CN117321211A - 测量细胞信号传导蛋白质活性的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本文描述了用于测量酶活性的系统。本文还描述了利用本文所述的系统测量或筛选酶活性的方法。

Description

测量细胞信号传导蛋白质活性的系统和方法
交叉引用
本申请要求2021年2月2日提交的美国临时申请号63/144,766的权益，该申请通过引用以其整体并入本文。
序列表
本申请包含以ASCII格式电子方式提交并据此通过引用以其整体并入本文的序列表。所述ASCII副本创建于2021年1月24日，命名为52652-708_601_SL.txt，并且大小为56,814字节。
背景技术
测量细胞信号传导通路响应是现代医学的基石之一。细胞信号传导通路响应可以源于先天的细胞活性。细胞信号传导通路响应可以通过外源性来源刺激，例如使细胞与结合至在细胞表面表达的受体的配体接触。配体与细胞表面受体之间的接触引发酶活性的变化，包括细胞内的信号传导级联，其导致细胞信号传导通路响应的变化。因此，测量或筛选酶活性可以捕捉由配体接触细胞表面受体引发的细胞信号传导通路响应的变化。
发明内容
本文描述了一种系统和方法，所述系统和方法用于询问和测量细胞信号传导通路响应、筛选细胞信号传导通路的拮抗剂、反向激动剂或激动剂或发现新的细胞信号传导通路的系统和方法。目前的方法利用编码报告分子的核酸近侧的内源性应答元件调控的启动子。由于细胞中内源性应答元件结合启动子的“泄漏”性质，这些方法受到报告分子的高程度背景信号的影响。此外，这些方法受到高程度的以下项的影响：在细胞信号传导通路的可测量活性中的高度的变异系数、假阳性或假阴性。最后，这种方法受报告子激活的绝对值较低的影响，导致可测量的细胞信号传导活性与背景的比率较低。
在一个方面，本文所述的系统和方法包括至少一个编码细胞信号传导通路的调控元件和/或效应物的核酸。在一些情况下，调控元件上调或下调效应物的表达。在一些情况下，调控元件上调或下调外源效应物的表达。在一些情况下，调控元件上调或下调内源效应物的表达。通过调节效应物的表达，该系统和方法增加了可测量的细胞信号传导通路响应；增加了可测量的细胞信号传导通路响应与背景的比率；并降低可测量细胞信号传导通路的变异系数、假阳性或假阴性。
在一些方面，本文描述了一种用于测量哺乳动物细胞中的G蛋白偶联受体(GPCR)活性的系统，所述系统包含：GPCR活性的第一效应物，其中与野生型状态下GPCR活性的第一效应物的表达相比，GPCR活性的第一效应物的表达上调；和GPCR活性的第二效应物，其中与野生型状态下GPCR活性的第二效应物的表达相比，GPCR活性的第二效应物的表达下调。在一些实施方案中，GPCR活性包含Giα亚基活性、Gsα亚基活性、Gqα亚基活性或G12/13α亚基活性。在一些实施方案中，GPCR活性包含Giα亚基活性。在一些实施方案中，Giα亚基活性包含Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαo、Gαt、Gαg或Gαz的活性。在一些实施方案中，GPCR活性包含Gsα亚基活性。在一些实施方案中，GPCR活性包含Gqα亚基活性。在一些实施方案中，GPCR活性包含G12/13α亚基活性。在一些实施方案中，GPCR活性的第一效应物包含第一腺苷酸环化酶。在一些实施方案中，第一腺苷酸环化酶选自ADCY1、ADCY2、ADCY3、ADCY4、ADCY5、ADCY6、ADCY7、ADCY8、ADCY9和ADCY10。在一些实施方案中，第一腺苷酸环化酶是ADCY6。在一些实施方案中，第一腺苷酸环化酶由与启动子或增强子操作性偶联的核酸编码，与野生型状态相比，所述启动子或增强子过表达第一腺苷酸环化酶。在一些实施方案中，GPCR活性的第二效应物包含第二腺苷酸环化酶。在一些实施方案中，第二腺苷酸环化酶选自ADCY1、ADCY2、ADCY3、ADCY4、ADCY5、ADCY6、ADCY7、ADCY8、ADCY9和ADCY10。在一些实施方案中，第二腺苷酸环化酶是ADCY3。在一些实施方案中，第二腺苷酸环化酶被微RNA、shRNA、siRNA、CRISPR/Cas9复合物中的一个或多个靶向，与野生型状态相比，所述微RNA、shRNA、siRNA、CRISPR/Cas9复合物降低第二腺苷酸环化酶的表达。在一些实施方案中，该系统包含报告核酸，其中报告核酸从报告基因产生与GPCR活性成比例的可检测信号。在一些实施方案中，报告核酸包含操作性偶联到报告基因的cAMP应答元件(CRE)序列。在一些实施方案中，报告基因包含唯一分子标识符(UMI)核酸序列。在一些实施方案中，报告基因包含以下中的一种或多种：唯一分子标识符的表达、荧光信号、发光信号。在一些实施方案中，哺乳动物细胞选自HEK 293细胞、CHO-K1细胞、COS-7细胞和U2OS细胞。在一些实施方案中，该系统被整合到哺乳动物细胞的基因组中。
在一些方面，本文描述了一种用于测量细胞中的GPCR活性的方法，该方法包括使本文描述的系统与GPCR配体接触，其中配体与GPCR复合并引发或抑制GPCR活性。在一些实施方案中，GPCR配体选自多肽和小分子。
在一个方面，本文描述了一种用于测量G蛋白偶联受体(GPCR)活性的系统，所述系统包括：(a)GPCR活性的第一效应物，其中与野生型状态下第一效应物的表达相比，第一效应物的表现上调；和(b)GPCR活性的第二效应物，其中与野生型状态下第二效应物的表达相比，第二效应物的表达下调。在某些实施方案中，通过使GPCR与GPCR激活剂接触来上调第一效应物的表达。在某些实施方案中，GPCR激活剂是GPCR激动剂。在某些实施方案中，GPCR激活剂是第一效应物的激动剂。在某些实施方案中，该系统包含编码GPCR活性的第一效应物的第一核酸，所述第一核酸操作性偶联至用于上调第一效应物表达的调控元件。在某些实施方案中，通过使GPCR与GPCR抑制剂接触来下调第二效应物的表达。在某些实施方案中，GPCR抑制剂是GPCR反向激动剂。在某些实施方案中，GPCR抑制剂是GPCR拮抗剂。在某些实施方案中，GPCR抑制剂是第二效应物的反向激动剂。在某些实施方案中，GPCR抑制剂是第二效应物的拮抗剂。在某些实施方案中，该系统包含下调第二效应物表达的第二核酸。在某些实施方案中，GPCR活性包括Giα亚基活性、Gsα亚基活性、Gqα亚基活性或G12/13α亚基活性。在某些实施方案中，GPCR活性包含Giα亚基活性。在某些实施方案中，Giα亚基活性包含Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαo、Gαt、Gαg或Gαz的活性。在某些实施方案中，GPCR活性包含Gsα亚基活性。在某些实施方案中，GPCR活性包含Gqα亚基活性。在某些实施方案中，GPCR活性包含G12/13α亚基活性。在某些实施方案中，调控元件是可诱导的。在某些实施方案中，调控元件是组成活性的。在某些实施方案中，第一效应物包含第一腺苷酸环化酶。在某些实施方案中，第一腺苷酸环化酶选自ADCY1、ADCY2、ADCY3、ADCY4、ADCY5、ADCY6、ADCY7、ADCY8、ADCY9和ADCY10。在某些实施方案中，第一腺苷酸环化酶是ADCY6。在某些实施方案中，第二效应物包含第二腺苷酸环化酶。在某些实施方案中，第二腺苷酸环化酶选自ADCY1、ADCY2、ADCY3、ADCY4、ADCY5、ADCY6、ADCY7、ADCY8、ADCY9和ADCY10。在某些实施方案中，第二腺苷酸环化酶是ADCY3。在某些实施方案中，第二核酸包含微RNA、shRNA、siRNA、gRNA或其组合。在某些实施方案中，第二核酸包含微RNA。在某些实施方案中，第二核酸包含gRNA。在某些实施方案中，该系统还包含操作性偶联到gRNA的CRISPR-Cas系统。在某些实施方案中，GPCR活性包含环AMP(cAMP)活性。在某些实施方案中，GPCR活性包含cAMP浓度的变化。在某些实施方案中，GPCR活性包含反向cAMP活性。在某些实施方案中，与没有该系统的细胞中的cAMP活性相比，该系统使包含该系统的细胞中的cAMP活性增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍或100倍。在某些实施方案中，与没有该系统的细胞中的cAMP浓度相比，该系统使包含该系统的细胞中的cAMP浓度增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍或100倍。在某些实施方案中，与没有该系统的细胞中的反向cAMP活性相比，该系统使包含该系统的细胞中的反向cAMP活性增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍或100倍。在某些实施方案中，该系统包含用于上调Giα亚基表达的第二调控元件。在某些实施方案中，该系统包含至少一个附加效应物。在某些实施方案中，该至少一个附加效应物是腺苷酸环化酶。在某些实施方案中，该系统还包含用于上调该至少一个附加效应物的表达的第二调控元件。在某些实施方案中，与没有该系统的细胞中的GPCR活性与背景之间的比率相比，该系统使包含该系统的细胞中的GPCR活性与背景之间的比率增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍或100倍。在某些实施方案中，与没有该系统的细胞中的GPCR活性相比，该系统使包含该系统的细胞中的GPCR活性增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍或100倍。在某些实施方案中，与没有该系统的细胞中的背景相比，该系统将包含该系统的细胞中的背景降低至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍或100倍。在某些实施方案中，该系统包含报告核酸，其中报告核酸产生与GPCR活性成比例的可检测信号。在某些实施方案中，报告核酸包含cAMP应答元件(CRE)序列。在某些实施方案中，报告核酸操作性偶联到唯一分子识别符(UMI)核酸序列。在某些实施方案中，可检测信号包含荧光信号。在某些实施方案中，可检测信号包含发光信号。在某些实施方案中，第一核酸包含用于上调第一效应物表达的基因表达盒。在某些实施方案中，第二核酸包含用于下调第二效应物表达的基因表达盒。本文还描述了一种包括所描述的系统的细胞。在某些实施方案中，细胞包含真核细胞。在某些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，是哺乳动物细胞衍生的细胞。在某些实施方案中，细胞衍生自细胞系。在某些实施方案中，细胞选自CHO-K1细胞、COS-7细胞和U2OS细胞。在某些实施方案中，系统整合到细胞的基因组中。在某些实施方案中，细胞包含细胞群。在某些实施方案中，细胞群包含真核细胞的群体。在某些实施方案中，细胞群包含哺乳动物细胞的群体。在某些实施方案中，细胞群包含哺乳动物细胞衍生的细胞的群体。在某些实施方案中，细胞群包含衍生自细胞系的细胞的群体。在某些实施方案中，细胞群包含选自以下的细胞的群体：CHO-K1细胞、COS-7细胞和U2OS细胞。本文还描述了一种用于测量GPCR活性的方法，包括测量细胞中或细胞群中的GPCR活性。在某些实施方案中，GPCR活性是基础GPCR活性。在某些实施方案中，细胞或细胞群未与GPCR配体接触。本文还描述了一种用于测量细胞中的GPCR活性的方法，所述方法包括使细胞或细胞群与GPCR配体接触，其中配体与GPCR复合并引发或抑制GPCR活性。在某些实施方案中，GPCR配体在细胞中表达。在某些实施方案中，GPCR配体选自多肽、非肽化合物和小分子。
附图说明
本专利申请包含至少一个彩色绘图。在提出要求并支付必要费用后，专利局将提供本专利或专利申请的带有彩色图纸的副本。
图1示出了本文所述的示例性实施方案，其中可以通过上调或下调腺苷酸环化酶(AC)的至少一个家族成员的表达来更准确和稳健地测量G蛋白偶联受体(GPCR)活性。腺苷酸环化酶的上调或下调由双头箭头指示。
图2示出了本文所述的通过改变腺苷酸环化酶(AC)的表达水平来增加GPCR活性的基因表达盒设计。图2A示出了示例性的第二代基因表达盒，其中AC3的表达可以被敲低，而AC6表达可以增加。图2B示出了示例性的第三代基因表达盒，其中可以通过用多个指导RNA靶向AC3来敲低AC3表达，以用转录阻遏物下调AC3。图2C示出了示例性的第一代基因表达盒，其中仅AC6表达增加。
图3示出了通过改变AC表达而增加的GPCR活性(MADSv2.5盒，例如图2A的第二代基因表达盒)。
图4示出了从包含图2C的第一代基因表达盒的细胞产生的萤光素酶测量，显示仅AC6过表达时反向CRE活性增加。
图5示出了从包含图2B的第三代基因表达盒(包含AC3敲低)的细胞产生的平台数据，显示了与从包含本文所述的第二代基因表达盒的细胞产生平台数据相比的改进。
具体实施方式
尽管本文已经显示和描述了本公开的优选实施方案，但对于本领域技术人员明显的是，这些实施方案仅作为示例提供。在不脱离本公开的情况下，对于本领域技术人员来说，现在将发生许多变化、改变和替换。应当理解，在实践本公开时可以采用本文所描述的本公开的实施方案的各种替代方案。以下权利要求限定了本公开的范围，并且在这些权利要求及其等同的范围内的方法和结构由此被覆盖。
绝对或顺序术语的使用，例如，“将”、“将不”、“应该”、“不应该”、“必须”、“必须不”、“第一”、“最初的”、“下一”、“随后”、“之前”、“之后”、“最后”和“最终”，并不意味着限制本文公开的本实施方案的范围，而是作为示例性的。
如本文所用，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”也应包括复数形式。此外，如果在详细说明书和/或权利要求书中使用了术语“包括”、“包含”、“具有”、“有”、“带有”或其变体，则这些术语旨在以类似于术语“包含”的方式具有包容性。
如本文所用，短语“至少一个”、“一个或多个”和“和/或”是开放式表达式，在操作中既是合取的又是析取的。例如，“A、B和C中的至少一个”、“A、B或C中的至少一个”、“A、B和C中的一个或多个”、“A、B或C中的一个或多个”和“A、B和/或C”中的每一个表达都表示单独A、单独B、单独C、A和B一起、A和C一起、B和C一起、或A、B和C一起。
如本文所用，“或”可指“和”、“或”、“和/或”，并可排他性使用和包涵性使用。例如，术语“A或B”可以指“A或B”、“A但不是B”、“B但不是A”和“A和B”。在一些情况下，上下文可能会规定特定的含义。
本文描述的任何系统和方法都是模块化的，不限于顺序步骤。因此，术语诸如“第一”和“第二”并不一定意味着优先性、重要性顺序或行为顺序。
术语“约”或“近似”是指本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定该值，例如测量系统的限制。例如，“约”可以是指根据给定值的实践，在1或超过1个标准偏差内。在一些情况下，“约”或“近似”是指相距(加或减)规定量10％的量。
如本文所用，短语“小分子”是指具有低分子量(例如，900道尔顿)的任何分子。在一些情况下，分子可以是可以调节生物过程或反应的有机化合物。在一些情况下，小分子可以与GPCR或GPCR的配体结合以增加或降低GPCR活性。在一些情况下，小分子是GPCR的配体。小分子的非限制性实例可包括阿夫唑嗪(alfuzosin)、特拉唑嗪(terazosin)、氯压定(clonidine)、比索洛尔(bisoprolol)、倍他洛尔(betaxolol)、美托洛尔(metoprolol)、阿替洛尔(atenolol)、沙丁胺醇(albuterol)、那多洛尔(nadolol)、喷布洛尔(penbutolol)、托特罗定(tolterodine)、阿托品(atropine)、东莨菪碱(scopolamine)、降钙素(calcimar)、甲氧氯普胺(metoclopramide)、氟哌啶醇(haloperidol)、奥氮平(olanzapine)、罗匹尼罗(ropinirole)、普拉克索(pramipexole)、氯雷他定(loratadine)、西替利嗪(cetirizine)、乘晕宁(dimenhydrinate)、西咪替丁(cimetidine)、雷尼替丁(ranitidine)、曲唑酮(trazodone)、舒马曲普坦(sumatriptan)、艾塞那肽(exenatide)、芬太尼(fentanyl)、可待因(codeine)、哌替啶(meperidine)、羟考酮(oxycodone)、孟鲁司特(montelukast)或米索前列醇(misoprostol)。
在本申请和权利要求中描述了特定值的情况下，除非另有说明，否则术语“约”应假定为特定值的可接受误差范围。
如本文使用的术语“增加的”、“渐增的”或“增加”通常指统计上显著量的增加。在一些情况下，术语“增加的”或“增加”是指与参考水平相比增加至少10％，例如与参考水平、标准或对照相比，增加至少约10％、至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或高达并包括100％的增加或10-100％之间的任何增加。“增加”的其他实例包括与参考水平相比增加至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍或更多。
如本文使用的术语“减少的”、“渐少的”或“减少”通常指统计上显著量的减少。在一些情况下，“减少的”或“减少”是指与参考水平相比减少至少10％，例如与参考水平相比，减少至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或高达并包括100％的减少(例如，与参考水平相比，不存在水平或不可检测水平)或在10-100％之间的任何减少。在标记物或症状的上下文中，这些术语意味着该水平在统计上显著减少。该减少可以是，例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或更多，并且优选地降低到对于没有给定疾病的个体而言可接受的正常范围内的水平。
如本文所用，“细胞”通常指生物细胞。细胞是活体生物体的基本结构、功能和/或生物单元。细胞可以来源于具有一个或多个细胞的任何生物体。一些非限制性实例包括：原核细胞、真核细胞、细菌细胞、古菌细胞、单细胞真核生物体的细胞、原生动物细胞、来自植物的细胞、真菌细胞(例如，酵母细胞、来自蘑菇的细胞)、动物细胞、来自无脊椎动物(例如，果蝇、刺胞动物、棘皮动物、线虫等)的细胞、来自脊椎动物(例如，鱼、两栖动物、爬行动物、鸟、哺乳动物)的细胞、或来自哺乳动物(例如，猪、牛、山羊、绵羊、啮齿动物、大鼠、小鼠、非人类灵长类动物、人类等)的细胞。有时细胞并非源自自然生物体(如细胞是人工合成的，有时称为人工细胞)。在一些情况下，细胞是初生细胞。在一些情况下，细胞衍生自细胞系。
如本文所使用的术语“核苷酸”通常指碱-糖-磷酸组合。核苷酸包括合成核苷酸。核苷酸包括合成核苷酸类似物。核苷酸是核酸序列(例如脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA))的单体单元。术语核苷酸可包括核糖核苷三磷酸三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸尿苷(UTP)、三磷酸胞嘧啶(CTP)、三磷酸盐鸟苷(GTP)和脱氧核糖核苷三磷酸如dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP或其衍生物。这样的衍生物可以包括，例如，[αS]dATP、7-脱氮-dGTP和7-脱氮-dATP，以及赋予含有它们的核酸分子核酸酶抗性的核苷酸衍生物。如本文所使用的术语核苷酸可以指双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)及其衍生物。双脱氧核糖核苷三磷酸的说明性实例可包括但不限于ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP和ddTTP。
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可互换地用于指单链、双链或多链形式的任何长度的核苷酸的聚合形式(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)或其类似物。在一些情况下，多核苷酸是外源性的(例如，异源多核苷酸)。在一些情况下，多核苷酸是细胞内源性的。在一些情况下，多核苷酸可以存在于无细胞环境中。在一些情况下，多核苷酸是基因或其片段。在一些情况下，多核苷酸是DNA。在一些情况下，多核苷酸是RNA。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。在一些情况下，多核苷酸包含一种或多种类似物(例如，改变的主链、糖或核碱基)。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。类似物的一些非限制性实例包括：5-溴尿嘧啶、肽核酸、异种核酸(xenonucleic acid)、吗啉核酸(morpholinos)、锁核酸、甘油核酸、苏糖核酸、双脱氧核苷酸、虫草素、7-脱氮-GTP、荧光团(例如与糖连接的罗丹明或荧光素)、含硫醇的核苷酸、生物素连接的核苷酸、荧光碱基类似物、CpG岛、甲基-7-鸟苷、甲基化核苷酸、肌苷、硫尿苷、假尿苷(pseudourdine)、二氢尿苷、辫苷和怀俄苷。多核苷酸的非限制性实例包括基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析限定的基因座(基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、指导RNA(gRNA)、微RNA(miRNA)、非编码RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、包括无细胞DNA(cfDNA)和无细胞RNA(cfRNA)的无细胞多核苷酸、核酸探针和引物。在一些情况下，核苷酸序列被非核苷酸成分中断。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换地用于指代氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。多肽，包括所提供的多肽链和其他肽，例如接头和结合肽，可以包括包括天然和/或非天然氨基酸残基的氨基酸残基。术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。在一些方面，多肽可以包含相对于原生或天然序列的修饰，只要蛋白质保持所需的活性即可。这些修饰可能是有意为之，如通过定点突变，或者也可能是偶然的，如产生蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增引起的错误。在一些情况下，多肽编码如本文所述的基因或转基因。
如本文所用的术语“基因”或“转基因”是指编码单个蛋白质或RNA的核酸片段(也称为“编码序列”或“编码区域”)，任选地与位于编码序列上游或下游的相关调控元件(如启动子、操作子、终止子等)一起。在一些情况下，启动子是诱导型启动子。在一些实施方案中，调控元件包含至少一个不编码转基因的可读框(ORF)。相反，调控元件中的ORF可以上调转基因。在一些实施方案中，调控元件中的ORF可以下调转基因。在一些实施方案中，调控元件中的ORF位于转基因的5’上游。在一些实施方案中，调控元件中的ORF位于转基因的3’下游。术语“基因”或“转基因”应被广泛解释，且可以包括基因的mRNA、cDNA、cRNA和基因组DNA形式。在一些用途中，术语“基因”包括转录序列，包括5′和3′非翻译区(5′-UTR和3′-UTR)、外显子和内含子。在一些基因中，转录区域将包含编码多肽的“可读框”。在该术语的一些用途中，“基因”或“转基因”仅包含编码多肽所必需的编码序列(例如，“可读框”或“编码区域”)。在一些方面，基因或转基因不编码多肽，例如核糖体RNA基因(rRNA)和转移RNA(tRNA)基因。在一些方面，术语“基因”或“转基因”不仅包括转录序列，而且还附加包括非转录区域，包括上游和下游调控元件，如调控区域、增强子和启动子。术语“基因”或“转基因”可以包括基因的mRNA、cDNA和基因组形式。
术语“反向环AMP活性”是指cAMP活性的降低或cAMP浓度的降低。
术语“表达”通常指多核苷酸从DNA模板转录(如转录成mRNA或其他RNA转录物)的一个或多个过程和/或转录的mRNA随后翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可以统称为“基因产物”。如果多核苷酸衍生自基因组DNA，则表达可以包括真核细胞中mRNA的剪接。在一些实施方案中，表达可以包括由本文所述的多核苷酸编码的多肽的生物活性。“上调”，就表达而言，通常是指多核苷酸(例如RNA，如mRNA)和/或多肽序列的表达水平与其在野生型状态下的表达水平相比增加。例如，与野生型状态下的基因或转基因的表达相比(例如，没有上调基因或转基因表达的本文所述的系统)，基因或转基因的表达可以由本文所述的系统上调至少0.1倍、0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或更多倍。“下调”通常是指多核苷酸(例如RNA，如mRNA)和/或多肽序列的表达水平与其在野生型状态下的表达相比降低。例如，与野生型状态下的基因或转基因的表达相比(例如，没有本文所述的系统上调基因或转基因表达)，基因或转基因的表达可以由本文所述的系统下调至少0.1倍、0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或更多倍。“野生型”或“野生型状态”可以指在自然界中发生的表达的表型或生物学测量或观察，而无需通过表达载体或核酸操纵来减少靶标的表达(例如，表达作为正常等位基因的产物，而不是作为突变或工程基因的产物或通过siRNA或CRISPR/Cas9系统表达)。
相对于参考多肽序列的序列同一性百分比(％)是指在比对序列并引入空位(如有必要)以实现最大序列同一性后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，并且不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以各种已知的方式实现，例如使用公开可用的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。能够确定用于比对序列的适当参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的算法。
当本文用于描述核酸序列时，与参考序列相比的术语“同一性”、“相同”或“相同的百分比”可以使用Karlin和Altschul描述的公式(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268,1990，修改为Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877,1993)来确定。这样的公式被结合到Altschul等人(J.Mol.Biol.215:403-410,1990)的基本局部比对搜索工具(BLAST)程序中。序列的同一性百分比可以使用截至本申请提交日的最新版本的BLAST来确定。
本文所述系统的多肽可由核酸编码。核酸是包含两个或更多个核苷酸碱基的多核苷酸类型。在某些实施方案中，核酸是载体的组分，所述载体可用于将编码多肽的多核苷酸转移到细胞中。如本文所用，术语“载体”是指能够运输与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是基因组整合载体，或“整合载体”，其可以整合到宿主细胞的染色体DNA中。另一种类型的载体是“附加型”载体，例如能够进行染色体外复制的核酸。能够指导与其操作性连接的基因表达的载体在本文中被称为“表达载体”。合适的载体包含质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、病毒载体等。在一些情况下，载体包含用于控制转录的调控元件，如启动子、增强子、多腺苷酸化信号。调控元件可以来源于哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因。在实施方案中，载体包括本文所述的基因表达盒。可以额外加入通常由复制起源赋予的在宿主中复制的能力以及促进识别转化体的选择基因。可以使用源自病毒的载体，如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等。质粒载体可以线性化以整合到染色体位置。载体可以包含引导位点特异性整合到基因组中位点限定的位置或限制性集合的序列(例如，AttP-AttB重组)。此外，载体可以包括衍生自用于整合的转座元件的序列。
如本文所用，术语“转染”或“转染的”是指通过实验室中常用的过程有意将外源核酸引入细胞的方法。转染可以通过例如脂质转染、磷酸钙沉淀、病毒转导或电穿孔来实现。转染可以是短暂的或稳定的。
如本文所用，术语“转染效率”是指细胞群掺入外源核酸的范围或程度。转染效率可以测量为掺入外源核酸的给定群体中的细胞与系统中的总细胞群相比的百分比(％)。可以在瞬时和稳定转染的细胞中测量转染效率。
如本文所用，术语“生物激活多肽”是指由调节基因表达的细胞表达的多肽。生物激活多肽可以直接、通过经由一个或多个中介分子或多肽的信号传导、响应刺激、或通过任何其他机制来调节基因表达。生物激活多肽可以是跨膜多肽(如受体或通道蛋白)、细胞内多肽(如信号转导中介物)、细胞外多肽或分泌的多肽。
如本文所用，“报告子活性”是指报告子的经验读出。例如，当与适当的底物孵育时，萤光素酶报告子将具有发光读出。其他报告子，如荧光蛋白，可能不需要底物，但可以通过例如显微术或荧光板读取器进行测量。在一些实施方案中，报告子由报告基因核酸编码。在一些情况下，报告子的表达由本文所述的调控元件或启动子驱动。在一些实施方案中，报告基因的表达由cAMP应答元件如cAMP应答元件结合蛋白(CREB)驱动。
概述
本文所述的系统和方法可以通过检测与GPCR活性相关的应答元件结合启动子的存在和/或激活水平来测量GPCR活性。本文还描述了用于提高GPCR活性的系统和方法。在一些情况下，与用于测量GPCR活性的常规报告系统和方法相比，在测量GPCR活性时，本文所述的系统和方法允许具有降低的背景的GPCR活性。在一些情况下，与用于测量GPCR活性的常规报告系统和方法相比，本文所述的系统和方法允许具有增加的cAMP信号水平的GPCR活性。在一些实施方案中，本文所述的系统和方法包括编码本文所述效应物的至少一种核酸。在一些情况下，所述至少一种核酸包含调控元件。在某些实施方案中，应答元件结合启动子在GPCR活性(例如GPCR的信号传导级联)结束时被激活。在某些实施方案中，应答元件结合启动子的存在可以在外部刺激物(如肽、大分子、化合物或与GPCR结合或复合的小分子)之前和之后测量。在某些实施方案中，系统或方法可用于药物发现目的的筛选。在一些情况下，系统或方法最低限度地包含至少一个核酸，所述核酸包含驱动报告子表达的应答元件调控的启动子。在某些实施方案中，报告子是多肽。在某些实施方案中，报告子可进一步包含用于识别特定细胞类型或特定细胞群的唯一分子标识符(UMI)，例如独特核酸序列。
作为非限制性实例，生物激活多肽可包含特定的G-偶联蛋白受体(GPCR)，其已知有数百种。因此，UMI元件允许以多路复用形式简单而快速地询问几种不同的生物激活多肽的信号传导。此外，本文提供的系统和方法通过应答元件调控的启动子降低背景。这在任何可能激活生物激活多肽的化合物的多路复用筛选中允许更准确的定量并减少假阳性测试化合物的数量。在某些实施方案中，不存在编码报告多肽的核酸序列。在某些实施方案中，不存在编码UMI的核酸序列。在某些实施方案中，编码UMI的核酸序列是编码报告多肽的核酸序列的5’。在某些实施方案中，编码报告多肽的核酸序列是编码UMI的核酸序列的5’。
在某些实施方案中，编码报告子的核酸编码报告多肽。在某些实施方案中，报告多肽能够被直接检测。在某些实施方案中，报告多肽在蛋白质的酶活性上对底物产生可检测的信号。在某些实施方案中，报告多肽的检测可以定量地完成。在某些实施方案中，报告多肽包含萤光素酶蛋白、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型胎盘碱性磷酸酶或其组合。在某些实施方案中，报告多肽是萤光素酶蛋白，底物的非限制性实例包括萤火虫萤光素、latia萤光素、细菌萤光素、腔肠菌素、甲藻萤光素、海萤荧光素(vargulin)和3-羟基牛奶树碱(3-hydroxy hispidin)。
在某些实施方案中，编码报告子的核酸也可以编码UMI。UMI包含核酸所特有的短核苷酸序列。UMI的长度可以是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个核苷酸。UMI能够以允许UMI序列确定的任何合适的方式被检测，诸如通过下一代测序方法。检测UMI的方法可以是定量的，并且包括下一代测序方法。
在某些实施方案中，本文所述为使用本文所述系统的方法，所述系统包含至少一个编码本文所述的效应物的核酸和用于药物发现的报告核酸。在某些实施方案中，该方法包括在足以使核酸被细胞内化和表达的条件下使核酸与细胞或细胞群接触(例如，转染)；使细胞与物理或化学刺激物接触；以及通过一个或多个测定来确定报告子的激活。在某些实施方案中，该方法包括接触包含编码转录因子核酸和报告核酸的核酸的细胞或细胞群；以及通过一个或多个测定来确定报告子的激活。
本公开的一个非限制性实施方案如图1所示。细胞100包含本文所述的用于测量GPCR活性的系统。GPCR 101与GPCR配体102接触。在GPCR 101和GPCR配体102之间接触时，G蛋白103的Gα亚基从Gβ和Gγ解离以与腺苷酸环化酶(AC)家族104的各种成员相互作用。通过上调或下调各种AC家族成员104的表达，可以通过检测本文所述的报告构建体105的表达的存在和水平来更稳健和准确地测量GPCR活性。在一些情况下，报告构建体105可以任选地包含用于识别包含本文所述系统的特定细胞类型或特定细胞群的唯一分子标识符(UMI)核酸序列。
GPCR活性
在一些实施方案中，本文描述了用于测量细胞中GPCR活性的系统和方法。在一些情况下，该系统包含编码GPCR活性的第一效应物的第一核酸。在一些情况下，第一核酸可以操作性地偶联到配置为过表达GPCR活性的第一效应物的调控元件。在一些实施方案中，调控元件包括启动子、增强子或其组合。在一些情况下，该系统可进一步包含第二核酸，所述第二核酸降低GPCR活性的第二效应物的表达。在一些情况下，GPCR活性包括由配体与细胞表达的GPCR结合或复合引起的活性。在一些实施方案中，该系统包括附加的效应物。
GPCR可以是产生GPCR活性的任何GPCR。在一些实施方案中，GPCR对于包含本文所述系统的细胞可以是外源性或内源性。例如，GPCR可以是作为转基因引入包含本文所述系统的细胞中的外源性GPCR。在一些情况下，GPCR可以是携带本文所述系统的细胞的内源性GPCR。在一些情况下，GPCR可以被配体刺激以产生GPCR活性。在一些实施方案中，GPCR可以独立于或在不存在与GPCR复合或结合的配体的情况下产生GPCR活性。在一些实施方案中，GPCR活性包含孤儿GPCR活性，其中GPCR活性可以由与GPCR复合或结合的推定配体或未知配体产生。示例性GPCR可包括腺苷受体、β-肾上腺素受体、神经降压素受体、毒蕈碱酸受体、5-羟色胺受体、肾上腺素受体、过敏毒素受体、血管紧张素受体、爱帕琳肽受体、蛙皮素受体、缓激肽受体、大麻素受体、趋化因子受体、胆囊收缩素受体、多巴胺受体、内皮素受体、游离脂肪酸受体、胆汁酸受体、甘丙肽受体、胃动素受体、胃促生长素受体、糖蛋白激素受体、GnRH受体、组胺受体、KiSS1衍生肽受体、白三烯和脂氧素受体、溶血磷脂受体、黑色素浓缩激素受体、黑皮质素受体、褪黑激素受体、神经介肽U受体、神经肽受体、N-甲酰基肽家族受体、烟酸受体、阿片受体、视蛋白样受体、食欲素受体、P2Y受体、肽P518受体、血小板激活因子受体、前动力蛋白受体、催乳素释放肽受体、前列腺素受体、蛋白酶激活受体、松弛素受体、生长抑素受体、SPC/LPC受体、速激肽受体、微量氨基受体、促甲状腺激素释放激素受体、尾加压素受体、加压素/催产素受体、孤儿GPCR、降钙素受体、促肾上腺皮质激素释放因子受体、胰高血糖素受体、甲状旁腺受体、VIP/PACAP受体、LNB7TM受体、GABA受体、代谢型谷氨酸受体或钙感受器受体。
在一些实施方案中，与本文所述的GPCR复合或结合的配体是已知的。在一些情况下，GPCR的配体可以是激动剂或部分激动剂，并且能够与GPCR复合或结合并增加细胞中的GPCR活性。在一些实施方案中，配体可以是反向激动剂，其中配体与GPCR结合或复合降低了基础GPCR活性。在一些实施方案中，与GPCR复合或结合的配体可以是拮抗剂，其与GPCR结合并阻断GPCR激动剂的结合。在一些情况下，配体是小的有机或无机部分。在一些情况下，配体可以是多肽。多肽可以是天然存在的GPCR结合蛋白或能够与GPCR结合或复合的其他蛋白质、衍生物或其片段。在一些实施方案中，多肽可以是结合GPCR的抗体。抗体可以是任何免疫球蛋白，包括包含抗原结合结构域(如Fab、F(ab′)2、单链Fv(scFv)、Fv、结构域抗体(dAbs)、纳米体和双体)的任何免疫球球蛋白亚型、亚类、单克隆抗体及其片段。在一些实施方案中，配体可以与GPCR共价连接。在一些实施方案中，配体可以是拟肽、核酸、肽核酸(PNA)、大分子或适配体。在一些实施方案中，配体可以是离子，诸如Na+或Zn2+。在一些实施方案中，配体可以是脂质。在一些实施方案中，配体可以是碳水化合物。在一些实施方案中，配体可以以从毫摩尔(mM)到皮摩尔(pM)的解离常数(Kd)与GPCR结合。
在一些实施方案中，GPCR活性包括G蛋白活性。在一些情况下，G蛋白活性可以是刺激活性。在一些情况下，G蛋白活性可以是抑制活性。G蛋白活性可包含G蛋白α亚基(Gα)、G蛋白β亚基(Gβ)、G蛋白质γ亚基(Gγ)和/或G蛋白β和γ亚基(Gβγ)的活性。在一些情况下，G蛋白活性包含Gα的活性。Gα活性可包括Giα亚基的活性、Gsα亚基活性、Gqα亚基活性或G12α亚基的活性。在一些情况下，G蛋白活性包括Giα亚基活性。Giα亚基可以包括Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαo、Gαt、Gαg或Gαz。Gsα亚基可以包括Gαs或Gαolf，Gqα亚基可以包括Gαq、Gα11、Gα14或Gα16。G12α亚基可以包括Gα12或Gα13。在一些情况下，Gβ亚基可以包括Gβ1、Gβ2、Gβ3、Gβ4或Gβ5。在一些情况下，Gγ亚基可以包括Gγ1、Gγ2、Gγ3、Gγ4、Gγ5、Gγ6、Gγ7、Gγ8、Gγ9、Gγ10、Gγ11或Gγ12。
在一些情况下，GPCR活性包括GPCR的至少一个效应物的活性。在一些情况下，GPCR的效应物包括与G蛋白相关的第二信使。例如，GPCR活性包括为与G蛋白活性相关的第二信使的活性效应物，如腺苷酸环、磷脂酶、磷酸二酯酶、激酶或离子通道。在一些实施方案中，GPCR活性包括环AMP(cAMP)活性。在一些实施方案中，GPCR活性包括反向cAMP活性。在一些情况下，GPCR活性包括与G蛋白相关的信使或分子的下游信号传导。例如，GPCR活性可以包括与本文所述的报告核酸结合的cAMP应答元件的转录或翻译活性。在一些情况下，GPCR活性可以从由结合至本文所述的报告核酸的cAMP应答元件产生的可检测信号来测量。在一些实施方案中，GPCR活性与本文所述的报告子产生的可检测信号成比例。
在一些实施方案中，本文所述的系统包含至少一个核酸以调节本文所述任何一个效应物的表达。在一些情况下，核酸编码本文所述的任何一个效应物。在一些实施方案中，核酸编码调控元件，其调节效应物的表达。在一些实施方案中，调控元件包含启动子、增强子或其组合。在一些实施方案中，调控元件包含启动子。在一些实施方案中，调控元件包含增强子。在一些实施方案中，调控元件上调效应物的表达。在一些实施方案中，调控元件下调效应物的表达。在一些实施方案中，核酸编码调控元件和效应物二者，其中调控元件上调由核酸编码的效应物的表达。在一些实施方案中，核酸编码调控元件和效应物二者，其中调控元件下调由核酸编码的效应物的表达。在一些实施方案中，所述至少一个核酸编码本文所述的任何一个效应物和本文所述任何一个调节元件。在一些实施方案中，所述至少一个核酸编码一个效应物和一个调节元件。例如，所述至少一个核酸可以编码操作性偶联到调控元件的效应物。在一些实施方案中，本文所述的系统包括包含第一腺苷酸环化酶的至少第一效应物和包含第二腺苷酸环酶的至少第二效应物。在一些实施方案中，第一效应物和第二效应物在不同调控元件的表达控制之下。在一些实施方案中，第一效应物由与启动子或增强子操作性偶联的核酸编码，其中与野生型状态相比，启动子或增强子增加或过表达第一效应物的表达。在一些实施方案中，第一腺苷酸环化酶由与启动子或增强子操作性偶联的核酸编码，其中与野生型状态相比，启动子或增强子增加或过表达第一腺苷酸环化酶的表达。
在一些实施方案中，由调控元件调节的效应物是腺苷酸环化酶。在一些实施方案中，腺苷酸环化酶是ADCY1、ADCY2、ADCY3、ADCY4、ADCY5、ADCY6、ADCY7、ADCY8、ADCY9或ADCY10。在一些实施方案中，调控元件上调ADCY1、ADCY2、ADCY3、ADCY4、ADCY5、ADCY6、ADCY7、ADCY8、ADCY9或ADCY10中的任一种。在一些实施方案中，调控元件上调ADCY6。在一些实施方案中，调控元件下调ADCY1、ADCY2、ADCY3、ADCY4、ADCY5、ADCY6、ADCY7、ADCY8、ADCY9或ADCY10中的任一种。在一些实施方案中，核酸编码可以下调本文所述的任何一个效应物的表达的RNA。在一些实施方案中，RNA包括短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、指导RNA(gRNA)或微RNA(miRNA)以下调效应物的表达。在一些情况下，gRNA可以募集并与gRNA指导的核酸酶形成复合物，以引导核酸酶消化效应物的核酸。可被募集以消化效应物的核酸(并随后降低表达)的gRNA指导的核酸酶的非限制性实例可包括CRISPR相关(Cas)蛋白或Cas核酸酶，包括I型CRISPR相关(Cas)多肽、II型CRISPR相关(Cas)多肽、III型CRISPR相关(Cas)多肽、IV型CRISPR相关(Cas)多肽、V型CRISPR相关(Cas)多肽和VI型CRISPR相关(Cas)多肽；锌指核酸酶(ZFN)；转录激活子样效应物核酸酶(TALEN)；大核酸酶；RNA结合蛋白(RBP)；CRISPR相关RNA结合蛋白；重组酶；翻转酶；转座酶；Argonaute(Ago)蛋白(例如，原核Argonate(pAgo)、古菌Argonaite(aAgo)和真核Argonaute(eAgo))；其任何衍生物；其任何变体及其任何片段。在一些实施方案中，gRNA指导的核酸酶可以是CRISPR相关(Cas)蛋白。在一些实施方案中，gRNA指导的核酸酶可以是CRISPR/Cas9蛋白。在一些实施方案中，gRNA指导的核酸酶如CRISPR/Cas9蛋白可以由还编码gRNA的相同核酸编码。在一些实施方案中，gRNA指导的核酸酶如CRISPR/Cas9蛋白可以由编码gRNA的不同核酸编码。
在一些实施方案中，RNA包含微RNA以下调效应物的表达。在一些实施方案中，RNA包含siRNA、shRNA、gRNA或miRNA以下调本文所述的任何一种腺苷酸环化酶(例如ADCY1、ADCY2、ADCY3、ADCY4、ADCY5、ADCY6、ADCY7、ADCY8、ADCY9或ADCY10)。在一些实施方案中，RNA包含siRNA、shRNA、miRNA或gRNA以下调ADCY3。
在一些实施方案中，可以通过使细胞与抑制剂接触来敲低或敲除细胞中至少一种效应物的活性来下调至少一种效应物。在一些情况下，抑制剂可以是GPCR的抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂可以是腺苷酸环化酶的抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂可以是拮抗剂。在一些实施方案中，拮抗剂可以是GPCR的拮抗剂。在一些实施方案中，拮抗剂可以是腺苷酸环化酶的拮抗剂。在一些实施方案中，抑制剂可以是反向激动剂。在一些实施方案中，拮抗剂可以是GPCR的反向激动剂。在一些实施方案中，拮抗剂可以是腺苷酸环化酶的反向激动剂。腺苷酸激动剂的示例性抑制剂可以包括KH7、MDL12330A、NKY80、SKF 83566、SQ22536和ST034307。
在一些实施方案中，本文所述的系统包含由第一调控元件上调的至少一个效应物和由第二调控元件下调的至少一个其他不同的效应物。在一些实施方案中，该系统包括由第一调控元件上调的至少一个腺苷酸环化酶和由第二调控元件下调的至少一个其他不同的腺苷酸环化酶。在一些实施方案中，该系统包括由第一调控元件上调的ADCY6和由第二调控元件下调的ADCY3。
在一些实施方案中，通过使细胞与激活剂接触，可以在细胞中上调至少一个效应物。在一些情况下，激活剂可以是GPCR的激活剂。在一些实施方案中，激活剂可以是腺苷酸环化酶的激活剂。在一些实施方案中，激活剂可以是激动剂。在一些实施方案中，激动剂可以是GPCR的激动剂。在一些实施方案中，激动剂可以是腺苷酸环化酶的激动剂。腺苷酸激动剂的示例性激活剂可以包括毛喉素、NKH477、PACAP1-27和PACAP1-38。
在一些实施方案中，本文所述的系统增加GPCR活性。在一些实施方案中，本文所述的系统增加可测量的GPCR活性。在一些实施方案中，可测量的GPCR活性包含可测量的G蛋白活性。在一些实施方案中，可测量的GPCR活性包含G蛋白α亚基(Gα)活性、G蛋白β亚基(Gβ)活性、G蛋白γ亚基(Gγ)活性和/或G蛋白β和γ亚基(Gβγ)活性。在一些情况下，G蛋白包含Gα的活性。Gα活性可包括Giα亚基的活性、Gsα亚基活性、Gqα亚基活性或G12α亚基的活性。在一些情况下，G蛋白活性包括Giα亚基活性。在一些实施方案中，与没有该系统的细胞中的Giα亚基活性相比，该系统增加了包含该系统的细胞中Giα亚基活性。在一些实施方案中，该系统使细胞中可测量的Giα亚基活性增加至少约0.1倍至约10,000倍。在一些实施方案中，该系统使细胞中可测量的Giα亚基活性增加至少约0.1倍至约0.5倍、约0.1倍至约1倍、约0.1倍至约2倍、约0.1倍至约5倍、约0.1倍至约10倍、约0.1倍至约20倍、约0.1倍至约50倍、约0.1倍至约100倍、约0.1倍至约500倍、约0.1倍至约1,000倍、约0.1倍至约10,000倍、约0.5倍至约1倍、约0.5倍至约2倍、约0.5倍至约5倍、约0.5倍至约10倍、约0.5倍至约20倍、约0.5倍至约50倍、约0.5倍至约100倍、约0.5倍至约500倍、约0.5倍至约1,000倍、约0.5倍至约10,000倍、约1倍至约2倍、约1倍至约5倍、约1倍至约10倍、约1倍至约20倍、约1倍至约50倍、约1倍至约100倍、约1倍至约500倍、约1倍至约1,000倍、约1倍至约10,000倍、约2倍至约5倍、约2倍至约10倍、约2倍至约20倍、约2倍至约50倍、约2倍至约100倍、约2倍至约500倍、约2倍至约1,000倍、约2倍至约10,000倍、约5倍至约10倍、约5倍至约20倍、约5倍至约50倍、约5倍至约100倍、约5倍至约500倍、约5倍至约1,000倍、约5倍至约10,000倍、约10倍至约20倍、约10倍至约50倍、约10倍至约100倍、约10倍至约500倍、约10倍至约1,000倍、约10倍至约10,000倍、约20倍至约50倍、约20倍至约100倍、约20倍至约500倍、约20倍至约1,000倍、约20倍至约10,000倍、约50倍至约100倍、约50倍至约500倍、约50倍至约1,000倍、约50倍至约10,000倍、约100倍至约500倍、约100倍至约1,000倍、约100倍至约10,000倍、约500倍至约1,000倍、约500倍至约10,000倍或约1,000倍至约10,000倍。在一些实施方案中，该系统使细胞中可测量的Giα亚基活性增加至少约0.1倍、约0.5倍、约1倍、约2倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍、约500倍、约1,000倍或约10,000倍。在一些实施方案中，该系统使细胞中可测量的Giα亚基活性增加至少至少约0.1倍、约0.5倍、约1倍、约2倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍、约500倍或约1,000倍。在一些实施方案中，该系统使细胞中可测量的Giα亚基活性增加至少至多约0.5倍、约1倍、约2倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍、约500倍、约1,000倍或约10,000倍。
在一些实施方案中，GPCR活性包含可测量的cAMP活性。在一些情况下，可测量的cAMP活性包含cAMP浓度的增加或减少。在一些实施方案中，与没有该系统的细胞中的cAMP活性相比，该系统增加了包含该系统的细胞中的可测量的cAMP活性。在一些实施方案中，该系统使细胞中可测量的cAMP增加至少约0.1倍至约10,000倍。在一些实施方案中，该系统使细胞中cAMP增加至少约0.1倍至约0.5倍、约0.1倍至约1倍、约0.1倍至约2倍、约0.1倍至约5倍、约0.1倍至约10倍、约0.1倍至约20倍、约0.1倍至约50倍、约0.1倍至约100倍、约0.1倍至约500倍、约0.1倍至约1,000倍、约0.1倍至约10,000倍、约0.5倍至约1倍、约0.5倍至约2倍、约0.5倍至约5倍、约0.5倍至约10倍、约0.5倍至约20倍、约0.5倍至约50倍、约0.5倍至约100倍、约0.5倍至约500倍、约0.5倍至约1,000倍、约0.5倍至约10,000倍、约1倍至约2倍、约1倍至约5倍、约1倍至约10倍、约1倍至约20倍、约1倍至约50倍、约1倍至约100倍、约1倍至约500倍、约1倍至约1,000倍、约1倍至约10,000倍、约2倍至约5倍、约2倍至约10倍、约2倍至约20倍、约2倍至约50倍、约2倍至约100倍、约2倍至约500倍、约2倍至约1,000倍、约2倍至约10,000倍、约5倍至约10倍、约5倍至约20倍、约5倍至约50倍、约5倍至约100倍、约5倍至约500倍、约5倍至约1,000倍、约5倍至约10,000倍、约10倍至约20倍、约10倍至约50倍、约10倍至约100倍、约10倍至约500倍、约10倍至约1,000倍、约10倍至约10,000倍、约20倍至约50倍、约20倍至约100倍、约20倍至约500倍、约20倍至约1,000倍、约20倍至约10,000倍、约50倍至约100倍、约50倍至约500倍、约50倍至约1,000倍、约50倍至约10,000倍、约100倍至约500倍、约100倍至约1,000倍、约100倍至约10,000倍、约500倍至约1,000倍、约500倍至约10,000倍或约1,000倍至约10,000倍。在一些实施方案中，该系统使细胞中cAMP增加至少约0.1倍、约0.5倍、约1倍、约2倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍、约500倍、约1,000或约10,000倍。在一些实施方案中，该系统使细胞中cAMP增加至少至少约0.1倍、约0.5倍、约1倍、约2倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍、约500倍或约1,000倍。在一些实施方案中，该系统使细胞中cAMP增加至少至多约0.5倍、约1倍、约2倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍、约500倍、约1,000倍或约10,000倍。
在一些实施方案中，GPCR活性包含可测量的反向cAMP活性。在一些实施方案中，与没有该系统的细胞中的反向cAMP活性相比，该系统增加了包含该系统的细胞中可测量的反向cAMP活性。在一些实施方案中，该系统使细胞中的反向cAMP增加至少约0.1倍至约10,000倍。在一些实施方案中，该系统使反向cAMP增加至少约0.1倍至约0.5倍、约0.1倍至约1倍、约0.1倍至约2倍、约0.1倍至约5倍、约0.1倍至约10倍、约0.1倍至约20倍、约0.1倍至约50倍、约0.1倍至约100倍、约0.1倍至约500倍、约0.1倍至约1,000倍、约0.1倍至约10,000倍、约0.5倍至约1倍、约0.5倍至约2倍、约0.5倍至约5倍、约0.5倍至约10倍、约0.5倍至约20倍、约0.5倍至约50倍、约0.5倍至约100倍、约0.5倍至约500倍、约0.5倍至约1,000倍、约0.5倍至约10,000倍、约1倍至约2倍、约1倍至约5倍、约1倍至约10倍、约1倍至约20倍、约1倍至约50倍、约1倍至约100倍、约1倍至约500倍、约1倍至约1,000倍、约1倍至约10,000倍、约2倍至约5倍、约2倍至约10倍、约2倍至约20倍、约2倍至约50倍、约2倍至约100倍、约2倍至约500倍、约2倍至约1,000倍、约2倍至约10,000倍、约5倍至约10倍、约5倍至约20倍、约5倍至约50倍、约5倍至约100倍、约5倍至约500倍、约5倍至约1,000倍、约5倍至约10,000倍、约10倍至约20倍、约10倍至约50倍、约10倍至约100倍、约10倍至约500倍、约10倍至约1,000倍、约10倍至约10,000倍、约20倍至约50倍、约20倍至约100倍、约20倍至约500倍、约20倍至约1,000倍、约20倍至约10,000倍、约50倍至约100倍、约50倍至约500倍、约50倍至约1,000倍、约50倍至约10,000倍、约100倍至约500倍、约100倍至约1,000倍、约100倍至约10,000倍、约500倍至约1,000倍、约500倍至约10,000倍或约1,000倍至约10,000倍。在一些实施方案中，该系统使反向cAMP增加至少约0.1倍、约0.5倍、约1倍、约2倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍、约500倍、约1,000或约10,000倍。在一些实施方案中，该系统使反向cAMP增加至少至少约0.1倍、约0.5倍、约1倍、约2倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍、约500倍或约1,000倍。在一些实施方案中，该系统使反向cAMP增加至少至多约0.5倍、约1倍、约2倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍、约500倍、约1,000倍或约10,000倍。
在一些实施方案中，与没有该系统的细胞中GPCR活性与背景之间的可测量比率相比，该系统在包含该系统的细胞中测量GPCR活性期间增加了GPCR活性与背景之间的可测量比率。在一些实施方案中，该系统使细胞中GPCR活性与背景之间的可测量比率增加至少约0.1倍至约10,000倍。在一些实施方案中，该系统使细胞中GPCR活性与背景之间的可测量比率增加至少约0.1倍至约0.5倍、约0.1倍至约1倍、约0.1倍至约2倍、约0.1倍至约5倍、约0.1倍至约10倍、约0.1倍至约20倍、约0.1倍至约50倍、约0.1倍至约100倍、约0.1倍至约500倍、约0.1倍至约1,000倍、约0.1倍至约10,000倍、约0.5倍至约1倍、约0.5倍至约2倍、约0.5倍至约5倍、约0.5倍至约10倍、约0.5倍至约20倍、约0.5倍至约50倍、约0.5倍至约100倍、约0.5倍至约500倍、约0.5倍至约1,000倍、约0.5倍至约10,000倍、约1倍至约2倍、约1倍至约5倍、约1倍至约10倍、约1倍至约20倍、约1倍至约50倍、约1倍至约100倍、约1倍至约500倍、约1倍至约1,000倍、约1倍至约10,000倍、约2倍至约5倍、约2倍至约10倍、约2倍至约20倍、约2倍至约50倍、约2倍至约100倍、约2倍至约500倍、约2倍至约1,000倍、约2倍至约10,000倍、约5倍至约10倍、约5倍至约20倍、约5倍至约50倍、约5倍至约100倍、约5倍至约500倍、约5倍至约1,000倍、约5倍至约10,000倍、约10倍至约20倍、约10倍至约50倍、约10倍至约100倍、约10倍至约500倍、约10倍至约1,000倍、约10倍至约10,000倍、约20倍至约50倍、约20倍至约100倍、约20倍至约500倍、约20倍至约1,000倍、约20倍至约10,000倍、约50倍至约100倍、约50倍至约500倍、约50倍至约1,000倍、约50倍至约10,000倍、约100倍至约500倍、约100倍至约1,000倍、约100倍至约10,000倍、约500倍至约1,000倍、约500倍至约10,000倍或约1,000倍至约10,000倍。在一些实施方案中，该系统使细胞中GPCR活性与背景之间的比率增加至少约0.1倍、约0.5倍、约1倍、约2倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍、约500倍、约1,000倍或约10,000倍。在一些实施方案中，该系统使细胞中GPCR活性与背景之间的比率增加至少至少约0.1倍、约0.5倍、约1倍、约2倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍、约500倍或约1,000倍。在一些实施方案中，该系统使细胞中GPCR活性与背景之间的比率增加至少至多约0.5倍、约1倍、约2倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍、约500倍、约1,000倍或约10,000倍。
在一些实施方案中，与没有该系统的细胞中的背景相比，该系统在包含该系统的细胞中的GPCR活性的测量期间降低了背景。在一些实施方案中，在GPCR活性的测量期间，包含该系统的细胞中的背景降低至少约0.1倍至约10,000倍。在一些实施方案中，在GPCR活性的测量期间，包含该系统的细胞中的背景降低至少约0.1倍至约0.5倍、约0.1倍至约1倍、约0.1倍至约2倍、约0.1倍至约5倍、约0.1倍至约10倍、约0.1倍至约20倍、约0.1倍至约50倍、约0.1倍至约100倍、约0.1倍至约500倍、约0.1倍至约1,000倍、约0.1倍至约10,000倍、约0.5倍至约1倍、约0.5倍至约2倍、约0.5倍至约5倍、约0.5倍至约10倍、约0.5倍至约20倍、约0.5倍至约50倍、约0.5倍至约100倍、约0.5倍至约500倍、约0.5倍至约1,000倍、约0.5倍至约10,000倍、约1倍至约2倍、约1倍至约5倍、约1倍至约10倍、约1倍至约20倍、约1倍至约50倍、约1倍至约100倍、约1倍至约500倍、约1倍至约1,000倍、约1倍至约10,000倍、约2倍至约5倍、约2倍至约10倍、约2倍至约20倍、约2倍至约50倍、约2倍至约100倍、约2倍至约500倍、约2倍至约1,000倍、约2倍至约10,000倍、约5倍至约10倍、约5倍至约20倍、约5倍至约50倍、约5倍至约100倍、约5倍至约500倍、约5倍至约1,000倍、约5倍至约10,000倍、约10倍至约20倍、约10倍至约50倍、约10倍至约100倍、约10倍至约500倍、约10倍至约1,000倍、约10倍至约10,000倍、约20倍至约50倍、约20倍至约100倍、约20倍至约500倍、约20倍至约1,000倍、约20倍至约10,000倍、约50倍至约100倍、约50倍至约500倍、约50倍至约1,000倍、约50倍至约10,000倍、约100倍至约500倍、约100倍至约1,000倍、约100倍至约10,000倍、约500倍至约1,000倍、约500倍至约10,000倍或约1,000倍至约10,000倍。在一些实施方案中，在GPCR活性的测量期间，包含该系统的细胞中的背景降低至少约0.1倍、约0.5倍、约1倍、约2倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍、约500倍、约1,000倍或约10,000倍。在一些实施方案中，在GPCR活性的测量期间，包含该系统的细胞中的背景降低至少至少约0.1倍、约0.5倍、约1倍、约2倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍、约500倍或约1,000倍。在一些实施方案中，在GPCR活性的测量期间，包含该系统的细胞中的背景降低至少至多约0.5倍、约1倍、约2倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍、约500倍、约1,000倍或约10,000倍。
在一些实施方案中，与没有该系统的细胞中的GPCR活性测量的可测量变异系数相比，该系统降低了包含该系统的细胞中的GPCR活性测量的可测量变异系数。在一些实施方案中，该系统使细胞中GPCR活性测量的可测量变异系数降低至少约0.1倍至约10,000倍。在一些实施方案中，该系统使细胞中GPCR活性测量的可测量变异系数降低至少约0.1倍至约0.5倍、约0.1倍至约1倍、约0.1倍至约2倍、约0.1倍至约5倍、约0.1倍至约10倍、约0.1倍至约20倍、约0.1倍至约50倍、约0.1倍至约100倍、约0.1倍至约500倍、约0.1倍至约1,000倍、约0.1倍至约10,000倍、约0.5倍至约1倍、约0.5倍至约2倍、约0.5倍至约5倍、约0.5倍至约10倍、约0.5倍至约20倍、约0.5倍至约50倍、约0.5倍至约100倍、约0.5倍至约500倍、约0.5倍至约1,000倍、约0.5倍至约10,000倍、约1倍至约2倍、约1倍至约5倍、约1倍至约10倍、约1倍至约20倍、约1倍至约50倍、约1倍至约100倍、约1倍至约500倍、约1倍至约1,000倍、约1倍至约10,000倍、约2倍至约5倍、约2倍至约10倍、约2倍至约20倍、约2倍至约50倍、约2倍至约100倍、约2倍至约500倍、约2倍至约1,000倍、约2倍至约10,000倍、约5倍至约10倍、约5倍至约20倍、约5倍至约50倍、约5倍至约100倍、约5倍至约500倍、约5倍至约1,000倍、约5倍至约10,000倍、约10倍至约20倍、约10倍至约50倍、约10倍至约100倍、约10倍至约500倍、约10倍至约1,000倍、约10倍至约10,000倍、约20倍至约50倍、约20倍至约100倍、约20倍至约500倍、约20倍至约1,000倍、约20倍至约10,000倍、约50倍至约100倍、约50倍至约500倍、约50倍至约1,000倍、约50倍至约10,000倍、约100倍至约500倍、约100倍至约1,000倍、约100倍至约10,000倍、约500倍至约1,000倍、约500倍至约10,000倍或约1,000倍至约10,000倍。在一些实施方案中，该系统使细胞中GPCR活性测量的变异系数降低至少约0.1倍、约0.5倍、约1倍、约2倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍、约500倍、约1,000倍或约10,000倍。在一些实施方案中，该系统使细胞中GPCR活性测量的变异系数降低至少至少约0.1倍、约0.5倍、约1倍、约2倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍、约500倍或约1,000倍。在一些实施方案中，该系统使细胞中GPCR活性测量的变异系数降低至少至多约0.5倍、约1倍、约2倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍、约500倍、约1,000倍或约10,000倍。
在一些实施方案中，与没有该系统的细胞中的GPCR活性测量的可测量假阳性相比，该系统降低了包含该系统的细胞中的GPCR活性测量的可测量假阳性。在一些实施方案中，该系统使细胞中GPCR活性测量的可测量假阳性降低至少约0.1倍至约10,000倍。在一些实施方案中，该系统使细胞中GPCR活性测量的可测量假阳性降低至少约0.1倍至约0.5倍、约0.1倍至约1倍、约0.1倍至约2倍、约0.1倍至约5倍、约0.1倍至约10倍、约0.1倍至约20倍、约0.1倍至约50倍、约0.1倍至约100倍、约0.1倍至约500倍、约0.1倍至约1,000倍、约0.1倍至约10,000倍、约0.5倍至约1倍、约0.5倍至约2倍、约0.5倍至约5倍、约0.5倍至约10倍、约0.5倍至约20倍、约0.5倍至约50倍、约0.5倍至约100倍、约0.5倍至约500倍、约0.5倍至约1,000倍、约0.5倍至约10,000倍、约1倍至约2倍、约1倍至约5倍、约1倍至约10倍、约1倍至约20倍、约1倍至约50倍、约1倍至约100倍、约1倍至约500倍、约1倍至约1,000倍、约1倍至约10,000倍、约2倍至约5倍、约2倍至约10倍、约2倍至约20倍、约2倍至约50倍、约2倍至约100倍、约2倍至约500倍、约2倍至约1,000倍、约2倍至约10,000倍、约5倍至约10倍、约5倍至约20倍、约5倍至约50倍、约5倍至约100倍、约5倍至约500倍、约5倍至约1,000倍、约5倍至约10,000倍、约10倍至约20倍、约10倍至约50倍、约10倍至约100倍、约10倍至约500倍、约10倍至约1,000倍、约10倍至约10,000倍、约20倍至约50倍、约20倍至约100倍、约20倍至约500倍、约20倍至约1,000倍、约20倍至约10,000倍、约50倍至约100倍、约50倍至约500倍、约50倍至约1,000倍、约50倍至约10,000倍、约100倍至约500倍、约100倍至约1,000倍、约100倍至约10,000倍、约500倍至约1,000倍、约500倍至约10,000倍或约1,000倍至约10,000倍。在一些实施方案中，该系统使细胞中GPCR活性测量的假阳性降低至少约0.1倍、约0.5倍、约1倍、约2倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍、约500倍、约1,000倍或约10,000倍。在一些实施方案中，该系统使细胞中GPCR活性测量的假阳性降低至少至少约0.1倍、约0.5倍、约1倍、约2倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍、约500倍或约1,000倍。在一些实施方案中，该系统使细胞中GPCR活性测量的假阳性降低至少至多约0.5倍、约1倍、约2倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍、约500倍、约1,000倍或约10,000倍。
在一些实施方案中，与没有该系统的细胞中的GPCR活性测量的可测量假阴性相比，该系统降低了包含该系统的细胞中的GPCR活性测量的可测量假阴性。在一些实施方案中，该系统使细胞中GPCR活性测量的可测量假阴性降低至少约0.1倍至约10,000倍。在一些实施方案中，该系统使细胞中GPCR活性测量的可测量假阴性降低至少约0.1倍至约0.5倍、约0.1倍至约1倍、约0.1倍至约2倍、约0.1倍至约5倍、约0.1倍至约10倍、约0.1倍至约20倍、约0.1倍至约50倍、约0.1倍至约100倍、约0.1倍至约500倍、约0.1倍至约1,000倍、约0.1倍至约10,000倍、约0.5倍至约1倍、约0.5倍至约2倍、约0.5倍至约5倍、约0.5倍至约10倍、约0.5倍至约20倍、约0.5倍至约50倍、约0.5倍至约100倍、约0.5倍至约500倍、约0.5倍至约1,000倍、约0.5倍至约10,000倍、约1倍至约2倍、约1倍至约5倍、约1倍至约10倍、约1倍至约20倍、约1倍至约50倍、约1倍至约100倍、约1倍至约500倍、约1倍至约1,000倍、约1倍至约10,000倍、约2倍至约5倍、约2倍至约10倍、约2倍至约20倍、约2倍至约50倍、约2倍至约100倍、约2倍至约500倍、约2倍至约1,000倍、约2倍至约10,000倍、约5倍至约10倍、约5倍至约20倍、约5倍至约50倍、约5倍至约100倍、约5倍至约500倍、约5倍至约1,000倍、约5倍至约10,000倍、约10倍至约20倍、约10倍至约50倍、约10倍至约100倍、约10倍至约500倍、约10倍至约1,000倍、约10倍至约10,000倍、约20倍至约50倍、约20倍至约100倍、约20倍至约500倍、约20倍至约1,000倍、约20倍至约10,000倍、约50倍至约100倍、约50倍至约500倍、约50倍至约1,000倍、约50倍至约10,000倍、约100倍至约500倍、约100倍至约1,000倍、约100倍至约10,000倍、约500倍至约1,000倍、约500倍至约10,000倍或约1,000倍至约10,000倍。在一些实施方案中，该系统使细胞中GPCR活性测量的假阴性降低至少约0.1倍、约0.5倍、约1倍、约2倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍、约500倍、约1,000倍或约10,000倍。在一些实施方案中，该系统使细胞中GPCR活性测量的假阴性降低至少至少约0.1倍、约0.5倍、约1倍、约2倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍、约500倍或约1,000倍。在一些实施方案中，该系统使细胞中GPCR活性测量的假阴性降低至少至多约0.5倍、约1倍、约2倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍、约500倍、约1,000倍或约10,000倍。
应答元件调控的启动子
应答元件是基因启动子区域内的DNA短序列，其能够与特定转录因子结合并调控基因转录。某些应答元件对某些启动子具有特异性。一些应答元件能够被内源性转录因子结合。同一应答元件的多个拷贝可以位于核苷酸序列的不同部分，从而激活不同的基因以响应相同的刺激。可并入本文所述系统的应答元件的非限制性实例包括cAMP反应元件(CRE)、B识别元件、AhR-、二噁英-或生物异源物质-应答元件、HIF应答元件、激素应答元件、血清应答元件、视黄酸应答元件、过氧化物酶体增殖物激素应答元件、金属应答元件、DNA损伤应答元件、IFN刺激应答元件、ROR应答元件、糖皮质激素应答元件、钙应答元件CaRE1、抗氧化剂应答元件、p53应答元件、甲状腺激素应答元件、生长激素应答元件、甾醇应答元件、多梳应答元件和维生素D应答元件。
应答元件调控的启动子核苷酸序列是含有一个或多个应答元件的核酸区域，其有助于募集启动子和其他分子来调控基因转录。细胞含有许多应答元件调控的核苷酸序列，其利用内源性蛋白质来调节基因的转录。在内源性应答元件调控的启动子核苷酸序列直接调控报告子转录的情况下，由于内源性启动子的存在，存在高水平的背景信号。与用内源性转录因子调控报告子转录的系统相比，用对含有该系统的细胞来说不是内源性转录因子的转录因子调控该报告子的转录的系统将具有优势。这种系统的一个优点是报告子的背景生成较低。
报告子
报告核酸最低限度地包含能够被与GPCR活性相关的转录因子(例如cAMP应答元件(CRE)结合蛋白)结合的调控元件，和编码报告子的核苷酸序列。编码报告子的核苷酸序列位于调控元件的下游，所述调控元件能够被与GPCR活性相关的转录因子结合。与GPCR活性相关的转录调控报告子的表达。
在某些实施方案中，编码报告子的核苷酸序列包含报告基因。在某些实施方案中，报告基因编码选自荧光蛋白、萤光素酶蛋白、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、氯霉素乙酰转移酶和分泌型胎盘碱性磷酸酶的报告子。可以测定这些报告蛋白的特定酶活性，或者在荧光报告子的情况下可以测定荧光发射。在某些实施方案中，荧光蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)或青色荧光蛋白(CFP)。
在某些实施方案中，编码报告子的核苷酸序列包括编码唯一序列标识符(UMI)的核苷酸序列。在某些实施方案中，UMI对于测试多肽是独特的，其中测试多肽由报告核酸编码。通常，UMI的长度将在8和20个核苷酸之间，然而其可能更长。在某些实施方案中，UMI的长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个核苷酸。在某些实施方案中，UMI的长度为8个核苷酸。在某些实施方案中，UMI的长度为9个核苷酸。在某些实施方案中，UMI的长度为10个核苷酸。在某些实施方案中，UMI的长度为11个核苷酸。在某些实施方案中，UMI的长度为12个核苷酸。在某些实施方案中，UMI的长度为13个核苷酸。在某些实施方案中，UMI的长度为14个核苷酸。在某些实施方案中，UMI的长度为15个核苷酸。在某些实施方案中，UMI的长度为16个核苷酸。在某些实施方案中，UMI的长度为17个核苷酸。在某些实施方案中，UMI的长度为18个核苷酸。在某些实施方案中，UMI的长度为19个核苷酸。在某些实施方案中，UMI的长度为20个核苷酸。在某些实施方案中，UMI的长度超过20个核苷酸。
本文所述的系统可以利用许多不同的调控序列，这些调控序列通过与GPCR活性相关的转录因子(例如CREB)的结合来控制报告基因的激活。调控序列是一种可以被与GPCR活性相关的转录因子结合的序列。通常，其将被配置为使得调控序列是在UMI、报告基因或两者的5'。在某些实施方案中，调控序列包含Gal4-、PPR1-或LexA-UAS，其能够被与GPCR活性相关的转录因子结合。
在某些实施方案中，报告子包含荧光蛋白、萤光素酶蛋白、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、氯霉素乙酰转移酶或分泌的胎盘碱性磷酸酶和UMI。在某些实施方案中，UMI在荧光蛋白、萤光素酶蛋白、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、氯霉素乙酰转移酶或分泌的胎盘碱性磷酸酶5’的报告核酸上编码。在某些实施方案中，编码荧光蛋白、萤光素酶蛋白、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、氯霉素乙酰转移酶或分泌型胎盘碱性磷酸酶的核苷酸序列是在UMI的5’。
UMI允许在同一测定中不同系统的多路复用，因为UMI的转录将指示特定系统与报告子的关联。UMI可以是允许足够多样性的任何长度，以允许在同一测定中对不同系统进行多路复用确定。长度应足以在至少100、500、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000个靶标之间进行区分。在某些实施方案中，不同的系统将存在于不同的细胞中。在某些实施方案中，不同的系统将存在于相同的细胞中。报告元件可以进一步包含5’UTR、3’UTR或两者。UTR可以与报告元件异源。
报告子激活
报告分子的激活可以使用标准测定法来确定，以检测萤光素酶蛋白、β-半乳糖苷酶蛋白、β-葡萄糖醛酸酶蛋白、氯霉素乙酰转移酶蛋白、分泌型胎盘碱性磷酸酶蛋白。通常，这些是酶测定，其中基于蛋白质对底物的酶活性产生可检测信号。例如，萤光素酶表达可以在萤光素酶底物存在的情况下通过光度计测量。荧光报告子不需要底物，并且可以通过荧光显微镜或荧光板读取器来测量信号。荧光报告子对于测量活细胞中的报告子激活特别有用。
在一些实施方案中，报告分子包括独特的RNA序列，诸如唯一分子标识符(UMI)，也称为索引序列或条形码序列。报告子激活可以以任何合适的方式进行测量，该方式允许独特RNA序列的序列确定，优选允许以多路复用方式确定序列的方法。这样的方法包括高通量测序方法，其可以在24小时时间段内产生关于至少约100,000、1,000,000、10,000,000或100,000,000个DNA或RNA碱基的信息。在某些实施方案中，使用下一代测序技术来确定独特RNA序列的序列。下一代测序包括许多种测序，诸如焦磷酸测序、合成测序、单分子测序、第二代测序、纳米孔测序、连接测序或杂交测序。下一代测序平台包括lllumina(RNA-Seq)和Helicos(数字基因表达或“DGE”)的商用测序平台。下一代测序方法包括但不限于由以下方商业化的方法：1)454/Roche Lifesciences，包括但不限于以下描述的方法和装置，Margulies等人，Nature(2005)437:376-380(2005)；以及美国专利号7,244,559；7,335,762；7,21 1,390；7,244,567；7,264,929；7,323,305；2)Helicos BiosciencesCorporation(Cambridge，MA)，如美国申请号1 1/167046和美国专利号7501245；7491498；7,276,720；以及在美国专利申请公开号US20090061439；US20080087826；US20060286566；US2006002471 1；US20060024678；US20080213770；以及US20080103058中所述；3)AppliedBiosystems(例如SOLiD测序)；4)Dover Systems(例如Polonator G.007测序)；5)lllumina,Inc.，如美国专利5,750,341；6,306,597；和5,969,119中所述；和6)PacificBiosciences，如美国专利号7,462,452；7,476,504；7,405,281；7,170,050；7,462,468；7,476,503；7,315,019；7,302,146；7,313,308；以及美国申请公开号US20090029385；US20090068655；US20090024331；以及US20080206764中所述。这里以实例的方式提供了此类方法和装置，而不旨在进行限制。
细胞
可用于本文所述系统和方法的细胞通常是那些能够用本文所述的一个或多个核酸容易地使得为转基因的细胞。可以使用本领域已知的方法，诸如磷酸钙转染、基于脂质的转染(例如LipofectamineTM、Lipofectamine-2000TM、Lipofectamine-3000TM或HD)、电穿孔或病毒转导，可以将编码调控元件、效应物和/或报告元件的系统核酸转染或转导到合适的细胞系中。细胞也可以是在适当的组织培养容器中生长到汇合或接近汇合的相同类型的细胞群。
在某些实施方案中，本文所用的细胞包含编码调控元件的核酸、编码效应物的核酸、包含报告元件的核酸或其组合的稳定整合。通过使用线性化质粒的随机整合、病毒或转座子定向整合或定向整合，例如使用AttP和AttB位点之间的位点特异性重组，可以从本文所述的细胞制备稳定的细胞系。在某些实施方案中，任一核酸在安全着陆位点如AAVS1位点整合。
在一些实施方案中，本文所述的细胞包含稳定整合到细胞基因组中的核酸。在一些实施方案中，本文所述的细胞包含编码稳定整合到细胞基因组中的调控元件的核酸。在一些实施方案中，本文所述的细胞包含编码稳定整合到细胞基因组中的至少一个本文所述效应物的核酸。在一些情况下，效应物是GPCR效应物。在一些情况下，GPCR效应物是选自以下的腺苷酸环化酶：ADCY1、ADCY2、ADCY3、ADCY4、ADCY5、ADCY6、ADCY7、ADCY8、ADCY9或ADCY10。在一些实施方案中，细胞包含稳定整合的核酸，所述核酸编码用于调节效应物表达的调控元件。在一些情况下，细胞包含稳定整合的核酸，所述核酸编码用于上调本文所述效应物的调控元件。在一些情况下，细胞包含稳定整合的核酸，所述核酸编码用于上调ADCY6的调控元件。在一些情况下，细胞包含稳定整合的编码ADCY6的核酸。在一些情况下，细胞包含稳定整合的核酸，所述核酸编码用于下调本文所述效应物的调控元件。在一些情况下，细胞包含稳定整合的核酸，所述核酸编码用于下调ADCY3的调控元件。
在某些实施方案中，系统中使用的细胞或细胞群是真核细胞。在某些实施方案中，细胞或细胞群是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，细胞或细胞群是人细胞。在某些实施方案中，细胞或细胞群是SH-SY5Y，人类神经母细胞瘤；Hep G2，高加索人肝细胞癌；293(也称为HEK 293)，人类胚胎肾脏；RAW 264.7，小鼠单核巨噬细胞；HeLa，人类宫颈上皮样癌；MRC-5(PD 19)，人类胎儿肺；A2780，人类卵巢癌；CACO-2，高加索人结肠腺癌；THP1，人类单核细胞白血病；A549，高加索人肺癌；MRC-5(PD 30)，人类胎儿肺；MCF7，高加索人乳腺癌；SNL76/7，小鼠SIM株胚胎纤维原细胞；C2C12，小鼠C3H肌肉成肌细胞；Jurkat E6.1，人类白血病T细胞成淋巴细胞；U937，高加索人组织细胞淋巴瘤；L929，小鼠C3H/An结缔组织；3T3L1，小鼠胚胎；HL60，高加索人早幼粒细胞白血病；PC-12，大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤；HT29，高加索人结肠腺癌；OE33，高加索人食管癌；OE19，高加索人食管癌；NIH 3T3，瑞士小鼠NIH胚胎；MDA-MB-231，高加索人乳腺腺癌；K562，高加索人慢性髓性白血病；U-87MG，人类胶质母细胞瘤星形细胞瘤；MRC-5(PD 25)，人类胎儿肺；A2780cis，人类卵巢癌；B9，小鼠B细胞杂交瘤；CHO-K1，U2OS，中国仓鼠卵巢；MDCK，犬类可卡犬肾脏；1321N1，人类脑星形细胞瘤；A431，人类鳞状细胞癌；ATDC5，衍生的小鼠129畸胎瘤AT805；RCC4 PLUS VECTOR ALONE，用空表达载体pcDNA3稳定转染的肾细胞癌细胞系RCC4，赋予新霉素抗性；HUVEC(S200-05n)，人类预筛选脐静脉内皮细胞(HUVEC)；新生儿；Vero，非洲猴绿肾；RCC4PLUS VHL，用pcDNA3-VHL稳定转染的肾细胞癌细胞系RCC4；Fao，大鼠肝癌；J774A.1，小鼠BALB/c单核细胞巨噬细胞；MC3T3-E1，小鼠C57BL/6颅骨；J774.2，小鼠BALB/c单核细胞巨噬细胞；PNT1A，人类青春期后前列腺正常，用SV40永生化；U-2OS，人类骨肉瘤；HCT 116，人类结肠癌；MA104，非洲猴绿肾；BEAS-2B，人类支气管上皮，正常；NB2-11，大鼠淋巴瘤；BHK 21(克隆13)，叙利亚仓鼠肾；NS0，小鼠骨髓瘤；Neuro-2a，小鼠白化神经母细胞瘤；SP2/0-Ag14，小鼠x小鼠骨髓瘤，非生产性；T47D，人类乳腺肿瘤；1301，人类T细胞白血病；MDCK-II，犬类可卡犬肾脏；PNT2，人类前列腺正常，用SV40永生化；PC-3，高加索人前列腺腺癌；TF1，人类红白血病；COS-7，非洲猴绿肾，SV40转化；MDCK，犬类可卡犬肾脏；HUVEC(200-05n)，人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)；新生儿；NCI-H322，高加索人细支气管癌；SK.N.SH，高加索人神经母细胞瘤；LNCaP.FGC，高加索人前列腺癌；OE21，高加索人食管鳞状细胞癌；PSN1，人类胰腺腺癌；ISHIKAWA，亚洲人类子宫内膜腺癌；MFE-280，高加索人子宫内膜腺癌；MG-63，人类骨肉瘤；RK 13，兔肾，BVDV阴性；EoL-1细胞，人类嗜酸性粒细胞白血病；VCaP，人类前列腺癌症转移；tsA201，人类胚胎肾，SV40转化；CHO，中国仓鼠卵巢；HT 1080，人类纤维肉瘤；PANC-1，高加索人胰腺；Saos-2，人类原发性骨肉瘤；纤维原细胞生长基质(116K-500)、纤维原细胞生长基质试剂盒；ND7/23，小鼠神经母细胞瘤x大鼠神经元杂交瘤；SK-OV-3，高加索人卵巢腺癌；COV434，人类卵巢粒层细胞瘤；Hep 3B，人类肝细胞癌；Vero(WHO)，非洲猴绿肾；Nthy-ori 3-1，人类甲状腺滤泡上皮；U373 MG(Uppsala)，人类胶质母细胞瘤星形细胞瘤；A375，人类恶性黑色素瘤；AGS，高加索人胃腺癌；CAKI 2，高加索人肾癌；COLO 205，高加索人结肠腺癌；COR-L23，高加索人肺大细胞癌；IMR32，高加索人神经母细胞瘤；QT 35，日本鹌鹑纤维肉瘤；WI 38，高加索人胎儿肺；HMVII，人类阴道恶性黑色素瘤；HT55，人类结肠癌；TK6，人类成淋巴细胞，胸苷激酶杂合子；SP2/0-AG14(AC-FREE)，小鼠x小鼠杂交瘤，无分泌，无血清，无动物成分(AC)；AR42J，或大鼠外分泌胰腺肿瘤，或其任何组合。
在某些实施方案中，细胞或细胞系包含高基础报告子活性。在某些实施方案中，高基础报告子活性比背景大至少约5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％，其中背景是对于不包含报告子的细胞或细胞系观察到的报告子活性水平。在某些实施方案中，高基础报告子活性比背景大至少约5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％，其中背景是对于不包含本文所述系统的细胞或细胞系观察到的报告子活性水平。对于这样的比较，通常用作比较物的细胞或细胞系将是包含该系统的细胞系的亲本(例如，具有系统的HEK293与没有系统的HEK293)。
在某些实施方案中，细胞或细胞系包含高基础报告子活性。在某些实施方案中，高基础报告子活性比背景大至少约2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、15x、20x、25x、30x、32x、50x、75x、100x、200x、500x、750x、1,000x、2,000x、5,000x、10,000x或20,000x，其中背景是对于不包含报告子的细胞或细胞系观察到的报告子活性水平。在某些实施方案中，高基础报告子活性比背景大至少约2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、15x、20x、25x、30x、32x、50x、75x、100x、200x、500x、750x、1,000x、2,000x、5,000x、10,000x或20,000x，其中背景是对于不包含本文所述系统的细胞或细胞系观察到的报告子活性水平。在某些实施方案中，细胞或细胞系包含高基础报告子活性。在某些实施方案中，高基础报告子活性比背景大至少约30x，其中背景是对不包含报告子的细胞或细胞系观察到的报告子活性水平。在某些实施方案中，高基础报告子活性比背景大至少约30x，其中背景是对于不包含本文所述系统的细胞或细胞系观察到的报告子活性水平。对于这样的比较，通常用作比较物的细胞或细胞系将是包含该系统的细胞系的亲本(例如，具有系统的HEK293对比没有系统的HEK293)。
在某些实施方案中，细胞或细胞系包含基础报告子活性的低方差。在某些实施方案中，基础报告子活性的低方差是小于约0.6的生物方差系数。在某些实施方案中，基础报告子活性的低方差是小于约0.5的生物方差系数。在某些实施方案中，基础报告子活性的低方差是小于约0.4的生物方差系数。在某些实施方案中，基础报告子活性的低方差是小于约0.3的生物方差系数。在某些实施方案中，基础报告子活性的低方差是小于约0.2的生物方差系数。在某些实施方案中，基础报告子活性的低方差是小于约0.1的生物方差系数。
测量GPCR活性的方法
本文所述的系统可以使用多种方法有效地用于测量GPCR活性。在稳态和响应物理或化学刺激时，该系统可用于测量细胞信号传导通路的GPCR活性的方法。当报告元件包括与特定报告元件匹配的UMI序列时，该系统可以部署在多路复用测定中。
在一个非限制性的说明性实例中，将多个细胞在多孔板的一个孔中孵育。用本文所述的至少一种核酸转染所述多个细胞。在一些实施方案中，核酸编码本文所述的调控元件。在一些实施方案中，核酸编码本文所述的效应物。在一些实施方案中，核酸编码本文所述的报告子。然后将转染的细胞与GPCR的配体接触。在允许报告子表达的足够时间后，可以收获细胞裂解物，并测量报告基因的激活。在该实例中，报告基因存在的增加将指示配体与GPCR结合或复合以引起GPCR活性的增加。在一些情况下，报告基因存在的增加将指示配体与GPCR结合或复合以引起包含Giα亚基活性的GPCR活性的增加。在一些情况下，报告基因存在的增加将指示配体与GPCR结合或复合以引起包含cAMP活性的GPCR活性的增加。在一些情况下，报告基因存在的增加将指示配体与GPCR结合或复合以引起包括反向cAMP活性的GPCR活性的增加。在一些实施方案中，与未用本文所述系统转染的细胞的GPCR活性相比，与配体接触的转染细胞表现出增加的GPCR活性。在一些实施方案中，与未用本文所述系统转染的细胞的GPCR活性相比，与配体接触的转染细胞表现出增加的Giα亚基活性。在一些实施方案中，与未用本文所述系统转染的细胞的GPCR活性相比，与配体接触的转染细胞表现出增加的cAMP活性。在一些实施方案中，与未用本文所述系统转染的细胞的GPCR活性相比，与配体接触的转染细胞表现出增加的反向cAMP活性。
在一些实施方案中，报告基因包含在与底物相互作用时产生可检测信号的酶，本领域已知的标准测定可用于定量激活报告基因。在一些实施方案中，报告基因包含荧光分子，报告基因的激活可以通过荧光显微术或荧光板读取器来测量，并且可能不需要细胞裂解。荧光分子可用于测量活细胞中的报告子激活。在一些实施方案中，报告基因包含UMI，mRNA被逆转录，并且UMI的测序通过下一代测序技术进行。
在某些实施方案中，测定以多孔格式进行，诸如6、12、24、48、96或384孔格式。在某些实施方案中，向每个孔提供不同的测试化学品(例如，配体)，或者向一式两份、一式三份或一式四份的孔提供测试化学品。该测定还可以包括一个或多个阳性或阴性对照孔。在一些实施方案中，该方法包括测量用本文所述的至少一种核酸转染的细胞群中的GPCR活性。用本公开的至少一种核酸转染的细胞群可以是任何大小。在某些实施方案中，细胞群包含1,000、10,000、100,000、1,000,000、10,000,000个或更多个细胞。在某些实施方案中，用本文所述系统的至少一种核酸转染至少约1,000个或更多个细胞。在某些实施方案中，用本文所述系统的至少一种核酸转染至少约10,000个或更多个细胞。在某些实施方案中，用本文所述系统的至少一种核酸转染至少约100,000个或更多个细胞。在某些实施方案中，用本文所述系统的至少一种核酸转染至少约1,000,000个或更多个细胞。在某些实施方案中，用本文所述系统的至少一种核酸转染至少约10,000,000个或更多个细胞。在某些实施方案中，本公开的系统可以用于多孔板实验。与本公开的系统相配的多孔板的非限制性实例包括6、12、24、48、96、384或1,536孔板。在某些实施方案中，多孔板的每个孔包含用本文所述系统的至少一种核酸转染的细胞群。在某些实施方案中，多孔板的每个孔包含用本文所述系统的至少一种核酸转染的细胞群。在某些实施方案中，每个孔包含多个细胞群，每个细胞群用本文所述系统的至少一种核酸转染。在某些实施方案中，每个孔包含多个细胞群，每个细胞群用本文所述系统的至少一种核酸转染。
当前系统的一个优点是，表达不同靶标的细胞文库可以在同一个孔中一起培养并并行分析，例如在同一实验中允许2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、500、1,000或更多靶标。这是通过将靶标与该靶标唯一的UMI相关联来实现的，然后可以通过对数据进行高通量测序去卷积来分析UMI。因此，在某些实施方案中，本文所述的系统包括：多个哺乳动物细胞，其中多个哺乳动物细胞中的每一个包含不同的GPCR靶标，并且多个哺乳动物细胞的每一细胞包含：a)GPCR活性的第一效应物，其中与野生型状态下GPCR活性的第一效应物的表达相比，GPCR活性的第一效应物的表达上调；和b)GPCR活性的第二效应物，其中与野生型状态下GPCR活性第二效应物的表达相比，GPCR活性第二效应物的表达下调。在某些实施方案中，多个哺乳动物细胞进一步包含报告基因，所述报告基因包含唯一分子标识符(UMI)核酸序列，所述报告基因能够被响应于GPCR信号传导的启动子激活。
因此，在某些实施方案中，本文描述了一种系统，其包含：多个哺乳动物细胞，其中多个哺乳动物细胞中的每一个包含不同的靶标，并且多个哺乳动物细胞的每一细胞包含：a)靶标活性的第一效应物，其中与野生型状态下靶标活性的第一效应物的表达相比，靶标活性的第一效应物的表达上调；和b)靶标活性的第二效应物，其中与野生型状态下的靶标活性的第二效应物的表达相比，靶标活性的第二效应物的表达下调。在某些实施方案中，多个哺乳动物细胞进一步包含报告基因，所述报告基因包含唯一分子标识符(UMI)核酸序列，报告基因能够被响应于靶信号传导的启动子激活。
在某些实施方案中，将与GPCR复合或结合的测试试剂如配体应用于用本文所述系统的至少一种核酸转染的细胞。在某些实施方案中，在细胞与测试试剂接触后测量报告分子转录的激活水平。在某些实施方案中，测试试剂是化学品、小分子、生物分子、多肽、多核苷酸、适配体或其任何组合。在某些实施方案中，将单个测试试剂应用于细胞群。在某些实施方案中，将多个测试试剂应用于细胞群。
在一些实施方案中，本文所述的方法通过使配体与在包含本文所述系统的细胞表面上表达的GPCR接触来测量GPCR活性。在一些实施方案中，该方法通过使多个配体与在包含本文所述系统的细胞表面上表达的GPCR接触来测量GPCR活性。在一些实施方案中，该方法通过使配体与在包含本文所述系统的细胞表面上表达的多个GPCR接触来测量GPCR活性。在一些实施方案中，该方法通过使多个配体与在包含本文所述系统的细胞表面上表达的多个GPCR接触来测量GPCR活性。
在某些实施方案中，该系统可适用于测量GPCR对测试试剂或配体的响应。本公开的系统可以适用于与任何GPCR受体一起使用。在某些实施方案中，系统适于通过利用cAMP应答元件调控的启动子与GPCR受体一起使用。GPCR的非限制性实例包括5-羟色胺受体、乙酰胆碱受体、腺苷受体、肾上腺素受体、血管紧张素受体、爱帕琳肽受体、胆汁酸受体、蛙皮素受体、缓激肽受体、大麻素受体、趋化素受体、趋化因子受体、胆囊收缩素受体、多巴胺受体、内皮素受体、甲酰肽受体、游离脂肪酸受体、甘丙肽受体、胃促生长素受体、糖蛋白激素受体、促性腺激素释放激素受体、GPR18、GPR55、GPR119、G蛋白偶联雌激素受体、组胺受体、羟基羧酸受体、亲吻素受体、白三烯受体、LPA受体、S1P受体、黑色素浓缩激素受体、黑素皮质素受体、褪黑素受体、胃动素受体、神经介肽U受体、神经肽FF/神经肽AF受体、神经肽S受体、神经肽W/神经肽B受体、神经肽Y受体、神经降压素受体、阿片受体、视蛋白受体、食欲素受体、氧戊二酸受体、P2Y受体、血小板激活因子受体、前动力蛋白受体、催乳素释放肽受体、前列腺素受体、蛋白酶激活受体、QRFP受体、松弛素家族肽受体、生长抑素受体、琥珀酸受体、速激肽受体、促甲状腺激素释放激素受体、痕量胺受体、尾加压素受体、加压素和催产素受体、降钙素受体、促肾上腺皮质激素释放因子受体、胰高血糖素受体家族、甲状旁腺激素受体、VIP和PACAP受体、钙感应受体、GABAB受体、代谢型谷氨酸受体、味觉1受体、卷曲类受体、黏附类GPCR、孤儿受体或其任何组合。
本公开的核酸与本领域中常见的许多载体匹配。载体的非限制性实例包括基因组整合载体、游离型载体、质粒、病毒载体、粘粒、细菌人工染色体和酵母人工染色体。与本公开的核酸匹配的病毒载体的非限制性实例包括衍生自慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒的载体。在某些实施方案中，本公开的核酸存在于载体上，所述载体包含引导向基因组中位点的限定位置或限制性集合的位点特异性整合的序列(例如，AttP-AttB重组)。
在某些实施方案中，本文所述的系统被结合到单个载体中。在某些实施方案中，将单个载体瞬时转染到细胞中。在某些实施方案中，将单个载体稳定地转染到细胞中。
在某些实施方案中，系统被划分为两个载体。在某些实施方案中，第一载体包含第一调控元件和第一效应物，而第二载体包含用于调节第二效应物表达的第二调控元件。在某些实施方案中，将第一载体和第二载体瞬时转染到细胞中。在某些实施方案中，将第一载体和第二载体稳定转染到细胞中。在某些实施方案中，将第一载体稳定地转染到细胞中，并将第二载体瞬时转染到细胞。在某些实施方案中，将第一载体瞬时转染到细胞中，并将第二载体稳定转染到细胞。在一些实施方案中，可以将包含报告子的单独载体转染到细胞中。在一些实施方案中，用第一或第二载体转染的细胞已经包含报告子。
包含本文所述系统的载体或其部分可以使用许多众所周知的分子生物学技术构建。许多此类程序的详细方案，包括扩增、克隆、突变形成、转化等，在以下中描述，例如，Ausubel等人Current protocols in Molecular Biology(2012年补充)John Wiley&Sons，New York 10(“Ausubel”)；Sambrook等人，Molecular Cloning–A Laboratory Manual(第4版)，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,2012(“Sambrook”)；以及Abelson等人Guide to Molecular Cloning Techniques(Methods inEnzymology)volume 152Academic Press,Inc.,San Diego,CA(“Abelson”)。
试剂盒
在一些实施方案中，本文公开了包含本文所述系统的试剂盒。在一些情况下，试剂盒包含本文所述系统的至少一个核酸。在一些实施方案中，试剂盒不包含细胞。在一些实施方案中，试剂盒包括用本文所述的至少核酸转染的细胞。在一些实施方案中，试剂盒包含要用本文所述的至少核酸转染的细胞。在一些实施方案中，本文公开的试剂盒可用于测量细胞中的GPCR活性。在一些实施方案中，本文公开的试剂盒可用于调节细胞中的GPCR活性。在一些实施方案中，本文公开的试剂盒可用于调节细胞中的G蛋白活性。在一些实施方案中，本文公开的试剂盒可用于调节细胞中的Giα亚基活性。在一些实施方案中，本文公开的试剂盒可用于调节细胞中的cAMP活性。在一些实施方案中，本文公开的试剂盒可用于调节细胞中的反向cAMP活性。在一些实施方案中，本文公开的试剂盒可用于增加细胞中的GPCR活性。在一些实施方案中，本文公开的试剂盒可用于增加细胞中的G蛋白活性。在一些实施方案中，本文公开的试剂盒可用于增加细胞中Giα亚基的活性。在一些实施方案中，本文公开的试剂盒可用于增加细胞中的cAMP活性。在一些实施方案中，本文公开的试剂盒可用于增加细胞中的反向cAMP活性。
在一些实施方案中，本文公开的试剂盒可用于调节细胞中GPCR效应物的表达。在一些实施方案中，本文公开的试剂盒可用于增加细胞中GPCR效应物的表达。在一些实施方案中，本文公开的试剂盒可用于降低细胞中GPCR效应物的表达。在一些实施方案中，本文公开的试剂盒可用于增加细胞中第一GPCR效应物的表达并降低细胞中第二GPCR效应物的表达。在一些实施方案中，GPCR效应物是腺苷酸环化酶。腺苷酸环化酶可以是ADCY1、ADCY2、ADCY3、ADCY4、ADCY5、ADCY6、ADCY7、ADCY8、ADCY9或ADCY10。在一些实施方案中，本文公开的试剂盒可用于增加任何一种腺苷酸环化酶的表达。在一些实施方案中，本文公开的试剂盒可用于增加ADCY6的表达。在一些实施方案中，本文公开的试剂盒可用于降低任何一种腺苷酸环化酶的表达。在一些实施方案中，本文公开的试剂盒可用于降低ADCY3的表达。
在一些实施方案中，试剂盒包含本文所述的系统，其可用于执行本文所述方法。试剂盒包含材料或组合物的集合，包括系统的至少一种组合物。在其他实施方案中，试剂盒含有进行本文所述方法所必需和/或足够的所有组合物，包括所有对照和指示。
在一些情况下，本文所述的试剂盒包含本文所述的用于调节本文所述的任何一种转基因的基因活性的系统。试剂盒中配置的成分的确切性质取决于其预期用途。例如，一些试剂盒可以被配置用于筛选与GPCR结合或复合的配体的GPCR活性。在一些实施方案中，试剂盒可以被配置为特别用于筛选未知配体的目的。在一些实施方案中，试剂盒可以被配置为特别用于测量由配体刺激或在不存在配体的情况下的GPCR活性。
在一些情况下，试剂盒中可以包括使用说明。任选地，试剂盒还含有其他有用的组分，诸如稀释剂、缓冲液、药学上可接受的载体、注射器、导管、涂抹器、移液管或测量工具、包扎材料或其他有用的用具。组装在试剂盒中的材料或成分可以提供给从业者，所述材料或组分以保持其可操作性和实用性的任何方便和合适的方式储存。例如，组分可以是溶解的、脱水的或冻干的形式；其可以在室温、冷藏或冷冻温度下提供。组分典型地包含在合适的包装材料中。如本文所用，短语“包装材料”是指用于容纳试剂盒内容物(例如组合物等)的一个或多个物理结构。包装材料通过众所周知的方法构造，以优选地提供无菌、无污染物的环境。试剂盒中使用的包装材料是那些习惯上用于基因表达测定和治疗给药的包装材料。如本文所用，术语“包装”是指能够容纳单个试剂盒成分的合适的固体基质或材料，如玻璃、塑料、纸、箔等。因此，例如，包装可以是用于容纳合适量的药物组合物的玻璃小瓶或预填充注射器。包装材料有外部标签，其标明试剂盒的内容和/或用途及其组分。
尽管本文已经示出和描述了系统和方法的优选实施方案，但对本领域技术人员来说显而易见的是，这些实施方案仅通过示例的方式提供。系统和方法不受说明书中提供的具体实例的限制。虽然已经参考上述说明书描述了系统和方法，但是本文中的实施方案的描述和图示并不意味着在限制意义上被解释。在不脱离本公开的情况下，对于本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。此外，应当理解，系统和方法的所有方面不限于本文所述的具体描述、配置或相对比例，其取决于各种条件和变量的变化。应当理解，在实践本公开中可以采用本文所描述的系统和方法的实施方案的各种替代方案。因此，本文所述的系统和方法也应涵盖任何此类替代方案、修改、变化或等效方案。以下权利要求限定了本文所述系统和方法的范围，并且本文所述的系统和方法在这些权利要求的范围内，并且它们的等效方案由此被覆盖。
实施方案
实施方案1.一种用于测量G蛋白偶联受体(GPCR)活性的系统，所述系统包含：所述GPCR活性的第一效应物，其中与野生型状态下的所述第一效应物的表达相比，所述第一效应物的表现上调；和GPCR活性的第二效应物，其中与野生型状态下的所述第二效应物的表达相比，所述第二效应物的表达下调。
实施方案2.根据实施方案1所述的系统，其中通过使GPCR与GPCR激活剂接触来上调所述第一效应物的所述表达。
实施方案3.根据实施方案2所述的系统，其中所述GPCR激活剂是GPCR激动剂。
实施方案4.根据实施方案2所述的系统，其中所述GPCR激活剂是所述第一效应物的激动剂。
实施方案5.根据实施方案1所述的系统，其中所述系统包含编码所述GPCR活性的所述第一效应物的第一核酸，所述第一核酸操作性偶联至用于上调所述第一效应物表达的调控元件。
实施方案6.根据实施方案1所述的系统，其中通过使GPCR与GPCR抑制剂接触来下调所述第二效应物的所述表达。
实施方案7.根据实施方案6所述的系统，其中所述GPCR抑制剂是GPCR反向激动剂。
实施方案8.根据实施方案6所述的系统，其中所述GPCR抑制剂是GPCR拮抗剂。
实施方案9.根据实施方案6所述的系统，其中所述GPCR抑制剂是所述第二效应物的反向激动剂。
实施方案10.根据实施方案6所述的系统，其中所述GPCR抑制剂是所述第二效应物的拮抗剂。
实施方案11.根据实施方案1所述的系统，其中所述系统包含下调所述第二效应物的所述表达的第二核酸。
实施方案12.根据实施方案1所述的系统，其中所述GPCR活性包括Giα亚基活性、Gsα亚基活性、Gqα亚基活性或G12/13α亚基活性。
实施方案13.根据实施方案12所述的系统，其中所述GPCR活性包含所述Giα亚基活性。
实施方案14.根据实施方案13所述的系统，其中所述Giα亚基活性包含Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαo、Gαt、Gαg或Gαz的活性。
实施方案15.根据实施方案12所述的系统，其中所述GPCR活性包含所述Gsα亚基活性。
实施方案16.根据实施方案12所述的系统，其中所述GPCR活性包含所述Gqα亚基活性。
实施方案17.根据实施方案12所述的系统，其中所述GPCR活性包含所述G12/13α亚基活性。
实施方案18.根据实施方案5所述的系统，其中所述调控元件是可诱导的。
实施方案19.根据实施方案5所述的系统，其中所述调控元件是组成活性的。
实施方案20.根据先前实施方案中任一项所述的系统，其中所述第一效应物包含第一腺苷酸环化酶。
实施方案21.根据实施方案20所述的系统，其中所述第一腺苷酸环化酶选自ADCY1、ADCY2、ADCY3、ADCY4、ADCY5、ADCY6、ADCY7、ADCY8、ADCY9和ADCY10。
实施方案22.根据实施方案21所述的系统，其中所述第一腺苷酸环化酶是ADCY6。
实施方案23.根据先前实施方案中任一项所述的系统，其中所述第二效应物包含第二腺苷酸环化酶。
实施方案24.根据实施方案23所述的系统，其中所述第二腺苷酸环化酶选自ADCY1、ADCY2、ADCY3、ADCY4、ADCY5、ADCY6、ADCY7、ADCY8、ADCY9和ADCY10。
实施方案25.根据实施方案24所述的系统，其中所述第二腺苷酸环化酶是ADCY3。
实施方案26.根据实施方案12-25中任一项所述的系统，其中所述第二核酸包含微RNA、shRNA、siRNA、gRNA或其组合。
实施方案27.根据实施方案26所述的系统，其中所述第二核酸包含所述微RNA。
实施方案28.根据实施方案26所述的系统，其中所述第二核酸包含所述gRNA。
实施方案29.根据实施方案28所述的系统，进一步包含操作性偶联到所述gRNA的CRISPR-Cas系统。
实施方案30.根据实施方案1所述的系统，其中所述GPCR活性包含环AMP(cAMP)活性。
实施方案31.根据实施方案1所述的系统，其中所述GPCR活性包含cAMP浓度的变化。
实施方案32.根据实施方案1所述的系统，其中所述GPCR活性包含反向cAMP活性。
实施方案33.根据实施方案20所述的系统，其中与没有所述系统的细胞中的cAMP活性相比，所述系统使包含所述系统的细胞中的所述cAMP活性增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍或100倍。
实施方案34.根据实施方案31所述的系统，其中与没有所述系统的细胞中的cAMP浓度相比，所述系统使包含所述系统的细胞中的所述cAMP浓度增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍或100倍。
实施方案35.根据实施方案32所述的系统，其中与没有所述系统的细胞中的反向cAMP活性相比，所述系统使包含所述系统的细胞中的所述反向cAMP活性增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍或100倍。
实施方案36.根据先前实施方案中任一项所述的系统，其中所述系统包含用于上调Giα亚基表达的第二调控元件。
实施方案37.根据先前实施方案中任一项所述的系统，其中所述系统包含至少一个附加效应物。
实施方案38.根据实施方案37所述的系统，其中所述至少一个附加效应物是腺苷酸环化酶。
实施方案39.根据实施方案37所述的系统，其中所述系统还包含用于上调所述至少一个附加效应物的表达的第二调控元件。
实施方案40.根据任何一个先前实施方案的系统，其中与没有所述系统的细胞中的所述GPCR活性与所述背景之间的比率相比，所述系统使包含所述系统的细胞中的所述GPCR活性与背景之间的比率增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍或100倍。
实施方案41.根据实施方案40所述的系统，其中与没有所述系统的所述细胞中的所述GPCR活性相比，所述系统使包含所述系统的所述细胞中的所述GPCR活性增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍或100倍。
实施方案42.根据实施方案40所述的系统，其中与没有所述系统的所述细胞中的所述背景相比，所述系统将包含所述系统的所述细胞中的所述背景降低至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍或100倍。
实施方案43.根据先前实施方案中任一项所述的系统，其中所述系统包含报告核酸，其中所述报告核酸产生与所述GPCR活性成比例的可检测信号。
实施方案44.根据实施方案43所述的系统，其中所述报告核酸包含cAMP应答元件(CRE)序列。
实施方案45.根据实施方案43所述的系统，其中所述报告核酸操作性偶联到唯一分子识别符(UMI)核酸序列。
实施方案46.根据实施方案43所述的系统，其中所述可检测信号包含荧光信号。
实施方案47.根据实施方案43所述的系统，其中所述可检测信号包含发光信号。
实施方案48.根据实施方案5所述的系统，其中所述第一核酸包含用于上调所述第一效应物的所述表达的基因表达盒。
实施方案49.根据实施方案11所述的系统，其中所述第二核酸包含用于下调所述第二效应物的所述表达的基因表达盒。
实施方案50.一种细胞，其包含实施方案1-49中任一项所述的系统。
实施方案51.根据实施方案50所述的细胞，其中所述细胞包含真核细胞。
实施方案52.根据实施方案50所述的细胞，其中所述细胞包含哺乳动物细胞。
实施方案53.根据实施方案50所述的细胞，其中所述细胞包含哺乳动物细胞衍生的细胞。
实施方案54.根据实施方案50所述的细胞，其中所述细胞衍生自细胞系。
实施方案55.根据实施方案50所述的细胞，其中所述细胞选自CHO-K1细胞、COS-7细胞和U2OS细胞。
实施方案56.根据实施方案50-55中任一项所述的细胞，其中所述系统整合到所述细胞的基因组中。
实施方案57.一种细胞群，其包含实施方案52-57中任一项所述的细胞。
实施方案58.根据实施方案57所述的细胞群，其中所述细胞群包含真核细胞的群体。
实施方案59.根据实施方案57所述的细胞群，其中所述细胞群包含哺乳动物细胞的群体。
实施方案60.根据实施方案57所述的细胞群，其中所述细胞群包含哺乳动物细胞衍生的细胞的群体。
实施方案61.根据实施方案55所述的细胞群，其中所述细胞群包含衍生自细胞系的细胞的群体。
实施方案62.根据实施方案55所述的细胞群，其中所述细胞群包含选自以下的细胞的群体：CHO-K1细胞、COS-7细胞和U2OS细胞。
实施方案63.一种用于测量GPCR活性的方法，所述方法包括测量实施方案50-56中任一项所述的细胞中或实施方案57-62中任一项所述的细胞群中的所述GPCR活性。
实施方案64.根据实施方案63所述的方法，其中所述GPCR活性是基础GPCR活性。
实施方案65.根据实施方案63所述的方法，其中实施方案50-56中任一项所述的细胞或实施方案57-62中任一项所述的细胞群未与GPCR配体接触。
实施方案66.一种用于测量细胞中GPCR活性的方法，所述方法包括使实施方案50-56中任一项所述的细胞或实施方案57-62中任一项所述的细胞群与GPCR配体接触，其中所述配体与所述GPCR复合并引发或抑制所述GPCR活性。
实施方案67.根据实施方案66所述的方法，其中所述GPCR配体在实施方案50-56中任一项所述的细胞中表达。
实施方案68.根据实施方案67所述的方法，其中所述GPCR配体选自多肽、非肽化合物和小分子。
实施例
以下说明性实施例代表本文所述刺激、系统和方法的实施方案，并不意味着以任何方式进行限制。
实施例1.GPCR活性测量
如图2所示，从用不同质粒转染的细胞中测量GPCR活性。图2A中描述的质粒含有编码miRNA阵列的基因表达盒，该miRNA阵列靶向内源性腺苷酸环化酶3(AC3)mRNA进行下调。该盒还含有为腺苷酸环化酶6(AC6)蛋白的产生进行编码的外源序列。这两个元件都在同一个cumate控制的启动子的控制下。该核酸还含有第二盒，该盒编码对抗生素杀稻瘟菌素提供抗性的基因的产生。通过与含有具有bxbi整合酶的表达盒的第二质粒共转染，将质粒稳定地整合到HEK 293细胞系中。细胞系和质粒含有bxbi整合序列，允许质粒在基因组中的特定基因座以单拷贝整合。该细胞系还含有为cumate阻遏蛋白的产生进行编码的表达盒(其允许cumate控制的启动子的cumate诱导表达)并且含有允许多西环素诱导表达的反向-四环素-反式激活剂(rTTA)蛋白。通过在杀稻瘟菌素补充的介质中传代细胞来选择成功的整合。
图2B中描述的质粒含有为dCas9-BFP-KRAB融合蛋白进行编码的基因表达盒和为靶向AC3的3种不同RNA指导物(gRNA)进行编码的多个表达盒。通过gRNA将dCas9-BFP-KRAB靶向天然AC3基因组基因座来实现下调。该质粒还含有为潮霉素抗性和睡美人转座子整合序列进行编码的基因表达盒。通过与为睡美人转座酶表达进行编码的质粒共转染，将两个不同的质粒稳定地整合到上述bxbi整合细胞系中，这两个不同质粒个字含有AC3的3个指导物(总共5个独特的指导物)。通过在潮霉素补充的介质中传代细胞来选择成功的整合。
图2C中描述的质粒含有在为AC6蛋白的产生进行编码的在cumate控制的启动子下的基因表达盒。该质粒还含有为cumate阻遏蛋白的产生进行编码的第二基因表达盒(其允许cumate控制的启动子的cumate诱导表达)，和嘌呤霉素抗性基因。该质粒还含有piggybac转座子整合序列。通过与为piggybac转座酶的表达进行编码的质粒共转染，将质粒稳定地整合到上述HEK 293细胞系中。通过在嘌呤霉素补充的介质中传代细胞来选择成功的整合。图2的质粒的核酸序列可以在SEQ ID NO:1-4中找到。
用第二代基因表达盒(图2A)转染的细胞与多巴胺和0.5μM毛喉素(Fsk)接触(图3)。如图3所示，在用MADSv2.5核酸转染的细胞中，分别与ADRA2A、ADRA2C、DRD2、DRD3、DRD4和HTR1F受体结合的肾上腺素、肾上腺素、多巴胺、多巴胺和血清素相关的GPCR活性增加。如图4所示，由包含第一代基因表达盒(图2C)的细胞生成的萤光素酶测量结果，显示仅具有AC6过表达(AC6-OE)的增加的反向CRE活性。如图5所示，从包含第三代盒(图2B，包含AC3敲低，ADCY3-KD)的细胞生成的平台数据，显示出与从包含第二代基因表达盒的细胞生成的平台数据相比的改进，其中ADCY3敲低导致降低的测量活性。
尽管为了清楚和理解的目的，已经对上述公开进行了一些详细描述，但本领域技术人员通过阅读本公开将清楚，在不脱离本公开的真实范围的情况下，可以对形式和细节进行各种改变。例如，以上描述的所有技术和设备可以以各种组合使用。本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和/或其他文件出于所有目的通过引用整体并入，其程度如同每个单独的出版物、专利和/或专利申请和或其他文件单独且分别地表示出于所有目的通过引用并入。通过引用并入的文本中包含的定义在与本公开中的定义相矛盾时被排除在外。
序列表
<110> 奥科坦特公司
<120> 测量酶活性的系统和方法
<130> 52652-708.601
<140>
<141>
<150> 63/144,766
<151> 2021-02-02
<160> 4
<170> PatentIn版本 3.5
<210> 1
<211> 11087
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 1
aatctaacgt taataaaata tctttatttt cattacatct gtgtgttggt tttttgtgtg 60
aatcgatagt actaacatac gctctccatc aaaacaaaac gaaacaaaac aaactagcaa 120
aataggctgt ccccagtgca agtgcaggtg ccagaacatt tctcttaaga gactagttat 180
taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca 240
taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca 300
ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg 360
gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg 420
ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc 480
ttacgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg 540
atgcggtttt ggcagtacac caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca 600
agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt 660
ccaaaatgtc gtaatacccc cgccccgttg acgcaaatgg gcaagcttgc cgggtcgagg 720
taggcgtgta cggtgggagg cctatataag caaccggtat aatcaaacag accagattgt 780
ctgtttgtta ccggtgttta gtgaaccggg cgtttagtga ctcctgcagg ccctaagtga 840
ccagctacag tcggaaacca tcagcaagca ggtatgtact ctccagggtg gggaatctcc 900
cgccctgctc gctcagctga tctgtggctt gcgacgagca gcatgagcgt gattgagttt 960
tgaacgctca tgctgctcgt cgtattagtt acatcagtcg gttttcgtcg agggccccaa 1020
cccacctcct acgatcaacg atccaagaag gtatattgct gttgacagtg agcgatacgt 1080
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tactgcctcg gacttcaagg gagatgtctc aacggcagct tagctacagt ctttcttcat 1200
gtgactcgtg gactacgcgc gaagttcagg cccagagaat atatgaaggg gcctgaactt 1260
cgcgcgtgtt gttcaattgt catcactggc atcttttttg agctccctgg cttccccagt 1320
caagactcca gggatttgag ggacgctgtg gcctcttctc ttacatgtac cttttgctag 1380
cctcaaccct gactatcttc caggtcattg ttccaacatg cacttgacag ccaccatgtc 1440
atggtttagt ggactcctgg tccctaaagt ggatgaacgg aaaacagcct ggggtgaacg 1500
aaatggacag aagcgttcga gaaggcgtgg cactagggct ggtggattct gcacgcctcg 1560
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atgcccttgg caggatgacg ccttcatcag aaggggagga ccaggaaagg gaaaggagtt 1680
gggtctgaga gcagtggctc tgggtttcga ggataccgag gtgacaacga cagcaggagg 1740
aacggctgag gtggcacctg acgcagtgcc caggagtggg cgatcctgct ggaggcgtct 1800
ggtgcaggta ttccagtcga agcagttccg ttcggccaag ctggagcgcc tgtaccagcg 1860
gtacttcttc cagatgaacc agagcagcct gacgctgctg atggcggtgc tggtgctgct 1920
cacagcggtg ctgctggctt tccacgctgc tcctgctcgc cctcagcctg cttatgtggc 1980
actgttggcc tgtgcagcag cactgttcgt gggactcatg gtggtgtgta acagacattc 2040
tttcagacag gactccatgt gggtggtgag ctacgtggtg ctgggcatcc tggcagcagt 2100
gcaggtcgga ggagcactcg cagcagaccc tcgcagcccc tctgcgggac tctggtgccc 2160
tgtgttcttt gtctacatcg cctacacgct cctccccatc cgcatgagag ctgccgtcct 2220
cagcggactg ggactctcca ccttgcattt gatcttggcc tggcaactta accgtggtga 2280
tgccttcctc tggaagcagc tcggtgccaa tgtgctgctg ttcctctgca ccaacgtcat 2340
tggcatctgc acacactatc cagcagaggt gtctcagcgc caggcctttc aggaaacccg 2400
cggttacatc caggcccggc tccatctgca gcatgagaat cggcagcagg agcggctgct 2460
gctgtcggta ttgccccagc acgttgcaat ggagatgaaa gaagatatta acacaaaaaa 2520
agaggacatg atgttccaca aaatctacat acagaagcat gacaatgtca gcatcctgtt 2580
tgcagacatt gagggcttca ccagcctggc atcccagtgc actgcgcagg agctggtcat 2640
gaccctgaat gagctgtttg cccggtttga caagctggct gcggagaatc actgcctgag 2700
gatcaagatt ttgggggact gttactactg tgtgtcaggg ctgccggagg cacgggccga 2760
ccatgcccac tgctgtgtgg agatgggggt agacatgatt gaggccatct cgctggttcg 2820
tgaggtgaca ggagtgaatg tgaacatgcg cgtgggcatc cacagcgggc gcgtgcactg 2880
cggcgtcctt ggcttgcgga aatggcagtt cgatgtgtgg tccaatgatg tgaccctggc 2940
caaccacatg gaggcaggag gccgggctgg ccgcatccac atcactcggg caacactgca 3000
gtacctgaac ggggactacg aggtggagcc aggccgtggt ggcgagcgca atgcgtacct 3060
caaggagcag cacattgaga ctttcctcat cctgggcgcc agccagaaac ggaaagagga 3120
gaaggccatg ctggccaagc tgcagcggac tcgggccaac tctatggaag ggctgatgcc 3180
gcgctgggtt cctgatcgtg ccttctcccg gaccaaggac tccaaggcct tccgccagat 3240
gggcattgat gattccagca aagacaaccg gggcacccaa gatgccctga accctgagga 3300
tgaggtggat gagttcctga gccgtgccat cgacgcccgc agcattgatc agctgcggaa 3360
ggaccatgtg cgccggtttc tgctcacctt ccagagagag gatcttgaga agaagtactc 3420
ccggaaggtc gatccccgct tcggagccta cgttgcctgt gccctgttgg tcttttgctt 3480
catctgcttc atccagcttc tcatcttccc acactccacc ctgatgcttg ggatctatgc 3540
cagcatcttc ctgctgctgc taatcaccgt gctgatctgt gctgtgtact cctgtggttc 3600
tctgttccct aaggccctgc aacgtctgtc ccgcagcatt gtccgctcac gggcacatag 3660
caccgcagtt ggcatctttt ccgtcctgct tgtgtttact tctgccattg ccaacatgtt 3720
cacctgtaac cacaccccca tacggagctg tgcagcccgg atgctgaatt taacaccagc 3780
tgacatcact gcctgccatc tgcagcagct caattactct ctgggcctgg atgctcccct 3840
gtgtgagggc accatgccta cctgcagctt tcctgagtat ttcatcggga acatgctgct 3900
gagtctcttg gccagctctg ttttcctgca catcagcagc atcgggaagt tggccatgat 3960
ctttgtcttg gggctcatct atttggtgct gcttctgctg ggtcccccag ccaccatctt 4020
tgacaactat gacctactgc ttggcgttca tggcttggct tcttccaatg aaacctttga 4080
tgggctggac tgtccagctg cagggagggt ggccctcaaa tatatgaccc ctgtgattct 4140
gctggtgttt gcgctggcgc tgtatctgca tgctcagcaa gtggagagca ctgcccgcct 4200
agacttcctc tggaaactac aggcaacagg ggagaaggag gagatggagg agctacaggc 4260
atacaaccgg aggctgctgc ataacattct gcccaaggac gtggcggccc acttcctggc 4320
tcgggagcgc cgcaatgatg aactctacta tcagtcgtgc gagtgtgtgg ctgttatgtt 4380
tgcctccatt gccaacttct ctgagttcta tgtggagctg gaggcaaaca atgagggtgt 4440
cgagtgcctg cggctgctca acgagatcat cgctgacttt gatgagatta tcagcgagga 4500
gcggttccgg cagctggaaa agatcaagac gattggtagc acctacatgg ctgcctcagg 4560
gctgaacgcc agcacctacg atcaggttgg ccgctcccac atcactgccc tggctgacta 4620
cgccatgcgg ctcatggagc agatgaagca catcaatgag cactccttca acaatttcca 4680
gatgaagatt gggctgaaca tgggcccagt cgtggcagga gtcatcgggg ctcggaagcc 4740
acagtatgac atctggggga acacagtgaa tgtctctagt cgtatggaca gcacgggggt 4800
ccccgaccga atccaggtta ccacggacct gtaccaggtt ctagctgcca agggctacca 4860
gctggagtgt cgaggggtgg tcaaggtgaa gggcaagggg gagatgacca cctacttcct 4920
caatgggggc cccagcagtt aactcgagcc cctctccctc ccccccccct aacgttactg 4980
gccgaagccg cttggaataa ggccggtgtg cgtttgtcta tatgttattt tccaccatat 5040
tgccgtcttt tggcaatgtg agggcccgga aacctggccc tgtcttcttg acgagcattc 5100
ctaggggtct ttcccctctc gccaaaggaa tgcaaggtct gttgaatgtc gtgaaggaag 5160
cagttcctct ggaagcttct tgaagacaaa caacgtctgt agcgaccctt tgcaggcagc 5220
ggaacccccc acctggcgac aggtgcctct gcggccaaaa gccacgtgta taagatacac 5280
ctgcaaaggc ggcacaaccc cagtgccacg ttgtgagttg gatagttgtg gaaagagtca 5340
aatggctctc ctcaagcgta ttcaacaagg ggctgaagga tgcccagaag gtaccccatt 5400
gtatgggatc tgatctgggg cctcggtgca catgctttac atgtgtttag tcgaggttaa 5460
aaaacgtcta ggccccccga accacgggga cgtggttttc ctttgaaaaa cacgatgata 5520
atatggccac aaccatgaaa acgatcatcg ccctgagcta catcttctgc ctggtattcg 5580
ccgactacaa ggacgatgat gacgccagca tcgatggatc catggcagga gcaccaggac 5640
ccctgcgctt ggctttgctc ttgcttggga tggttgggcg ggctgggcct cgaccccaag 5700
gcgcaaccgt ttcactgtgg gaaactgttc aaaagtggcg agaatatcgg cgccaatgcc 5760
aacggtcttt gactgaggac ccacctccag ccaccgatct gttctgtaac cgcaccttcg 5820
acgaatatgc ctgttggcca gacggggaac cagggtcctt cgtcaatgtc tcctgtcctt 5880
ggtatctgcc ctgggcatcg tctgtccctc aagggcatgt ctaccgattc tgcacagccg 5940
aaggcctgtg gctccaaaag gacaactcct ccttgccttg gcgggacctg tctgagtgtg 6000
aggagtctaa acgaggagag cggtcatctc cggaggaaca actgcttttc ttgtatatca 6060
tatataccgt cggctacgca ctgtctttct ccgcacttgt catcgcttcc gccattctcc 6120
tgggatttcg ccacctgcac tgcacgcgaa attacattca tctgaatctg tttgcgtctt 6180
ttatactccg cgcactgtct gtctttatca aagacgctgc gttaaagtgg atgtattcca 6240
ctgccgcgca acaacatcaa tgggatgggc tgctgtccta tcaagattca ctgtcctgtc 6300
gcctggtttt ccttcttatg caatattgtg ttgccgcaaa ctactattgg ctgctggttg 6360
aaggcgttta cctgtatact ctgctcgctt tttctgttct ctccgaacaa tggatattcc 6420
gactttatgt ctctattggc tggggcgttc ccctgctgtt cgttgtcccg tgggggatcg 6480
ttaagtacct atatgaggat gagggatgtt ggacacgaaa ttccaacatg aattactggc 6540
ttatcattcg gctccctatt ctcttcgcta tcggcgtcaa ctttctcatt ttcgttcgcg 6600
tcatttgcat agtcgtttca aaactcaaag ctaatttaat gtgcaagacc gatattaagt 6660
gtcggttagc taagtctaca cttacactaa taccactttt gggaacacac gaggttattt 6720
ttgctttcgt catggatgaa cacgcccgcg gcaccttgcg ctttataaag ttgttcactg 6780
agttatcctt tacctctttt caaggcctca tggtcgccat tttgtattgt ttcgtcaata 6840
acgaagtcca acttgaattt cggaagtcat gggaacgctg gcggctagag cacttgcaca 6900
tacaacgaga ttcatccatg aaacctctca agtgcccaac ctcatcatta tcatctggcg 6960
ccaccgccgg ctcctccatg tatactgcca catgtcaagc ctcatgctcc taatagcgaa 7020
ttccctgtga cccctcccca gtgcctctcc tggccttgga agttgccact ccagtgccca 7080
ccagccttgt cctaataaaa ttaagttgca tcattttgtc tgactaggtg tcctctataa 7140
tattatgggg tggagggggg tggtatggag caaggggccc aagttgggaa gacaacctgt 7200
agggcctgcg gggtctattc gggaaccaag ctggagtgca gtggcacaat cttggctcac 7260
tgcaatctcc gcctcctggg ttcaagcgat tctcctgcct cagcctcccg agttgttggg 7320
attccaggca tgcatgacca ggctcagcta atttttgttt ttttggtagt gacggggttt 7380
caccatattg gccaggctgg tctccaactc ctaatctcag gtgatctacc caccttggcc 7440
tcccaaattg ctgggattac aggcgtgaac cactgctccc ttccctgtcc ttcctaggtc 7500
gtccacgatc agctagaatc aagctagata aactggccgt cgttttacac gggtgggcct 7560
ttcttcggta gaaaatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct 7620
gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac 7680
caactctttt tccgaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct 7740
agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc 7800
tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt 7860
ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg 7920
cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct 7980
atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag 8040
ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag 8100
tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcaccgattt ttgtgatgct cgtcaggggg 8160
gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc agaaaggccc acccgaaggt gagccaggtg 8220
attacattta ggtcctcatt agaaaaactc atcgagcatc aagtgaaact gcaatttatt 8280
catatcagga ttatcaatac catatttttg aaaaagccgt ttctgtaatg aaggagaaaa 8340
ctcaccgagg cagttccata ggatggcaag atcctggtat cggtctgcga ttccgactcg 8400
tccaacatca atacaaccta tcagtttccc ctcgtcaaaa ataaggttat caagtgagaa 8460
atcaccatga gtgacgactg aatccggtga gaatggcaag agtttatgca tttctttcca 8520
gacttgttca acaggccagc cattacgctc gtcatcaaaa tcactcgcac caaccaaacc 8580
gttattcatt cgtgattgcg cctgagccag acgaaatacg cgatcaccgt taaaaggaca 8640
attacaaaca ggaatcgaat gcaaccggcg caggaacact gccagcgcat caacaatatt 8700
ttcacctgaa tcaggatatt cttctaatac ctggaatgct gttttccctg ggatcgcagt 8760
ggtgagtaac catgcatcat caggagtacg gataaaatgc ttgatggtcg gaagaggcat 8820
aaattccgtc agccagttta gcctgaccat ctcatctgta acatcattgg caacgctacc 8880
tttgccatgt ttcagaaaca actctggcgc atcgggcttc ccatacaatc ggtagattgt 8940
cgcacctgat tgcccgacat tatcacgagc ccatttatac ccatataaat cagcatccat 9000
gttggaattt aatcgcggct tcaagcaaga cgtttcccgt tgaatatggc tcattttagc 9060
ttccttagct cctgaaaatc tcgataactc aaaaaatacg cccggtagtg atcttatttc 9120
attatggtga aagttggaac ctcttacgtg ccgatcaagt caaaagcctc cggtcggagg 9180
cttttgactt tctgctatgg aggtcaggta tgatttaaat ggtcagtatt gagcctcagg 9240
aaacagctat gaccatgatc gctgactaga taatctagcg tcgtgacgca cgcgtgccat 9300
agagcccacc gcatccccag catgcctgct attgtcttcc caatcctccc ccttgctgtc 9360
ctgccccacc ccacccccca gaatagaatg acacctactc agacaatgcg atgcaatttc 9420
ctcattttat taggaaagga cagtgggagt ggcaccttcc agggtcaagg aaggcacggg 9480
ggaggggcaa acaacagatg gctggcaact agaaggcaca gtcgggccgc gatgattttc 9540
atatgccctt gagcacagaa attaagcaga ggctaattat gtgatatgat ttaaggttgg 9600
gtctatatag ttatagcttg atgagttaaa ttggattagg agtttgcaag atgatttggc 9660
acagttagtc atagacgaag gacttacttt gaaccagcgg tttcagttgt caatcttgga 9720
tttcagcgac agcccgcagc ccttcaaatt aattaacgag attagttcct ggtgtacttg 9780
agggggatga gttcctcaat ggtggttttg accagcttgc cattcatctc aatgagcaca 9840
aagcagtcag gagcatagtc agagatcagc tctctacaca tgccacaggg gctgaccacc 9900
ctgatggatc tgtccacctc atcagagtag gggtgcctga cagccacaat ggtgtcaaag 9960
tccttctgcc cgttgctcac agcagaccca atggcaatgg cttcagcaca gacagtgacc 10020
ctgccaatgt aggcttcaat gtggacagca gagatgatct ccccagtctt ggtcctgatg 10080
gccgccccga catggtgctt gttgtcctca tagagcatgg tgatcttctc agtggcgacc 10140
tccaccagct ccagatcctg ctgagagatg ttgaaggttt tcatagggcc gggattctcc 10200
tccacgtcac cgcatgttag aagacttcct ctgccctcgc gagatccggt ggagccgggt 10260
ccggcggtgc cgtccacggc agaattggac gactgagcgc gggatctggc gaaggcgatg 10320
ggggtcttga aggcgtgctg gtactccacg atgcccagct cggtgttgct gtgcagctcc 10380
tccacgcggc ggaaggcgaa catggggccc ccgttctgca ggatgctggg gtggatggcg 10440
ctcttgaagt gcatgtggct gtccaccacg aagctgtagt agccgccgtc gcgcaggctg 10500
aaggtgcggg cgaagctgcc caccagcacg ttatcgccca tggggtgcag gtgctccacg 10560
gtggcgttgc tgcggatgat cttgtcggtg aagatcacgc tgtcctcggg gaagccggtg 10620
cccaccacct tgaagtcgcc gatcacgcgg ccggcctcgt agcggtagct gaagctcacg 10680
tgcagcacgc cgccgtcctc gtacttctcg atgcgggtgt tggtgtagcc gccgttgttg 10740
atggcgtgca ggaaggggtt ctcgtagccg ctggggtagg tgccgaagtg gtagaagccg 10800
tagcccatca cgtggctcag caggtagggg ctgaaggtca gggcgccttt ggtgctcttc 10860
atcttgttgg tcatgcggcc ctgcttgggg gtgccctctc cgccgcccac cagctcgaac 10920
tccacgccgt tcagggtgcc ggtgatgcgg cactcgatct ccatggcggg caggccgctc 10980
tcgtcgctct ccatggtggc ggcggtcgcc cttattacta ccccggatga tcctgacgac 11040
ggagaccgcc gtcgtcgaca agccggaagc ttgtgcactc tcagtac 11087
<210> 2
<211> 11134
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 2
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattagaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
cgaaaggagc cgagccagcc gagtccgttt aagagctatg ctggaaacag catagcaagt 300
ttaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gcttttttga 360
acgctgacgt catcaacccg ctccaaggaa tcgcgggccc agtgtcacta ggcgggaaca 420
cccagcgcgc gtgcgccctg gcaggaagat ggctgtgagg gacaggggag tggcgccctg 480
caatatttgc atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga 540
tttgggaatc ttataagttc tgtatgagac cactctttcc cagtgcacag ctattccccg 600
cggtttaaga gctatgctgg aaacagcata gcaagtttaa ataaggctag tccgttatca 660
acttgaaaaa gtggcaccga gtcggtgctt tttttctaga gatccgacgc cgccatctct 720
aggcccgcgc cggccccctc gcacagactt gtgggagaag ctcggctact cccctgcccc 780
ggttaatttg catataatat ttcctagtaa ctatagaggc ttaatgtgcg ataaaagaca 840
gataatctgt tctttttaat actagctaca ttttacatga taggcttgga tttctataag 900
agatacaaat actaaattat tattttaaaa aacagcacaa aaggaaactc accctaactg 960
taaagtaatt gtgtgttttg agactataaa tatgcatgcg agaaaagcct tgtttgggcc 1020
ctggggctga ggctcaggtt taagagctat gctggaaaca gcatagcaag tttaaataag 1080
gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttc gaatttaaat 1140
cggatccgcg gccgcaatca acctctggat tacaaaattt gtgaaagatt gactggtatt 1200
cttaactatg ttgctccttt tacgctatgt ggatacgctg ctttaatgcc tttgtatcat 1260
gcgttaacta aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac 1320
aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat 1380
caatgtatct tatcatgtct gtaagaggtt ccaactttca ccataatgaa ataagatcac 1440
taccgggcgt attttttgag ttatcgagat tttcaggagc taaggaagct aaaatgagta 1500
ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg 1560
ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg 1620
gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagtttacgc cccgaagaac 1680
gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg 1740
acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgaat 1800
actcaccagt cacagaaaag catctcacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg 1860
ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctggcaacc atcggaggac 1920
cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt 1980
gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag 2040
caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc 2100
aacaactgat agactggatg gaggcggata aagttgcagg atcacttctg cgctcggccc 2160
tcccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggc tctcgcggta 2220
tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgcat cgtagttatc tacacgacgg 2280
ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga 2340
ttaagcattg gtaatgaggg ccctgaggac ctaaatgtaa tcacctggct caccttcggg 2400
tgggcctttc tgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca 2460
aaaatcggtg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt 2520
ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc 2580
tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc 2640
tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc 2700
ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact 2760
tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg 2820
ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta 2880
tctgcgctct gctgaagcca gttacctcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 2940
acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 3000
aaaaggatct caagaagatc ctttgataag gatctgcgat cgctccggtg cccgtcagtg 3060
ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg ggaggggtcg gcaattgaac 3120
gggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt gatgtcgtgt actggctccg 3180
cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca gtagtcgccg tgaacgttct 3240
ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca gctgaagctt cgaggggctc gcatctctcc 3300
ttcacgcgcc cgccgcccta cctgaggccg ccatccacgc cggttgagtc gcgttctgcc 3360
gcctcccgcc tgtggtgcct cctgaactgc gtccgccgtc taggtaagtt taaagctcag 3420
gtcgtgaccg ggcctttgtc cggcgctccc ttggagccta cctagactca gccggctctc 3480
cacgctttgc ctgaccctgc ttgctcaact ctacgtcttt gtttcgtttt ctgttctgcg 3540
ccgttacaga tccaagctgt gaccggcgcc tacgctagac gccaccatgg acaagaagta 3600
cagcatcggc ctggccatcg gcaccaactc tgtgggctgg gccgtgatca ccgacgagta 3660
caaggtgccc agcaagaaat tcaaggtgct gggcaacacc gaccggcaca gcatcaagaa 3720
gaacctgatc ggcgccctgc tgttcgacag cggagaaaca gccgaggcca cccggctgaa 3780
gagaaccgcc agaagaagat acaccagacg gaagaaccgg atctgctatc tgcaagagat 3840
cttcagcaac gagatggcca aggtggacga cagcttcttc cacagactgg aagagtcctt 3900
cctggtggaa gaggataaga agcacgagcg gcaccccatc ttcggcaaca tcgtggacga 3960
ggtggcctac cacgagaagt accccaccat ctaccacctg agaaagaaac tggtggacag 4020
caccgacaag gccgacctgc ggctgatcta tctggccctg gcccacatga tcaagttccg 4080
gggccacttc ctgatcgagg gcgacctgaa ccccgacaac agcgacgtgg acaagctgtt 4140
catccagctg gtgcagacct acaaccagct gttcgaggaa aaccccatca acgccagcgg 4200
cgtggacgcc aaggccatcc tgtctgccag actgagcaag agcagacggc tggaaaatct 4260
gatcgcccag ctgcccggcg agaagaagaa tggcctgttc ggcaacctga ttgccctgag 4320
cctgggcctg acccccaact tcaagagcaa cttcgacctg gccgaggatg ccaaactgca 4380
gctgagcaag gacacctacg acgacgacct ggacaacctg ctggcccaga tcggcgacca 4440
gtacgccgac ctgtttctgg ccgccaagaa cctgtccgac gccatcctgc tgagcgacat 4500
cctgagagtg aacaccgaga tcaccaaggc ccccctgagc gcctctatga tcaagagata 4560
cgacgagcac caccaggacc tgaccctgct gaaagctctc gtgcggcagc agctgcctga 4620
gaagtacaaa gagattttct tcgaccagag caagaacggc tacgccggct acatcgatgg 4680
cggagccagc caggaagagt tctacaagtt catcaagccc atcctggaaa agatggacgg 4740
caccgaggaa ctgctcgtga agctgaacag agaggacctg ctgcggaagc agcggacctt 4800
cgacaacggc agcatccccc accagatcca cctgggagag ctgcacgcca ttctgcggcg 4860
gcaggaagat ttttacccat tcctgaagga caaccgggaa aagatcgaga agatcctgac 4920
cttccgcatc ccctactacg tgggccctct ggccagggga aacagcagat tcgcctggat 4980
gaccagaaag agcgaggaaa ccatcacccc ctggaacttc gaggaagtgg tggacaaggg 5040
cgccagcgcc cagagcttca tcgagcggat gaccaacttc gataagaacc tgcccaacga 5100
gaaggtgctg cccaagcaca gcctgctgta cgagtacttc accgtgtaca acgagctgac 5160
caaagtgaaa tacgtgaccg agggaatgag aaagcccgcc ttcctgagcg gcgagcagaa 5220
aaaagccatc gtggacctgc tgttcaagac caaccggaaa gtgaccgtga agcagctgaa 5280
agaggactac ttcaagaaaa tcgagtgctt cgactccgtg gaaatctccg gcgtggaaga 5340
tcggttcaac gcctccctgg gcacatacca cgatctgctg aaaattatca aggacaagga 5400
cttcctggac aatgaggaaa acgaggacat tctggaagat atcgtgctga ccctgacact 5460
gtttgaggac agagagatga tcgaggaacg gctgaaaacc tatgcccacc tgttcgacga 5520
caaagtgatg aagcagctga agcggcggag atacaccggc tggggcaggc tgagccggaa 5580
gctgatcaac ggcatccggg acaagcagtc cggcaagaca atcctggatt tcctgaagtc 5640
cgacggcttc gccaacagaa acttcatgca gctgatccac gacgacagcc tgacctttaa 5700
agaggacatc cagaaagccc aggtgtccgg ccagggcgat agcctgcacg agcacattgc 5760
caatctggcc ggcagccccg ccattaagaa gggcatcctg cagacagtga aggtggtgga 5820
cgagctcgtg aaagtgatgg gccggcacaa gcccgagaac atcgtgatcg aaatggccag 5880
agagaaccag accacccaga agggacagaa gaacagccgc gagagaatga agcggatcga 5940
agagggcatc aaagagctgg gcagccagat cctgaaagaa caccccgtgg aaaacaccca 6000
gctgcagaac gagaagctgt acctgtacta cctgcagaat gggcgggata tgtacgtgga 6060
ccaggaactg gacatcaacc ggctgtccga ctacgatgtg gacgctatcg tgcctcagag 6120
ctttctgaag gacgactcca tcgataacaa agtgctgact cggagcgaca agaaccgggg 6180
caagagcgac aacgtgccct ccgaagaggt cgtgaagaag atgaagaact actggcgcca 6240
gctgctgaat gccaagctga ttacccagag gaagttcgac aatctgacca aggccgagag 6300
aggcggcctg agcgaactgg ataaggccgg cttcatcaag agacagctgg tggaaacccg 6360
gcagatcaca aagcacgtgg cacagatcct ggactcccgg atgaacacta agtacgacga 6420
gaacgacaaa ctgatccggg aagtgaaagt gatcaccctg aagtccaagc tggtgtccga 6480
tttccggaag gatttccagt tttacaaagt gcgcgagatc aacaactacc accacgccca 6540
cgacgcctac ctgaacgccg tcgtgggaac cgccctgatc aaaaagtacc ctaagctgga 6600
aagcgagttc gtgtacggcg actacaaggt gtacgacgtg cggaagatga tcgccaagag 6660
cgagcaggaa atcggcaagg ctaccgccaa gtacttcttc tacagcaaca tcatgaactt 6720
tttcaagacc gagattaccc tggccaacgg cgagatccgg aagcggcctc tgatcgagac 6780
aaacggcgaa acaggcgaga tcgtgtggga taagggccgg gactttgcca ccgtgcggaa 6840
agtgctgtct atgccccaag tgaatatcgt gaaaaagacc gaggtgcaga caggcggctt 6900
cagcaaagag tctatcctgc ccaagaggaa cagcgacaag ctgatcgcca gaaagaagga 6960
ctgggaccct aagaagtacg gcggcttcga cagccccacc gtggcctatt ctgtgctggt 7020
ggtggccaaa gtggaaaagg gcaagtccaa gaaactgaag agtgtgaaag agctgctggg 7080
gatcaccatc atggaaagaa gcagcttcga gaagaatccc atcgactttc tggaagccaa 7140
gggctacaaa gaagtgaaaa aggacctgat catcaagctg cctaagtact ccctgttcga 7200
gctggaaaac ggccggaaga gaatgctggc ctctgccggc gaactgcaga agggaaacga 7260
actggccctg ccctccaaat atgtgaactt cctgtacctg gccagccact atgagaagct 7320
gaagggctcc cccgaggata atgagcagaa acagctgttt gtggaacagc acaaacacta 7380
cctggacgag atcatcgagc agatcagcga gttctccaag agagtgatcc tggccgacgc 7440
taatctggac aaggtgctga gcgcctacaa caagcacaga gacaagccta tcagagagca 7500
ggccgagaat atcatccacc tgtttaccct gaccaatctg ggagcccctg ccgccttcaa 7560
gtactttgac accaccatcg accggaagag gtacaccagc accaaagagg tgctggacgc 7620
caccctgatc caccagagca tcaccggcct gtacgagaca cggatcgacc tgtctcagct 7680
gggaggcgac gcctatccct atgacgtgcc cgattatgcc agcctgggca gcggctcccc 7740
caagaaaaaa cgcaaggtgg aagatcctaa gaaaaagcgg aaagtggacg gcattggtag 7800
tgggagcaac ggcagcagcg gatccagcga gctgattaag gagaacatgc acatgaagct 7860
gtacatggag ggcaccgtgg acaaccatca cttcaagtgc acatccgagg gcgaaggcaa 7920
gccctacgag ggcacccaga ccatgagaat caaggtggtc gagggcggcc ctctcccctt 7980
cgccttcgac atcctggcta ctagcttcct ctacggcagc aagaccttca tcaaccacac 8040
ccagggcatc cccgacttct tcaagcagtc cttccctgag ggcttcacat gggagagagt 8100
caccacatac gaagacgggg gcgtgctgac cgctacccag gacaccagcc tccaggacgg 8160
ctgcctcatc tacaacgtca agatcagagg ggtgaacttc acatccaacg gccctgtgat 8220
gcagaagaaa acactcggct gggaggcctt caccgagacg ctgtaccccg ctgacggcgg 8280
cctggaaggc agaaacgaca tggccctgaa gctcgtgggc gggagccatc tgatcgcaaa 8340
catcaagacc acatatagat ccaagaaacc cgctaagaac ctcaagatgc ctggcgtcta 8400
ctatgtggac tacagactgg aaagaatcaa ggaggccaac aacgagacct acgtcgagca 8460
gcacgaggtg gcagtggcca gatactgcga cctccctagc aaactggggc acaagcttaa 8520
tggcggtggc ggagggatgg atgctaagtc actaactgcc tggtcccgga cactggtgac 8580
cttcaaggat gtatttgtgg acttcaccag ggaggagtgg aagctgctgg acactgctca 8640
gcagatcgtg tacagaaatg tgatgctgga gaactataag aacctggttt ccttgggtta 8700
tcagcttact aagccagatg tgatcctccg gttggagaag ggagaagagc cccttgaggg 8760
cagaggaagt ctgctaacat gcggtgacgt ggaggagaat cccggccctg ctagcatgaa 8820
gaagcccgaa ctcaccgcta ccagcgttga aaaatttctc atcgagaagt tcgacagtgt 8880
gagcgacctg atgcagttgt cggagggcga agagagccga gccttcagct tcgatgtcgg 8940
cggacgcggc tatgtactgc gggtgaatag ctgcgctgat ggcttctaca aagaccgcta 9000
cgtgtaccgc cacttcgcca gcgctgcact acccatcccc gaagtgttgg acatcggcga 9060
gttcagcgag agcctgacat actgcatcag tagacgcgcc caaggcgtta ctctccaaga 9120
cctccccgaa acagagctgc ctgctgtgtt acagcctgtc gccgaagcta tggatgctat 9180
tgccgccgcc gacctcagtc aaaccagcgg cttcggccca ttcgggcccc aaggcatcgg 9240
ccagtacaca acctggcggg atttcatttg cgccattgct gatccccatg tctaccactg 9300
gcagaccgtg atggacgaca ccgtgtccgc cagcgtagct caagccctgg acgaactgat 9360
gctgtgggcc gaagactgtc ccgaggtgcg ccacctcgtc catgccgact tcggcagcaa 9420
caacgtcctg accgacaacg gccgcatcac cgccgtaatc gactggtccg aagctatgtt 9480
cggggacagt cagtacgagg tggccaacat cttcttctgg cggccctggc tggcttgcat 9540
ggagcagcag actcgctact tcgagcgccg gcatcccgag ctggccggca gccctcgtct 9600
gcgagcctac atgctgcgca tcggcctgga tcagctctac cagagcctcg tggacggcaa 9660
cttcgacgat gctgcctggg ctcaaggccg ctgcgatgcc atcgtccgca gcggggccgg 9720
caccgtcggt cgcacacaaa tcgctcgccg gagcgcagcc gtatggaccg acggctgcgt 9780
cgaggtgctg gccgacagcg gcaaccgccg gcccagtaca cgaccgcgcg ctaaggaggt 9840
aggtcgagtt taaggcccga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc 9900
ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga 9960
ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca 10020
ggacagcaag ggggaggatt gggaggacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc 10080
tatggctgaa aactattccg gaatgggaat ccaggggtag gagatgcttt ggctctagat 10140
gcaagacatg aagcgtttgc ttctggccac cagggggagc tgctgggacg cagacggact 10200
ccaaggactg gagccagaag cctggtgttg gtcgagtgta tgtaaacttc tgacccactg 10260
ggaatgtgat gaaagaaata aaagctgaaa tgaatcattc tctctactat tattctgata 10320
tttcacattc ttaaaataaa gtggtgatcc taactgacct aagacaggga atttttacta 10380
ggattaaatg tcaggaattg tgaaaaagtg agtttaaatg tatttggcta aggtgtatgt 10440
aaacttccga cttcaactgt atagaataag agacaacgca cctagctatg ctgaaagcga 10500
gaatccggga aggtctgtac gggcttctgt tatggtgtca acactacgag aagaaaatcg 10560
atcggaattg tcgaatgaag ggaataatgt cgaggcacag acttcaacag caagaaaggt 10620
tctgaatttt ttcaaaagaa ggagcatgag ggtttgatac agttgaagtc ggaagtttac 10680
atacacttaa gttggagtca ttaaaactcg tttttcaact actccacaaa tttcttgtta 10740
acaaacaata gttttggcaa gtcagttagg acatctactt tgtgcatgac acaagtcatt 10800
tttccaacaa ttgtttacag acagattatt tcacttataa ttcactgtat cacaattcca 10860
gtgggtcaga agtttacata cactaagttg actgaaaaaa aaaaagaaaa agaaaacacc 10920
tactttcctc tccatggaaa cagcatgcca gaaaattttg tggacccttg aaatgagcac 10980
acatctcact tgcaaaagca cagcaccagc gccctctgct gtttcctggt ttgatttaga 11040
actcagagaa gctacagtac tttctagact aaaataccat gtagagttca ggataattat 11100
attctagatt agacataggc atctagagct agcg 11134
<210> 3
<211> 11134
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 3
gtttaagagc tatgctggaa acagcatagc aagtttaaat aaggctagtc cgttatcaac 60
ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttcgaattta aatcggatcc gcggccgcaa 120
tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc 180
ttttacgcta tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat catgcgttaa ctaaacttgt 240
ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag 300
catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg 360
tctgtaagag gttccaactt tcaccataat gaaataagat cactaccggg cgtatttttt 420
gagttatcga gattttcagg agctaaggaa gctaaaatga gtattcaaca tttccgtgtc 480
gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg 540
gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat 600
ctcaacagcg gtaagatcct tgagagttta cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc 660
acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa 720
ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg aatactcacc agtcacagaa 780
aagcatctca cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt 840
gataacactg cggccaactt acttctggca accatcggag gaccgaagga gctaaccgct 900
tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat 960
gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg 1020
cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaact gatagactgg 1080
atggaggcgg ataaagttgc aggatcactt ctgcgctcgg ccctcccggc tggctggttt 1140
attgctgata aatctggagc cggtgagcgt ggctctcgcg gtatcattgc agcactgggg 1200
ccagatggta agccctcccg catcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg 1260
gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaatga 1320
gggccctgag gacctaaatg taatcacctg gctcaccttc gggtgggcct ttctgcgttg 1380
ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg gtgctcaagt 1440
cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc 1500
ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct 1560
tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc 1620
gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta 1680
tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca 1740
gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag 1800
tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag 1860
ccagttacct cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta 1920
gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag 1980
atcctttgat aaggatctgc gatcgctccg gtgcccgtca gtgggcagag cgcacatcgc 2040
ccacagtccc cgagaagttg gggggagggg tcggcaattg aacgggtgcc tagagaaggt 2100
ggcgcggggt aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg 2160
ggggagaacc gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg 2220
ccgccagaac acagctgaag cttcgagggg ctcgcatctc tccttcacgc gcccgccgcc 2280
ctacctgagg ccgccatcca cgccggttga gtcgcgttct gccgcctccc gcctgtggtg 2340
cctcctgaac tgcgtccgcc gtctaggtaa gtttaaagct caggtcgtga ccgggccttt 2400
gtccggcgct cccttggagc ctacctagac tcagccggct ctccacgctt tgcctgaccc 2460
tgcttgctca actctacgtc tttgtttcgt tttctgttct gcgccgttac agatccaagc 2520
tgtgaccggc gcctacgcta gacgccacca tggacaagaa gtacagcatc ggcctggcca 2580
tcggcaccaa ctctgtgggc tgggccgtga tcaccgacga gtacaaggtg cccagcaaga 2640
aattcaaggt gctgggcaac accgaccggc acagcatcaa gaagaacctg atcggcgccc 2700
tgctgttcga cagcggagaa acagccgagg ccacccggct gaagagaacc gccagaagaa 2760
gatacaccag acggaagaac cggatctgct atctgcaaga gatcttcagc aacgagatgg 2820
ccaaggtgga cgacagcttc ttccacagac tggaagagtc cttcctggtg gaagaggata 2880
agaagcacga gcggcacccc atcttcggca acatcgtgga cgaggtggcc taccacgaga 2940
agtaccccac catctaccac ctgagaaaga aactggtgga cagcaccgac aaggccgacc 3000
tgcggctgat ctatctggcc ctggcccaca tgatcaagtt ccggggccac ttcctgatcg 3060
agggcgacct gaaccccgac aacagcgacg tggacaagct gttcatccag ctggtgcaga 3120
cctacaacca gctgttcgag gaaaacccca tcaacgccag cggcgtggac gccaaggcca 3180
tcctgtctgc cagactgagc aagagcagac ggctggaaaa tctgatcgcc cagctgcccg 3240
gcgagaagaa gaatggcctg ttcggcaacc tgattgccct gagcctgggc ctgaccccca 3300
acttcaagag caacttcgac ctggccgagg atgccaaact gcagctgagc aaggacacct 3360
acgacgacga cctggacaac ctgctggccc agatcggcga ccagtacgcc gacctgtttc 3420
tggccgccaa gaacctgtcc gacgccatcc tgctgagcga catcctgaga gtgaacaccg 3480
agatcaccaa ggcccccctg agcgcctcta tgatcaagag atacgacgag caccaccagg 3540
acctgaccct gctgaaagct ctcgtgcggc agcagctgcc tgagaagtac aaagagattt 3600
tcttcgacca gagcaagaac ggctacgccg gctacatcga tggcggagcc agccaggaag 3660
agttctacaa gttcatcaag cccatcctgg aaaagatgga cggcaccgag gaactgctcg 3720
tgaagctgaa cagagaggac ctgctgcgga agcagcggac cttcgacaac ggcagcatcc 3780
cccaccagat ccacctggga gagctgcacg ccattctgcg gcggcaggaa gatttttacc 3840
cattcctgaa ggacaaccgg gaaaagatcg agaagatcct gaccttccgc atcccctact 3900
acgtgggccc tctggccagg ggaaacagca gattcgcctg gatgaccaga aagagcgagg 3960
aaaccatcac cccctggaac ttcgaggaag tggtggacaa gggcgccagc gcccagagct 4020
tcatcgagcg gatgaccaac ttcgataaga acctgcccaa cgagaaggtg ctgcccaagc 4080
acagcctgct gtacgagtac ttcaccgtgt acaacgagct gaccaaagtg aaatacgtga 4140
ccgagggaat gagaaagccc gccttcctga gcggcgagca gaaaaaagcc atcgtggacc 4200
tgctgttcaa gaccaaccgg aaagtgaccg tgaagcagct gaaagaggac tacttcaaga 4260
aaatcgagtg cttcgactcc gtggaaatct ccggcgtgga agatcggttc aacgcctccc 4320
tgggcacata ccacgatctg ctgaaaatta tcaaggacaa ggacttcctg gacaatgagg 4380
aaaacgagga cattctggaa gatatcgtgc tgaccctgac actgtttgag gacagagaga 4440
tgatcgagga acggctgaaa acctatgccc acctgttcga cgacaaagtg atgaagcagc 4500
tgaagcggcg gagatacacc ggctggggca ggctgagccg gaagctgatc aacggcatcc 4560
gggacaagca gtccggcaag acaatcctgg atttcctgaa gtccgacggc ttcgccaaca 4620
gaaacttcat gcagctgatc cacgacgaca gcctgacctt taaagaggac atccagaaag 4680
cccaggtgtc cggccagggc gatagcctgc acgagcacat tgccaatctg gccggcagcc 4740
ccgccattaa gaagggcatc ctgcagacag tgaaggtggt ggacgagctc gtgaaagtga 4800
tgggccggca caagcccgag aacatcgtga tcgaaatggc cagagagaac cagaccaccc 4860
agaagggaca gaagaacagc cgcgagagaa tgaagcggat cgaagagggc atcaaagagc 4920
tgggcagcca gatcctgaaa gaacaccccg tggaaaacac ccagctgcag aacgagaagc 4980
tgtacctgta ctacctgcag aatgggcggg atatgtacgt ggaccaggaa ctggacatca 5040
accggctgtc cgactacgat gtggacgcta tcgtgcctca gagctttctg aaggacgact 5100
ccatcgataa caaagtgctg actcggagcg acaagaaccg gggcaagagc gacaacgtgc 5160
cctccgaaga ggtcgtgaag aagatgaaga actactggcg ccagctgctg aatgccaagc 5220
tgattaccca gaggaagttc gacaatctga ccaaggccga gagaggcggc ctgagcgaac 5280
tggataaggc cggcttcatc aagagacagc tggtggaaac ccggcagatc acaaagcacg 5340
tggcacagat cctggactcc cggatgaaca ctaagtacga cgagaacgac aaactgatcc 5400
gggaagtgaa agtgatcacc ctgaagtcca agctggtgtc cgatttccgg aaggatttcc 5460
agttttacaa agtgcgcgag atcaacaact accaccacgc ccacgacgcc tacctgaacg 5520
ccgtcgtggg aaccgccctg atcaaaaagt accctaagct ggaaagcgag ttcgtgtacg 5580
gcgactacaa ggtgtacgac gtgcggaaga tgatcgccaa gagcgagcag gaaatcggca 5640
aggctaccgc caagtacttc ttctacagca acatcatgaa ctttttcaag accgagatta 5700
ccctggccaa cggcgagatc cggaagcggc ctctgatcga gacaaacggc gaaacaggcg 5760
agatcgtgtg ggataagggc cgggactttg ccaccgtgcg gaaagtgctg tctatgcccc 5820
aagtgaatat cgtgaaaaag accgaggtgc agacaggcgg cttcagcaaa gagtctatcc 5880
tgcccaagag gaacagcgac aagctgatcg ccagaaagaa ggactgggac cctaagaagt 5940
acggcggctt cgacagcccc accgtggcct attctgtgct ggtggtggcc aaagtggaaa 6000
agggcaagtc caagaaactg aagagtgtga aagagctgct ggggatcacc atcatggaaa 6060
gaagcagctt cgagaagaat cccatcgact ttctggaagc caagggctac aaagaagtga 6120
aaaaggacct gatcatcaag ctgcctaagt actccctgtt cgagctggaa aacggccgga 6180
agagaatgct ggcctctgcc ggcgaactgc agaagggaaa cgaactggcc ctgccctcca 6240
aatatgtgaa cttcctgtac ctggccagcc actatgagaa gctgaagggc tcccccgagg 6300
ataatgagca gaaacagctg tttgtggaac agcacaaaca ctacctggac gagatcatcg 6360
agcagatcag cgagttctcc aagagagtga tcctggccga cgctaatctg gacaaggtgc 6420
tgagcgccta caacaagcac agagacaagc ctatcagaga gcaggccgag aatatcatcc 6480
acctgtttac cctgaccaat ctgggagccc ctgccgcctt caagtacttt gacaccacca 6540
tcgaccggaa gaggtacacc agcaccaaag aggtgctgga cgccaccctg atccaccaga 6600
gcatcaccgg cctgtacgag acacggatcg acctgtctca gctgggaggc gacgcctatc 6660
cctatgacgt gcccgattat gccagcctgg gcagcggctc ccccaagaaa aaacgcaagg 6720
tggaagatcc taagaaaaag cggaaagtgg acggcattgg tagtgggagc aacggcagca 6780
gcggatccag cgagctgatt aaggagaaca tgcacatgaa gctgtacatg gagggcaccg 6840
tggacaacca tcacttcaag tgcacatccg agggcgaagg caagccctac gagggcaccc 6900
agaccatgag aatcaaggtg gtcgagggcg gccctctccc cttcgccttc gacatcctgg 6960
ctactagctt cctctacggc agcaagacct tcatcaacca cacccagggc atccccgact 7020
tcttcaagca gtccttccct gagggcttca catgggagag agtcaccaca tacgaagacg 7080
ggggcgtgct gaccgctacc caggacacca gcctccagga cggctgcctc atctacaacg 7140
tcaagatcag aggggtgaac ttcacatcca acggccctgt gatgcagaag aaaacactcg 7200
gctgggaggc cttcaccgag acgctgtacc ccgctgacgg cggcctggaa ggcagaaacg 7260
acatggccct gaagctcgtg ggcgggagcc atctgatcgc aaacatcaag accacatata 7320
gatccaagaa acccgctaag aacctcaaga tgcctggcgt ctactatgtg gactacagac 7380
tggaaagaat caaggaggcc aacaacgaga cctacgtcga gcagcacgag gtggcagtgg 7440
ccagatactg cgacctccct agcaaactgg ggcacaagct taatggcggt ggcggaggga 7500
tggatgctaa gtcactaact gcctggtccc ggacactggt gaccttcaag gatgtatttg 7560
tggacttcac cagggaggag tggaagctgc tggacactgc tcagcagatc gtgtacagaa 7620
atgtgatgct ggagaactat aagaacctgg tttccttggg ttatcagctt actaagccag 7680
atgtgatcct ccggttggag aagggagaag agccccttga gggcagagga agtctgctaa 7740
catgcggtga cgtggaggag aatcccggcc ctgctagcat gaagaagccc gaactcaccg 7800
ctaccagcgt tgaaaaattt ctcatcgaga agttcgacag tgtgagcgac ctgatgcagt 7860
tgtcggaggg cgaagagagc cgagccttca gcttcgatgt cggcggacgc ggctatgtac 7920
tgcgggtgaa tagctgcgct gatggcttct acaaagaccg ctacgtgtac cgccacttcg 7980
ccagcgctgc actacccatc cccgaagtgt tggacatcgg cgagttcagc gagagcctga 8040
catactgcat cagtagacgc gcccaaggcg ttactctcca agacctcccc gaaacagagc 8100
tgcctgctgt gttacagcct gtcgccgaag ctatggatgc tattgccgcc gccgacctca 8160
gtcaaaccag cggcttcggc ccattcgggc cccaaggcat cggccagtac acaacctggc 8220
gggatttcat ttgcgccatt gctgatcccc atgtctacca ctggcagacc gtgatggacg 8280
acaccgtgtc cgccagcgta gctcaagccc tggacgaact gatgctgtgg gccgaagact 8340
gtcccgaggt gcgccacctc gtccatgccg acttcggcag caacaacgtc ctgaccgaca 8400
acggccgcat caccgccgta atcgactggt ccgaagctat gttcggggac agtcagtacg 8460
aggtggccaa catcttcttc tggcggccct ggctggcttg catggagcag cagactcgct 8520
acttcgagcg ccggcatccc gagctggccg gcagccctcg tctgcgagcc tacatgctgc 8580
gcatcggcct ggatcagctc taccagagcc tcgtggacgg caacttcgac gatgctgcct 8640
gggctcaagg ccgctgcgat gccatcgtcc gcagcggggc cggcaccgtc ggtcgcacac 8700
aaatcgctcg ccggagcgca gccgtatgga ccgacggctg cgtcgaggtg ctggccgaca 8760
gcggcaaccg ccggcccagt acacgaccgc gcgctaagga ggtaggtcga gtttaaggcc 8820
cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga 8880
ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt 8940
gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg 9000
attgggagga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggct gaaaactatt 9060
ccggaatggg aatccagggg taggagatgc tttggctcta gatgcaagac atgaagcgtt 9120
tgcttctggc caccaggggg agctgctggg acgcagacgg actccaagga ctggagccag 9180
aagcctggtg ttggtcgagt gtatgtaaac ttctgaccca ctgggaatgt gatgaaagaa 9240
ataaaagctg aaatgaatca ttctctctac tattattctg atatttcaca ttcttaaaat 9300
aaagtggtga tcctaactga cctaagacag ggaattttta ctaggattaa atgtcaggaa 9360
ttgtgaaaaa gtgagtttaa atgtatttgg ctaaggtgta tgtaaacttc cgacttcaac 9420
tgtatagaat aagagacaac gcacctagct atgctgaaag cgagaatccg ggaaggtctg 9480
tacgggcttc tgttatggtg tcaacactac gagaagaaaa tcgatcggaa ttgtcgaatg 9540
aagggaataa tgtcgaggca cagacttcaa cagcaagaaa ggttctgaat tttttcaaaa 9600
gaaggagcat gagggtttga tacagttgaa gtcggaagtt tacatacact taagttggag 9660
tcattaaaac tcgtttttca actactccac aaatttcttg ttaacaaaca atagttttgg 9720
caagtcagtt aggacatcta ctttgtgcat gacacaagtc atttttccaa caattgttta 9780
cagacagatt atttcactta taattcactg tatcacaatt ccagtgggtc agaagtttac 9840
atacactaag ttgactgaaa aaaaaaaaga aaaagaaaac acctactttc ctctccatgg 9900
aaacagcatg ccagaaaatt ttgtggaccc ttgaaatgag cacacatctc acttgcaaaa 9960
gcacagcacc agcgccctct gctgtttcct ggtttgattt agaactcaga gaagctacag 10020
tactttctag actaaaatac catgtagagt tcaggataat tatattctag attagacata 10080
ggcatctaga gctagcggag ggcctatttc ccatgattcc ttcatatttg catatacgat 10140
acaaggctgt tagagagata attagaatta atttgactgt aaacacaaag atattagtac 10200
aaaatacgtg acgtagaaag taataatttc ttgggtagtt tgcagtttta aaattatgtt 10260
ttaaaatgga ctatcatatg cttaccgtaa cttgaaagta tttcgatttc ttggctttat 10320
atatcttgtg gaaaggacga aaggagccag ccgagtccgg gctgtttaag agctatgctg 10380
gaaacagcat agcaagttta aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg 10440
agtcggtgct tttttgaacg ctgacgtcat caacccgctc caaggaatcg cgggcccagt 10500
gtcactaggc gggaacaccc agcgcgcgtg cgccctggca ggaagatggc tgtgagggac 10560
aggggagtgg cgccctgcaa tatttgcatg tcgctatgtg ttctgggaaa tcaccataaa 10620
cgtgaaatgt ctttggattt gggaatctta taagttctgt atgagaccac tctttcccag 10680
cgagggctgg gagatccgtg tttaagagct atgctggaaa cagcatagca agtttaaata 10740
aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt ttctagagat 10800
ccgacgccgc catctctagg cccgcgccgg ccccctcgca cagacttgtg ggagaagctc 10860
ggctactccc ctgccccggt taatttgcat ataatatttc ctagtaacta tagaggctta 10920
atgtgcgata aaagacagat aatctgttct ttttaatact agctacattt tacatgatag 10980
gcttggattt ctataagaga tacaaatact aaattattat tttaaaaaac agcacaaaag 11040
gaaactcacc ctaactgtaa agtaattgtg tgttttgaga ctataaatat gcatgcgaga 11100
aaagccttgt ttgggccctg gggctgaggc tcag 11134
<210> 4
<211> 9557
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 4
ttaaccctag aaagataatc atattgtgac gtacgttaaa gataatcatg tgtaaaattg 60
acgcatgtga ctgaaaaaaa aaaagaaaaa gaaaacacct actttcctct ccatggaaac 120
agcatgccag aaaattttgt ggacccttga aatgagcaca catctcactt gcaaaagcac 180
agcaccagcg ccctctgctg tttcctggtt tgatttagaa ctcagagaag ctacagtact 240
ttctagacta aaataccatg tagagttcag gataattata ttctagatta gacataggca 300
agactagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt 360
tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc 420
cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac 480
gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata 540
tgccaagtcc gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc 600
agtacatgac cttacgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta 660
ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca ccaatgggcg tggatagcgg tttgactcac 720
ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc 780
aacgggactt tccaaaatgt cgtaataccc ccgccccgtt gacgcaaatg ggcaagcttg 840
ccgggtcgag gtaggcgtgt acggtgggag gcctatataa gcaaccggta taatcaaaca 900
gaccagattg tctgtttgtt accggtgttt agtgaaccgg gcgcgcctca tatcgcctgg 960
agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagacacc gggaccgatc cagcctccgc 1020
ggtcactctc ttccgcatcg ctgtctgcga gggccagctg ttgggctcgc ggttgaggac 1080
aaactcttcg cggtctttcc agtactcttg gatcggaaac ccgtcggcct ccgaacggta 1140
ctccgccacc gagggacctg agcgagtccg catcgaccgg atcggaaaac ctctcgagaa 1200
aggcgtctaa ccagtcacag tcgcaaggta ggctgagcac cgtggcgggc ggcagcgggt 1260
ggcggtcggg gttgtttctg gcggaggtgc tgctgatgat gtaattaaag taggcggtct 1320
tgagacggcg gatggtcgag gtgaggtgtg gcaggcttga gatccagctg ttggggtgag 1380
tactccctct caaaagcggg cattacttct gcgctaagat tgtcagtttc caaaaacgag 1440
gaggatttga tattcacctg gcccgatctg gccatacact tgagtgacaa tgacatccac 1500
tttgcctttc tctccacagg tgtccactcc caggtccaag tttggtctag acacttgaca 1560
gccaccatgt catggtttag tggactcctg gtccctaaag tggatgaacg gaaaacagcc 1620
tggggtgaac gaaatggaca gaagcgttcg agaaggcgtg gcactagggc aggtggattc 1680
tgcacgcctc gctatatgag ctgcctcaga gatgcagagc cacccagccc aacccctgct 1740
ggaccaccta gatgcccttg gcaggatgac gccttcatca gaaggggagg accaggtaag 1800
ggtaaggagt tgggtctgag agcagtggct ctgggtttcg aggataccga ggtgacaacg 1860
acagcaggag gtacggctga ggtggcacct gacgcagtgc ccaggagtgg gcgatcctgc 1920
tggagacgtc tggtgcaggt gttccagtcg aagcagttcc gttcggccaa gctggagcgc 1980
ctgtaccagc ggtacttctt ccagatgaac cagagcagcc tgacgctgct gatggcggtg 2040
ctggtgctgc tcacagcggt gctgctggct ttccacgctg cacctgctcg ccctcagcct 2100
gcttatgtgg cactgttggc ctgtgcagca gcactgttcg tgggactcat ggtggtgtgt 2160
aacagacata gcttcagaca ggactccatg tgggtggtga gctacgtggt gctgggcatc 2220
ctggcagcag tgcaggtcgg aggagcactc gcagcagacc ctcgcagccc ctctgcggga 2280
ctctggtgcc ctgtgttctt tgtctacatc gcctacacgc tcctccccat ccgcatgaga 2340
gctgccgtcc tcagcggact gggactctcc accttgcatt tgatcttggc ctggcaactt 2400
aaccgtggtg atgccttcct ctggaagcag ctcggtgcca atgtgctgct gttcctctgc 2460
accaacgtca ttggcatctg cacacactat ccagcagagg tgtctcagcg ccaggccttt 2520
caggagaccc gcggttacat ccaggcccgg ctccacctgc agcatgagaa tcggcagcag 2580
gagcggctgc tgctgtcggt attgccccag cacgttgcca tggagatgaa agaagacatc 2640
aacacaaaaa aagaagacat gatgttccac aagatctaca tacagaagca tgacaatgtc 2700
agcatcctgt ttgcagacat tgagggcttc accagcctgg catcccagtg cactgcgcag 2760
gagctggtca tgaccctgaa tgagctgttt gcccggtttg acaagctggc tgcggagaat 2820
cactgcctga ggatcaagat cttgggggac tgttactact gtgtgtcagg gctgccggag 2880
gcccgggccg accatgccca ctgctgtgtg gagatggggg tagacatgat tgaggccatc 2940
tcgctggtac gtgaggtgac aggtgtgaat gtgaacatgc gcgtgggcat ccacagcggg 3000
cgcgtgcact gcggcgtcct tggcttgcgg aaatggcagt tcgatgtgtg gtccaatgat 3060
gtgaccctgg ccaaccacat ggaggcagga ggccgggctg gccgcatcca catcactcgg 3120
gcaacactgc agtacctgaa cggggactac gaggtggagc caggccgtgg tggcgagcgc 3180
aatgcgtacc tcaaggagca gcacattgag actttcctca tcctgggcgc cagccagaaa 3240
cggaaagagg agaaggccat gctggccaag ctgcagcgga ctcgggccaa ctccatggaa 3300
gggctgatgc cgcgctgggt tcctgatcgt gccttctccc ggaccaagga ctccaaggcc 3360
ttccgccaga tgggcattga tgattccagc aaagacaacc ggggcaccca agatgccctg 3420
aaccctgagg atgaggtgga tgagttcctg agccgtgcca tcgacgcccg cagcattgat 3480
cagctgcgga aggaccatgt gcgccggttt ctgctcacct tccagagaga ggatcttgag 3540
aagaagtact cccggaaggt cgatccccgc ttcggagcct acgttgcctg tgccctgttg 3600
gtcttctgct tcatctgctt catccagctt ctcatcttcc cacactccac cctgatgctt 3660
gggatctatg ccagcatctt cctgctgctg ctaatcaccg tgctgatctg tgctgtgtac 3720
tcctgtggtt ctctgttccc taaggccctg caacgtctgt cccgcagcat tgtccgctca 3780
cgggcacata gcaccgcagt tggcatcttt tccgtcctgc ttgtgtttac ttctgccatt 3840
gccaacatgt tcacctgtaa ccacaccccc atacggagct gtgcagcccg gatgctgaat 3900
ttaacacctg ctgacatcac tgcctgccac ctgcagcagc tcaattactc tctgggcctg 3960
gatgctcccc tgtgtgaggg caccatgccc acctgcagct ttcctgagta cttcatcggg 4020
aacatgctgc tgagtctctt ggccagctct gtcttcctgc acatcagcag catcgggaag 4080
ttggccatga tctttgtctt ggggctcatc tatttggtgc tgcttctgct gggtccccca 4140
gccaccatct ttgacaacta tgacctactg cttggcgtcc atggcttggc ttcttccaat 4200
gagacctttg atgggctgga ctgtccagct gcagggaggg tggccctcaa atatatgacc 4260
cctgtgattc tgctggtgtt tgcgctggcg ctgtatctgc atgctcagca ggtggagagc 4320
actgcccgcc tagacttcct ctggaaacta caggcaacag gggagaagga ggagatggag 4380
gagctacagg catacaaccg gaggctgctg cataacattc tgcccaagga cgtggcggcc 4440
cacttcctgg cccgggagcg ccgcaatgat gaactctact atcagtcgtg tgagtgtgtg 4500
gctgttatgt ttgcctccat tgccaacttc tctgagttct atgtggagct ggaggcaaac 4560
aatgagggtg tcgagtgcct gcggctgctc aacgagatca tcgctgactt tgatgagatt 4620
atcagcgagg agcggttccg gcagctggaa aagatcaaga cgattggtag cacctacatg 4680
gctgcctcag ggctgaacgc cagcacctac gatcaggtgg gccgctccca catcactgcc 4740
ctggctgact acgccatgcg gctcatggag cagatgaagc acatcaatga gcactccttc 4800
aacaatttcc agatgaagat tgggctgaac atgggcccag tcgtggcagg tgtcatcggg 4860
gctcggaagc cacagtatga catctggggg aacacagtga atgtctctag tcgtatggac 4920
agcacggggg tccccgaccg aatccaggtg accacggacc tgtaccaggt tctagctgcc 4980
aagggctacc agctggagtg tcgaggggtg gtcaaggtga agggcaaggg ggagatgacc 5040
acctacttcc tcaatggggg ccccagcagt taagaatcaa cctctggatt acaaaatttg 5100
tgaaagattg actggtattc ttaactatgt tgctcctttt acgctatgtg gatacgctgc 5160
tttaatgcct ttgtatcatg cgttaactaa acttgtttat tgcagcttat aatggttaca 5220
aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt 5280
gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg taagaggttc caactttcac 5340
cataatgaaa taagatcact accgggcgta ttttttgagt tatcgagatt ttcaggagct 5400
aaggaagcta aaatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca 5460
ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat 5520
cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag 5580
agtttacgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc 5640
gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct 5700
cagaatgact tggttgaata ctcaccagtc acagaaaagc atctcacgga tggcatgaca 5760
gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt 5820
ctggcaacca tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat 5880
gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt 5940
gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta 6000
cttactctag cttcccggca acaactgata gactggatgg aggcggataa agttgcagga 6060
tcacttctgc gctcggccct cccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt 6120
gagcgtggct ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgcatc 6180
gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct 6240
gagataggtg cctcactgat taagcattgg taatgagggc cctgaggacc taaatgtaat 6300
cacctggctc accttcgggt gggcctttct gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 6360
ccccctgacg agcatcacaa aaatcggtgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 6420
ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 6480
ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 6540
agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 6600
cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 6660
aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 6720
gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 6780
agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttacctcgga aaaagagttg 6840
gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc 6900
agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgataagg atctgcgatc 6960
gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg 7020
gaggggtcgg caattgaacg ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg 7080
atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag 7140
tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag ctgaagcttc 7200
gaggggctcg catctctcct tcacgcgccc gccgccctac ctgaggccgc catccacgcc 7260
ggttgagtcg cgttctgccg cctcccgcct gtggtgcctc ctgaactgcg tccgccgtct 7320
aggtaagttt aaagctcagg tcgtgaccgg gcctttgtcc ggcgctccct tggagcctac 7380
ctagactcag ccggctctcc acgctttgcc tgaccctgct tgctcaactc tacgtctttg 7440
tttcgttttc tgttctgcgc cgttacagat ccaagctgtg accggcgcct acgctagacg 7500
ccaccatggc ttacccatac gatgttccag attacgctag tttggtgagg cagcagagac 7560
cgatgacatc cactttgcct ttctctccac aggtgtccac tcccaggtcc aagtttggaa 7620
gatctaccat gccaaagaga cccagacccg tgatcatgag tccaaagaga agaacacagg 7680
cagagcgcgc aatggagacc cagggcaagt tgattgcagc ggccctgggg gttttacggg 7740
aaaaaggtta cgcgggattc cggatcgcag atgtgcccgg tgctgcaggt gtctcgagag 7800
gagcgcagag ccatcatttc ccgacaaagc ttgagcttct gcttgccact tttgaatggc 7860
tttacgaaca gatcaccgaa cgcagtcggg ctcgattagc gaaattgaag ccagaggatg 7920
acgtcatcca gcaaatgctg gacgacgccg ccgaattttt cctcgacgat gacttctcta 7980
tcagccttga tttgattgtg gctgccgacc gggatccagc gttacgcgag ggtattcagc 8040
gcacggtaga gaggaatcgg tttgtcgtcg aggatatgtg gcttggtgtt ctggtgagcc 8100
gtggtctttc gcgtgatgat gcagaagata tcctttggtt gatattcaat tcggtgcgtg 8160
ggcttgctgt tcgtagccta tggcagaagg acaaagaacg ctttgagcgt gtcaggaact 8220
cgacactcga aattgcgcga gagcggtacg cgaaattcaa gcgcgcggcc aaaccctctg 8280
gcgcggccgc ggagggcaga ggaagtcttc taacatgcgg tgacgtggag gagaatcccg 8340
gccctatgac cgagtacaag cccacggtgc gcctcgccac ccgcgacgac gtccccaggg 8400
ccgtacgcac cctcgccgcc gcgttcgccg actaccccgc cacgcgccac accgtcgatc 8460
cggaccgcca catcgagcgg gtcaccgagc tgcaagaact cttcctcacg cgcgtcgggc 8520
tcgacatcgg caaggtgtgg gtcgcggacg acggcgccgc ggtggcggtc tggaccacgc 8580
cggagagcgt cgaagcgggg gcggtgttcg ccgagatcgg cccgcgcatg gccgagttga 8640
gcggttcccg gctggccgcg cagcaacaga tggaaggcct cctggcgccg caccggccca 8700
aggagcccgc gtggttcctg gccaccgtcg gcgtgtcgcc cgaccaccag ggcaagggtc 8760
tgggcagcgc cgtcgtgctc cccggagtgg aggcggccga gcgcgccggg gtgcccgcct 8820
tcctggaaac ctccgcgccc cgcaacctcc ccttctacga gcggctcggc ttcaccgtca 8880
ccgccgacgt cgaggtgccc gaaggaccgc gcacctggtg catgacccgc aagcccggtg 8940
cctgaggccc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc 9000
cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg 9060
catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca 9120
agggggagga ttgggaggac aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc tctatggctg 9180
aaaactattc cggaatggga atccaggggt aggagatgct ttggctctag atgcaagaca 9240
tgaagcgttt gcttctggcc accaggggga gctgctggga cgcagacgga ctccaaggac 9300
tggagccaga agcctggtgt tgcatgcgtc aattttacgc agactatctt tctagggtta 9360
atagaataag agacaacgca cctagctatg ctgaaagcga gaatccggga aggtctgtac 9420
gggcttctgt tatggtgtca acactacgag aagaaaatcg atcggaattg tcgaatgaag 9480
ggaataatgt cgaggcacag acttcaacag caagaaaggt tctgaatttt ttcaaaagaa 9540
ggagcatgag ggtttga 9557

Claims (23)

1.一种用于测量哺乳动物细胞中的G蛋白偶联受体(GPCR)活性的系统，所述系统包含：
a)GPCR活性的第一效应物，其中与野生型状态下GPCR活性的所述第一效应物的表达相比，GPCR活性的所述第一效应物的表达上调；和
b)GPCR活性的第二效应物，其中与野生型状态下GPCR活性的所述第二效应物的表达相比，GPCR活性的所述第二效应物的表达下调。
2.根据权利要求1所述的系统，其中所述GPCR活性包含Giα亚基活性、Gsα亚基活性、Gqα亚基活性或G12/13α亚基活性。
3.根据权利要求2所述的系统，其中所述GPCR活性包含所述Giα亚基活性。
4.根据权利要求3所述的系统，其中所述Giα亚基活性包含Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαo、Gαt、Gαg或Gαz的活性。
5.根据权利要求4所述的系统，其中所述GPCR活性包含所述Gsα亚基活性。
6.根据权利要求4所述的系统，其中所述GPCR活性包含所述Gqα亚基活性。
7.根据权利要求4所述的系统，其中所述GPCR活性包含所述G12/13α亚基活性。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的系统，其中GPCR活性的所述第一效应物包含第一腺苷酸环化酶。
9.根据权利要求8所述的系统，其中所述第一腺苷酸环化酶选自ADCY1、ADCY2、ADCY3、ADCY4、ADCY5、ADCY6、ADCY7、ADCY8、ADCY9和ADCY10。
10.根据权利要求8或9所述的系统，其中所述第一腺苷酸环化酶是ADCY6。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的系统，其中所述第一腺苷酸环化酶由与启动子或增强子操作性偶联的核酸编码，与野生型状态相比，所述启动子或增强子过表达所述第一腺苷酸环化酶。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的系统，其中GPCR活性的所述第二效应物包含第二腺苷酸环化酶。
13.根据权利要求12所述的系统，其中所述第二腺苷酸环化酶选自ADCY1、ADCY2、ADCY3、ADCY4、ADCY5、ADCY6、ADCY7、ADCY8、ADCY9和ADCY10。
14.根据权利要求12或13所述的系统，其中所述第二腺苷酸环化酶是ADCY3。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的系统，其中所述第二腺苷酸环化酶被微RNA、shRNA、siRNA、CRISPR/Cas9复合物中的一个或多个靶向，与野生型状态相比，所述微RNA、shRNA、siRNA、CRISPR/Cas9复合物降低所述第二腺苷酸环化酶的表达。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的系统，其中所述系统包含报告核酸，其中所述报告核酸从报告基因产生与所述GPCR活性成比例的可检测信号。
17.根据权利要求16所述的系统，其中所述报告核酸包含与所述报告基因操作性偶联的cAMP应答元件(CRE)序列。
18.根据权利要求1或17中任一项所述的系统，其中所述报告基因包含唯一分子标识符(UMI)核酸序列。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的系统，其中所述报告基因包含以下中的一种或多种：唯一分子标识符的表达、荧光信号或发光信号。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的系统，其中所述哺乳动物细胞选自HEK 293细胞、CHO-K1细胞、COS-7细胞和U2OS细胞。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的系统，其中所述系统被整合到所述哺乳动物细胞的基因组中。
22.一种用于测量哺乳动物细胞中的GPCR活性的方法，所述方法包括使权利要求1至21中任一项所述的系统与GPCR配体接触，其中所述配体与所述GPCR复合并引发或抑制所述GPCR活性。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述GPCR配体选自多肽和小分子。
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