KR20230134232A

KR20230134232A - 백금계 항암제에 대한 난소암 환자의 약물 반응성 예측용 다중 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단방법

Info

Publication number: KR20230134232A
Application number: KR1020220031287A
Authority: KR
Inventors: 문유석; 아룰쿠마나가판
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2022-03-14
Filing date: 2022-03-14
Publication date: 2023-09-21

Abstract

본 발명은 카베올린-1 (Caveolin-1) 및 안지오텐신 전환 효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2; ACE2)를 유효성분으로 포함하는 난소암 환자의 백금계 항암제에 대한 반응성 예측용 바이오마커 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 시토크롬 P450 3A4 (Cytochrome P450 3A4; CYP3A4)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는데, 진단 측면에서 난소암 환자의 약물반응성을 조기에 예측하고, 약물감수성을 예측하여 효율적인 치료에 도움이 될 수 있다.

Description

백금계 항암제에 대한 난소암 환자의 약물 반응성 예측용 다중 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단방법{Multiple Biomarker Composition for Predicting Drug Responsiveness to Platinum-based Anti-cancer Agents in Ovarian Cancer and Method for Diagnosing Using The Same Marker}

본 발명은 백금계 항암제에 대한 난소암 환자의 약물 반응성 예측용 다중 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단방법을 제공한다.

난소암은 부인과 질병으로 인한 사망 사례들 중에서 주요한 여성 사망 원인으로 손꼽힌다. 미국에서는 2018년에 대략 22,240명의 새로운 난소암 환자가 발생하였으며, 14,070명이 난소암으로 인해 사망하였다. 암으로 인한 사망률 중 난소암으로 인한 사망 사례는 5위에 달한다.

난소암의 예후가 좋지 않은 이유는 난소암 발병 초기에 증상이 거의 없기 때문에 조기 진단이 어렵고 진행성 난소암의 경우 항암제 내성을 가지고 있기 때문이다. 난소암이 초기에 진단되었을 때 5년 생존율이 90% 이상에 달하지만, 후기에 발견되어 전이가 진행된 상태라면 5년 생존율이 30% 이하로 급감하게 된다.

한편, 상피성 난소암 (epithelial ovarian cancer; EOC)은 여성의 부인과 암 관련 사망의 가장 흔한 원인으로 그 중 난소 투명세포암종 (ovarian clear cell carcinoma; OCCC)은 생물학적 및 임상적으로 상피성 난소암의 뚜렷한 하위 유형으로 전세계 인종 중 동북아시아 지역 특히 일본 및 한국인 여성에서 상대적으로 많이 발생한다. 타 난소암의 높은 약물반응성과는 달리 투명세포암 (OCCC) 환자는 1차 화학요법에 대한 민감도가 낮을 뿐만 아니라 (플라틴 기반 화학요법에 대해 11%의 낮은 반응률) 재발 후 진행된 단계에서도 예후가 매우 나쁘다.

따라서, 모든 난소암의 약물 민감성에 대한 잠재적인 표적 개발이 절실하여, 연구가 계속 진행되고 있는 실정이다.

1. 대한민국공개특허 10-2011-0120890호.

본 발명의 목적은 카베올린-1 (Caveolin-1) 및 안지오텐신 전환 효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2; ACE2)를 유효성분으로 포함하는 난소암 환자의 백금계 항암제에 대한 반응성 예측용 바이오마커 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 카베올린-1 (Caveolin-1) 및 안지오텐신 전환 효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2; ACE2)의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 난소암 환자의 백금계 항암제에 대한 반응성 예측용 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 난소암 환자의 백금계 항암제에 대한 반응성 예측용 조성물을 포함하는 난소암 환자의 백금계 항암제에 대한 반응성 예측용 키트를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 난소암 환자의 백금계 항암제에 대한 반응성 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 카베올린-1 (Caveolin-1) 또는 카베올린-1 (Caveolin-1) 발현 촉진제; 및 안지오텐신 전환 효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2; ACE2) 발현 억제제;를 유효성분으로 포함하는 난소암 환자의 백금계 항암제에 대한 항암 효과 증진용 약학 조성물 및 건강기능식품 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 카베올린-1 (Caveolin-1) 또는 카베올린-1 (Caveolin-1) 발현 촉진제; 안지오텐신 전환 효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2; ACE2) 발현 억제제; 및 백금계 항암제를 유효성분으로 포함하는 난소암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 백금계 항암제를 유효성분으로 포함하는 카베올린-1 (Caveolin-1)의 발현 수준이 증가되거나, 안지오텐신 전환 효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2; ACE2) 또는 시토크롬 P450 3A4 (Cytochrome P450 3A4; CYP3A4)의 발현 수준이 억제된 환자의 난소암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 백금계 항암제에 대한 민감성 증진제 스크리닝 방법을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 카베올린-1 (Caveolin-1) 및 안지오텐신 전환 효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2; ACE2)를 유효성분으로 포함하는 난소암 환자의 백금계 항암제에 대한 반응성 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 카베올린-1 (Caveolin-1) 및 안지오텐신 전환 효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2; ACE2)의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 난소암 환자의 백금계 항암제에 대한 반응성 예측용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 난소암 환자의 백금계 항암제에 대한 반응성 예측용 조성물을 포함하는 난소암 환자의 백금계 항암제에 대한 반응성 예측용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 a) 개체로부터 분리된 시료 중 카베올린-1 (Caveolin-1), 안지오텐신 전환 효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2; ACE2) 및 시토크롬 P450 3A4 (Cytochrome P450 3A4; CYP3A4)의 발현 수준을 측정하는 단계; b) 상기 a) 단계에서 측정된 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 c) 상기 a) 단계에서 측정된 카베올린-1 (Caveolin-1)의 발현 수준이 대조군 시료보다 증가하거나, 안지오텐신 전환 효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2; ACE2) 또는 시토크롬 P450 3A4 (Cytochrome P450 3A4; CYP3A4)의 발현 수준이 대조군 시료보다 감소된 경우 백금계 항암제에 대한 민감성을 갖는 것으로 판단하는 단계;를 포함하는 난소암 환자의 백금계 항암제에 대한 반응성 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 카베올린-1 (Caveolin-1) 또는 카베올린-1 (Caveolin-1) 발현 촉진제; 및 안지오텐신 전환 효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2; ACE2) 발현 억제제;를 유효성분으로 포함하는 난소암 환자의 백금계 항암제에 대한 항암 효과 증진용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 카베올린-1 (Caveolin-1) 또는 카베올린-1 (Caveolin-1) 발현 촉진제; 및 안지오텐신 전환 효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2; ACE2) 발현 억제제;를 유효성분으로 포함하는 난소암 환자의 백금계 항암제에 대한 항암 효과 증진용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 카베올린-1 (Caveolin-1) 또는 카베올린-1 (Caveolin-1) 발현 촉진제; 안지오텐신 전환 효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2; ACE2) 발현 억제제; 및 백금계 항암제를 유효성분으로 포함하는 난소암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 백금계 항암제를 유효성분으로 포함하는 카베올린-1 (Caveolin-1)의 발현 수준이 증가되거나, 안지오텐신 전환 효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2; ACE2) 또는 시토크롬 P450 3A4 (Cytochrome P450 3A4; CYP3A4)의 발현 수준이 억제된 환자의 난소암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 i) 난소암 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; ii) 상기 시험물질을 접촉한 난소암 세포에서 카베올린-1 (Caveolin-1), 안지오텐신 전환 효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2; ACE2) 및 시토크롬 P450 3A4 (Cytochrome P450 3A4; CYP3A4)의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 iii) 상기 ii) 단계에서 측정된 카베올린-1 (Caveolin-1)의 발현 수준이 대조군 시료보다 증가하거나, 안지오텐신 전환 효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2; ACE2) 또는 시토크롬 P450 3A4 (Cytochrome P450 3A4; CYP3A4)의 발현 수준이 대조군 시료보다 감소된 시험물질을 선별하는 단계;를 포함하는 백금계 항암제에 대한 민감성 증진제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 카베올린-1 (Caveolin-1) 및 안지오텐신 전환 효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2; ACE2)를 유효성분으로 포함하는 난소암 환자의 백금계 항암제에 대한 반응성 예측용 바이오마커 조성물에 관한 것으로, 진단 측면에서 난소암 환자의 약물반응성을 조기에 예측하여 환자의 수고를 덜고, 약물감수성을 예측하여 효율적인 치료에 도움이 되어, 이를 통해 인종, 지역 및 환경 특이성에 따른 난소암 맞춤형 시장 전략 플랫폼 수립할 수 있다.

도 1은 인간 난소 투명세포암의 유전자 전사체 발현을 비교한 결과를 나타낸다.
도 2는 카베올린-1 (Caveolin-1) 결여 또는 정상 발현된 약물 감수성 있는 난소 투명세포암 세포주에서 24시간 플라틴 약물처치 후, 세포사멸 분석한 결과를 나타낸다.
도 3은 카베올린-1 (Caveolin-1) 과발현 또는 정상 발현된 약물 저항성 있는 난소 투명세포암 세포에서 24시간 플라틴 약물처치 후, 세포사멸 분석한 결과를 나타낸다.
도 4는 카베올린-1 (Caveolin-1) 저발현 또는 과발현된 난소암 환자 간 안지오텐신 전환 효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2; ACE2)의 발현을 비교한 결과를 나타낸다.
도 5는 병태조직학적 분류에 따라 난소암 종류별 난소암 세포주에서 안지오텐신 전환 효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2; ACE2)의 발현을 비교한 결과를 나타낸다.
도 6은 안지오텐신 전환 효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2; ACE2) 결여 또는 정상발현된 약물저항성 난소 투명세포암 세포에서 24시간 플라틴 약물처치 후 세포생존율을 분석한 결과를 나타낸다.
도 7은 안지오텐신 전환 효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2; ACE2) 결여 또는 정상발현된 약물저항성 난소 투명세포암 세포에서의 약물대사 유전자 시토크롬 P450 (Cytochrome P450; CYP450)의 전사체 발현량을 비교한 결과를 나타낸다.
도 8은 안지오텐신 전환 효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2; ACE2) 결여, 카베올린-1 (Caveolin-1) 과발현 또는 정상발현된 약물 저항성 있는 난소 투명세포암세포; 및 약물 감수성 있는 난소 투명암세포;의 시토크롬 P450 3A4 (Cytochrome P450 3A4; CYP3A4) 전사체 발현량을 비교 분석한 결과를 나타낸다.
도 9는 백금계 약물에 대한 저항성 또는 감수성이 있는 환자 간 안지오텐신 전환 효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2; ACE2) 및 시토크롬 P450 3A4 (Cytochrome P450 3A4; CYP3A4) 발현 전사량 비교 분석한 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

난소암 발병 초기에 증상이 거의 없어 조기 진단이 어렵고, 진행성 난소암의 경우, 항암제 내성을 가지고 있기 때문에 난소암에 대한 예후가 좋지 않아, 이러한 예후 개선을 위해서, 난소암 환자의 백금계 항암제에 대한 반응성 예측을 위한 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 카베올린-1 (Caveolin-1) 및 안지오텐신 전환 효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2; ACE2)를 유효성분으로 포함하는 난소암 환자의 백금계 항암제에 대한 반응성 예측용 바이오마커 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 시토크롬 P450 3A4 (Cytochrome P450 3A4; CYP3A4)를 더 포함 할 수 있다.

상기 난소암은 상피성 난소암 (epithelial ovarian cancer; EOC)일 수 있으며, 바람직하게는 난소 투명세포암 (ovarian clear cell carcinoma; OCCC)일 수 있다.

상기 백금계 항암제는 옥살리플라틴 (oxaliplatin), 시스플라틴 (cisplatin) 및 카보플라틴 (carboplatin)로 이루어진 군 중 어느 하나 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 조성물는 시토크롬 P450 3A4 (Cytochrome P450 3A4; CYP3A4)의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 더 포함할 수 있다.

상기 백금계 항암제는 옥살리플라틴 (oxaliplatin), 시스플라틴 (cisplatin) 및 카보플라틴 (carboplatin)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 시료는 혈액, 뇌척수액 및 소변으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 약학 조성물 및 건강기능식품 조성물은 시토크롬 P450 3A4 (Cytochrome P450 3A4; CYP3A4) 발현 억제제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.

본 발명에 따른 유효성분의 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 투여량이 0.01 mg/kg 내지 200 mg/kg, 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

상기 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

그밖에 천연 과일 주스, 합성 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강기능식품 조성물은 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.

또한, 상기 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안전청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반 시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고랭색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류 첨가 알칼리제, 보존료제제, 타르색소 제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.

이때, 건강기능식품을 제조하는 과정에서 식품에 첨가되는 유효성분은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있으며, 바람직하게는 식품 100 중량부에 1 중량부 내지 90 중량부 포함되도록 첨가될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예 등은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예 등에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예 등은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

[준비예] 세포 배양 및 화학 시약

인간 상피성 난소암 (epithelial ovarian cancer; EOC) 세포를 포함한 인간 난소 투명세포암 (ovarian clear cell carcinoma; OCCC) 세포주는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 구입했다. 상기 세포주는 20 %(v/v) 열불활성화 소태아혈청 (FBS), 50 U/mL 페니실린 및 50 mg/mL 스트렙토마이신 (Welgene)이 보충된 RPMI 1640 배지에서 37 ℃의 5 % 이산화탄소 가습 인큐베이터에서 배양했다. 세포수는 혈구계를 사용하여 트리판 블루 (trypan blue; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 염료 배제 분석을 수행하여 계산했다.

[실험예 1] 실시간 PCR (Real-time polymerase chain reaction; qPCR)

총 RNA는 제조사의 프로토콜에 따라 RiboEX™ 시약 (GeneAll Biotech, Seoul, Korea)을 사용하여 추출했다. TOPscript™ RT DryMIX 키트 (Enzynomics, Seoul, Korea)를 사용하여 각 샘플의 동일한 양의 RNA (3 μg)를 cDNA로 역전사한 후, SYBR® Green은 Rotor-Gene Q 열 순환기 (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 cDNA를 증폭시켰다. 이를 검출 위한 형광 리포터 염료로 실시간 PCR에 사용되었다. 각 실험에는 통계적 유의성을 보장하기 위해 3번의 반복 실험이 포함되었으며, 각각의 독립적인 실험 세트는 2 내지 3회 반복했다. 상대적인 유전자 발현은 Ct 값을 사용하여 정량화했다. Ct 값은 형광의 통계적으로 유의한 증가가 관찰된 지점으로 정의되었다. SYBR® Green 형광 강도가 배경 바로 위의 임계값 수준을 초과하는데 필요한 Ct 값은 테스트 및 참조 반응에 대해 계산되었다. GAPDH는 모든 실험에서 내인성 대조군으로 사용되었다. 결과는 대조군 세포에 대한 값에 대한 정량화에 의해 분석되었다.

[ 실험예 2] 항암제에 대한 종양세포사 분석

상기 준비예의 난소 투명세포암 세포주를 표시된 농도의 약물과 함께 24시간 동안 인큐베이션 후 세포를 수집하고, 차가운 PBS로 세척하고, 원심분리하였다. 아폽토시스 세포는 제조사의 프로토콜에 따라 FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I (#556547, BD Pharmingen, San Diego, CA, USA)을 사용하여 검출되었다. 요약하자면, 세포주를 5 μL의 Annexin V-FITC로 염색한 후 5 μL의 요오드화 프로피디움 (PI)과 400 μL의 Annexin V 결합 완충액을 100 μL의 세포 현탁액에 15분 동안 첨가했다. BD Accuri™ C6 Plus 소프트웨어 버전 1.0.23.1 (BD Biosciences)을 사용하여 유세포 분석을 수행하고 분석했다.

[실험예 3] 생존 세포 분석

상기 준비예의 난소 투명세포암 세포주를 5,000개 세포/웰의 밀도로 96웰 플레이트에 접종하고 24시간 동안 인큐베이션하였다. 배지를 제거하고, 새로운 배지 또는 플라티눔 첨가하여 최종 부피가 200 μL/웰이 되도록 하였다. 24시간 동안 배양한 후 배양액을 제거하고 1 mg/mL MTT를 포함하는 50 μL의 PBS (phosphate-buffered saline)를 각 웰에 첨가하고 4시간 동안 배양하였다. 그 후, PBS가 포함된 MTT 용액을 조심스럽게 제거하고, 100 μL의 디메틸설폭사이드 (DMSO)를 각 웰에 첨가하고, 25 ℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 흡광도는 마이크로플레이트 판독기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 540 nm에서 측정했다. 세포 생존율의 50 % 억제 농도 (IC50) 값은 CompuSyn 1.0 소프트웨어 (ComboSyn Inc., Paramus, NJ, USA)를 사용하여 분석하였다.

[실험예 4] 환자 조직 전사체 분석

난소암 환자 조직 전사체 분석은 2 내지 4기 난소암 환자의 원발성 종류와 조직특성에 따라 분류되고, 약물처방이력을 연계하여 분석했다. 이와 더불어, 공공 데이터 세트 TCGA-OV, GSE29450, GSE14407, GSE50831, GSE26193 및 GSE63885 등의 전사체에서 데이터를 추출하여 비교하여 표적 유전자의 mRNA 프로파일을 분석했다.

[실험예 5] 통계분석

GraphPad Prism 5.04 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하여 통계 분석을 수행했다. 두 그룹 간의 비교는 Student's t-test를 수행했고, 다중 그룹 간의 비교는 ANOVA 분산분석 및 Student-Newman-Keuls 사후 방법을 사용하여 쌍별 비교를 수행했다. 본 발명에 제시된 모든 데이터는 평균 ± 표준 편차 (SD)로 표시되었다. 차이는 p < 0.05에서 통계적으로 유의한 것으로 간주했다.

[실시예 1] 카베올린-1 (Caveolin-1; CAV-1)의 난소암과의 관계

카베올린-1 (Caveolin-1; 이하, CAV-1이라함)은 지질 마이크로도메인 주요 구조 막횡단 단백질로서, 일반인과 난소 투명세포암 (ovarian clear cell carcinoma; OCCC) 환자 간의 CAV-1 전사체 발현량을 비교했다. 그 결과, 도 1에 따를 때, 난소 투명세포암 환자에게서 CAV-1 전사체가 낮게 발현되는 것을 확인했다.

CAV-1이 결여 또는 정상 발현된 약물 감수성 있는 난소 투명세포암 세포주에 24시간 시스플라틴 (cisplatin) 약물처치 후, 세포사멸 분석했다. 그 결과, 도 2에 따를 때, 약물 감수성 있는 난소 투명세포암 세포주에서 CAV-1 결여 시, 시스플라틴 약물에 의한 세포 사멸이 억제되는 것을 확인했다.

CAV-1이 과발현 또는 정상 발현된 약물 저항성 있는 난소 투명세포암 세포주에 24시간 시스플라틴 (cisplatin) 약물처치 후, 세포사멸 분석했다. 그 결과, 도 3에 따를 때, 약물 저항성 있는 난소 투명세포암 세포주에서 CAV-1 과발현 시, 시스플라틴 약물에 의한 세포 사멸이 증진되는 것을 확인했다.

이러한 결과로 볼 때, 난소암에서 CAV-1은 백금계 약물감수성에 직접 관여할 수 있음을 예상할 수 있었다.

[ 실시예 2] 안지오텐신 전환 효소 2 ( Angiotensin -converting enzyme 2; ACE2)의 난소암과의 관계

CAV-1 저발현 및 고발현 난소암 환자 간에 안지오텐신 전환 효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2; 이하, ACE2라함) 발현량을 비교하였다. 그 결과, 도 4에 따를 때, CAV-1 및 ACE2 간에는 음의 상관관계를 가지는 것을 확인하였다.

병태조직학적 분류에 따라 난소암 종류별 난소암 세포주에서 ACE2의 발현량을 비교했다. 그 결과, 도 5에 따를 때, 타 난소암 종에 비해서 상대적으로 항암제 내성이 큰 난소 투명세포암 세포주에서 더 높은 ACE2 발현을 나타내는 것을 확인했다.

ACE2가 결여 또는 정상 발현된 약물 저항성 있는 난소 투명세포암 세포주에 24시간 시스플라틴 (cisplatin) 약물처치 후, 세포생존율을 분석했다. 그 결과, 도 6에 따를 때, 약물 저항성 있는 난소 투명세포암 세포주에서 ACE2 결여 시, 약물감수성이 증가되기에, 시스플라틴 약물에 의한 세포 사멸이 증진되어 세포생존율이 감소함을 확인했다.

[ 실시예 3] 시토크롬 P450 3A4 ( Cytochrome P450 3A4; CYP3A4 )의 난소암과의 관계

ACE2가 결여 또는 정상 발현된 약물 저항성 있는 난소 투명세포암 세포주에 약물대사 유전자인 시토크롬 P450 (Cytochrome P450; CYP450)의 전사체 발현량을 비교 분석했다. 그 결과, 도 7에 따를 때, 난소 투명세포암에서 약물 저항성 인자로서 ACE2는 약물대사 표적으로 다양한 시토크롬 P450 중 시토크롬 P450 3A4 (Cytochrome P450 3A4; 이하, CYP3A4라함)의 발현에 양의 상관성으로 관여하는 것을 확인했다.

ACE2가 결여, CAV-1이 과발현 또는 정상 발현된 약물 저항성 있는 난소 투명세포암 세포주 및 약물 감수성 있는 난소 투명세포암 세포주의 CYP3A4 전사체 발현량을 비교 분석했다. 그 결과, 도 8에 따를 때, 약물 저항성 있는 난소 투명세포암 세포주에서 높은 발현을 보이는 CYP3A4는 백금계 약물 체내 제거에서 중요한 효소이며, 약물 저항성 있는 난소 투명세포암 세포주에서 CAV-1을 과발현 시키거나, ACE2를 결여 시, CYP3A4 발현이 현격히 감소하는 것을 확인하여, CAV-1 - ACE2 - CYP3A4 간의 연계성을 확인할 수 있었다.

백금계 약물에 저항성이 있어나 감수성이 있는 환자 간에 ACE2 및 CYP3A4 전사체 발현량을 비교 분석했다. 그 결과, 도 9에 따를 때, 약물 저항성 있는 난소 투명세포암 세포주에서 ACE2 결여 시에 약물감수성 증가로, ACE2가 약물저항성에 관여함이 예측되어, 백금계 약물 감수성이 있는 환자의 경우, 상대적으로 ACE2 및 CYP3A4의 발현이 낮고, 백금계 약물 저항성이 있는 환자는 ACE2 및 CYP3A4 발현이 높은 연계성을 보여 마커조합의 유효성을 확인했다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

카베올린-1 (Caveolin-1) 및 안지오텐신 전환 효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2; ACE2)를 유효성분으로 포함하는 난소암 환자의 백금계 항암제에 대한 반응성 예측용 바이오마커 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 시토크롬 P450 3A4 (Cytochrome P450 3A4; CYP3A4)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이오마커 조성물.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 난소암은 상피성 난소암 (epithelial ovarian cancer; EOC)인 것을 특징으로 하는, 바이오마커 조성물.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 상피성 난소암은 난소 투명세포암 (ovarian clear cell carcinoma; OCCC)인 것을 특징으로 하는, 바이오마커 조성물.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 백금계 항암제는 옥살리플라틴 (oxaliplatin), 시스플라틴 (cisplatin) 또는 카보플라틴 (carboplatin)인 것을 특징으로 하는, 바이오마커 조성물.
카베올린-1 (Caveolin-1) 및 안지오텐신 전환 효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2; ACE2)의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 난소암 환자의 백금계 항암제에 대한 반응성 예측용 조성물.
청구항 6에 있어서, 상기 조성물은 시토크롬 P450 3A4 (Cytochrome P450 3A4; CYP3A4)의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
청구항 6 또는 청구항 7의 조성물을 포함하는 난소암 환자의 백금계 항암제에 대한 반응성 예측용 키트.
a) 개체로부터 분리된 시료 중 카베올린-1 (Caveolin-1), 안지오텐신 전환 효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2; ACE2) 및 시토크롬 P450 3A4 (Cytochrome P450 3A4; CYP3A4)의 발현 수준을 측정하는 단계;
b) 상기 a) 단계에서 측정된 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및
c) 상기 a) 단계에서 측정된 카베올린-1 (Caveolin-1)의 발현 수준이 대조군 시료보다 증가하거나, 안지오텐신 전환 효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2; ACE2) 또는 시토크롬 P450 3A4 (Cytochrome P450 3A4; CYP3A4)의 발현 수준이 대조군 시료보다 감소된 경우 백금계 항암제에 대한 민감성을 갖는 것으로 판단하는 단계;를 포함하는 난소암 환자의 백금계 항암제에 대한 반응성 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
청구항 9에 있어서, 상기 백금계 항암제는 옥살리플라틴 (oxaliplatin), 시스플라틴 (cisplatin) 또는 카보플라틴 (carboplatin)인 것을 특징으로 하는, 방법.
청구항 9 또는 청구항 10에 있어서, 상기 시료는 혈액, 뇌척수액 및 소변으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 방법.
카베올린-1 (Caveolin-1) 또는 카베올린-1 (Caveolin-1) 발현 촉진제; 및 안지오텐신 전환 효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2; ACE2) 발현 억제제;를 유효성분으로 포함하는 난소암 환자의 백금계 항암제에 대한 항암 효과 증진용 약학 조성물.
카베올린-1 (Caveolin-1) 또는 카베올린-1 (Caveolin-1) 발현 촉진제; 및 안지오텐신 전환 효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2; ACE2) 발현 억제제;를 유효성분으로 포함하는 난소암 환자의 백금계 항암제에 대한 항암 효과 증진용 건강기능식품 조성물.
카베올린-1 (Caveolin-1) 또는 카베올린-1 (Caveolin-1) 발현 촉진제; 안지오텐신 전환 효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2; ACE2) 발현 억제제; 및 백금계 항암제를 유효성분으로 포함하는 난소암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
청구항 12 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 시토크롬 P450 3A4 (Cytochrome P450 3A4; CYP3A4) 발현 억제제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
백금계 항암제를 유효성분으로 포함하는 카베올린-1 (Caveolin-1)의 발현 수준이 증가되거나, 안지오텐신 전환 효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2; ACE2) 또는 시토크롬 P450 3A4 (Cytochrome P450 3A4; CYP3A4)의 발현 수준이 억제된 환자의 난소암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
i) 난소암 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
ii) 상기 시험물질을 접촉한 난소암 세포에서 카베올린-1 (Caveolin-1), 안지오텐신 전환 효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2; ACE2) 및 시토크롬 P450 3A4 (Cytochrome P450 3A4; CYP3A4)의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
iii) 상기 ii) 단계에서 측정된 카베올린-1 (Caveolin-1)의 발현 수준이 대조군 시료보다 증가하거나, 안지오텐신 전환 효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2; ACE2) 또는 시토크롬 P450 3A4 (Cytochrome P450 3A4; CYP3A4)의 발현 수준이 대조군 시료보다 감소된 시험물질을 선별하는 단계;를 포함하는 백금계 항암제에 대한 민감성 증진제 스크리닝 방법.