KR20230129672A - 아욱 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물 - Google Patents
아욱 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 아욱(Malva verticillata) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물에 관한 것으로, 아욱(Malva verticillata) 추출물의 농도 의존적 산화질소(nitirc oxide) 생성 저해를 통한 항산화 작용 및 농도 의존적 iNOS 및 COX-2의 단백질 및 mRNA 발현 저해를 통한 항염 작용을 확인함으로써, 항산화 및 항염증용 약학 조성물, 건강기능식품 조성물 또는 화장료 조성물로서 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 아욱(Malva verticillata) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물에 관한 것이다.
아욱(Malva verticillata)은 기록된 문헌에 인용되는 오래된 식물 중 하나로, 한국과 중국에서 오랫동안 사용된 잎채소이다. 아욱의 씨앗은 한방에서 이뇨제, 완하제, 최유제 등을 위한 약제로 사용되어 왔다. 아욱 씨앗의 주요 성분인 다당류는 항-보체성, 면역학적 및 혈당강하 활성을 나타내는 것으로 보고되었다. 아욱의 잎 또한 한방에서 위장 및 호흡기 질환의 치료를 위한 약제로 사용되어 왔다. 이와 같이, 아욱의 화학적 성분 및 그의 생물학적 활성에 관한 연구가 활발히 진행되고 있는 상황이다.
본 발명의 목적은 아욱(Malva verticillata) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 아욱(Malva verticillata) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 약학 조성물, 건강기능식품 조성물 또는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 아욱(Malva verticillata) 추출물이 농도 의존적으로 산화질소(nitirc oxide) 생성 저해를 통한 항산화 작용 및 농도 의존적으로 염증 인자인 iNOS 및 COX-2의 단백질 및 mRNA 발현 저해를 통한 항염 작용을 확인함으로써, 항산화 및 항염증용 약학 조성물, 건강기능식품 조성물 또는 화장료 조성물로서 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 전자공여능(DPPH assay)을 통한 아욱 추출물의 항산화 활성 분석 결과를 나타낸다.
도 2는 ABTS assay를 통한 아욱 추출물의 항산화 활성 분석 결과를 나타낸다.
도 3은 아욱 추출물 처리를 통한 RAW 264.7 세포에서의 세포생존율 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 아욱 추출물 처리를 통한 RAW 264.7 세포에서의 nitric oxide 저해 활성 분석 결과를 나타낸다.
도 5는 western blot을 통한 아욱 추출물의 iNOS 및 COX-2의 단백질 발현 분석 결과를 나타낸다.
도 6은 RT-PCR 분석을 통한 아욱 추출물의 iNOS 및 COX-2의 mRNA 발현 분석 결과를 나타낸다.
도 2는 ABTS assay를 통한 아욱 추출물의 항산화 활성 분석 결과를 나타낸다.
도 3은 아욱 추출물 처리를 통한 RAW 264.7 세포에서의 세포생존율 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 아욱 추출물 처리를 통한 RAW 264.7 세포에서의 nitric oxide 저해 활성 분석 결과를 나타낸다.
도 5는 western blot을 통한 아욱 추출물의 iNOS 및 COX-2의 단백질 발현 분석 결과를 나타낸다.
도 6은 RT-PCR 분석을 통한 아욱 추출물의 iNOS 및 COX-2의 mRNA 발현 분석 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 아욱(Malva verticillata) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 약학 조성물을 제공한다.
상기 아욱 추출물은 70% 에탄올로 추출한 것을 특징으로 하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 조성물은 농도 의존적으로 산화질소(nitric oxide) 생성을 저해하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 조성물은 농도 의존적으로 iNOS 및 COX-2의 단백질 및 mRNA 발현을 저해하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물에 포함되는 첨가제의 함량은 특별히 한정되는 것은 아니며 통상의 제제화에 사용되는 함량 범위 내에서 적절하게 조절될 수 있다.
상기 약학 조성물은 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 정제, 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 외용제 형태로 제형화될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 제형화를 위해 추가로 있는 약학적으로 허용 가능한 담체 및 희석제를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체 및 희석제는 전분, 당, 및 만니톨과 같은 부형제, 칼슘 포스페이트 등과 같은 충전제 및 증량제, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등과 같은 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 알긴산염, 및 폴리비닐 피롤리돈 등과 같은 결합제, 활석, 스테아린산 칼슘, 수소화 피마자유 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제, 포비돈, 크로스포비돈과 같은 붕해제, 폴리소르베이트, 세틸알코올, 및 글리세롤 등과 같은 계면활성제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체 및 희석제는 대상체에게 생물학적 및 생리학적으로 친화적인 것일 수 있다. 희석제의 예로는 염수, 수용성 완충액, 용매 및/또는 분산제(dispersion media)를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있다. 경구 투여일 경우, 정제, 트로키제(troches), 로젠지(lozenge), 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등으로 제형화될 수 있다. 비경구 투여일 경우, 주사액, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 연고, 도포용 파우더, 오일, 크림 등으로 제형화 될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이 체질 특이성, 제제의 성질, 질병의 정도, 조성물의 투여시간, 투여방법, 투여기간 또는 간격, 배설율, 및 약물 형태에 따라 그 범위가 다양할 수 있으며, 이 분야 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예컨대, 약 0.1 내지 10,000mg/kg의 범위일 수 있으나 이제 제한되지 않으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여될 수 있다.
상기 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여되거나 비경구 투여(예를 들면, 정맥 내, 피하 내, 복강 내 또는 국소에 적용)될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 약학 유효량, 유효 투여량은 약학 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여는 하루에 1회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수도 있다.
또한, 본 발명은 아욱(Malva verticillata) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 통상적으로 이용되는 식품으로써 일반적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품으로서 사용될 수 있다. 상기 "건강기능 식품"이라 함은 건강기능 식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
상기 건강기능식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 "식품 첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품 첨가물 공전"에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다. 예를 들어, 캡슐 형태의 건강기능 식품 중 경질 캡슐제는 통상의 경질 캡슐에본 발명에 따른 조성물을 부형제 등의 첨가제와 혼합 및 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캡슐제는 본 발명에 따른 조성물을 부형제 등의 첨가제와 혼합하고 젤라틴 등 캡슐기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캡슐제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명에서 용어 “예방”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여로 질환의 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다. 본 발명에서 용어 “치료”는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다. 본 발명에서 "개선"이란 본 발명의 조성물을 개체에 투여하거나 섭취시켜 질환의 나쁜 상태를 좋게 하는 모든 행위를 의미한다.
또한, 본 발명은 아욱(Malva verticillata) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 “항산화”는 산화를 억제하는 작용을 의미하는 것으로, 인체는 산화촉 진물질과 산화억제물질이 균형을 이루고 있으나, 여러 가지 요인들로 인하여 이러한 균형 상태를 잃고 산화를 촉진하는 방향으로 기울게 되면, 생체 내에 산화적 스트레스(oxidative stress)가 유발되어 세포손상 및 병리적 질환을 유발할 수 있다.
상기 “항염”은 염증 개선 효과를 의미한다. 상기 “염증”은 생체나 조직에 물리적 작용이나 화학적 물질, 세균 감염 등의 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상부위를 수복 재생하려는 기전으로, 일단 자극이 가해지면 국소적으로 히스타민, 세로토닌, 브라디키닌, 프로스타글란딘, HETE(hydroxyeicosatetraenoic acid), 류코트리엔과 같은 혈관 활성 물질이 유리되어 혈관 투과성이 증대되면서 염증이 유발될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 수분크림, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 앰플, 젤, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 스프레이 및 파우더로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 제형화될 수 있다.
구체적으로, 상기 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화제형으로 제조할 수 있다. 예컨대, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등의 화장수; 훼이셜 로션, 바디로션 등의 유액; 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림 등의 크림; 에센스; 화장연고; 스프레이; 젤; 팩; 선 스크린; 메이크업 베이스; 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션; 파우더; 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일 등의 메이크업 제거제; 또는 클렌징 폼, 비누, 바디워시 등의 세정제로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 피부 외용제는, 연고, 패치, 겔, 크림 또는 분무제로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 화장료 조성물은 각각의 제형에 있어서 상기 필수성분 외에 제형의 종류 또는 사용 목적 등에 따라 본 발명에 따른 목적을 저해하지 않는 범위 내에서 다른 성분들이 적절히 배합될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 통상적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있으며, 예컨대 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 허용 가능한 담체는 제형에 따라 달리할 수 있다. 예컨대, 연고, 페이스트, 크림 또는 젤로 제형화될 때 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 추출물이 사용될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 파우더 또는 스프레이로 제형화될 때, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 추출물이 사용될 수 있고, 스프레이의 경우 클로로플루오로히드로카본, 프로판, 부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 더 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 용액 또는 유탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 용매, 용해화제, 또는 유탁화제가 사용될 수 있고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-브틸글리콜 오일이 사용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 사용될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 현탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리 옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 사용될 수 있다.
상기 화장료 조성물이 비누로 제형화될 때, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 사용될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 최종 제품의 품질이나 기능에 따라 업계에서 통상적으로 사용되는 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉 쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품 학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 추가적으로 함유할 수 있다.
다만, 상기 보조제 및 그 혼합 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 영향을 미치지 않도록 적절히 선택할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
[
실험예
1] 아욱 추출물 제조
1) 아욱 물 추출물(DW 추출물)
아욱을 세척하여 열풍건조 한 후 파쇄한 것을 사용하였다. 아욱 100g에 10배의 증류수를 첨가하여 100℃에서 3시간 환류 냉각 추출해 실온에서 24시간 침지한 후, 부직포로 1차 여과하여 상등액과 침전물을 분리하여 위와 같은 방법으로 3회 실시하였다. 상등액은 진공펌프와 여과지를 이용하여 여과한 후 용매를 제거하기 위해 감압 농축을 진행한 후, 완료된 추출물을 동결건조하여 -20℃에 보관하며 본 연구에 사용하였다.
2) 아욱 70% 에탄올 추출물(EE 추출물)
아욱을 세척하여 열풍건조 한 후 파쇄한 것을 사용하였다. 아욱 100g에 10배의 70% 에탄올을 첨가하여 실온에서 24시간 침지한 후 부직포로 1차 여과하여 상등액과 침전물을 분리하였다. 위와 같은 방법으로 3회 실시하였다. 상등액은 진공펌프와 여과지를 이용하여 여과한 후 용매를 제거하기 위해 감압 농축을 진행한 후, 완료된 추출물을 동결건조하여 -20℃에 보관하며 본 연구에 사용하였다.
[
실시예
1] 총 폴리페놀 함량 측정
총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법을 변형하여 측정하였다. 추출물을 증류수에 희석한 다음 2ml와 50% Folin-ciocalteu reagent 2ml를 혼합한 후 실온에 3분간 방치하였다. 그 후 10% Ca2CO3 2ml를 첨가하여 혼합 후 상온에서 1시간 동안 방치한 후, 흡광도 700nm에서 총 폴리페놀 함량을 측정하였다. 각 시료의 페놀함량을 측정한 후 시료 g당 함유하고 있는 양을 나타내었다.
그 결과, 아욱 DW 추출물은 1.4 ± 0.48mg/g, EE 추출물은 1.6 ± 0.28mg/g의 폴리페놀 함량을 확인하였다(표 1).
| 구 분 | 아욱 DW | 아욱 EE |
| Total phenolic content (mg tannic acid/g) |
1.4 ± 0.48 | 1.6 ± 0.28 |
[
실시예
2]
전자공여능
(
DPPH
assay) 측정
아욱 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위해, DPPH asssy를 실시하였다. DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) radical 소거 활성 실험은 Blois MS.의 방법을 변형하여 시행하였다(Blois MS. Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. Nature, 181: 1199-1200, 1958.). 시료 0.5ml에 60μM DPPH(in EtOH) 3ml을 혼합하여 암실에서 15분간 반응한 후 분광광도계를 사용하여 흡광도 517nm에서 측정하였다. 전자공여능은 인체 내에서 활성 라디칼에 의한 노화억제 작용의 척도로 사용되는 실험으로 소거율을 %로 환산하여 그래프로 작성하여 나타내었다. 대조군으로 Vitamin C를 사용하였다.
아욱 DW 및 EE 추출물의 전자공여능 측정 결과, 1,000μg/ml 농도에서 아욱 DW 및 EE 추출물은 각각 65.02%, 75.53%의 전자공여능 활성을 보였다. 결론적으로, 아욱 추출물이 농도 의존적으로 항산화 활성을 나타내는 것을 확인하였다(표 2 및 도 1).
| 추출물 농도(ppm) | 5 | 10 | 50 | 100 | 500 | 1,000 |
| Vit.C | 53.16% | 87.68% | 92.88% | 92.36% | 93.19% | 91.81% |
| 아욱 DW | 1.24% | 2.45% | 5.97% | 8.68% | 33.89% | 65.02% |
| 아욱 EE | 3.39% | 2.10% | 7.88% | 15.03% | 51.60% | 75.53% |
[
실시예
3]
ABTS
라이칼
소거능
측정
아욱 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위해, ABTS asssy를 실시하였다. ABTS 라디칼 소거능은 Nicoletta(Nicoletta, P. (1999). Screening of dietary carotenoids and carotenoid-rich fruit extracts for antioxidant activities applying 2, 2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) radical cation decolorization assay. Methods Enzymol., 299, 379-389.)의 방법을 따라 측정하였다. 7mM ABTS 5ml와 140mM, K2S2O8 88μl를 섞어 암실에 14~16시간 동안 반응시켰다. 이를 absolute ethanol과 1:88 비율로 섞어 734nm에서 흡광도 값이 0.7±0.002가 되도록 조절한 ABTS solution을 사용하였다. 시료용액 150μl와 ABTS solution 3ml를 혼합하여 30초간 vortex 후 2.3m 간 상온에서 반응시키고 734nm에서 흡광도를 측정하였다.
아욱 추출물의 ABTS 라디칼 소거능을 측정한 결과, 1,000μg/ml 농도에서 아욱 DW 및 EE 추출물은 각각 99.87%, 98.12%의 소거능을 보였고, 대조군인 Vitamin C와 유사한 활성을 보였다. 결론적으로, 아욱 DW 및 EE 추출물은 모두 시료에서 농도 의존적으로 라디칼 소거능을 나타내는 것을 확인하였다(표 3 및 도 2).
| 추출물 농도(ppm) | 5 | 10 | 50 | 100 | 500 | 1,000 |
| Vit.C | 36.63% | 85.81% | 100.16% | 100.16% | 100.18% | 100.08% |
| 아욱 DW | - | - | 4.89% | 15.10% | 84.19% | 99.87% |
| 아욱 EE | 5.43% | 3.58% | 11.76% | 29.73% | 92.24% | 98.12% |
[
실시예
4] 세포 생존율(세포독성) 측정
추출물이 세포에 노출되었을 때 세포에 미치는 독성을 확인하기 위하여, MTT assay를 실시하였다. 세포는 외부 환경에 의해 다양한 숙주반응에 관여하고, 염증 반응 시 NO 및 염증성 cytokine을 생성 및 분비하고, 다양한 숙주반응 및 염증반응에 관여하는 대식세포 RAW 264.7을 사용했고, 세포를 농도별로 처리하여 비교하였다. 먼저 96 well plate에는 5×10⁴cell/well 되도록 분주 후 24시간 후 각 농도에 맞도록 DMSO에 녹인 sample을 첨가하였다. 24시간 후 배지를 제거하고, MTT 시약(in PBS 2.5mg/ml) well에 40μl씩 가하고 incubator에 4시간 반응 후 다시 상층액을 제거하였다. DMSO를 100μl씩 분주하여 완전히 녹인 후, 분광광도계를 이용하여 흡광도 540nm에서 측정하였다.
아욱 추출물에 대한 세포 생존율을 측정한 결과, 아욱 DW 및 EE 추출물은 500μg/ml 농도에서 90% 이상의 세포생존율이 나타나는 것을 확인하였다(도 3). 따라서, 세포 생존율이 90% 이상인 500μg/ml 농도 이하에서 NO, iNOS 및 COX-2의 단백질 발현 및 mRNA 발현 측정 시험을 진행하였다.
[
실시예
5] 산화질소(Nitric Oxide) 저해활성 측정
염증반응의 대표적인 인자인 산화질소(nictric oxide; 이하 NO라 함)의 생성 억제 효과를 확인하기 위해, NO 저해 활성 실험을 실시했고, NO 측정은 cell의 supernatant에서의 NO의 양을 nitrite 및 nitrate로서 측정하였다. Nitrite에 대한 nitrate로 환원된 후의 안전한 형태인 griess reagent를 사용하였으며, 96 well plate(5×10⁴cells/well)에 RAW 264.7 세포의 confluence가 80%일 때, PBS로 2번 washing한 후에 무혈청 배지를 사용하여 18시간 이상 배양시킨 후에 시료를 농도별로 처리하여 1시간 동안 배양한 후 lipopolysaccharide(LPS) 1μg/ml 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배양액의 상층액을 취하여 griess 시약과 반응시킨 후 ELISA reader로 540nm에서 흡광도를 측정하여 NO 생성율을 백분율로 표시하였다.
NO 저해활성 분석 결과, LPS 단독 처리군과 LPS 무처리군에서의 차이가 나타나는 것을 확인하였으며, LPS와 농도별로 추출물을 처리하였을 때, 아욱 DW 및 EE 추출물은 농도 의존적으로 NO 생성량이 감소하는 것을 확인하였다. 500μg/ml 농도에서 아욱 DW 추출물은 15.3%, 아욱 EE 추출물은 19.94%의 저해 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 4).
[
실시예
6] 항염증 관련 Western blot 측정
아욱 추출물의 항염 효과를 분석하기 위해, RAW 264.7 세포를 이용하여 Western blot을 통해 측정하였다. RAW 264.7 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 6 well plate에 2×106 cells/well의 세포수가 되도록 3ml씩 분주하여 37℃ 조건으로 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 새로운 DMEM 배지로 교환한 후 2시간 동안 자극제인 LPS를 처리하여 배양한 후 추출물을 농도별로 세포에 처리하여 배양하였다. 24시간 후 단백질 발현을 측정하기 위하여 배지를 제거하고 차가운 phosphate buffered saline(PBS)로 세척한 후 cell lysates는 RIPA buffer에 Protease & Phosphatase Single-Use inhibitor Cocktail 100X를 첨가하여 단백질을 추출하였다. 단백질을 정량(BCA protein kit)하여, 10% SDS-PAGE에 전기영동한 후, membrane으로 transfer하여 5% skim milk(5% skim milk in TBST)에 2시간 동안 blocking하였다. 1차 항체를 희석(3% skim milk in TBST)하여 4℃에서 over night한 다음, TBST로 3회 세척하였다. 2차 항체는 실온에서 2시간 동안 배양하여 측정하였다. iNOS 및 COX-2의 단백질 발현은 enhanced chemiluminescence(ECL) 용액(Amersham, Pittsburgh, PA, USA)을 이용하여 확인하였다. Internal control로써 1:1000으로 희석한 β-actin(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California, USA)을 사용하였다.
염증의 매개 인자인 iNOS 및 COX-2의 단백질 발현량에 미치는 아욱 DW 및 EE 추출물의 항염증 효과를 확인하였다. RAW 264.7 세포에 추출물을 50~500μg/ml 농도로 처리하고 각 단백질의 발현량을 측정한 결과, 아욱 DW 추출물의 500μg/ml 농도에서 iNOS 및 COX-2의 단백질 발현은 각각 22.29%, 50.83% 저해하는 것을 확인하였다. 또한, 아욱 EE 추출물의 500μg/ml 농도에서 iNOS 및 COX-2의 단백질 발현은 각각 75.74%, 30.07% 저해하는 것을 확인하였다. LPS 단독 처리군에 의해 각 단백질의 발현량이 증가하였으나, 모든 시료에서 아욱 추출물을 농도별로 처리하였을 때 그 발현량이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 5).
[
실시예
7] 항염증 관련 RT-
PCR
측정
항염증 활성을 확인하기 위해, iNOS 및 COX-2의 mRNA 발현량에 미치는 아욱 DW 및 EE 추출물의 항염증 효과를 확인하였다. 항염증 활성은 염증 인자인 iNOS 및 COX-2를 사용하였다. PCR PreMix에 합성한 cDNA와 primer sequences를 충분히 섞어 준 후 실험을 진행하였다. 실험에 사용한 primer sequences는 표 4와 같다. GAPDH는 96℃에서 2분, 96℃에서 10초, 64℃에서 30초, 72℃에서 1분 및 72℃에서 10분(30 cycles) 실행했고, iNOS는 96℃에서 2분, 96℃에서 10초, 64℃에서 30초, 72℃에서 1분 및 72℃에서 10분(35 cycles) 실행했으며, COX-2는 96℃에서 2분, 94℃에서 10초, 51℃에서 30초, 72℃에서 1분 및 72℃에서 10분(35 cycles)을 실행하였다. 1% midori green을 첨가한 1.5% agarose gel에 100V에서 20분 전기영동 한 후 UV를 조사하여 밴드를 확인하였다.
| Gene | Primer | Sequence (5’ → 3’) |
| GAPDH | sense | TGA AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG GC |
| anti-sense | CAT GTA GGC CAT GAG GTC CAC CAC | |
| COX-2 | sense | GGA GAG ACT ATC AAG ATA GT |
| anti-sense | ATG GTC AGT AGA CTT TTA CA | |
| iNOS | sense | AAT GGC AAC ATC AGG TCG GCC ATC ACT |
| anti-sense | GCT GTG TGT CAC AGA AGT CTC GAA CTC |
RAW 264.7 세포에 추출물을 50~500μg/ml 농도로 처리하고 mRNA의 발현량을 측정한 결과, 아욱 DW 추출물의 500μg/ml 농도에서 iNOS 및 COX-2의 mRNA 발현은 각각 27.41%, 12.61% 저해하는 것을 확인하였다. 또한, 아욱 EE 추출물의 500μg/ml 농도에서 iNOS 및 COX-2의 mRNA 발현은 각각 19.26%, 32.08% 저해하는 것을 확인하였다. LPS 단독 처리군에 의해 mRNA의 발현량이 증가하였으나, 모든 시료에서 아욱 추출물을 농도별로 처리하였을 때 그 발현량이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 6).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허 청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> SEOWON UNIVERSITY INSTITUTE OF INDUSTRY-ACADEMY COLLABORATION
<120> Anti-oxidative and anti-inflammatory composition comprising
extract of Malva verticillata as an active ingredient
<130> ADP-2021-0833
<160> 6
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Primer of GAPDH gene(sense)
<400> 1
tgaaggtcgg tgtgaacgga tttggc 26
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Primer of GAPDH gene(anti-sense)
<400> 2
catgtaggcc atgaggtcca ccac 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Primer of COX-2 gene(sense)
<400> 3
ggagagacta tcaagatagt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Primer of COX-2 gene(anti-sense)
<400> 4
atggtcagta gacttttaca 20
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Primer of iNOS gene(sense)
<400> 5
aatggcaaca tcaggtcggc catcact 27
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Primer of iNOS gene(anti-sense)
<400> 6
gctgtgtgtc acagaagtct cgaactc 27
Claims (6)
- 아욱(Malva verticillata) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 약학 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 아욱 추출물은 70% 에탄올로 추출한 것을 특징으로 하는 항산화 및 항염증용 약학 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 농도 의존적으로 산화질소(nitric oxide) 생성을 저해하는 것을 특징으로 하는 항산화 및 항염증용 약학 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 농도 의존적으로 iNOS 및 COX-2의 단백질 및 mRNA 발현을 저해하는 것을 특징으로 하는 항산화 및 항염증용 약학 조성물.
- 아욱(Malva verticillata) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 건강기능식품 조성물.
- 아욱(Malva verticillata) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 화장료 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220026560A KR20230129672A (ko) | 2022-03-02 | 2022-03-02 | 아욱 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220026560A KR20230129672A (ko) | 2022-03-02 | 2022-03-02 | 아욱 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230129672A true KR20230129672A (ko) | 2023-09-11 |
Family
ID=88020452
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020220026560A KR20230129672A (ko) | 2022-03-02 | 2022-03-02 | 아욱 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20230129672A (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102135797B1 (ko) | 2018-07-16 | 2020-07-20 | 경희대학교 산학협력단 | 아욱 유래 글리코실 글리세라이드를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물 |
-
2022
- 2022-03-02 KR KR1020220026560A patent/KR20230129672A/ko unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102135797B1 (ko) | 2018-07-16 | 2020-07-20 | 경희대학교 산학협력단 | 아욱 유래 글리코실 글리세라이드를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물 |
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