KR20230130191A - 원심분리 없는 신속한 플라스미드 dna 추출 및 정제 방법 - Google Patents
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Abstract
기존의 플라스미드 DNA의 추출 및 정제 방법과 달리 단백질과 RNA 제거를 위해 화합물이나 효소를 처리하지 않고, 활성탄과 필터를 사용하여 원심분리가 필요 없는 플라스미드 DNA의 추출 및 정제 방법을 제공한다. 상기 방법은 대용량 생산도 가능하고 원심분리 단계가 없기 때문에 자동화 공정에 적합하여 유전자 치료 및 백신 등 의약품의 개발 및 생산에 널리 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 활성탄과 필터를 이용한 원심분리 없는 신속한 플라스미드 DNA 추출 및 정제방법에 관한 것이다.
플라스미드 DNA는 숙주에서 빠르게 증식하며, 항생제 처리만으로 플라스미드 DNA의 도입 이전과 도입 이후의 숙주세포 선별이 가능한 특성을 지닌 폐쇄원형분자(closed circular molecule)로서 특정 유전자의 증폭이 가능하고, 이를 벡터로 이용할 경우, 다양한 종에서 특정 유전자를 고도로 발현시킨 형질전환 유기체(GMO, genetically modified organism)의 연구 및 그의 생산이 가능하다. 아울러, 고순도 플라스미드 DNA는 DNA 증폭, DNA 염기서열 결정과 트랜스진 서브클로닝(transgene subcloning) 등 후속연구를 성공적으로 수행하기 위한 중요한 요소로, 최근에 유전자 치료분야, 백신 등 분야가 빠르게 발전하면서 그에 따라 고순도 플라스미드 DNA 분리정제 방법에 대한 수요는 더욱 증가하는 추세이다.
일반적으로 플라스미드 DNA 정제는 효율적이고, 프로토콜이 잘 정립되어 있는 알칼리 용해방법을 사용한다. 알칼리 용해방법은 세포수확, 플라스미드 DNA 추출 및 플라스미드 DNA 정제 과정을 포함한다. 첫번째 과정인 세포 수확은 원심분리방법이나 필터방법을 이용한다. 이 방법은 간단하지만 원심분리를 이용하는 방법은 플라스미드 DNA의 자동화 공정에 적합한 방법은 아니다. 두번째 과정인 플라스미드 DNA 추출은 세포를 용해시킨 뒤에 gDNA와 세포파편을 제거하는 과정을 포함한다. 세포의 용해는 라이소자임(lysozyme)을 이용하는 방법이나 글루코스를 처리하여 삼투압 충격(osmotic shock)을 이용하는 방법을 사용할 수 있다. gDNA를 제거하고 플라스미드 DNA와 분리하기 위해서는 먼저 pH의 변화를 주는 방법 또는 끓이기 방법을 통해 DNA를 변성시킨다. 그리고 다시 변성된 DNA의 이중가닥을 재생시키는 과정을 거치는데 이때 플라스미드 DNA는 다시 복구되는 반면 훨씬 복잡한 구조를 가지는 gDNA는 이중가닥으로 복구되지 못하고 불용성의 복잡한 DNA 구조를 형성하게 된다. 이후에 gDNA와 세포파편은 원심분리법, 멤브레인 필터를 이용한 필터방법, 접선유동여과(tangential flow filtration) 방법, 침전법 및 흡수법을 이용하여 제거할 수 있다. 원심분리 방법을 제외한 다른 방법들은 세포수확 후 자동화 공정에 적용될 수 있게 디자인되었고, 추출 과정만 제한적으로 자동화가 이루어졌다. 마지막으로 플라스미드 DNA 정제방법은 작은 DNA 조각, RNA, 이온 및 단백질 같은 불순물을 제거하는 것이다. 플라스미드 DNA 정제방법은 원심분리법, 크로마토그래피 방법 및 흡수법 3가지 방법을 사용하고 있다. 원심분리법은 페놀/클로로포름을 처리하고 농도구배 형성을 위해 초고속 원심분리를 수행한다. 크로마토그래피 방법은 소수성, 이온교환, 혼합형, 치환 등의 방법을 이용한다. 또한, 리간드 친화 크로마토그래피, 상용화된 키트, 다이 친화 크리오젤(Dye affinity cryogel)을 이용한 흡수법 및 친화성 크로마토그래피 방법 등이 잘 알려져 있다. 정제 단계는 후속 DNA 실험 및 활용에 특히 중요한 단계이다.
알칼리 용해방법은 최소 5번의 원심분리가 필요하고, 이러한 원심분리는 자동화 공정을 적용하는데 큰 장애물이고 시간도 많이 소요된다. 5번의 원심분리는 1) 대장균 수확, 2) 플라스미드 DNA 추출, 3) 페놀/클로로포름을 이용한 플라스미드 DNA 정제, 4) 플라스미드 DNA 회수 및 5) 염을 제거하는 추가 정제 단계로, 추가적으로 순도를 높이기 위해 더 많은 원심분리 과정이 필요할 수 있다. 플라스미드 DNA 정제를 위한 정제과정을 포함하지 않은 세포수확 과정과 플라스미드 DNA 추출과정을 자동화시킨 논문은 이미 게재되어 있지만, 아직 모든 단계를 자동화시킨 공정은 풀어야할 문제이다.
이에 본 발명자들은 자동화 공정에 적합하게 원심분리 과정이 없는 플라스미드 DNA 추출 및 정제 방법을 개발하였다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 원심분리 없는 신속한 플라스미드 DNA 추출 및 정제방법을 제공하기 위한 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에서는 (a) 미생물을 필터를 이용하여 배양액과 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 미생물을 용해하여 세포 용해물을 얻고 상기 세포 용해물을 필터로 여과시켜 세포파편과 gDNA를 제거한 제1 여과물을 얻는 단계; (c) 상기 제1 여과물에 활성탄을 넣고 필터로 여과시켜 RNA와 단백질을 제거하여 플라스미드 DNA를 포함하는 제2 여과물을 얻는 단계; (d) 상기 제2 여과물에 플라스미드 DNA를 응집시키기 위해 DNA 침전액을 넣고 필터로 여과시켜 침전된 플라스미드 DNA는 필터에 남고 염을 제거하는 단계; 및 (e) 상기 침전된 플라스미드 DNA를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA의 추출 및 정제 방법이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 플라스미드 DNA의 추출 및 정제 방법은 원심분리를 사용하지 않을 수 있다.
일 구현예에서, 상기 활성탄은 분말형태 또는 증류수에 현탁된 형태로 첨가할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 필터는 셀룰로스 나이트레이트 멤브레인(cellulose nitrate membrane)일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 (a), (b) 및 (c) 단계에서 사용한 필터의 기공 크기는 0.15 내지 0.25μm 이고, 상기 (d) 및 (e) 단계에서 사용한 필터의 기공 크기는 0.05 내지 0.15μm 일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 (d)단계의 DNA 침전액은 염을 포함하는 에탄올 또는 이소프로판올일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 (d)단계 후에 60 ~ 80% 에탄올을 처리하여 잔류 DNA 침전액을 제거하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 (e) 단계에서 TE 버퍼를 이용하여 플라스미드 DNA를 회수할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 미생물은 대장균일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 플라스미드 DNA 추출 및 정제방법은 필터와 활성탄을 사용하여 단백질과 RNA를 제거하기 위한 화합물이나 효소를 처리하지 않고, 원심분리 없이 신속하게 대용량의 플라스미드 DNA를 정제하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 원심분리 단계를 포함하지 않음으로 인해 플라스미드 DNA 추출 및 정제 과정을 완전히 자동화하여 연속적으로 수행할 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 플라스미드 DNA 추출 및 정제 과정을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 부분적인 필터 방법을 이용한 플라스미드 DNA 추출 및 정제 과정을 도식화하여 나타내고, 각 방법의 결과물을 분석한 결과이다.
도 3은 활성탄의 농도 최적화를 수행한 실험 결과이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 플라스미드 DNA 추출 및 정제 과정과 알칼리 용해방법의 결과물을 비교한 결과이다.
도 5와 도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 플라스미드 DNA 추출 및 정제 과정을 통해 정제한 플라스미드 DNA의 품질을 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 플라스미드 DNA 추출 및 정제 과정을 대용량 배양에 적용한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 부분적인 필터 방법을 이용한 플라스미드 DNA 추출 및 정제 과정을 도식화하여 나타내고, 각 방법의 결과물을 분석한 결과이다.
도 3은 활성탄의 농도 최적화를 수행한 실험 결과이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 플라스미드 DNA 추출 및 정제 과정과 알칼리 용해방법의 결과물을 비교한 결과이다.
도 5와 도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 플라스미드 DNA 추출 및 정제 과정을 통해 정제한 플라스미드 DNA의 품질을 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 플라스미드 DNA 추출 및 정제 과정을 대용량 배양에 적용한 결과이다.
이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, (a) 미생물을 필터를 이용하여 배양액과 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 미생물을 용해하여 세포 용해물을 얻고 상기 세포 용해물을 필터로 여과시켜 세포파편과 gDNA를 제거한 제1 여과물을 얻는 단계; (c) 상기 제1 여과물에 활성탄을 넣고 필터로 여과시켜 RNA와 단백질을 제거하여 플라스미드 DNA를 포함하는 제2 여과물을 얻는 단계; (d) 상기 제2 여과물에 플라스미드 DNA를 응집시키기 위해 DNA 침전액을 넣고 필터로 여과시켜 침전된 플라스미드 DNA는 필터에 남고 염을 제거하는 단계; 및 (e) 상기 침전된 플라스미드 DNA를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA의 추출 및 정제 방법을 제공한다.
상기 플라스미드 DNA의 추출 및 정제 방법은 원심분리 없이 필터와 활성탄을 활용하여 신속하게 플라스미드 DNA의 추출 및 정제가 가능하다. 소용량에서 대용량에 이르는 플라스미드 DNA를 추출 및 정제를 하기 위해서 원심분리를 하려면 초고속 원심분리가 가능한 특수한 설비가 필요하기 때문에 비용이 많이 들고, 원심분리 후 다시 샘플을 분리하는 과정이 필요하여 시간이 많이 소요되기 때문에 자동화 공정에 적합하지 않다. 따라서 상기 플라스미드 DNA의 추출 및 정제 방법은 원심분리가 필요하지 않고 신속하게 플라스미드 DNA의 추출 및 정제가 가능하기 때문에 자동화 공정에 적합하다.
상기 플라스미드 DNA의 추출 및 정제 방법에서 사용하는 활성탄은 DNA 절편, 단백질, RNA 등에 흡착하지만 플라스미드 DNA에는 거의 흡착하지 않아서 플라스미드 DNA만을 분리할 수 있다. 따라서 활성탄을 처리하게 되면 DNA 절편, 단백질, RNA 등을 제거하기 위한 과정이나 첨가액을 추가할 필요가 없어 정제 방법을 간단화 할 수 있고, 활성탄은 필터를 통과할 수 없는 크기이기 때문에 필터에 여과시킴으로써 플라스미드 DNA 만 빠르게 추출이 가능할 수 있다.
상기 활성탄을 처리하는 방법은 특별히 제한되지 않으나, 분말형태나 증류수에 현탁된 형태로 첨가할 수 있다. 바람직하게는 증류수에 현탁된 형태로 첨가할 수 있다.
상기 플라스미드 DNA의 추출 및 정제 방법에서 사용하는 필터는 친수성 소재를 사용할 수 있다. 예를 들면, 폴리에테르술폰 멤브레인, 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인, 폴리테트라플루오로에틸렌 멤브레인, 셀룰로스 아세테이트 멤브레인, 나일론 멤브레인, 혼합 셀룰로스 에스테르 멤브레인 또는 셀룰로스 나이트레이트 멤브레인일 수 있다. 바람직하게는 셀룰로스 나이트레이트 멤브레인일 수 있다.
상기 (a), (b) 및 (c) 단계에서 사용한 필터의 기공 크기는 0.15 내지 0.25μm 이고, 상기 (d) 및 (e) 단계에서 사용한 필터의 기공 크기는 0.05 내지 0.15μm 일 수 있다. 바람직하게는 (a), (b) 및 (c) 단계에서 사용한 필터의 기공 크기는 0.17 내지 0.23μm 이고, (d) 및 (e) 단계에서 사용한 필터의 기공 크기는 0.07 내지 0.13μm 일 수 있다. 더 바람직하게는 (a), (b) 및 (c) 단계에서 사용한 필터의 기공 크기는 0.19 내지 0.21μm 이고, (d) 및 (e) 단계에서 사용한 필터의 기공 크기는 0.09 내지 0.11μm 일 수 있다.
이하, 상기 플라스미드 DNA 추출 및 정제 방법을 각 단계에 따라 상세히 설명한다.
상기 (a) 단계에서 미생물을 필터를 사용하여 여과시키면 미생물은 필터를 통과하지 못하기 때문에 배양액과 미생물을 분리할 수 있다. 필터에 남아있는 미생물을 따로 회수하여 (b) 단계를 진행하거나, 회수하지 않고 필터를 재사용하여 바로 (b) 단계로 진행할 수 있다. 바람직하게는 과정의 간소화를 위하여 필터에 남아있는 미생물을 따로 회수하지 않고 바로 (b) 단계로 진행할 수 있다.
상기 (b) 단계는 분리된 미생물을 용해하는 단계를 포함한다. 상기 미생물의 용해 방법은 라이소자임(lysozyme) 처리방법, 글루코스를 처리하여 삼투압 충격(osmotic shock)을 이용하는 방법, 끓이기 방법 및 알칼리 용해(alkialine lysis)의 용해방법을 사용할 수 있다. 바람직하게는 일반적으로 많이 사용되는 알칼리 용해의 용해방법을 사용할 수 있다. 미생물을 용해시킨 세포 용해물을 필터로 여과시키면 세포파편과 gDNA는 필터에 의해 제거된 제1 여과물을 얻을 수 있다. (b)단계의 필터는 (a)단계의 필터를 재사용할 수 있다.
상기 (c) 단계에서는 상기 제1 여과물에 활성탄을 첨가할 수 있다. 활성탄은 RNA와 단백질에 흡착할 수 있고 플라스미드 DNA에는 거의 흡착하지 않아서 활성탄을 첨가한 후에 필터에 여과시키면 활성탄에 흡착된 RNA와 단백질은 필터에 남게되어 플라스미드 DNA를 포함하는 제2 여과물을 얻을 수 있다.
상기 (d) 단계에서는 상기 제2 여과물에 플라스미드 DNA를 응집시키기 위해 DNA 침전액을 첨가할 수 있다. 상기 DNA 침전액은 염이 포함된 에탄올 또는 이소프로판올을 사용할 수 있다. 바람직하게는 염이 포함된 이소프로판올을 사용할 수 있다. DNA 침전액을 첨가한 후 필터로 여과시키면 침전된 플라스미드 DNA는 필터에 남고 첨가한 염은 제거될 수 있다. 상기 (d) 단계 후에 60 ~ 80% 에탄올을 처리하여 잔류 DNA 침전액을 제거할 수 있다.
상기 (e) 단계에서는 필터에 남아있는 플라스미드 DNA를 회수할 수 있다. 상기 (d) 단계 후에 필터에 남아있는 알코올 성분을 건조시켜 제거한 뒤에 플라스미드 DNA가 잘 용해되는 물이나 TE 버퍼를 처리하여 필터에 남아있는 플라스미드 DNA를 회수할 수 있다. 바람직하게는 DNA를 장기로 보관할 수 있는 TE 버퍼를 사용할 수 있다.
상기 미생물은 대장균이나 박테리아 일 수 있다. 바람직하게는 일반적인 플라스미드 DNA 복제에 많이 사용하는 대장균 일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
<실시예>
1. 필터와 활성탄을 활용한 플라스미드 DNA 추출 및 정제 방법 디자인
일반적인 플라스미드 DNA(pDNA) 추출 및 정제에 사용되는 방법인 알칼리 용해방법에서 원심분리 단계를 필터와 활성탄(activated charcoal; AC)을 활용하여 대체할 수 있도록 디자인하였다. 일반적인 알칼리 용해방법과 디자인한 플라스미드 DNA 추출 및 정제 방법은 도 1에 도식화하여 나타내었다.
2. 알칼리 용해방법을 이용한 플라스미드 DNA 추출 및 정제
필터와 활성탄을 활용한 추출 및 정제 방법이 기존의 알칼리 용해방법을 이용한 추출 및 정제 방법과 비교하기 위하여 알칼리 용해방법을 이용하여 플라스미드 DNA를 추출 및 정제하여 결과를 비교하였다.
도1의 알칼리 용해방법을 통해 플라스미드 DNA를 정제하였다. 플라스미드 DNA는 pGNEM-3Z(Promega, USA)를 구매하여 사용하였다. 상기 플라스미드의 DNA 길이는 2,743 bp 이다. 상기 플라스미드로 형질전환 시킨 대장균을 1.5ml 배양액에서 밤새 배양하고 4도에서 12,000 rpm으로 30초 동안 원심분리하여 배양액은 제거하였다. 대장균 세포에 100 μl Sol I(50 mM glucose, 10mM EDTA, 25mM Tris-Cl(pH 8.0))을 가하여 현탁시키고, 200 μl sol II(0.2N NaOH, 1% SDS)를 가하여 볼텍싱한 후에 얼음에 5분간 두었다. 그 후에 1500 ml sol III(3M potassium acetate and glacial acetic acid)를 가하여 얼음에 5분간 두었다. 샘플을 4도 12,000 rpm으로 5분동안 원심분리하고 RNA를 제거하기 위해서 RNase(Ribonuclease A, USB, USA) 처리하였다. 플라스미드만 분리하기 위해서 페놀/클로로포름(Ph/Ch)을 가한 뒤에 4도 12,000 rpm으로 2분동안 원심분리한 뒤에 상층액만 튜브로 옮겼다. 상층액 부피의 1/10배 3M sodium acetate와 2배 에탄올(EtOH)을 넣고 얼음에 2분 동안 두었다. 그리고 4도 12,000 rpm으로 5분동안 원심분리하고 펠렛을 70% 에탄올로 워싱하고 건조시킨 뒤에 TE 버퍼로 플라스미드 DNA를 회수하였다.
3. 부분적인 필터 방법을 이용한 플라스미드 DNA 추출 및 정제
상기 알칼리 용해방법의 모든 원심분리단계에 필터 방법을 적용하기 전에 알칼리 용해방법 각각의 원심분리단계에서 필터방법을 부분적으로 적용하여 원심분리를 통해 얻은 결과와 부분적인 필터방법을 통해 얻은 결과를 비교하였다. 결과는 도2에 나타내었다.
1.5 ml 배양액으로 배양한 대장균을 첫번째 필터 F1(0.2 μm 셀룰로스 나이트레이트 멤브레인)이 있는 실린지에 넣고 배양액을 제거하였다. 분리된 대장균의 양은 유사하였다(도2의 B).
도2의 C는 gDNA와 세포파편을 제거하는 단계에서만 첫번째 필터 F2(F1 재사용)를 사용하고 다른 과정들은 알칼리 용해방법과 동일하게 진행하였다. 그 결과 알칼리 용해방법과 차이가 없었다.
도2의 D는 RNA와 단백질을 제거하는 단계에서 활성탄과 첫번째 필터 F3(새로운 F1)을 사용하고 다른 과정들은 알칼리 용해방법과 동일하게 진행하였다. 알칼리 용해방법에서는 단백질을 제거하기 위해서 독성이 있는 페놀/클로로포름과 RNA을 제거하기 위해 RNase를 처리하지만 활성탄을 이용하여 이를 대체하였다. RNase를 처리하지 않으면 RNA가 상당량 검출되지만 RNase 처리하면 전부 제거되었고, 활성탄을 처리한 후 필터해도 전부 제거됨이 확인되었다.
도2의 E는 플라스미드 DNA를 침전시키고 두번째 필터 F4(0.1 μm 셀룰로스 나이트레이트 멤브레인)를 에탄올로 워싱하는 단계에서 두번째 필터 F5(F4 재사용)를 사용하고 다른 과정들은 알칼리 용해방법과 동일하게 진행하였다. 그 결과 알칼리 용해방법과 차이가 없었다.
이를 통해 알칼리 용해방법의 원심분리 단계를 필터와 활성탄을 적용하여도 결과에는 차이가 없음을 확인하였다.
4. 활성탄의 단백질 및 RNA 제거능 확인
활성탄이 RNA와 단백질을 효율적으로 제거할 수 있는지 확인하는 실험을 수행하였다.
RNA 제거를 확인하기 위해서 상기 도2의 D방법에서 활성탄을 5, 10, 15, 20 mg으로 처리하여 결과를 확인하였다. 결과는 도3의 A에 나타내었다.
단백질 제거를 확인하기 위해서 마우스의 세럼에 활성탄을 5, 10, 15, 20 mg으로 처리하여 결과를 확인하였다. 결과는 도3의 B에 나타내었다.
상기 결과들을 통해 1.5ml 대장균 배양에서는 활성탄 15mg 이상에서 효율적으로 RNA와 단백질이 제거됨을 확인할 수 있었다.
5. 필터와 활성탄을 활용한 플라스미드 DNA 추출 및 정제 방법
필터와 활성탄을 활용한 플라스미드 DNA 추출 및 정제방법은 상기 부분적인 필터방법을 하나로 합쳐서 실시하였다. 모든 원심분리 단계가 필터링으로 대체되었지만 알칼리 용해방법과 결과는 유사하였다. 이 결과는 도4에 나타내었다.
6. 정제한 플라스미드 DNA의 품질 확인
정제한 플라스미드 DNA의 품질은 DNA 재조합(DNA recombination)과 PCR을 통해 확인하였다. DNA 재조합에서는 제한효소 처리와 준비된 대장균에 플라스미드 DNA 형질전환만 수행하였다.
정제한 플라스미드 DNA는 제한효소가 제대로 작용하는 정제수준인지 확인하기 위하여 pCMV-Inhα(6.2 kbp) 플라스미드를 이용하였다. 필터방법으로 정제한 플라스미드에 Hind III (Promega, USA) 제한효소를 처리한 뒤에 전기영동하여 확인하였다. 그 결과는 도5의 A에 나타내었다. 필터방법으로 정제하였을 때에도 제한효소가 잘 작용함을 알 수 있었다.
다음으로, 정제한 플라스미드 DNA가 형질전환을 수행하는데 적합한 정제수준인지 확인하기 위하여 DH5-α 균주에 형질전화 시킨 뒤에 암피실린이 첨가된 고체배지에 배양하였을 때에도 콜로니가 잘 형성되고 콜로니 숫자도 대조군과 유사함을 확인하였다. 그 결과는 도 5의 B, C에 나타내었다.
또한, 정제한 플라스미드 DNA는 PCR을 수행하는데 적합한 정제수준인지 확인하기 위하여 pCMV-Inhα 플라스미드는 Inhibin α 유전자를 포함하고 있기 때문에 Inhibin α 유전자를 타겟하는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 프라이머 서열은 각각 정방향 프라이머 5'-ATTCGAATTCCCCTGTCGTCAGGGCAAGTGA-3'이고 역방향 프라이머는 5'- CGACGGTCTAGAGATACAAGCACAGTGTTGTGT- 3' 이다. PCR 결과물은 1,144bp 이고, 정제한 플라스미드 DNA를 상기 프라이머로 PCR 하였을 때 PCR이 정상적으로 됨을 확인할 수 있었다. 결과는 도 6에 나타내었다.
7. 대용량 플라스미드 DNA 추출 및 정제
필터와 활성탄을 활용한 플라스미드 DNA 추출 및 정제 방법을 대용량 플라스미드 정제에 적용하였다. 대장균을 100 ml로 배양한 후에 필터와 활성탄을 이용하여 원심분리 없이 정제하였다. 활성탄을 350 ~ 550 mg 처리하였고, 진공펌프를 이용하여 필터링을 수행하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었다. 대용량 배양에서도 활성탄을 400mg 이상 처리하였을 때 원심분리 없이 효율적으로 플라스미드 DNA 추출 및 정제가 됨을 확인하였다.
상기 결과들을 통해 필터와 활성탄을 활용한 플라스미드 DNA 추출 및 정제 방법은 기존의 알칼리 용해방법과 달리 단백질 제거를 위해 독성이 있는 페놀/클로로포름과 RNA 제거를 위한 RNase를 처리하지 않고, 원심분리를 하지 않아도 높은 품질의 플라스미드 DNA를 추출 및 정제할 수 있음을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (9)
- (a) 미생물을 필터를 이용하여 배양액과 분리하는 단계;
(b) 상기 분리된 미생물을 용해하여 세포 용해물을 얻고 상기 세포 용해물을 필터로 여과시켜 세포파편과 gDNA를 제거한 제1 여과물을 얻는 단계;
(c) 상기 제1 여과물에 활성탄을 넣고 필터로 여과시켜 RNA와 단백질을 제거하여 플라스미드 DNA를 포함하는 제2 여과물을 얻는 단계;
(d) 상기 제2 여과물에 플라스미드 DNA를 응집시키기 위해 DNA 침전액을 넣고 필터로 여과시켜 침전된 플라스미드 DNA는 필터에 남고 염을 제거하는 단계; 및
(e) 상기 침전된 플라스미드 DNA를 회수하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA의 추출 및 정제 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 플라스미드 DNA의 추출 및 정제 방법은 원심분리를 사용하지 않는 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA의 추출 및 정제 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 활성탄은 분말형태 또는 증류수에 현탁된 형태로 첨가하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA 추출 및 정제 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 필터는 폴리에테르술폰 멤브레인, 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인, 폴리테트라플루오로에틸렌 멤브레인, 셀룰로스 아세테이트 멤브레인, 나일론 멤브레인, 혼합 셀룰로스 에스테르 멤브레인 또는 셀룰로스 나이트레이트 멤브레인인 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA 추출 및 정제 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (a), (b) 및 (c) 단계에서 사용한 필터의 기공 크기는 0.15 내지 0.25μm 이고, 상기 (d) 및 (e) 단계에서 사용한 필터의 기공 크기는 0.05 내지 0.15μm 인 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA 추출 및 정제 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (d)단계의 DNA 침전액은 염을 포함하는 에탄올 또는 이소프로판올인 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA 추출 및 정제 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (d)단계 후에 60 ~ 80% 에탄올을 처리하여 잔류 DNA 침전액을 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA 추출 및 정제 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (e) 단계에서 TE 버퍼를 이용하여 플라스미드 DNA를 회수하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA 추출 및 정제 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 미생물은 대장균인 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA 추출 및 정제 방법.
Priority Applications (1)
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| KR1020220026692A KR20230130191A (ko) | 2022-03-02 | 2022-03-02 | 원심분리 없는 신속한 플라스미드 dna 추출 및 정제 방법 |
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2022
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