KR20230131449A - Fam167a를 포함하는 bcr-abl 비의존성 타이로신 키나아제 억제제 내성을 진단하기 위한 바이오마커 및 fam167a를 타겟으로 하는 만성 골수성 백혈병 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Fam167a를 포함하는 bcr-abl 비의존성 타이로신 키나아제 억제제 내성을 진단하기 위한 바이오마커 및 fam167a를 타겟으로 하는 만성 골수성 백혈병 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 FAM167A를 포함하는 BCR-ABL 비의존성 타이로신 키나아제 억제제(tyrosine kinase inhibitor, TKI) 내성을 진단하기 위한 바이오마커 조성물 및 FAM167A를 타겟으로 하는 만성 골수성 백혈병 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 FAM167A 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 확인함으로써, 만성 골수성 백혈병 환자의 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 진단하는 조성물, 키트, 방법과 FAM167A를 타겟으로 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 나타내는 만성 골수성 백혈병 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 만성 골수성 백혈병 환자의 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성 억제용 약학 조성물을 제공한다.

Description

FAM167A를 포함하는 BCR-ABL 비의존성 타이로신 키나아제 억제제 내성을 진단하기 위한 바이오마커 및 FAM167A를 타겟으로 하는 만성 골수성 백혈병 예방 또는 치료용 조성물 {A biomarker for diagnosing BCR-ABL-independent tyrosine kinase inhibitor resistance comprising FAM167A and a composition for preventing or treating chronic myeloid leukemia targeting FAM167A}
본 발명은 FAM167A를 포함하는 BCR-ABL 비의존성 타이로신 키나아제 억제제(tyrosine kinase inhibitor, TKI) 내성을 진단하기 위한 바이오마커 조성물 및 FAM167A를 타겟으로 하는 만성 골수성 백혈병 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 FAM167A 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 확인함으로써, 만성 골수성 백혈병 환자의 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 진단하는 조성물, 키트, 방법과 FAM167A를 타겟으로 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 나타내는 만성 골수성 백혈병의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 만성 골수성 백혈병 환자의 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성 억제용 약학 조성물을 제공한다.
만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia, CML)은 BCR-ABL 필라델피아 염색체의 특징적인 t(9;22)(q34;q11) 상호 전좌(reciprocal translocation)에 의해 발생한다. BCR-ABL 융합 유전자는 전좌 동안 ABL1의 상류 조절 도메인의 손실로 인해 구성적으로 활성인 BCR-ABL 종양 단백질을 암호한다. 이마티닙(imatinib)과 같은 BCR-ABL-타겟 타이로신 키나아제 억제제(tyrosine kinase inhibitor, TKI)의 개발은 CML 환자의 치료에 혁명을 일으켰다. 그러나, TKI에 대한 내성은 성공적인 CML 치료의 주요 장애물로 남아 있다.
TKI 내성은 BCR-ABL 의존성과 BCR-ABL 비의존성의 두 가지 방식으로 발생한다. BCR-ABL 의존성 내성은 주로 BCR-ABL 키나아제 도메인의 돌연변이에 의해 발생하지만, 이 도메인에 돌연변이가 없는 많은 CML 환자도 TKI 내성을 나타낸다. 닐로티닙(nilotinib) 및 다사티닙(dasatinib)과 같은 2세대 TKI는 BCR-ABL 의존성 내성 질환에 효과적인 치료법이다. 대조적으로, BCR-ABL 비의존성 TKI 내성은 2세대 TKI로 해결할 수 없다. 신호경로 활성의 변화, 후생유전학적 조절자의 돌연변이, 미세환경 요인 및 백혈병 줄기 세포 활성을 포함한 여러 요인이 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성에 잠재적인 기여자이지만, 이러한 유형의 내성의 근본적인 이유는 완전히 이해되지 않았다. 따라서, 기본 메커니즘을 식별하고 효과적인 치료법을 개발하는 것이 주요 목표이다.
핵 인자-κB(NF-κB) 패밀리 멤버는 면역 반응, 염증 및 암과 관련된 다양한 유전자를 조절하는 유도전사인자이다. 표준 및 비표준의 두 가지 주요 NF-κB 활성화 신호 경로가 있다. 표준 NF-κB 경로는 주로 κB 단백질 억제제(IκB)의 분해와 p50 함유 이량체의 핵 전좌를 통해 활성화된다. 대조적으로, 비표준 NF-κB 경로의 중심 신호 단백질은 NF-κB 유도 키나아제(NF-κB-inducing kinase, NIK)이다. 비표준 NF-κB 활성화는 유비퀴틴화 의존성 NIK 분해의 차단을 통한 NIK 축적에 의존한다. 축적된 NIK는 p100에서 p52로의 처리를 유도하고, 이어서 p52 함유 이량체의 핵 전좌가 뒤따른다. NF-κB 경로는 TKI 내성에 기여하고, 이러한 경로의 억제는 TKI에 대한 CML의 민감성을 회복시킨다. 그러나, TKI 내성 CML에서 NF-κB 경로의 직접적인 활성화와 관련된 요인은 아직 알려지지 않았다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 NF-κB가 인실리코(in silico) 활성화된 전사인자 분석을 통해 테스트된 것 중에서 가장 고도로 활성화된 전사인자이며, BCR-ABL 비의존성 TKI 내성 CML 세포에서 차등 유전자 발현을 담당한다는 것을 밝혔다. 또한, 본 발명자들은 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성이 있는 CML의 비표준 NF-κB 경로에서 이전에 특성화되지 않은 단백질인 FAM167A의 중요한 기능을 밝혔다. 구체적으로, FAM167A의 발현이 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 가진 환자의 CD34+ CML 세포에서 고도로 상향조절되고(CML 세포주에서의 결과와 유사), FAM167A가 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 담당한다는 것을 보여준다. FAM167A의 중화는 배양 세포 및 마우스 종양 모델에서 TKI 내성을 역전시켰다.
이러한 발견은 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성의 메커니즘과 관련하여 비표준 NF-κB 경로에서 FAM167A에 대한 신규하고 중요한 역할을 설명하며, TKI 내성 CML을 극복하기 위한 유망한 타겟으로 제시된다.
FAM167A와 관련하여, 비특허문헌 1은 CGA에 의해 확인된 전신성 경화증(systemic sclerosis) 감수성 유전자로 FAM167A-BLK를 확인한 바 있으나, BCR-ABL 비의존성 TKI 내성의 진단 및 TKI 내성 CML을 치료하기 위한 타겟으로서 FAM167A의 역할에 대해서는 알려진 바 없다.
Ota Y, Kuwana M. Updates on genetics in systemic sclerosis. Inflamm Regen. 2021 Jun 15;41(1):17.
본 발명은 상술한 과제를 해결하기 위해 안출된 것으로, BCR-ABL 비의존성 TKI 내성의 진단 및 TKI 내성 CML을 치료하기 위한 신규 타겟을 발굴하고, 상기 타겟을 바이오마커로 하여, CML 환자의 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성 진단, BCR-ABL 비의존성 TKI 내성 CML의 치료 및 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 억제하는 기술을 제공하는 데 목적이 있다.
상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 FAM167A 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는, 만성 골수성 백혈병 환자에서 BCR-ABL 비의존성 타이로신 키나아제 억제제(tyrosine kinase inhibitor, TKI) 내성을 진단하기 위한 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, FAM167A 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 만성 골수성 백혈병 환자에서 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 진단하기 위한 조성물 및 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 FAM167A 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 FAM167A 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 압타머를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 FAM167A 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 경쟁적 RT-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, 마이크로어레이 키트, SAGE(Serial Analysis of Gene Expression) 키트, 유전자 칩 키트, ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는 만성 골수성 백혈병 환자의 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 진단하기 위한 정보제공방법을 제공한다:
(a) 만성 골수성 백혈병 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 FAM167A 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된 발현 수준을, BCR-ABL 비의존성 타이로신 키나아제 억제제 내성이 없는 만성 골수성 백혈병 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 동일한 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준과 비교하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 정보제공방법은 (c) 상기 (a) 단계의 만성 골수성 백혈병 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 FAM167A 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이, 상기 (b) 단계의 BCR-ABL 비의존성 타이로신 키나아제 억제제 내성이 없는 만성 골수성 백혈병 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 동일한 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준보다 높은 경우, BCR-ABL 비의존성 TKI에 내성을 나타내는 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 점액, 타액, 눈물, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
추가로, 본 발명은 FAM167A 단백질 억제제; FAM167A 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 억제제; 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 나타내는 만성 골수성 백혈병의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 만성 골수성 백혈병 환자의 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성 억제용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 나타내는 만성 골수성 백혈병은 TKI 민감성을 나타내는 만성 골수성 백혈병에 비해 NF-κB 활성이 증가될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 TKI와 병용 투여될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 TKI는 크리조티닙(crizotinib), 세리티닙(ceritinib), 알렉티닙(alectinib), 브리가티닙(brigatinib), 보수티닙(bosutinib), 다사티닙(dasatinib), 이마티닙(imatinib), 닐로티닙(nilotinib), 포나티닙(ponatinib), 이브루티닙(ibrutinib), 카보잔티닙(cabozantinib), 게피티닙(gefitinib), 엘로티닙(erlotinib), 라파티닙(lapatinib), 반데타닙(vandetanib), 아파티닙(afatinib), 오시메르티닙(osimertinib), 룩소리티닙(ruxolitinib), 토파시티닙(tofacitinib), 엑시티닙(axitinib), 렌바티닙(lenvatinib), 닌테다닙(nintedanib), 파조파닙(pazopanib), 레고라페닙(regorafenib), 소라페닙(sorafenib) 또는 수니티닙(sunitinib)을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 나타내는 CML의 치료제 또는 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 나타내는 세포주 또는 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계; 및
(b) 상기 후보물질이 처리된 세포주 또는 동물모델에서 FAM167A 단백질의 억제 여부 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자 발현의 억제 여부를 확인하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 스크리닝 방법은 (c) 상기 후보물질이 FAM167A 단백질을 억제하거나 상기 단백질을 암호화하는 유전자 발현을 억제하는 경우, 상기 후보물질을 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 나타내는 CML의 치료제 또는 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성 억제제로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서는 BCR-ABL 키나제 도메인에 돌연변이가 없는 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 나타내는 CML에서 TKI 내성의 지표로 활용할 수 있는 신규 바이오마커로 FAM167A를 발굴하고, 이를 억제하는 경우 TKI 내성이 역전되는 것을 확인하였는 바, 이를 이용하여 기존 2세대 TKI로 치료되지 않는 CML 환자의 TKI 내성을 진단하고, BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 나타내는 CML 환자의 TKI 내성을 역전시킴으로써, TKI 내성 환자를 효과적으로 치료할 수 있는 이점을 제공한다.
도 1a는 CML에서 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성에 기여하는 유전자의 선택을 위한 전략을 나타낸 것이다.
도 1b와 도 1c는 각각 표시된 농도의 이마티닙(도 1b)과 닐로티닙(도 1c)으로 3일 동안 처리한 후 K562S 및 K562R 세포의 생존능을 분석한 결과를 나타낸 것이고, 도 1d와 도 1e는 각각 표시된 농도의 이마티닙(도 1d)과 닐로티닙(도 1e)으로 3일 동안 처리한 후 K562S 및 K562R 세포에서 아폽토시스를 평가하기 위한 아넥신 V 염색 세포의 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다. 데이터는 3번(도 1b 내지 도 1e)의 독립 실험(오차 막대, 3중(도 1b 및 도 1c) 샘플의 s.d.)을 나타낸다. 독립표본 양측 t-테스트; ***P<0.001. K562S: TKI에 민감한 K562 세포주, K562R: BCR-ABL 키나아제 도메인 돌연변이가 없는 TKI 내성 K562 세포주.
도 1f는 마이크로어레이 및 RNA-seq 분석으로 검사한 K562R 세포에서 상향 조절 및 하향 조절된 유전자(배수변화 ≥2)를 보여주는 벤 다이어그램이다.
도 1g는 K562R 세포에서 차등 발현되는 유전자의 발현 수준에 대한 히트맵 분석을 나타낸 것이다.
도 1h와 1i는 마이크로어레이 및 RNA-seq 분석 모두에서 차등 발현되는 유전자 조절에 관여하는 전사인자(도 1h) 및 3개의 대조군 유전자(각 그룹은 500개의 무작위로 선택된 유전자를 포함함)(도 1i)의 인실리코(in silico) 분석 결과를 나타낸 것이다. 크기와 색상은 전사 인자와 관련된 유전자의 수를 나타낸다.
도 1j는 전사인자에 대한 농축 스코어를 나타낸 것으로, 무작위로 선택된 유전자와 비교하여, 차등 발현된 유전자와의 연관성 정도를 나타낸다.
도 1k의 A는 K562S와 K562R 사이에서 차등 발현되는 유전자 중 표시된 전사인자에 의해 타겟팅된 유전자의 비율을 나타낸 것이고, B는 무작위로 선택된 500개의 유전자 중에서 표시된 전사인자에 의해 타겟팅된 유전자의 비율을 나타낸 것이다.
도 1l은 K562S 및 K562R 세포와 1μM 이마티닙으로 24시간 동안 처리된 K562R 세포에서의 NF-κB 및 AP-1 루시페라아제 리포터 활성을 나타낸 것이다.
도 1m은 K562S 및 K562R 세포와 1μM 이마티닙으로 24시간 동안 처리된 K562R 세포에서 7개 유전자의 mRNA 수준에 대한 정량적 역전사 PCR(qRT-PCR) 분석 결과를 나타낸 것이다. IMA: 이마티닙. 데이터는 3번(도 1l 및 도 1m)의 독립적인 실험(오차 막대, 이중(도 1m) 또는 삼중(도 1j 및 도 1l) 샘플의 s.d.)을 나타낸다. 독립표본 양측 T 검정; *P < 0.05, **P < 0.01. NS: 유의성 없음; K562S: TKI 민감 K562 세포주; K562R: BCR-ABL 키나아제 도메인 돌연변이가 없는 TKI 내성 K562 세포주.
도 2a는 표시된 유전자를 암호화하는 플라스미드의 형질감염 24시간 후 K562S 세포 및 24시간 동안 1μM 이마티닙으로 처리된 K562R 세포와 K562R 세포에서의 NF-κB 루시페라아제 리포터 활성을 나타낸 것이다.
도 2b는 2 일 동안 이마티닙(IMA, 1 μM)으로 처리하거나 처리하지 않은 후 표시된 유전자를 암호화하는 플라스미드로 형질감염된 K562S 세포의 생존율을 나타낸 것이다. 데이터는 2번의 독립적인 실험(오차 막대, 3중 샘플의 s.d.)을 나타낸다. 독립표본 양측 t-테스트; ***P<0.001.
도 2c의 A는 SecretomeP 툴(http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/)에 의한 인간, 마우스, 래트 및 제브라피시 FAM167A 및 HA-태그 인간 FAM167A 분비의 인실리코(in silico) 예측을 나타낸 것으로, NN 스코어가 0.5 이상인 단백질은 분비될 것으로 예측된다. 도 2c의 B는 K562R 세포의 세포 용해물 및 배양 상등액에서 FAM167A의 면역블랏분석 결과를 나타낸 것이다. 배지는 대조군 상등액으로 사용되었다. 상등액 단백질은 아세톤 침전에 의해 농축되었다. 세포질 단백질인 Erbin도 대조군으로 분석하여 배양 상등액에 세포질 단백질이 없다는 것을 확인하였다. 데이터는 3번(도 2c의 B)의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 2d는 재조합 FAM167A으로 처리 후 K562S 세포에서 24시간 동안의 NF-κB 루시페라아제 리포터 활성을 나타낸 것이고, 도 2e는 항-FAM167A 중화 항체로 24시간 동안 처리한 후 K562R 세포에서 NF-κB 루시페라아제 리포터 활성을 나타낸 것이고, 도 2f는 50μg/ml SN50, 10ng/ml LPS 또는 이 둘 다로 24시간 동안 처리한 후 K562R 세포에서 NF-κB 루시페라아제 리포터 활성을 나타낸 것이고, 도 2g는 우성-음성 NIK(NIK-DN)를 암호화하는 플라스미드의 형질감염 24시간 후 K562R 세포에서 NF-κB 루시페라아제 리포터 활성을 나타낸 것이고, 도 2h와 도 2i는 K562S 및 K562R 세포에서 NIK(도 2h) 및 p100/p52(도 2i)에 대한 면역블랏분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2j는 NF-κB 프로브 및 항-p52 항체로 슈퍼시프트(supershift)을 나타내는 K562S 및 K562R 세포로부터 분리된 핵 추출물의 전기영동 이동성 이동 분석(EMSA) 결과를 나타낸 것이다.
도 2k는 100ng/ml 재조합 FAM167A로 처리하고 NIK-DN을 암호화하는 플라스미드의 형질감염 후 24시간째에 K562S 세포에서 NF-κB 루시페라아제 리포터 활성을 나타낸 것이다.
도 2l은 2μg/ml의 항-FAM167A 중화 항체 또는 아이소타입 대조군으로 12시간 동안 처리한 후 K562R 세포에서 NIK의 면역블랏분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2m은 표시된 농도의 재조합 FAM167A로 12시간 동안 처리한 후 K562S 및 K562R 세포에서 p100/p52의 면역블랏분석 결과를 나타낸 것이다. GAPDH는 내부 표준(도 2h, 도 2i 도 2l 및 도 2m)으로 사용되었다. 데이터는 3번(도 2a, 도 2d 내지 2g 및 도 2i 내지 도 2m) 또는 5번(도 2h)의 독립적인 실험을 나타낸다(오차 막대, 3중(도 2a, 도 2d 내지 2g 및 도 2i 내지 도 2m) 또는 5개(도 2h) 샘플의 s.d.). 독립표본 양측 t-테스트; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001
도 3a는 Myc-태그 FAM167A 및 Alexa Fluor 488-접합 항-Myc 항체를 사용한 K562S 및 K562R 세포의 표면 FAM167A 수용체(FAM167AR) 염색 결과를 나타낸 것이다.
도 3b는 FAM167A 수용체 식별을 위한 실험 설계를 나타낸 것이다.
도 3c는 Myc-태그 FAM167A 및 Protein G Sepharose® 비드에 결합된 항-Myc 항체를 사용하여 K562R 세포로부터 준비한 면역침전 샘플의 은 염색 결과를 나타낸 것이다.
도 3d는 MS/MS 스펙트럼 및 도 3c로부터 표시된 밴드의 펩티드 서열을 나타낸 것이다.
도 3e는 K562R 세포에서 FAM167A와 DSG1 사이의 공동-면역침전분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3f는 K562S와 K562R 세포 및 24시간 동안 1μM 이마티닙으로 처리된 K562R 세포에서 DSG1 mRNA 수준의 qRT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3g는 K562S 및 K562R 세포에서 DSG1 발현의 면역블랏분석을 나타낸 것이다.
도 3h는 항-DSG1 항체를 사용한 K562S 및 K562R 세포의 표면 염색 결과를 나타낸 것이다.
도 3i는 K562S 및 K562R 세포에서 DSG1 발현의 면역형광 현미경 분석 사진을 나타낸 것이다. Hoechst 33342를 사용하여 핵을 시각화하였다. 눈금 막대, 10μm. GAPDH는 내부 표준(도 3g)으로 사용되었다. IP: 면역침전. MFI: 평균 형광 강도. 데이터는 3번(도 3a, 도 3c 및 도 3e 내지 3i)의 독립 실험(오차 막대, 2중(도 3f) 또는 3중(도 3a 및 도 3h) 샘플의 s.d.)을 나타낸다. 독립표본 양측 t-테스트; **P < 0.01, ***P < 0.001. NS: 유의하지 않음.
도 3j는 K562R 세포에서 DSG1 및 FAM167A의 면역형광 현미경 분석 사진을 나타낸 것이다. Hoechst 33342를 사용하여 핵을 시각화하였다. 눈금 막대, 10μm.
도 3k는 FAM167A를 암호화하는 플라스미드의 형질감염 및 표시된 농도의 항-FAM167A 중화 항체로 처리한 후 24시간째에 K562S 세포에서 NF-κB 루시페라아제 리포터 활성 결과를 나타낸 것이다. 데이터는 2번(도 3j 및 도 3k)의 독립 실험(오차 막대, 3중(도 3j) 샘플의 s.d.)을 나타낸다. 독립표본 양측 t-테스트; *P<0.05.
도 4a는 항-DSG1 항체와 함께 2개의 상이한 DSG1-특이적 shRNA를 암호화하는 재조합 렌티바이러스를 사용하여 DSG1 넉다운시킨 후, K562R 세포의 표면 DSG1 염색 결과를 나타낸 것이다.
도 4b는 2개의 상이한 DSG1-특이적 shRNA를 암호화하는 재조합 렌티바이러스를 사용하여 DSG1 넉다운시킨 후, K562R 세포에서 NF-κB 루시페라아제 리포터 활성을 나타낸 것이다.
도 4c는 DSG1 넉다운 후, K562R 세포에서 p100/p52의 면역블랏분석 결과를 나타낸 것이다
도 4d는 2μg/ml 항-FAM167A 중화 항체로 처리하거나 처리하지 않은 상태에서 DSG1 또는 DSG1과 Erbin을 암호화하는 플라스미드의 형질감염 24시간 후, K562R 세포에서 NF-κB 루시페라아제 리포터 활성을 나타낸 것이다.
도 4e는 K562S, K562R 및 24시간 동안 1μM 이마티닙으로 처리된 K562R 세포에서 Erbin mRNA의 qRT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4f는 K562S 및 K562R 세포에서 Erbin에 대한 면역블랏분석 결과를 나타낸 것이다. 데이터는 3번(도 4a, 도 4e 및 도 4f)의 독립적인 실험(오차 막대, 3중(도 4e) 샘플의 s.d.)을 나타낸다. 독립표본 양측 t-테스트; NS: 유의하지 않음.
도 4g는 K562S 및 K562R 세포에서 DSG1, Erbin 및 NIK의 공동면역침전분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4h는 2μg/ml의 항-FAM167A 중화 항체 또는 아이소타입 대조군으로 3시간 동안 처리한 후, K562R 세포에서 DSG1 및 NIK의 공동면역침전분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4i는 2μg/ml의 항-FAM167A 중화 항체 또는 아이소타입 대조군과 10μM MG132를 3시간 동안 처리한 K562R 세포로부터의 NIK 면역침전 후 항-유비퀴틴 항체를 사용한 NIK 유비퀴틴화의 면역블랏분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4j의 A는 K562S 및 K562R 세포에서 DSG1, Erbin, NIK, TRAF3, CHIP 및 c-cbl의 공동-면역침전분석 결과를 나타낸 것이고, B는 항-DSG1 및 항-TRAF3 항체를 사용하여 K562S 세포에서 DSG1, NIK 및 TRAF3의 공동-면역침전 분석 결과를 나타낸 것이고, C는 항-DSG1 및 항-CHIP 항체를 사용하여 K562S 세포에서 DSG1, NIK 및 CHIP의 공동-면역침전분석 결과를 나타낸 것이고, D는 항-DSG1 및 항-c-cbl 항체를 사용하여 K562S 세포에서 DSG1, NIK 및 c-cbl의 공동-면역침전분석 결과를 나타낸 것이다. GAPDH는 내부 표준(도 4j의 A)으로 사용되었다. 데이터는 3번(도 4j의 A 내지 D)의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 4k는 FAM167A 유도 비표준 NF-κB 경로의 개략도 모델을 나타낸 것이다. GAPDH는 내부 표준(도 4c 및 도 4g 내지 도 4i)으로 사용되었다. Ub: 유비퀴틴화. 데이터는 2번(도 4c) 또는 3번(도 4b, 도 4d, 도 4g 내지 도 4i)의 독립적인 실험(오차 막대, 2중(도 4c) 또는 3중(도 4b, 도 4d, 도 4g 및 도 4h) 샘플의 s.d.)을 나타낸다. 독립표본 양측 t-테스트; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.
도 5a는 FAM167A-유도 비표준 NF-κB 경로의 억제를 나타내는 개략도이다.
도 5b는 3일 동안 이마티닙 또는 닐로티닙(Nilo)으로 처리한 후 NIK-DN을 암호화하는 플라스미드로 형질감염된 K562R 세포의 생존율을 나타낸 것이다.
도 5c는 항-FAM167A 중화 항체 2μg/ml 또는 아이소타입 대조군으로 3일 동안 이마티닙 또는 닐로티닙의 존재 하에 처리한 후 K562R 세포의 생존능 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5d는 이마티닙 또는 닐로티닙의 존재 하에 3일 동안 2μg/ml의 항-FAM167A 중화 항체 또는 아이소타입 대조군으로 처리한 후 K562R 세포의 세포사멸 집단을 나타낸 것이다. 데이터는 3번(도 5b 내지 도 5d)의 독립적인 실험(오차 막대, 3중(도 5b 내지 도 5d) 샘플의 s.d.)을 나타낸다. 독립표본 양측 t-테스트; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001
도 6a는 마우스 모델을 보여주는 실험 스케줄 및 개략도이다.
도 6b와 도 6c는 각각 항-FAM167A 중화 항체 또는 아이소타입 대조군(2mg/kg/3일)이 있거나 없는 상태에서 비히클 또는 10mg/kg/일 이마티닙으로 처리된 마우스에서 확립된 K562R 종양의 부피와 마우스의 체중을 나타낸 것이다.
도 6d는 치료 10일째에 각 그룹의 마우스에서 수집한 종양 사진을 나타낸 것이고, 도 6e는 치료 10일째의 종양 중량을 나타낸 것이다.
도 6f는 헤마톡실린 및 에오신(HE) 염색, 항-Ki-67 및 항-NIK 항체를 사용한 종양 절편의 면역조직화학적 염색 및 TUNEL 염색 결과를 나타낸 것이다. 눈금 막대: 100μm. 데이터는 3번(도 6b 내지 6f)의 독립적인 실험(오차 막대, 5 마리(도 6b, 도 6c, 도 6e 및 도 6f) 마우스 또는 샘플의 s.d.)을 나타낸다. 독립표본 양측 t-테스트; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. NS, 유의하지 않음.
도 7은 24시간 동안 1 μM 이마티닙으로 처리된 KCL22S, KCL22R 및 KCL22R 세포에서 FAM167A mRNA의 qRT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이다. 데이터는 3번의 독립적인 실험(오차 막대, 3중 샘플의 s.d.)을 나타낸다. 독립표본 양측 t-테스트; **P<0.01, ***P<0.001.
도 8a는 진단 시점(n = 12) 및 추적 관찰 시(n = 11) BCR-ABL 돌연변이가 없는 이마티닙 내성 CML 환자(R), 그리고 진단 시점(n = 10) 및 추적 관찰 시(n = 12) BCR-ABL 돌연변이가 있는 이마티닙 내성 CML 환자에서, 진단 시점(n = 26) 및 추적 관찰 시(n = 26) 이마티닙 반응성 CML 환자(S)의 CD34+ 줄기/전구 세포에서 FAM167A mRNA 발현의 qRT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이다. 이마티닙 내성과 BCR-ABL 돌연변이 상태는 추적 관찰에서 결정되었다. FAM167A의 수준은 GAPDH의 수준으로 정규화되었다.
도 8b는 유세포 분석을 통해 측정된, 진단 시점(n = 8) 및 추적 관찰 시(n = 8) 이마티닙 반응성 CML 환자와 진단 시점(n = 10) 및 추적 관찰 시(n = 7)에서 BCR-ABL 돌연변이가 없는 이마티닙 내성 CML 환자의 CD34+ 줄기/전구 세포에서 DSG1(MFI)의 상대적 표면 발현을 나타낸것이다.
도 8c는 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성에서 FAM167A-유도된 비표준 NF-
Figure pat00001
B 경로의 관여를 보여주는 제안된 모델이다. 독립표본 양측 t-테스트; *P < 0.05, ***P < 0.001. NS: 유의하지 않음.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.
상술한 바와 같이, BCR-ABL 비의존성 TKI 내성은 2세대 TKI로도 치료가 불가능하여, BCR-ABL 비의존성 TKI 내성 CML의 진단 및 치료에 활용할 수 있는 신규한 바이오마커의 발굴이 필요한 실정이다.
이에, 본 발명에서는 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 나타내는 CML의 비표준 NF-κB 경로에서 이전에 특성화되지 않은 단백질인 FAM167A의 중요한 기능을 밝히고, FAM167A의 중화가 배양 세포 및 마우스 종양 모델에서 TKI 내성을 역전시키는 효과를 나타낸다는 것을 규명하여, FAM167A가 TKI 내성 CML을 극복하기 위한 유망한 타겟이 될 수 있음을 확인함으로써, 상술한 문제의 해결방안을 모색하였다.
따라서, 본 발명의 제1 측면은 FAM167A 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는, 만성 골수성 백혈병 환자에서 BCR-ABL 비의존성 타이로신 키나아제 억제제(tyrosine kinase inhibitor, TKI) 내성을 진단하기 위한 바이오마커 조성물에 관한 것이다.
상기 FAM167A는 C8orf13으로도 알려져 있으며 FAM167(SEC) 패밀리에 속하는 214개 아미노산 단백질이다. FAM167A를 암호화하는 유전자는 약 1억 4600만 염기쌍으로 구성된 인간 염색체 8에 맵핑된다. 인간에서 상기 FAM167A 단백질 또는 이의 단편은 NCBI Reference Sequence: NP_444509.2의 아미노산을 포함할 수 있으나, 실질적으로 상기 단백질과 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 상기 FAM167A 단백질은 동형 단백질(isoform) 또는 이의 전구체도 포함할 수 있다. 본 발명에서는 대표적인 FAM167A 단백질의 아미노산 서열을 서열번호 1에 나타내었다.
MSVPQIHVEE VGAEEGAGAA APPDDHLRSL KALTEKLRLE TRRPSYLEWQ ARLEEHTWPF PRPAAEPQAS LEEGERGGQE PLLPLREAGQ HPPSARSASQ GARPLSTGKL EGFQSIDEAI AWLRKELTEM RLQDQQLARQ LMRLRGDINK LKIEHTCRLH RRMLNDATYE LEERDELADL FCDSPLASSF SLSTPLKLIG VTKMNINSRR FSLC (서열번호 1)
상기 FAM167A 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA는 NCBI Reference Sequence: NM_053279.3의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있으나, 실질적으로 상기 유전자와 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 뉴클레오타이드 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 본 발명에서는 대표적인 FAM167A 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 서열을 서열번호 2에 나타내었다.
gagaattcac cggagctcgg ggaggcgagg cgggagccct gagctgaggc cgggcagcgc ggacccgcgc aggaggaggc ggcggggaca ccggcgagtc cccagcaggg cccctgggct cccggaaggg tctccagcca cctgcccttc ccgagaagag agagctctgg gccttcttcc tgccagtctg gtcttcgagt gcgttcagga cagatagacc ttggcacagg ctgccccgag attcctgcga cgctgtctgt tcctgccttc tgtggagcat ggcacccaca ggcttccagg acggatcata gacccgagcc tccaggaggg cgccctgtgc ggctcactgc gcggtccctc tcagctcccc tgccacccag cctctgaggc cggctcctgt cccggaaatg ccctcgggca cctggatgag gccatcccag agcgggaccc aactgtgcca cccaccaagc ctccccctgc gccccccgtg ccctcgcatg tccggctgcc agggcagact gtagaatgtc tgtgccccag atccacgtgg aagaagtggg tgcagaagag ggggcgggag cagccgcacc acccgatgac cacctccgga gcctgaaggc cctcaccgag aaactgaggc tggagacccg caggccctcc tacctggaat ggcaggccag gctggaggag catacctggc ccttcccgag gccggctgcg gagccacagg cgagcttgga ggagggggag cgtggggggc aggagccctt gctccccctg agagaggctg ggcagcaccc cccttctgcc aggagtgcca gccaaggtgc cagacccctg tccactggca agctggaagg ctttcagagc atcgatgaag ctatagcctg gctcaggaag gaactgacgg agatgcggct gcaggaccag caactggcca gacagctcat gcgcctgcgt ggcgacatca acaagctgaa aatcgaacac acctgccgcc tccacaggag gatgctcaac gatgccacct acgagctgga ggagcgggat gagctggccg acctcttctg tgactcccct cttgcctcct ccttcagcct ctccacacca ctcaagctta ttggcgtgac caagatgaac atcaactctc ggaggttctc tctctgctga ggagccctca gactgggcgg aggggctgga gcggagggct tgggctggag gggtgtcaga ggaagctgag gccaagttac tccagtgggt ctcccggagg caggggtccc tgggactggc gactcaaggg ccccaggacc tattcagtgg tgctctccca cccaggggcc ctgggtgtgg atgccagtgt ctctgtgact ggctcttgct tactacccaa agagctctgc agaagggccg ctccaaccaa gatgttaaag gagacctggg ttcccaccat aatccatccc tccacggtca cgttcctgtt tcctggaatc actggtgcta tgaactggga ttcccaaagg gaggcccccc aacaaagctg tcatttttgc agaaggctgt cccgcaaggg ccttggggga aattaggcat gtcagatgtg cctgtctcac gtgctgttgc tgtcctctaa gtattgtctc aaattcaccc taagtacatg actcagcaac attgacaggg agctactagg aagggaaaat cgaaaggcat gacaaatggg cacttgggga cgcagcccca gtggctggca gccagtgtct ctggtgagcc tgacactata aggctgtgta aattgtaaat tctggcgtgt gctgggacat gtgatggggg cactagcgta gcttgggtgc aacaagcaca gatgtcccca ttgtctcccc tggccacatg catctccaaa gagcctcttc actgccaccc acaccccagg gtgacagcct gggagaccac tggtgactga accaggcagg tcctgaaagc attttccata actgaattct cctgcagggg cgtgaccggg gcctcctggt ggattctggt ggtgtcacct tactgccctc tctggaaaga caatctaggg agcccagagg cccatcctga gcctcctctg agattttgtg cctgacctaa acaactagtt ttaataagac tgttactgat gtgttgttca cttgttagta actgattttt gtccaaatgc ggaagccact tgtgtaggtc aactacagtg cgtaggattt gattttaaga gtttctccct cccaacaggc ttgaggatca gcaagttaag accccagcag gttagggagg tcagtctggg gtcatacggc atggcagggg tccctcggcc agacccgtag aatcctgaga taaggagtgt ttctgacctt tggtgtcatc tagtcgagtc ctctcattag taaaggagca aagtgaaacc tgggggagga gaaggacttc cctcaggttg cacagctgtt taggctatag aatattgatg tgtgaaacca ttattgataa tgcctagtag atcacatgtc aatgaacttg aaccccaaag atggtcgtga tgctttgcca aacccgcaca ctgccaaccc ctctactctc cacctcagcc cccacccaca tctcccagag tattgcaatt cagaacattt gggtcaaggt ggagcaaggc actgacagtg gccccacagg gcatgtgtca ctaatcactg tcccatggtc tacgcacggc atctggctgc tctgtctact gtgacttctt cctgtgtaat ctcagtgggg cccgtgtcca cccacacatc gtgacccaca taggggagag gttgcttttc ttttgtgggc tgagagtagg acaatgcaaa tgaatgatct ctagtagaca gaaaagaact tggtctcttt tttaaaattt caaagagcca gaagttctat gcctccttca aagtaggcag aacaacgcag ccaagatcta ctgtctgcca tgctctgtgc aatgaagtct gcaggcctga ggaccatgta ctgctgtcct tcctcagagc tctgcacaaa cactgccaag tcctgaagac gcattccttt cctgccaacc tctttccaga taagcccttg aggtctcggg ctgacctaca cacacacaca cacacacaca cacacacacc cccacacaca cacacacgac agagaacatg ccataaacat ccttgaaccc atgcaggaaa gcccatccca tattctgaaa aaatgccaaa ttaggttttt ctttcttttt ggaaatcagt cattacagta accgaaacca ttgggttcag cgaaaatgga aagatttagc tgaatgtagt cagtccaatt aagttggatg caactgagtg atttagttgc ttgggtaacc cagtgcttgc ttgctttctt cattctctgg gtggaaacta agatcaagac acatgtttgg ggataagtta aatgtctgag ctattttgct cggtttatcc taagagaact ttattatggg atgaggaggt gacccaagat gagaagtgga gggggacagc gatgttttct aaacatcgtc cagtgttgac tggcttcctt actttgcaca gtgaacacaa ctaaccacat taattcagct ttgtgaagtc cctgctctct gtgggtctat gagtcagcag caacattggc ctaacctccg tcccagcctc ctggctcacc acatgtgtac agtgctgttt gcagttgtac tcattatcca tccatctctc tgccatcccc aagcatcgct gggtgtaaaa cgcaaactct ccaccgacac tgccatgcgt ggtcatgtct tgatgccttc aggggctcag tagctatcaa agaggcctgg agggcctggg caggcttgac gatgcctgac cgagttcaag acccacaccc tgtagcaata ccaagtgcta ttacataatc aatggacgat ttatactttt attttttatg attatttgtt tctatattgc tgttagaaaa agtgaaataa aaatacttca aaagaagata tccatataaa aataaaa (서열번호 2)
상기 바이오마커 단백질 및 이를 암호화하는 유전자의 구체적인 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열은 공지의 데이터베이스인 NCBI 등에서 확인할 수 있다.
본 발명의 용어 "바이오마커"는 생물학적 현상의 존재와 정량적 또는 정성적으로 연관된 분자를 의미하며, 본 발명의 바이오마커는 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성 여부를 판단하는 기준이 되는 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 지칭한다. 바이오마커는 게놈 뉴클레오타이드 서열로부터 또는 발현된 뉴클레오타이드 서열로부터(예를 들어, RNA, nRNA, mRNA, cDNA 등으로부터), 또는 암호화된 폴리펩티드로부터 유래될 수 있다. 이 용어는 바이오마커 서열에 상보적이거나 이에 플랭킹된 핵산 서열, 예컨대 상기 바이오마커 서열을 증폭시킬 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍으로 사용된 핵산을 포함한다.
본 발명에서 상기 "발현(expression)"은 단백질 또는 핵산이 생성되는 것을 의미한다. "단백질"은 "폴리펩타이드(polypeptide)" 또는 "펩타이드(peptide)"와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다. "폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)" 또는 "핵산"은 단일 또는 이중 가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오타이드(DNA) 또는 리보뉴클레오타이드(RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오타이드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다. "mRNA"는 단백질 합성 과정에서 특정 유전자로부터 아미노산 서열을 특정하게 되는 리보솜으로 유전 정보(유전자 특이적 염기 서열)를 전달하는 RNA를 의미한다.
상기 제1 측면과 관련하여, 본 발명은 FAM167A 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 암호화하는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 만성 골수성 백혈병 환자에서 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 진단하기 위한 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 개체(subject)의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 개체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 개체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 개체의 상태를 모니터링하는 것)를 포함한다.
본 발명에 있어서, 용어 "내성"은 "저항성"이라고도 하며, 해당 약물에 대하여 민감하게 반응하지 아니하여 약물의 효능이 작용하지 않는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, "FAM167A 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제"란, 본 발명의 바이오마커 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 확인하기 위하여 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 바람직하게는 상기 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 앱타머일 수 있거나, 또는 상기 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 FAM167A 단백질의 단편은 면역원성 단편일 수 있으며, 바람직하게는 상기 단백질에 대한 항체에 의해 인식될 수 있는 하나 이상의 에피토프(epitope)를 가지고 있는 단편일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 전술한 바이오마커에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현 벡터에 클로닝하여 상기 바이오마커 유전자가 암호화하는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩타이드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩타이드로는, 최소한 7개의 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 이러한 본 발명의 바이오마커 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 항체는 당업계의 공지된 방법으로 제조될 수 있는 모든 항체가 될 수 있다. 예를 들어, 전술한 바이오마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 상기 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서, 용어 "앱타머"란 단일가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 항체와 유사한 기능을 가져 화학적 항체(chemical antibody)로도 불리며, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 상기 앱타머는 그 염기 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가질 수 있으며, 항원-항체 반응과 같이 특정 물질에 대하여 높은 친화력을 가질 수 있다. 앱타머는 소정의 표적 분자에 결합함으로써 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다.
본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 변형된(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 그 형태가 직쇄상 또는 환상(環狀)일 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 상기 3종의 바이오마커 단백질 각각에 결합 활성을 갖는 앱타머는 각 염기 서열을 참조하여 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 공지의 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3` hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 주형의 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 본 발명에서는 전술한 바이오마커 폴리뉴클레오타이드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 CML 환자의 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명에서 용어, "프로브(probe)"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드 프로브, 단일 사슬 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중 사슬 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 전술한 바이오마커 폴리뉴클레오타이드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 만성 골수성 백혈병 환자의 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명에서 이용되는 바이오마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제의 염기서열은, 생물학적으로 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 바이오마커 유전자에 특이적으로 결합하는 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기 용어, "실질적인 동일성"은 특정 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 정렬하고(align), 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 정렬된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 동일성, 더욱 구체적으로 70%의 동일성, 더더욱 구체적으로 80%의 동일성, 가장 구체적으로 90%의 동일성을 나타내는 서열을 의미한다.
본 발명의 키트는 RT-PCR 키트, 경쟁적 RT-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, 마이크로어레이 키트, SAGE(Serial Analysis of Gene Expression) 키트, 유전자 칩 키트, ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적인 예로, 상기 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 예를 들어, RT-PCR 키트는, 바이오마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양함), 디옥시뉴클레오타이드(dNTPs), 디디옥시뉴클레오타이드(ddNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 DNA 또는 RNA에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트에는 핵산(예를 들면, 총 RNA)을 추출하기 위한 키트, 표지용 형광물질, 핵산 증폭용 효소 및 배지, 사용 설명서 등을 포함시킬 수 있다.
본 발명의 키트는 상기 핵산이, 예를 들면 고상에 결합 또는 부착된 췌장암에 대한 바이오마커 측정을 위한 디바이스이다. 고상의 재질의 예는 플라스틱, 종이, 유리, 실리콘 등이며, 가공의 용이함으로부터 바람직한 고상의 재질은 플라스틱이다. 고상의 형상은 임의이며, 예를 들면 사각형, 원형, 직사각형, 필름형 등이다.
상기 키트는 데이터 분석 또는 통계처리를 할 수 있는 프로그램을 더 포함할 수 있다. 상기 프로그램은 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 분석하는 것일 수 있다. 상기 데이터 분석 또는 통계처리 프로그램은 Skyline Software, ProteoWizard Software, SCIEX OS Software, SPSS Statistics Software, MedCalc Software, MultiQuant Software, MasterView Software 또는 Cliquid Software 중에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서는 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 나타내는 세포에서 상향 조절되는, 이전에 특성화되지 않은 단백질인 FAM167A를 확인하였고, 임상 샘플 분석 결과에서도 FAM167A가 TKI 치료 후뿐만 아니라 CML 진단 시점에도 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성 환자의 세포에서 상향조절되는 것을 확인하였는 바, 상기 바이오마커 단백질을 이용하여 CML 환자의 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 진단할 수 있다.
따라서, 본 발명의 제2 측면은 FAM167A 바이오마커를 이용한, 만성 골수성 백혈병 환자의 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 진단하기 위한 정보제공방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "정보제공방법(method for providing information)"이란, CML 환자의 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성 여부에 관한 정보를 제공하는 방법으로서, 본 발명에 따른 바이오마커 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성이 없는 CML, 다르게는 TKI 민감성 CML에 비해 증가되었을 때, BCR-ABL 비의존성 TKI 내성에 대한 정보를 획득하는 방법을 의미한다.
구체적으로, 본 발명에 따른 만성 골수성 백혈병 환자의 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 진단하기 위한 정보제공방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 만성 골수성 백혈병 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 FAM167A 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된 발현 수준을, BCR-ABL 비의존성 TKI 내성이 없는 만성 골수성 백혈병 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 동일한 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준과 비교하는 단계.
본 발명의 정보제공방법은 (c) 상기 (a) 단계의 만성 골수성 백혈병 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 FAM167A 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이, 상기 (b) 단계의 BCR-ABL 비의존성 타이로신 키나아제 억제제 내성이 없는 만성 골수성 백혈병 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 동일한 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준보다 높은 경우, BCR-ABL 비의존성 TKI에 내성을 나타내는 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 정보제공방법에 있어서, 상기 만성 골수성 백혈병 환자는 BCR-ABL 비의존성 TKI에 내성을 진단하고자 하는 대상으로, 환자의 대상은 인간, 침팬지를 포함한 영장류, 개, 고양이 등의 애완동물, 소, 말, 양, 염소 등의 가축동물, 마우스, 래트 등의 설치류 등의 포유동물을 포함하는 의미로 해석된다.
본 발명의 정보제공방법에 있어서, 분석을 위해 사용되는 "생물학적 시료"는 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성이 없는 CML 환자, 다르게는 TKI 민감성 CML 환자와 구별될 수 있는, BCR-ABL 비의존성 TKI 내성 진단에 특이적인 바이오마커 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 수준을 확인할 수 있는 생체 시료를 포함한다. 예를 들어, 상기 생체 시료는 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성 여부를 판별하고자 하는 CML 환자로부터 분리된 CD34+ 줄기세포/전구세포를 포함하는 생체 시료를 의미할 수 있으며, 예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 점액, 타액, 눈물, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 또는 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 정보제공방법에 있어서, 상기 바이오마커의 발현 수준은 FAM167A 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준에서 측정할 수 있고, 생물학적 시료에서 단백질 또는 mRNA의 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어, "단백질 수준 측정"이란 시료에서 상기 바이오마커 단백질 또는 이의 단편의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 단백질 또는 이의 단편에 대하여 특이적으로 결합하는 항체 등을 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbentassay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), 질량분석법(mass spectrometry), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 또는 단백질 칩 방법(protein chip technology) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 용어, "mRNA 수준 측정"이란 시료에서 본 발명의 바이오마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(northern blotting), 서던 블랏팅(southern blotting) 인시츄(In situ) 교잡법 또는 DNA 칩(DNA chip technology) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 바이오마커 유전자의 mRNA 발현 수준은 혼성화법 또는 유전자 증폭방법으로 측정될 수 있다. 상기 혼성화법은 프로브를 이용하여 유전자의 존재를 확인하는 것일 수 있다.
본 발명의 정보제공방법이 혼성화 방식 중 마이크로어레이 방식으로 실시되는 경우, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화 된다. 바람직한 기질은 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기의 기질 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예컨대, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데하이드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.
한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 변경할 수 있다. 또한, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.
프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5(Pharmacia)), TdT(terminal deoxynucleotidyl transferase), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 또는 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.
프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이러한 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다.
혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다.
본 발명에서는 FAM167A를 중화하면 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성이 있는 세포에서 TKI 민감성이 회복되고, 마우스 종양 모델에서 TKI 내성이 역전되는 것을 확인하였는 바, FAM167A 단백질 바이오마커를 타겟으로 하는 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 나타내는 CML에 대한 치료제 및 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성 억제제를 제공할 수 있다.
따라서, 본 발명의 제3 측면은 FAM167A 단백질 억제제; FAM167A 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 억제제; 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는, BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 나타내는 CML 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 CML 환자의 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성 억제용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 FAM167A 단백질 억제제는 FAM167A 단백질의 발현을 감소시키거나, 기능 또는 활성을 감소시키는 제제를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 FAM167A 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 억제제는 FAM167A 유전자의 mRNA 발현을 감소시키는 제제를 포함할 수 있다.
상기 FAM167A 단백질 억제제는 FAM167 단백질과 결합하여 비표준 NF-κB 활성을 감소시키는 펩타이드 또는 화합물 등일 수 있다. 이러한 억제제는 단백질 구조 분석 등의 하기 예시된 스크리닝 방법을 통해 선정될 수 있으며, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 설계될 수 있을 것이다.
구체적으로, 상기 FAM167A 단백질 억제제는 FAM167A 단백질에 특이적으로 결합하는 저분자 화합물, 펩타이드, 펩타이드 미메틱스(mimetics), 앱타머, 항체 및 천연물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 FAM167A 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 억제제는 유전자 자체에 결합하여 전사를 방해하거나 유전자로부터 전사된 mRNA에 결합하여 mRNA의 해독을 방해하는 저해제일 수 있다. 예를 들어, 상기 유전자의 발현 억제제는 FAM167A 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA 및 shRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 용어 "siRNA"는 표적 유전자의 mRNA의 절단을 통해 RNA 간섭현상을 유도하는 이중사슬 RNA를 의미하며, 표적 유전자의 mRNA와 같은 서열을 가지는 센스 서열의 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 서열의 RNA 가닥으로 구성된다.
상기 siRNA는 시험관 내에서 합성한 siRNA 자체 또는 siRNA를 코딩하는 염기서열을 발현벡터에 삽입하여 발현되는 형태를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 "벡터"는 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈 내로 삽입된 외부 DNA를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 말한다.
본 발명과 관련된 벡터는 상기 유전자를 억제하는 핵산 서열이 게놈 내로 삽입된 벡터로서, 이들 벡터는 DNA 벡터, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 효모 벡터, 또는 바이러스 벡터를 예로 들 수 있다.
또한, 상기 안티센스는 FAM167A 유전자 또는 이의 단편으로부터 전사되는 mRNA 서열 전체 또는 일부와 상보적인 서열을 지니고, 상기 mRNA와 결합하여 상기 FAM167A 유전자 또는 단편의 발현을 억제할 수 있다.
또한, 상기 shRNA(short hairpin RNA)는 인간 또는 마우스의 shRNA 공통 염기서열 부위를 타겟으로 하여 통상의 방법에 따라 제작된 것을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 나타내는 만성 골수성 백혈병은 TKI 민감성을 나타내는 CML에 비해 NF-κB 활성이 증가될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 TKI와 병용 투여될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "병용 투여"는 상이한 성분이 대상에 함께 투여되는 것을 의미한다. 상이한 성분이 함께 투여된다는 것은 원하는 치료 효과를 얻기 위해서, 각 성분을 동일한 시간에 또는 임의의 순서로 또는 상이한 시간에 순차적으로 투여될 수 있음을 의미한다.
따라서, 본 발명의 약학 조성물은 TKI와 동시에(simultaneous), 별도로 (separate) 또는 순차적(sequential)으로 투여될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 TKI는 크리조티닙(crizotinib), 세리티닙(ceritinib), 알렉티닙(alectinib), 브리가티닙(brigatinib), 보수티닙(bosutinib), 다사티닙(dasatinib), 이마티닙(imatinib), 닐로티닙(nilotinib), 포나티닙(ponatinib), 이브루티닙(ibrutinib), 카보잔티닙(cabozantinib), 게피티닙(gefitinib), 엘로티닙(erlotinib), 라파티닙(lapatinib), 반데타닙(vandetanib), 아파티닙(afatinib), 오시메르티닙(osimertinib), 룩소리티닙(ruxolitinib), 토파시티닙(tofacitinib), 엑시티닙(axitinib), 렌바티닙(lenvatinib), 닌테다닙(nintedanib), 파조파닙(pazopanib), 레고라페닙(regorafenib), 소라페닙(sorafenib) 또는 수니티닙(sunitinib)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 용어 "예방" 및/또는 "치료"는 질병 또는 병증의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위, 질병 또는 병증 상태를 호전 또는 이롭게 변경하는 모든 행위, 및 질병 또는 병증의 진행을 지연, 중단 또는 역전시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로, 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있다.
경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 담체는 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예를 들어, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예를 들어, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예를 들어, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨카 르복시메틸셀룰로오스, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건 조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 전신 또는 국소적으로 투여될 수 있으며, 이러한 투여를 위해 공지의 기술로 적합한 제형으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 부형 제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방, 억제 또는 경감 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
상기 제3 측면과 관련하여, 본 발명은 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 나타내는 CML 환자에게 FAM167A 단백질 억제제, FAM167A 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 억제제 또는 이들의 혼합물을 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 나타내는 CML의 치료 방법 및 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성의 억제 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 방법에 사용되는 FAM167A 단백질 억제제 또는 FAM167A 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 억제제 및 이의 투여 방법은 전술한 바와 같으므로, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
한편, 상기 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 나타내는 CML 환자의 대상은 상기 정보제공방법에서 설명된 환자의 대상과 동일하므로, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명에서는 FAM167A를 중화하면 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성이 있는 세포에서 TKI 민감성이 회복되고, 마우스 종양 모델에서 TKI 내성이 역전되는 것을 확인하였는 바, FAM167A 단백질 바이오마커의 억제 여부에 따라 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 나타내는 CML의 치료제 및 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성 억제제로 판단할 수 있는 기준을 제공한다.
따라서, 본 발명의 제4 측면은 FAM167A 바이오마커를 이용한, BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 나타내는 CML의 치료제 또는 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성 억제제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명의 스크리닝 방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다:
(a) BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 나타내는 세포주 또는 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계; 및
(b) 상기 후보물질이 처리된 세포주 또는 동물모델에서 FAM167A 단백질의 억제 여부 및/또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자 발현의 억제 여부를 확인하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 후보물질은 통상적인 선정방식에 따라 FAM167A 유전자 염기서열에서 mRNA, 단백질로의 전사, 번역을 억제하는 물질 또는 FAM167A 단백질의 기능 또는 활성을 억제하는 의약으로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 펩타이드, 기타 추출물, 천연물, 화 합물 등이 될 수 있다.
이후, 후보물질이 처리된 세포주 또는 동물모델로부터 분리된 생물학적 시료에서 상기 유전자의 발현량, 단백질의 수준 또는 활성을 측정할 수 있으며, 측정 결과, 상기 유전자의 발현량, 단백질의 수준 또는 활성이 감소하는 것이 측정되면 상기 후보물질은 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 나타내는 CML의 치료제 및 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성 억제제로 판단할 수 있다.
따라서, 본 발명의 스크리닝 방법은 (c) 상기 후보물질이 FAM167A 단백질을 억제하거나, 상기 단백질을 암호화하는 유전자 발현을 억제하는 경우, 상기 후보물질을 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 나타내는 CML의 치료제 또는 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성 억제제로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기에서 유전자의 발현량, 단백질의 수준 또는 활성을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있으며, 상기 정보제공방법에서 설명한 바와 동일하므로, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명에 있어서, 상기 후보물질은 이후의 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 나타내는 CML의 치료제 및 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성 억제제의 개발 과정에서 선도물질(leading compound)로서 작용하게 되며, 선도물질이 FAM167A 유전자 또는 이로부터 발현되는 단백질의 기능을 억제시키는 효과를 나타낼 수 있도록 그 구조를 변형시키고 최적화함으로써, 새로운 CML의 치료제 및 TKI 내성 억제제를 개발할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 단, 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는바, 이하에서 기술하는 특정 실시예 및 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발 명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니다. 본 발명의 범위는 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
TKI-내성 CML 세포에서 차등 발현되는 유전자 및 이를 조절하는 전사 인자의 확인
1-1. 세포 배양
인간 CML 세포주 K562S는 한국세포주은행에서 입수하였다. KCL22S는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 입수하였다. K562R 세포주는 K562S로부터 TKI의 농도를 점진적으로 증가시켜 세포에 처리함으로써 생성되었다. 모든 세포주는 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 37 ℃ 및 5% CO2로 유지되었고, 10% 소태아혈청(HyClone), 100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신이 보충된 RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 1640 배지(HyClone)에서 배양되었다. TKI 내성을 유지하기 위해 K562R 및 KCL22R 세포를 1μM 이마티닙이 보충된 배지에서 배양하였다.
1-2. 마이크로어레이 및 RNA-seq 분석
BCR-ABL 키나아제 도메인의 돌연변이를 수반하지 않는 TKI 내성(즉, BCR-ABL 비의존성 TKI 내성)은 잘 알려져 있지 않다. 이에 따라, 본 발명자들은 TKI-내성 CML 세포에서 차등 발현되는 유전자를 확인하여 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성에서 잠재적인 역할을 하는 유전자를 찾으려고 하였다(도 1a). 따라서, BCR-ABL 키나아제 도메인에 돌연변이가 없는 TKI 내성 CML 세포주인 K562R(도 1b 내지 도 1e)을 상기 실시예 1-1과 같이 생성한 다음, TKI 민감성 K562S 세포, K562R 세포 및 이마티닙으로 처리된 K562R 세포에서 유전자 발현을 분석하였고, 분석 방법으로 인한 위양성을 제거하기 위해 마이크로어레이 및 RNA 시퀀싱(RNA-seq) 분석을 모두 수행하였다.
마이크로어레이 및 RNA-seq 분석 방법은 다음과 같다. 총 RNA는 TRI 시약(Molecular Research Center)로 추출하였다. 마이크로어레이의 경우, Illumina TotalPrep RNA 증폭 키트(Ambion)를 사용하여 cDNA 및 비오티닐화된 cRNA의 합성을 수행하였다. 표지된 cRNA를 Human HT-12 v4 Expression BeadChip(Illumina)에 혼성화하고 어레이를 Bead Array Reader 공초점 스캐너(Illumina)로 스캔하였다. RNA-seq의 경우, Illumina TruSeq 프로토콜에 따라 TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit(Illumina)를 사용하여 라이브러리를 준비하였다. NovaSeq 6000 시스템(Illumina)을 사용하여 페어드 엔드 시퀀싱(paired-end sequencing)을 수행하였다. 배수 변화 ≥ 2를 나타내는 유전자는 Multiple Experiment Viewer에서 생성된 히트맵에 차등적으로 표현되고 표시되는 것으로 정의된다.
K562S와 K562R 사이에서 789개의 차등 발현된(즉, 배수 변화 ≥ 2) 유전자가 엄격하게 선택되었다(도 1f 및 1g).
1-3. 인실리코( in silico ) 분석
차등 발현된 유전자를 식별하는 것 외에도, BCR-ABL 비의존성 내성 CML 세포에서 특이적으로 차등 발현된 유전자를 조절할 수 있는 전사 인자를 밝혀내고자 하였다. 활성화된 전사 인자의 인실리코(in silico) 분석을 위해, GeneCards 데이터베이스(https://www.genec ards.org/)에서 차등적으로 발현되거나 무작위로 선택된 유전자 프로모터에서 각각의 결합 부위와 관련된 전사 인자에 대한 정보를 얻었고, 플롯은 Cytoscape를 사용하여 생성하였다. 전사 인자의 농축 스코어는 다음 등식을 사용하여 계산하였다:
농축 스코어 = (차별적으로 발현된 유전자와 관련된 전사 인자의 비율)/(무작위로 선택된 유전자와 관련된 전사 인자의 비율) × (전사 인자와 관련된 차별적으로 발현된 유전자의 수).
BCR-ABL 비의존성 TKI 내성 CML 세포의 차등 유전자 발현에 관여하는 전사 인자의 인실리코(in silico) 분석을 통해 AP-1 및 NF-κB가 무작위로 선택된 유전자와 비교하여 차등 발현된 유전자의 조절자 중에서 가장 풍부한 전사 인자임을 밝혔다(도 1h 내지 1k). AP-1과 NF-κB는 다른 전사 인자에 비해 현저하게 높은 농축 스코어를 보였으며, 이 두 전사 인자에 대한 스코어만 평균에서 3 표준 편차를 벗어났다.
1-4. 루시페라아제 리포터 분석
TKI 내성 세포주에서 AP-1과 NF-κB 활성의 차이를 확인하기 위해, K562R 세포, K562S 세포 및 이마티닙이 처리된 K562R 세포에서 AP-1 및 NF-κB 리포터 어세이를 수행하여 TKI 치료의 효과를 조사하였다.
이를 위해, K562S 및 K562R 세포는 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 사용하여 문헌 [Park SG, Schulze-Luehrman J, Hayden MS, Hashimoto N, Ogawa W, Kasuga M, et al. The kinase PDK1 integrates T cell antigen receptor and CD28 coreceptor signaling to induce NF-kappaB and activate T cells. Nat Immunol. 2009;10(2):158-66.]에 기재된 레닐라 루시페라아제(Renilla luciferase) 벡터와 NF-κB 의존성 리포터 컨스트럭트(pBIIx-luc) 또는 문헌 [Zhang D, Zhang G, Hayden MS, Greenblatt MB, Bussey C, Flavell RA, et al. A toll-like receptor that prevents infection by uropathogenic bacteria. Science. 2004;303(5663):1522-6.]에 기재된 AP-1 의존성 리포터 컨스트럭트(AP-1-luc)와 기타 플라스미드로 동시 형질감염시킨 다음, 각 문헌에 지시된 바와 같이 처리하였다. 형질감염 24시간 후 Dual-luciferase Reporter Assay Kit(Promega)를 사용하여 루시페라아제 활성을 측정하고, 레닐라 루시페라아제 활성으로 정규화하였다.
결과는 AP-1이 아닌 NF-κB 활성이 K562S 세포보다 K562R 세포에서 유의하게 더 높았음을 보여주었다. 또한, 이 활성은 이마티닙으로 처리된 K562R 세포에서 훨씬 높았지만, AP-1 활성에는 유의한 차이가 없었다(도 1l). 이는 NF-κB가 유전자 발현을 조절함으로써 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성에 기여한다는 것을 시사한다. 또한, K562R 세포에서 증가된 NF-κB 활성과 관련된 유전자를 확인하기 위해, K562S, K562R 및 이마티닙으로 처리된 K562R 세포의 유전자 발현 프로파일 데이터를 사용하여 패턴 NF-κB 활성과 유사한 발현 양상을 보인 7개의 차등 발현 유전자(FAM167A, AIF1L, ACSS1, S100A4, LY6G6D, CYP11A1 및 NR5A1)를 선택하였다.
1-5. 정량적 역전사 PCR(qRT-PCR)
선택된 유전자의 발현 수준을 확인하기 위해 qRT-PCR을 수행하였다. RNeasy Mini Kit(Qiagen)를 사용하여 총 세포 RNA를 분리하고, TOPscript RT Drymix(Enzynomics)로 cDNA를 준비하였다. qRT-PCR은 Stratagene Mx3000P(Agilent Technologies)에서 SYBR Green qPCR 2x Premix(Enzynomics)를 사용하여 수행되었다. 결과는 GAPDH 수준으로 정규화되었다. qRT-PCR에 사용된 프라이머 서열은 표 1에 나타내었고, qRT-PCR 결과는 도 1m에 나타내었다.
프라이머 서열 서열번호
FAM167A-F 5′-GCA CAG TGA ACA CAA CTA ACC-3′ 3
FAM167A-R 5′-CTT GGG GAT GGC AGA GAG AT-3′ 4
S100A4-F 5′-TCT TGG GGA AAA GGA CAG ATG-3′ 5
S100A4-R 5′-CAT TTC TTC CTG GGC TGC TTA-3′ 6
CYP11A1-F 5′-TTC CTG CCA AGA CAC TGG TG-3′ 7
CYP11A1-R 5′-GAT CCG CCG TCC CAG ACA-3′ 8
ACSS1-F 5′-TTG GAG GTC TGG ATC CAG TC-3′ 9
ACSS1-R 5′-GAC AAA CTC TCC CTC CCC TA-3′ 10
LY6G6D-F 5′-TAC CTG GAA ACC CCC CAG T-3′ 11
LY6G6D-R 5′-TGC CTG CAG GGG CCA CAT-3′ 12
NR5A1-F 5′-TTC AGC CTG GAT TTG AAG TTC-3′ 13
NR5A1-R 5′-CTT GTG GTA CAG GTA CTC C-3′ 14
AIF1L-F 5′-AGG GTC TCA AGA GTT GTC CC-3′ 15
AIF1L-R 5′-ATA CTT GGC AGT CCT CAC GTT-3′ 16
GAPDH-F 5′-GGA GCG AGA TCC CTC CAA AAT-3′ 17
GAPDH-R 5′-GGC TGT TGT CAT ACT TCT CATG-3′ 18
비표준 NF-κB 경로에서의 FAM167A 역할
2-1. 선택된 유전자의 루시페라아제 리포터 분석
선택된 유전자를 스크리닝하기 위해, 표시된 유전자를 암호화하는 플라스미드로 형질감염된 K562S 세포에서 NF-κB 활성을 루시페라아제 리포터 분석으로 확인하였다. 상기 플라스미드는 HA 태그 S100A4, CYP11A1, ACSS1, LY6G6D, NR5A1, AIF1L 및 FAM167A를 MigR1 벡터에 클로닝하여 제조하였다.
7개의 선택된 유전자 중에서, FAM167A만이 이소적으로(ectopically) 발현될 때 NF-κB 활성을 유의하게 증가시켰다(도 2a). 또한, 다른 유전자와 비교하여, FAM167A의 이소성 발현은 이마티닙의 존재 하에서 K562S 세포의 생존력을 증가시켰다(도 2b). FAM167A는 분비에 대한 신호서열이 없음에도, 비고전적 단백질 분비를 예측하는 SecretomeP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/)를 이용한 생물정보학적 분석에서 FAM167A가 높은 스코어(NN-스코어 = 0.905)(도 2c의 A)를 갖는다는 것을 보여주었다.
2-2. 세포 분획 준비 및 면역블랏분석
K562R 세포 용해물 및 배양 상등액의 면역블랏분석에 의해 FAM167A의 분비를 분석하였다.
세포 용해물은 세포를 SDS 샘플 완충액에서 끓임으로써 추출되었다. 배양 상등액 내 단백질은 아세톤을 이용한 침전을 통해 농축된 후 SDS 샘플 완충액에서 끓임으로써 추출되었다.
다음으로, 면역블랏분석을 위해 단백질을 8-15% 겔에서 SDS(sodium dodecyl sulfate)-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 분리한 다음 폴리비닐리덴 다이플루오라이드(polyvinylidene difluoride) 막으로 옮겼다. 멤브레인은 지시된 바와 같이 항-FAM167A 항체(sc-393999, Santa Cruz Biotechnology) 또는 Erbin 항체(NBP2-13968, Novus Biologicals)로 프로브되었다. 분석 결과, FAM167A가 이들 세포에 의해 분비됨을 확인하였다(도 2c의 B).
2-3. FAM167A의 NF-κB 활성화 기능 확인
NF-κB 활성화 기능을 직접 테스트하기 위해, 재조합 FAM167A 단백질(MBS1363522, MyBioSource)과 FAM167A에 특이적인 중화 항체(sc-393999, Santa Cruz Biotechnology)를 사용하여 세포 배양 중 FAM167A 수준을 각각 증가 및 감소시킨 후, NF-κB 루시페라아제 리포터 분석을 수행하였다.
생물정보학적 분석 결과와 일치하여, 가용성 재조합 FAM167A로 K562S 세포를 처리하면, NF-κB 활성이 증가한 반면(도 2d), K562R 세포 배양에서 FAM167A를 중화하면 NF-κB 활성이 감소하였다(도 2e). 이는 분비된 FAM167A 단백질이 NF-κB 경로의 유도제로 기능한다는 것을 시사한다.
2-4. NF-κB 활성화 경로 확인
K562R 세포에서 어떤 NF-κB 경로가 활성화되는지 결정하기 위해, 표준 NF-κB 경로를 억제하는 SN50(481480, Sigma-Aldrich)을 처리하거나, 비표준 NF-κB 경로를 억제하는 NIK-DN을 일시적으로 발현시킨 후, NF-κB 루시페라아제 리포터 분석을 수행하였다. NIK-DN의 일시적 발현을 위해, 문헌 [Park SG, Ryu HM, Lim SO, Kim YI, Hwang SB, Jung G. Interferon-gamma inhibits hepatitis B virus-induced NF-kappaB activation through nuclear localization of NF-kappaB-inducing kinase. Gastroenterology. 2005;128(7):2042-53.]에 기재된 pFLAG-NIK-DN을 사용하였다.
표준 NF-κB 경로를 억제하는 SN50 처리는 K562R 세포에서 NF-κB 활성을 유의하게 감소시키지 않았지만, SN50 처리는 NF-κB 활성의 추가 LPS(lipopolysaccharide) 자극 증가를 차단하였다(도 2f). 대조적으로, 비표준 NF-κB 경로를 억제하는 우성-음성 NIK(NIK-DN)의 일시적인 발현은 K562R 세포에서 NF-κB 활성을 유의하게 감소시켰고, 자극 받지 않은 K562S 세포에서 관찰된 것과 유사한 수준으로 감소시켰다(도 2g).
2-5. NIK 및 p100/p52에 대한 면역블랏분석
비표준 NF-κB 활성화는 유비퀴틴화 의존형 NIK 분해의 차단을 통한 NIK 축적에 의존하며, 축적된 NIK는 p100에서 p52로의 처리를 유도하고, 이어서 p52 함유 이량체의 핵 전좌가 뒤따른다. 따라서, K562S 세포와 K562R 세포에서 NIK 및 p100/p52에 대한 면역블랏분석을 통해 K562R 세포에서 비표준 NF-κB 경로가 활성화되는지 확인하였다.
멤브레인은 지시된 바와 같이 항-NIK(4994, Cell Signaling Technology), 항-p100/p52((sc-7386 X, Santa Cruz Biotechnology) 및 GAPDH(sc-166574, Santa Cruz Biotechnology) 항체로 프로브되었다. GAPDH를 내부 표준으로 사용하는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 밀도 측정을 수행하였다.
분석 결과, p100을 p52로 처리하는 NIK의 수준 및 활성은 K562S 세포보다 K562R 세포에서 더 높았다(도 2h 및 2i).
2-6. 전기영동 이동도 분석(Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)
핵 분획은 다음과 같이 추출되었다. 먼저, 세포를 저장성 완충액(10mM HEPES, pH7.9; 10mM KCl; 1.5mM MgCl2; 0.5mM DTT; 0.5mM PMSF)에 현탁시키고, 얼음 위에서 15분 동안 배양하였다. 그런 다음, 0.05% Nonidet P-40을 첨가하고 용해물을 25-게이지 바늘에 5회 통과시켰다. 핵을 침전시키기 위해 원심분리(1000×g, 5분, 4 ℃)한 후, 상등액을 수집하고, 고속 원심분리(16,000×g, 5분, 4 ℃)로 분리하였다. 생성된 상등액은 세포질 분획으로 - 80 ℃에서 보관되었다. 세포 핵을 포함하는 펠릿을 저장성 완충액으로 세척하고, 고장성 완충액(20mM HEPES, pH7.9; 420mM NaCl; 1.5mM MgCl2; 25% 글리세롤; 0.2mM EDTA; 0.5mM DTT; 0.5mM PMSF; 1μg/ mL 류펩틴, 1 μg/mL 아프로티닌, 1 μg/mL 펩스타틴 A)에 현탁한 다음, 10분마다 볼텍싱(voltexing)하면서 얼음에서 30분 배양하였다. 핵 용해물을 원심분리(16,000Хg, 5분, 4 ℃한 후, 생성된 상등액을 핵 분획으로 -80 ℃에서 보관하였다.
슈퍼시프트 분석을 위해서는 핵 분획을 결합 완충액(5mM Tris, pH7.5; 25mM KCl; 0.5mM EDTA; 2.5% 글리세롤; 0.5mM DTT; 0.1μg/μl 폴리(dI/dC), 0.5mg/ml BSA)에서 항-p52 항체(4882, Cell Signaling Technology) 또는 아이소타입(isotype) 대조군(H9658, Sigma-Aldrich)과 함께 실온에서 20분 동안 배양한 후, 실온에서 20분 동안 비오티닐화된 이중 가닥 NF-κB 프로브(서열번호 23: 5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGG-3')와 함께 추가 배양하였다. 반응 샘플을 6% 비변성 폴리아크릴아마이드 겔을 통해 분리하고, 나일론 멤브레인으로 옮겼다. 멤브레인 상 프로브는 LightShift Chemiluminescent EMSA 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 시각화하고 ImageJ로 정량화하였다.
EMSA에서 수행된 슈퍼시프트 분석에서도 K562R 세포에서 더 높은 NF-κB 활성 및 p52 슈퍼시프트 수준이 나타났다(도 2j).
2-7. FAM167A의 비표준 NF-κB 경로 활성화 효과 확인
상기 결과를 바탕으로, FAM167A가 비표준 NF-κB 경로의 활성화를 담당하는지 여부를 확인하였다.
첫 번째로, 100ng/ml 재조합 FAM167A로 처리하고 NIK-DN을 암호화하는 플라스미드의 형질감염 후 24시간 째에 K562S 세포에서 NF-κB 루시페라아제 리포터 활성을 확인한 결과, 흥미롭게도, 재조합 FAM167A에 의해 자극된 NF-κB 활성은 NIK-DN의 일시적인 발현이 있는 세포에서 감소되었다(도 2k).
두 번째로, 2μg/ml의 항-FAM167A 중화 항체 또는 아이소타입 대조군으로 12시간 동안 처리한 후 K562R 세포에서 NIK의 면역블랏분석을 수행하였다. 상기 결과와 일치하여, FAM167A의 중화는 K562R 세포의 NIK 수준을 상당히 감소시켰다(도 2l).
마지막으로, 표시된 농도의 재조합 FAM167A로 12시간 동안 처리한 후 K562S 및 K562R 세포에서 p100/p52의 면역블랏분석을 수행하였다. 재조합 FAM167A로 K562S 및 K562R 세포를 처리하면 p100에서 p52로의 처리가 증가하였다(도 2m).
따라서, 상기 데이터는 FAM167A가 K562S 세포에서보다 K562R 세포에서 더 큰 정도로 비표준 NF-κB 경로를 활성화한다는 것을 나타낸다.
FAM167A 결합 수용체의 확인
3-1. 유세포 분석
분비된 FAM167A의 처리 및 중화가 비표준 NF-κB 경로를 효과적으로 조절함에 따라, FAM167A에 대한 수용체가 세포 표면에서 발현될 수 있다는 가설을 세웠다. FAM167A에 대한 잠재적 수용체의 발현을 평가하기 위해, 먼저 K562S 및 K562R 세포를 Myc-태그 재조합 FAM167A로 표지한 다음, 형광 염료-결합 항-Myc 항체 염색 및 유세포 분석을 수행하였다.
구체적으로, 표면 수용체 염색을 위해, 세포를 Myc-태그 FAM167A (MyBioSource)와 함께 배양한 다음 Alexa Fluor 488-접합 항-Myc 항체 (9B11, Cell Signaling Technology)로 염색하였다.
유세포 분석 및 세포 분류는 Guava EasyCyte HT (Millipore), FACSCanto II (BD Biosciences) 또는 FACSAria III (BD Biosciences)를 사용하여 수행되었으며, 데이터는 FlowJo 소프트웨어 (TreeStar)로 분석되었다.
분석 결과는 FAM167A에 대한 수용체가 세포 표면에서 발현되고, K562R 세포의 수준이 K562S 세포의 수준보다 높다는 것을 시사하였다(도 3a).
세포 표면에서 수용체의 존재를 확인한 후, 식별을 위해 수용체를 분리하기 위해 단백질 G Sepharose® 비드에 결합된 Myc-태그 재조합 FAM167A 및 항-Myc 항체를 사용하여 K562R 세포에서 수용체를 면역침천하였다(도 3b).
Myc-태그 FAM167A로 면역침전된 단백질의 은 염색은 Pierce Silver Stain Kit (24612, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 수행하였다. 은 염색 결과, FAM167A 없이 면역침전된 대조군 샘플에서도 검출된 백그라운드와 비교하여 2개의 별개의 밴드를 나타냈다(도 3c). LC-MS/MS 분석은 재조합 FAM167A로 하나의 밴드(약 30kDa)를 확인하고, 다른 밴드(약 120kDa)를 알려진 세포 부착 분자인 DSG1로 확인하였다(도 3d).
3-2. K562R 세포 용해물을 사용한 공동-면역침전
세포를 용해 완충액(20mM Tris-HCl, pH8.0; 150mM NaCl; 1% Triton X-100; 10% 글리세롤; 2mM EDTA; 1μg/ml 류펩틴; 1μg/ml; 아프로티닌; 1μg/ml 펩스타틴 A; 0.1mM PMSF)에서 얼음 위에서 30분 동안 용해시켰다. 그런 다음, 용해물을 15분 동안 15,000 xg 및 4 ℃에서 원심분리하고, 상등액을 항-FAM167A(sc-393999, Santa Cruz Biotechnology)와 함께 회전하면서 4 ℃에서 배양하였다. Protein G Sepharose® 비드(GE Healthcare)를 첨가하고 4 ℃에서 회전하면서 배양하였다. 용해 완충액으로 4회 세척한 후, 면역침전물을 SDS 샘플 완충액에 끓여서 용출시킨 다음 면역블랏분석을 하였다. 밴드 강도는 ImageJ 소프트웨어로 분석하였다.
이를 통해 FAM167A가 DSG1에 결합함을 확인하였다(도 3e).
3-3. DSG1에 대한 qRT-PCR 및 면역블랏분석
DSG1의 상향조절된 표면 발현이 총 DSG1 단백질 수준의 증가에 의해 매개된다는 것을 확인하기 위해, DSG1 mRNA 및 단백질의 발현을 각각 qRT-PCR 및 면역블랏분석으로 측정하였다. qRT-PCR에 사용된 프라이머의 서열은 표 2에 나타내었다.
프라이머 서열 서열번호
DSG1-F 5′-TGC TGG AGT TGA AAG GCA TTA-3′ 19
DSG1-R 5′-AGT GCA ATG TGA AAT GGG TCT-3′ 20
GAPDH-F 5′-GGA GCG AGA TCC CTC CAA AAT-3′ 17
GAPDH-R 5′-GGC TGT TGT CAT ACT TCT CATG-3′ 18
흥미롭게도, K562S와 K562R 세포 사이에 mRNA나 단백질의 발현에는 차이가 없었다(도 3f 및 3g). 대조적으로, DSG1의 세포 표면 발현은 K562R 세포에서 더 높았다(도 3a 및 3h).
3-4. 면역형광염색 및 NF-kB 루시페라아제 리포터 분석
면역형광염색을 위해, 고정 및 투과성 세포를 항-DSG1 항체(129204, R&D Systems)로 염색한 다음 Alexa Fluor 488-접합 항-마우스 IgG 항체(Invitrogen)로 염색하였다. 핵은 Hoechst 33342(Sigma-Aldrich) 염색으로 시각화되었다. FV1000 공초점 현미경(Olympus) 및 함께 제공되는 FV10-ASW 소프트웨어를 사용하여 공초점 이미지를 획득하였다.
또한, FAM167A를 암호화하는 플라스미드의 형질감염 및 표시된 농도의 항-FAM167A 중화 항체로 처리한 후 24시간째에 K562S 세포에서 NF-κB 루시페라아제 리포터 활성을 분석하였다.
면역형광염색 결과 및 NF-κB 루시페라아제 리포터 활성을 분석 결과를 통해, DSG1이 K562S 세포가 아닌 K562R 세포의 표면에 주로 국한되어 있음을 확인하였다(도 3i). 또한, FAM167A는 주로 K562R 세포의 표면에서 DSG1과 함께 공동국소화되었다(도 3j). FAM167A가 K562S 세포에서 이소적으로 발현되었지만, FAM167A-유도 NF-κB 활성화는 항-FAM167A 중화 항체로 처리하여 상당히 억제되었으며(도 3k), 이는 분비된 FAM167A가 비표준 NF-κB 경로를 활성화함을 나타낸다. 종합하면, 이러한 결과는 DSG1이 FAM167A의 수용체이고, 이의 표면 발현은 K562S 세포보다 K562R 세포에서 더 높다는 것을 보여준다.
FAM167A의 DSG1을 통한 NIK 유비퀴틴화 조절 확인
4-1. DSG1이 넉다운된 K562R 세포에서의 NF-κB 활성 확인
DSG1의 표면 발현은 K562S 세포보다 K562R 세포에서 더 높았기 때문에(도 3a 및 3h), K562R 세포에서 DSG1 넉다운이 비표준 NF-κB 활성을 감소시킬 수 있다는 가설을 세웠다. 이를 테스트하기 위해, K562R 세포에 DSG1-특이적 shRNA 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 컨스트럭트를 렌티바이러스로 형질도입하여 DSG1의 발현을 넉다운시킨 다음(도 4a), NF-κB 루시페라아제 리포터 분석 및 p100/p52에 대한 면역블랏분석을 수행하였다. DSG1-특이적 shRNA 렌티바이러스 입자(sc-35224-V)와 대조군 shRNA 렌티바이러스 입자(sc-108080)는 Santa Cruz Biotechnology에서 입수하여 사용하였다.
예상과 달리, DSG1 넉다운은 K562R 세포에서 NF-κB 활성과 p100의 p52로의 처리를 증가시켰다(도 4b 및 4c).
4-2. DSG1 또는 DSG1 및 Erbin이 일시적으로 발현된 세포에서의 NF-κB 활성 확인
항-FAM167A 중화 항체를 처리하거나 처리하지 않은 K562R 세포에서 DSG1과 이의 상호작용 단백질 Erbin의 일시적인 발현 후, NF-κB 활성을 측정하였다. DSG1의 일시적인 발현은 DSG을 MigR1 벡터에 클로닝한 플라스미드를 사용하여 수행하였고, Erbin의 일시적인 발현은 pClneo-Myc-Erbin(Addgene)을 사용하여 수행하였다.
NF-κB 활성은 DSG1의 일시적인 발현에 의해 감소되었고, DSG1과 Erbin 모두의 일시적인 발현에 의해 추가로 감소되었다(도 4d). 더욱이, FAM167A-중화 항체의 존재 하에 DSG1 및 Erbin의 일시적인 발현은 NF-κB 활성의 추가적인 감소를 거의 일으키지 않았다(유의하지 않음, p > 0.05)(도 4d). 이러한 데이터는 DSG1과 Erbin이 억제하는 반면, FAM167A는 동일한 경로를 통해 비표준 NF-κB를 활성화한다는 것을 보여준다.
4-3. Erbin의 발현 수준 확인
이 경로의 기본 분자 메커니즘을 더 조사하기 위해, 먼저 K562S 및 K562R 세포에서 Erbin의 mRNA 및 단백질 발현 수준을 각각 qRT-PCR과 면역블랏분석으로 확인하였다. qRT-PCR에 사용된 프라이머 서열은 표 3에 나타내었고, 면역블랏분석에는 항-Erbin 항체(NBP2-13968, Novus Biologicals)를 사용하였다.
프라이머 서열 서열번호
Erbin-F 5′-CAA GTC TCG GTG TTC CCT TT-3′ 21
Erbin-R 5′-AGA TCC ATT GTT CCG TGA GG-3′ 22
GAPDH-F 5′-GGA GCG AGA TCC CTC CAA AAT-3′ 17
GAPDH-R 5′-GGC TGT TGT CAT ACT TCT CATG-3′ 18
DSG1 mRNA 및 단백질 수준과 유사하게(도 3f 및 3g), Erbin의 mRNA 및 단백질 수준은 K562S 및 K562R 세포 간에 유의한 차이가 없었다(도 4e 및 도 4f).
4-4. 공동면역침전분석을 통한 Erbin 및 NIK 간의 상호작용 확인
NIK가 비표준 NF-κB 경로의 핵심 구성 요소이기 때문에, DSG1, Erbin 및 NIK 간의 상호작용을 조사하기 위해 공동-면역침전분석을 수행하였다.
먼저, 세포를 용해 완충액(20mM Tris-HCl, pH8.0; 150mM NaCl; 1% Triton X-100; 10% 글리세롤; 2mM EDTA; 1μg/ml 류펩틴; 1μg/ml; 아프로티닌; 1μg/ml 펩스타틴 A; 0.1mM PMSF)에서 얼음 위에서 30분 동안 용해시켰다. 그런 다음, 용해물을 15분 동안 15,000 xg 및 4 ℃에서 원심분리하고, 상등액을 항-DSG1 항체(32-6000, Invitrogen)와 함께 회전하면서 4 ℃에서 배양하였다. Protein G Sepharose® 비드(GE Healthcare)를 첨가하고 4 ℃에서 회전하면서 배양하였다. 용해 완충액으로 4회 세척한 후, 면역침전물을 SDS 샘플 완충액에 끓여서 용출시킨 다음 면역블랏분석을 하였다. 밴드 강도는 ImageJ 소프트웨어로 분석하였다.
DSG1에 대한 Erbin의 결합이 K562S 및 K562R 세포 간에 유의미한 차이가 없지만, DSG1에 대한 NIK의 결합은 K562R 세포에서 감소되었음을 보여주었다(도 4g). FAM167A가 DSG1에 대한 NIK 결합의 변화를 일으키는지 여부를 추가로 결정하기 위해, K562R 세포에서 FAM167A 단백질을 중화하고 DSG1에 대한 NIK의 결합을 평가하였다. FAM167A가 중화되었을 때, 증가된 결합을 관찰할 수 있었다(도 4h).
4-5. 면역블랏분석을 통한 NIK 유비퀴틴화 확인
NIK는 유비퀴틴화-매개 분해를 통해 조절되기 때문에, K562R 세포에서 FAM167A 중화 후 면역블랏분석을 통해 NIK 유비퀴틴화를 조사하고자 하였다.
구체적으로, 2μg/ml의 항-FAM167A 중화 항체 또는 아이소타입 대조군과 10μM MG132(474790, Sigma-Aldrich)를 3시간 동안 처리한 K562R 세포로부터의 NIK 면역침전 후 항-유비퀴틴 항체(sc-8017, Santa Cruz Biotechnology)를 사용한 NIK 유비퀴틴화를 확인하였다.
면역블랏분석은 FAM167A가 중화되었을 때 NIK의 유비퀴틴화가 증가하였음을 보여주었다(도 4i). NIK의 유비퀴틴화는 DSG1 및 Erbin과의 상호작용의 변화에 의해 조절되는 것으로 보이지만(도 4g 내지 도 4i), 이러한 단백질은 보고된 유비퀴틴 리가아제 기능이 없다. NIK 유비퀴틴화에 관여하는 리가아제를 확인하기 위해, TRAF3, CHIP 및 c-cbl을 포함하는 후보 유비퀴틴 리가아제 구성 요소에 대한 공동-면역침전분석을 수행하였다. 이때 사용된 항-TRAF3 항체(4729), 항-CHIP 항체(2080) 및 항-c-cbl 항체(2747) Cell Signaling Technology에서 구입하였다. 공동-면역침전분석 결과, 이들에 대한 상호 작용을 발견하지 못하였다(도 4j).
전반적으로, 이러한 결과는 FAM167A가 DSG1 및 Erbin에 대한 NIK의 결합을 조절함으로써 비표준 NF-κB 경로를 활성화할 뿐만 아니라, 후속 유비퀴틴화를 활성화한다는 것을 시사하며, 이는 비표준 NF-κB 활성과 DSG1의 세포 표면 발현 사이의 관계를 설명할 수 있다(도 4k).
BCR-ABL 비의존성 TKI 내성에서의 FAM167A 역할 확인
5-1. TKI 처리 후 비표준 NF-κB 경로를 억제에 따른 세포 생존율 확인
FAM167A가 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 담당하는지 여부를 조사하기 위해, 먼저 비표준 NF-κB 경로의 역할을 조사하였다. 이를 위해, 3일 동안 이마티닙(sc-202180, Santa Cruz Biotechnology) 또는 닐로티닙(17050, BioVision)으로 처리한 후 NIK-DN을 암호화하는 플라스미드로 형질감염된 K562R 세포의 생존율을 확인하였다.
세포 생존능 어세이를 위해, K562S 또는 K562R 세포를 96-웰 플레이트에 파종하고, 발현 컨스트럭트로 일시적인 형질감염 전에 지시된 바와 같이 처리하였다. 72시간 후, WST 시약(DoGenBio)을 사용하여 세포 생존율을 측정하였다.
NIK-DN의 일시적인 발현에 의해 비표준 NF-κB 경로를 억제하면, TKI가 있는 경우 K562R 세포의 생존력이 효과적으로 감소하였다(도 5a 및 5b).
5-2. TKI 처리 후 항-FAM167A 중화 항체 처리에 따른 세포 생존율 확인
추가로, 항-FAM167A 중화 항체 2μg/ml 또는 아이소타입 대조군으로 3일 동안 이마티닙 또는 닐로티닙의 존재 하에 처리한 후 K562R 세포의 생존율을 확인하기 위해 세포 생존능 어세이 및 아폽토시스 분석을 수행하였다.
아폽토시스 분석을 위해, K562S 또는 K562R 세포를 6-웰 플레이트에 파종하고 지시된 바와 같이 처리하였다. 72시간 후, 세포를 Annexin V-APC 아폽토시스 검출 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 Annexin V-APC 및 프로피듐 아이오다이드로 염색하고 Guava EasyCyte HT 세포측정기(Millipore)에서 분석히였다.
세포 생존율(WST 어세이에서) 및 아폽토시스(유세포분석으로 측정)의 분석은 FAM167A의 중화가 K562R 세포의 생존능력을 유의하게 감소시켰고(도 5a 및 5c), TKI의 존재 하에서 아폽토시스를 증가시켰다는 것을 보여주었다(도 5d). 따라서, 비표준 NF-κB 경로의 FAM167A-매개 활성화는 TKI 내성에 중요하다.
생체 내( in vivo ) BCR-ABL 비의존성 TKI 내성에서의 FAM167A 역할 확인
K562R 세포를 누드 마우스에 피하 주사하여 확립된 마우스 이종이식 모델을 사용하여 생체 내(in vivo) TKI 내성에 대한 FAM167A의 효과를 조사하였다.
6-1. 마우스 이종이식 모델 확립
K562R 세포(1Х 107)를 50%(v/v) 무혈청 마트리겔(Corning)에 현탁하고 6주령 암컷 BALB/c(nu/nu) 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 이식하였다. 종양의 크기는 캘리퍼로 측정하였고, 종양 부피는 표준 공식(너비2 × 길이/2)을 사용하여 계산하였다. 종양 부피가 100-200mm3에 도달하면, 마우스를 무작위로 그룹으로 나누고, 10일 동안 이마티닙(10mg/kg/일, 복강 내), 항-FAM167A 항체 또는 아이소타입 대조군(2mg/kg/3 일, 복강 내), 또는 비히클(식염수, PBS)로 처리하였다. 모든 동물 실험은 서울대학교 동물실험위원회(SNU-210315-6)와 광주과학기술원(GIST-2019-008)에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었다.
6-2. 항-FAM167A 중화 항체 처리에 따른 CML 치료 효과 확인
항-FAM167A 중화 항체 또는 아이소타입 대조군(2mg/kg/3일)이 있거나 없는 상태에서 비히클 또는 10mg/kg/일 이마티닙으로 처리된 마우스에서 확립된 K562R 종양의 부피(도 6b) 및 마우스의 체중(도 6c), 치료 10 일째에 각 그룹의 마우스에서 수집한 종양의 크기(도 6d) 및 중량(도 6e)을 측정하였다. 이마티닙 단독 또는 아이소타입 대조군 항체와 이마티닙의 조합과 비교하여, 이마티닙과 FAM167A 중화(항-FAM167A 중화 항체의 복강내 주사에 의해 유도됨)로 치료하면 체중 손실 없이 종양 성장이 현저하게 억제되었다(도 6b 내지 6e).
세포 수준에서 종양 성장의 차이에 대한 근거를 조사하기 위해, 면역조직화학적염색을 수행하였다. 고정 및 파라핀 포매 종양 절편을 표준 절차를 사용하여 헤마톡실린 및 에오신(HE), 항-Ki-67 항체(SP6, Abcam) 및 항-NIK 항체(Abcam)로 염색하였다. TUNEL 염색은 DeadEnd Colorimetric TUNEL System(Promega)으로 수행되었다. 이미지는 Eclipse Ti 도립 현미경(Nikon)과 함께 제공되는 NIS-Elements 소프트웨어로 캡처하였다. 정량화는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 각 필드에서 Ki-67+ 또는 TUNEL+ 세포의 수를 계수하였다. 종양 세포에서 NIK 발현을 점수화하고(강도: 0 = 음성, 1 = 약함, 2 = 보통, 3 = 강함), H 스코어를 다음 등식을 사용하여 계산하였다.
H 스코어 = 1 × (강도 1인 세포의 %) + 2 × (강도 2인 세포의 %) + 3 × (강도 3인 세포의 %).
HE 염색을 통해 종양 조직 절편을 분석한 결과, FAM167A 중화 종양에서 세포 밀도가 더 낮았다. 추가 면역조직화학염색은 NIK 및 증식 마커 Ki-67의 감소된 발현과 함께, 아폽토시스 마커 TUNEL의 증가된 수준을 보여주었다(도 6f). 종합하면, 이러한 데이터는 FAM167A를 중화하면 BCR-ABL 독립형 TKI 내성이 있는 세포에서 TKI 민감성을 회복한다는 것을 시사한다.
BCR-ABL 비의존성 TKI 내성 KCL22R 세포에서의 FAM167A 발현 확인
7-1. 세포 배양
K562R 세포 외에도, BCR-ABL 비의존성 TKI 내성 KCL22R 세포를 조사하였다. KCL22S 및 KCL22R은 ATCC(American Type Culture Collection)에서 입수하였다. 모든 세포주는 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 37 ℃ 및 5% CO2로 유지되었고, 10% 소태아혈청(HyClone), 100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신이 보충된 RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 1640 배지(HyClone)에서 배양되었다. TKI 내성을 유지하기 위해 KCL22R 세포를 1μM 이마티닙이 보충된 배지에서 배양하였다.
7-2. KCL22R 세포에서의 FAM167A 수준 확인
서열 분석을 통해 ABL 영역에 돌연변이가 없음을 확인하였다. 또한, FAM167A의 mRNA 발현 수준을 qRT-PCR로 확인한 결과, KCL22R 세포는 KCL22S 세포보다 더 높은 FAM167A 수준을 나타냈고, KCL22R 세포의 이마티닙 처리는 증가된 FAM167A 발현을 보였다(도 7).
CML 환자에서의 FAM167A 발현 확인
본 연구 결과의 임상적 중요성을 확인하기 위해, qRT-PCR을 통해 CML 환자에서 분리한 CD34+ 줄기세포/전구세포의 FAM167A 수준을 분석하였다.
8-1. 1차 인간 샘플
화순 전남대학교병원에서 CML 환자 58명 (표 4에 나열된 임상병리학적 특징)으로부터 말초 혈액 또는 골수 샘플을 채취하였다. 샘플은 진단 당시와 TKI로 치료하기 전 (진단), TKI로 치료한 후 후속 조치 시 (후속 조치)에 다시 채취하였다. 환자로부터 분리된 단핵세포는 추가 사용 전까지 액체 질소에 냉동 보관되었다. 헬싱키 선언에 따라 사전 동의를 얻었으며, 모든 절차는 서울대학교 임상심사위원회 (E2103/003-007)와 광주과학기술원 (20180629-BR-36-01-02)의 승인을 받았다. TKI 반응자와 TKI 내성 환자는 유럽백혈병네트워크 (European Leukemia Net) 지침에 따라 임상적으로 분류되었다. CML 샘플에서 BCR-ABL의 돌연변이 상태는 시퀀싱 분석에 의해 확인되었다.
환자번호 나이 성별 진단 이마티닙 저항성 1
이마티닙 반응성 환자 		BCR-ABL 돌연변이 상태 2
1 74 F CP 반응성 -
2 59 F CP 반응성 -
3 68 F CP 반응성 -
4 67 F CP 반응성 -
5 69 M CP 반응성 -
6 60 M CP 반응성 -
7 57 M CP 반응성 -
8 48 M CP 반응성 -
9 48 M CP 반응성 -
10 41 M CP 반응성 -
11 56 M CP 반응성 -
12 75 F CP 반응성 -
13 56 M CP 반응성 -
14 46 M CP 반응성 -
15 69 M CP 반응성 -
16 76 F CP 반응성 -
17 69 F CP 반응성 -
18 23 M CP 반응성 -
19 69 F CP 반응성 -
20 53 F CP 반응성 -
21 67 M CP 반응성 -
22 61 M CP 반응성 -
23 70 M CP 반응성 -
24 73 F CP 반응성 -
25 26 M CP 반응성 -
26 18 M CP 반응성 -
27 52 M CP 반응성 -
28 58 M CP 반응성 -
29 66 M CP 반응성 -
30 34 M CP 반응성 -
31 79 F CP 반응성 -
32 53 M CP 반응성 -
33 43 M CP 반응성 -
34 43 F CP 반응성 -
BCR-ABL 돌연변이가 없는 이마티닙 내성 환자
1 62 M CP 내성 돌연변이 없음
2 37 F CP 내성 돌연변이 없음
3 44 M CP 내성 돌연변이 없음
4 77 M CP 내성 돌연변이 없음
5 61 F CP 내성 돌연변이 없음
6 37 F CP 내성 돌연변이 없음
7 56 M CP 내성 돌연변이 없음
8 28 M CP 내성 돌연변이 없음
9 49 M CP 내성 돌연변이 없음
10 20 F AP 내성 돌연변이 없음
11 53 F CP 내성 돌연변이 없음
12 52 M AP 내성 돌연변이 없음
BCR-ABL 돌연변이를 포함하는 이마티닙 내성 환자
1 51 M CP 내성 Y253H
2 61 F CP 내성 G250E
3 60 F AP 내성 F359I
4 40 M BP 내성 T315I
5 43 F CP 내성 P480L
6 44 M CP 내성 H396R
7 58 M CP 내성 Y215F
8 30 M CP 내성 F317L
9 34 M CP 내성 E255K
10 61 M BP 내성 E255K
11 60 F CP 내성 T315I
12 54 M CP 내성 G250E
1이마티닙 내성은 European Leukemia Net 가이드라인에 따라 임상적으로 분류됨. 2염기서열 분석으로 BCR-ABL의 돌연변이 상태 확인함. CP: 만성기; AP: 가속기; BP: 모세포기.
데이터는 FAM167A의 발현이 이마티닙 반응성 환자 또는 BCR-ABL 의존성 이마티닙 내성 환자(각각 S 및 R 돌연변이)의 세포에서 보다 BCR-ABL 비의존성 이마티닙-내성 환자(R, 돌연변이 없음)의 세포에서 더 높았다는 것을 보여주었다(도 8a). 또한, FAM167A 수준은 치료를 받기 전(즉, 진단 시) BCR-ABL 비의존성 이마티닙-내성 환자의 세포에서 더 높았으며, 이는 FAM167A의 발현이 CML 환자에서 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 예측할 수 있음을 시사한다.
유세포 분석은 또한 DSG1의 표면 발현이 치료 전(진단)보다 이마티닙 치료 후(추적 관찰) BCR-ABL 비의존성 이마티닙 내성 환자의 세포에서 더 높았음을 보여주었다(도 8b). 종합적으로, 이러한 결과는 FAM167A 및 DSG1이 비표준 NF-κB 경로의 활성화를 통해 CML 환자에서 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성과 관련이 있음을 시사한다(도 8c).
통계 분석
각 실험의 반복 횟수는 도면에 표시되었다. 데이터는 평균 ± 표준 편차(s.d.)로 표시된다. 양측 독립표본 스튜던트 T 검정(Two-tailed unpaired Student t-test)은 통계적 유의성을 결정하는 데 사용되었다. P 값 < 0.05는 유의한 것으로 간주되었다(*P < 0.05, **P < 0.01 및 ***P < 0.001).

Claims (21)

  1. FAM167A 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는, 만성 골수성 백혈병 환자에서 BCR-ABL 비의존성 타이로신 키나아제 억제제(tyrosine kinase inhibitor, TKI) 내성을 진단하기 위한 바이오마커 조성물.
  2. FAM167A 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 만성 골수성 백혈병 환자에서 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 진단하기 위한 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 FAM167A 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 FAM167A 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 압타머를 포함하는, 만성 골수성 백혈병 환자에서 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 진단하기 위한 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 FAM167A 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머 또는 프로브를 포함하는, 만성 골수성 백혈병 환자에서 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 진단하기 위한 조성물.
  5. 제2항의 조성물을 포함하는, 만성 골수성 백혈병 환자의 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성 진단용 키트.
  6. 제5항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 경쟁적 RT-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, 마이크로어레이 키트, SAGE(Serial Analysis of Gene Expression) 키트, 유전자 칩 키트, ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인, 만성 골수성 백혈병 환자의 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성 진단용 키트.
  7. (a) 만성 골수성 백혈병 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 FAM167A 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계에서 측정된 발현 수준을, BCR-ABL 비의존성 타이로신 키나아제 억제제 내성이 없는 만성 골수성 백혈병 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 동일한 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준과 비교하는 단계;
    를 포함하는, 만성 골수성 백혈병 환자의 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 진단하기 위한 정보제공방법.
  8. 제7항에 있어서, (c) 상기(a) 단계의 만성 골수성 백혈병 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 FAM167A 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이, 상기 (b) 단계의 BCR-ABL 비의존성 타이로신 키나아제 억제제 내성이 없는 만성 골수성 백혈병 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 동일한 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준보다 높은 경우, BCR-ABL 비의존성 TKI에 내성을 나타내는 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 만성 골수성 백혈병 환자의 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 진단하기 위한 정보제공방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 점액, 타액, 눈물, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 또는 이들의 조합을 포함하는, 만성 골수성 백혈병 환자의 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 진단하기 위한 정보제공방법.
  10. FAM167A 단백질 억제제;
    FAM167A 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 억제제; 또는
    이들의 혼합물;
    을 유효성분으로 포함하는, BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 나타내는 만성 골수성 백혈병 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 FAM167A 단백질 억제제는 FAM167A 단백질에 특이적으로 결합하는 저분자 화합물, 펩타이드, 펩타이드 미메틱스, 앱타머, 항체 및 천연물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 1종 이상을 포함하는, BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 나타내는 만성 골수성 백혈병 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 상기 FAM167A 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 억제제는 FAM167A 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 나타내는 만성 골수성 백혈병 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  13. 제10항에 있어서, 상기 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 나타내는 만성 골수성 백혈병은 TKI 민감성을 나타내는 백혈병에 비해 NF-κB 활성이 증가된 것인, BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 나타내는 만성 골수성 백혈병 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  14. 제10항에 있어서, TKI와 병용 투여되는 것인, BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 나타내는 만성 골수성 백혈병 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 TKI는 크리조티닙(crizotinib), 세리티닙(ceritinib), 알렉티닙(alectinib), 브리가티닙(brigatinib), 보수티닙(bosutinib), 다사티닙(dasatinib), 이마티닙(imatinib), 닐로티닙(nilotinib), 포나티닙(ponatinib), 이브루티닙(ibrutinib), 카보잔티닙(cabozantinib), 게피티닙(gefitinib), 엘로티닙(erlotinib), 라파티닙(lapatinib), 반데타닙(vandetanib), 아파티닙(afatinib), 오시메르티닙(osimertinib), 룩소리티닙(ruxolitinib), 토파시티닙(tofacitinib), 엑시티닙(axitinib), 렌바티닙(lenvatinib), 닌테다닙(nintedanib), 파조파닙(pazopanib), 레고라페닙(regorafenib), 소라페닙(sorafenib) 또는 수니티닙(sunitinib)을 포함하는, BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 나타내는 만성 골수성 백혈병 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  16. FAM167A 단백질 억제제;
    FAM167A 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 억제제; 또는
    이들의 혼합물;
    을 유효성분으로 포함하는, 만성 골수성 백혈병 환자의 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성 억제용 약학 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 나타내는 만성 골수성 백혈병은 TKI 민감성을 나타내는 백혈병에 비해 NF-κB 활성이 증가된 것인, 만성 골수성 백혈병 환자의 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성 억제용 약학 조성물.
  18. 제16항에 있어서, TKI와 병용 투여되는 것인, 만성 골수성 백혈병 환자의 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성 억제용 약학 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 TKI는 크리조티닙(crizotinib), 세리티닙(ceritinib), 알렉티닙(alectinib), 브리가티닙(brigatinib), 보수티닙(bosutinib), 다사티닙(dasatinib), 이마티닙(imatinib), 닐로티닙(nilotinib), 포나티닙(ponatinib), 이브루티닙(ibrutinib), 카보잔티닙(cabozantinib), 게피티닙(gefitinib), 엘로티닙(erlotinib), 라파티닙(lapatinib), 반데타닙(vandetanib), 아파티닙(afatinib), 오시메르티닙(osimertinib), 룩소리티닙(ruxolitinib), 토파시티닙(tofacitinib), 엑시티닙(axitinib), 렌바티닙(lenvatinib), 닌테다닙(nintedanib), 파조파닙(pazopanib), 레고라페닙(regorafenib), 소라페닙(sorafenib) 또는 수니티닙(sunitinib)을 포함하는, 만성 골수성 백혈병 환자의 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성 억제용 약학 조성물.
  20. (a) BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 나타내는 세포주 또는 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계; 및
    (b) 상기 후보물질이 처리된 세포주 또는 동물모델에서 FAM167A 단백질의 억제 여부 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자 발현의 억제 여부를 확인하는 단계;
    를 포함하는, BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 나타내는 CML의 치료제 또는 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성 억제제의 스크리닝 방법.
  21. 제20항에 있어서, (c) 상기 후보물질이 FAM167A 단백질을 억제하거나, 상기 단백질을 암호화하는 유전자 발현을 억제하는 경우, 상기 후보물질을 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 나타내는 CML의 치료제 또는 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성 억제제로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, BCR-ABL 비의존성 TKI 내성을 나타내는 CML의 치료제 또는 BCR-ABL 비의존성 TKI 내성 억제제의 스크리닝 방법.
KR1020230028586A 2022-03-03 2023-03-03 Fam167a를 포함하는 bcr-abl 비의존성 타이로신 키나아제 억제제 내성을 진단하기 위한 바이오마커 및 fam167a를 타겟으로 하는 만성 골수성 백혈병 예방 또는 치료용 조성물 KR102615053B1 (ko)

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