外ポリペプチド、または分泌ポリペプチドであってもよい。
本明細書で使用される場合、「レポーター活性」は、レポーターの経験的な読み取りを指す。例えば、ルシフェラーゼレポーターは、適切な基質で培養されると、発光読み出しを有するであろう。蛍光タンパク質のような他のレポーターは、基質を必要としない場合があるが、例えば、顕微鏡または蛍光プレートリーダーによって測定することができる。いくつかの実施形態では、レポーターは、レポーター核酸によってコードされる。いくつかの事例では、レポーターの発現は、本明細書に記載の調節エレメントまたはプロモーターによって導かれる。いくつかの実施形態では、レポーターの発現は、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）などのｃＡＭＰ応答エレメントによって導かれる。
概要
本明細書に記載の系および方法は、ＧＰＣＲ活性化因子に関連する応答エレメント結合プロモーターの有無および／または活性化レベルを検出することによってＧＰＣＲ活性を測定することができる。また、本明細書には、ＧＰＣＲ活性を増加させるための系および方法が記載される。場合によっては、本明細書に記載の系および方法は、ＧＰＣＲ活性を測定するための従来のレポーター系および方法と比較して、ＧＰＣＲ活性を測定する際のバックグラウンドが減少したＧＰＣＲ活性を可能にする。場合によっては、本明細書に記載の系および方法は、ＧＰＣＲ活性を測定するための従来のレポーター系および方法と比較してｃＡＭＰシグナルのレベルが増加したＧＰＣＲ活性を可能にする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の系および方法は、本明細書に記載のエフェクターをコードする少なくとも１つの核酸を含む。いくつかの事例では、少なくとも１つの核酸は、調節エレメントを含む。ある特定の実施形態では、応答エレメント結合プロモーターは、ＧＰＣＲ活性の終了時に活性化される（例えば、ＧＰＣＲのシグナル伝達カスケード）。ある特定の実施形態では、応答エレメント結合プロモーターの存在は、ＧＰＣＲと結合または複合体形成するペプチド、高分子、化合物、または小分子などの外部刺激の前後に測定することができる。ある特定の実施形態では、系または方法は、製薬発見の目的のためのスクリーニングに有用である。場合によっては、系または方法は、レポーターの発現を導く応答エレメント調節プロモーターを含む少なくとも１つの核酸を最低限含む。ある特定の実施形態では、レポーターは、ポリペプチドである。ある特定の実施形態では、レポーターは、特定の細胞型または特定の細胞集団を同定するために使用することができる固有の核酸配列などの固有の分子識別子（ＵＭＩ）をさらに含んでもよい。
非限定的な例として、生理活性ポリペプチドは、数百の既知のもののうちの特定のＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を含んでもよい。よって、ＵＭＩエレメントは、多重フォーマットでいくつかの異なる生理活性ポリペプチドのシグナル伝達を容易にかつ迅速に照合することができる。さらに、本明細書で提供される系および方法は、応答エレメント調節プロモーターによってバックグラウンドを減少させる。これにより、より正確な定量化が可能になり、生理活性ポリペプチドを活性化し得る化合物についてのいずれの多重スクリーニングにおいても偽陽性の試験化合物の数を減少させる。ある特定の実施形態では、レポーターポリペプチドをコードする核酸配列は、存在しない。ある特定の実施形態では、ＵＭＩをコードする核酸配列は、存在しない。ある特定の実施形態では、ＵＭＩをコードする核酸配列は、レポーターポリペプチドをコードする核酸配列の５’である。ある特定の実施形態では、レポーターポリペプチドをコードする核酸配列は、ＵＭＩをコードする核酸配列の５’である。
ある特定の実施形態では、レポーターをコードする核酸は、レポーターポリペプチドをコードする。ある特定の実施形態では、レポーターポリペプチドは、直接検出可能である。ある特定の実施形態では、レポーターポリペプチドは、基質に対するタンパク質の酵素活性の際に検出可能なシグナルを生成する。ある特定の実施形態では、レポーターポリペプチドの検出は、定量的に達成することができる。ある特定の実施形態では、レポーターポリペプチドは、ルシフェラーゼタンパク質、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型胎盤アルカリホスファターゼ、またはそれらの組合せを含む。ある特定の実施形態では、レポーターポリペプチドは、ルシフェラーゼタンパク質であり、基質の非限定的な例として、ホタルルシフェリン、ラチアルシフェリン、バクテリアルシフェリン、セレンテラジン、渦鞭毛藻ルシフェリン、ヴァルグリン、および３－ヒドロキシヒスピジンが挙げられる。
ある特定の実施形態では、レポーターをコードする核酸は、ＵＭＩもコードしてもよい。ＵＭＩは、核酸に固有のヌクレオチドの短い配列を含む。ＵＭＩは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド長以上であってもよい。ＵＭＩは、次世代シーケンシング法など、ＵＭＩの配列決定可能ないずれかの好適な方法で検出可能である。ＵＭＩの検出方法は、定量的なものであってもよく、これには、次世代シーケンシング法が挙げられる。
ある特定の実施形態において、本明細書には、創薬で使用するために本明細書に記載の系を使用する方法が記載され、該系は、本明細書に記載のエフェクターをコードする少なくとも１つの核酸と、レポーター核酸とを含む。ある特定の実施形態では、方法は、核酸が内在化されて細胞によって発現される（例えば、トランスフェクトされる）のに十分な条件下で、核酸と細胞または細胞集団を接触させる工程と、細胞と物理的または化学的な刺激を接触させる工程と、１つまたは複数のアッセイによってレポーターの活性化を決定する工程とを含む。ある特定の実施形態では、方法は、転写因子核酸をコードする核酸とレポーター核酸とを含む細胞または細胞集団を接触させる工程と、１つまたは複数のアッセイによってレポーターの活性化を決定する工程とを含む。
本開示の非限定的な一実施形態は、図１に示す。細胞（１００）は、本明細書に記載の、ＧＰＣＲ活性を測定するための系を含む。ＧＰＣＲ（１０１）は、ＧＰＣＲリガンド（１０２）に接触させられる。ＧＰＣＲ（１０１）とＧＰＣＲリガンド（１０２）とが接触すると、Ｇタンパク質（１０３）のＧαサブユニットはＧｐおよびＧｙから解離し、アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）ファミリー（１０４）の様々なメンバーと相互作用する。種々のＡＣファミリーメンバー（１０４）の発現を上方制御または下方制御することによって、ＧＰＣＲ活性は、本明細書に記載のレポーター構築物（１０５）の発現の有無や程度を検出することによって、より堅固かつ正確に測定することができる。場合によっては、レポーター構築物（１０５）は任意選択で、本明細書に記載の系を含む、特定の細胞型または特定の細胞集団を同定するために使用することができる固有の分子識別子（ＵＭＩ）の核酸配列をさらに含んでもよい。
ＧＰＣＲ活性
本明細書において、いくつかの実施形態では、細胞におけるＧＰＣＲ活性を測定するための系および方法が記載される。いくつかの事例では、系は、ＧＰＣＲ活性の第１のエフェクターをコードする第１の核酸を含む。場合によっては、第１の核酸は、ＧＰＣＲ活性の第１のエフェクターを過剰発現するように構成された調節エレメントに作動可能に連結されてもよい。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、プロモーター、エンハンサー、またはそれらの組合せを含む。場合によっては、系は、ＧＰＣＲ活性の第２のエフェクターの発現を減少させる第２の核酸をさらに含んでもよい。場合によっては、ＧＰＣＲ活性は、細胞によって発現したＧＰＣＲと結合または複合体形成するリガンドに起因する活性を含む。いくつかの実施形態では、系は、さらなるエフェクターを含む。
ＧＰＣＲは、ＧＰＣＲ活性を生じるいずれのＧＰＣＲであってもよい。いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲは、本明細書に記載の系を含む細胞に対して外来性であっても、内在性であってもよい。例えば、ＧＰＣＲは、本明細書に記載の系を含む細胞に導入遺伝子として導入される外来性ＧＰＣＲであってもよい。場合によっては、ＧＰＣＲは、本明細書に記載の系を有する細胞に対して内在性ＧＰＣＲであってもよい。場合によっては、ＧＰＣＲは、リガンドによって刺激を受けて、ＧＰＣＲ活性を生じさせてもよい。いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲは、ＧＰＣＲと複合体形成または結合するリガンドとは非依存的、あるいは非存在下でＧＰＣＲ活性を生じさせてもよい。いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲ活性は、オーファンＧＰＣＲ活性を含み、ここで、ＧＰＣＲ活性は、ＧＰＣＲと複合体形成または結合する推定リガンドまたは未知のリガンドから生じてもよい。例示的なＧＰＣＲとして、アデノシン受容体、βアドレナリン受容体、ニューロテンシン受容体、ムスカリン酸受容体、５－ヒドロキシトリプタミン受容体、アドレノ受容体、アナフィラトキシン受容体、アンジオテンシン受容体、アペリン受容体、ボンベシン受容体、ブラジキニン受容体、カンナビノイド受容体、ケモカイン受容体、コレシストキニン受容体、ドーパミン受容体、エンドセリン受容体、遊離脂肪酸受容体、胆汁酸受容体、ガラニン受容体、モチリン受容体、グレリン受容体、糖タンパク質ホルモン受容体、ＧｎＲＨ受容体、ヒスタミン受容体、ＫｉＳＳ１由来ペプチド受容体、ロイコトリエンおよびリポキシン受容体、リゾリン脂質受容体、メラニン濃縮ホルモン受容体、メラノコルチン受容体、メラトニン受容体、ニューロメジンＵ受容体、ニューロペプチド受容体、Ｎ－ホルミルペプチドファミリー受容体、ニコチン酸受容体、オピオイド受容体、オプシン様受容体、オレキシン受容体、Ｐ２Ｙ受容体、ペプチドＰ５１８受容体、血小板活性化因子受容体、プロキネチシン受容体、プロラクチン放出ペプチド受容体、プロスタノイド受容体、プロテアーゼ活性化受容体、リラキシン受容体、ソマトスタチン受容体、ＳＰＣ／ＬＰＣ受容体、タキキニン受容体、微量アミノ受容体、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体、ウロテンシン受容体、バソプレシン／オキシトシン受容体、オーファンＧＰＣＲ、カルシトニン受容体、コルチコトロピン放出因子受容体、グルカゴン受容体、上皮小体受容体、ＶＩＰ／ＰＡＣＡＰ受容体、ＬＮＢ７（商標）受容体、ＧＡＢＡ受容体、代謝型グルタミン酸受容体、またはカルシウムセンサー受容体を挙げることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の、ＧＰＣＲと複合体形成または結合するリガンドは、公知である。場合によっては、ＧＰＣＲに対するリガンドは、アゴニストまたはパーシャルアゴニストであってもよく、ＧＰＣＲと複合体形成または結合して、細胞におけるＧＰＣＲ活性を増加させることができる。いくつかの実施形態では、リガンドは、インバースアゴニストであってもよく、インバースアゴニストは、リガンドがＧＰＣＲと結合または複合体形成して、定常ＧＰＣＲ活性を減少させるものである。いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲと複合体形成または結合するリガンドは、アンタゴニストであってもよく、アンタゴニストは、ＧＰＣＲと結合して、ＧＰＣＲアゴニストとの結合を遮断するものである。場合によっては、リガンドは、小さい有機部分または無機部分である。場合によっては、リガンドは、ポリペプチドであってもよい。ポリペプチドは、天然に存在するＧＰＣＲ結合タンパク質、あるいはＧＰＣＲと結合または複合体形成することができる他のタンパク質、またはその誘導体もしくはフラグメントであってもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＧＰＣＲに結合する抗体であってもよい。抗体は、いずれかの免疫グロブリンアイソタイプ、サブクラス、モノクローナル抗体、ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、ナノボディ、およびダイアボディなどの抗原結合ドメインを含むそのフラグメントを含む、いずれかの免疫グロブリンであってもよい。いくつかの実施形態では、リガンドは、ＧＰＣＲと共有結合することができる。いくつかの実施形態では、リガンドは、ペプチド模倣物、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、高分子、またはアプタマーであってもよい。いくつかの実施形態では、リガンドは、Ｎａ＋またはＺｎ２＋などのイオンであってもよい。いくつかの実施形態では、リガンドは、脂質であってもよい。いくつかの実施形態では、リガンドは、炭水化物であってもよい。いくつかの実施形態では、リガンドは、ミリモル（ｍＭ）～ピコモル（ｐＭ）の解離定数（Ｋｄ）でＧＰＣＲに結合することができる。
いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲ活性は、Ｇタンパク質活性を含む。場合によっては、Ｇタンパク質活性は、刺激活性であってもよい。いくつかの事例では、Ｇタンパク質活性は、阻害活性であってもよい。Ｇタンパク質活性として、Ｇタンパク質αサブユニット（Ｇα）、Ｇタンパク質βサブユニット（Ｇβ）、Ｇタンパク質γサブユニット（Ｇγ）、および／またはＧタンパク質βγサブユニット（Ｇβγ）の活性を挙げることができる。場合によっては、Ｇタンパク質活性は、Ｇαの活性を含む。Ｇα活性は、Ｇｉαサブユニット、Ｇｓαサブユニット活性、Ｇｑαサブユニット活性、またはＧ１２αサブユニットの活性を含んでもよい。場合によっては、Ｇタンパク質活性は、Ｇｉαサブユニット活性を含む。Ｇｉαサブユニットは、Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｏ、Ｇαｔ、Ｇαｇ、またはＧαｚを含んでもよい。Ｇｓαサブユニットは、ＧαｓまたはＧαｏｉｆを含むことができ、Ｇｑαサブユニットは、Ｇαｑ、Ｇα１１、Ｇα１４、またはＧα１６を含んでもよい。Ｇ１２αサブユニットは、Ｇα１２またはＧα１３を含んでもよい。場合によっては、Ｇβサブユニットは、Ｇβ１、Ｇβ２、Ｇβ３、Ｇβ４、またはＧβ５を含んでもよい。いくつかの事例では、Ｇγサブユニットは、Ｇγ１、Ｇγ２、Ｇγ３、Ｇγ４、Ｇγ５、Ｇγ６、Ｇγ７、Ｇγ８、Ｇγ９、Ｇγ１０、Ｇγ１１、またはＧγ１２を含んでもよい。
場合によっては、ＧＰＣＲ活性は、ＧＰＣＲの少なくとも１つのエフェクターの活性を含む。場合によっては、ＧＰＣＲのエフェクターは、Ｇタンパク質に関連するセカンドメッセンジャーを含む。例えば、ＧＰＣＲ活性は、Ｇタンパク質活性に関連するセカンドメッセンジャーである、アデニリルサイクル、ホスホリパーゼ、ホスホジエステラーゼ、キナーゼ、またはイオンチャネルなどの活性エフェクターを含む。いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲ活性は、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）活性を含む。いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲ活性は、逆ｃＡＭＰ活性を含む。場合によっては、ＧＰＣＲ活性は、Ｇタンパク質に関連するメッセンジャーまたは分子の下流のシグナル伝達を含む。例えば、ＧＰＣＲ活性は、本明細書に記載のレポーター核酸に結合するｃＡＭＰ応答エレメントの転写活性または翻訳活性を含むことができる。場合によっては、ＧＰＣＲ活性は、本明細書に記載のレポーター核酸に結合するｃＡＭＰ応答エレメントから生じた検出可能なシグナルから測定することができる。いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲ活性は、本明細書に記載のレポーターによって生じた検出可能なシグナルに比例する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の系は、本明細書に記載のエフェクターのうちのいずれか１つの発現を調整する少なくとも１つの核酸を含む。場合によっては、核酸は、本明細書に記載のエフェクターのいずれか１つをコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、エフェクターの発現を調整する調節エレメントをコードする。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、プロモーター、エンハンサー、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、エンハンサーを含む。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、エフェクターの発現を上方制御する。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、エフェクターの発現を下方制御する。いくつかの実施形態では、核酸は、調節エレメントとエフェクターの両方をコードし、ここで、調節エレメントは、核酸によってコードされるエフェクターの発現を上方制御する。いくつかの実施形態では、核酸は、調節エレメントとエフェクターの両方をコードし、ここで、調節エレメントは、核酸によってコードされるエフェクターの発現を下方制御する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸は、本明細書に記載のエフェクターのいずれか１つと、本明細書に記載の調節エレメントのいずれか１つとをコードする。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸は、１つのエフェクターと１つの調節エレメントとをコードする。例えば、少なくとも１つの核酸は、調節エレメントに作動可能に連結されたエフェクターをコードすることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の系は、第１のアデニリルシクラーゼを含む少なくとも第１のエフェクターと、第２のアデニリルシクラーゼを含む少なくとも第２のエフェクターとを含む。いくつかの実施形態では、第１のエフェクターおよび第２のエフェクターは、異なる調節エレメントの発現制御下にある。いくつかの実施形態では、第１のエフェクターは、プロモーターまたはエンハンサーに作動可能に連結された核酸によってコードされ、ここで、プロモーターまたはエンハンサーは、野生型の状態と比較して第１のエフェクターの発現を増加または過剰発現させる。いくつかの実施形態では、第１のアデニリルシクラーゼは、プロモーターまたはエンハンサーに作動可能に連結された核酸によってコードされ、ここで、プロモーターまたはエンハンサーは、野生型の状態と比較して第１のアデニリルシクラーゼの発現を増加または過剰発現させる。
いくつかの実施形態では、調節エレメントによって調整されるエフェクターは、アデニリルシクラーゼである。いくつかの実施形態では、アデニリルシクラーゼは、ＡＤＣＹ１、ＡＤＣＹ２、ＡＤＣＹ３、ＡＤＣＹ４、ＡＤＣＹ５、ＡＤＣＹ６、ＡＤＣＹ７、ＡＤＣＹ８、ＡＤＣＹ９、またはＡＤＣＹ１０である。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、ＡＤＣＹ１、ＡＤＣＹ２、ＡＤＣＹ３、ＡＤＣＹ４、ＡＤＣＹ５、ＡＤＣＹ６、ＡＤＣＹ７、ＡＤＣＹ８、ＡＤＣＹ９、またはＡＤＣＹ１０のうちのいずれか１つを上方制御する。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、ＡＤＣＹ６を上方制御する。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、ＡＤＣＹ１、ＡＤＣＹ２、ＡＤＣＹ３、ＡＤＣＹ４、ＡＤＣＹ５、ＡＤＣＹ６、ＡＤＣＹ７、ＡＤＣＹ８、ＡＤＣＹ９、またはＡＤＣＹ１０のうちのいずれか１つを下方制御する。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載のエフェクターのうちのいずれか１つの発現を下方制御することができるＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、エフェクターの発現を下方制御する短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む。場合によっては、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼとの複合体を補助し、ヌクレアーゼを誘導してエフェクターの核酸を消化させることができる。エフェクターの核酸を消化して（その後、発現を減少させる）ように補助することができるｇＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの非限定的な例として、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、およびＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチドを含むＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質またはＣａｓヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）、ＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡ結合タンパク質、リコンビナーゼ、フリッパーゼ、トランスポザーゼ、アルゴノート（Ａｇｏ）タンパク質（例えば、原核生物アルゴノート（ｐＡｇｏ）、古細菌アルゴノート（ａＡｇｏ）、および真核生物アルゴノート（ｅＡｇｏ））、それらのいずれかの誘導体、それらのいずれかの変異体、ならびにそれらのいずれかのフラグメントを挙げることができる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質であってもよい。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質であってもよい。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質などのｇＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ｇＲＮＡもコードする同じ核酸からコードされることができる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質などのｇＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ｇＲＮＡをコードする異なる核酸からコードされることができる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、エフェクターの発現を下方制御するマイクロＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、本明細書に記載のアデニリルシクラーゼ（例えば、ＡＤＣＹ１、ＡＤＣＹ２、ＡＤＣＹ３、ＡＤＣＹ４、ＡＤＣＹ５、ＡＤＣＹ６、ＡＤＣＹ７、ＡＤＣＹ８、ＡＤＣＹ９、またはＡＤＣＹ１０）のうちのいずれか１つを下方制御するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ＡＤＣＹ３を下方制御するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｇＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのエフェクターは、細胞と阻害因子を接触させることによって細胞における少なくとも１つのエフェクターの活性をノックダウンまたはノックアウトすることで、下方制御することができる。場合によっては、阻害因子は、ＧＰＣＲに対する阻害因子であってもよい。いくつかの実施形態では、阻害因子は、アデニリルシクラーゼに対する阻害因子であってもよい。いくつかの実施形態では、阻害因子は、アンタゴニストであってもよい。いくつかの実施形態では、アンタゴニストは、ＧＰＣＲに対するアンタゴニストであってもよい。いくつかの実施形態では、アンタゴニストは、アデニリルシクラーゼに対するアンタゴニストであってもよい。いくつかの実施形態では、阻害因子は、インバースアゴニストであってもよい。いくつかの実施形態では、アンタゴニストは、ＧＰＣＲに対するインバースアゴニストであってもよい。いくつかの実施形態では、アンタゴニストは、アデニリルシクラーゼに対するインバースアゴニストであってもよい。アデニリルアゴニストの例示的な阻害因子としては、ＫＨ７、ＭＤＬ１２３３０Ａ、ＮＫＹ８０、ＳＫＦ８３５６６、ＳＱ２２５３６、およびＳＴ０３４３０７を挙げることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の系は、第１の調節エレメントによって上方制御される少なくとも１つのエフェクターと、第２の調節エレメントによって下方制御される少なくとも１つの他の異なるエフェクターとを含む。いくつかの実施形態では、系は、第１の調節エレメントによって上方制御される少なくとも１つのアデニリルシクラーゼと、第２の調節エレメントによって下方制御される少なくとも１つの他の異なるアデニリルシクラーゼとを含む。いくつかの実施形態では、系は、第１の調節エレメントによって上方制御されるＡＤＣＹ６と、第２の調節エレメントによって下方制御されるＡＤＣＹ３とを含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのエフェクターは、細胞と活性化因子を接触させることによって、細胞において上方制御することができる。場合によっては、活性化因子は、ＧＰＣＲに対する活性化因子であってもよい。いくつかの実施形態では、活性化因子は、アデニリルシクラーゼの活性化因子であってもよい。いくつかの実施形態では、活性化因子は、アゴニストであってもよい。いくつかの実施形態では、アゴニストは、ＧＰＣＲに対するアゴニストであってもよい。いくつかの実施形態では、アゴニストは、アデニリルシクラーゼに対するアゴニストであってもよい。アデニリルアゴニストの例示的な活性化因子としては、フォルスコリン、ＮＫＨ４７７、ＰＡＣＡＰ１－２７、およびＰＡＣＡＰ１－３８を挙げることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の系は、ＧＰＣＲ活性を増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の系は、測定可能なＧＰＣＲ活性を増加させる。いくつかの実施形態では、測定可能なＧＰＣＲ活性は、測定可能なＧタンパク質活性を含む。いくつかの実施形態では、測定可能なＧＰＣＲ活性は、Ｇタンパク質αサブユニット（Ｇα）活性、Ｇタンパク質βサブユニット（Ｇβ）活性、Ｇタンパク質γサブユニット（Ｇγ）活性、および／またはＧタンパク質βγサブユニット（Ｇβγ）活性を含む。場合によっては、Ｇタンパク質は、Ｇα活性を含む。Ｇα活性は、Ｇｉαサブユニット、Ｇｓαサブユニット活性、Ｇｑαサブユニット活性、またはＧ１２αサブユニットの活性を含んでもよい。場合によっては、Ｇタンパク質活性は、Ｇｉαサブユニット活性を含む。いくつかの実施形態では、系は、系を含まない細胞におけるＧｉαサブユニット活性と比較して、系を含む細胞におけるＧｉαサブユニット活性を増加させる。いくつかの実施形態では、系は、細胞における測定可能なＧｉαサブユニット活性を少なくとも約０．１倍から約１０，０００倍増加させる。いくつかの実施形態では、系は、細胞における測定可能なＧｉαサブユニット活性を少なくとも約０．１倍から約０．５倍、約０．１倍から約１倍、約０．１倍から約２倍、約０．１倍から約５倍、約０．１倍から約１０倍、約０．１倍から約２０倍、約０．１倍から約５０倍、約０．１倍から約１００倍、約０．１倍から約５００倍、約０．１倍から約１，０００倍、約０．１倍から約１０，０００倍、約０．５倍から約１倍、約０．５倍から約２倍、約０．５倍から約５倍、約０．５倍から約１０倍、約０．５倍から約２０倍、約０．５倍から約５０倍、約０．５倍から約１００倍、約０．５倍から約５００倍、約０．５倍から約１，０００倍、約０．５倍から約１０，０００倍、約１倍から約２倍、約１倍から約５倍、約１倍から約１０倍、約１倍から約２０倍、約１倍から約５０倍、約１倍から約１００倍、約１倍から約５００倍、約１倍から約１，０００倍、約１倍から約１０，０００倍、約２倍から約５倍、約２倍から約１０倍、約２倍から約２０倍、約２倍から約５０倍、約２倍から約１００倍、約２倍から約５００倍、約２倍から約１，０００倍、約２倍から約１０，０００倍、約５倍から約１０倍、約５倍から約２０倍、約５倍から約５０倍、約５倍から約１００倍、約５倍から約５００倍、約５倍から約１，０００倍、約５倍から約１０，０００倍、約１０倍から約２０倍、約１０倍から約５０倍、約１０倍から約１００倍、約１０倍から約５００倍、約１０倍から約１，０００倍、約１０倍から約１０，０００倍、約２０倍から約５０倍、約２０倍から約１００倍、約２０倍から約５００倍、約２０倍から約１，０００倍、約２０倍から約１０，０００倍、約５０倍から約１００倍、約５０倍から約５００倍、約５０倍から約１，０００倍、約５０倍から約１０，０００倍、約１００倍から約５００倍、約１００倍から約１，０００倍、約１００倍から約１０，０００倍、約５００倍から約１，０００倍、約５００倍から約１０，０００倍、または約１，０００倍から約１０，０００倍増加させる。いくつかの実施形態では、系は、細胞における測定可能なＧｉαサブユニット活性を少なくとも約０．１倍、約０．５倍、約１倍、約２倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、約１，０００倍、または約１０，０００倍増加させる。いくつかの実施形態では、系は、細胞における測定可能なＧｉαサブユニット活性を少なくとも約０．１倍、約０．５倍、約１倍、約２倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、または約１，０００倍増加させる。いくつかの実施形態では、系は、細胞における測定可能なＧｉαサブユニット活性を少なくとも最大約０．５倍、約１倍、約２倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、約１，０００倍、または約１０，０００倍増加させる。
いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲ活性は、測定可能なｃＡＭＰ活性を含む。場合によっては、測定可能なｃＡＭＰ活性は、ｃＡＭＰ濃度の増加または減少を含む。いくつかの実施形態では、系は、系を含まない細胞におけるｃＡＭＰ活性と比較して、系を含む細胞において測定可能なｃＡＭＰ活性を増加させる。いくつかの実施形態では、系は、細胞において測定可能なｃＡＭＰを少なくとも約０．１倍から約１０，０００倍増加させる。いくつかの実施形態では、系は、細胞におけるｃＡＭＰを少なくとも約０．１倍から約０．５倍、約０．１倍から約１倍、約０．１倍から約２倍、約０．１倍から約５倍、約０．１倍から約１０倍、約０．１倍から約２０倍、約０．１倍から約５０倍、約０．１倍から約１００倍、約０．１倍から約５００倍、約０．１倍から約１，０００倍、約０．１倍から約１０，０００倍、約０．５倍から約１倍、約０．５倍から約２倍、約０．５倍から約５倍、約０．５倍から約１０倍、約０．５倍から約２０倍、約０．５倍から約５０倍、約０．５倍から約１００倍、約０．５倍から約５００倍、約０．５倍から約１，０００倍、約０．５倍から約１０，０００倍、約１倍から約２倍、約１倍から約５倍、約１倍から約１０倍、約１倍から約２０倍、約１倍から約５０倍、約１倍から約１００倍、約１倍から約５００倍、約１倍から約１，０００倍、約１倍から約１０，０００倍、約２倍から約５倍、約２倍から約１０倍、約２倍から約２０倍、約２倍から約５０倍、約２倍から約１００倍、約２倍から約５００倍、約２倍から約１，０００倍、約２倍から約１０，０００倍、約５倍から約１０倍、約５倍から約２０倍、約５倍から約５０倍、約５倍から約１００倍、約５倍から約５００倍、約５倍から約１，０００倍、約５倍から約１０，０００倍、約１０倍から約２０倍、約１０倍から約５０倍、約１０倍から約１００倍、約１０倍から約５００倍、約１０倍から約１，０００倍、約１０倍から約１０，０００倍、約２０倍から約５０倍、約２０倍から約１００倍、約２０倍から約５００倍、約２０倍から約１，０００倍、約２０倍から約１０，０００倍、約５０倍から約１００倍、約５０倍から約５００倍、約５０倍から約１，０００倍、約５０倍から約１０，０００倍、約１００倍から約５００倍、約１００倍から約１，０００倍、約１００倍から約１０，０００倍、約５００倍から約１，０００倍、約５００倍から約１０，０００倍、または約１，０００倍から約１０，０００倍増加させる。いくつかの実施形態では、系は、細胞におけるｃＡＭＰを少なくとも約０．１倍、約０．５倍、約１倍、約２倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、約１，０００倍、または約１０，０００倍増加させる。いくつかの実施形態では、系は、細胞におけるｃＡＭＰを少なくとも約０．１倍、約０．５倍、約１倍、約２倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、または約１，０００倍増加させる。いくつかの実施形態では、系は、細胞におけるｃＡＭＰを少なくとも最大約０．５倍、約１倍、約２倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、約１，０００倍、または約１０，０００倍増加させる。
いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲ活性は、測定可能な逆ｃＡＭＰ活性を含む。いくつかの実施形態では、系は、系を含まない細胞における逆ｃＡＭＰ活性と比較して、系を含む細胞において測定可能な逆ｃＡＭＰ活性を増加させる。いくつかの実施形態では、系は、細胞における逆ｃＡＭＰを少なくとも約０．１倍から約１０，０００倍増加させる。いくつかの実施形態では、系は、逆ｃＡＭＰを少なくとも約０．１倍から約０．５倍、約０．１倍から約１倍、約０．１倍から約２倍、約０．１倍から約５倍、約０．１倍から約１０倍、約０．１倍から約２０倍、約０．１倍から約５０倍、約０．１倍から約１００倍、約０．１倍から約５００倍、約０．１倍から約１，０００倍、約０．１倍から約１０，０００倍、約０．５倍から約１倍、約０．５倍から約２倍、約０．５倍から約５倍、約０．５倍から約１０倍、約０．５倍から約２０倍、約０．５倍から約５０倍、約０．５倍から約１００倍、約０．５倍から約５００倍、約０．５倍から約１，０００倍、約０．５倍から約１０，０００倍、約１倍から約２倍、約１倍から約５倍、約１倍から約１０倍、約１倍から約２０倍、約１倍から約５０倍、約１倍から約１００倍、約１倍から約５００倍、約１倍から約１，０００倍、約１倍から約１０，０００倍、約２倍から約５倍、約２倍から約１０倍、約２倍から約２０倍、約２倍から約５０倍、約２倍から約１００倍、約２倍から約５００倍、約２倍から約１，０００倍、約２倍から約１０，０００倍、約５倍から約１０倍、約５倍から約２０倍、約５倍から約５０倍、約５倍から約１００倍、約５倍から約５００倍、約５倍から約１，０００倍、約５倍から約１０，０００倍、約１０倍から約２０倍、約１０倍から約５０倍、約１０倍から約１００倍、約１０倍から約５００倍、約１０倍から約１，０００倍、約１０倍から約１０，０００倍、約２０倍から約５０倍、約２０倍から約１００倍、約２０倍から約５００倍、約２０倍から約１，０００倍、約２０倍から約１０，０００倍、約５０倍から約１００倍、約５０倍から約５００倍、約５０倍から約１，０００倍、約５０倍から約１０，０００倍、約１００倍から約５００倍、約１００倍から約１，０００倍、約１００倍から約１０，０００倍、約５００倍から約１，０００倍、約５００倍から約１０，０００倍、または約１，０００倍から約１０，０００倍増加させる。いくつかの実施形態では、系は、逆ｃＡＭＰを少なくとも約０．１倍、約０．５倍、約１倍、約２倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、約１，０００倍、または約１０，０００倍増加させる。いくつかの実施形態では、系は、逆ｃＡＭＰを少なくとも約０．１倍、約０．５倍、約１倍、約２倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、または約１，０００倍増加させる。いくつかの実施形態では、系は、逆ｃＡＭＰを少なくとも最大約０．５倍、約１倍、約２倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、約１，０００倍、または約１０，０００倍増加させる。
いくつかの実施形態では、系を含まない細胞におけるＧＰＣＲ活性とバックグラウンドとの間の測定可能な比と比較して、系を含む細胞におけるＧＰＣＲ活性の測定中にＧＰＣＲ活性とバックグラウンドとの間の測定可能な比を増加させる。いくつかの実施形態では、系は、細胞におけるＧＰＣＲ活性とバックグラウンドとの間の測定可能な比を少なくとも約０．１倍から約１０，０００倍増加させる。いくつかの実施形態では、系は、細胞におけるＧＰＣＲ活性とバックグラウンドとの間の測定可能な比を少なくとも約０．１倍から約０．５倍、約０．１倍から約１倍、約０．１倍から約２倍、約０．１倍から約５倍、約０．１倍から約１０倍、約０．１倍から約２０倍、約０．１倍から約５０倍、約０．１倍から約１００倍、約０．１倍から約５００倍、約０．１倍から約１，０００倍、約０．１倍から約１０，０００倍、約０．５倍から約１倍、約０．５倍から約２倍、約０．５倍から約５倍、約０．５倍から約１０倍、約０．５倍から約２０倍、約０．５倍から約５０倍、約０．５倍から約１００倍、約０．５倍から約５００倍、約０．５倍から約１，０００倍、約０．５倍から約１０，０００倍、約１倍から約２倍、約１倍から約５倍、約１倍から約１０倍、約１倍から約２０倍、約１倍から約５０倍、約１倍から約１００倍、約１倍から約５００倍、約１倍から約１，０００倍、約１倍から約１０，０００倍、約２倍から約５倍、約２倍から約１０倍、約２倍から約２０倍、約２倍から約５０倍、約２倍から約１００倍、約２倍から約５００倍、約２倍から約１，０００倍、約２倍から約１０，０００倍、約５倍から約１０倍、約５倍から約２０倍、約５倍から約５０倍、約５倍から約１００倍、約５倍から約５００倍、約５倍から約１，０００倍、約５倍から約１０，０００倍、約１０倍から約２０倍、約１０倍から約５０倍、約１０倍から約１００倍、約１０倍から約５００倍、約１０倍から約１，０００倍、約１０倍から約１０，０００倍、約２０倍から約５０倍、約２０倍から約１００倍、約２０倍から約５００倍、約２０倍から約１，０００倍、約２０倍から約１０，０００倍、約５０倍から約１００倍、約５０倍から約５００倍、約５０倍から約１，０００倍、約５０倍から約１０，０００倍、約１００倍から約５００倍、約１００倍から約１，０００倍、約１００倍から約１０，０００倍、約５００倍から約１，０００倍、約５００倍から約１０，０００倍、または約１，０００倍から約１０，０００倍増加させる。いくつかの実施形態では、系は、細胞におけるＧＰＣＲ活性とバックグラウンドとの比を少なくとも約０．１倍、約０．５倍、約１倍、約２倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、約１，０００倍、または約１０，０００倍増加させる。いくつかの実施形態では、系は、細胞におけるＧＰＣＲ活性とバックグラウンドとの比を少なくとも約０．１倍、約０．５倍、約１倍、約２倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、または約１，０００倍増加させる。いくつかの実施形態では、系は、細胞におけるＧＰＣＲ活性とバックグラウンドとの比を少なくとも最大約０．５倍、約１倍、約２倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、約１，０００倍、または約１０，０００倍増加させる。
いくつかの実施形態では、系は、系を含まない細胞におけるバックグラウンドと比較して、系を含む細胞におけるＧＰＣＲ活性の測定中にバックグラウンドを減少させる。いくつかの実施形態では、系を含む細胞におけるバックグラウンドは、ＧＰＣＲ活性の測定中に少なくとも約０．１倍から約１０，０００倍減少する。いくつかの実施形態では、系を含む細胞におけるバックグラウンドは、ＧＰＣＲ活性の測定中に少なくとも約０．１倍から約０．５倍、約０．１倍から約１倍、約０．１倍から約２倍、約０．１倍から約５倍、約０．１倍から約１０倍、約０．１倍から約２０倍、約０．１倍から約５０倍、約０．１倍から約１００倍、約０．１倍から約５００倍、約０．１倍から約１，０００倍、約０．１倍から約１０，０００倍、約０．５倍から約１倍、約０．５倍から約２倍、約０．５倍から約５倍、約０．５倍から約１０倍、約０．５倍から約２０倍、約０．５倍から約５０倍、約０．５倍から約１００倍、約０．５倍から約５００倍、約０．５倍から約１，０００倍、約０．５倍から約１０，０００倍、約１倍から約２倍、約１倍から約５倍、約１倍から約１０倍、約１倍から約２０倍、約１倍から約５０倍、約１倍から約１００倍、約１倍から約５００倍、約１倍から約１，０００倍、約１倍から約１０，０００倍、約２倍から約５倍、約２倍から約１０倍、約２倍から約２０倍、約２倍から約５０倍、約２倍から約１００倍、約２倍から約５００倍、約２倍から約１，０００倍、約２倍から約１０，０００倍、約５倍から約１０倍、約５倍から約２０倍、約５倍から約５０倍、約５倍から約１００倍、約５倍から約５００倍、約５倍から約１，０００倍、約５倍から約１０，０００倍、約１０倍から約２０倍、約１０倍から約５０倍、約１０倍から約１００倍、約１０倍から約５００倍、約１０倍から約１，０００倍、約１０倍から約１０，０００倍、約２０倍から約５０倍、約２０倍から約１００倍、約２０倍から約５００倍、約２０倍から約１，０００倍、約２０倍から約１０，０００倍、約５０倍から約１００倍、約５０倍から約５００倍、約５０倍から約１，０００倍、約５０倍から約１０，０００倍、約１００倍から約５００倍、約１００倍から約１，０００倍、約１００倍から約１０，０００倍、約５００倍から約１，０００倍、約５００倍から約１０，０００倍、または約１，０００倍から約１０，０００倍減少する。いくつかの実施形態では、系を含む細胞におけるバックグラウンドは、ＧＰＣＲ活性の測定中に少なくとも約０．１倍、約０．５倍、約１倍、約２倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、約１，０００倍、または約１０，０００倍減少する。いくつかの実施形態では、系を含む細胞におけるバックグラウンドは、ＧＰＣＲ活性の測定中に少なくとも約０．１倍、約０．５倍、約１倍、約２倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、または約１，０００倍減少する。いくつかの実施形態では、系を含む細胞におけるバックグラウンドは、ＧＰＣＲ活性の測定中に少なくとも最大約０．５倍、約１倍、約２倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、約１，０００倍、または約１０，０００倍減少する。
いくつかの実施形態では、系は、系を含まない細胞におけるＧＰＣＲ活性の測定値の測定可能な変動係数と比較して、系を含む細胞におけるＧＰＣＲ活性の測定値の測定可能な変動係数を減少させる。いくつかの実施形態では、系は、細胞におけるＧＰＣＲ活性の測定値の測定可能な変動係数を少なくとも約０．１倍から約１０，０００倍減少させる。いくつかの実施形態では、系は、細胞におけるＧＰＣＲ活性の測定値の測定可能な変動係数を少なくとも約０．１倍から約０．５倍、約０．１倍から約１倍、約０．１倍から約２倍、約０．１倍から約５倍、約０．１倍から約１０倍、約０．１倍から約２０倍、約０．１倍から約５０倍、約０．１倍から約１００倍、約０．１倍から約５００倍、約０．１倍から約１，０００倍、約０．１倍から約１０，０００倍、約０．５倍から約１倍、約０．５倍から約２倍、約０．５倍から約５倍、約０．５倍から約１０倍、約０．５倍から約２０倍、約０．５倍から約５０倍、約０．５倍から約１００倍、約０．５倍から約５００倍、約０．５倍から約１，０００倍、約０．５倍から約１０，０００倍、約１倍から約２倍、約１倍から約５倍、約１倍から約１０倍、約１倍から約２０倍、約１倍から約５０倍、約１倍から約１００倍、約１倍から約５００倍、約１倍から約１，０００倍、約１倍から約１０，０００倍、約２倍から約５倍、約２倍から約１０倍、約２倍から約２０倍、約２倍から約５０倍、約２倍から約１００倍、約２倍から約５００倍、約２倍から約１，０００倍、約２倍から約１０，０００倍、約５倍から約１０倍、約５倍から約２０倍、約５倍から約５０倍、約５倍から約１００倍、約５倍から約５００倍、約５倍から約１，０００倍、約５倍から約１０，０００倍、約１０倍から約２０倍、約１０倍から約５０倍、約１０倍から約１００倍、約１０倍から約５００倍、約１０倍から約１，０００倍、約１０倍から約１０，０００倍、約２０倍から約５０倍、約２０倍から約１００倍、約２０倍から約５００倍、約２０倍から約１，０００倍、約２０倍から約１０，０００倍、約５０倍から約１００倍、約５０倍から約５００倍、約５０倍から約１，０００倍、約５０倍から約１０，０００倍、約１００倍から約５００倍、約１００倍から約１，０００倍、約１００倍から約１０，０００倍、約５００倍から約１，０００倍、約５００倍から約１０，０００倍、または約１，０００倍から約１０，０００倍減少させる。いくつかの実施形態では、系は、細胞におけるＧＰＣＲ活性の測定値の測定可能な変動係数を少なくとも約０．１倍、約０．５倍、約１倍、約２倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、約１，０００倍、または約１０，０００倍減少させる。いくつかの実施形態では、系は、細胞におけるＧＰＣＲ活性の測定値の測定可能な変動係数を少なくとも約０．１倍、約０．５倍、約１倍、約２倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、または約１，０００倍減少させる。いくつかの実施形態では、系は、細胞におけるＧＰＣＲ活性の測定値の測定可能な変動係数を少なくとも最大約０．５倍、約１倍、約２倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、約１，０００倍、または約１０，０００倍減少させる。
いくつかの実施形態では、系は、系を含まない細胞におけるＧＰＣＲ活性の測定値の測定可能な偽陽性と比較して、系を含む細胞におけるＧＰＣＲ活性の測定値の測定可能な偽陽性を減少させる。いくつかの実施形態では、系は、細胞におけるＧＰＣＲ活性の測定値の測定可能な偽陽性を少なくとも約０．１倍から約１０，０００倍減少させる。いくつかの実施形態では、系は、細胞におけるＧＰＣＲ活性の測定値の測定可能な偽陽性を少なくとも約０．１倍から約０．５倍、約０．１倍から約１倍、約０．１倍から約２倍、約０．１倍から約５倍、約０．１倍から約１０倍、約０．１倍から約２０倍、約０．１倍から約５０倍、約０．１倍から約１００倍、約０．１倍から約５００倍、約０．１倍から約１，０００倍、約０．１倍から約１０，０００倍、約０．５倍から約１倍、約０．５倍から約２倍、約０．５倍から約５倍、約０．５倍から約１０倍、約０．５倍から約２０倍、約０．５倍から約５０倍、約０．５倍から約１００倍、約０．５倍から約５００倍、約０．５倍から約１，０００倍、約０．５倍から約１０，０００倍、約１倍から約２倍、約１倍から約５倍、約１倍から約１０倍、約１倍から約２０倍、約１倍から約５０倍、約１倍から約１００倍、約１倍から約５００倍、約１倍から約１，０００倍、約１倍から約１０，０００倍、約２倍から約５倍、約２倍から約１０倍、約２倍から約２０倍、約２倍から約５０倍、約２倍から約１００倍、約２倍から約５００倍、約２倍から約１，０００倍、約２倍から約１０，０００倍、約５倍から約１０倍、約５倍から約２０倍、約５倍から約５０倍、約５倍から約１００倍、約５倍から約５００倍、約５倍から約１，０００倍、約５倍から約１０，０００倍、約１０倍から約２０倍、約１０倍から約５０倍、約１０倍から約１００倍、約１０倍から約５００倍、約１０倍から約１，０００倍、約１０倍から約１０，０００倍、約２０倍から約５０倍、約２０倍から約１００倍、約２０倍から約５００倍、約２０倍から約１，０００倍、約２０倍から約１０，０００倍、約５０倍から約１００倍、約５０倍から約５００倍、約５０倍から約１，０００倍、約５０倍から約１０，０００倍、約１００倍から約５００倍、約１００倍から約１，０００倍、約１００倍から約１０，０００倍、約５００倍から約１，０００倍、約５００倍から約１０，０００倍、または約１，０００倍から約１０，０００倍減少させる。いくつかの実施形態では、系は、細胞におけるＧＰＣＲ活性の測定値の偽陽性を少なくとも約０．１倍、約０．５倍、約１倍、約２倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、約１，０００倍、または約１０，０００倍減少させる。いくつかの実施形態では、系は、細胞におけるＧＰＣＲ活性の測定値の偽陽性を少なくとも約０．１倍、約０．５倍、約１倍、約２倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、または約１，０００倍減少させる。いくつかの実施形態では、系は、細胞におけるＧＰＣＲ活性の測定値の偽陽性を少なくとも最大約０．５倍、約１倍、約２倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、約１，０００倍、または約１０，０００倍減少させる。
いくつかの実施形態では、系は、系を含まない細胞におけるＧＰＣＲ活性の測定値の測定可能な偽陰性と比較して、系を含む細胞におけるＧＰＣＲ活性の測定値の測定可能な偽陰性を減少させる。いくつかの実施形態では、系は、細胞におけるＧＰＣＲ活性の測定値の測定可能な偽陰性を少なくとも約０．１倍から約１０，０００倍減少させる。いくつかの実施形態では、系は、細胞におけるＧＰＣＲ活性の測定値の測定可能な偽陰性を少なくとも約０．１倍から約０．５倍、約０．１倍から約１倍、約０．１倍から約２倍、約０．１倍から約５倍、約０．１倍から約１０倍、約０．１倍から約２０倍、約０．１倍から約５０倍、約０．１倍から約１００倍、約０．１倍から約５００倍、約０．１倍から約１，０００倍、約０．１倍から約１０，０００倍、約０．５倍から約１倍、約０．５倍から約２倍、約０．５倍から約５倍、約０．５倍から約１０倍、約０．５倍から約２０倍、約０．５倍から約５０倍、約０．５倍から約１００倍、約０．５倍から約５００倍、約０．５倍から約１，０００倍、約０．５倍から約１０，０００倍、約１倍から約２倍、約１倍から約５倍、約１倍から約１０倍、約１倍から約２０倍、約１倍から約５０倍、約１倍から約１００倍、約１倍から約５００倍、約１倍から約１，０００倍、約１倍から約１０，０００倍、約２倍から約５倍、約２倍から約１０倍、約２倍から約２０倍、約２倍から約５０倍、約２倍から約１００倍、約２倍から約５００倍、約２倍から約１，０００倍、約２倍から約１０，０００倍、約５倍から約１０倍、約５倍から約２０倍、約５倍から約５０倍、約５倍から約１００倍、約５倍から約５００倍、約５倍から約１，０００倍、約５倍から約１０，０００倍、約１０倍から約２０倍、約１０倍から約５０倍、約１０倍から約１００倍、約１０倍から約５００倍、約１０倍から約１，０００倍、約１０倍から約１０，０００倍、約２０倍から約５０倍、約２０倍から約１００倍、約２０倍から約５００倍、約２０倍から約１，０００倍、約２０倍から約１０，０００倍、約５０倍から約１００倍、約５０倍から約５００倍、約５０倍から約１，０００倍、約５０倍から約１０，０００倍、約１００倍から約５００倍、約１００倍から約１，０００倍、約１００倍から約１０，０００倍、約５００倍から約１，０００倍、約５００倍から約１０，０００倍、または約１，０００倍から約１０，０００倍減少させる。いくつかの実施形態では、系は、細胞におけるＧＰＣＲ活性の測定値の偽陰性を少なくとも約０．１倍、約０．５倍、約１倍、約２倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、約１，０００倍、または約１０，０００倍減少させる。いくつかの実施形態では、系は、細胞におけるＧＰＣＲ活性の測定値の偽陰性を少なくとも約０．１倍、約０．５倍、約１倍、約２倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、または約１，０００倍減少させる。いくつかの実施形態では、系は、細胞におけるＧＰＣＲ活性の測定値の偽陰性を少なくとも最大約０．５倍、約１倍、約２倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、約１，０００倍、または約１０，０００倍減少させる。
応答エレメント調節プロモーター
応答エレメントは、特定の転写因子に結合して遺伝子の転写を調節できる、遺伝子プロモーター領域中にあるＤＮＡの短い配列である。ある特定の応答エレメントは、ある特定のプロモーターに特異的である。いくつかの応答エレメントは、内因性の転写因子によって結合可能である。同じ応答エレメントの複数のコピーは、ヌクレオチド配列の異なる部分に位置し、同じ刺激に応答して異なる遺伝子を活性化できる。本明細書に記載の系に取り込まれる応答エレメントの非限定的な例には、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）、Ｂ認識エレメント、ＡｈＲ応答エレメント、ダイオキシン応答エレメントまたは異物応答エレメント、ＨＩＦ応答エレメント、ホルモン応答エレメント、血清応答エレメント、レチノイン酸応答エレメント、ペルオキシソーム増殖因子ホルモン応答エレメント、金属応答エレメント、ＤＮＡ損傷応答エレメント、ＩＦＮ刺激応答エレメント、ＲＯＲ応答エレメント、グルココルチコイド応答エレメント、カルシウム応答エレメントＣａＲＥ１、抗酸化剤応答エレメント、ｐ５３応答エレメント、甲状腺ホルモン応答エレメント、成長ホルモン応答エレメント、ステロール応答エレメント、ポリコーム応答エレメント、およびビタミンＤ応答エレメントが挙げられる。
応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列は、遺伝子の転写を調節するためにプロモーターおよび他の分子の補充を補助する１つまたは複数の応答エレメントを含有する、核酸の領域である。細胞は、遺伝子の転写を調整するために内因性のタンパク質を利用する多数の応答エレメント調節ヌクレオチド配列を含有する。内因性の応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列がレポーターの転写を直接調節する状況では、内因性のプロモーターの存在により、高いレベルのバックグラウンドシグナルが存在する。系を含有する細胞に内在していない転写因子によってレポーターの転写を調節する系は、内因性の転写因子によってレポーターの転写を調節する系に比べて利点を有する。係る系の利点の１つは、レポーターによるバックグラウンド生成が低いことである。
レポーター
レポーター核酸は、ＧＰＣＲ活性に関連する転写因子（例えば、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）結合タンパク質）によって結合できる調節エレメントと、レポーターをコードするヌクレオチド配列とを最低限含む。レポーターをコードするヌクレオチド配列は、ＧＰＣＲ活性に関連する転写因子によって結合できる調節エレメントの下流にある。ＧＰＣＲ活性に関連する転写因子は、レポーターの発現を調節する。
ある特定の実施形態では、レポーターをコードするヌクレオチド配列は、レポーター遺伝子を含む。ある特定の実施形態では、レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼタンパク質、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、および分泌型胎盤アルカリホスファターゼから選択されるレポーターをコードする。これらのレポータータンパク質は、特定の酵素活性についてアッセイすることができるか、あるいは蛍光レポーターの場合は、蛍光発光についてアッセイすることができる。ある特定の実施形態では、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、またはシアン色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）を含む。
ある特定の実施形態では、レポーター遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、固有の配列識別子（ＵＭＩ）をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ＵＭＩは、試験ポリペプチドに特有であり、試験ポリペプチドは、レポーター核酸によってコードされる。概して、ＵＭＩは、８ヌクレオチド長と２０ヌクレオチド長の間であるが、それを超える長さであってもよい。ある特定の実施形態では、ＵＭＩは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド長以上である。ある特定の実施形態では、ＵＭＩは、８ヌクレオチド長である。ある特定の実施形態では、ＵＭＩは、９ヌクレオチド長である。ある特定の実施形態では、ＵＭＩは、１０ヌクレオチド長である。ある特定の実施形態では、ＵＭＩは、１１ヌクレオチド長である。ある特定の実施形態では、ＵＭＩは、１２ヌクレオチド長である。ある特定の実施形態では、ＵＭＩは、１３ヌクレオチド長である。ある特定の実施形態では、ＵＭＩは、１４ヌクレオチド長である。ある特定の実施形態では、ＵＭＩは、１５ヌクレオチド長である。ある特定の実施形態では、ＵＭＩは、１６ヌクレオチド長である。ある特定の実施形態では、ＵＭＩは、１７ヌクレオチド長である。ある特定の実施形態では、ＵＭＩは、１８ヌクレオチド長である。ある特定の実施形態では、ＵＭＩは、１９ヌクレオチド長である。ある特定の実施形態では、ＵＭＩは、２０ヌクレオチド長である。ある特定の実施形態では、ＵＭＩは、２０ヌクレオチド長を超える。
本明細書に記載の系は、ＧＰＣＲ活性に関連する転写因子（例えば、ＣＲＥＢ）との結合によってレポーター遺伝子の活性化を制御する多数の異なる調節配列を利用することができる。調節配列は、ＧＰＣＲ活性に関連する転写因子によって結合できるものである。概して、調節配列は、ＵＭＩ、レポーター遺伝子、あるいはその両方の５’であるように構成される。ある特定の実施形態では、調節配列は、ＧＰＣＲ活性に関連する転写因子によって結合することができるＧａｌ４－、ＰＰＲ１－、またはＬｅｘＡ－ＵＡＳを含む。
ある特定の実施形態では、レポーターは、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼタンパク質、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、または分泌型胎盤アルカリホスファターゼと、ＵＭＩとを含む。ある特定の実施形態では、ＵＭＩは、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼタンパク質、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、または分泌型胎盤アルカリホスファターゼのレポーター核酸の５’にコードされる。ある特定の実施形態では、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼタンパク質、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、または分泌型胎盤アルカリホスファターゼをコードするヌクレオチド配列は、ＵＭＩの５’である。
ＵＭＩの転写は、特定の系とレポーターの関連性を示すので、ＵＭＩによって、同じアッセイ内で異なる系の多重化が可能になる。ＵＭＩは、同じアッセイ内で異なる系の多重決定が可能になるように十分な多様性が可能な任意の長さであってもよい。長さは、少なくとも１００、５００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、または１０，０００の標的を分化させるのに十分でなければならない。ある特定の実施形態では、異なる系は、異なる細胞に存在する。ある特定の実施形態では、異なる系は、同じ細胞に存在する。レポーターエレメントは、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、あるいはその両方をさらに含んでもよい。ＵＴＲは、レポーターエレメントとは異種であってもよい。
レポーター活性化
レポーター分子の活性化は、ルシフェラーゼタンパク質、β－ガラクトシダーゼタンパク質、β－グルクロニダーゼタンパク質、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼタンパク質、分泌型胎盤アルカリホスファターゼタンパク質を検出するために標準的なアッセイを使用して決定できる。概して、基質に対するタンパク質酵素活性に基づいて検出可能なシグナルが産生される酵素アッセイがある。例えば、ルシフェラーゼ発現は、ルシフェラーゼ基質が存在するときはルミノメーターによって測定できる。蛍光レポーターは、基質を必要とせず、シグナルは、蛍光顕微鏡法または蛍光プレートリーダーによって測定できる。蛍光レポーターは、生細胞におけるレポーターの活性化を測定するのに特に有用である。
いくつかの実施形態では、レポーター分子は、インデックス配列またはバーコード配列とも称される固有の分子識別子（ＵＭＩ）などの固有のＲＮＡ配列を含む。レポーター活性化は、固有のＲＮＡ配列の配列決定を可能にするいずれかの好適な方法で、好ましくは、マルチプレックス法で配列決定を可能にする方法で測定できる。係る方法には、２４時間の間に少なくとも約１００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、または１００，０００，０００のＤＮＡまたはＲＮＡ塩基に関する情報を生成することができるスループットの高い配列決定方法が挙げられる。ある特定の実施形態では、次世代シーケンシング技術は、固有のＲＮＡ配列の配列を決定するために使用される。次世代シーケンシングは、パイロシーケンシング、合成によるシーケンシング、１分子シーケンシング、第２世代シーケンシング、ナノポアシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、またはハイブリダイゼーションによるシーケンシングなどの多数の種類のシーケンシングを包含する。次世代シーケンシングプラットフォームには、ｌｌｌｕｍｉｎａ社（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）およびＨｅｌｉｃｏｓ社（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、すなわち「ＤＧＥ」）市販のものが含まれる。次世代シーケンシング法には、（１）Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ（２００５年）４３７巻：３７６～３８０頁（２００５年）、ならびに米国特許第７，２４４，５５９号、第７，３３５，７６２号、第７，２１１，３９０号、第７，２４４，５６７号、第７，２６４，９２９号、第７，３２３，３０５号に記載の方法および機器が含まれるがこれらに限らない４５４／Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ、（２）米国特許仮出願第１１／１６７０４６号、ならびに米国特許第７５０１２４５号、第７４９１４９８号、第７，２７６，７２０号、ならびに米国特許出願公開第２００９００６１４３９号、第２００８００８７８２６号、第２００６０２８６５６６号、第２００６００２４７１１号、第２００６００２４６７８号、第２００８０２１３７７０号および第２００８０１０３０５８号に記載されるようなＨｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）、（３）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（例えばＳＯＬｉＤシーケンシング）、（４）Ｄｏｖｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ（例えばＰｏｌｏｎａｔｏｒ Ｇ．００７シーケンシング）、（５）米国特許第５，７５０，３４１号、第６，３０６，５９７号、および第５，９６９，１１９号に記載されるようなｌｌｌｕｍｉｎａ， Ｉｎｃ．、ならびに（６）米国特許第７，４６２，４５２号、第７，４７６，５０４号、第７，４０５，２８１号、第７，１７０，０５０号、第７，４６２，４６８号、第７，４７６，５０３号、第７，３１５，０１９号、第７，３０２，１４６号、第７，３１３，３０８号、ならびに、米国特許出願公開第２００９００２９３８５号、第２００９００６８６５５号、第２００９００２４３３１号、および第２００８０２０６７６４号に記載されるようなＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって市販のものが含まれるが、これらに限らない。係る方法および機器は、例としてここに提示されているが、限定するように意図されていない。
細胞
本明細書に記載の系および方法に有用な細胞は、概して、本明細書に記載の１つまたは複数の核酸を容易に形質導入することができるものである。調節エレメント、エフェクター、および／またはレポーターエレメントをコードする系の核酸は、リン酸カルシウムトランスフェクション、脂肪系トランスフェクション（例えばＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－２０００（商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－３０００（商標）、またはＦｕｇｅｎｅ（登録商標）ＨＤ）、エレクトロポレーション、またはウイルス形質導入などの当技術分野において既知の方法を使用して好適な細胞株にトランスフェクトまたは形質導入することができる。細胞はまた、適切な組織培養容器でコンフルエントまたはほぼコンフルエントになるまで増殖させられた同じ種類の細胞集団であってもよい。
ある特定の実施形態では、本明細書で使用される細胞は、調節エレメントをコードする核酸、エフェクターをコードする核酸、レポーターエレメントを含む核酸、あるいはそれらの組合せのいずれかの安定した組み込みを含む。安定した細胞株は、直鎖状プラスミドの無作為組み込み、ウイルス組み込み、あるいはトランスポゾン指向型組み込み、または指向型組み込みを使用して、例えば、ＡｔｔＰとＡｔｔＢとの部位間での部位特異的組み換えを使用して、本明細書に記載の細胞から生成することができる。ある特定の実施形態では、核酸のいずれかは、ＡＡＶＳ１部位などの安全な着地部位に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞は、細胞のゲノムに安定的に組み込まれた核酸を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞は、細胞のゲノムに安定的に組み込まれた、調節エレメントをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞は、細胞のゲノムに安定的に組み込まれた、本明細書に記載の少なくとも１つのエフェクターをコードする核酸を含む。場合によっては、エフェクターは、ＧＰＣＲエフェクターである。場合によっては、ＧＰＣＲエフェクターは、ＡＤＣＹ１、ＡＤＣＹ２、ＡＤＣＹ３、ＡＤＣＹ４、ＡＤＣＹ５、ＡＤＣＹ６、ＡＤＣＹ７、ＡＤＣＹ８、ＡＤＣＹ９、またはＡＤＣＹ１０の群より選択されるアデニリルシクラーゼである。いくつかの実施形態では、細胞は、エフェクターの発現を調整するための調節エレメントをコードする、安定的に組み込まれた核酸を含む。場合によっては、細胞は、本明細書に記載のエフェクターを上方制御するための調節エレメントをコードする、安定的に組み込まれた核酸を含む。場合によっては、細胞は、ＡＤＣＹ６を上方制御するための調節エレメントをコードする、安定的に組み込まれた核酸を含む。場合によっては、細胞は、ＡＤＣＹ６をコードする、安定的に組み込まれた核酸を含む。場合によっては、細胞は、本明細書に記載のエフェクターを下方制御するための調節エレメントをコードする、安定的に組み込まれた核酸を含む。場合によっては、細胞は、ＡＤＣＹ３を下方制御するための調節エレメントをコードする、安定的に組み込まれた核酸を含む。
ある特定の実施形態では、系で使用される細胞または細胞集団は、真核細胞である。ある特定の実施形態では、細胞または細胞集団は、哺乳動物細胞である。ある特定の実施形態では、細胞または細胞集団は、ヒト細胞である。ある特定の実施形態では、細胞または細胞集団は、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ（ヒト神経芽細胞癌）、Ｈｅｐ Ｇ２（ヒト白色人肝細胞癌）、２９３（ＨＥＫ ２９３としても知られる）（ヒト胎児腎）、ＲＡＷ ２６４．７（マウス単球マクロファージ）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸部類上皮癌）、ＭＲＣ－５（ＰＤ １９）（ヒト胎児肺）、Ａ２７８０（ヒト卵巣癌）、ＣＡＣＯ－２（ヒト白色人結腸腺癌）、ＴＨＰ １（ヒト単球性白血病）、Ａ５４９（ヒト白色人肺癌）、ＭＲＣ－５（ＰＤ ３０）（ヒト胎児肺）、ＭＣＦ７（ヒト白色人乳腺癌）、ＳＮＬ ７６／７（マウス細胞株ＳＩＭ胚線維芽細胞）、Ｃ２Ｃ１２（マウスＣ３Ｈ筋芽細胞）、Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１（ヒト白血病性Ｔ細胞リンパ芽球）、Ｕ９３７（ヒト白色人組織球性リンパ腫）、Ｌ９２９（マウスＣ３Ｈ／Ａｎ結合組織）、３Ｔ３ Ｌ１（マウス胚）、ＨＬ６０（ヒト白色人骨髄性白血病）、ＰＣ－１２（ラット副腎褐色細胞腫）、ＨＴ２９（ヒト白色人結腸腺癌）、ＯＥ３３（ヒト白色人食道癌）、ＯＥ１９（ヒト白色人食道癌）、ＮＩＨ ３Ｔ３（マウススイスＮＩＨ胚）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ヒト白色人乳腺癌）、Ｋ５６２（ヒト白色人慢性骨髄性白血病）、Ｕ－８７ ＭＧ（ヒト膠芽腫星細胞腫）、ＭＲＣ－５（ＰＤ ２５）（ヒト胎児肺）、Ａ２７８０ｃｉｓ（ヒト卵巣癌）、Ｂ９（マウスＢ細胞ハイブリドーマ）、ＣＨＯ－Ｋ１、Ｕ２ＯＳ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＭＤＣＫ（コッカースパニエルイヌ腎臓）、１３２１Ｎ１（ヒト脳星状細胞腫）、Ａ４３１（ヒト扁平上皮癌）、ＡＴＤＣ５（マウス１２９奇形癌ＡＴ８０５由来）、ＲＣＣ４ ＰＬＵＳ ＶＥＣＴＯＲ ＡＬＯＮＥ（ネオマイシン耐性を付与する空の発現ベクター、ｐｃＤＮＡ３で安定的にトランスフェクトさせた腎細胞癌細胞株ＲＣＣ４）、ＨＵＶＥＣ（Ｓ２００－０５ｎ）（プレスクリーニングされたヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ））、新生児、Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザル腎臓）、ＲＣＣ４ ＰＬＵＳ ＶＨＬ（ｐｃＤＮＡ３－ＶＨＬで安定的にトランスフェクトさせた腎細胞癌細胞株ＲＣＣ４）、Ｆａｏ（ラット肝細胞癌）、Ｊ７７４Ａ．１（マウスＢＡＬＢ／ｃ単球マクロファージ）、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１（マウスＣ５７ＢＬ／６頭蓋冠）、Ｊ７７４．２（マウスＢＡＬＢ／ｃ単球マクロファージ）、ＰＮＴ１Ａ（ＳＶ４０で不死化させた思春期後のヒト正常前立腺）、Ｕ－２ ＯＳ（ヒト骨肉腫）、ＨＣＴ １１６（ヒト大腸癌）、ＭＡ１０４（アフリカミドリザル腎臓）、ＢＥＡＳ－２Ｂ（ヒト正常気管支上皮）、ＮＢ２－１１（ラットリンパ腫）、ＢＨＫ ２１（クローン１３）（シリアンハムスター腎臓）、ＮＳ０（マウス骨髄腫）、Ｎｅｕｒｏ ２ａ（アルビノマウス神経芽細胞腫）、ＳＰ２／０－Ａｇ１４、マウス×マウス非産生性骨髄腫、Ｔ４７Ｄ（ヒト乳腫瘍）、１３０１（ヒトＴ細胞白血病）、ＭＤＣＫ－ＩＩ（コッカースパニエルイヌ腎臓）、ＰＮＴ２（ＳＶ４０で不死化させたヒト正常前立腺）、ＰＣ－３（ヒト白色人前立腺癌）、ＴＦ１（ヒト赤白血病）、ＣＯＳ－７（ＳＶ４０で形質転換させたアフリカミドリザル腎臓）、ＭＤＣＫ（コッカースパニエルイヌ腎臓）、ＨＵＶＥＣ（２００－０５ｎ）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、新生児、ＮＣＩ－Ｈ３２２（ヒト白色人細気管支肺胞癌）、ＳＫ．Ｎ．ＳＨ（ヒト白色人神経芽細胞腫）、ＬＮＣａＰ．ＦＧＣ（ヒト白色人前立腺癌）、ＯＥ２１（ヒト白色人食道扁平上皮癌）、ＰＳＮ１（ヒト膵臓腺癌）、ＩＳＨＩＫＡＷＡ（ヒトアジア人子宮内膜線癌）、ＭＦＥ－２８０（ヒト白色人子宮内膜腺癌）、ＭＧ－６３（ヒト骨肉腫）、ＲＫ １３（ＢＶＤＶ陰性ウサギ腎臓）、ＥｏＬ－１細胞（ヒト好酸球性白血病）、ＶＣａＰ（ヒト前立腺癌転移）、ｔｓＡ２０１（ＳＶ４０で形質転換させたヒト胚腎臓）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＨＴ １０８０（ヒト線維肉腫）、ＰＡＮＣ－１（ヒト白色人膵臓）、Ｓａｏｓ－２（ヒト原発性骨原性肉腫）、線維芽細胞増殖培地（１１６Ｋ－５００）、線維芽細胞増殖培地キット、ＮＤ７／２３（マウス神経芽細胞腫×ラットニューロンハイブリッド）、ＳＫ－ＯＶ－３（ヒト白色人卵巣腺癌）、ＣＯＶ４３４（ヒト卵巣顆粒膜腫瘍）、Ｈｅｐ ３Ｂ（ヒト肝細胞癌）、Ｖｅｒｏ（ＷＨＯ）（アフリカミドリザル腎臓）、Ｎｔｈｙ－ｏｒｉ ３－１（ヒト甲状腺濾胞上皮、Ｕ３７３ ＭＧ（ウプサラ）（ヒト膠芽腫星細胞腫）、Ａ３７５（ヒト悪性黒色腫）、ＡＧＳ（ヒト白色人胃腺癌）、ＣＡＫＩ ２（ヒト白色人腎細胞癌）、ＣＯＬＯ ２０５（ヒト白色人結腸腺癌）、ＣＯＲ－Ｌ２３（ヒト白色人肺大細胞癌）、ＩＭＲ ３２（ヒト白色人神経芽細胞腫）、ＱＴ ３５（日本ウズラ線維肉腫）、ＷＩ ３８（ヒト白色人胎児肺）、ＨＭＶＩＩ（ヒト膣悪性黒色腫）、ＨＴ５５（ヒト大腸癌）、ＴＫ６（ヒトリンパ芽球、チミジンキナーゼヘテロ接合体）、ＳＰ２／０－ＡＧ１４（ＡＣＦＲＥＥ）（非分泌性、無血清、動物成分（ＡＣ）不含マウス×マウスハイブリドーマ）、ＡＲ４２Ｊ、またはラット膵外分泌腫瘍、あるいはそれらのいずれかの組合せである。
ある特定の実施形態では、細胞または細胞株は、高い定常レポーター活性を含む。ある特定の実施形態では、高い定常レポーター活性は、レポーターを含まない細胞または細胞株において観察されるレポーター活性のバックグラウンドレベルより少なくとも約５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％大きい。ある特定の実施形態では、高い定常レポーター活性は、本明細書に記載の系を含まない細胞または細胞株において観察されるレポーター活性のバックグラウンドレベルより少なくとも約５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％大きい。係る比較のために、概して、コンパレータとして使用される細胞または細胞株は、系を含む細胞株の親である（例えば、系を含むＨＥＫ２９３対系を含まないＨＥＫ２９３）。
ある特定の実施形態では、細胞または細胞株は、高い定常レポーター活性を含む。ある特定の実施形態では、高い定常レポーター活性は、レポーターを含まない細胞または細胞株において観察されるレポーター活性のレベルであるバックグラウンドより少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３２倍、５０倍、７５倍、１００倍、２００倍、５００倍、７５０倍、１，０００倍、２，０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、または２０，０００倍大きい。ある特定の実施形態では、高い定常レポーター活性は、本明細書に記載の系を含まない細胞または細胞株において観察されるレポーター活性のレベルであるバックグラウンドより少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３２倍、５０倍、７５倍、１００倍、２００倍、５００倍、７５０倍、１，０００倍、２，０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、または２０，０００倍大きい。ある特定の実施形態では、細胞または細胞株は、高い定常レポーター活性を含む。ある特定の実施形態では、高い定常レポーター活性は、レポーターを含まない細胞または細胞株において観察されるレポーター活性のレベルであるバックグラウンドより少なくとも約３０倍大きい。ある特定の実施形態では、高い定常レポーター活性は、本明細書に記載の系を含まない細胞または細胞株において観察されるレポーター活性のレベルであるバックグラウンドより少なくとも約３０倍大きい。係る比較のために、概して、コンパレータとして使用される細胞または細胞株は、系を含む細胞株の親である（例えば、系を含むＨＥＫ２９３対系を含まないＨＥＫ２９３）。
ある特定の実施形態では、細胞または細胞株は、低変動の定常レポーター活性を含む。ある特定の実施形態では、低変動の定常レポーター活性は、生物学的変動係数が約０．６未満のものである。ある特定の実施形態では、低変動の定常レポーター活性は、生物学的変動係数が約０．５未満のものである。ある特定の実施形態では、低変動の定常レポーター活性は、生物学的変動係数が約０．４未満のものである。ある特定の実施形態では、低変動の定常レポーター活性は、生物学的変動係数が約０．３未満のものである。ある特定の実施形態では、低変動の定常レポーター活性は、生物学的変動係数が約０．２未満のものである。ある特定の実施形態では、低変動の定常レポーター活性は、生物学的変動係数が約０．１未満のものである。
ＧＰＣＲ活性を測定するための方法
本明細書に記載の系は、ＧＰＣＲ活性を測定するための様々な方法を使用して有効に利用することができる。この系は、定常状態のときと、物理的または化学的刺激に応答するときの両方で、細胞シグナル伝達経路のＧＰＣＲ活性を測定する方法において有用である。レポーターエレメントが特定のレポーターエレメントに結合するＵＭＩ配列を含む場合、系は、多重アッセイで展開することができる。
非限定的かつ例示的な一例では、複数の細胞は、マルチウェルプレートの１つのウェル内でインキュベートされる。複数の細胞は、本明細書に記載の核酸のうちの少なくとも１つでトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載の調節エレメントをコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載のエフェクターをコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載のレポーターをコードする。次いで、トランスフェクトされた細胞は、ＧＰＣＲに対するリガンドと接触させられる。レポーターが発現するのに十分な時間が経過した後、細胞溶解物が採取され、レポーター遺伝子の活性化が測定される。この例では、レポーター遺伝子の存在の増加は、リガンドがＧＰＣＲと結合または複合体形成して、ＧＰＣＲ活性の増加を引き起こしていることを示す。場合によっては、レポーター遺伝子の存在の増加は、リガンドがＧＰＣＲと結合または複合体形成して、Ｇｉαサブユニット活性を含むＧＰＣＲ活性の増加を引き起こしていることを示す。場合によっては、レポーター遺伝子の存在の増加は、リガンドがＧＰＣＲと結合または複合体形成して、ｃＡＭＰ活性を含むＧＰＣＲ活性の増加を引き起こしていることを示す。場合によっては、レポーター遺伝子の存在の増加は、リガンドがＧＰＣＲと結合または複合体形成して、逆ｃＡＭＰ活性を含むＧＰＣＲ活性の増加を引き起こしていることを示す。いくつかの実施形態では、リガンドと接触したトランスフェクトされた細胞は、本明細書に記載の系をトランスフェクトしていない細胞のＧＰＣＲ活性と比較して、ＧＰＣＲ活性が増加することを示す。いくつかの実施形態では、リガンドと接触したトランスフェクトされた細胞は、本明細書に記載の系をトランスフェクトしていない細胞のＧＰＣＲ活性と比較して、Ｇｉαサブユニット活性が増加することを示す。いくつかの実施形態では、リガンドと接触したトランスフェクトされた細胞は、本明細書に記載の系をトランスフェクトしていない細胞のＧＰＣＲ活性と比較して、ｃＡＭＰ活性が増加することを示す。いくつかの実施形態では、リガンドと接触したトランスフェクトされた細胞は、本明細書に記載の系をトランスフェクトしていない細胞のＧＰＣＲ活性と比較して、逆ｃＡＭＰ活性が増加することを示す。
いくつかの実施形態では、レポーター遺伝子は、基質との相互作用時に検出可能なシグナルを生成する酵素を含み、当技術分野で公知の標準的なアッセイを利用して、レポーター遺伝子の活性化を定量化することができる。いくつかの実施形態では、レポーター遺伝子は蛍光分子を含み、レポーター遺伝子の活性化は、蛍光顕微鏡または蛍光プレートリーダーによって測定することができ、細胞溶解を必要としなくてもよい。蛍光分子は、生細胞におけるレポーターの活性化を測定するのに有用である。いくつかの実施形態では、レポーター遺伝子はＵＭＩを含み、ｍＲＮＡは逆転写され、ＵＭＩの配列決定は次世代シーケンシング技術によって実施される。
ある特定の実施形態では、アッセイは、６、１２、２４、４８、９６、または３８４ウェルフォーマットなどのマルチウェルフォーマットで実施される。ある特定の実施形態では、各ウェルに異なる試験化学物質（例えば、リガンド）が供給されるか、あるいは２重ウェル、３重ウェル、または４重ウェルに試験化学物質が供給される。アッセイはまた、１つまたは複数の陽性対照ウェル、あるいは１つの陰性対照ウェルを含んでもよい。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載の少なくとも１つの核酸でトランスフェクトされた細胞集団におけるＧＰＣＲ活性を測定する工程を含む。本開示の少なくとも１つの核酸でトランスフェクトされた細胞集団は、いずれの大きさであってもよい。ある特定の実施形態では、細胞集団は、１，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００、または１０，０００，０００以上の細胞を含む。ある特定の実施形態では、少なくとも約１，０００以上の細胞が、本明細書に記載の系の少なくとも１つの核酸でトランスフェクトされる。ある特定の実施形態では、少なくとも約１０，０００以上の細胞が、本明細書に記載の系の少なくとも１つの核酸でトランスフェクトされる。ある特定の実施形態では、少なくとも約１００，０００以上の細胞が、本明細書に記載の系の少なくとも１つの核酸でトランスフェクトされる。ある特定の実施形態では、少なくとも約１，０００，０００以上の細胞が、本明細書に記載の系の少なくとも１つの核酸でトランスフェクトされる。ある特定の実施形態では、少なくとも約１０，０００，０００以上の細胞が、本明細書に記載の系の少なくとも１つの核酸でトランスフェクトされる。ある特定の実施形態では、本開示の系は、マルチウェルプレート実験で利用することができる。本開示の系に適合したマルチウェルプレートの非限定的な例として、６、１２、２４、４８、９６、３８４、または１，５３６ウェルプレートが挙げられる。ある特定の実施形態では、マルチウェルプレートの各ウェルは、本明細書に記載の系の少なくとも１つの核酸でトランスフェクトされた細胞集団を含む。ある特定の実施形態では、マルチウェルプレートの各ウェルは、本明細書に記載の系の少なくとも１つの核酸でトランスフェクトされた細胞集団を含む。ある特定の実施形態では、各ウェルは、本明細書に記載の系の少なくとも１つの核酸で各々トランスフェクトされた複数の細胞集団を含む。ある特定の実施形態では、各ウェルは、本明細書に記載の系の少なくとも１つの核酸で各々トランスフェクトされた複数の細胞集団を含む。
既存の系の長所の１つは、異なる標的を発現させる細胞のライブラリーを、同じウェルで一緒に培養し、並行して分析することができることであり、例えば、同じ実験において２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、５００、１，０００以上を標的とすることができる。これは、標的がその標的に固有のＵＭＩと関連付けられることによって達成され、次いで、ＵＭＩは、データを逆畳み込みする高スループットの配列決定によって分析することができる。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書において、複数の哺乳動物細胞を含む系が記載され、複数の哺乳動物細胞の各々は、異なるＧＰＣＲ標的を含み、複数の哺乳動物細胞の各々は、（ａ）発現が野生型の状態でのＧＰＣＲ活性の第１のエフェクターの発現と比較して上方制御される、ＧＰＣＲ活性の第１のエフェクターと、（ｂ）発現が野生型の状態でのＧＰＣＲ活性の第２のエフェクターの発現と比較して下方制御される、ＧＰＣＲ活性の第２のエフェクターとを含む。ある特定の実施形態では、複数の哺乳動物細胞は、ＧＰＣＲシグナル伝達に応答するプロモーターによって活性化可能な、固有の分子識別子（ＵＭＩ）の核酸配列を含むレポーター遺伝子をさらに含む。
したがって、ある特定の実施形態では、本明細書において、複数の哺乳動物細胞を含む系が記載され、複数の哺乳動物細胞の各々は、異なる標的を含み、複数の哺乳動物細胞の各々は、（ａ）発現が野生型の状態での標的活性の第１のエフェクターの発現と比較して上方制御される、標的活性の第１のエフェクターと、（ｂ）発現が野生型の状態での標的活性の第２のエフェクターの発現と比較して下方制御される、標的活性の第２のエフェクターとを含む。ある特定の実施形態では、複数の哺乳動物細胞は、標的シグナル伝達に応答するプロモーターによって活性化可能な、固有の分子識別子（ＵＭＩ）の核酸配列を含むレポーター遺伝子をさらに含む。
ある特定の実施形態では、ＧＰＣＲと複合体形成または結合するリガンドなどの試験薬が、本明細書に記載の系の少なくとも１つの核酸でトランスフェクトされた細胞に適用される。ある特定の実施形態では、細胞に試験薬を接触させた後に、レポーター分子の転写の活性化レベルが測定される。ある特定の実施形態では、試験薬は、化学物質、小分子、生体分子、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、アプタマー、またはそれらのいずれかの組合せである。ある特定の実施形態では、単一の試験薬が細胞集団に適用される。ある特定の実施形態では、複数の試験薬が細胞集団に適用される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、リガンドを、本明細書に記載の系を含む細胞の表面に発現したＧＰＣＲと接触させることによって、ＧＰＣＲ活性を測定する。いくつかの実施形態では、方法は、複数のリガンドを、本明細書に記載の系を含む細胞の表面に発現したＧＰＣＲと接触させることによって、ＧＰＣＲ活性を測定する。いくつかの実施形態では、方法は、リガンドを、本明細書に記載の系を含む細胞の表面に発現した複数のＧＰＣＲと接触させることによって、ＧＰＣＲ活性を測定する。いくつかの実施形態では、方法は、複数のリガンドを、本明細書に記載の系を含む細胞の表面に発現した複数のＧＰＣＲと接触させることによって、ＧＰＣＲ活性を測定する。
ある特定の実施形態では、系は、試験薬またはリガンドに対するＧＰＣＲの応答を測定するように適合される。本開示の系は、いずれかのＧＰＣＲ受容体との使用に適合することができる。ある特定の実施形態では、系は、ｃＡＭＰ応答エレメント調節プロモーターを利用することによって、ＧＰＣＲ受容体との使用に適合される。ＧＰＣＲの非限定的な例には、５－ヒドロキシトリプタミン受容体、アセチルコリン受容体、アデノシン受容体、アドレナリン受容体、アンジオテンシン受容体、アペリン受容体、胆汁酸受容体、ボンベシン受容体、ブラジキニン受容体、カンナビノイド受容体、ケメリン受容体、ケモカイン受容体、コレシストキニン受容体、ドーパミン受容体、エンドセリン受容体、ホルミルペプチド受容体、遊離脂肪酸受容体、ガラニン受容体、グレリン受容体、糖タンパク質ホルモン受容体、性腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体、ＧＰＲ１８、ＧＰＲ５５、ＧＰＲ１１９、Ｇタンパク質共役型エストロゲン受容体、ヒスタミン受容体、ヒドロキシカルボン酸受容体、キスペプチン受容体、ロイコトリエン受容体、ＬＰＡ受容体、Ｓ１Ｐ受容体、メラニン凝集ホルモン受容体、メラノコルチン受容体、メラトニン受容体、モチリン受容体、ニューロメジンＵ受容体、神経ペプチドＦＦ／神経ペプチドＡＦ受容体、神経ペプチドＳ受容体、神経ペプチドＷ／神経ペプチドＢ受容体、神経ペプチドＹ受容体、ニューロテンシン受容体、オピオイド受容体、オプシン受容体、オレキシン受容体、オキソグルタル酸受容体、Ｐ２Ｙ受容体、血小板活性化因子受容体、プロキネチシン受容体、プロラクチン放出ペプチド受容体、プロスタノイド受容体、プロテアーゼ活性化受容体、ＱＲＦＰ受容体、リラキシンファミリーペプチド受容体、ソマトスタチン受容体、コハク酸受容体、タキキニン受容体、サイロトロピン放出ホルモン受容体、微量アミン受容体、ウロテンシン受容体、バソプレシンおよびオキシトシン受容体、カルシトニン受容体、コルチコトロピン放出因子受容体、グルカゴン受容体ファミリー、副甲状腺ホルモン受容体、ＶＩＰおよびＰＡＣＡＰ受容体、カルシウム感知受容体、ＧＡＢＡＢ受容体、代謝型グルタミン酸受容体、味覚１受容体、ｆｒｉｚｚｌｅｄクラス受容体、接着クラスＧＰＣＲ、オーファン受容体、またはそれらのいずれかの組合せが挙げられる。
本開示の核酸は、当技術分野において一般的な多数のベクターに適合する。ベクターの非限定的な例には、ゲノム組み込み型ベクター、エピソーマルベクター、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、バクテリア人工染色体、および酵母人工染色体が挙げられる。本開示の核酸に適合するウイルスベクターの非限定的な例には、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス由来のベクターが挙げられる。ある特定の実施形態では、本開示の核酸は、ゲノム内の規定された位置または制限された部位のセットに部位特異的な組み込み（例えば、ＡｔｔＰ－ＡｔｔＢ組み換え）を導く配列を含むベクターに存在する。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の系は、単一のベクターに取り込まれる。ある特定の実施形態では、単一のベクターは、一過的に細胞にトランスフェクトされる。ある特定の実施形態では、単一のベクターは、安定的に細胞にトランスフェクトされる。
ある特定の実施形態では、系は、２つのベクターに分けられる。ある特定の実施形態では、第１のベクターは、第１の調節エレメントと第１のエフェクターとを含み、第２のベクターは、第２のエフェクターの発現を調節するための第２の調節エレメントを含む。ある特定の実施形態では、第１のベクターおよび第２のベクターは、一過的に細胞にトランスフェクトされる。ある特定の実施形態では、第１のベクターおよび第２のベクターは、安定的に細胞にトランスフェクトされる。ある特定の実施形態では、第１のベクターは、安定的に細胞にトランスフェクトされ、第２のベクターは、一過的に細胞にトランスフェクトされる。ある特定の実施形態では、第１のベクターは、一過的に細胞にトランスフェクトされ、第２のベクターは、安定的に細胞にトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、レポーターを含む別個のベクターを細胞にトランスフェクトできる。いくつかの実施形態では、第１のベクターまたは第２のベクターでトランスフェクトされた細胞は、既にレポーターを含む。
本明細書またはその一部に記載の系またはその一部を含むベクターは、多数の周知の分子生物学技術を使用して構成できる。増幅、クローニング、突然変異誘発、形質転換などを含むこのような多数のプロトコルの詳細のプロトコルは、例えばＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ２０１２） Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １０（“Ａｕｓｕｂｅｌ”）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ － Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ Ｅｄ．）、Ｖｏｌ．１－３、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０１２年（“Ｓａｍｂｒｏｏｋ”）；およびＡｂｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ） ｖｏｌｕｍｅ １５２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（“Ａｂｅｌｓｏｎ”）に記載されている。
キット
本明細書において、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の系を含むキットが開示される。場合によっては、キットは、本明細書に記載の系の少なくとも１つの核酸を含む。いくつかの実施形態では、キットは、細胞を含まない。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の少なくとも核酸でトランスフェクトされた細胞を含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の少なくとも核酸でトランスフェクトすべき細胞を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるキットは、細胞におけるＧＰＣＲ活性を測定するために使用できる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるキットは、細胞におけるＧＰＣＲ活性を調整するために使用できる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるキットは、細胞におけるＧタンパク質活性を調整するために使用できる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるキットは、細胞におけるＧｉαサブユニット活性を調整するために使用できる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるキットは、細胞におけるｃＡＭＰ活性を調整するために使用できる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるキットは、細胞における逆ｃＡＭＰ活性を調整するために使用できる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるキットは、細胞におけるＧＰＣＲ活性を増加させるために使用できる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるキットは、細胞におけるＧタンパク質活性を増加させるために使用できる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるキットは、細胞におけるＧｉαサブユニット活性を増加させるために使用できる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるキットは、細胞におけるｃＡＭＰ活性を増加させるために使用できる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるキットは、細胞における逆ｃＡＭＰ活性を増加させるために使用できる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるキットは、細胞におけるＧＰＣＲエフェクターの発現を調整するために使用できる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるキットは、細胞におけるＧＰＣＲエフェクターの発現を増加させるために使用できる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるキットは、細胞におけるＧＰＣＲエフェクターの発現を減少させるために使用できる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるキットは、細胞における第１のＧＰＣＲエフェクターの発現を増加させたり、細胞における第２のＧＰＣＲエフェクターの発現を減少させたりするために使用できる。いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲエフェクターは、アデニリルシクラーゼである。アデニリルシクラーゼは、ＡＤＣＹ１、ＡＤＣＹ２、ＡＤＣＹ３、ＡＤＣＹ４、ＡＤＣＹ５、ＡＤＣＹ６、ＡＤＣＹ７、ＡＤＣＹ８、ＡＤＣＹ９、またはＡＤＣＹ１０であってもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるキットは、アデニリルシクラーゼのうちのいずれか１つの発現を増加させるために使用できる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるキットは、ＡＤＣＹ６の発現を増加させるために使用できる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるキットは、アデニリルシクラーゼのうちのいずれか１つの発現を減少させるために使用できる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるキットは、ＡＤＣＹ３の発現を減少させるために使用できる。
いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の系を含み、本明細書に記載の方法を実施するために使用できる。キットは、系の組成物のうちの少なくとも１つを含む材料または組成の集合体を含む。他の実施形態では、キットは、すべての制御および誘導を含む、本明細書に記載の方法を実施するのに必要および／または十分な組成物すべてを含有する。
いくつかの事例では、本明細書に記載のキットは、本明細書に記載の導入遺伝子のうちのいずれか１つの遺伝子活性を調整するための、本明細書に記載の系を含む。キットに構成された成分の正確な性質は、その所期の目的によって決まる。例えば、一部のキットは、リガンドがＧＰＣＲと結合または複合体形成するＧＰＣＲ活性をスクリーニングするために構成されてもよい。いくつかの実施形態では、キットは特に、未知のリガンドについてスクリーニングすることを目的として構成されてもよい。いくつかの実施形態では、キットは特に、リガンドによって刺激された際のＧＰＣＲ活性やリガンドの非存在下でのＧＰＣＲ活性を測定するために構成されてもよい。
場合によっては、キットに使用説明書が含まれてもよい。任意選択で、キットはまた、他の有用な構成要素、例えば、希釈剤、緩衝剤、薬学的に許容可能な担体、シリンジ、カテーテル、塗布具、ピペット装置もしくは測定装置、包帯材料、または他の有用な器具も含有する。キットで組み合わされる材料および構成要素は、その操作性および有用性を保持するいずれかの便利で好適な方法で貯蔵されて、医療従事者に提供されてよい。例えば、構成要素は、溶解形態、脱水形態、または凍結乾燥形態であってもよく、室温、冷蔵温度、または凍結温度で提供されてよい。構成要素は典型的に、好適な包装材料に含有される。本明細書で用いられる場合、「包装材料」という語句は、組成物などのキットの内容物を収容するために使用される１つまたは複数の物理的構造を指す。包装材料は、周知の方法によって構築され、好ましくは、無菌の混入物を含まない環境を提供するものである。キットに用いられる包装材料は、遺伝子発現アッセイや治療投与において慣習的に利用されるものである。本明細書で使用される場合、「包装」という用語は、個々のキット構成要素を保持することが可能なガラス、プラスチック、紙、ホイルなどの好適な固形マトリックスまたは材料を指す。故に、例えば、包装は、好適な量の医薬組成物を含有するために使用されるガラスバイアルまたはプレフィルドシリンジであってもよい。包装材料は、キットおよびその構成要素の内容物および／または目的を示す外部ラベルを有する。
系および方法の好ましい実施形態が本明細書で示され、記載されてきたが、このような実施形態はほんの一例として提供されているに過ぎないことが当業者には明らかであろう。系および方法は、本明細書内で提供される特定の例によって限定されることを意図していない。系および方法は、前述の明細書を参照して説明されてきたが、本明細書における実施形態の説明および例示は、限定的な意味で解釈されるべきではない。当業者であれば、ここで、本発明から逸脱することなく多数の変形、変更および置換を思いつくであろう。さらに、系および方法のすべての態様は、本明細書に示す特定の描写、構成または相対的比率に限定されず、様々な条件および変数によって決められることが理解されよう。本明細書に記載の系および方法の実施形態の様々な代替が、本開示の実施において用いられ得ることを理解されたい。したがって、本明細書に記載の系および方法は、任意のそのような代替物、修正、変形例、または均等物も網羅するものとすることを企図する。以下の特許請求の範囲は、本明細書に記載の系および方法の範囲を定義し、本明細書に記載の系および方法がこれらの特許請求の範囲内にあり、それらの均等物がこれらの特許請求の範囲によって網羅されることを意図している。
実施形態
実施形態１。Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）活性を測定するための系であって、発現が野生型の状態での第１のエフェクターの発現と比較して上方制御される、ＧＰＣＲ活性の第１のエフェクターと、発現が野生型の状態での第２のエフェクターの発現と比較して下方制御される、ＧＰＣＲ活性の第２のエフェクターとを含む、系。
実施形態２。第１のエフェクターの発現は、ＧＰＣＲとＧＰＣＲ活性化因子を接触させることによって上方制御される、実施形態１に記載の系。
実施形態３。ＧＰＣＲ活性化因子は、ＧＰＣＲアゴニストである、実施形態２に記載の系。
実施形態４。ＧＰＣＲ活性化因子は、第１のエフェクターのアゴニストである、実施形態２に記載の系。
実施形態５。系は、ＧＰＣＲ活性の第１のエフェクターをコードする第１の核酸を含み、第１のエフェクターの発現を上方制御するために調節エレメントに作動可能に連結される、実施形態１に記載の系。
実施形態６。第２のエフェクターの発現は、ＧＰＣＲとＧＰＣＲ阻害因子を接触させることによって下方制御される、実施形態１に記載の系。
実施形態７。ＧＰＣＲ阻害因子は、ＧＰＣＲインバースアゴニストである、実施形態６に記載の系。
実施形態８。ＧＰＣＲ阻害因子は、ＧＰＣＲアンタゴニストである、実施形態６に記載の系。
実施形態９。ＧＰＣＲ阻害因子は、第２のエフェクターのインバースアゴニストである、実施形態６に記載の系。
実施形態１０。ＧＰＣＲ阻害因子は、第２のエフェクターのアンタゴニストである、実施形態６に記載の系。
実施形態１１。系は、第２のエフェクターの発現を下方制御する第２の核酸を含む、実施形態１に記載の系。
実施形態１２。ＧＰＣＲ活性は、Ｇｉαサブユニット活性、Ｇｓαサブユニット活性、Ｇｑαサブユニット活性、またはＧ１２／１３αサブユニット活性を含む、実施形態１に記載の系。
実施形態１３。ＧＰＣＲ活性は、Ｇｉαサブユニット活性を含む、実施形態１２に記載の系。
実施形態１４。Ｇｉαサブユニット活性は、Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｏ、Ｇαｔ、Ｇαｇ、またはＧαｚの活性を含む、実施形態１３に記載の系。
実施形態１５。ＧＰＣＲ活性は、Ｇｓαサブユニット活性を含む、実施形態１２に記載の系。
実施形態１６。ＧＰＣＲ活性は、Ｇｑαサブユニット活性を含む、実施形態１２に記載の系。
実施形態１７。前記ＧＰＣＲ活性は、Ｇ１２／１３αサブユニット活性を含む、実施形態１２に記載の系。
実施形態１８。調節エレメントは、誘導型である、実施形態５に記載の系。
実施形態１９。調節エレメントは、構成的活性型である、実施形態５に記載の系。
実施形態２０。第１のエフェクターは、第１のアデニリルシクラーゼを含む、従前の実施形態のいずれか１つに記載の系。
実施形態２１。第１のアデニリルシクラーゼは、ＡＤＣＹ１、ＡＤＣＹ２、ＡＤＣＹ３、ＡＤＣＹ４、ＡＤＣＹ５、ＡＤＣＹ６、ＡＤＣＹ７、ＡＤＣＹ８、ＡＤＣＹ９、およびＡＤＣＹ１０からなる群より選択される、実施形態２０に記載の系。
実施形態２２。第１のアデニリルシクラーゼは、ＡＤＣＹ６である、実施形態２１に記載の系。
実施形態２３。第２のエフェクターは、第２のアデニリルシクラーゼを含む、従前の実施形態のいずれか１つに記載の系。
実施形態２４。第２のアデニリルシクラーゼは、ＡＤＣＹ１、ＡＤＣＹ２、ＡＤＣＹ３、ＡＤＣＹ４、ＡＤＣＹ５、ＡＤＣＹ６、ＡＤＣＹ７、ＡＤＣＹ８、ＡＤＣＹ９、およびＡＤＣＹ１０からなる群より選択される、実施形態２３に記載の系。
実施形態２５。第２のアデニリルシクラーゼは、ＡＤＣＹ３である、実施形態２４に記載の系。
実施形態２６。第２の核酸は、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ、またはそれらの組合せを含む、実施形態１２から２５のいずれか１つに記載の系。
実施形態２７。第２の核酸は、マイクロＲＮＡを含む、実施形態２６に記載の系。
実施形態２８。第２の核酸は、ｇＲＮＡを含む、実施形態２６に記載の系。
実施形態２９。ｇＲＮＡに作動可能に連結されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系をさらに含む、実施形態２８に記載の系。
実施形態３０。ＧＰＣＲ活性は、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）活性を含む、実施形態１に記載の系。
実施形態３１。ＧＰＣＲ活性は、ｃＡＭＰ濃度の変化を含む、実施形態１に記載の系。
実施形態３２。ＧＰＣＲ活性は、逆ｃＡＭＰ活性を含む、実施形態１に記載の系。
実施形態３３。系は、系を含まない細胞におけるｃＡＭＰ活性と比較して、系を含む細胞におけるｃＡＭＰ活性を少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍増加させる、実施形態２０に記載の系。
実施形態３４。系は、系を含まない細胞におけるｃＡＭＰ濃度と比較して、系を含む細胞におけるｃＡＭＰ濃度を少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍増加させる、実施形態３１に記載の系。
実施形態３５。系は、系を含まない細胞における逆ｃＡＭＰ活性と比較して、系を含む細胞における逆ｃＡＭＰ活性を少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍増加させる、実施形態３２に記載の系。
実施形態３６。系は、Ｇｉαサブユニットの発現を上方制御するための第２の調節エレメントを含む、従前の実施形態のいずれか１つに記載の系。
実施形態３７。系は、少なくとも１つのさらなるエフェクターを含む、従前の実施形態のいずれか１つに記載の系。
実施形態３８。少なくとも１つのさらなるエフェクターは、アデニリルシクラーゼである、実施形態３７に記載の系。
実施形態３９。系は、少なくとも１つのさらなるエフェクターの発現を上方制御するための第２の調節エレメントをさらに含む、実施形態３７に記載の系。
実施形態４０。系は、系を含まない細胞におけるＧＰＣＲ活性とバックグラウンドとの間の比と比較して、系を含む細胞におけるＧＰＣＲ活性とバックグラウンドとの間の比を少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍増加させる、従前の実施形態のいずれか１つに記載の系。
実施形態４１。系は、系を含まない細胞におけるＧＰＣＲ活性と比較して、系を含む細胞におけるＧＰＣＲ活性を少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍増加させる、実施形態４０に記載の系。
実施形態４２。系は、系を含まない細胞におけるバックグラウンドと比較して、系を含む細胞におけるバックグラウンドを少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍減少させる、実施形態４０に記載の系。
実施形態４３。系は、レポーター核酸を含み、レポーター核酸は、ＧＰＣＲ活性に比例した検出可能なシグナルを生成する、従前の実施形態のいずれか１つに記載の系。
実施形態４４。レポーター核酸は、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）配列を含む、実施形態４３に記載の系。
実施形態４５。レポーター核酸は、固有の分子識別子（ＵＭＩ）核酸配列に作動可能に連結される、実施形態４３に記載の系。
実施形態４６。検出可能なシグナルは、蛍光シグナルを含む、実施形態４３に記載の系。
実施形態４７。検出可能なシグナルは、発光シグナルを含む、実施形態４３に記載の系。
実施形態４８。第１の核酸は、第１のエフェクターの発現を上方制御するための遺伝子発現カセットを含む、実施形態５に記載の系。
実施形態４９。第２の核酸は、第２のエフェクターの発現を下方制御するための遺伝子発現カセットを含む、実施形態１１に記載の系。
実施形態５０。実施形態１から４９のいずれか１つに記載の系を含む細胞。
実施形態５１。細胞は、真核細胞を含む、実施形態５０に記載の細胞。
実施形態５２。細胞は、哺乳動物細胞を含む、実施形態５０に記載の細胞。
実施形態５３。哺乳動物細胞由来の細胞を含む、実施形態５０に記載の細胞。
実施形態５４。細胞は、細胞株由来である、実施形態５０に記載の細胞。
実施形態５５。細胞は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＯＳ－７細胞、およびＵ２ＯＳ細胞からなる群より選択される、実施形態５０に記載の細胞。
実施形態５６。系は、細胞のゲノムに組み込まれる、実施形態５０から５５のいずれか１つに記載の細胞。
実施形態５７。実施形態５２から５７のいずれか１つに記載の細胞を含む細胞集団。
実施形態５８。細胞集団は、真核細胞の集団を含む、実施形態５７に記載の細胞集団。
実施形態５９。細胞集団は、哺乳動物細胞の集団を含む、実施形態５７に記載の細胞集団。
実施形態６０。細胞集団は、哺乳動物細胞由来の細胞の集団を含む、実施形態５７に記載の細胞集団。
実施形態６１。細胞集団は、細胞株由来の細胞の集団を含む、実施形態５５に記載の細胞集団。
実施形態６２。細胞集団は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＯＳ－７細胞、およびＵ２ＯＳ細胞からなる群より選択される細胞の集団を含む、実施形態５５に記載の細胞集団。
実施形態６３。ＧＰＣＲ活性を測定するための方法であって、該方法は、実施形態５０から５６のいずれか１つに記載の細胞、または実施形態５７から６２のいずれか１つに記載の細胞集団におけるＧＰＣＲ活性を測定することを含む、方法。
実施形態６４。ＧＰＣＲ活性は、定常ＧＰＣＲ活性である、実施形態６３に記載の方法。
実施形態６５。実施形態５０から５６のいずれか１つに記載の細胞、または実施形態５７から６２のいずれか１つに記載の細胞集団は、ＧＰＣＲリガンドと接触させない、実施形態６３に記載の方法。
実施形態６６。細胞におけるＧＰＣＲ活性を測定するための方法であって、該方法は、実施形態５０から５６のいずれか１つに記載の細胞、または実施形態５７から６２のいずれか１つに記載の細胞集団とＧＰＣＲリガンドを接触させる工程を含み、リガンドは、ＧＰＣＲと複合体形成し、ＧＰＣＲ活性を開始または阻害する、方法。
実施形態６７。ＧＰＣＲリガンドは、実施形態５０から５６のいずれか１つに記載の細胞に発現する、実施形態６６に記載の方法。
実施形態６８。ＧＰＣＲリガンドは、ポリペプチド、非ペプチド化合物、および小分子からなる群より選択される、実施形態６７に記載の方法。
以下の例示的な実施例は、本明細書に記載の刺激、系、および方法の代表的な実施形態であり、何ら限定することを意味するものではない。
実施例１．ＧＰＣＲ活性の測定
図２に示すように、異なるプラスミドでトランスフェクトした細胞からＧＰＣＲ活性を測定した。図２Ａに記載のプラスミドは、下方制御するために内因性アデニリルシクラーゼ３（ＡＣ３）ｍＲＮＡを標的化するｍｉＲＮＡアレイをコードする遺伝子発現カセットを含有するものであった。このカセットはまた、アデニリルシクラーゼ６（ＡＣ６）タンパク質の産生をコードする外因性配列も含有するものであった。これらのエレメントは両方とも、同じクメート制御プロモーターの制御下に置かれていた。この核酸はまた、抗生物質ブラストサイジンに対する耐性を与える遺伝子の産生をコードする第２のカセットも含有するものであった。発現カセットとｂｘｂｉインテグラーゼとを含有する第２のプラスミドで共トランスフェクトすることによって、プラスミドをＨＥＫ２９３細胞株に安定的に組み込んだ。細胞株およびプラスミドは、ｂｘｂｉ組込み配列を含有しており、それによって、単一コピーでゲノム中の特定の遺伝子座にプラスミドを組み込むことが可能となった。細胞株はまた、クメート制御プロモーターのクメート誘導発現を可能とするクメート抑制タンパク質と、ドキシサイクリン誘導発現を可能とする逆テトラサイクリントランス活性化因子（ｒＴＴＡ）タンパク質の産生をコードする発現カセットも含有するものであった。ブラストサイジンを添加した培地で細胞を継代することで、組込みの成功をつかみ取った。
図２Ｂに記載のプラスミドは、ｄＣａｓ９－ＢＦＰ－ＫＲＡＢ融合タンパク質をコードする遺伝子発現カセットと、ＡＣ３を標的化する３つの異なるＲＮＡガイド（ｇＲＮＡ）をコードする複数の発現カセットとを含有するものであった。ｇＲＮＡによってｄＣａｓ９－ＢＦＰ－ＫＲＡＢを天然ＡＣ３ゲノム遺伝子座に標的化することによって、下方制御を達成した。プラスミドはまた、ハイグロマイシン耐性およびｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポゾン組込み配列をコードする遺伝子発現カセットも含有するものであった。ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼの発現をコードするプラスミドで共トランスフェクトすることによって、それぞれがＡＣ３に対して３つのガイド（合計５つの固有のガイド）を含有する２つの異なるプラスミドを上記のｂｘｂｉ組込み細胞株に安定的に組み込んだ。ハイグロマイシンを添加した培地で細胞を継代することで、組込みの成功をつかみ取った。
図２Ｃに記載のプラスミドは、ＡＣ６タンパク質の産生をコードするクメート制御プロモーター下の遺伝子発現カセットを含有するものであった。このプラスミドはまた、クメート制御プロモーターのクメート誘導性発現を可能にするクメート抑制タンパク質の産生をコードする第２の遺伝子発現カセットと、ピューロマイシン耐性遺伝子とも含有するものであった。このプラスミドはまた、ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポゾン組込み配列も含有するものであった。ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポゾンの発現をコードするプラスミドで共トランスフェクトすることによって、プラスミドを上記のＨＥＫ２９３細胞株に安定的に組み込んだ。ピューロマイシンを添加した培地で細胞を継代することで、組込みの成功をつかみ取った。図２のプラスミドの核酸配列は、配列番号１～４に見出すことができる。
第２世代遺伝子発現カセット（図２Ａ）でトランスフェクトした細胞を、ドーパミンおよびフォルスコリン（Ｆｓｋ）０．５μＭと接触させた（図３）。図３に示すように、ＡＤＲＡ２Ａ、ＡＤＲＡ２Ｃ、ＤＲＤ２、ＤＲＤ３、ＤＲＤ４、およびＨＴＲ１Ｆの受容体とそれぞれ結合するアドレナリン、アドレナリン、ドーパミン、ドーパミン、ドーパミン、およびセロトニンに関連するＧＰＣＲ活性は、ＭＡＤＳｖ２．５核酸でトランスフェクトした細胞において増加した。図４に示すように、第１世代遺伝子発現カセット（図２Ｃ）を含む細胞から生成したルシフェラーゼ測定値は、ＡＣ６過剰発現（ＡＣ６－ＯＥ）のみで逆ＣＲＥ活性が増加したことを示す。図５に示すように、（図２Ｂ、ＡＣ３ノックダウンＡＤＣＹ３－ＫＤを含む）第３世代カセットを含む細胞から生成したプラットフォームデータは、第２世代遺伝子発現カセットを含む細胞から生成したプラットフォームデータと比べて改善したことを示し、ＡＤＣＹ３ノックダウンが、測定された活性の減少につながるものであった。
前述の開示は、明確性および理解のために細部にわたって説明してきたが、当業者であれば、本開示を読み上げて、本開示から逸脱することなく形態および詳細に様々な変更を行うことができることは明らかであろう。例えば、上記の技術および装置はすべて、様々な組合せで使用することができる。本明細書で言及されているすべての刊行物、特許、特許出願、および／またはその他の文書は、個々の刊行物、特許、特許出願、および／またはその他の文書が個々かつ個別に、すべての目的のために参照により組み込まれると示されているように、その全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる文章に含まれている定義は、それらが本開示の定義に矛盾する程度で除外される。

Claims (23)

  1. 哺乳動物細胞におけるＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）活性を測定するための系であって、
    ａ）発現が野生型の状態でのＧＰＣＲ活性の第１のエフェクターの発現と比較して上方制御される、ＧＰＣＲ活性の第１のエフェクターと、
    ｂ）発現が野生型の状態でのＧＰＣＲ活性の第２のエフェクターの発現と比較して下方制御される、ＧＰＣＲ活性の第２のエフェクターと
    を含む、系。
  2. 前記ＧＰＣＲ活性は、Ｇｉαサブユニット活性、Ｇｓαサブユニット活性、Ｇｑαサブユニット活性、またはＧ１２／１３αサブユニット活性を含む、請求項１に記載の系。
  3. 前記ＧＰＣＲ活性は、Ｇｉαサブユニット活性を含む、請求項２に記載の系。
  4. 前記Ｇｉαサブユニット活性は、Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｏ、Ｇαｔ、Ｇαｇ、またはＧαｚの活性を含む、請求項３に記載の系。
  5. 前記ＧＰＣＲ活性は、Ｇｓαサブユニット活性を含む、請求項４に記載の系。
  6. 前記ＧＰＣＲ活性は、Ｇｑαサブユニット活性を含む、請求項４に記載の系。
  7. 前記ＧＰＣＲ活性は、Ｇ１２／１３αサブユニット活性を含む、請求項４に記載の系。
  8. 前記ＧＰＣＲ活性の第１のエフェクターは、第１のアデニリルシクラーゼを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の系。
  9. 前記第１のアデニリルシクラーゼは、ＡＤＣＹ１、ＡＤＣＹ２、ＡＤＣＹ３、ＡＤＣＹ４、ＡＤＣＹ５、ＡＤＣＹ６、ＡＤＣＹ７、ＡＤＣＹ８、ＡＤＣＹ９、およびＡＤＣＹ１０からなる群より選択される、請求項８に記載の系。
  10. 前記第１のアデニリルシクラーゼは、ＡＤＣＹ６である、請求項８または９に記載の系。
  11. 前記第１のアデニリルシクラーゼは、野生型の状態と比較して前記第１のアデニリルシクラーゼを過剰発現するプロモーターまたはエンハンサーに作動可能に連結された核酸によってコードされる、請求項８から１０のいずれか一項に記載の系。
  12. 前記ＧＰＣＲ活性の第２のエフェクターは、第２のアデニリルシクラーゼを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の系。
  13. 前記第２のアデニリルシクラーゼは、ＡＤＣＹ１、ＡＤＣＹ２、ＡＤＣＹ３、ＡＤＣＹ４、ＡＤＣＹ５、ＡＤＣＹ６、ＡＤＣＹ７、ＡＤＣＹ８、ＡＤＣＹ９、およびＡＤＣＹ１０からなる群より選択される、請求項１２に記載の系。
  14. 前記第２のアデニリルシクラーゼは、ＡＤＣＹ３である、請求項１２または１３に記載の系。
  15. 前記第２のアデニリルシクラーゼは、野生型の状態と比較して前記第２のアデニリルシクラーゼの発現を減少させるマイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体のうちの１つまたは複数によって標的化される、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の系。
  16. 前記系は、レポーター核酸を含み、前記レポーター核酸は、レポーター遺伝子から、前記ＧＰＣＲ活性に比例した検出可能なシグナルを生成する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の系。
  17. 前記レポーター核酸は、前記レポーター遺伝子に作動可能に連結されたｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）配列を含む、請求項１６に記載の系。
  18. 前記レポーター遺伝子は、固有の分子識別子（ＵＭＩ）核酸配列を含む、請求項１または１７に記載の系。
  19. 前記レポーター遺伝子は、固有の分子識別子、蛍光シグナル、または発光シグナルの発現のうちの１つまたは複数を含む、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の系。
  20. 前記哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＯＳ－７細胞、およびＵ２ＯＳ細胞からなる群より選択される、請求項１から１９のいずれか一項に記載の系。
  21. 前記系は、前記哺乳動物細胞のゲノムに組み込まれる、請求項１から２０のいずれか一項に記載の系。
  22. 哺乳動物細胞におけるＧＰＣＲ活性を測定するための方法であって、該方法は、請求項１から２１のいずれか一項に記載の系とＧＰＣＲリガンドを接触させる工程を含み、前記リガンドは、ＧＰＣＲと複合体形成し、前記ＧＰＣＲ活性を開始または阻害する、方法。
  23. 前記ＧＰＣＲリガンドは、ポリペプチドおよび小分子からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
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