JPH11500616A - カルシニューリンで制御可能なアデニル酸シクラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 配列番号１に示すヌクレオチド配列を有する新規なアデニル酸シクラーゼ酵素が提供される。アデニル酸シクラーゼの活性は、プロテインホスファターゼであるカルシニューリン（calcineurin）により特有の方法で制御される。カルシニューリン結合部位は、この新規アデニル酸シクラーゼのアミノ酸５０３〜６１０に同定されている。新規アデニル酸シクラーゼの制御は特定の疾患の治療に有用である。適切な制御物質には、５０３〜６１０アミノ酸部位に結合する物質があり、カルシニューリン、そのアクチベーター、インヒビターおよび競合物質ならびにこの部位に特異的な抗体がある。具体的な疾患としては、パーキンソン病のような神経疾患、狭心症のような心血管疾患、および癌（特に卵巣腫瘍）がある。

Description

【発明の詳細な説明】 カルシニューリンで制御可能なアデニル酸シクラーゼ 本発明は、アデニル酸シクラーゼによる細胞代謝過程の調節に関する。 多細胞生物の細胞は、外来性の因子（通常、化学的要因である）によりその代 謝が影響を受ける。ホルモンは、そのような化学的因子の公知の例である。一般 に外来性の化学的因子は、標的細胞の膜上に位置する特異的受容体と相互作用す る。因子とその受容体の結合には、「第二メッセンジャー」メディエーターを介 する細胞代謝の変化を含む。 重要な「第二メッセンジャー」の１つは、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）で ある（Sutherland，Science 177:401-407(1972)）。サイクリックＡＭＰは、酵 素アデニル酸シクラーゼの作用によりＡＴＰから産生される。アデニル酸シクラ ーゼ活性は、関連するＧタンパク質を介して伝達される因子／受容体結合により 影響を受ける。 サイクリックＡＭＰの細胞内濃度の変化は、多くの細胞の反応に影響を与える 。例えば、サイクリックＡＭＰの細胞内濃度の増加は、プロテインキナーゼ（Ａ ＴＰから末端リン酸基を標的タンパク質の特異的部位に転移させる酵素）の活性 を刺激する。プロテインキナーゼの作用はその基質の活性または機能を変化させ る。 ｃＡＭＰと第二メッセンジャー系に関する総説については、「分子細胞生物学 （Molecular Cell Biology）」，Darnellら、1986、第16章、参考のため本明細 書に引用される）を参照されたい。 第二メッセンジャーのさらなる検討により、ｃＡＭＰ細胞内濃度の変化は、い くつかの異なる外的因子とその特異的な受容体との相互作用により引き起こされ ることが明らかになった。さらに、異なる受容体が，それ自身アデニル酸シクラ ーゼに関連するその特定のＧタンパク質仲介物と結合していることが見いだされ た。さらに最近の研究は、実際に異なるタイプ（イソ酵素）のアデニル酸シクラ ーゼがあり、それが制御の大きな多様性を示すことが証明された。 今日までにアデニル酸シクラーゼの８つの異なる特徴的なイソ酵素が同定され ており、文献に記載されている。イソ酵素タイプ１〜８については完全なＤＮＡ 配列が知られている。既知のアデニル酸シクラーゼイソ酵素の現在の理解と情報 の総説は、Pieroniら、Current Opinion in Neurobiology 3:345-351(1993);Ker win Jr医科学年次報告（Annual Reports in Medicinal Chemistry），第２９章 ，第６節、287-295頁(Venuti編)，(1994)およびPremont,Methods in Enzymology 238:116-127(1994)に記載されている。 アデニル酸シクラーゼの既知のイソ酵素の制御の要約は表１に記載されている 。 プロテインホスファターゼのカルシニューリンがアデニル酸シクラーゼイソ酵 素を制御することが初めて見いだされた。 カルシニューリンにより制御されるイソ酵素は、新規のまだ性状解析されてい ないアデニル酸シクラーゼイソ酵素であることが、さらに見いだされた。本発明 の新規イソ酵素は、元々アデニル酸シクラーゼ１０（ＡＣ１０）と呼ばれていた が、命 名法が改訂されて、この新規酵素は現在アデニル酸シクラーゼ９（ＡＣ９）と呼 ばれている。命名法が改訂される前に「アデニル酸シクラーゼ９」として知られ ていた異なるイソ酵素との混同を避けるために、本発明のこの新規のアデニル酸 シクラーゼは本明細書では単に［ＡＣ」と呼ぶ。 ＡＣをコードするヌクレオチド配列は単離され、クローン化され、そして配列 が決定されている（実施例２を参照）。ＡＣをコードするヌクレオチド配列は配 列番号１に示す。この配列はまた、ジーンバンク（Genbank）（登録商標）デー タベース中で、受託番号ＭＭＵ３０６０２およびＥＭＢＬデータベース中で受託 番号Ｚ５０１９０として入手できる。 従って本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列によりコードされるか、また は配列番号２に開示されているポリペプチド（またはこれらの配列の機能的同等 物）を提供する。 本明細書において「機能的同等物」という用語は、非修飾型の基本的機能を保 持するヌクレオチドまたはポリペプチドの任意の改変物を意味する。例として、 アミノ酸配列やヌクレオチド配列を一部変更しても、その分子によりコードされ るポリペプチドまたはそのポリペプチドの機能に影響を与えないことがあること が知られている。また欠失を有する分子が元の分子と同じ特定の機能を示すこと もある。改変が、特定の機能の有無や程度に影響を与えない時は、そのような改 変分子は、分子の機能がその目的には無用になるほど影響を受けないなら、「機 能的同等物」という用語に包含される。 理論に拘泥されるつもりはないが、カルシニューリンは、酵素の活性型に必要 なリン酸基の除去によりＡＣを制御すると考えられる。すなわち、ＡＣのアデニ ル酸シクラーゼ活性は、カルシニューリンの存在下で低下すると考えられる。 従ってさらなる面において本発明は、アデニル酸シクラーゼ活性の制御、特に ＡＣの制御におけるカルシニューリンの使用を提供する。 カルシニューリンの活性自身は、Ｃａ²⁺イオンの存在により増強され、カルモ ジュリンの追加的存在によりさらに増強される。 さらなる面において、本発明は、その活性がカルシニューリンにより制御され る アデニル酸シクラーゼイソ酵素を提供する。 カルシニューリンで制御可能なアデニル酸シクラーゼイソ酵素は、好ましくは 配列番号１のヌクレオチド配列、その機能的同等物もしくは部分によりコードさ れる。 さらなる面において本発明は、配列番号１に記載の配列またはその部分から誘 導される配列からなるポリヌクレオチドを提供する。 「から誘導される」という用語は、ＲＮＡもしくはＤＮＡおよび１本鎖もしく は２本鎖型の配列番号１の配列の同一および相補的コピーを包含する。「から誘 導される」という用語はさらに、発現されるポリペプチドのアミノ酸配列に（遺 伝暗号の縮重のために）影響を与えない変化を有する配列、ならびに機能（発現 されるポリペプチドの機能を含む）に実質的に悪影響を与えないヌクレオチドの 欠失、付加または置換により修飾される配列を包含する。 本発明のポリヌクレオチドは、前述の本発明のヌクレオチド配列からなるすべ ての組換え作製体を含む。そのような組換え作製体は、ＡＣの一部のみを発現す るように設計されてよい。この作製体は、天然のＡＣ遺伝子に隣接する制御配列 とは異なる発現制御配列を含んでよい。場合により、この作製体は非ＡＣタンパ ク質コード領域を含有してもよい。すなわち組換え作製体は、ＡＣまたはその機 能的同等物の少なくとも一部を含む、キメラタンパク質をコードする作製体を含 む。 特定の実施態様において本発明は、前記で定義した組換え作製体を含むベクタ ー（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）を提供する。ベクター は、細菌および酵母宿主細胞のための従来のクローニングおよび発現プラスミド 、および真核生物細胞株中での発現に有用なワクシニアのようなウイルスベクタ ーを含有する。そのようなベクターは、適当な宿主細胞を（クローニングまたは 発現のために）形質転換するのに使用でき、形質転換された宿主細胞はまた、本 発明のさらなる面を構成する。産生されるベクターが、その一部のみが配列番号 １から誘導されるヌクレオチド配列からなるなら、ベクターと適合性のある宿主 細胞タイプを選択することが適切である。例えば、大腸菌（E．coli）のような 原核宿主細胞、ならびに酵母、藻類、魚、昆虫または培養哺乳動物細胞のような 真核宿主細胞がある。バキュロウイルス発現系を使用する場合は、昆虫細胞が特 に有用である。適切な宿 主細胞は、当業者に公知である。 遺伝子操作法に関する一般的文献としては、例えばSambrook，Fritsch，Mania tis、「分子クローニング、実験室マニュアル（Molecular Cloning，a Laborato ry Manual）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)、コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor)、 ニューヨーク、1989；およびOldとPrimrose、「遺伝子操作の原理(Principles o f Genetic Manipulation)」、第５版、1994を参照されたい。 特に、ヒト胚腎細胞株２９３（ＨＥＫ２９３）から誘導される細胞株が作成さ れており、ＡＣを安定に発現する。簡単に説明すると、細胞を全長ＡＣ ＤＮＡ を含有するｐｃＤＮＡ３（クローンＪＰ１７３、実施例３を参照）でトランスフ ェクションし、Ｇ４１８抗生物質（０．８mg/ml）に対する耐性に基づき細胞を ４週間選択した。耐性細胞の各クローンを拡大し、ＣＲＦに応答したｃＡＭＰ産 生と免疫抑制剤の作用について調べた。少なくとも３つの細胞株がＣＲＦに応答 してｃＡＭＰ産生を示し、これはシクロスポリンＡとＦＫ５０６により増強され た。ＦＫ５０６の場合、この作用はＬ−６８５，８１８により阻止された。さら にホスホジエステラーゼのインヒビターの存在下でのｃＡＭＰの蓄積は、野生型 ＨＥＫ２９３細胞より約１０倍高い。この後者の知見は、トランスフェクション されたシクラーゼは構成的に活性であり、従って野生型酵素の突然変異体である 可能性を示している。 さらに別の面において、本発明はＡＣの制御物質を提供する。そのような制御 物質は、ＡＣ自身に直接作用してもよく、カルシニューリンおよび抗体（しかし これらに限定されない）を含んでもよく、あるいはＡＣの産生に影響を与えても よく、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド（これは、ＤＮＡの一部に結合し て転写を妨害し、および／またはｍＲＮＡに結合して翻訳を妨害することにより 、ＡＣ遺伝子の発現を妨害する）、および受容体に結合し従ってＡＣの活性に影 響を与える物質を含有し、例えばβ−アドレナリン作用性アゴニストおよびβ− アドレナリン作用性アンタゴニストがある。β−アドレナリン作用性アゴニスト としては、サルブタモール（salbutamol）、クレンブテロール（clenbuterol） 、フェノテロール（fenoterol）などがあり、適切なβ−アドレナリン作用性ア ンタゴニストとして はプロプラノロール（propranolol）がある。 ＡＣに特異的な抗体（モノクローナル抗体を含む）は、従来の免疫学的方法を 用いて産生されてよい。 さらに別の面において本発明は、ＡＣの活性または量を変更することからなる 、細胞代謝を制御する方法を提供する。例えば、ＡＣの活性または量は、前記し た制御物質により影響される。あるいは、例えばＡＣの量はゲノムの遺伝子操作 を介して、ＡＣ遺伝子の転写および／または翻訳に影響する物質を提供すること により制御される。 ＡＣの分布は、異なる組織または細胞型により変化し、ＡＣの細胞内濃度は、 特定の刺激に対するＡＣ遺伝子の発現制御の結果として変動する。 組織内のＡＣ分布の研究は、これが骨格筋と心臓に顕著に存在することを示唆 している（図１７）。これらの組織におけるその可能性のある機能は、収縮と代 謝的要求の間の調整である。細胞内カルシウムイオン濃度は、収縮を促進し、ｃ ＡＭＰはグリコーゲン分解を促進する。ｃＡＭＰ合成へのカルシウムイオンのフ ィードバックは、カルシウム蓄積の制限をなくし、収縮は代謝的に細胞により許 容されるものではないことを保証する。この意味で、シクラーゼのレベルが、ス ポーツマンや競馬のような動物のトレーニングで見られる筋肉の栄養状態により 制御されることはあり得る。すなわち、特異的プローブを用いるＡＣレベルの測 定は、収縮と栄養物質の代謝の最適な制御を予測する手段の１つとなるであろう 。 すなわち、例えばＡＣは、ある疾患状態または症状で異常レベルで存在するこ とがある。この意味で、神経系疾患（例えばパーキンソン病、てんかん）、精神 系疾患（例えば、不安症、主要抑うつ障害、躁病、精神分裂症、強迫性障害、ト ゥーレット症状群、および関連するチック病）、内分泌系疾患（例えば、クッシ ング症候群および病、ネルソン症候群、コーン症候群、グルココルチコイド耐性 、眼球突出を伴うかまたは伴わないグレーブス病（甲状腺中毒症）、甲状腺機能 亢進症および低下症；高プロラクチン血症およびその影響）；前立腺の肥大；心 血管系疾患（例えば、狭心症、心筋梗塞、高血圧（良性および悪性））、妊娠系 疾患（例えば、反復性自然流産、子癇前症および子癇）、呼吸系疾患（例えば、 喘息、気管支炎、慢 性気管支炎、肺気腫、肺性心）、骨系疾患（例えば、副甲状腺機能亢進症、骨軟 化症、ページェット病、骨粗鬆症）、骨治癒の促進、腎系疾患（例えば、急性お よび慢性糸球体腎炎、オルブライト症候群、またはマックーン-オルブライト症 候群）、腸管系疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、大腸過敏症、クローン病、ヒルシ ュスプラング（Hirschssprung）病）、癌（良性および悪性）、特に卵巣癌およ び前立腺癌、および妊娠の調節と促進がある。ＡＣは脳（特に、脳の皮質、線条 および海馬領域）、卵巣および胚に多く存在することが見いだされている。 最後に、このシクラーゼの活性を制御するように開発された物質は、心筋虚血 と骨格筋萎縮症状の代謝バランスの改善物質として有用である可能性がある。 従ってさらなる面における本発明は、ＡＣ活性を調節することによるそのよう な症状を治療する方法を提供する。そのような調節の例としては、カルシニュー リン結合部位として作用する配列番号２の５０３〜６１０位（特に５０３〜５７ ０位）のアミノ酸のコンフォメーションに似た化合物の設計であろう。 ＡＣのアミノ酸配列は、解析されており（さらなる詳細については実施例３と 配列番号２を参照）、イムノフィリン（immunophilin）タンパク質ＦＫＢＰ１２ に対応するドメイン（カルシニューリンを阻害する可能性がある）が、残基５９ ４〜６１１に見いだされている。この配列の類似性は、これがカルシニューリン 結合部位であることを強く示唆する。 実施例３に記載のＦＫＰＢ１２および１３タンパク質との配列類似の可能性に ついて、他のアデニリルシクラーゼも試験した。知見の要約を図１５に示す。簡 単に説明すると、既知のアデニリルシクラーゼ配列のすべては、Ｃ１αとＣ１β ドメイン（命名法については実施例３を参照）の結合部分に対応する領域でＦＫ ＢＰとの有意な類似性を示す。図１６に示すように、各シクラーゼとＦＫＢＰ１ ２との並び方は特徴的であり、Ｃ１α高相同性領域の異なる部分がＦＫＢＰ様配 列の一部である。これらの整列は、この領域のシクラーゼアミノ酸配列のモジュ ラーリピート（modular repeats）により可能である。この並び方の支配的モチ ーフは、シクラーゼ「ＦＫＢＰ様」配列中の相同的な位置のＦＫＢＰ１２の「８ ０余りの」ループの存在の必要性である（Yangら、(1993)Journal of the Ameri can Chemical Society 115 : 819-820）。カルシウム活性化アデニリルシクラーゼであるアクチペル（AC typel）は、カルシニューリンとの相互作用に必須のＦＫＢＰ１２の８０余りの ループのかなりの部分（配列：ＦＧＰＬＩ）を含有する（Yangら、1993、前述） ことに注意すべきである。 アクチペルに対する現在の知識と一緒にすると、Ｃ１α−Ｃ１β結合ドメイン は、アデニリルシクラーゼ活性の重要な制御部位のようである。すべてのアデニ リルシクラーゼは、この領域で強く結合したカルシニューリンにより制御される と提唱されている。この結合は結局、カルシウムイオンに依存するかも知れない 。ほとんどアデニリルシクラーゼではこの領域に、可能性のあるプロテインキナ ーゼＡ、ＣＡＭキナーゼIIおよびカゼインキナーゼIIリン酸化部位があり、これ がカルシニューリンの基質であり、カルシニューリンとシクラーゼとの結合活性 に影響を与えることが注目される。 マウスＡＣのＦＫＢＰ１２様ドメイン（残基５９４〜６１１）は、発現ベクタ ーｐＧＥＸ−２Ｔ（ファルマシア（Pharmacia））中でグルタチオン−Ｓ−トラ ンスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合蛋白として発現されている。この融合蛋白のシク ラーゼ部分は、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼによりリン酸化され、カルシ ニューリンによりカルシウム依存性に脱リン酸化される。これらのデータは、こ こで記載したシクラーゼの領域は、カルシニューリン結合部位であり、カルシニ ューリンの基質であるリン酸化アミノ酸を含有するという考えを支持する。 最近公表されたデータは、Ｌ型骨格筋カルシウムチャネル上の筋緊張性異栄養 症プロテインキナーゼのリン酸化部位（Timchenkoら、(1995)、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America92:5366- 5370）と、下記のＡＣのＦＫＢＰ様ドメイン（ここで、●はアミノ酸が同一であ ることを示し、｜は機能的に保存的な置換を示す）の間に顕著な類似性があるこ とを示している： ＩＤＤＳＲＥＳＳＧＰＲ ＡＣ_594-604 ｜ ｜●● ●●｜ ｜ ＬＲＱＳＲＬＳＳＳ−Ｋ カルシウムチャネルβ−サブユニット_176-185 さらに、カルシウムβ−サブユニットは、カルシニューリンにより選択的に脱 リン酸化されることが報告されている（Laiら(1993)Journal of Neurochemistry 61:1333-1339）。従ってＡＣ中のＳｅｒ₆₀₀またはＳｅｒ₆₀₁は、筋緊張性異栄 養症プロテインキナーゼによりリン酸化され、カルシニューリンにより脱リン酸 化される可能性がある。この過程の異常は、筋緊張性異栄養症で起きることがあ り、この遺伝的疾患の症状（特に、脳、筋肉、心臓および脳下垂体前葉機能に関 して）に寄与する。 さらなる面において本発明は、試料内のＡＣの有無および／または量を測定す るための診断測定法を提供し、該方法はＡＣに特異的な物質を試料と接触させ、 そして形成された複合体の有無および／または量を測定することからなる。この 物質は例えば、ＡＣのｍＲＮＡに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドであ ってよい。あるいはこの物質は、ＡＣに特異的な抗体、またはカルシニューリン であってもよい。 好適な実施態様において、診断物質は支持体（例えば、膜）上に固定化される 。 さらに、物質／ＡＣ複合体の測定が単純化されるように、測定法中に標識部分 が存在することが好ましい。 本発明を以下の実施例と添付の図面を参考にして説明する。 図１ ０．５mmol/lのイソブチルメチルキサンチンの存在下での、ＡｔＴ２０細胞中 の１０nmol/ｌのＣＲＦにより誘導されるｃＡＭＰ蓄積に及ぼす、ＦＫ５０６、 シクロスポリンＡ(ＣｓＡ)およびＭｅＶａｌ⁴−シクロスポリンＡ(ＭｅＶａｌ⁴ ＣｓＡ)（ＳＤＺ２０２−３８４）の影響。基準ｃＡＭＰ産生は０．６±０．０ ８pmol/ウェルであった。データは平均±標準誤差を、６．１pmol/ウェルである １０nmol/lのＣＲＦにより引き起こされる増加の割合をパーセントで表したもの である。 図２ Ａ:基準およびＣＲＦ誘導ｃＡＭＰ生成の経時変化に及ぼすシクロスポリンＡ の作用。データは２つの実験からのものである。平均±標準誤差、ＣＲＦ処理群 についてはｎ＝３（○＝１０nmol/l ＣＲＦ＋ビヒクル、●＝ＣＲＦ＋１μmol/ l シ クロスポリンＡ）であり、基準（△＝ビヒクル、▲＝シクロスポリンＡ）、０． ５mmol/l ＩＢＭ、０．１mMロリプラム（rolipram）であり、シクロスポリンＡ は３７℃で３０分間前処理として与えてから、３_nM ＣＲＦを２４℃で１０分間 を適用した。各対照群に比較して＊Ｐ＜０．０５（一元配置分散分析後直交対比 ）。 Ｂ：ＩＢＭＸの存在下での、ＣＲＦ誘導ｃＡＭＰ生成に及ぼす１μmol/l Ｆ Ｋ５０６の作用の依存。ＦＫ５０６とＩＢＭＸは図２Ａに示すものである。デー タは、平均±標準誤差、ｎ＝４〜６群（□＝ＦＫ５０６群、△＝対照群）。各ビ ヒクル処理群に比較して＊Ｐ＜０．０５（一元配置分散分析後直交対比）。 図３ Ａ：ＦＫ５０６によるＣＲＦ誘導ｃＡＭＰ生成の増強に及ぼすＬ６８５，８１ ８の作用。データは、平均±標準誤差であり、１００％としての１０nmol/l Ｃ ＲＦの存在下でのｃＡＭＰレベルは１２pmol/ウェル＊１０分間、基準レベルは １．６pmol/ウェル＊１０分間であった。 Ｂ：ＡｔＴ２０細胞中の１μmol/l ＦＫ５０６によるカルシニューリン活性 の阻害に及ぼすＬ６８５，８１８の作用。カルシニューリン活性は、ホスフォカ ゼイン法により測定し、ＦＫ５０６が無い場合の活性を１００％とした。 図４ ＡｔＴ２０細胞中のＣＲＦ誘導ｃＡＭＰ蓄積に及ぼす細胞内遊離カルシウム濃 度を低下させる種々の操作の作用。実験の間中ＩＢＭＸ ０．５mmol/lであった 。すべてのデータは、ｎ＝４／群で測定した、ＣＲＦ誘導ｃＡＭＰ生成のパーセ ント（平均±標準誤差）として表す。 ＥＧＴＡ：プレインキュベーションの間、カルシウムのない培地中で２mmol/l のＥＧＴＡに細胞を暴露した；ニモジピン（nimodipine）：プレインキュベーシ ョンの間、１μmol/lのニモジピンに細胞を暴露した； ＢＡＰＴＡ−ＡＭ：プレインキュベーションの間、２０μmol/lの［１，２− ビス−（ｏ−アミノフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（アセ トキシメチル）−エステル］に細胞を暴露した。 図５ ＡｔＴ２０細胞中の細胞外カルシウムイオンによるＣＲＦ誘導ｃＡＭＰ蓄積の 阻害に及ぼすＦＫ５０６の作用。２mmlol/lのＥＧＴＡのカルシウムの無い培地( ５μmol/lのＡ２３１８７と５μmol/lのニモジピンを含有する)中でプレインキ ュベートして、カルシウムを枯渇させ、段階的濃度のＣａＣｌ₂中を１０nmol/l のＣＲＦとともに加えた。横軸の値は、名目上の細胞外カルシウムイオン濃度を 示す。データは平均±標準誤差、ｎ＝６／群である。 図６ ＦＫ５０６とソマトスタチンによるＣＲＦ誘導ｃＡＭＰ生成の調節に及ぼす百 日咳ワクチン（１μg/mlを１８時間）の作用。ＡｔＴ２０細胞をＦＫ５０６また はソマトスタチンと３０分間プレインキュベートした。実験の間ＩＢＭＸ（０． ５mmol/l）が存在した。データは平均±標準誤差、ｎ＝６／群である。 図７ Ａ:ＡｔＴ２０細胞中の基準およびＣＲＦ誘導ＡＣＴＨ分泌に対するＦＫ５０ ６（０．５μmol/l）。 Ｂ：Ｌ６８５，８１８によるＣＲＦ誘導ＡＣＴＨ放出に及ぼすＦＫ５０６（０ ．５μmol/l）の作用の拮抗作用。これは、この系では５μmol/lでも基準ＡＣＴ Ｈ分泌への作用はなかった。ｎ＝４／群、平均±標準誤差。 パネルＡでは１００％として取った基準およびＣＲＦ刺激ＡＣＴＨ放出の値は 、それぞれ１５±１および２２±１fmol/ウェル＊３０分間であった。 図８ プライマーセットＢを使用してＡｔＴ２０細胞ＲＮＡから増幅した配列と、現 在のデータベース(ＥＭＢＬ、ジーンバンク(GenBank)、スイスプロット(SwissPr ot))に存在する他のアデニリルシクラーゼを有する対応する配列との比較。数字 は、ウサギＡＣｔｙｐｅ５（ｏｃｍｒａｄｃｙｖ）のアミノ酸配列に関する。配 列には注釈がついており、●は新規配列と少なくとも１つのすでに報告おされた ＡＣとのアミノ酸の同一性を示し、○は機能的に保存的な置換を示し、−は非保 存的置換を示す。略語 ｈｕｍ７−ヒトＡＣｔｙｐｅ７（ジーンバンク（GenBank）＃Ｄ２５５３８）； ｍｍｕ１２９１９−マウスＡＣｔｙｐｅ７； ｃｙａ２＿ラット−ラットＡＣｔｙｐｅ２； ｃｙａ４＿ラット−ラットＡＣｔｙｐｅ４； ｈｓａｄｅｎｃｙｒ８−ヒトＡＣｔｙｐｅ８； ｒａｔａｃｖｉｉｉ−ラットＡＣｔｙｐｅ８； ａ４６１８７−ヒトＡＣｔｙｐｅ５； ｃｙａ６＿ｍｏｕｓｅ−マウスＡＣｔｙｐｅ６； ａ４９２０１−マウスＡＣｔｙｐｅ５； ｃｙａ６＿ｒａｔ−ラットＡＣｔｙｐｅ６； ｃｙａ６＿ｃａｎｆａ−イヌＡＣｔｙｐｅ６； ｓ２９７１７−ラットＡＣｔｙｐｅ５； ｏｃｍｒａｄｃｙｖ−ウサギＡＣｔｙｐｅ５； ｃｙａ５＿ｃａｎｆａ−イヌＡＣｔｙｐｅ５； ｃｙａｌ＿ｂｏｖｉｎ−ウシＡＣｔｙｐｅ１； ｃｙａ３＿ｒａｔ−ラットＡＣｔｙｐｅ３； ＡＣ−新しい配列から誘導されるＡｔＴ２０、すなわちＡＣ 図９ ＥＭＢＬおよびジーンバンク（GenBank）データベースに見いだされるアデニ リルシクラーゼ配列のパイルアップ解析（pileup analysis）。略語： 系統樹の凡例 アデニリルシクラーゼイソフォーム ｈｕｍ７ ヒトタイプ７ジーンバンク＃Ｄ２５５３８； ｍｍｕ１２９１９ マウスタイプ７； ｃｙａ２＿ｒａｔ ラットタイプ２； ｃｙａ４＿ｒａｔ ラットタイプ４； ｃｙａ５＿ｃａｎｆａ イヌタイプ５； ｃｙａ５＿ｒａｂｉｔ ウサギタイプ５； ｓ２９７１７ ラットタイプ５； ｃｙａ６＿ｍｏｕｓｅ マウスタイプ６； ｃｙａ１＿ｂｏｖｉｎ ウシタイプ１； ｒａｔａｃｖｉｉｉ ラットタイプ８； ｃｙａ３＿ｒａｔ ラットタイプ３； Ａｃ マウスＡＣ９、すなわちＡＣ。 図１０ Kyteら（1982）J Mol Biol 157：105に従う、ＡＣの疎水性プロット。数字は 予測される膜内ドメインを示す。 図１１ トランスフェクションされた宿主細胞中のクローン化ＡＣの機能解析 ホスフォジエステラーゼインヒビター（１mmol/lのイソブチルメチルキサンチ ン）と０．１mmol/lのロリプラム）の存在下で一過性にトランスフェクションさ れたＨＥＫ２９３（ａ−ｃ）とＣＯＳ７（ｄ）中のｃＡＭＰのレベル。示したデ ータは平均±標準誤差、ｎ＝４／群である。２つの類似のシリーズの実験からの 代表的データ。 （ａ）ベクターｃＤＮＡでトランスフェクションし、０．２％（v/v）エタノー ル（空カラム）または２μmol/l ＦＫ５０６（縞模様のカラム）で前処理した ＨＥＫ２９３細胞を０．５nmol/lのＣＲＦで抗原刺激した。 （ｂ）ＡＣで細胞をトランスフェクションした以外は（ａ）と同様（データは平 均±標準誤差、ｎ＝４／群。＊各ビヒクル処理群と比較した時Ｐ＜０．０５、１ 元配置分散分析、次にNewman-Keuls 検定）。 （ｃ）ＣＲＦ誘導ｃＡＭＰ産生に及ぼすＦＫ５０６の作用を、さらに（ｃ）で調 べた。ＦＫ５０６によるＣＲＦ誘導ｃＡＭＰ応答の増強を、ＦＫ５０６アンタゴ ニストであるＬ−６８５，８１８（１００μmol/l）により阻止した(Dumontら、 (1992)J．Exp．Med．176：751-760)。これは単独で投与した時、ＣＲＦ誘導ｃＡ ＭＰ生成に対して何の作用もなかった。しかしＦＫ５０６と同様に、ｃＡＭＰの 非刺激レベルを、基準か３倍に上昇させた（データは示していない）。＊ビヒク ル処理群と 比較した時Ｐ＜０．０５、１元配置分散分析、次にNewman-Keuls 検定。 （ｄ）もう１つのカルシニューリン阻止性免疫抑制剤であるシクロスポリンＡの 適用は、ＡＣでトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞中で１nmol/lのＣＲＦに 対するｃＡＭＰ応答を増強した（＊ビヒクル処理群と比較した時Ｐ＜０．０５） 。 図１２ ＡＣ中のＦＫＢＰ様ドメイン （Ａ）ＡＣの予測される構造の模式図、命名法はGilmanと共同研究者たちに示唆 されたものである（Taussigら、(1995)J．Biol．Chem．270：1-4）。Ｎ＝Ｎ−末 端細胞内ループ；Ｍ１とＭ２＝膜貫通セグメント；Ｃ１αとＣ２α（太い線）＝ 高度に保存された推定の触媒性シクラーゼドメイン；Ｃ１βとＣ２β＝細胞内ル ープの非保存推定の制御ドメイン。 （Ｂ）ＡＣ_(503-610)は、ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）と約 ４０％の全体的配列類似性を示す。上の行の残基番号はＡＣに対応し、下の行は 哺乳動物ＦＫＢＰ１２ｓに対応する。点は、ＡＣと少なくとも１つのＦＫＢＰの 間の配列同一性を示す。縦の線は、１）Ｃ、２）ＳＴＰＡＧ、３）ＮＤＥＱ、４ ）ＨＲＫ、５）ＭＩＬＶ、６）ＦＹＷとして規定した保護置換を示す(Krupinski ら(1989)Science 244：1558-1564を参照)。 ｙｓｔ＝サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）、ｈｕｍ ＝ヒト、ｍｕｓ＝マウス、ｎｃｒ＝ノイロスポラ・クラッサ（Neurospora crass a）。 （Ｃ）既知の哺乳動物アデニリルシクラーゼイソタイプのＣ１αとＣ１β結合領 域の整列。ｂｏｖＡＣｔｐ１中の下線を引いた領域は、２８アミノ酸残基の推定 カルモジュリン結合部位（４９５〜５２２）の２４残基に対応する(Vorherrら、 (1993)Biochemistry（USA）32：6081-6088;およびWuら、（1993）J．Biol．Chem ．286:23766-23768)、ｂｏｖ＝ウシ。略語は図１５に示したものと同じである。 図１３ ＡｔＴ２０細胞、ＨＥＫ２９３細胞およびマウス線条体ＲＮＡのノーザン解析 ＡＣ配列から誘導される³²Ｐ標識ｃＤＮＡプローブを用いた。両プローブとハ イブリダイズするＡｔＴ２０細胞中の約９kbのバンドに注目されたい。同様のサ イ ズのＲＮＡ種も、マウス線条体ＲＮＡ中で強くハイブリダイズし、ＨＥＫ２９３ 細胞中でかろうじて認められるバンドがある。プローブｊｐ１６４との相対的ハ イブリダイゼーション強度（２つのレーンの平均）は、ＡｔＴ２０ ２．１；Ｈ ＥＫ２９３ ０．３；マウス線条体 １．４であった。 図１４ マウス脳でのＡＣ ｍＲＮＡの局在化 （Ａ）海馬（ＣＡ１−ＣＡ４（ａ）、鉤状回（ｂ）の錐体細胞層、歯状回（ｃ ）、および大脳皮質の種々の部分（後部帯状回皮質を（ｄ）で示す）の顆粒細胞 、 （Ｂ）³⁵Ｓ−ＣＴＰ−センスＲＮＡプローブ対照 中のプラスミドＪＰ１４２から誘導される³⁵Ｓ−ＣＴＰ標識アンチセンスリボ核 酸プローブにより検出されるＡＣ ｍＲＮＡ。 倍率：２５×。 図１５ アデニリルシクラーゼとＦＫＢＰとの整列 ●は同一であることを示す；｜はＦＫＢＰの少なくとも１つの保存された置換を 示す。保存された置換は １） Ｃ ２） ＳＴＰＡＧ ３） ＮＤＥＱ ４） ＨＲＫ ５） ＭＩＬＶ ６） ＦＹＷ として定義される。略語 ＹｅａｓｔＦＫＢＰ１２ 酵母ＦＫＰＢ１２ ｈｕｍＦＫＢＰ１２ ヒトＦＫＢＰ１２ ｍｕｓＦＫＢＰ１２ マウスＦＫＢＰ１２ ＮｃｒＦＫＢＰ１２ ノイロスポラ・クラッサＦＫＢＰ１２ ｈｕｍＦＫＢＰ１３ ヒトＦＫＢＰ１３ ｆｋｂ２＿ｈｕｍ ヒトＦＫＢＰ１３前駆体 ｆｋｂ２＿ｙｅａｓｔ 酵母ＦＫＢＰ１３ ｂｏｖＡＣｔｐ１ ウシアデニリルシクラーゼタイプ１ ｒａｔＡＣｔｐ３ ラットアデニリルシクラーゼタイプ３ ｒａｔＡＣｔｐ８ ラットアデニリルシクラーゼタイプ８ ｒｕｔａｂａｇａ ドロソフィラ（drosophila）カルモジュリン活性化 アデニリルシクラーゼ ｒａｔＡＣｔｐ５ ラットアデニリルシクラーゼタイプ５ ＡＣｔｐ５ｓｐ１ イヌアデニリルシクラーゼタイプ５スプライス変種 ｒａｔＡＣｔｐ６ ラットアデニリルシクラーゼタイプ６ ｍｕｓＡＣ マウスアデニリルシクラーゼタイプ９（ＡＣ） ｒａｔＡＣｔｐ２ ラットアデニリルシクラーゼタイプ２ ｒａｔＡＣｔｐ４ ラットアデニリルシクラーゼタイプ４ ｍｕｓＡＣｔｐ７ マウスアデニリルシクラーゼタイプ７ ｈｕｍＡＣｔｐ７ ヒトアデニリルシクラーゼタイプ７ 図１６ ＦＫＢＰとの整列から抽出されたシクラーゼを示す。略語 １．ウシアデニリルシクラーゼタイプ１ ２．ラットアデニリルシクラーゼタノプ３ ３．ラットアデニリルシクラーゼタイプ８ ４．ドロソフィラ（drosophila）カルモジュリン活性化アデニリルシクラーゼ ５．ラットアデニリルシクラーゼタイプ５ ６．イヌアデニリルシクラーゼタイプ５スプライス変種 ７．ラットアデニリルシクラーゼタイプ６ ８．マウスアデニリルシクラーゼタイプ９、すなわちＡＣ ９．ラットアデニリルシクラーゼタイプ２ １０．ラットアデニリルシクラーゼタイプ４ １１．ラットアデニリルシクラーゼタイプ７ 図１７ ＲＮａｓｅ保護測定法で測定したマウスのＡＣ ｍＲＮＡの分布を示す、異な る組織中の相対的ハイブリダイゼーション強度を示す。実施例１：アゴニストに誘発されるｃＡＭＰ生成のカルシニューリンによるフィ ードバック阻害 緒言 主要な免疫抑制剤であるシクロスポリンＡとＦＫ５０６は、白血球中のＣａ²⁺ ／カルモジュリン制御プロテインホスファターゼカルシニューリン（プロテイン ホスファターゼ２Ｂ）の強力な遮断物質である（Liuら、(1991)Cell 66:807-815 ）。この観察結果から、カルシニューリンは、Ｔ細胞受容体により活性化される シグナル伝達経路の必須成分であることが発見された（Schreiber（1992）Cell 70 :365-368およびSigalら、(1992)Ann．Rev．Immunol．10:519-560）。リンパ球 中のカルシニューリン活性に及ぼす免疫抑制剤の作用を仲介するタンパク質であ るイムノフィリン（Schreiber(1992)Cell 70:365-368）は、脳において同定（St einerら（1992）Nature 358: 584-586）されており、ＦＫ５０６とシクロスポリ ンＡの重要な神経副作用の分子標的であると考えられている(Frankら、（1993） Tansplantation Proceeding 25:1887-1888およびReyesら、(1990)Transplantati on50：10434-1081)。 カルシニューリンは脳中に豊富に存在するが（総タンパク質の０．５〜１％） （Kleeら、(1988)Advances in Enzymology 61: 149-200）、興奮性細胞における その機能は未だに不明である。カルシニューリンは、電位差制御イオンチャネル 活性の調節（Armstrong，（1989）Trends in Neurosciences 12: 117-122）、特 にＬ−タイプカルシウムチャネルにおいて関係があると考えられている(Laiら、 (1993)J．Neurochem．61: 1333-1339)。さらに最近の研究は、神経末端のシナプ ス小胞のリサイクリングに参加すると考えられているシナプス小胞タンパク質で あるダイナミン(dynamin)は、カルシニューリンの主要な基質であることを証明 した(Liu ら、(1994)Science 265: 970-973）。さらに、免疫抑制剤によるカルシニューリ ンの阻止は、ラット脳から調製されるシナプトソームによるグルタミン酸放出を 増強し、これはダイナミン（dynamin）のリン酸化の状態に相関するようである （Nicholsら、(1994)J．Biol．Chem．269:2 3817-23823）。 他の系における分泌機能に関して、免疫抑制剤は、下垂体コルチコトロフ腫瘍 (ＡｔＴ２０)細胞のカルシニューリン活性を阻止し、そのカルシニューリン阻止 活性に相関してＣａ²⁺依存性ホルモン放出を刺激することが報告されている（An toniら、(1993)Biochem．Biophys．Res．Commun．194: 226-233）。サイクリッ クＡＭＰ（ｃＡＭＰ）は、細胞内遊離Ｃａ²⁺（［Ｃａ²⁺］_i）の増加を引き起こ し、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）の放出を刺激する（Antoniら、(1986)En docr.Rev.7:351-378）。［Ｃａ²⁺］_iは種々の系でｃＡＭＰ生成を阻害すること が知られている（Cooperら、(1993)Trends Pharm．Sci．14: 34-36）、我々は、 ＡｔＴ２０細胞において、視床下部神経ペプチドであるコルチコトロピン放出因 子（ＣＲＦ）とベータ−アドレナリン作用性刺激により誘導されるｃＡＭＰ産生 に及ぼすＦＫ５０６とシクロスポリンＡの作用を調べた。 実験方法 ＡｔＴ２０ Ｄ１６：１６マウス下垂体前葉腫瘍細胞を、既に記載されている ように培養して維持した（Woodsら、(1992)Endocrinology 131: 2873-2880）。 ＡＣＴＨ放出、ｃＡＭＰ産生またはカルシニューリン活性の測定のために、細胞 を２４ウェルの培養プレート（５×１０⁴細胞／ウェル）に蒔き、４〜６日後に 使用した。ＡＣＴＨ(Woodsら、(1992)Endocrinology 131:2873-2880)とｃＡＭＰ （Dufauら、(1973)Endocrinology 92: 6-11）を特異的ＲＩＡにより測定した。 カルシニューリンプロテインホスファターゼ活性は、³²Ｐ標識カゼイン測定法に より測定した（Tallantら、(1984)Arch.Biochem．Biophys．232: 269-279）か、 または既に記載されているように（Antoniら、(1993)Biochem.Biophys.Res.Comm un.194: 226-233）、ＡｔＴ２０細胞抽出物中で、カルシニューリンホスファタ ーゼ活性を測定するように適合させた³²Ｐ標識ＲＩＩペプチド基質(Blumenthal ら、(1986)J．Biol．Chem．261：8140-8145)を使用して測定した。 ｃＡＭＰのための実験はすべて、２mM ＣａＣｌ₂と、２５mMヘペス（ｐＨ７ ．４）で緩衝化した１mM ＭｇＳＯ₄を含有し、０．２５％（w/v）のウシ血清ア ルブミンを補足したハンクス平衡塩類溶液中で行った。細胞を無血清培地中で１ 時間プレインキュベートし、次にホスフォジエステラーゼの遮断物質（イソブチ ルメチルキサンチン０．５mM（ＩＢＭＸ）および／またはロリプラム０．１mM） を種々の他の処理物とともに３７℃で３０分間適用した。次に細胞を水浴で２２ ℃で５分間冷却し、アゴニストを１０分間加えた。０．２mol/lのＨＣｌを加え て反応を停止させ、最終濃度０．１mol/lを達成した（Brookrら，(1979)Adv.inC yclic Nucl.Res.Vol.10,G.Brooker,P.GreengardとG.A.Robinson、ラーベンプレ ス(RavenPress)、ニューヨーク、2-34）。ホスフォジエステラーゼ遮断物質の非 存在下では、アゴニスト誘導性の総ｃＡＭＰ含量の変化（細胞＋培地）は小さく （基準の２〜３倍）、細胞内ｃＡＭＰの増加は認められなかった（Woodsら、(19 92)Endocrinology 131: 2873-2880）。ＩＢＭＸの存在下では、ｃＡＭＰ含量は 、時間とともにＣＲＦの添加後１０分目までは直線的に増加し、２０分目までは 一定であった。これに対して、２〜５分の間に細胞内ｃＡＭＰ含量はピークに達 し、次にホスフォジエステラーゼ遮断物質の存在下ででも規定レベルまで低下し た。従って、免疫抑制剤はピーク細胞性および総ｃＡＭＰ含量に対して同じ作用 を有したため、これらの条件下で、ここに示したすべての実験は総ｃＡＭＰ含量 を報告している。 ある実験で細胞を、２mmol/l ＥＧＴＡを含有しＣａ²⁺は含まず、５μmol/l Ａ２３１８７と２．５μmol/lニフェジピンを補足した培地中で３０分プレイン キュベートして、急速に動員したＣａ²⁺の細胞貯蔵を枯渇させた。この処理はま た、ＡｔＴ２０細胞への電位差制御Ｃａ²⁺流入の主要経路であるＬ型Ｃａ²⁺チャ ネル（Luiniら、(1985)Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．82:8034-8038；Reisine ら、(1987)Mol.Pharmacol．32: 488-496およびAntoniら、(1992)J.Endocrinol 133 : R13-R16）が完全に遮断され、次に細胞外液に加えられたＣａ²⁺は、イオノ フォアＡ２３１８７によりできた孔を通過して入ることが確保された。この前処 理の理論は、カルシニューリンはＬチャネル活性に影響を与えると報告されてい る（Laiら、(1993)J.Neurochem.61: 1333-1339;およびArmstrongら、(1987)Proc .Natl.Acad. Sci．U.S.A．84: 2518-2522）が、使用される処理方法は、Ｃａ²⁺流入をこの制 御に無関係なものとする。 プレインキュベーションの間、免疫抑制剤類似体（ＦＫ５０６、藤沢薬品（日 本国大阪）からの供与；シクロスポリンＡとＳＤＺ２２０−３８４（ＭｅＶａｌ⁴ −シクロスポリンＡ）（Fliri，H．（1993）抗生物質と抗ウイルス化合物、化 学合成と修飾（Antibiotics and antiviral compounds，Chemical synthesis an d modification）、K.Krohn,H.Kirst And H.Maasg,VCN Verlagsgesellschaft mb H,ベインハイム（Weinheim）、229-240）、サンド薬品（スイス、バーゼル）か らの供与、Ｌ６８５，８１８（Dumontら、(1992)J.Exp.Med.176: 751-760）Merc k&Co（ラーウェイ（Rahway）、ニュージャージー州の供与）を適用した。これら の化合物はエタノール中で１０^-3mol/lで作成し、目的の最終濃度までインキュ ベート培地で希釈した。ある場合には、細胞をＬ６８５，８１８とＦＫ５０６の 構造的類似体（これは、ＦＫＢＰ−１２に結合し、ピリル−イソメラーゼ活性を 阻害するが、免疫抑制活性は欠如している（Dumontら、(1992)J．Exp．Med．176 : 751-760）で１０分間プレインキュベートしてから、３７℃で３０分間ＦＫ５ ０６を添加した。 ＡＣＴＨ分泌のインキュベーションは、ＣＲＦとの試験インキュベーションが ２２℃であった以外は、既に記載されているように（Woodsら、(1992)Endocrino logy131: 2873-2880）行った。Ａ１細胞中でのアデニリルシクラーゼｃＤＮＡの増幅とＤＮＡ配列解析 トリゾール（Trizol）試薬（ギブコ（GIBCO）、ペーズリー（Paisley）、英国 ）を用いて製造業者の説明書に従って、約１０⁷細胞から総ＲＮＡを調製した。 ＲＴ−ＰＣＲは、ＲＮＡ ＰＣＲキット（パーキン・エルマー（Perkin Elmer） 、ワリングトン（Warrington）、チェシア（Cheshire）、英国）を用いて行った 。簡単に説明すると、０．８μgの総ＲＮＡを９５℃で５分間変性させ、次に第 １の鎖のｃＤＮＡ合成のための２．５μＭランダムヘキサヌクレオチドプライマ ーとアニーリングさせて、第１の鎖の合成は、２０μlの反応混合物(１０mMトリ ス−塩酸（ｐＨ８．３）、５０mM ＫＣｌ、５mM ＭｇＣｌ₂、１mMの各ｄＮＴ Ｐ、２０ＵのＲＮａｓｅインヒビターおよび５０ＵのＭＭＬＶ逆転写酵素を含有 する)中で４２℃ で１５分間行った。９９℃で５分間反応を停止させ、次に４℃に冷却し、氷上で 保存した。あらかじめクローン化した哺乳動物アデニリルシクラーゼの第１（対 Ａ： 5'CTCATCGATGGIGAYTGYTAYTAYTG3'； 3'GGCTCGAGCCAIACRTCRTAYTGCCA5' 予測生成物サイズ：２２０塩基対）と第２( 対Ｂ： 5'GAAGCTTAARATIAARACIATIGGI^T/_A ^C/_GIACITAYATGGC3'； 3'GGGATCCACRTTIACIGTRTTICCCCAIATRTCRTA5' 予測される生成物サイズ １８０ 塩基対)の細胞質ドメイン内の高度に保存された対Ａと対Ｂの縮重オリゴヌクレ オチドを用いてＰＣＲを行った(Yoshimuraら、(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A .89: 6716-6720; Krupinskiら、(1992)J．Biol．Chem．267: 24859-24862；およ びGaoら、(1991)Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．88: 10178-10182)。ＰＣＲの ための逆転写反応物（２０μl）を1００μlに拡大し、１０mMトリス−塩酸（ｐ Ｈ８．３）、５０mM ＫＣｌ、２mM ＭｇＣｌ₂、２００μMの各ｄＮＴＰ、３５ pmolの各プライマーおよび２．５Ｕのアンプリタク（Amplitaq）ＤＮＡポリメラ ーゼに含有された。ＰＣＲ反応物に鉱物油（シグマ（Sigma）、プール（Poole） 、ドルセット（Dorset）、英国）を重層し、９５℃で３分間変性させ、次に５サ イクル（９４℃で変性を６０秒、４５℃でアニーリング／伸長を６０秒）、次に さらに３５サイクル（９４℃で変性を６０秒、５５℃でアニーリング／伸長を６ ０秒）そして最後に５５℃でアニーリング／伸長を７分間行った。各反応物のア リコート（５％）をアガロースゲル電気泳動（３％ＦＭＣ、フコウゲン・インス トルメンツ社（Flowgen Instruments Ltd）、シッチングブーネ（Sittingbourne ）、ケント（Kent）、英国）により解析した。各プライマー対について予測され るサイズ範囲内の生成物をゲルから切り出し、ウィザード（Wizard）（登録商標 ）ＰＣＲ Ｐｒｅｐキット（プロメガ（Promega）、マジソン、ウィスコンシン 州、米国）を用いて精製した。予測されるサイズの挿入体を含有するクローンを 同定し、そのＤＮＡ配列をジデオキシヌクレオチド法（シーケナーゼ（Sequenas e）２．０キット、ＵＳＢ、アマシャムインターナショナル（Amersham Internat ional）、アイレスベリー（Aylesbury）、英国）により測定した。ｍＲＮＡ発現の検出 標準的方法を用いてノーザン解析を行った。簡単に説明すると、１０μgの総 ＲＮＡをホルムアルデヒドゲル電気泳動で分離し、陽性荷電のナイロン膜（アプ リゲン（Appligene）にブロットして移し、次に８０℃で焼いて固定し、５０％ の脱イオン化ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、０．５×デンハルト、０．１％w/v ＳＤＳ、０．２mg/mlの変性サケ精子担体ＤＮＡおよび１０％のデキストラン 硫酸中で、４２℃で２時間プレハイブリダイズした。次にランダムプライムした 標識ＤＮＡプローブ（５０ng；＞１０⁹cpm/μg）を添加し、４２℃で一晩ハイブ リダイゼーションを続けた。２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で膜を２０分間２回 洗浄し、次に１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で４２℃で２０分間、最後に０．５ ×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で５０℃で２０分間洗浄した後、ラップで包み、次 に−７０℃でオートラジオグラフィーフィルムに暴露させた。リボヌクレアーゼ 保護測定法は、ＲＰＡ IIキット（アムビオン（Ambion）、エーエムエスバイオ テクノロジー（AMS Biotechnology）、ウィトネイ（Witney）、オキソン（Oxon ）、英国）を用いて製造業者の説明書に従って行った。簡単に説明すると、１０ μgの総ＲＮＡを、１０⁵cpmの放射能標識アンチセンスリボプローブに４５℃で ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、反応物を１本鎖特異的ＲＮ ａｓｅで消化し、保護された断片を６％変性ポリアクリルアミドゲル上で分離し 、これを１５％メタノール／５％酢酸中で３０分間固定し、乾燥しそして−７０ ℃でオートラジオグラフィーフィルムに暴露させた。 結果免疫抑制剤によるＣＲＦ刺激ｃＡＭＰ産生の増強 カルシニューリン活性の免疫抑制遮断物質であるＦＫ５０６、シクロスポリン ＡおよびＭｅＶａｌ⁴−シクロスポリンＡは、ＣＲＦ誘導ｃＡＭＰ産生を濃度依 存性に増強させた（図１）。ＣＲＦ添加の２、５および１０分後では、シクロス ポリンＡの作用（図２）は、統計的に有意であり（Ｐ＜０．０５またはそれ未満 ）、ＦＫ５０６でも同様の結果が得られた。ＦＫ５０６によるｃＡＭＰ生成の増 強は、ＣＲＦの低濃度（０．１〜１０nmol/l）で明らかであり、最大応答は変化 がなかった(図 ２Ｂ)。 ＣＲＦ誘導ｃＡＭＰ産生に及ぼすＦＫ５０６の作用（図３）は、ＦＫ５０６類 似体であるＬ６８５，８１８（これは、ＦＫＢＰ１２プロリルイソメラーゼ活性 の強力なインヒビターであり、免疫抑制活性は無く、従ってカルシニューリンを 遮断せず（Dumontら、(1992)J．Exp．Med．176: 751-760）、従って、ＦＫ５０ ６のカルシニューリン阻害作用の特異的アンタゴニストである。重要なことは、 この化合物は、ＡｔＴ２０細胞中のホスフォカゼイン（図３）のカルシニューリ ン介在脱リン酸化に及ぼすＦＫ５０６の阻害作用も遮断することである。ｃＡＭＰの受容体誘導性合成は細胞同Ｃａ²⁺とカルシニューリンの阻害調節を受 けている 種々の方法（例えば、ＥＧＴＡやカルシウムイオノフォアＡ２３１８７による 欠失）による細胞内遊離Ｃａ²⁺の低下、細胞内カルシウムキレート物質ＢＡＰＴ Ａ−ＡＭの細胞への添加、およびジヒドロピリジンチャネル遮断物質ニモジピン を用いるカルシウムチャネルの遮断は、すべてＣＲＦに対するｃＡＭＰ応答を著 しく低下させた（図４）。ＣＲＦ誘導ｃＡＭＰ生成に及ぼすＢＡＰＴＡ−ＡＭの 作用は、ＣＲＦの添加２分後までにおよび２０分までの以後のすべての時点で統 計的に有意（Ｐ＜０．０５）であった（データは示していない）。 ＣＲＦとともに段階的な量のＣａ²⁺を、Ｃａ²⁺を欠失させイオノフォアＡ２３ １８７で前処理した細胞に加えると、２mmol/l Ｃａ²⁺を含有する培地中でイン キュベートした非欠失細胞中で見られるレベルまで、ＣＲＦ阻害ｃＡＭＰ産生の 濃度依存性阻害が起きた。外来性Ｃａ²⁺の作用は、ＦＫ５０６により阻害され、 これは実際Ｃａ²⁺の非存在下でのｃＡＭＰ蓄積を変化させなかった（図５）。免疫抑制作用の部位と特異性 ｃＡＭＰ生成のソマトスタチン介在阻害の減弱化により評価した阻害性Ｇタン パク質機能を強く抑制した百日咳毒素（１μg/ml）（図６）で、細胞を１６時間 前処理した後は、ＣＲＦ誘導ｃＡＭＰ生成に及ぼすＦＫ５０６の作用は明らかで あった。百日咳毒素処理はまた、Ｃａ²⁺欠失細胞中の細胞外Ｃａ²⁺によりＣＲＦ 誘導ｃＡＭＰ生成の抑制にも何の作用もなかった（データは示していない）。 Ｇｓとは独立にアデニリルシクラーゼを活性化する薬剤である１０または３０ μM フォルスコリンにより誘発されるｃＡＭＰ蓄積に、ＦＫ５０６は影響を与 えなかった。細胞にＢＡＰＴＡ−ＡＭを添加すると、小さい（１５％）が、フォ ルスコリン誘発性ｃＡＭＰ蓄積の統計的に有意（Ｐ＜０．０５）な増強を引き起 こした（データは示していない）。 最後に、ＦＫ５０６とシクロスポリンＡの作用に対して、カリクリ（calyculi ）Ａ（１〜３０nmol/l）やオカダ酸（０．２〜５μmol/l）のようなプロテイン ホスファターゼの他の遮断物質で前処理すると、ＣＲＦ誘導ｃＡＭＰ蓄積の濃度 依存性の阻害（８０％まで）が起きた（データは示していない、およびKochら、 (1994)Cellular Signalling 6: 467-473）。ＦＫ５０６によるＣＲＦ刺激ＡＣＴＨ放出の増強 ＦＫ５０６によるカルシニューリン活性の阻止は、ＣＲＦにより誘発されるＡ ＣＴＨの放出を増強し（図７Ａ）、この作用はＬ６８５，８１８により防止され た（図７Ｂ）。ＡＣＴＨ放出を刺激しＣＲＦにより誘導されるｃＡＭＰ蓄積を増 強するＡｔＴ２０細胞中のカルシニューリン活性を阻害（Antoni、(1986)Endocr ．Rev．7:351-378）するＦＫ５０６の見かけのＥＣ₅₀は、すべての約１０nMであ る。β−アドレナリン作用性刺激はカルシニューリンにより同様に制御される イソプロパノールは、ＡｔＴ２０細胞中でβ₂−アドレナリン作用性受容体を 介してｃＡＭＰ蓄積を誘導する（Heislerら、(1983)Biochemical And Biophysic al Research Communications 111: 112-119）。イソプロパノールに誘導される ｃＡＭＰ生成はまた、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ、ＦＫ５０６およびＡｔＴ２０細胞中の Ｃａ²⁺枯渇により増強される（表１）。ＡｔＴ２０細胞中のｃＡＭＰ蓄積に及ぼす免疫抑制剤の作用は新規アデニリルシ クラーゼｍＲＮＡの発現に相関する ＡｔＴ２０細胞中に存在するアデニリルシクラーゼイソフォームのプロフィー ルを測定するために、２セットのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、Ａｔ Ｔ２０細胞総ＲＮＡをアデニリルシクラーゼ関連配列についてＲＴ−ＰＣＲによ り解析した。プライマーセットＢを用いて約１８０塩基対のＰＣＲ産物が得られ た。 ＤＮＡ配列解析により、増幅されたサブクローン化１８０塩基対ｃＤＮＡ断片の 約８％は、タイプ６アデニリルシクラーゼと同一であった。しかし大部分(＞９ ０％)は、現在のデータベース内に存在する既知の哺乳動物アデニリルシクラー ゼのアミノ酸配列と高レベルの相同性を示したが、すでに報告されているどの配 列とも同一ではなかった（図８）。タイプ１アデニリルシクラーゼはプライマー セットＡを用いてＡｔＴ２０細胞中で検出された。 新規アデニリルシクラーゼ１８０塩基対ｃＤＮＡ断片をプローブとして用いる 総ＲＮＡのノーザンブロット解析は、ＡｔＴ２０細胞中で発現される約９kbのｍ ＲＮＡとのハイブリダイゼーションを示した。このメッセージの発現は、ＮＣＢ ２０またはＨＥＫ２９３細胞ＲＮＡでは検出されなかった。 より高感度な代替法として、新規アデニリルシクラーゼ１８０塩基対ｃＤＮＡ を用いてメッセージのリボヌクレアーゼ保護によってもｍＲＮＡ発現を測定した 。変性ポリアクリルアミドゲル上で顕著な約１５５塩基対のバンドとして移動す るリボヌクレアーゼ保護断片の存在は、新規アデニリルシクラーゼｍＲＮＡは、 ＡｔＴ２０細胞中に豊富に存在するが、ＮＣＢ２０細胞では非常に低レベルでし か存在せず、ＨＥＫ２９３細胞ではメッセージは検出されないことを示す。 ３つのすべての細胞株からの細胞抽出物中のカルシニューリン活性の測定は、 ＦＫ５０６とシクロスポリンＡに対してカルシニューリンプロテインホスファタ ーゼ活性の同様の感度を示した（基質ＲIIサブユニットペプチド、Frumanら、(1 992)Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．89:3686-3690）。さらにすべての３つの細 胞株は、細胞内遊離のカルシウムの枯渇により増強されるＣＲＦによる刺激に対 して応答した。ＦＫ５０６とシクロスポリンＡは、ＡｔＴ２０細胞中でＣＲＦ誘 導ｃＡＭＰ生成を一貫して増強した。ＮＣＢ２０細胞中では、４回の実験のうち １回のみは、ＣＲＦ誘導ｃＡＭＰ蓄積に対してシクロスポリンＡの統計的に有意 な作用を示し、ＨＥＫ２９３細胞では作用は認められなかった。 考察 これらのデータは、受容体刺激ｃＡＭＰ生成は、カルシニューリンにより制御 され、この制御は新規アデニリルシクラーゼｍＲＮＡの発現に関連していること を証 明している。 ここに報告したｃＡＭＰ生成のすべての試験は、ホスフォジエステラーゼの遮 断物質（ＩＢＭＸおよび／またはロリプラム）の存在下で行い、従って観察され た作用は、その分解よりｃＡＭＰの合成に関連する。 ｃＡＭＰ蓄積の調節のカルシニューリンの関与の証拠は、すでに（Antoniら、 (1993)Biochem．Biophys．Res．Commun．194: 226-233；およびFliri、(1993)抗 生物質と抗ウイルス化合物、化学合成と修飾（Antibiotics and antiviral comp ounds，Chemical synthesis and modification）、K．Krohn，H．Kirst And H． Maasg，VCN Verlagsgesellschaft mbH，ベインハイム（Weinheim）、229-240） ＡｔＴ２０細胞中とＴリンパ球細胞中でｃＡＭＰ蓄積に影響を与えたのと同じ程 度の力価でカルシニューリン活性を阻止することが証明されている免疫抑制類似 体の使用により提供される。さらに、ＦＫ５０６と同様にプロピルイソメラーゼ ＦＫＢＰ−１２に結合するが、カルシニューリンの活性を阻害する薬剤タンパク 質複合体を生成しない、ＦＫ５０６の類似体であるＬ６８５，８１８（Dumontら 、(1992)J．Exp．Med．176: 751-760）は、カルシニューリン活性、ｃＡＭＰ生 成ならびにＡＣＴＨ放出に及ぼすＦＫ５０６の作用を逆転させた。重要なことは 、Ｌ６８５，８１８は単独で投与された時、ｃＡＭＰのためのまたはＡＣＴＨ分 泌に対して検出できる作用は示さず、これはＦＫ５０６による処理で観察された 変化は、カルシニューリンの阻害によることを示唆している。最後に、ＦＫ５０ ６もシクロスポリンＡもＣａ²⁺を枯渇させた細胞で有効ではなかった。 まとめると、これらの特徴は、本明細書で記載した免疫抑制の作用はカルシニ ューリンの阻害に起因するという結論を支持している。 ＡｔＴ２０細胞中のｃＡＭＰの産生は、［Ｃａ²⁺］_iによる阻害調節を受けて いる。ｃＡＭＰによる刺激は、これらの細胞で［Ｃａ²⁺］_iの上昇を誘発する。 Ｃａ²⁺の細胞内プールは少ないため（Fiekers（1993）神経科学会の第２３回年 次大会（the 23rd Annual Meeting of the Society for Neuroscience）の抄録 、1186 Abst488.3）、これは、ほとんどジヒドロピリジン感受性Ｃａ²⁺チャネル を通過する流入により細胞外プールから誘導される（Luiniら、(1985)Proc．Nat l．Acad．Sci． U.S.A．82:8034-8038；Reisineら、(1987)Mol．Pharmacol．32: 488-496およびA ntoniら、(1992)J．Endocrinol 133: R13-R16）。すなわち、［Ｃａ²⁺］_iシグナ ルは、細胞の電気的活性の尺度であり、ホルモン放出を刺激する以外に、それを 生成する化学メッセンジャー系にフィードバック阻害を提供する。ＣＲＦ誘導ｃ ＡＭＰ生成の場合は、このフィードバックは主にカルシニューリンにより仲介さ れる。 シグナル伝達経路におけるＣａ²⁺／カルシニューリンの作用の部位に関して、 いくつかの可能性を考慮する必要がある。 受容体レベルでのカルシニューリンの作用は推定可能であり、Ｇタンパク質結 合受容体（Sibleyら、(1987)Cell 48: 913-922）の主要な考え方は、受容体ダウ ンレギュレーションまたはアンカプリングが、プロテインキナーゼの作用の大き な原因であり、プロテインホスファターゼはこの作用を逆転させるというもので ある。これに対して、このデータは、受容体刺激ｃＡＭＰ産生のインヒビターと してのカルシニューリンを示す。 カプリングタンパク質Ｇｓの脱リン酸化はまた、カルシニューリンによる制御 が可能な部位である（Houslay（1994）生物学におけるＧＴＰａｓｅ（GTPases i n Biology）B.F．Dickey and L．Birnbaumer，スプリンガーフェアラーク（Spri nger Verlag）、ベルリン、108巻、Ｐｔ２、147-165）。再度、文献中のこの証 拠は、タンパク質リン酸化をＧタンパク質機能のダウンレギュレーションと関連 付けており、細胞応答の回復におけるプロテインホスファターゼの役割を示唆し ている（パイネ（Pyne）ら、(1992)Biochem．Biophys．Res．Commun．186: 1081 -1086；およびStrassheimら、(1994)J．Biol．Chem．269: 14307-14313）。 エフェクターアデニリルシクラーゼに関して、これらのタンパク質は最近、シ グナル組み込みのダイナミックな部位として出現した（Taussigら、(1995)J．Bi ol．Chem．270: 1-4）。少なくとも２つのタイプのシクラーゼ(タイブ５と６)（ Iyengar（1993）第二メッセンジャーとホスホタンパク質研究の進歩（Advances in Second Messenger and Phosphoprotein Research）、B.L．BrownとP.R.M．Do bson、ラーベンプレス社（Raven Press Ltd）、ニューヨーク、28: 27-36）は、 Ｃａ²⁺により阻害されるが、この作用機構は解明されていない(Yoshimuraら、(1 992)Proc.Natl. Acad．Sci．USA 89: 6716-6720)。Ｃａ²⁺によるタイプ５と６のシクラーゼの阻 害は、ヒヨコ心臓細胞中のイソプロテレノール（isoproterenol）（Yuら、(1993 )Mol．Pharmacol．44:689-693）のようなアゴニスト、ＧＨ₄Ｃ_I下垂体腫瘍細胞 中のＶＩＰ（Boyajianら、(1990)Cell Calcium 11: 299-307）による刺激後は最 も顕著であるが、ＧＨ₄Ｃ_I細胞中のホルスコリンによる活性化後はあまり目立た ない（Boyajianら、(1990)Cell Calcium 11: 299-307）。全体として、これは本 明細書の観察結果と似ており、これは最初の例で、Ｇタンパク質エフェクターカ プリングのレベルまたはその前でカルシニューリンの顕著な作用を示唆し(Yoshi muraら、(1992)Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．89: 6716-6720；DeBernardini ら、(1993)Biochem．J．293: 325-328およびHellevuoら、(1993)Biochem．Bioph ys．Res．Commun．192: 311-318)、そしてこれは、増幅したｃＤＮＡのＲＴ−Ｐ ＣＲ解析と配列決定が、少なくとも３つのタイプのアデニリルシクラーゼｍＲＮ Ａ（タイプ１と６ならびに新規イソタイプ）の同時発現を明白に示したように、 ＡｔＴ２０細胞に当てはまる。ホルスコリンは、異なる効率と機構でアデニリル シクラーゼイソタイプを活性化するようであり（Iyengar（1993）第二メッセン ジャーとホスホタンパク質研究の進歩（Advances in Second Messenger and Pho sphoprotein Research）、B.L．BrownとP.R.M．Dobson、ラーベンプレス社（Rav en Press Ltd）、ニューヨーク、28: 27-36）、従ってホルスコリン誘導ｃＡＭ Ｐに対する各シクラーゼイソタイプの相対的寄与は、受容体活性化ｃＡＭＰ生成 とは異なり、従ってホルスコリン誘導ｃＡＭＰ合成と受容体活性化合成は異なる 薬剤学的プロフィールを有するかも知れない。 タイプ１シクラーゼはＣａ²⁺とここに報告したカルシニューリン（これはいつ もＣａ²⁺により刺激されるため）の作用に関与している可能性は小さく、ＣＲＦ とβ−アドレナリン作用性刺激の主要な作用はＣａ²⁺による阻害であった。Ｃａ²⁺ により強く阻害されるため、タイプ６アデニリルシクラーゼの関与が考えられ る。しかし、タイプ６イソザイムはＮＣＢ２０（Yoshimuraら、(1992)Proc.Natl .Acad.Sci．U.S.A．89: 6716-6720）ならびにＨＥＫ２９３細胞（Hellevuoら、( 1993)Biochem．Biophys．Res．Commun．192: 312-318）中に豊富に存在するが、 ＣＲＦ の内因性に発現された受容体を介するこれらの細胞でのｃＡＭＰ蓄積の刺激は、 カルシニューリンプロテインホスファターゼ活性を阻止しても変化しなかった。 重要なことは、新規アデニリルシクラーゼ同族体ｍＲＮＡは、ＨＥＫ２９３細胞 中で検出されず、ＮＣＢ２０細胞中では非常に低濃度で検出されたが、これはＡ ｔＴ２０細胞中の主要なアデニリルシクラーゼイソタイプであると思われる。別 に報告されている研究（Patersonら、1995、投稿中）は、この新規マウスアデニ リルシクラーゼの完全なコード配列を含有するＡｔＴ２０細胞からの4473塩基対 のｃＤＮＡの単離を報告している。 まとめると、これらのデータは、カルシニューリンインヒビターの作用は、こ れまで報告されていない特異的アデニリルシクラーゼイソタイプに関連している ことを示唆する。 下垂体細胞中でのｃＡＭＰ生成に対するカルシニューリンのネガティブフィー ドバックの可能な機能的意義は従来の知見により強調され、ＣＲＦ誘導ＡＣＴＨ 放出の副腎皮質による阻害は、カルシニューリンのカルシウムセンサー制御タン パク質であるカルモジュリンの新規合成を伴うことを示している（Shipstonら、 (1992)Biochem．Biophys．Res．Commun．189: 1382-1388）。さらにカルシニュ ーリンの免疫抑制遮断物質により、コルチコステロイド阻害は約１０倍低下する （Shipstonら、(1994)Ann．N．Y．Acad．Sci．746: 453-456；およびAntoniら、 (1994)J．Physiol-London 475: 137-138）。 要約すると、カルシニューリンは、下垂体コルチコトロープ腫瘍細胞中のＣＲ Ｆまたはβ₂−アドレナリン作用性受容体により活性化されるｃＡＭＰ産生のＣ ａ²⁺作用性フィードバックインヒビターである。［Ｃａ²⁺］_iは、ＡｔＴ２０細 胞中の電位差制御Ｃａ²⁺チャネルを介して主に得られ、これらの細胞は、カルシ ニューリンが細胞の化学的および電気的シグナリング系の間の結合部分として機 能する場合を例示する。これらの知見は、以前の報告（Armstrong（1989）Trend s in Neurosciences 12: 117-122；およびNicholsら、(1994)J．Biol．Chem．26 9 :23817-23823）に一致し、興奮性細胞においてカルシニューリンは、非興奮性 の系の刺激成分としての役割とは反対に細胞応答の基本的なネガティブフィード バッ ク制御物質であることを示唆する（Kincaidら、(1993)Adv．Prot．Phosphatases 7:543-583）。さらに、我々の知見は、カルシウムチャネルおよびシナプス小胞 リサイクリングからカルシニューリンの関与を、ＣＮＳ全体の細胞内シグナリン グにとって基本的なアデニリルシクラーゼシグナリング経路へ拡張している。要約 Ｃａ²⁺−およびカルモジュリン−活性化プロテインホスファターゼであるカル シニューリンは、脳に豊富に存在する。カルシニューリンの生理学的役割は、Ｔ リンパ球活性化において説明されてきたが、興奮性細胞におけるその役割につい てはあまり知られていない。本研究では、アゴニスト誘導ｃＡＭＰ生成とマウス 下垂体腫瘍（ＡｔＴ２０）細胞によるホルモン放出に及ぼすカルシニューリンの 免疫抑制遮断物質の作用を検討した。ＦＫ５０６またはシクロスポリンＡによる カルシニューリンの阻害はｃＡＭＰ生成およびコルチコトロピン放出因子（ＣＲ Ｆ）に誘導される副腎皮質刺激ホルモン分泌を増強した。ｃＡＭＰ産生のさらな る解析は、電位差制御カルシウムチャネルを介して得られる細胞内Ｃａ²⁺は、コ ルチコトロピン放出因子またはβ₂−アドレナリン作用性刺激により誘導される ｃＡＭＰ生成を低下させ、Ｃａ²⁺のこの作用はカルシニューリンにより仲介され ることを明らかにした。ＡｔＴ２０細胞ＲＮＡの解析は、タイプ１と６ならびに 新規イソタイプ（これは主要な分子種と思われた）をコードするアデニリルシク ラーゼｍＲＮＡの少なくとも３つの分子種の同時発現を示した。非常に低レベル または検出できないベルの新規シクラーゼｍＲＮＡを発現する２つの細胞株(そ れぞれＮＣＢ２０とＨＥＫ２９３)では、ＣＲＦ誘導ｃＡＭＰ生成は、ＦＫ５０ ６またはシクロスポリンＡにより変化を受けなかった。要約すると、これらのデ ータは、受容体刺激ｃＡＭＰ産生に及ぼす細胞内Ｃａ²⁺のネガティブフィードバ ックを仲介する、従ってｃＡＭＰ生成アゴニストに対する細胞応答を制御する、 Ｃａ²⁺センサーとしてカルシニューリンを同定している。さらに、ｃＡＭＰ合成 へのカルシニューリンの作用は、ＡｔＴ２０細胞中に豊富に存在する新規アデニ リルシクラーゼイソフォームの発現に関係すると思われる。実施例２：ＡＣのＤＮＡクローニングと組織分布 緒言 アデニリルシクラーゼは、ＡＴＰを、最も早期に認識された細胞内メッセンジ ャー分子であるｃＡＭＰに変換する。従来既知のアデニリルシクラーゼのファミ リーは、８つのメンバーよりなる（Prement（1994）Meth．Enzymol．238: 116-1 27）。これらの酵素の幾つかは、機能が解析されており、細胞に独特のシグナル 処理能力を与えていると考えられる（Taussigら，(1995)J．Biol．Chem．270: 1 -4）。詳細には、カルモジュリン、カルシウム（カルモジュリンとは独立に）、 プロテインキナーゼＣ並びにＧタンパク質サブユニットによる酵素活性のイソタ イプ特異的な調節が証明されている（総説については、Taussigら，(1995)J．Bi ol．Chem．270:1-4を参照のこと）。機能的多様性に加えて、アデニリルシクラ ーゼイソタイプは、別個の組織分布プロフィールを有し（Krupinskiら，(1992)J ．Biol．Chem．267:24859-24862）、そしてシクラーゼ分布の特に著しい領域の 差は脳において観察されている（Xiaら，(1994)Mol．Brain Res．22: 236-244； およびGlauら，(1993)Nature 361: 536-538）。これらの観察は集合的に、ある 細胞の特定のアデニリルシクラーゼイソタイプのプロフィールは細胞機能に関し て根本的に重要であることを示している。 マウスコルチコトロフ腫瘍（ＡｔＴ２０）細胞におけるアゴニスト刺激に対す るｃＡＭＰ応答の薬理学的解析（Antoniら，(1994)Journal Of Physiology-Lond on 475p: 137-138）により、これらの細胞におけるｃＡＭＰ蓄積のカルシウム阻 害が、Ｃａ²⁺／カルモジュリン活性化プロテインホスファターゼカルシニューリ ン（プロテインホスファターゼ２Ｂ）により仲介されることが証明されている。 ｃＡＭＰ応答のこの新規な特性により、ＡｔＴ２０細胞のアデニリルシクラーゼ イソタイプのプロフィールが検討され（Antoniら，(1995)EMBO Journal投稿中） 、２つの既知の配列（タイプ１および６）の中に、新規なイソタイプの存在が明 らかになった。本研究では、ＡｔＴ２０細胞で発現される酵素の優勢な種である 、この新規なアデニリルシクラーゼの全ｃＤＮＡ配列および組織分布を報告する 。この酵素のｍＲＮＡも、脳において、また、卵巣および副腎を含むある種の末 梢内分泌臓器において比較的豊富に存在する。 材料と方法ＡｔＴ２０細胞において同定された新規なマウスアデニリルシクラーゼの完全な コード配列を含有するｃＤＮＡの単離 ＡｔＴ２０細胞を、１０％ウシ胎児血清を補足したＤＭＥＭ中でコンフルエン スになる手前まで増殖させて（Woodsら，(1992)Endocrinology 131: 2873-2880 ）、製造業者の説明書に従ってトリゾール（Trizol）試薬（ギブコ（GIBCO）、 ペーズリー（Paisley）、英国）を使用して約１０⁷個の細胞から総ＲＮＡを単離 した。ＲＴ−ＰＣＲは、ＲＮＡ ＰＣＲキット（パーキン・エルマー（Perkin E lmer）、ウォリントン（Warrington）、チェシア州、英国）を使用して、以前に 報告（Antoniら，(1995)EMBO Journal投稿中）されたように、以前にクローン化 された哺乳動物アデニリルシクラーゼの第２細胞質ドメイン内の高度に保存され た領域に対応する変性オリゴヌクレオチドを使用して行った（Krupinskiら，(19 92)J．Biol．Chem．267: 24859-24862; Yoshimuraら，(1992)Proc．Natl．Acad ．Sci．U.S.A．89:6716-6720; およびGaoら，(1991)Proc．Natl．Acad．Sci．U. S.A．88: 10178-10182）。ＡｔＴ２０細胞から増幅された新規なアデニリルシク ラーゼの１８０塩基対ｃＤＮＡ断片（Antoniら，(1995)EMBO Journal投稿中）は 、ＡｔＴ２０細胞から調製し、５’ＲＡＣＥ ＰＣＲによりベクターＺＡＰ II （M.J.Shipston博士（エジンバラ）の贈与（Shipston（1992）博士論文，エジン バラ大学（University of Edinburgh））内に作成されたオリゴｄＴでプライム されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、完全なコード配 列を含有するｃＤＮＡを得るためのプローブとして使用した。約５×１０⁵クロ ーンのスクリーニングは、標準法（Sambrookら，(1989)コールド・スプリング・ ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Press）、米国）により行った。プラー ク精製した陽性クローンは、ヘルパーファージのエクスアシスト（ExAssist）（ ストラタジェン（Stratagene）、ケンブリッジ、英国）を使用する切除によりｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔファージミドとして回収した。これらのクローンの挿入配 列のサイズは、１〜３kbの範囲であった。ＤＮＡ配列は、Ｅｘｏ III／マング・ ビーン（Mung Bean）ヌクレアーゼ消化物を使用して、および／またはシーケナ ーゼ２．０キット（Sequenase 2.0 kit）（ユ ーエスビー(USB)、アマーシャム・インターナショナル(Amersham International )、エールズベリー（Aylesbury）、英国）と共にクローン特異的プライマーを使 用して、各クローンの幾つかの独立の単離体から決定した。生成されたＤＮＡ配 列データの解析により、適切な開始コドンを欠いたオープンフレームの存在が明 らかとなった。 残りの読み取り枠（open reading frame）を得るために、製造業者の説明書に 従って５’ＲＡＣＥシステムキット（ギブコ（GIBCO）、ペーズリー（Paisley） 、英国）を使用して２回の５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲを行い、以下に簡単に要約した 。ライブラリースクリーニングにより単離した最大のｃＤＮＡクローン（ｊｐ１ ３４）の５’末端のＤＮＡ配列に基づいて、３つの重なり（nested）アンチセン スオリゴヌクレオチドの１つのセットを設計した。これらの第１のもの（単離し たｃＤＮＡの３’末端に最も近い；プライマー１：CGTCAATGACCTCAAAGCC）を使 用して、２０mMトリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０mM ＫＣｌ、３mM ＭｇＣ ｌ₂、１０mM ＤＴＴ、１００nMプライマー１、４００μMの各ｄＮＴＰおよび２ ００ＵスーパースクリプトII逆転写酵素（Superscript II Reverse Transcripta se）を含有する２５μl反応物中の、ＡｔＴ２０細胞から単離した０．８μgの総 ＲＮＡを４２℃で３０分間逆転写して第１鎖ｃＤＮＡの合成をプライムした。グ ラスマックス(GlassMax)精製システム（ギブコ（GIBCO））を使用してこのプラ イマーから第１鎖ｃＤＮＡを精製し、そして精製したｃＤＮＡの５分の１に、２ ０mMトリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０mM ＫＣｌ、１．５mM ＭｇＣｌ₂、 ２００μM ｄＣＴＰを含有する２５μlの反応物中の１０Ｕの末端デオキシヌク レオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を使用して、３７℃で１５分間ｄＣＴＰ を３’末端につないだ。ＴｄＴの加熱不活性化後、５’ＲＡＣＥシステムキット と共に供給される２００nMで存在するアンカープライマーにより第２鎖ｃＤＮＡ 合成反応をプライムし、第１鎖合成と同様に行った。次にグラスマックス（Glas sMax）システムを使用して二本鎖ｃＤＮＡを精製し、この調製物の５分の１を、 ２０mMトリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０mMＫＣｌ、１．５mM ＭｇＣｌ₂、 ２００mM各ｄＮＴＰ、２００nMの各一般的増幅プライマー（universal amplific ation primer）（ＵＡＰ；キットと共に供給される） およびｊｐ１３４に特異的な重なりアンチセンスプライマー２（GCCTCTGCACAGCT GCAGTGGGACTCC）および０．０３U/μlアンプリタック（Amplitaq）ＤＮＡポリメ ラーゼ（パーキン・エルマー（Perkin Elmer））を含有するＰＣＲにおける鋳型 として使用した（全てのＰＣＲ反応に関するパラメーターは表IIに見い出すこと ができる）。０．０５％の最初のＰＣＲ反応物（または０．０５％のサイズ選択 した最初のＰＣＲ産物）を鋳型として使用して第２回目のＰＣＲを、プライマー ２の代わりにｊｐ１３４に特異的な重なりアンチセンスプライマー３（CCTGGCAG AACTGCTCGATGGCTTTTATCATGC）を使用した他は上述のように行った。この第１回 目の５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲにより、約１kbの産物が得られ、これらをアガロース ゲルから精製してプラスミドベクターｐＧＥＭ−Ｔ（プロメガ（Promega）、マ ジソン、ウィスコンシン州、米国）中に連結した。この断片（２つの独立のクロ ーンの両方の鎖からの）のＤＮＡ配列解析によりｊｐ１３４に観察される読み取 り枠が８４２塩基対延長されたが、未だ適切な開始コドンは明らかでなかった。 第１回目から得られた１kb断片の５’末端からの配列データに基づき別のセット の３つのアンチセンスプライマーを設計し、これらを使用して、１）第１鎖ｃＤ ＮＡは５０℃で３０分間合成され、そして２）プライマー１、２および３を、各 々４（GGAGAAGCTTCCTACTTG）、５（GTGGCCGTGAGAGTATGATTGGAGCTGTC）および６ （GTCCAAACCTGAAACTGCGCACGCAG）に置き換える他は上述のように、第２回目の５ ’ＲＡＣＥ−ＰＣＲを行った。これにより、約６５０塩基対の産物が得られ、こ れをｐＧＥＭ−Ｔにクローン化していくつかの独立の単離体を配列決定すると、 新規なマウスアデニリルシクラーゼをコードする読み取り枠が完成した。ｍＲＮＡ発現の検出 標準法を用いてノーザン解析を行った。簡単に述べると、２０μgの全ＲＮＡ をホルムアルデヒドゲル電気泳動により分離して、陽性荷電したナイロン膜（ア プリジェン（Appligene）、ウルキルチ（Ullkirch）、フランス）上にブロッテ ィングして、次に８０℃で焼いて固定し、５０％脱イオン化ホルムアミド、５× ＳＳＰＥ、０．５×デンハルト液、０．１％w/v ＳＤＳ、０．２mg/ml変性サケ 精子担体ＤＮＡおよび１０％硫酸デキストラン中で４２℃で２時間、プレハイブ リダイズを行っ た。次にランダムにプライムした標識ＤＮＡプローブ（５０ng；＞１０⁹cpm/μg ）を添加して、ハイブリダイゼーションを一晩４２℃で続けた。膜を２０分間２ ×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で２回洗浄し、次に１×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ 中で４２℃で２０分間洗浄し、最後に０．５×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で５０ ℃で２０分間洗浄してから、プラスチックに包んでオートラジオグラフ用フィル ムに−７０℃で暴露した。製造業者の説明書に従ってＲＰＡ IIキット(アンビオ ン(Ambion)、エイエムエス・バイオテクノロジー(AMS Biotechnology)、ウィッ トニー(Witney)、オクソン（Oxon）、英国)を使用して、リボヌクレアーゼ保護 測定法を行った。簡単に述べると、１０μgの全ＲＮＡを４５℃で一晩１０⁵cpm の放射能標識したアンチセンスリボプローブにハイブリダイズさせた。ハイブリ ダイゼーション後、反応物を一本鎖特異的ＲＮａｓｅで消化して、保護断片を６ ％変性ポリアクリルアミドゲル上で分割して、これを１５％メタノール／５％酢 酸中で３０分間固定し、乾燥して−７０℃でオートラジオグラフ用フィルムに暴 露した。 結果と考察ｃＤＮＡおよびアミノ酸配列の解析 ＡｔＴ２０細胞から単離された全長ｃＤＮＡの配列（一番上のセンス鎖）およ びＡＣの推定一次構造は、配列番号１に示される。４０６２塩基対の読み取り枠 （これは、１３５２アミノ酸タンパク質をコードする）を含有する４４７３塩基 対のｃＤＮＡ。ｃＤＮＡの５’末端近くの１０アミノ酸の延長は、翻訳の開始の ためのコザック（Kozak）のコンセンサス配列と非常に似ており、新規アデニリ ルシクラーゼタンパク質の推定開始コドンを含有する。このメチオニン残基の上 流の翻訳終止コドンの存在は、このタンパク質をコードする完全な読み取り枠が クローン化されたことを示唆している。残基１１０５と１１９２の間の推定アミ ノ酸配列は、予備的な形で報告（Premont（1994）Meth．Enzymol．238: 116-127 ）されたマウス脳ＲＮＡから誘導され、ＡＣと呼ばれた短い配列と同一（１１９ １位の１つのアスパラギンのアスパラギン酸への転換を除いて）であるように見 える。酵素のこの領域は、全てのシクラーゼに共通の少なくとも２つの高度に保 存されたアミノ酸配列の延長を含有するが、脳におけるＡＣ ｍＲＮＡの豊富さ （下記を参照のこと）に基づ いて、本明細書に報告される完全配列が、同じ酵素に対応し、したがってＡＣと 呼ばれることは当然と思われる。 触媒活性に関与すると考えられる重要なアデニリルシクラーゼコンセンサス配 列（Taussigら，(1995)J．Biol．Chem．270: 1-4）は、ＡＣにおいてよく保存さ れており、全アミノ酸配列相同性比較は、ＡＣが、図９に示されるような以前に 示唆されたサブファミリーの１つの中に置かれるのに十分には、現在知られてい るシクラーゼに類似していないことを示している。したがってＡＣは、第６番目 のアデニリルシクラーゼサブファミリーである。現在のところ、このサブファミ リーに他のメンバーが存在する可能性を否定できない。 疎水性プロット（Kyteら，(1982)J．Mol．Biol．157: 105）は、以前に報告さ れたアデニリルシクラーゼ構造（図１０）を、短いＮ末端ループと、これに続く ２つの相同なセグメント（この各々が、６つの膜間らせんを有する疎水性鎖と大 きな親水性（推定細胞質）ループよりなる）であると報告している。最初の細胞 質ループは、ＡＣ中で他のイソタイプに関して以前に報告されたものより相当長 い（約１３０アミノ酸）と思われる。 推定リン酸化部位の解析（Pearsonら，(1991)Meth．Enzymol．200: 61-81）は 、いくつかの強力なコンセンサスプロテインキナーゼＡおよびプロテインキナー ゼＣ部位並びに２つのカゼインキナーゼリン酸化部位を示している（表３）。Ａ Ｃタイプ１で同定された機能的に適切なカルモジュリン結合部位（Wuら，(1993) J．Biol．Chem．286: 23766-23768およびVorherrら，(1993)Biochemistry（U.S. A.）32: 6081-6088）は、最初の細胞質ドメイン中の５０４〜５０５位の保存さ れたアミノ酸残基に基づき識別することができる。しかし、ＡＣタイプ１のカル モジュリン結合部位の一部である２つの重要な塩基性残基Ｌｙｓ５００とＬｙｓ ４９７は、ＡＣではＧｌｙに置換されており、このため、酵素のこの領域でのカ ルモジュリン結合が起こりにくくなっている。ラット組織およびマウス脳におけるＡＣのｍＲＮＡの分布 ラット組織のリボヌクレアーゼ保護解析は、プローブＪＰ１１４との総ＲＮＡ のハイブリダイゼーションにより、脳において最も豊富な１２５塩基対の二本鎖 産物 が生成し、下垂体前部、卵巣、副腎、肺および腎臓においても有意なハイブリダ イゼーション活性が見られることを証明した。肝臓、膵臓、脾臓、胸腺、心臓は 、検出可能なシグナルを与えず、このことは、酵素の分布が高度に組織特異的で あることを示唆している。 マウス脳の大きな切片は、ＡＣ ｍＲＮＡが、皮質、線条体、および海馬に最 も豊富であり、小脳ではレベルが低く、そして嗅球、間脳、脳幹および下垂体で は非常に低いが検出可能な濃度であることを示唆している。マウス組織およびＡ ｔＴ２０細胞においてＲＮＡｓｅ抵抗性ハイブリッドは、ラット組織におけるそ れよりも約１５５塩基対大きく、このことは、酵素のこの領域における種間配列 変動を示していることに注意されたい。 ノーザンｍＲＮＡ解析は、ＪＰ１１４アンチセンス³²Ｐ−ＤＮＡプローブとハ イブリダイズするＡｔＴ２０細胞における約９kbの大きさのＲＮＡを示した。 要約すると本結果は、限定された組織分布と脳における明瞭な領域パターンを 有する、アデニリルシクラーゼファミリーのタンパク質のさらなるメンバーの存 在を証明している。このシクラーゼの機能的性質は、まだ詳細には探求されてい ない。薬理学的解析（Antoniら，(1994)Journal Of Physiology-London 475p: 1 37-138およびAntoniら，(1995)EMBO Journal投稿中）は、ＡＣがカルシニューリ ンを介してＣａ²⁺により阻害されること、およびこれが、下垂体前葉細胞におけ るコルチコトロピン分泌のコルチコステロイド阻害に関連しているであろうこと を示している（Shipstonら，(1994)Ann．N.Y．Acad．Sci．746: 453-456）。さ らに、脳の他の領域に比べてカルシニューリンが特に豊富であること（Kunoら， (1992)J．Neurochem．58: 1643-1651）、線条体および海馬におけるＡＣ ｍＲＮ Ａの豊富さは、シナプス機能に関して重要である。 要約 新規なアデニリルシクラーゼイソタイプ（ＡＣ）のｃＤＮＡを、マウス下垂体 コルチコトロフ腫瘍細胞株ＡｔＴ２０からクローン化して配列決定した。タンパ ク質のカルボキシル末端領域近くの高度に保存されたモチーフを含有する変性プ ライマーを使用してアデニリルシクラーゼｃＤＮＡ配列をＡｔＴ２０細胞から増 幅し た。サブクローン化増幅ｃＤＮＡ産物の多くは、新規な配列であることが判明し 、これをＡｔＴ２０細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに利用し て、そこから３１２０塩基対のクローンを単離して配列決定した。２ラウンドの ５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲにより、１３５２アミノ酸のタンパク質をコードする４０ ６２塩基対の読み取り枠を含有する４４７３塩基対の長さのｃＤＮＡが生成し、 完全長コード配列を得た。このタンパク質の疎水性プロフィールは、２セットの ６個の疎水性の推定上膜にわたる領域が予測されるだけでなく、大きな中央部の 細胞質ループおよび長いＣ末端細胞質テールが予測されることにおいて、アデニ リルシクラーゼファミリーの他のメンバーのプロフィールと似ている。アミノ酸 配列の比較は、この新規な酵素が、他の既知の哺乳動物アデニリルシクラーゼと は全く別物であり、以前に観察されたサブファミリーのいずれにも容易に割り当 てることができないことを示唆している。ｍＲＮＡの組織分布は、ＲＮＡｓｅ保 護測定法により検討し、この新規なアデニリルシクラーゼが脳において最も豊富 に存在し、次いで下垂体前部、卵巣および副腎に存在する（大体同等なレベルを 発現するようであった）ことが示された。肺および腎臓においてこのｍＲＮＡの 低いレベルの発現が検出されたが、心臓、肝臓および膵臓では明らかではなかっ た。脳において、皮質、海馬、線条体、小脳において比較的高いレベルの新規な アデニリルシクラーゼｍＲＮＡが検出されたが、間脳、嗅球および脳幹でははる かに少なかった。実施例３：ＡＣの機能的性質 方法 ＡＣの完全なコード配列を、真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３（インビトロ ジェン（Invitrogen））中にサブクローン化した。ベクターｐｃＤＮＡＩ（Chan gら，(1993)Neuron 11: 1187-1195）中にクローン化したＣＲＦ₁受容体のｃＤＮ Ａクローンは、R.V.Pearse IIおよびM.G．Rosenfeld両博士（カリフォルニア大 学、サンジエゴ）の贈与であった。両方の発現プラスミド（１０μg）が、二重 ＤＥＡＥ−デキストラン・トランスフェクションプロトコール（Ishikawaら，(1 992)Nucl．Acids Res．20:4367）により、７５cm²フラスコ中で７０％コンフル エンスになるまでＤＭＥＭおよび１０％ウシ胎児血清中で増殖させた、ＳＶ４０ で形質転換した サル胎児腎（ＣＯＳ−７）細胞中にトランスフェクションされたが、一方ＡＣ ｃＤＮＡのみが、これらはＣＲＦの内因性受容体を発現するため、アデノウイル スで形質転換したヒト胎児腎(ＨＥＫ２９３)細胞にトランスフェクションされた (F.A.Antoni,未公表データ)。対照のトランスフェクションでは、ｐｃＤＮＡ３ ベクターＤＮＡがＡＣ発現作製体の代わりに存在した。２回目のトランスフェク ションの４８時間後、Ｃａ²⁺とＭｇ²⁺を含まない、０．１％ ＥＤＴＡを含有す るハンクス平衡塩類液に細胞を回収して、２００×ｇで１０分間遠心分離を行っ た。再懸濁後、細胞を再度遠心分離して、血清タンパク質を除去して、１mlのＨ ＥＰＥＳ（２５mmol/l、ｐＨ７．４）緩衝化ハンクス平衡塩類液に再懸濁して、 ５０μlアリコートをタンパク質含量の測定のために取り出した。次に細胞をさ らに４mlの、０．２５％ ＢＳＡを含有するＨＥＰＥＳ緩衝化ハンクス液で希釈 して、大気下で３７℃で１時間、プレインキュベートした。続いて細胞を再度ペ レット化して、ポリプロピレンバイアルに分配（最終濃度３×１０⁵細胞/ml）し て、１mmol ＩＢＭＸと０．１mmol/lのロリプラム（rolipram）をｃＡＭＰ分解 性ホスホリジエステラーゼの阻害剤として使用した他はＡｔＴ２０細胞と同様に 処理した（実施例１を参照のこと）。 クローン化ＡＣ１０の機能的性質は、一時的にトランスフェクションしたＨＥ Ｋ２９３およびＣＯＳ７細胞において検討した（図１１）。ＣＲＦの内因性受容 体を有するＨＥＫ２９３細胞において、未刺激レベルのｃＡＭＰ、およびＣＲＦ に対するｃＡＭＰ応答は、ＡＣによるトランスフェクションによって変化しなか った（図１１ａとｂ）。しかし、ＦＫ５０６とのプレインキュベーションでは、 未刺激のｃＡＭＰレベルが３倍に増大し、１nmol/l ＣＲＦに対するｃＡＭＰ応 答を有意に増強したが、５（図１１ｂ）または２５nmol/l（図示していない）Ｃ ＲＦに対するそれは増強しなかった。これらの効果は、ＡＣでトランスフェクシ ョンされた細胞に特異的であった（図１１ａとｂ）。驚くべきことに、ＡＣでト ランスフェクションした細胞において、１００μmol/l Ｌ−６８５，８１８は、 未刺激のｃＡＭＰレベルを２μmol/l ＦＫ５０６と同じ程度に増大させたが、一 方、擬トランスフェクションした細胞またはｐｃＤＮＡ３でトランスフェクショ ンした細胞では影響がな かった（図示していない）。重要なことに、Ｌ−６８５，８１８はＣＲＦ誘導性 ｃＡＭＰ産生には有意に作用しなかったが、ＡＣでトランスフェクションした細 胞におけるＦＫ５０６による１nmol/l ＣＲＦへの応答の増強を阻止した（図１ １ｃ）。ＣＯＳ７細胞においてわずかに異なる結果が得られた。この系では、Ａ Ｃ ｃＤＮＡ（ＣＲＦ受容体を伴わないか、またはこれと組み合わせられた）で トランスフェクションした細胞における未刺激のｃＡＭＰ産生は、ベクターＤＮ Ａを受けている対照の１．９倍であり（ＣＲＦ受容体とｐｃＤＮＡ３でトランス フェクションしたＣＯＳ７細胞の未刺激ｃＡＭＰ［pmol/mgタンパク質］：２０ ．９±０．２；ＣＲＦ受容体とＡＣ ｃＤＮＡでトランスフェクション：３８． ２±３．４；平均値±標準誤差、ｎ＝４／群、Ｐ＜０．００１、スチューデント ｔ検定、４つの別の実験の標本）、一方ＣＲＦ（１〜２５nmol/l）により生じる 増大は一貫して変化を受けなかった（図１１ｄおよび示していないデータ）。シ クロスポリンＡは、ＡＣでトランスフェクションされた細胞において、１nmol/l ＣＲＦに対するｃＡＭＰ応答を有意かつ選択的に増強した（図１１ｄ）。これ らのデータは、ＡＣのｃＤＮＡが、ｃＡＭＰ生成酵素をコードしていることを確 認させる。この点でＣＯＳ７細胞とＨＥＫ２９３細胞の間の未刺激ｃＡＭＰ産生 における差の原因は、未知であるが、しかしこのような不一致は、真核生物発現 系において先例がないわけではない（Premont（1994）Meth．Enzymol．238: 116 -127；およびAdieら，(1994)Biochem．J．303: 803-808）。未刺激ｃＡＭＰレベ ルに及ぼすＬ−６８５，８１８の逆説的な効果に関して、これは、基礎ｃＡＭＰ 産生を増強するのに十分な高濃度（１００μmol/l）で幾らかのカルシニューリ ン阻害活性を有するようである。しかし、この小さな阻害作用は、ＨＥＫ２９３ とＣＯＳ７細胞の両方においてｃＡＭＰ刺激を起こすことが知られている細胞内 遊離Ｃａ²⁺のｃＡＭＰ誘導性増加によりカルシニューリンが活性化されるとき、 活性の機能的に適切な低下を引き起こすのに十分ではない（Linら，(1995)Mol． Pharmacol．47: 131-139；およびWidmanら，(1994)Mol．Pharmacol．45: 1029-1 035(1994)）。一時的なトランスフェクション実験の一致した知見は、低濃度Ｃ ＲＦに応答してのｃＡＭＰ産生が、カルシニューリンの免疫抑制ブロッカーによ り増強され、ＦＫ５０６の場合には、これは、アンタゴニ ストＬ−６８５，８１８によりブロックされるということである。この点で、ク ローン化および一時的にトランスフェクションしたＡＣによる知見は、ＡｔＴ２ ０細胞における知見およびＡＣで安定にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３ 細胞における予備検討と良好な一致を得られている（Antoniら,未公表データ） 。 配列比較 方法： ヒトゲノムマッピングプログラム（Human Genome Mapping Programme）、ケン ブリッジ、英国から利用可能なＧＣＧパッケージを使用して、他のアデニリルシ クラーゼとの比較を行った。ＦＫＢＰ１２との最初の整列は、ジーンジョッキー II（GeneJockeyII）（バイオソフト（Biosoft）、ケンブリッジ、英国）を使用 して行い、プログラムの補助により目視で調整した。 ＡＣの一次配列の詳細な検討により、最初の細胞質ループの残基５０３〜６１ ０が、ＦＫＢＰ１２と約４０％の類似性を示すことが明らかになった(図１２ａ とｂ)。このＦＫＢＰ１２様セグメントの最初の部分は、全てのアデニリルシク ラーゼに高度に保存されているＣ１αドメインのＣ末端セグメント（図１２ｃに おける残基５０３〜５７０）よりなる（Taussigら，(1995)J．Biol．Chem．270: 1-4)。第２の部分は、長い非保存セグメントの始まりである（Ｃ１βドメイン ）。重要なことに、幾つかの配列本体は、ＦＫＢＰ１２のＡｓｐ３７、Ｇｌｙ８ ６、Ｐｈｅ８７、Ｉｌｅ９０に対応（図１２ｂ）し、そしてカルシニューリンと のＦＫ５０６／ＦＫＢＰ１２複合体の高親和性相互作用にとって最重要なアミノ 酸残基である(Aldapeら，(1992)J．Biol．Chem．267: 16029-16032；Yangら，(1 993)J．Am．Chem．Soc．115: 819-820；およびBraunら，(1995)FASEB J．9: 63- 72）。最良の全配列の類似性は、酵母ＦＫＢＰ１２で観察され、これは実際ＦＫ ５０６の非存在下でカルシニューリンに結合することが証明されている（Carden asら，(1994)EMBO J．13: 5944-5957）。ＡＣを発現する系におけるｃＡＭＰ形 成にカルシニューリン遮断物質免疫抑制剤が顕著に作用するため、ＡＣ_{(503 〜61 0)} が、カルシニューリンの生理学的に適切なドッキング部位であるかもしれない ことを示唆するのは合理的である。 アデニリルシクラーゼタイプ１（ＡＣｔｐ１）はまた、このシクラーゼがＣａ²⁺ ／カルモジュリンにより顕著に刺激されるため、Ｇタンパク質サブユニットと は別のタンパク質補助因子と直接相互作用すると考えられている（総説について は、Taussigら，(1995)J．Biol．Chem．270: 1-4を参照のこと）。ＡＣｔｐ１の 残基４９５〜５２２（４９５〜５１８は図１２ｃ中で下線で示される）は、ナノ モルの親和性でカルモジュリンに結合する（Vorherrら，(1993)Biochemistry（U SA）32: 6081-6088）。さらに、Ｐｈｅ₅₀₃およびＬｙｓ₅₀₄の点変異は、このシ クラーゼに及ぼすＣａ²⁺／カルモジュリンの刺激効果を実質的に破壊する（Wuら ，(1993)J．Biol．Chem．286: 23766-23768）。興味深いことに、ＡＣの細胞質 ループに沿う残基４９５〜５２２の位置は、ＡＣのＦＫＢＰ１２様配列のＣ末端 部分に対応する（図１２ｃ）。したがってアデニリルシクラーゼ１およびＡＣに おけるＣ１αとＣ１βドメインの間の結合部は、カルシウム結合タンパク質によ るアロステリックな調節の部位であると考えられる。ＡＣの場合には、このよう な調節タンパク質の強力な候補は、カルシニューリンである。ＡＣは神経細胞で濃縮される 方法 総ＲＮＡ（レーン当たり２０μg）のノーザン解析は、正に荷電したナイロン 膜（アプリジェン（Appligene）、ウルキルチ（Ullkirch）、フランス）に移し 、次に５０％ホルムアミド中で放射標識プローブにハイブリダイズさせ、標準法 で洗浄することにより行った（Sambrookら，分子クローニング：実験室マニュア ル第２版（Molecular Cloning: a Laboratory Manual Ed.2）（コールドスプリ ングハーバープレス（Cold Spring Harbor Press）、米国、１９８９年））。使 用したｃＤＮＡプローブは、アミノ酸残基１〜１９５（ＪＰ１６４）および１１ ０５〜１１６５（ＪＰ１１４）に対応する。 リボヌクレアーゼ保護測定法は、製造業者の説明書に従ってＲＰＡ IIキット( アンビオン（Ambion）、エイエムエス・バイオテクノロジー（AMS Biotechnolog y）、ウィットニー（Witney）、オクソン（Oxon）、英国)を使用して、ＪＰ１１ ４またはＪＰ１４２（アミノ酸３２０〜４７８に対応する）から誘導した放射標 識アンチ センスリボプローブを使用して行った。ＡＣプローブは、サザン解析において、 アデニリルシクラーゼイソタイプｃＤＮＡ１、２、３、５または６との有意な交 差ハイブリダイゼーションを示さなかった。βアクチンとハイブリダイズする２ ５０塩基対プローブは、ＲＮＡ付加量の差を補正するための内部標準として使用 した。ブロットとゲルは、Ｘ線フィルム並びにモレキュラー・ダイナミクス・ホ スホルイメージャー（Molecular Dynamics Phosphorimager）のカセットに暴露 して、ノーザン解析およびＲＮａｓｅ保護解析におけるＲＮＡ付加量の標準とし て各々２８Ｓ ＲＮＡバンドおよびβアクチンバンドを使用して、イメージクア ント（ImageQuant）ソフトウェアで定量した。選択した放射標識バンドの画素の 合成容量を内部標準バンドの合成容量で割って、相対的ハイブリダイゼーション 強度を求め、これをブロット内の標識ＲＮＡバンドの強度と比較するために使用 した。所定の組織の保護ＲＮＡ種の相対的豊富さは、同じ測定法で流した総脳Ｒ ＮＡバンドの相対ハイブリダイゼーション強度の百分率として表される。 重要なことに、我々は、ＡＣ ｍＲＮＡが、ＣＲＦ４１およびバソプレッシン 産生神経内分泌運動ニューロンの主要な部分を含有し、かつ下垂体前葉によるＡ ＣＴＨの分泌を制御する、視床下部の室傍核において比較的高いレベルで存在す ることを発見した。加えて、ｍＲＮＡのレベルは、副腎コルチコステロイドによ り明らかに制御されており、このため、副腎皮質ステロイドレベルの低下が、Ａ Ｃ ｍＲＮＡの発現の増大を引き起こす。このことは、ＡＣが、副腎コルチコス テロイドの負のフィードバック作用にとって重要な脳の領域、視床下部−下垂体 −副腎皮質軸で発現されるという知見を強化している。この系は、コルチコステ ロイドのフィードバックが、系の関連する未だ同定されていない成分により不適 切ととして検出されるとき、ＡＣ ｍＲＮＡのレベルが上昇する、サーボ機構で ある。 結果 カルシニューリンに調節されるアデニリルシクラーゼの存在は、カルシニュー リンが脳の総タンパク質の約１％を構成するため、脳機能にとって非常に重要で ある（Kleeら，(1988)Adv．Enzymol．61: 149-200）。ＡＣは実際、脳に非常に 豊富にある：ノーザンブロット解析は、マウス線条体およびＡｔＴ２０細胞にお いて９kb ｍＲＮＡの存在を証明している（図１３）。マウス脳の切開領域のＲＮＡｓｅ保 護解析は、ＡＣ ｍＲＮＡの相対的発生量が、海馬≧線条体≧皮質≧小脳≧嗅球 ＞脳幹＞間脳≧下垂体前葉であることを示唆している（範囲３倍、方法について は図１３を参照のこと）。これらの知見は、主にニューロンの局在を示しており 、インサイチューハイブリダイゼーション組織化学検査により確認され、海馬ニ ューロンにおける強いＡＣ ｍＲＮＡハイブリダイゼーションを証明している（ 図１４）。 ＲＮＡｓｅ保護アッセイはまた、他の組織の中で、マウス腎臓、胸腺および脾 臓におけるＡＣ１０ ｍＲＮＡの存在をも証明しており（脳＝１００％とすれば 、各々相対発生量５０、１０および８％、方法については図１３を参照のこと） 、これら全てが、免疫抑制剤の重要な標的である（Schreierら，(1993)Transpla nt．Proc．25: 502-507；およびDumontら，(1992)J.Exp.Med．176: 751-760）。 カルシニューリンに調節されるアデニリルシクラーゼの機能的意味 要約すると、本結果は、脳に豊富に存在し、カルシニューリンにより阻害され る、アデニリルシクラーゼファミリーのタンパク質の新規なメンバーの存在を示 している。カルシニューリン活性のそのＥＦ側タンパク質βサブユニットによる 複雑な制御、並びにカルモジュリンによる追加の調節（Schreierら，(1993)Tran splant．Proc．25: 502-507）は、細胞内Ｃａ²⁺およびｃＡＭＰの間の微妙な相 互作用が細胞機能を決定する状況における、ＡＣの可能性ある根本的な役割を示 唆している（Cooperら，(1995)Nature 374: 421-424）。さらには、脳の他の領 域に比べてカルシニューリンが特に濃縮されている（Kunoら，(1992)J．Neuroch em．58: 1643-1651）線条体および海馬におけるＡＣ ｍＲＮＡの豊富さは、シナ プス機能に関して非常に重要である。最後に、現在既知のＣａ²⁺で調節されるシ クラーゼも、カルシニューリンによる制御を受けるかどうかが未解決である。最 近の研究は実際、Ｃａ²⁺刺激性アデニリルシクラーゼのカルシニューリン制御を 示唆する、Ｃａ²⁺／カルシニューリンによるｃＡＭＰ形成の促進を報告している （Baukalら，(1994)J．Biol．Chem．269: 24546-24549）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/46 ＡＣＶ Ａ６１Ｋ 37/54 ＡＥＤ ＡＥＤ ＡＡＢ 45/00 ＡＤＵ ＡＢＮ Ｃ０７Ｋ 14/47 ＡＣＤ Ｃ１２Ｎ 5/10 ＡＣＪ 9/88 ＡＣＶ //(Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ， ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．カルシニューリンにより制御可能なアデニル酸シクラーゼ活性を有するタン パク質またはポリペプチド。 ２．配列番号１に記載される配列から誘導されるヌクレオチド配列、またはその 一部を含んでなるポリヌクレオチドによりコードされる、請求の範囲第１項に記 載のタンパク質またはポリペプチド。 ３．配列番号２に記載されるアミノ酸配列、その機能的同等物またはその一部を 含んでなる、請求の範囲第１項および第２項のいずれか１項に記載のタンパク質 またはポリペプチド。 ４．配列番号２のアミノ酸番号５０３〜５７０を含む、請求の範囲第１項から第 ３項のいずれか１項に記載のタンパク質またはポリペプチド。 ５．配列番号１に記載のヌクレオチド配列から誘導されるヌクレオチド配列、ま たはその一部を有する、ポリヌクレオチド。 ６．請求の範囲第５項に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、組換えポリヌク レオチド作製体。 ７．請求の範囲第５項に記載のポリヌクレオチドまたは請求の範囲第６項に記載 の作製体を含んでなる、ベクター。 ８．請求の範囲第７項に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。 ９．ヒト胎児腎細胞株２９３から誘導される、請求の範囲第８項に記載の宿主細 胞。 10．アデニル酸シクラーゼ活性あるいは前記タンパク質またはポリペプチドの量 に作用することにより、細胞内代謝に影響を及ぼすための、請求の範囲第１項か ら第４項のいずれか１項に記載のタンパク質またはポリペプチドの制御物質の使 用。 11．前記調節物質が、カルシニューリン、そのアクチベーター、インヒビターお よび競合物質；アミノ酸５０３〜５７０に対する抗体；またはβアドレナリン作 用性アゴニストおよびβアドレナリン作用性アンタゴニストである、請求の範囲 第１０項に記載の使用。 12．前記調節物質が、配列番号２のアミノ酸５０３〜５７０に対する抗体である 、請求の範囲第１０項および第１１項のいずれか１項に記載の使用。 13．ヒトまたは非ヒト動物の身体を治療する方法であって、アデニル酸シクラー ゼ活性、あるいは前記身体内に存在する請求の範囲第１項から第４項のいずれか １項に記載のタンパク質またはポリペプチドの量に作用する物質を投与すること を含んでなる方法。 14．前記タンパク質またはポリペプチドが、前記身体内に本来存在する、請求の 範囲第１３項に記載の方法。 15．神経系疾患；精神系疾患；内分泌系疾患；心血管系疾患；妊娠系疾患；呼吸 器系疾患；骨系疾患；腎臓系疾患；消化器系疾患；または腫瘍に作用するため、 またはこれらを克服するための、請求の範囲第１３項および第１４項のいずれか １項に記載の方法。 16．細胞内代謝に影響を及ぼす治療薬を設計または試験するための、請求の範囲 第 １項から第４項のいずれか１項に記載のタンパク質またはポリペプチド、あるい は請求の範囲第５項に記載のポリペプチドの使用。