KR20230122076A

KR20230122076A - 아데노-연관 바이러스 벡터를 함유하는 개선된 제약조성물

Info

Publication number: KR20230122076A
Application number: KR1020237023859A
Authority: KR
Inventors: 제시카 에일린 코너; 린제이 앤 크로퍼드; 로버트 다미츠; 브렌던 마이클 데이비스; 코디 마이클 홋지; 마이클 릴런드 킴멜 2세; 티하미 쿠레시 윌러드; 필립 램지; 대니얼 조셉 쏜; 앤써니 리 영
Original assignee: 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드; 화이자 인코포레이티드
Priority date: 2020-12-18
Filing date: 2021-12-17
Publication date: 2023-08-22
Also published as: WO2022133324A1; CN116710149A; MX2023006471A; JP2024500133A; AU2021403118A9; IL303737A; US20240066146A1; CA3204462A1; AU2021403118A1; EP4262754A1

Abstract

본 발명은 재조합 AAV 및 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 다른 AAV 조성물과 비교하여 개선된 안정성 및 저장 기간을 가진다.

Description

아데노-연관 바이러스 벡터를 함유하는 개선된 제약 조성물

관련 출원에 대한 상호-참조

본 출원은 2020년 12월 18일에 출원된 미국 출원 번호 63/127,826을 우선권 주장하며, 상기 출원의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

서열 목록

본 출원은 ASCII 포맷으로 전자 제출되었고 그 전문이 본원에 참조로 포함된 서열 목록을 함유한다. 2021년 12월 1일에 생성된 상기 ASCII 카피는 025297_WO029_SL.txt로 명명되며 19,967 바이트 크기이다.

유전자 요법은 유전 질환을 치료하는 유망한 접근법이다. 이는 결함 유전자의 건강한 카피를 환자에게 도입하거나, 부적절하게 기능하는 돌연변이된 유전자를 불활성화한다. 유전자 요법 연구에 특히 관심인 유전 질환은 혈우병 A이다. 고전적 혈우병으로도 불리는 혈우병 A는 혈액 응고 과정이 누락 또는 결함 유전자 코딩 인자 VIII로 인해 손상되는 X-연관 유전 질환이다. 혈우병 A를 가진 환자는 내부로 (예를 들어, 관절 및 근육 내부로) 또는 외부로 (예를 들어, 작은 상처, 외상, 또는 치과 시술로 인해) 출혈할 수 있다. 인자 VIII의 정상 혈장 수준은 50% 내지 100%의 범위이다. 경증 혈우병 A는 혈액 내 인자 VIII의 6% 내지 49% 수준을 특징으로 하며; 환자는 전형적으로 심각한 부상, 외상, 또는 수술 후에만 출혈한다. 중등도 혈우병 A는 혈액 내 인자 VIII의 1% 내지 5% 수준을 특징으로 하며; 환자는 부상 후 출혈 에피소드를 가진다. 중증 혈우병 A는 혈액 내 인자 VIII의 1% 미만의 수준을 특징으로 하며; 환자는 부상 후 출혈을 경험하고 또한 종종 그의 관절 및 근육에서 빈번한 자발적인 출혈 에피소드를 가진다. 또한, 국립 혈우병 재단(National Hemophilia Foundation)의 웹 사이트를 참조한다. 혈우병 A는 통상적으로 요구시 (출혈시) 또는 대체 인자 VIII로 예방적으로 치료된다. 일부 환자는 대체 인자에 대한 동종항체(alloantibodies) (억제제라고도 함)를 발생시켜, 요법을 효과 없게 만든다. 현재의 요법은 빈번한 정맥내 주사를 필요로 하고 개발도상국에서는 자원에 제한이 있기 때문에 부담스럽다. 따라서, 유전자 요법은 혈우병 A 치료에 유망한 접근법을 제공한다.

재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)는 유전자 요법에서 유전자 전달을 위한 플랫폼으로서 탐구되었다. 아데노-연관 바이러스 (AAV)는 파르보비리다에(Parvoviridae) 과 및 데펜도파르보바이러스(Dependoparvovirus) 속에 속하는 소형 외피 비보유 바이러스이다. 상기 바이러스는 3종의 캡시드 단백질 - 바이러스 단백질 (VP) 1, VP2, 및 VP3 - 로부터 어셈블리된 캡시드 내로 패키징된 단일-가닥 DNA 게놈으로 구성된다. rAAV 제제를 임상적 사용을 위한 제약 조성물로 제제화하는 것은 도전과제였다. 통상적으로 사용되는 rAAV 제제는 시간이 지남에 따라 또는 실험실-모의 스트레스 시험 동안 가시적 침전물을 형성하는 것으로 관찰되었다. 해결하지 않은 상태로 방치하면, 이들 침전물은 환자 안전성에 대한 위험을 나타낸다. 일부 rAAV 제제로 관찰된 물리적 안정성 문제는 또한 보관, 운송, 및 환자에게로의 투여에 필요한 저장 기간(shelf life)에 걸쳐 제품의 효능에 부정적으로 영향을 미칠 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Wright et al., Molecular Therapy (2005) 12(1):171-8; Croyle et al., Gene Therapy (2001) 8:1281-90] 참조). 따라서, rAAV 벡터에 대한 개선된 제제를 개발하여 유전자 요법에서 이들의 치료 잠재력이 완전히 구현될 수 있도록 할 필요가 있다.

본 개시내용은 임상 투여에 적합한 안정한 rAAV 벡터 제제를 제공한다. 한 측면에서, 본 개시내용은 rAAV 벡터, 염화나트륨 (NaCl), 염화칼륨 (KCl), 인산이나트륨 (Na₂HPO₄), 인산일칼륨 (KH₂PO₄), 염화마그네슘 (MgCl₂), 폴리올 (예를 들어, 수크로스), 및 폴록사머 (예를 들어, 폴록사머 188)를 포함하며, 임의로 약 0.1 mM 이하의 염화칼슘을 포함하고 약 7.1 내지 약 7.5의 pH를 갖는 제약 조성물을 제공한다.

일부 실시양태에서, 조성물은 약 0.1 내지 약 2.0 mM (예를 들어, 약 0.5 mM 이상, 약 1.3 mM 이상, 또는 약 1.4 mM) 염화마그네슘을 함유한다.

일부 실시양태에서, 조성물은 약 150 내지 약 200 mM, 임의로 약 172 mM, 염화나트륨을 함유한다.

일부 실시양태에서, 조성물은 약 2.5 내지 약 3.0 mM, 임의로 약 2.7 mM, 염화칼륨을 함유한다.

일부 실시양태에서, 조성물은 약 5 내지 약 10 mM, 임의로 약 8 mM, 인산이나트륨을 함유한다.

일부 실시양태에서, 조성물은 약 1.0 내지 약 2.0 mM, 임의로 약 1.5 mM, 인산일칼륨을 함유한다.

일부 실시양태에서, 조성물은 약 0.5% 내지 약 2% (w/v), 임의로 약 1% (w/v), 수크로스를 함유한다.

일부 실시양태에서, 조성물은 약 0.01% 내지 약 0.1% (w/v), 임의로 약 0.05% (w/v), 폴록사머 188을 함유한다.

특정한 실시양태에서, 본 개시내용은 rAAV 벡터, 약 171.81 mM 염화나트륨, 약 2.68 mM 염화칼륨, 약 8.10 mM 인산이나트륨, 약 1.47 mM 인산일칼륨, 약 1.40 mM 염화마그네슘, 약 1.00% (w/v) 수크로스, 및 약 0.05% (w/v) 폴록사머 188을 포함하며, 임의로 약 0.1 mM 이하의 염화칼슘을 포함하고 약 7.1 내지 약 7.5의 pH를 갖는 제약 조성물을 제공한다.

다른 특정한 실시양태에서, 본 개시내용은 rAAV 벡터, 약 172 mM 염화나트륨, 약 2.68 mM 염화칼륨, 약 8.10 mM 인산이나트륨, 약 1.47 mM 인산일칼륨, 약 0.49 mM 염화마그네슘, 약 1.00% (w/v) 수크로스, 및 약 0.05% (w/v) 폴록사머 188을 포함하며, 임의로 약 0.1 mM 이하의 염화칼슘을 포함하고 약 7.1 내지 약 7.5의 pH를 갖는 제약 조성물을 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중의 rAAV는 인간 인자 VIII 폴리펩티드 (예를 들어, 서열식별번호: 1)와 같은 치료 단백질에 대한 발현 카세트를 포함하는 게놈을 포함한다. 특정한 실시양태에서, AAV 게놈은 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 131-5,024를 포함한다.

일부 실시양태에서, 조성물은 mL당 약 1.0E+12 내지 약 1.0E+14 벡터 게놈 (vg), 임의로 mL당 약 1.0E+13 내지 약 5.0E+13 vg (예를 들어, mL당 약 1.0E+13 vg)의 rAAV를 함유한다.

일부 실시양태에서, rAAV는 AAV6 캡시드 단백질 (예를 들어, AAV6 캡시드를 가짐)을 포함한다. 일부 실시양태에서, AAV 게놈은 AAV2로부터 역위 말단 반복부 (ITR)를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 5-10 mL, 임의로 6.4 mL의 본 발명의 조성물을 포함하는 바이알을 제공한다. 바이알은, 예를 들어, 시클로-올레핀 공중합체로 제조될 수 있고/있거나, 제 위치에(in-place) 열가소성 엘라스토머 마개(stopper)를 가질 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 치료 단백질을 필요로 하는 환자에게 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 치료 단백질을 필요로 하는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 인자 VIII의 혈청 수준의 증가를 필요로 하는 인간 대상체 (예를 들어, 혈우병 A를 갖는 인간 대상체)에게 rAAV가 인간 인자 VIII 폴리펩티드를 코딩하는 본 발명의 조성물을 정맥내 투여하는 것을 포함하는, 상기 인간 대상체에서 인자 VIII의 혈청 수준을 증가시키는 방법을 제공한다. 또한, 이러한 치료 방법에서 사용하기 위한 제약 조성물, 및 이러한 방법들에서 사용하기 위한 의약의 제조를 위한 조성물의 용도가 제공된다.

본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 하기 상세한 설명에서 명백하다. 그러나, 상세한 설명은 본 발명의 실시양태 및 측면을 나타내지만, 제한이 아니라 단지 예시로서 주어지는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 범위 내의 다양한 변화 및 변형은 상세한 설명으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백해질 것이다.

도 1a-도 1f는 SB-525를 함유하는 제제의 샘플에서 발견되는 미립자 물질의 특성화를 요약한다.
도 2는 접선 흐름 여과 (TFF)에 의한 완충제 교환의 개략도를 나타낸다.
도 3은 AAV6 벡터 제제에 대한 제제화, 충전, 및 마무리 단계를 나타낸다.
도 4a는 다중 동결 해동 주기에 따른 AAV6 벡터 제제의 벡터 게놈 (vg) 역가 및 감염 역가를 나타낸다. 표시된 오차 막대는 MADLS에 의한 입자 농도에 대한 N ≥ 3 샘플 측정값으로부터의 ± 백분율 RSD, 또는 vg 역가, 중앙 조직 배양 감염 용량 (TCID₅₀), ELISA, 및 SE-LC에 대한 허용된 시험 가변성이다. RSD: 상대 표준 편차. MADLS: 다각도 동적 광 산란. SE-LC: 크기 배제 액체 크로마토그래피.
도 4b는 다중 동결/해동 주기에 따른 AAV6 벡터 제제의 캡시드 역가 및 입자 농도를 나타낸다. 표시된 오차 막대는 MADLS에 의한 입자 농도에 대한 N ≥ 3 샘플 측정값으로부터의 ± 백분율 RSD, 또는 vg 역가, TCID₅₀, ELISA, 및 SE-LC에 대한 ± 허용된 시험 가변성이다.
도 4c는 동결/해동 AAV6 벡터 제제 샘플의 일반 및 순도 품질 속성 결과를 나타내는 표이다.
도 4d는 동결/해동 AAV6 벡터 제제 샘플의 강도 품질 속성 결과를 나타내는 표이다.
도 5a는 주위 (25℃/60% RH) 조건에서 최대 6개월에 걸친 vg 및 감염 역가를 나타낸다. RH: 상대 습도.
도 5b는 주위 (25℃/60% RH) 조건에서 최대 6개월에 걸친 캡시드 역가 및 입자 농도를 나타낸다.
도 5c는 주위 (25℃/60% RH) 인큐베이션된 샘플의 일반 및 순도 품질 속성 결과를 나타내는 표이다. ND: 데이터 없음. NAA: 이용가능한 분석 없음.
도 5d는 주위 (25℃/60% RH) 인큐베이션된 샘플의 강도 품질 속성 결과를 나타내는 표이다.
도 6a는 스트레스가 가해진 (40℃/75% RH) 조건에서 3개월에 걸친 vg 및 감염 역가를 나타낸다.
도 6b는 스트레스가 가해진 (40℃/75% RH) 조건에서 최대 7개월에 걸친 캡시드 역가 및 입자 농도를 나타낸다.
도 6c는 스트레스가 가해진 (40℃/75%RH) 인큐베이션된 샘플의 일반 및 순도 품질 속성 결과를 나타내는 표이다.
도 6d는 스트레스가 가해진 (40℃/75% RH) 인큐베이션된 샘플의 강도 품질 속성 결과를 나타내는 표이다.
도 7은 안정성 샘플에 대한 연관 및 불합격 기준과 함께 품질 속성을 나타내는 표이다.
도 8은 샘플간 제제 평가 요약을 나타내는 표이다.
도 9는 일반 및 순도 품질 속성에 대한 연구 종점 추세선 및 제제 평가를 나타내는 표이다.
도 10은 의도된 보관 온도 (-70℃)에서 SB-525 약물 제품의 장기간 (24개월) 안정성을 나타내는 표이다.

본 개시내용은 AAV 벡터 및 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 본 발명의 AAV 벡터 조성물은 게놈이 관심 단백질 (예를 들어, 치료 단백질)에 대한 발현 카세트를 운반하는 rAAV를 포함할 수 있다. 본 발명자들은 본질적으로 칼슘 미함유인 (예를 들어, 제제에 어떤 첨가된 칼슘도 갖지 않은) AAV 벡터 제제가 이전 조성물과 비교하여 개선된 안정성 및 저장 기간을 가진다는 것을 예기치 않게 발견하였다. 칼슘은 전형적으로 칼슘이 AAV 조성물의 안정성을 개선시킬 것이라는 통상적인 믿음으로 인해 이전 제제에 포함된다 (예를 들어, 문헌 [Turnbull et al., Hum Gene Ther. (2000) 11(4):629-35; Cotmore et al., J Virol. (2010) 84(4):1945-56] 참조). 본 발명자들은 본 발명의 AAV 벡터 조성물이 개선된 외관 (예를 들어, 투명도 및 색상 없음), 보다 안정한 pH, 및 보다 적은 응집체 (동결/해동 주기 및 가속화된 안정성 조건 하에 제품 품질 속성에 의해 결정된 바와 같음)를 가진다는 것을 발견하였다. 칼슘 없이 제조된 AAV 벡터 제품은 보다 양호한 제품 안정성을 입증했기 때문에, 제품 성능 또는 안정성을 위해 칼슘 이온이 필요하지 않다.

I. 재조합 AAV의 제조

본원에 기재된 바이러스 제제는 임의의 공지된 생산 시스템, 예컨대 포유동물 세포 AAV 생산 시스템 (예를 들어, 293T 또는 HEK293 세포에 기반한 것들) 및 곤충 세포 AAV 생산 시스템 (예를 들어, sf9 곤충 세포에 기반한 것들 및/또는 바큘로바이러스 헬퍼 벡터를 사용하는 것들)에 의해 수득될 수 있다. 바이러스 제제는 불연속 염화세슘 밀도 구배와 같은 널리 공지된 기술을 사용함으로써 세포 배양물로부터 정제할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Grieger, Mol Ther Methods Clin Dev. (2016) 3:16002] 참조).

본 발명의 조성물은 임의의 또는 다양한 AAV 혈청형의 조합의 AAV, 예컨대 AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV8.2, AAV9, AAVrh10, AAV10, 및 AAV11, 뿐만 아니라 그의 변이체, 하이브리드, 키메라 또는 슈도-유형(pseudo-type)을 포함할 수 있다. "슈도-유형" 또는 "교차-패키지형(cross-packaged)" rAAV는 그의 캡시드가 또 다른 AAV 혈청형의 캡시드로 대체되어, 예를 들어, 바이러스의 형질도입 효능(transduction efficacy) 또는 향성(tropism) 프로파일을 변경하는 재조합 AAV를 의미한다 (예를 들어, 문헌 [Balaji et al., J Surg Res. (2013) 184(1):691-8] 참조). "키메라" 또는 "하이브리드" rAAV란 그의 캡시드가 상이한 혈청형으로부터 유래된 캡시드 단백질로부터 어셈블리되고/되거나 그의 캡시드 단백질이 상이한 혈청형 (예를 들어, 혈청형 1 및 2; 예를 들어, 문헌 [Hauck et al., Mol Ther. (2003) 7(3):419-25] 참조)으로부터 유래된 서열을 가진 키메라 단백질인 재조합 AAV를 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 ITR과 같은 게놈이 AAV2와 같은 하나의 혈청형으로부터 유래되며 한편 캡시드가 또 다른 혈청형; 예를 들어, AAV2/8, AAV2/5, AAV2/6, AAV2/9, 또는 AAV2/6/9로부터 유래되는 재조합 AAV를 포함할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 7,198,951 및 9,585,971 참조.

II. 재조합 AAV의 제제화

일단 정제되면, AAV 제제는, 예를 들어, 접선 흐름 여과, 교반-셀을 사용한 정상 흐름 여과, 겔 여과, 투석, 컬럼 크로마토그래피, 및/또는 탈염 컬럼을 통한 완충제 교환에 의해 본원에 기재된 바와 같이 제제화되어, 원하는 성분을 포함하는 조성물에 도달될 수 있다. 예시로서, 정제된 바이러스 제제는 먼저 한외여과 (UF)에 의해 농축된 다음에 원하는 수성 제제 용액의 10배 이상의 동등한 부피로 정용여과 (DF)될 수 있다. 또한, 하기 실시예 참조.

제제 용액은 긴장제, 안정화제, 계면활성제, 및 완충제를 포함할 수 있다. 완충제는, 예를 들어, 아세테이트, 숙시네이트 (예를 들어, 디소듐 숙시네이트 6수화물), 숙신산, 글루코네이트, 시트레이트, 히스티딘, 아세트산, 포스페이트, 인산, 아스코르베이트, 아스코르브산, 타르타르산, 말레이트, 말레산, 글리신, 락테이트, 락트산, 중탄산염, 탄산, 벤조산나트륨, 벤조산, 에데테이트, 이미다졸, 트리스, 및 그의 혼합물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제제 용액은, 예를 들어, 각각 약 150-200 mM (예를 들어, 약 150 mM, 약 155 mM, 약 160 mM, 약 165 mM, 약 168 mM, 약 170 mM, 약 171 mM, 약 171.1 mM, 약 171.2 mM, 약 171.3 mM, 약 171.4 mM, 약 171.5 mM, 약 171.6 mM, 약 171.7 mM, 약 171.8 mM, 약 171.9 mM, 또는 약 172 mM) 및 약 2.5-3.0 mM (예를 들어, 약 2.5 mM, 약 2.6 mM, 약 2.61 mM, 약 2.61 mM, 약 2.63 mM, 약 2.64 mM, 약 2.65 mM, 약 2.66 mM, 약 2.67 mM, 약 2.68 mM, 약 2.69 mM, 또는 약 2.7 mM, 약 2.8 mM, 약 2.9 mM, 약 3.0 mM)의 염화나트륨 및/또는 염화칼륨을 함유한다.

제제 용액은 예를 들어 인산이나트륨 및/또는 인산일칼륨에 의해 포스페이트-완충될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제제 용액 중 총 포스페이트 이온 농도는 약 8-12 mM (예를 들어, 약 9.6 mM 또는 약 9.57 mM)이다. 특정 실시양태에서, 제제 용액은 약 5-10 mM (예를 들어, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 7.9 mM, 약 8 mM 또는 약 8.1 mM, 약 8.2 mM, 약 8.5 mM, 약 9 mM, 또는 약 10 mM) 인산이나트륨 및 약 1-2 mM (예를 들어, 약 1 mM, 약 1.2 mM, 약 1.3 mM, 약 1.45 mM, 약 1.47 mM, 약 1.48 mM, 약 1.49 mM, 약 1.5, 약 1.6 mM, 약 1.7 mM, 약 1.8 mM, 약 1.9 Mm, 또는 약 2 mM) 인산일칼륨을 함유한다. 제제는 약 6.5-8.0 (예를 들어, 약 7.1-7.5, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 또는 약 7.5)의 pH를 가질 수 있다.

제제 용액은 마그네슘을 함유할 수 있으나 어떤 첨가된 칼슘도 함유하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 제제 용액은 약 0.1 내지 2.0 mM (예를 들어, 약 0.5 내지 약 1.4 mM, 약 0.1 mM, 약 0.2 mM, 약 0.3 mM, 약 0.4 mM, 약 0.42 mM, 약 0.44 mM, 약 0.45 mM, 약 0.46 mM, 약 0.47 mM, 약 0.48 mM, 약 0.49 mM, 약 0.5, 약 0.55 mM, 또는 약 0.6 mM) 염화마그네슘을 함유한다. 제제 용액은 어떤 첨가된 칼슘도 함유하지 않긴 하지만, AAV 제제 및 제제 용액으로 구성된 제약 조성물은 AAV 제조 및 정제 공정을 위해 이월되는 미량의 칼슘을 가질 수 있다. 예를 들어, 제약 조성물은 비색 검정에 의해 측정되는 경우 약 0.10 mM 이하 (예를 들어, 약 0.09, 0.07, 0.05, 0.03, 또는 0.01 mM 이하)의 칼슘을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 비색 검정에 의해 측정된 바와 같이 어떤 검출가능한 칼슘도 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 어떤 칼슘도 함유하지 않는다 (즉, 0 mM 칼슘).

제제 용액은 폴리올 예컨대 만니톨, 트레할로오스, 소르비톨, 에리스리톨, 이소말트, 락티톨, 말티톨, 크실리톨, 글리세롤, 락티톨, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 이노시톨, 프럭토스, 글루코스, 만노스, 수크로스, 소르보스, 크실로스, 락토스, 말토스, 덱스트란, 풀루란, 덱스트린, 시클로덱스트린, 가용성 전분, 히드록시에틸 전분, 수용성 글루칸, 또는 그의 혼합물을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제제 용액은 약 0.5% 내지 2% (예를 들어, 약 0.5%, 약 0.6%, 약 0.7%, 약 0.8%, 약 0.9%, 또는 약 1%) (w/v) 수크로스를 함유한다.

제제 용액은 비이온성 또는 이온성 친수성 계면활성제를 함유할 수 있다. 계면활성제의 예는 폴리소르베이트, 폴록사머, 트리톤, 소듐 도데실 술페이트, 소듐 라우렐 술페이트, 소듐 옥틸 글리코시드, 라우릴-술포베타인, 미리스틸-술포베타인, 리놀레일-술포베타인, 스테아릴-술포베타인, 라우릴-사르코신, 미리스틸-사르코신, 리놀레일-사르코신, 스테아릴-사르코신, 리놀레일-베타인, 미리스틸-베타인, 세틸-베타인, 라우로아미도프로필-베타인, 코카미도프로필-베타인, 리놀레아미도프로필-베타인, 미리스타미도프로필-베타인, 팔미도프로필-베타인, 이소스테아르아미도프로필-베타인, 미리스타미도프로필-디메틸아민, 팔미도프로필-디메틸아민, 이소스테아르아미도프로필-디메틸아민, 소듐 메틸 코코일-타우레이트, 디소듐 메틸 올레일-타우레이트, 디히드록시프로필 PEG-5 리놀레암모늄 클로라이드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 소르비탄 모노에스테르 (예를 들어, 스판(Span)), 글리세롤의 산 에스테르, 및 그의 혼합물이다. 일부 실시양태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 (PS) 20, PS-21, PS-40, PS-60, PS-61, PS-65, PS-80, PS-81, PS-85, PEG-3350, 폴록사머 188, 및 그의 혼합물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제제 용액은 약 0.01% 내지 0.1% (예를 들어, 약 0.01%, 약 0.02%, 약 0.03%, 약 0.04%, 약 0.05%, 약 0.06%, 약 0.07%, 약 0.08%, 약 0.09%, 또는 약 0.1%) (w/v) 폴록사머 188을 함유한다.

특정한 실시양태에서, 제약 조성물은 제제 F2 또는 F3에서 AAV 벡터를 포함한다. F2 및 F3의 성분은 하기 표 A에 나타냈다. 칼슘과 마그네슘을 가진 둘베코의 포스페이트 완충 식염수 (DPBS)는 세포 배양 적용에 통상적으로 사용되는 제제이다. F0는 또 다른 이전의, 칼슘-함유 제제이다. 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, F2 및 F3은 AAV 제제화에서 DPBS 및 F0보다 우수하다.

<표 A>

제제 비교

본원에 사용되는 바와 같이, 제제 내의 다양한 성분의 농도는 소수점 이하 0, 1, 또는 2자리수로 표시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, F2에서, NaCl, KCl, Na₂HPO₄, KH₂PO₄, MgCl₂, 및 수크로스의 농도는 각각 171.80 (또는 171.8 또는 172) mM, 2.68 (또는 2.7) mM, 8.10 (또는 8.1 또는 8) mM, 1.47 (또는 1.5) mM, 0.49 (또는 0.5) mM, 및 1.00% (또는 1.0% 또는 1%) (w/v)로 표시될 수 있다. F3에서, NaCl, KCl, Na₂HPO₄, KH₂PO₄, MgCl₂, 및 수크로스의 농도는 각각 171.80 (또는 171.8 또는 172) mM, 2.68 (또는 2.7) mM, 8.10 (또는 8.1 또는 8) mM, 1.47 (또는 1.5) mM, 1.40 (또는 1.4) mM, 및 1.00% (또는 1.0% 또는 1%) (w/v)로 표시될 수 있다.

제약 조성물은 1종 이상의 방부제 예컨대 아스코르브산 (비타민 C), 술피트, 소르베이트, 벤조에이트, 페놀, m-크레졸, 벤질 알코올, 벤즈알코늄 클로라이드, 페녹시에탄올, 및/또는 파라벤 (예를 들어, 메틸 파라벤)을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 임의의 첨가된 방부제를 함유하지 않는다.

제약 조성물은 또한 제약 조성물의 유효성을 향상시키는 다른 시약을 포함할 수 있다. 제약 조성물은 전달 비히클 예컨대 리포좀, 나노캡슐, 미세입자, 미세구, 지질 입자, 및 소포를 함유할 수 있다.

III. 예시적인 재조합 AAV

예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 인자 VIII 유전자 요법을 위한 rAAV 벡터를 포함하는 개선된 제약 조성물을 제공한다. PF-07055480/SB-525 (또는 본원에서 "SB-525")로 명명된 rAAV 벡터는 AAV6 캡시드 및 AAV2 역위 말단 반복부 (ITR)를 갖는 재조합 게놈을 포함하는 2/6 슈도 혈청형이다. SB-525의 게놈은 인간 인자 VIII (FVIII)의 B-도메인 결실 (BDD) 버전을 코딩하는 발현 카세트를 운반한다. 예를 들어, WO 2017/074526 (서열 #37) 참조. SB-525는 정맥내 (IV) 용량으로서 투여되며 간-특이적 향성을 보유하여 혈우병 A를 가진 환자에서 인자 VIII 단백질의 장기간 간 생산을 제공한다. WO 2020/028830 참조. 분비된 FVIII 단백질은 승인된 재조합 항혈우병 인자 (레팍토(Refacto)® 및 크신타(Xyntha)®)와 동일한 아미노산 서열을 가진다.

SB-525의 게놈은 인간 인자 VIII BDD 버전에 대한 발현 카세트를 포함하며, 이는 하기에 나타낸 아미노산 서열을 가진다:

서열식별번호: 1의 신호 펩티드 부분은 상기 박스에 표시되어 있으며 단백질이 분비될 때 절단 제거된다.

SB-525 게놈은 하기 뉴클레오티드 서열을 포함한다:

상기 서열에서, 왼쪽 (5') ITR (AAV2 ITR)은 뉴클레오티드 1-130에 걸쳐 있고, 오른쪽 (3') ITR (AAV2 ITR)은 뉴클레오티드 5025-5132에 걸쳐 있다. 두 ITR 모두 박스로 표시된다.

IV. 재조합 AAV 제제의 용도

본 발명의 제약 조성물은 바이알 (예를 들어, 전처리된 유리 바이알 또는 COP 바이알) 및 사용 설명서를 포함하는 제조품 (예를 들어, 키트)으로 공급될 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 바이알은 0.5-50 mL (예를 들어, 1-10 mL) 중 AAV의 mL당 약 1E+11 내지 1E+15 vg을 함유한다. 특정한 실시양태에서, 각각의 바이알은 5E+12 내지 1E+14/mL (예를 들어, 1E+13 vg/mL)을 함유한다. 특정 실시양태에서, 각각의 바이알은 6 mL 중 6E+13 vg을 함유한다.

조성물은 환자에게 1회 또는 1회 초과 투여될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 환자에게 1개월, 3개월, 6개월, 9개월, 또는 1년 이상의 간격으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 환자에게 2년, 5년, 7년, 10년, 또는 15년 이상의 간격으로 투여될 수 있다. 제약 조성물은 이를 필요로 하는 환자에게 치료하고자 하는 질환에 적합한 경로를 통해 제공될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 정맥내 주사, 동맥내 주사, 두개내 주사, 복강내 주사, 문맥 주사, 또는 근육내 주사를 통해 투여될 수 있다. 예를 들어, SB-525 제약 조성물은 혈우병 A 환자에게 1E+11 내지 1E+15 vg/kg, 예컨대 1E+11 내지 1E+14 (예를 들어, 1E+12 내지 1E+14) vg/kg으로 정맥내로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, SB-525 제약 조성물은 혈우병 A 환자에게 5E+11, 6E+11, 7E+11, 8E+11, 9E+11, 1E+12, 2E+12, 3E+12, 4E+12, 5E+12, 6E+12, 7E+12, 8E+12, 9E+12, 1E+13, 2E+13, 3E+13, 4E+13, 5E+13, 6E+13, 7E+13, 8E+13, 9E+13, 또는 1E+14 vg/kg으로 정맥내로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, SB-525 조성물은 혈우병 A 환자에게 약 6E+13 vg/kg의 용량으로 정맥내로 제공될 수 있다.

일부 실시양태에서, 환자는 중증 또는 중등도 혈우병 A를 가진다. 추가의 일부 실시양태에서, 환자는 어떤 억제제 (인자 VIII에 대한 동종항체)도 갖고 있지 않다. 특정 실시양태에서, 환자는 AAV6에 대한 중화 항체를 갖고 있지 않는다. 환자는 성인 또는 청소년 환자 (≥12세 이상) 또는 소아 환자 (<12세 미만)일 수 있다.

본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 개시내용과 관련하여 사용된 과학 기술 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 예시적인 방법 및 물질이 하기에 기재되긴 하지만, 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 또한 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 상충되는 경우에, 정의를 포함한 본 명세서가 지배할 것이다. 일반적으로, 본원에 기재된 심장학, 의학, 의약 및 제약 화학, 및 세포 생물학과 관련하여 사용되는 명명법 및 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 통상적으로 사용되는 것들이다. 효소적 반응 및 정제 기술은 제조업체의 설명서에 따라, 관련 기술분야에서 통상적으로 완수되는 바와 같이 또는 본원에 기재된 바와 같이 수행된다. 추가로, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 본 명세서 및 실시양태 전반에 걸쳐, 단어 "가진다" 및 "포함한다", 또는 변형어 예컨대 "가진다", "갖는", "포함한다" 또는 "포함하는"은 언급된 정수 또는 정수의 군을 포함하나, 임의의 다른 정수 또는 정수의 군을 배제하지 않음을 암시하는 것으로 이해될 것이다. 본원에 언급된 모든 간행물 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 다수의 문헌이 본원에 인용되긴 하지만, 이러한 인용이 이들 문헌 중 임의의 것이 관련 기술분야의 통상의 일반 지식의 일부를 형성한다는 것의 인정을 구성하는 것은 아니다. 본원에 사용되는 바와 같이, 하나 이상의 관심 값에 적용되는 바와 같은 용어 "대략" 또는 "약"은 명시된 참조 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 용어는 달리 명시되지 않거나 문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한 명시된 참조 값의 어느 방향으로든 (초과 또는 미만) 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 미만 내에 속하는 값의 범위를 지칭한다.

본 발명을 보다 잘 이해할 수 있도록 하기 위해, 하기 실시예를 제시한다. 이들 실시예는 단지 예시를 위한 것이며, 어떤 방식으로도 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예

하기 실시예는 생물학적 제품의 저장 기간 및 장기간 안정성을 평가하기 위한 통상적인 시험인, 본 발명자들이 현재의 SB-525 제제가 동결/해동 순환시 침전물을 형성함을 발견한 연구를 기재한다. 본 발명자들은 완충제 제제 단독 (즉, 어떤 활성 바이러스 벡터 성분도 함유하지 않는 완충제 제제)에서도 침전물이 형성됨을 발견하였다. 따라서 본 발명자들은 이 문제를 피할 수 있는 신규 제제를 찾는데 착수하였다.

이 연구에서, SB-525 바이러스 제제를 제조하고 CaCl₂, MgCl₂, 35 mM NaCl, 1% 수크로스, 및 0.05% 콜리포르(Kolliphor)® P 188 (폴록사머 188)가 첨가된 포스페이트-완충 식염수 (PBS)에서 대략 1.0E+13 vg/mL로 제제화하고, 6 mL 어셉틱 테크놀로지즈(Aseptic Technologies) 크리스탈 밀폐형 바이알에 5 mL를 충전하고 ≤ -65℃에서 보관하였다. 안정성 시험을 위해, SB-525 조성물을 -0℃, 5℃, 및 25℃에서 최대 24개월 동안 안정 상태로 두었다 (표 5). 또한, 5회 주기의 제어되지 않은 동결/해동 (F/T) (표 1) 및 24시간 교반 (AG) (표 2)을 수행하였다. 약물 제품(Drug product) (DP) 품질 속성을 표 5 내지 표 8에 따라 분석하였다.

실시예 1: 동결/해동 순환 및 교반 시험

물질 및 방법

SB-525는 하기 성분을 함유하는 제제 완충제에서 공칭 1.0E+13 vg/mL로 제공되었다: 0.90 mM CaCl₂, 0.49 mM MgCl₂, 2.68 mM KCl, 1.47 mM KH₂PO₄, 172 mM NaCl, 8.10 mM Na₂HPO₄, 1% (w/v) 수크로스, 0.05% (w/v) 폴록사머 188, pH 7.36. 23개 바이알을 -70℃에서, 11개는 5℃에서, 그리고 8개는 25℃에서 보관하였다.

동결/해동 (F/T) 순환 시험의 경우, 샘플을 표 1에 나타낸 바와 같이 3회 주기 및 5회 주기 동안 제어되지 않은 F/T 순환시켰다.

<표 1>

DP 제어되지 않은 F/T 순환

교반 시험의 경우, 샘플을 표 2에 나타낸 바와 같이 실온에서 교반하였다.

<표 2>

DP 교반 설정

각각 -70℃, 5℃에서, 25℃에서 보관된 바이알을 (i) 외관 (액체), pH, 동적 광 산란 (DLS), 및 고 정확도 액체 입자 계수기 (HIAC); (ii) vg 동일성 (qPCR), vg 역가 (qPCR), 캡시드 역가 (ELISA), 캡시드 동일성 (ELISA), 및 감염 역가 (TCID₅₀); (iii) 시험관내 FVIII 활성 (생물검정); 또는 (iv) UV 260/280, 환원 CE-SDS, SEC 역가_260/280에 대해 분석하였다.

F/T 순환을 거친 샘플을 (i) 외관 (액체), pH, 오스몰농도, DLS, HIAC; (ii) vg 역가 (qPCR), 캡시드 역가 및 동일성 (ELISA), 환원 SDS-페이지, 및 감염 역가 (TCID₅₀); 또는 (iii) UV 260/280, SEC 역가_260/280, RP-HPLC, 시험관내 FVIII 활성 (생물검정), 및 환원 CE-SDS에 대해 분석하였다.

24시간 교반 (AG)을 거친 샘플을 (i) 외관 (액체), pH, 오스몰농도, DLS, 및 HIAC; (ii) vg 역가 (qPCR), 캡시드 역가 및 동일성 (ELISA), 환원 SDS-페이지, 감염 역가 (TCID₅₀); 또는 (iii) UV 260/280, SEC 역가_260/280, RP-HPLC, 시험관내 FVIII 활성 (생물검정), 및 환원 CE-SDS에 대해 분석하였다.

결과

SB-525 DP 안정성, 5회 주기의 제어되지 않은 F/T, 및 24시간 교반 아암으로부터의 결과를 하기에 기재하였다.

하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 샘플이 최대 1개월 동안 시험된 조건에서 보관되었을 경우 색상, 투명도, pH, DLS에 의해 측정한 바와 같은 유체역학적 반경, vg 역가, 캡시드 역가, SDS-페이지에 의해 측정한 바와 같은 캡시드 순도, 감염 역가, UV 260/280 (비어 있는(empty): 완전(full) 캡시드 비에 대한 대체 측정치), 및 생물학적 활성 (% 상대 효능)에 어떤 유의한 변화도 없었다. 5℃ 및 25℃에서 가시적 입자의 변화가 있었다. 모든 샘플은 동결되었고 T 제로 (T₀)에서 백색 및 불투명으로 나타났다.

<표 3>

안정성 결과

*T₀: 방출 시험에 의해 수행된, 기능적 생물검정을 제외한 모든 분석

¹ qPCR에 의한 벡터 게놈 동일성 및 역가의 T₀ 재-시험을 수행하였음

² 연구는 DP에서 입자 검출로 인해 T1M 후에 종료되었으며; 조사가 개시되었음

³상이한 참조 물질에 대한 생물검정 (% 상대 효능)에 대한 T₀ 재-시험

EFVP: 가시적 입자가 본질적으로 없음

TMTC: 셀 수 없을 정도로 많음

N.T.: 시험되지 않음

표 4에 나타낸 바와 같이, 모든 보관 조건에서 1개월 후 캡시드 순도에 어떤 유의한 변화도 없었다.

<표 4>

캡시드 순도 안정성 결과

표 5에 나타낸 바와 같이, 모든 보관 조건 (NMT: 이하; LOQ: 정량화 한계)에서 1개월 후에 고분자량 종 (HMWS)의 어떤 유의한 응집 또는 형성도 없었다.

<표 5>

의도된, 가속화된, 및 스트레스가 가해진 보관 조건 하에

1개월 후 SEC 역가 안정성 결과

표 6에 나타낸 바와 같이, 모든 보관 조건에서 1개월 후 비가시적 입자(subvisible particle) (HIAC당)의 어떤 유의한 증가도 없었다. 모든 시점은 ≥ 10 μm 및 ≥ 25 μm 범위와 관련하여 USP <787> 표준 미만의 입자를 나타냈으며, 여기서 허용 기준은 용기당 > 10 μm의 입자 6,000개 이하 및 용기당 > 25 μm의 입자 600개 이하이다.

<표 6>

HIAC 안정성 결과

표 7에 나타낸 바와 같이, F/T/AG 스트레스시 색상, 투명도, pH, DLS에 의해 측정된 바와 같은 유체역학적 반경, vg 역가, 캡시드 역가, 감염 역가, UV 260/280 (비어 있는: 완전 캡시드 비에 대한 대체물), RP-HPLC에 의해 측정된 바와 같은 캡시드 순도, 및 생물학적 활성 (% 상대 효능)에 어떤 유의한 변화도 없었다. F/T에 대한 가시적 입자에 변화가 있었다.

<표 7>

주기 제어되지 않은 F/T 및 24시간 AG 결과

¹ 색상은 열거된 참조 표준보다 더 강렬하거나 더 유백광을 내지 않는다.

² 투명도는 열거된 참조 표준보다 더 유백광을 내지 않는다.

표 8에 나타낸 바와 같이, F/T/AG 스트레스시 환원 CE-SDS의 어떤 유의한 변화도 없었다.

<표 8>

5회 주기 제어되지 않은 F/T 및 24시간 AG CE-SDS-환원 결과

표 9에 나타낸 바와 같이, F/T/AG 스트레스시 어떤 유의한 응집/HMWS 형성도 없었다.

<표 9>

5회 주기 제어되지 않은 F/T 및 24시간 AG SEC 역가 결과

표 10에 나타낸 바와 같이, F/T 시 비가시적 입자 (HIAC당)에 유의한 증가가 있었다. F/T 시의 입자는 ≥ 10 μm 및 ≥ 25 μm 범위와 관련하여 USP <787> 표준 초과였으며; 한편 AG시 입자는 ≥ 10 μm 및 ≥ 25 μm 범위와 관련하여 USP <787> 표준 미만이었다.

<표 10>

5회 주기 제어되지 않은 F/T 및 24시간 AG HIAC 결과

상기 결과는 SB-525 샘플이 -70℃, 5℃, 또는 25℃에서 최대 1개월 보관되는 경우 색상, 투명도, pH, 유체역학적 반경 (동적 광 산란에 의해 측정된 바와 같음), vg 역가, 캡시드 역가, 감염 역가, 비어 있는: 완전 캡시드 비 (UV 260/280에 의해 측정된 바와 같음), 생물학적 활성 (% 상대 효능), 캡시드 순도 (SDS-페이지, 환원 CE-SDS 및 RP-HPLC에 의해 측정된 바와 같음), 또는 바이러스 입자 역가에 어떤 유의한 변화도 나타내지 않았음을 입증하였다.

또한, F/T 또는 AG 스트레스시 색상, 투명도, pH, 유체역학적 반경 (동적 광 산란에 의해 측정된 바와 같음), vg 역가, 캡시드 역가, 감염 역가, 비어 있는: 완전 캡시드 비 (UV 260/280에 의해 측정된 바와 같음), 생물학적 활성 (% 상대 효능), 캡시드 순도 (SDS-페이지, 환원 CE-SDS, RP-HPLC에 의해 측정된 바와 같음), 또는 바이러스 입자 역가에 어떤 유의한 변화도 역시 없었다. 그러나, F/T시 비가시적 입자 (HIAC당)의 유의한 증가가 있었으며 5℃ 및 25℃에서 1개월 보관 후 가시적 입자의 증가가 있었다. 이들 결과로 인해 연구는 1개월에 종료되었다.

실시예 2: F/T 후 DP 바이알에서 미립자 물질의 특성화

미립자 물질이 관찰된 SB-525 제제의 상기 안정성 시험으로부터의 샘플을 단리 및 확인을 위해 추가로 분석하였다.

5회 동결-해동 주기를 거친 약물 제품 샘플 ("5 F/T 후 DP") 및 1개월 동안 25℃에서 보관된 샘플 (25℃에서 1M 후 DP)을 분석하였다. 미립자 물질은 0.8 μm 금 필터 상에 단리되었다. 이어서 이를 키엔스(Keyence) VHX6000 디지털 현미경을 사용하여 150x 배율로 부분 링 조명 하에 필터 상에서 영상화하였다. 이어서 필터를 푸리에 변환 적외선 (FTIR) 현미경으로 옮겨 상기 물질에 대한 스펙트럼을 수득하였다. FTIR 스펙트럼을 알려진 스펙트럼에 대한 KnowItAll 데이터베이스와 비교하였다. 25℃에서 1M 후 DP 샘플의 일부를 또한 유리 슬라이드 상에 필터에서 긁어내고 니콘 이클립스(Nikon Eclipse) ME600 편광 현미경을 사용하여 평면 편광 및 교차 극선(crossed polar) 하에 영상화하였다. 금 필터의 일부를 커팅하고 EDS 모듈이 장착된 JEOL6000 SEM 하에 분석하였다. 샘플은 또한 라만(Raman) 현미경검사 분석에 의해 분석하였다.

모든 샘플에 대해, 디지털 영상화는 반결정질로 보이는 백색 고체를 나타냈다. 교차 극선 하에, "5 F/T 후 DP" 샘플은 어떤 복굴절도 나타내지 않았으며, 이는 상기 샘플이 비정질 물질이거나 등방성이었음을 시사한다. SEM/EDS 분석은 많은 분량의 산소, 인, 및 칼슘을 나타냈다. FTIR 분석은 물질을 염으로서 확인하였으나, 추가 확인이 필요하였다. 라만 현미경검사는 인산칼슘의 특징적인 피크를 검출할 수 있었으며, 이는 모든 샘플 중의 백색 미립자 물질이 인산칼슘이었음을 시사한다. 도 1a-도 1f는 입자 특성화 연구를 요약한다.

실시예 3: SB-525의 재제제화

이 실시예는 상기에서 관찰된 침전 문제를 피할 수 있는 신규 SB-525 제제를 시험하는 실험을 기재한다. 이들 실험은 (1) 칼슘을 제거하거나, (2) 칼슘과 마그네슘을 제거하거나, (3) 수크로스를 8.5%로 증가시키도록 재제제화되는 경우 SB-525 DP의 단기간 안정성을 평가하였다. 이들 변화는 각각 (1) 입자 공급원 제거, (2) MgCl₂의 용해도 문제로 인한 2가 양이온 둘 다를 제거, 또는 (3) 동결-해동 스트레스에 대한 제제의 안정성 증가에 의해 입자 생성을 방지할 것으로 예상되었다. 2개의 파일럿 배치를 완충제 교환하고 6 mL AT 바이알에 2.5 mL를 충전하여 부피에 대한 표면적 (SA/V) 충전에 대한 최악-사례 조건을 모방하였다. 충전/마무리 후, 바이알을 5회의 제어되지 않은 동결-해동 주기 (≤ -65℃ 내지 주위)에 적용한 다음에, ≤ -65℃ (의도된 보관), 2-8℃ (스트레스가 가해짐; 액체 보관), 25℃ (가속화됨; 액체 보관), 및 40℃ (공격적/강제적 분해 조건; 액체 보관)에서 안정 상태로 두었다. 이들 조건은 제제 간의 차이를 강조할 것이라는 기대로 선택되었다.

SB-525 바이러스는 정화된 벌크 수확물로부터 정제되었고 CaCl₂, MgCl₂, 35 mM NaCl, 1% 수크로스, 및 0.05% 콜리포르® P 188 (폴록사머 188)을 함유하는 포스페이트 완충 식염수 (PBS)에서 대략 1.0E+13 vg/mL로 제제화되고, 바이알에 충전하고, ≤ -65℃에서 보관하였다.

물질 및 방법

SB-525 제제화된 벌크 약물 물질은 다음을 함유하였다: 멸균 여과되고 ≤ -65℃에서 125 mL HDPE 병에 보관된, 0.90 mM CaCl₂, 0.49 mM MgCl₂, 2.68 mM KCl, 1.47 mM KH₂PO₄, 172 mM NaCl, 8.10 mM Na₂HPO₄, 1% (w/v) 수크로스, 0.05% (w/v) 폴록사머 188, pH 7.0-7.6 중 SB-525 (1.0E+13 vg/ mL 공칭). Na₂HPO₄ (인산나트륨, 이염기성, 무수물), KH₂PO₄ (일염기성 인산칼륨), CaCl₂ (염화칼슘 2수화물), 및 MgCl₂ (염화마그네슘 6수화물)는 JT 베이커(Baker) 또는 피셔(Fischer)로부터 공급되었다. 폴록사머 188은 바스프(BASF)로부터 공급되었다. 보관 바이알은 6 mL 어셉틱 테크놀로지즈 (AT) 밀폐형 크리스탈 바이알 (어셉틱 테크놀로지즈; cat# VIA-060000)이었으며, 이는 주된 용기 폐쇄부(primary container closure), 제 위치에 열가소성 엘라스토머 마개 및 황색 캡을 가진 시클로-올레핀 공중합체 (COC)를 가진 바이알이다. DP 충전 전에, 제제화된 벌크 약물 물질 (FBDS)을 125 mL 고밀도 폴리에틸렌 (HDPE) 병에 충전하고 ≤ -65℃로 동결시켰다. 이어서 병을 주위 온도에서 해동하고, 완충제를 교환하고, 여과하고, 어셉틱 테크놀로지즈 M1 유닛을 사용하여 DP를 6 mL AT 바이알에 채웠다. 하나의 파일럿 배치 물질은 총 10개의 교환 부피에 대해 대략 40 psi의 압력에서 50 kDa 필터 유닛을 사용하여 TFF를 통해 완충제 교환되었다. 두 번째 파일럿 배치는 총 10개의 교환 부피에 대해 대략 40 psi에서 50 kDa NMW PES 필터에 걸쳐 아미콘(Amicon) 교반 셀을 사용하여 완충제 교환되었다. 두 가지 교환 방법은 물질의 유의한 손실이나 흡착 없이 AAV 용으로 이전에 사용되었다.

AT 바이알을 대략 1.0E+13 vg/mL의 목표로 2.5 mL 충전하고, ≤ -65℃에서 주위 조건까지 제어되지 않은 속도로 5회 주기로 동결 해동하고, 비-GMP 보관 유닛에 안정 상태로 두었다. 바이알은 표 11에 개요를 설명한 안정성 풀(pull) 일정에 적용되었고, 표 12에 열거된 방법에 의해 시험되었다. 시험된 제제는 표 13에 개요를 설명하였다.

<표 11>

캡시드 순도 안정성 일정

<표 12>

분석적 시험

<표 13>

제제

*대조군 제제 (F0): 0.90 mM CaCl₂, 0.49 mM MgCl₂, 2.68 mM KCl, 1.47 mM KH₂PO4, 172 mM NaCl, 8.10 mM Na₂HPO₄, 1% (w/v) 수크로스, 0.05% (w/v) 폴록사머 188 (P188), pH 7.0-7.6.

결과

제제 특성화

올바른 제제가 달성되었는지 확인하기 위해, SB-525 DP 제제를 시험하여 오스몰랄농도, P188 농도, 수크로스 농도, 및 환원 CGE에 의한 캡시드 비 및 순도를 결정하였다. M05-M08에 대한 이들 시험 결과는 하기 표 14에 나타냈다. 캡시드 순도 및 비는 rCGE에 의해 측정한 바와 같이 어떤 유의한 차이도 나타내지 않았다. 오스몰랄농도는 수크로스 수준에 따라 예상 범위 내에 있다. M05-M08 샘플은 P188에 대한 올바른 농도를 나타냈다. 또한, 칼슘과 마그네슘의 농도는 모든 제제에 대해 예상 범위 내에 있는 것으로 CEDEX에 의해 확인되었다.

<표 14>

제제 특성화

벡터 게놈 역가 (vg/mL)

M05-M08에 대한 벡터 게놈 역가 결과는 하기 표 15에 제시되어 있다. ≤ -65℃ 및 2-8℃ 조건에서, 4주 동안 보관 후에 관찰된 어떤 유의한 추세도 없었다. 3일 동안 40℃ 후, Ca/Mg 음성 제제는 벡터 게놈 역가에서 하향 추세를 나타냈다. 이 결과는 검정 가변성 내에서 고려되나, 이 제제에 대한 vp 역가 및 UV 260/280 결과와 일치한다.

<표 15>

게놈 역가 (vg/mL)

가시적 외관

모든 제제는 모든 시점 및 조건에 대해, 흑색 및 백색 백그라운드에 대한 육안 검사 동안 사용된, B9 색상 및 유백광 참조 1 이하, 색상 및 투명도 표준을 각각 나타냈다 (예를 들어, [Ph. Eur. 7.0, 20201, 20202 (01/2008); Millipore Sigma Colour Reference Solutions B] 참조). 가시적 외관 결과는 "대조군" 제제 (M05)만이 25℃에서 1주 초과 동안, 또는 40℃에서 3일 이상 동안 유지되는 경우 너무 많아 셀 수 없는 (TMTC) 백색 플레이크형 입자를 나타냈음을 나타낸다. M06 및 M07 제제는 때때로 TMTC 가시적 입자를 나타냈으나; 이들 샘플에 대한 입자 설명은 모두 섬유형 입자였다. 이들 입자는 이 연구에서 확인되지 않았지만, 섬유형 입자는 인산칼슘의 특징인 플레이크형 입자에 비해 외인성 입자 (예를 들어, 필터 입자)의 특징이 더 컸다. 또한, 엄격하게 제어된 환경 조건 하에 DP가 제조되지 않는 실험실-기반 개발 연구에서는 섬유형/외인성 입자의 출현은 무시할 만하다.

누적 비가시적 입자

HIAC에 의한 비가시적 누적 입자 분석은 유의한 비가시적 입자 수를 가진 유일한 제제가 "대조군" 제제임을 나타냈으며, 이는 더 공격적인 안정성 조건 (더 긴 시간 동안 더 높은 온도)에서 증가 추세를 나타냈다. 다른 제제 (M06-M08)는 시간 또는 조건과 무관하게, 유의하지 않은 입자 수만을 나타냈다.

기능적 생물검정 (효능)

기능적 FVIII 생물검정 결과는 하기 표 16에 제시되어 있다. 결과는 샘플이 ≤ -65℃ 또는 2-8℃ 조건에서 유지되는 경우 효능에 어떤 유의한 변화도 나타내지 않았다. 25℃에서, 4주 후 모든 제제 (M05-M08)의 효능의 하향 추세가 있었다. 40℃에서, 3일 후 Ca/Mg 음성 제제의 경우 효능의 유의한 하락이 있었다.

<표 16>

기능적 생물검정 (상대 효능)

SEC

SEC 결과는 하기에 제시되어 있다. 퍼센트 응집체 결과는 하기 표 17에 나타냈다. ≤ -65℃, 2-8℃, 또는 25℃ 안정성 조건에서 응집의 어떤 유의한 추세도 보이지 않았다. 40℃에서, Ca/Mg 음성 제제의 경우 응집체에서 1주 후 최대 7% HMWS까지 증가 추세가 있었다. "칼슘 음성" 제제는 40℃에서 1주의 종료시 대략 3% HMWS를 나타냈다. 다른 제제는 최대 5주 동안 ≤ -65℃ 또는 2-8℃, 최대 4주 동안 25℃, 그리고 최대 1주 동안 40℃에서 유지되는 경우 응집에서 유의한 성장을 나타내지 않았다.

<표 17>

SEC에 의한 응집체의 농도 (%HMWS)

*NMT: 이하. NT: 시험되지 않음.

바이러스 입자 결과는 하기 표 18에 제시되어 있다. ≤ -65℃, 2-8℃, 또는 25℃ 조건에서 유지된 모든 제제는 바이러스 입자 역가에서 어떤 유의한 변화도 나타내지 않았다. 그러나, 40℃에서, 3일 및 1주 후에 Ca/Mg 음성 제제에 대한 입자 역가의 유의한 하락이 있었다. 다른 제제 (M05-M06, M08)는 최대 5주 동안 ≤ -65℃ 또는 2-8℃, 최대 4주 동안 25℃, 그리고 최대 1주 동안 40℃에서 유지되는 경우 바이러스 입자 역가에서 유의한 하락을 나타내지 않았다.

<표 18>

SEC에 의한 바이러스 입자 역가 (vp/mL)

UV 260/280 비 결과는 하기 표 19에 제시되어 있다. UV 260/280 비의 경우, 40℃에서 유지되는 경우 Ca/Mg 음성 제제에 대해 기록된 하향 추세가 있었다. UV 260/280은 비어 있는/완전 입자 비의 대체물로 간주된다. 다른 제제 (M05, M06 및 M08)는 나타낸 바와 같이, 임의의 조건 또는 시점에서 UV 260/280 비의 어떤 유의한 변화도 나타내지 않았다.

<표 19>

SEC에 의한 UV 260/280 비

pH

하기 표 20에 나타낸 바와 같이, 모든 제제에 대해 임의의 조건 및 시점에서 pH의 어떤 유의한 변화도 없었다.

<표 20>

pH

질량 분석법 특성화 (탈아미드화)

질량 분석법에 의해 결정된 바와 같은 탈아미드화 결과는 하기 표 21에 제시되어 있다. 보다 낮은 온도에서 보관된 샘플은 5주 연구 기간에 걸쳐 제제 간에 유의한 차이를 나타낼 것으로 예상되지 않기 때문에 40℃에서 보관된 샘플만 이 시험에 사용하였다.

결과는 모든 제제의 T₀로서 대조군 제제의 T₀을 사용하여 제시된다. 모든 탈아미드화 사이트 중에서, AAV VP1의 N57G 및 N94H 핫스팟은 40℃에서 3주에 걸쳐 탈아미드화에서 가장 유의한 증가를 나타낸 두 곳이다. 다른 사이트가 또한 탈아미드화의 증가를 나타냈으나, 그 정도는 훨씬 적었다 (표시되지 않음). 이들 두 핫스팟은 형질도입 효율(transduction efficiency)에 영향을 미칠 것으로 예상되기 때문에 특히 중요하다. Ca/Mg 음성 제제는 탈아미드화에서 가장 유의한 증가를 나타냈다. 다른 제제 (M05, M06, 및 M08)는 모두 40℃에서 3일 및 3주 후에 유사한 수준의 탈아미드화 증가를 가졌다.

<표 21>

질량 분석법에 의한 탈아미드화 (40℃에서 %)

*T₀은 M05 물질에 대해 시험되었으며 모든 제제에 대해 T₀으로서 사용되었다.

결론

현재의 SB-525 제제에 대한 세 가지 가능한 변화를 평가하였다: 칼슘이 없는 것, 칼슘도 마그네슘도 없는 것, 그리고 더 높은 농도의 수크로스를 가진 것. 실시예 1 및 2는, 특히 동결/해동 순환 후 1주 초과 동안 25℃, 또는 3일 이상 동안 40℃에서 안정 상태로 유지한 후에, 완충제 및 약물 제품 둘 다에서 나타나는 매우 많은 백색-플레이크 입자의 무작위 생성을 나타낸다. 입자는 인산칼슘으로서 확인되었다.

여기서의 결과는 염화칼슘이 의도되고 스트레스가 가해진 보관 조건에서 제품 안정성을 위한 비필수 부형제임을 입증한다. 또한, 40℃에서 최대 2주, 25℃에서 4주, 그리고 5℃ 및 -70℃에서 5주 동안 "칼슘 음성" 및 "고 수크로스" 제제에 대해 어떤 유의한 차이도 관찰되지 않았다. 그러나, 제제로부터 칼슘과 마그네슘 둘 다를 제거하면, 특히 40℃에서 유지되는 경우, vg 및 vp 역가의 더 큰 하락뿐만 아니라 더 높은 탈아미드화 및 응집을 나타내는 것을 포함하여, 약물 제품 품질 속성의 변화를 발생시키는 것으로 관찰되었다. 또한, 5주 동안 내내, 이전 (대조군) 제제만이 백색 플레이크형 입자를 계속 나타내는 것으로 밝혀졌다.

실시예 4: SB-525의 추가 재제제화

입자 생성을 방지하기 위해, 제제에 대한 세 가지 유형의 변화가 본 실시예에서 시험되었다: (1) 수크로스 농도를 1%에서 5-10%로 증가시켜 FT 스트레스에 대한 안정성을 증가, (2) 2가 양이온을 제거하여 입자 공급원을 제거하고 잠재적인 용해도 문제를 방지, 그리고 (3) NaCl을 증가시켜 제제의 이온 강도를 이동시킴.

보다 구체적으로, 본 실시예의 실험은 이전 (대조군) 제제와 비교하여 여러 변형 중 하나로 재제제화되는 경우 SB-525 완충제의 안정성을 평가하였다; 즉, 172 mM NaCl, 8.10 mM Na₂HPO₄, 2.68 mM KCl, 1.47 mM KH₂PO₄, 0.90 mM CaCl₂, 0.49 mM MgCl₂, 1% (w/v) 수크로스, 및 0.05% (w/v) 폴록사머 188, pH 7.0-7.6. 제제를 6 mL AT 바이알에 5 mL로 충전하고, 5회의 제어되지 않은 FT 주기 (≤ -65℃에서 주위)에 적용한 다음에, 2-8℃ (가속화됨; 액체 보관) 및 25℃에서 (스트레스가 가해짐; 액체 보관)에서 열 안정 상태로 두어 입자 형성에 대한 다양한 완충제를 평가하였다.

연구 설계

표 22에 나타낸 바와 같은, 시험된 제제는 염화나트륨 및 염화칼륨과 인산나트륨 및 인산칼륨을 물에 첨가한 후, 수크로스를 첨가함으로써 제제화하였다. 존재하는 경우, 염화마그네슘에 이어서 염화칼슘을 별도의 50 mL 용액으로 준비하고, 더 큰 용액으로 옮겼다. 이어서, 폴록사머 188을 용액에 첨가하였다. 이어서 제제를 충분히 첨가하고 (적당량), pH를 시험하고, 0.22 μm PES 필터 상에서 여과하였다.

<표 22>

제제

이들 제제로, AT 바이알을 5 mL로 충전하고, 5회 제어되지 않은 동결/해동 주기를 거친 다음에, 5℃ 또는 25℃ 안정 상태로 두었다. 안정성 풀 일정은 표 23에 개요를 설명하였다. 표에서, X는 외관 (액체)을 지칭하며; A는 오스몰랄농도 (어는 점 하락), 전도도, 점도, 및 밀도를 지칭하며; B는 HIAC를 사용한 빛 차폐(light obscuration)를 지칭하며; C는 P188 농도를 지칭하고; D는 pH를 지칭한다.

<표 23>

안정성 일정 0139-M03 내지 -M08

* 5 FT 샘플은 열 안정성 샘플에 대한 T₀이었다.

제제 특성화

전도도, 오스몰랄농도, 밀도, 및 점도를 결정하기 위해 SB-525 완충제 제제를 시험하였다. P188 농도는 또한 5℃ 보관의 2.5주, 및 25℃ 보관의 5일에서 측정되었다. 이들 시험에 대한 결과는 하기 표 24에 나타냈다. M03-M09에 대한 전도도, 오스몰랄농도, 밀도, 및 점도의 결과는 모두 예상되는 추세를 따른다 - 수크로스의 양이 많을수록 오스몰랄농도, 밀도, 및 점도가 더 높아졌으며; NaCl이 높을수록 오스몰랄농도 및 전도도가 높아졌다. P188 농도에 대한 결과는 각각의 결과 세트에 대한 방법 가변성 내에 있었으며, 이는 제제화 동안 올바른 P188 농도가 달성되었음을 확인시켜 준다.

<표 24>

제제 특성화

¹밀도 측정 동안 온도는 20.0℃로서 기록되었다.

²점도 측정 동안 온도는 20.0℃로서 기록되었고 전단 속도는 2000 s-1로서 기록되었다.

pH

하기 표 25에 나타낸 바와 같이, FT 순환 동안 임의의 제제에 대해 pH의 어떤 유의한 변화도 관찰되지 않았다.

<표 25>

pH 결과

가시적 외관

모든 샘플은 시험된 각각의 조건 및 시점에 대해, B9 색상 및 유백광 참조 1 이하를 나타냈다. 가시적 외관 결과는 대조군 제제 (M09)만이 5℃ 및 25℃에서 5일에서 최대 8주까지 일관되게 너무 많아 셀 수 없는 (TMTC), 백색 플레이크형 입자를 나타냈음을 나타냈다. 5% 수크로스 제제는 TMTC 가시적 입자의 무작위 생성을 나타냈다. 많은 샘플은 또한 1-5개의 섬유질 입자를 나타냈다. 이들 입자는 이 연구에서 확인되지 않았지만, 섬유형 입자는 인산칼슘의 특징인 플레이크형 입자에 비해 외인성 입자 (예를 들어, 필터 입자)의 특징이 더 컸다. 또한, 엄격하게 제어된 환경 조건 하에 DP가 제조되지 않는 실험실-기반 개발 연구에서는 섬유형/외인성 입자의 출현은 무시할 만하였다.

비가시적 입자 수

HIAC에 의한 비가시적 입자 분석은 유의하고 일관된 비가시적 입자 수를 가진 유일한 제제가 대조군 제제 (M09)이며, 더 높은 안정성 조건 (25℃)에서 계속 진행중인 보관에 의해 악화됨을 나타냈다. 다른 제제 (M03-M08)는 시간 또는 조건과 무관하게 유의하지 않은 입자 수를 나타냈고, 어떤 전반적인 추세도 나타내지 않았다.

결론

본 실시예는 이전 (대조군) SB-525 제제로부터의 여러 제제 변형체에 대한 동결-해동 스트레스 및 열 안정성의 효과를 평가하였다. 일곱 가지 상이한 제제를 AT 크리스탈 밀폐형 바이알에 충전하고, 동결-해동 순환시키고, 5℃ 및 25℃에서 8주 동안 보관하였다. 모든 연구 조건에 걸쳐, 대조군 제제만이 일관되게 백색 플레이크형 입자를 계속 나타냈다.

FT 순환 후에, 어떤 제제도 유의한 가시적 입자 형성 또는 pH 변화를 나타내지 않았으며, 따라서 모든 제제는 8주 기간에 걸쳐 5℃ 및 25℃에서 단기간 안정 상태로 두었다. 안정 상태로 두었을 때, 유의한 가시적 입자를 일관되게 생성하는 것으로 나타난 유일한 제제는 대조군 제제 (M09)였다. 입자 결과는 필적하였긴 하지만 (즉, 어떤 유의한 가시적 입자 생성도 없음), "200 mM NaCl" (M03), "5% 수크로스" (M04) 및 "10% 수크로스" (M06) 제제가 계속되는 재제제화 연구를 위해 선택되지는 않았다. 특히, "5% 수크로스" 제제 (M04)는 백색 플레이크형 입자의 일부 형성을 나타냈으며, 이는 수크로스의 이 농도가 FT 스트레스로 인한 입자 생성을 방지하기에 충분하지 않을 수 있으며, "10% 수크로스" (M06)는 그의 더 높은 점도로 인해 제조상의 도전과제를 도입할 수 있음을 나타내는 것이다. 따라서, 이들 결과를 기반으로 하여, "8.5% 수크로스" (M05), "칼슘 음성" (M07), 및 "칼슘 및 마그네슘 음성' (M08) 제제가 유망한 것으로 보인다.

실시예 5: SB-525에 대한 최종 제제

SB-525 (PF-07055480) 약물 물질 (DS)의 조성 및 설명은 표 26에 제시되어 있다. 제제는 7.3 ± 0.3의 최종 pH를 가졌다. 부형제 농도는 염기 완충제 (포스페이트 완충 식염수)를 첨가하여 전체적으로 또는 부분적으로 수득하였다. DS 농도 목표는 1.0E+13 vg/mL (0.5E+13 - 2.5E+13 vg/mL)였으며, DS 범위는 DS 목표의 50-250%였다.

<표 26>

SB-525 약물 물질 제제 설명

SB-525 (PF-07055480) 약물 제품의 조성 및 설명은 표 27에 나타냈다. DP는 7.3 ± 0.3의 최종 pH를 가졌다. 부형제 농도는 염기 완충제 (포스페이트 완충 식염수)를 첨가하여 전체적으로 또는 부분적으로 수득하였다. DP 농도 목표는 1.0E+13 vg/mL (0.3E+13 - 3.0E+13 vg/mL)였으며, DP 범위는 DP 목표의 30-300%였다.

<표 27>

SB-525 약물 제품 제제 설명

용기 및 충전 부피

여과된 약물 물질을 멸균 고밀도 폴리에틸렌 (HDPE) 병에 패키징하였다. 제 위치에 열가소성 엘라스토머 마개 (어셉틱 테크놀로지즈 VIA-101800)를 가진 AT 10 mL 시클로-올레핀 공중합체 (COC) 바이알에 DP를 충전하였다. DS와 DP 둘 다 -60℃ 내지 -90℃에서 보관하였다. 각각의 바이알은 6.4E+13 (공칭 6.0E+13) vg SB-525 AAV와 함께, 6.4 mL의 DP (의도된 추출가능 부피 6 mL)를 함유하였다.

DP의 특성화

SB-525 DP의 점도, 오스몰랄농도, 밀도, 및 전도도를 측정하였다. 밀도는 1.0106 g/mL (20℃)였다. 점도는 1.112cP (20℃)였다. 오스몰랄농도는 374 mOsm/kg이었다. 전도도는 17.80 mS/cm (20℃)였다.

실시예 6: AAV6 바이러스 벡터 약물 제품 제제

하기 실시예 6 내지 8은 다양한 농도의 2가 양이온 염을 함유하는 AAV2/6 바이러스 벡터 약물 제품 제제를 평가하기 위해 수행된 추가적인 재제제화 및 가속화된 안정성 연구를 기재한다. 이전 예에서와 같이, 바이러스 벡터는 AAV6 캡시드 및 AAV2 ITR을 함유하는 재조합 게놈을 가진다. 여기서의 바이러스 벡터는 알파-L-이두로니다제 (IDUA)를 코딩하는 트랜스진을 운반한다. 이 트랜스진은 헐러 증후군(Hurler Syndrome) (리소좀 축적 장애)으로도 알려진 점액다당류 I형 (MPS I)을 가진 환자와 같이, IDUA-결핍인 환자에게 도움이 될 것이다. AAV 게놈은 US2020/0246486의 표 5에서 서열 번호 28로서 나타냈다. 바이러스 게놈은 AAV 캡시드 내에 위치하고 제품 제제에 노출되지 않기 때문에, 이전 실시예에서의 것들와 같이, 실시예 6 내지 실시예 8에서 이루어진 관찰은 다른 트랜스진을 운반하는 AAV6 벡터에 적용가능할 것으로 예상된다.

동결/해동 주기 후에 침전물을 형성하지 않는 신규 제품 제제를 확인하기 위해 연구가 또한 수행되었다. 다양한 농도의 2가 양이온 염을 함유하는 4개의 AAV6 바이러스 벡터 약물 제품 제제의 안정성을 평가하였다.

시험된 제제는 다양한 농도의 2가 양이온 염 (Ca²⁺ 및 Mg²⁺)을 함유하였다. 상기에 기재된 바와 같이, 이전의 AAV6 제제뿐만 아니라 AAV6이 없는 제제 완충제는 모두 다수의 동결/해동 주기 후에 소량의 가시적 침전물을 형성하는 것으로 관찰되었다. 침전된 입자는 인산칼슘 염으로 구성된 것으로 결정되었다. 약물 제품은 전형적인 사용 동안 동결/해동 주기를 경험하기 때문에, 염 침전 가능성은 환자 안전성에 대한 위험뿐만 아니라 제품 품질에 대한 위험을 초래할 것이다. 하기 실시예 6-8에 나타낸 연구는 이러한 침전 문제를 갖지 않는 개선된 제제를 찾는 것을 목표로 하였다.

연구에서, AAV6 바이러스 벡터 제품의 샘플은 접선 흐름 여과 및 더 높은 농도를 가진 스파이킹 샘플 "스파이크 완충제"에 의해 상이한 제품 제제로 제조되었다. 이어서 재제제화된 샘플을 다양한 가속화된 안정성 조건에서 인큐베이션하고, 샘플의 품질 속성을 인큐베이션 후 평가하였다. 품질 속성 결과는 적절한 경우 알려진 방법 가변성을 고려하여 평가되었다. 네 가지 제제 각각에 대해 연구 지속기간에 걸쳐 이상치 및 추세 결과를 확인하였다. 합격(Pass), 애매함(neutral), 또는 불합격(Fail)의 득점은 각각의 연구 종점의 결과를 기반으로 하여 각각의 품질 속성 및 제제에 배정되었다. 마지막으로, 각각의 네 가지 제제의 전반적인 품질 속성 안정성 점수를 서로 비교하였다. 연구는 하기에 상세히 설명되어 있다.

샘플 제조

본원에서 제조된 AAV6 생성물 제제는 하기 표 1에 기재된 바와 같이 제제 완충제 F0에 현탁된 대략 1.0E+13 vg/mL의 AAV6 공여체 벡터를 함유하였다. 완충제 F0은 둘베코의 포스페이트 완충 식염수의 레시피를 기반으로 하며, 이는 2가 양이온 칼슘 (CaCl₂로서) 및 마그네슘 (MgCl₂로서), 대략 35 mM의 추가 염화나트륨을 포함하고, 1% w/v 수크로스 및 0.05% w/v 폴록사머 188로 제제화된다.

AAV6 물질을 대안적 완충제 제제로 옮기기 위해, 접선 흐름 여과에 의한 완충제 교환을 도 2에 나타낸 바와 같이 수행하였다. 간단히 말해서, 완충제 F0에서 제제화된 AAV6 약물 제품의 여러 바이알을 해동하고 단일 한외여과/정용여과 (UF/DF) 저장소로 옮겼다. 한외여과를 먼저 수행하여 물질을 대략 2x 농축하였다. 이어서 농축된 물질을 적어도 10x 등가 부피의 제제 완충제 F1로 정용여과하였다. 따라서, 도 2에서 "A"로 표지된 회수된 중간 물질은 제제 완충제 F1에 현탁된 대략 2.0E+13 vg 카피/mL를 함유해야 한다.

이어서 중간 UF/DF 생성물 "A"는 세 가지 부피로 분리되었고 세 가지 상이한 완충제로 제제화되었다. 세 가지 추가 제제 완충제 (F1, F2, 및 F3; 표 28)는 추가 염화나트륨, 수크로스, 및 폴록사머 188 (예를 들어, 플루로닉(Pluronic)® F-68)과 함께 둘베코의 포스페이트 완충 식염수로부터 유래되었다. 이들 세 가지 완충제는 어떤 칼슘도 함유하지 않았으며 대신에 상이한 양의 마그네슘을 가졌다. 완충제 F1은 어떤 칼슘 또는 마그네슘 성분도 함유하지 않았고, 완충제 F2는 F0과 동등한 몰 농도의 마그네슘을 함유하였으며, 완충제 F3은 완충제 F0으로부터 제거된 칼슘의 몰수를 차지하는 추가 마그네슘을 함유하였다.

<표 28>

제제 완충제의 조성

샘플 제조를 단순화하고 상이한 완충제의 제조를 허용하기 위해, 완충제 F2 및 F3의 6배 더 높게 농축된 "스파이크 완충제"를 제조하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 이들 F2 및 F3 "6x 농축" 완충제는 F1과 1:5 비로 혼합되는 경우 각각 의도된 조성의 완충제 F2 및 F3을 산출하였다.

이들 제제 완충제를 제조하기 위해, 개별 건조 성분을 마이크로저울을 사용하여 칭량하였다. 성분을 혼합하고 주사용 탈이온수로 용해시켰다. 이어서 필요에 따라 이들 완충제를 0.1 M NaOH 또는 0.1 M HCl로 의도된 pH 범위로 적정하였다. 마지막으로, 이들 완충제는 수크로스 및 폴록사머 188을 사용하여 원하는 농도로 제제화되었다.

제조된 약물 제품 제제의 조성을 체크로서 몇몇 반정량 검정으로 측정하였고, 그의 결과는 표 29에 보고하였다. 기성 비색 검정을 사용하여 Ca²⁺ (바이오 비젼(Bio Vision) Cat# K380-250) 및 Mg²⁺ (바이오 비젼 Cat#K385-l 00)의 농도를 측정하였다. 두 비색 검정 모두의 경우, 샘플 농도는 검정의 동적 선형 범위 내에 있었고, 보고된 신호 및 계산된 농도는 이론적 샘플 조성의 경향을 잘 나타내었다. 결정적으로, 제제 F1, F2 및 F3에 대한 칼슘 신호는 모두 검정 음성 대조군과 일치하였다. 따라서, 이들 샘플은 어떤 칼슘도 함유하지 않았으며, TFF 샘플 제조 단계는 F0 출발 물질에 존재하는 임의의 칼슘을 제거하는 데 효과적이었다. 마그네슘 검정은 또한 Mg²⁺가 TFF에 의해 제거되고 F2 및 F3에서 적절한 농도로 스파이킹되었음을 확인해 주었다.

<표 29>

제제화된 약물 제품의 실험적으로 측정된 파라미터

*MADLS: 다각도 동적 광 산란.

또한 vg 역가를 측정하기 위해 qPCR을 수행하였고, 입자 농도를 측정하기 위해 다각도 동적 광 산란 (MADLS)을 수행하였다. 다시 말하면, 이들 결과는 샘플 제조로부터 예상된 범위에 있었으며, 이는 완충제 교환 및 제제화 단계가 의도한 바와 같이 수행되었음을 나타낸다.

벌크 제제화 제품을 멸균 여과하고 0.5 mL/바이알로 2 mL 시클릭 올레핀 중합체 (COP) 바이알 (웨스트 파르마(West Pharma)/다이쿄(Daikyo) CZ Cat # 19550057)에 충전하였다.

샘플 인큐베이션

바이알에 든 약물 제품을 하기에 기재된 다양한 조건에서 인큐베이션하였다. 동결/해동 순환은 표 30에 열거된 풀 데이트로 수행되었다.

<표 30>

동결/해동 순환 샘플 풀 데이트

샘플을 "가속화된, 스트레스가 가해진" 조건 (40℃/75% 상대 습도 (RH)) 또는 "가속화된, 주위" 조건 (25℃/60% RH)에 적용하였고, 풀 데이트는 D3, D7, 2주, 1개월, 2개월, 3개월 또는 6개월이었다. 샘플을 2-8℃에서 보관하였고 그의 풀 타임 24시간 내에 분석하였다.

모든 풀링된 샘플을 의도된 샘플 시험을 위해 폴리카보네이트 플립-탑 원심분리기 튜브에 분취하였다. 분취액을 2개월 이하 동안 활성 시험 동안 2-8℃에서 보관하였다. 풀 데이트로부터 합리적인 시간 내에 시험을 수행하지 않은 경우, 분취액을 시험이 발생할 수 있을 때까지 ≤ -65℃에서 동결시켰다. 시험 후 모든 유지 샘플 및 나머지 물질을 장기간 보관을 위해 ≤ -65℃에서 동결시켰다.

실시예 7: AAV6 약물 제품 제제의 시험

수행된 샘플 시험은 표 31에 열거된 품질 속성을 포함하였다. 약어는 다음과 같이 표시된다: DLS, 동적 광 산란; MADLS, 다각도 동적 광 산란; HMWS, 고분자량 종; SE-LC, 크기 배제 액체 크로마토그래피; 및 AEX-LC, 음이온 교환 액체 크로마토그래피. 용액의 외관을 평가하여 용액이 투명하고 무색이며 미립자가 없는지 확인해 주었다. 흐리거나, 탁하거나, 가시적 입자를 함유한 용액은 기준을 충족하지 못하였다.

<표 31>

평가된 제품 품질 속성

초기 샘플

모든 초기 제제화 약물 제품 샘플로부터의 품질 속성 결과는 표 32 및 표 33에 나타냈다. 결과는 일반, 순도, 및 강도의 품질 속성 범주에 의해 그룹화된다.

<표 32>

초기 (t₀) 샘플의 일반 및 순도 품질 속성 결과

<표 33>

초기 (t₀) 샘플의 강도 품질 속성 결과

초기 감염 역가 결과는 다른 초기 샘플과 비교했을 때 F3의 경우 대개 낮았다. 이것은 또한 다른 샘플보다 훨씬 더 높은 vg/TCID 비를 발생시켰다. 이것은 주로 TCID₅₀ 검정의 가변성에 기인하였다. 다른 결과 중 어느 것도 실질적으로 영향을 받지 않는 것으로 보였다.

동결/해동 순환된 샘플

네 가지 상이한 제제의 동결/해동 순환으로부터의 시험 결과를 도 4a-도 4d에 나타냈다. 데이터는 동결/해동 순환이 용액 pH, 단량체 캡시드 크기, 샘플 크기 분포, 또는 완전 캡시드 함량에 영향을 미치지 않았으며; 또한 모든 네 가지 제제에서 유의한 양의 HMWS 또는 가용성 응집체를 생성하지도 않았음을 나타낸다. 그러나, 동결/해동 순환은 초기 F0 대조군 제제에서 가시적 외관 불합격을 야기하였다. 5x F/T 주기 후, 침전물의 작은 백색 반점(fleck)이 관찰될 수 있었고, 이들은 이전에 관찰된 인산칼슘 침전물의 특징이었다. 이들 침전물은 제제 F1, F2 또는 F3에서 검출되지 않았다. 데이터는 또한 시험 방법의 가변성을 또한 고려할 경우 동결/해동 순환이 임의의 제품 강도 속성에 유의하게 영향을 미치는 것으로 보이지 않았음을 나타낸다.

25℃/60% RH (주위) 가속화된 샘플

네 가지 상이한 제제의 주위 조건 (25℃/60% RH) 인큐베이션으로부터의 시험 결과를 도 5a-도 5d에 나타냈다. 데이터는 외관과 pH가 25℃ 조건에 영향을 받지 않음을 나타낸다. 샘플 크기 분포는 넓어져, 다분산 지수 (PDI)가 증가하는 것으로 보였고, 단량체 피크 평균 크기는 배양 시간이 증가함에 따라 약간 성장하였다. 고 분자량 종 (HMWS)이 또한 인큐베이션 시간 동안 형성되기 시작하였다. 일반적으로, 이들 HMWS는 DLS에 의해서보다 SE-LC에 의해 더 쉽게 검출되었다. 완전 캡시드와 비어 있는 캡시드의 전하 분리는 25℃에서 1-2개월 인큐베이션 후 손실된 것으로 보였으므로, % 완전 캡시드는 AEX-LC에 의해 측정할 수 없었다. 캡시드 역가 및 단량체 농도는 25℃ 조건에 의해 영향을 받지 않았고, vg 역가도 영향을 받지 않는 것으로 보였다. TCID₅₀은 F0, F1, F2의 경우 3개월 및 6개월 시점에서 감소하였으나 F3으로는 동일한 결과가 관찰되지 않았다.

40℃/75% RH 스트레스가 가해진 샘플

네 가지 상이한 제제의 스트레스 조건 (40℃/75% RH) 인큐베이션으로부터의 시험 결과를 도 6a-도 6d에 나타냈다. 데이터는 40℃/75% RH 조건이 여러 제품 품질 속성에 훨씬 더 큰 영향을 미쳤음을 나타낸다. 입자 크기 분포가 실질적으로 넓어지고 HMWS가 형성되었다. SE-LC는 DLS보다 적은 양의 HMWS를 검출하는 데 더 민감한 것으로 보였으나, 다량의 HMWS (및 아마도 더 큰 분자량 종)가 존재할 경후, 이들 입자는 SE-LC에 의해 검출되지 않았을 수 있다. 이들 경우에 검출기에 도달하기 위해 큰 분자량 종은 여과되었거나 LC 컬럼을 통과하지 않을 가능성이 있다.

40℃에서 3개월 후, 모든 용액이 흐릿하게 보이기 시작했는데, 이는 아마도 큰 불용성 응집체 또는 HMWS의 형성으로 인한 것일 수 있다. 용액 pH는 영향을 받지 않는 것으로 보였다. TCID₅₀은 40℃/75% RH에서 1개월 후 모든 샘플에서 실질적으로 감소하였으며 F3에서 초기부터 가장 작은 감소가 보였다.

실시예 8: 연구 종점 평가

각각의 제제에 대해 샘플내 분석을 수행하였다. 각각의 제제 내에서, 각각의 품질 속성에 대한 각각의 연구 종점 결과는 도 7에 기재된 바와 같이 허용 및 불합격 기준에 대해 채점되었다. 의도된 안정성 연구 종점은 다음과 같았다: 주기당 ≤ -65℃에서 12시간 이상 그리고 주위 온도에서 6시간 이상의 10x 동결/해동 주기, 25℃/60% RH에서 3개월, 및 40℃/75% RH에서 1개월. 각각의 연구 종점에서, 도 7에 열거된 바와 같은 품질 속성은 공지되고 확립된 방법 가변성뿐만 아니라 이 연구에서 생성된 모든 데이터의 전체적 평가를 기반으로 하여 결정되었다.

샘플간 분석 또는 각각의 제제의 상대적인 평가를 수행하기 위해, 각각의 품질 속성에 대한 각각의 종점 점수를 제제별로 비교하였다. 단일 품질 속성을 고려할 때, 네 가지 고려된 제제에 걸쳐 상대 종점 득점을 전체적으로 비교함으로써 각각의 제제에 대해 전반적인 합격, 애매함, 또는 불합격 득점을 배정하였다. 예를 들어, 모든 종점 결과가 주어진 제제에 대해 허용 기준을 통과한 경우, 그 제제에 대한 품질 속성에 대해 전반적인 합격 점수가 배정되었다. 그 제제에 대한 전반적인 품질 속성 득점을 배정할 때 애매함 및 불합격 종점 조건의 수를 고려하였다. 외관과 같은 특정 품질 속성의 경우, 하나의 불합격 종점 점수가 그 제제에 대한 전반적인 불합격 점수를 매기기에 충분하였다. 단량체 농도와 같은 다른 품질 속성의 경우, 모든 제제 (F3 제외)에 대해 40℃ 조건에서 하나의 불합격 종점이 직면되었으며; 따라서, 이 불합격 종점은 심각하게로 점수가 매겨지지 않았다. TCID₅₀결과는 정보용으로만 포함되었으며 득점은 배정되지 않았다.

이들 샘플내 샘플 분석 점수는 도 8 및 도 9에 나타냈다. 각각의 제제에 대한 모든 전반적인 품질 속성 점수의 요약 표를 표 34에 나타냈으며, 여기서 제제 F0은 대조군으로서 사용된다.

<표 34>

샘플간 제제 평가 요약

가속화된 안정성 연구의 지속기간 동안 전체 품질 속성 득점은 제제 F3 및 F2가 F0 및 F1보다 우수함을 입증한다. 제제 F3은 여덟 가지의 전반적인 합격 품질 속성 점수 및 단 두 가지의 애매함 점수로, 가장 잘 수행한 것으로 보인다. 제제 F2가 또한 잘 수행하였다. F0은 외관에 대한 전반적인 불합격 점수를 가졌고, 이는 이 제품 제제를 개선하기 위한 초기 목표를 확인해 준다. F1은 가장 많은 양의 HMWS가 검출되어 가장 많은 양의 응집을 갖는 것으로 보였다.

실시예 9: 확장된 온도 시험

제제 완충제에서 1.00E+13 vg/mL로 제공된 SB-525 (PF-07055480) 약물 제품의 안정성을 확장된 온도에서 시험하였다. 제제 완충제는 하기 성분을 함유하였다: 0.49 mM MgCl₂, 2.68 mM KCl, 1.47 mM KH₂PO₄, 172 mM NaCl, 8.10 mM Na₂HPO₄, 1% (w/v) 수크로스, 0.05% (w/v) 폴록사머 188, pH 7.4.

약물 제품을 함유하는 바이알을 (i) -70℃에서 0일 동안 (T₀), (ii) -150℃에서 3일 동안 (T_3-일), 및 (iii) -150℃에서 14일 동안 (T_14-일) 보관하였다. 이어서, 약물 제품 샘플을 (i) 외관 (액체), (ii) 환원 CE-SDS, (iii) SEC 역가_260/280, 및 (iv) 시험관내 FVIII 활성 (생물검정)에 대해 분석하였다. 제제 완충제 샘플은 또한 (i) 용기 폐쇄부 무결성에 대해 분석되었다.

하기 표 35에 나타낸 바와 같이, 샘플을 최대 14일 동안 -150℃에서의 보관을 포함하여 시험된 조건에서 보관하였을 경우 색상, 투명도, 환원 CE-SDS, SEC 역가_260/280 (비어 있는:완전 캡시드 비에 대한 대체 측정치), 또는 생물학적 활성 (% 상대 효능)에서 어떤 유의한 변화도 없었다. -150℃에서 14일 보관 후에도 용기 폐쇄부 무결성에 대해 어떤 영향도 관찰되지 않았다.

<표 35>

안정성 결과

EFVP: 본질적으로 가시적 입자가 없음

TMTC: 셀 수 없을 정도로 많음

N.T.: 시험되지 않음

실시예 10: 운송 시뮬레이션 및 확장된 온도 시험

충격, 압력, 낙하, 및 진동과 같은 시뮬레이션된 운송 조건 하에 SB-525 약물 제품의 안정성을 시험하였다. SB-525 약물 제품은 하기 성분을 함유하는 제제 완충제에서 1.00E+13 vg/mL로 제공되었다: 0.49 mM MgCl₂, 2.68 mM KCl, 1.47 mM KH₂PO₄, 172 mM NaCl, 8.10 mM Na₂HPO₄, 1% (w/v) 수크로스, 0.05% (w/v) 폴록사머 188, pH 7.4.

약물 제품을 함유하는 시험 샘플 바이알은 최악의 경우의 전체 수송 프로파일을 활용하여, 공동으로 적용되는 수송 위험 (예를 들어, 충격, 압력, 낙하, 및 진동)을 겪었다. 대조군 샘플 바이알은 그러한 공동으로 적용되는 수송 위험에 적용되지 않았다. 시뮬레이션의 일부로서, 시험 바이알을 -35℃에서 40시간 동안 및 후속적으로 -70℃에서 또 다른 40시간 동안 유지하였다. 시뮬레이션 후, 대조군 및 시험 약물 제품 바이알을 -70℃에 보관하고 0일 (T_0,), 6개월 (T_6-개월), 및 10개월 (T_10-개월)에 시험하였다. 제제 완충제 바이알을 -70℃에서 보관하고 T₀에 시험하였다. 약물 제품 샘플을 (i) 외관 (액체), (ii) 환원 CE-SDS, (iii) SEC 역가_260/280, 및 (iv) 시험관내 FVIII 활성 (생물검정)에 대해 분석하였다. 제제 완충제 샘플을 (i) 용기 폐쇄부 무결성에 대해 분석하였다.

하기 표 36에 나타낸 바와 같이, 샘플을 최대 10개월 동안 시험된 조건에서 보관한 경우, 색상, 투명도, 환원 CE-SDS, SEC 역가_260/280 (비어 있는:완전 캡시드 비에 대한 대체 측정치), 또는 생물학적 활성 (% 상대 효능)에 어떤 유의한 변화도 없었다. T₀에 용기 폐쇄부 무결성에 어떤 영향도 없었다.

<표 36>

안정성 결과

실시예 11: 약물 제품 안정성 데이터 - 24개월

이 연구의 목적은 의도된 보관 온도 (-70℃)에서 SB-525 약물 제품의 장기간 (24개월) 안정성을 확립하는 것이었다. 이 연구를 위해, SB-525 약물 제품 (DP)을 Sf9 곤충 세포로부터 정제하고 8.10 mM Na₂HPO₄, 1.47 mM KH₂PO₄, 0.49 mM MgCl₂, 2.68 mM KCl, 172 mM NaCl, 1% (w/v) 수크로스, 및 0.05% (w/v) 폴록사머 P188, pH 7.3 ± 0.3 중 1.00E+13 벡터 vg/mL의 목표로 제제화하였다. 이어서 DP를 6.4 mL로 10 mL 어셉틱 테크놀로지즈 (AT) 크리스탈 밀폐형 바이알에 충전하고, -60℃ 내지 -90℃에서 보관하였다.

5회 주기의 제어되지 않은 F/T 및 24시간 교반을 포함한, DP 안정성 연구로부터의 결과를 도 10에 나타냈다. 데이터는 색상, 투명도, pH, 비가시적 누적 미립자 물질, R-CGE에 의한 캡시드 순도 및 VP 비, SEC-HPLC에 의한 %HMMS 및 UV 260/280, 및 캡시드 역가에서 -70℃에서 최대 24개월, 5℃에서 12개월, 그리고 25℃ / 60% RH에서 3개월까지 관찰된 어떤 명백한 추세도 없었음을 나타낸다. 12개월, 5℃ 샘플은 제어되지 않은 환경 조건 (즉, 개방된 실험실 공간)에서 형태론 및 시험을 기반으로 하여 본질적으로 외인성인 것으로 보인 용액에서 "1개의 긴 섬유 입자"를 보고하였으며; 모든 다른 샘플은 "본질적으로 가시적 입자가 없음"을 보고하였다. 5회 주기의 제어되지 않은 F/T 또는 24시간 교반 후에 이들 품질 속성의 어떤 변화도 관찰되지 않았다.

시험된 모든 시점 및 조건에 대해, 게놈 역가 및 감염 바이러스 역가뿐만 아니라 감염성 비에 대한 결과의 가변성은 예상된 검정 가변성 내에 있었고 명백한 추세를 나타내지 않았다. 민감하고 정밀한 안정성-표시법인 시험관내 상대 효능에 대한 결과는 의도된 보관 조건(-70℃)에서 24개월 후 효능의 약간 하향 추세를 나타내나, 결과는 임상적 안정성 허용 기준 내에 있다. 25℃ / 60% RH에서 3개월 및 5℃에서 12개월에서 효능의 안정성-표시 하향 추세가 또한 관찰되었다.

또한, 용기 폐쇄부 무결성 (CCIT)은 검증된 헤드스페이스 분석기에 의해 의도된 보관 조건 (-70℃)에서 18개월에 시험하고 합격 결과를 기록하였다. 이 분석에는 6개의 비상용 바이알이 사용되었다. P188 농도가 또한 -70℃에서 최대 18개월, 5℃에서 12개월, 그리고 25℃/60% RH에서 3개월 동안 안정적이었다. -70℃에서 24개월에 P188 농도의 약간의 감소가 관찰되었다.

SEQUENCE LISTING <110> SANGAMO THERAPEUTICS, INC. PFIZER INC. <120> IMPROVED PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS CONTAINING ADENO-ASSOCIATED VIRAL VECTOR <130> 025297.WO029 <140> <141> <150> 63/127,826 <151> 2020-12-18 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1457 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 1 Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe 1 5 10 15 Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser 20 25 30 Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg 35 40 45 Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val 50 55 60 Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile 65 70 75 80 Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln 85 90 95 Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser 100 105 110 His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser 115 120 125 Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys 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Arg 545 550 555 560 Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu 565 570 575 Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val 580 585 590 Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu 595 600 605 Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp 610 615 620 Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val 625 630 635 640 Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp 645 650 655 Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe 660 665 670 Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr 675 680 685 Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro 690 695 700 Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly 705 710 715 720 Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp 725 730 735 Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys 740 745 750 Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val 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Leu 965 970 975 Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His 980 985 990 Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe 995 1000 1005 Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn 1010 1015 1020 Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys 1025 1030 1035 Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr 1040 1045 1050 Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr 1055 1060 1065 Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe 1070 1075 1080 Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met 1085 1090 1095 Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met 1100 1105 1110 Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly 1115 1120 1125 Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser 1130 1135 1140 Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg 1145 1150 1155 Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro 1160 1165 1170 Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser 1175 1180 1185 Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro 1190 1195 1200 Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe 1205 1210 1215 Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp 1220 1225 1230 Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu 1235 1240 1245 Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn 1250 1255 1260 Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro 1265 1270 1275 Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly 1280 1285 1290 Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys 1295 1300 1305 Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn 1310 1315 1320 Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln 1325 1330 1335 Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu 1340 1345 1350 Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val 1355 1360 1365 Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys 1370 1375 1380 Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu 1385 1390 1395 Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp 1400 1405 1410 Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr 1415 1420 1425 Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala 1430 1435 1440 Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr 1445 1450 1455 <210> 2 <211> 5132 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct gcggcctaag cttggaacca ttgccacctt cagggggagg ctgctggtga 180 atattaacca agatcacccc agttaccgga ggagcaaaca gggactaagt tcacacgcgt 240 ggtaccgtct gtctgcacat ttcgtagagc gagtgttccg atactctaat ctccctaggc 300 aaggttcata tttgtgtagg ttacttattc tccttttgtt gactaagtca ataatcagaa 360 tcagcaggtt tggagtcagc ttggcaggga tcagcagcct gggttggaag gagggggtat 420 aaaagcccct tcaccaggag aagccgtcac acagatccac aagctcctga agaggtaagg 480 gtttaagtta tcgttagttc gtgcaccatt aatgtttaat tacctggagc acctgcctga 540 aatcattttt ttttcaggtt ggctagtatg cagatcgagc tctccacctg cttctttctg 600 tgcctgttga gattctgctt cagcgccacc aggagatact acctgggggc tgtggagctg 660 agctgggact acatgcagtc tgacctgggg gagctgcctg tggatgccag gttccccccc 720 agagtgccca agagcttccc cttcaacacc tctgtggtgt acaagaagac cctgtttgtg 780 gagttcactg accacctgtt caacattgcc aagcccaggc ccccctggat gggcctgctg 840 ggccccacca tccaggctga ggtgtatgac actgtggtga tcaccctgaa gaacatggcc 900 agccaccctg tgagcctgca tgctgtgggg gtgagctact ggaaggcctc tgagggggct 960 gagtatgatg accagaccag ccagagggag aaggaggatg acaaggtgtt ccctgggggc 1020 agccacacct atgtgtggca ggtgctgaag gagaatggcc ccatggcctc tgaccccctg 1080 tgcctgacct acagctacct gagccatgtg gacctggtga aggacctgaa ctctggcctg 1140 attggggccc tgctggtgtg cagggagggc agcctggcca aggagaagac ccagaccctg 1200 cacaagttca tcctgctgtt tgctgtgttt gatgagggca agagctggca ctctgaaacc 1260 aagaacagcc tgatgcagga cagggatgct gcctctgcca gggcctggcc caagatgcac 1320 actgtgaatg gctatgtgaa caggagcctg cctggcctga ttggctgcca caggaagtct 1380 gtgtactggc atgtgattgg catgggcacc acccctgagg tgcacagcat cttcctggag 1440 ggccacacct tcctggtcag gaaccacagg caggccagcc tggagatcag ccccatcacc 1500 ttcctgactg cccagaccct gctgatggac ctgggccagt tcctgctgtt ctgccacatc 1560 agcagccacc agcatgatgg catggaggcc tatgtgaagg tggacagctg ccctgaggag 1620 ccccagctga ggatgaagaa caatgaggag gctgaggact atgatgatga cctgactgac 1680 tctgagatgg atgtggtgag gtttgatgat gacaacagcc ccagcttcat ccagatcagg 1740 tctgtggcca agaagcaccc caagacctgg gtgcactaca ttgctgctga ggaggaggac 1800 tgggactatg cccccctggt gctggcccct gatgacagga gctacaagag ccagtacctg 1860 aacaatggcc cccagaggat tggcaggaag tacaagaagg tcaggttcat ggcctacact 1920 gatgaaacct tcaagaccag ggaggccatc cagcatgagt ctggcatcct gggccccctg 1980 ctgtatgggg aggtggggga caccctgctg atcatcttca agaaccaggc cagcaggccc 2040 tacaacatct acccccatgg catcactgat gtgaggcccc tgtacagcag gaggctgccc 2100 aagggggtga agcacctgaa ggacttcccc atcctgcctg gggagatctt caagtacaag 2160 tggactgtga ctgtggagga tggccccacc aagtctgacc ccaggtgcct gaccagatac 2220 tacagcagct ttgtgaacat ggagagggac ctggcctctg gcctgattgg ccccctgctg 2280 atctgctaca aggagtctgt ggaccagagg ggcaaccaga tcatgtctga caagaggaat 2340 gtgatcctgt tctctgtgtt tgatgagaac aggagctggt acctgactga gaacatccag 2400 aggttcctgc ccaaccctgc tggggtgcag ctggaggacc ctgagttcca ggccagcaac 2460 atcatgcaca gcatcaatgg ctatgtgttt gacagcctgc agctgtctgt gtgcctgcat 2520 gaggtggcct actggtacat cctgagcatt ggggcccaga ctgacttcct gtctgtgttc 2580 ttctctggct acaccttcaa gcacaagatg gtgtatgagg acaccctgac cctgttcccc 2640 ttctctgggg agactgtgtt catgagcatg gagaaccctg gcctgtggat tctgggctgc 2700 cacaactctg acttcaggaa caggggcatg actgccctgc tgaaagtctc cagctgtgac 2760 aagaacactg gggactacta tgaggacagc tatgaggaca tctctgccta cctgctgagc 2820 aagaacaatg ccattgagcc caggagcttc agccagaatc cacccgtcct taagcgccat 2880 cagcgcgaga tcaccaggac caccctgcag tctgaccagg aggagattga ctatgatgac 2940 accatctctg tggagatgaa gaaggaggac tttgacatct acgacgagga cgagaaccag 3000 agccccagga gcttccagaa gaagaccagg cactacttca ttgctgctgt ggagaggctg 3060 tgggactatg gcatgagcag cagcccccat gtgctgagga acagggccca gtctggctct 3120 gtgccccagt tcaagaaggt ggtgttccag gagttcactg atggcagctt cacccagccc 3180 ctgtacagag gggagctgaa tgagcacctg ggcctgctgg gcccctacat cagggctgag 3240 gtggaggaca acatcatggt gaccttcagg aaccaggcca gcaggcccta cagcttctac 3300 agcagcctga tcagctatga ggaggaccag aggcaggggg ctgagcccag gaagaacttt 3360 gtgaagccca atgaaaccaa gacctacttc tggaaggtgc agcaccacat ggcccccacc 3420 aaggatgagt ttgactgcaa ggcctgggcc tacttctctg atgtggacct ggagaaggat 3480 gtgcactctg gcctgattgg ccccctgctg gtgtgccaca ccaacaccct gaaccctgcc 3540 catggcaggc aggtgactgt gcaggagttt gccctgttct tcaccatctt tgatgaaacc 3600 aagagctggt acttcactga gaacatggag aggaactgca gggccccctg caacatccag 3660 atggaggacc ccaccttcaa ggagaactac aggttccatg ccatcaatgg ctacatcatg 3720 gacaccctgc ctggcctggt gatggcccag gaccagagga tcaggtggta cctgctgagc 3780 atgggcagca atgagaacat ccacagcatc cacttctctg gccatgtgtt cactgtgagg 3840 aagaaggagg agtacaagat ggccctgtac aacctgtacc ctggggtgtt tgagactgtg 3900 gagatgctgc ccagcaaggc tggcatctgg agggtggagt gcctgattgg ggagcacctg 3960 catgctggca tgagcaccct gttcctggtg tacagcaaca agtgccagac ccccctgggc 4020 atggcctctg gccacatcag ggacttccag atcactgcct ctggccagta tggccagtgg 4080 gcccccaagc tggccaggct gcactactct ggcagcatca atgcctggag caccaaggag 4140 cccttcagct ggatcaaggt ggacctgctg gcccccatga tcatccatgg catcaagacc 4200 cagggggcca ggcagaagtt cagcagcctg tacatcagcc agttcatcat catgtacagc 4260 ctggatggca agaagtggca gacctacagg ggcaacagca ctggcaccct gatggtgttc 4320 tttggcaatg tggacagctc tggcatcaag cacaacatct tcaacccccc catcattgcc 4380 agatacatca ggctgcaccc cacccactac agcatcagga gcaccctgag gatggagctg 4440 atgggctgtg acctgaacag ctgcagcatg cccctgggca tggagagcaa ggccatctct 4500 gatgcccaga tcactgccag cagctacttc accaacatgt ttgccacctg gagccccagc 4560 aaggccaggc tgcatctgca gggcaggagc aatgcctgga ggccccaggt caacaacccc 4620 aaggagtggc tgcaggtgga cttccagaag accatgaagg tgactggggt gaccacccag 4680 ggggtgaaga gcctgctgac cagcatgtat gtgaaggagt tcctgatcag cagcagccag 4740 gatggccacc agtggaccct gttcttccag aatggcaagg tgaaggtgtt ccagggcaac 4800 caggacagct tcacccctgt ggtgaacagc ctggaccccc ccctgctgac cagatacctg 4860 aggattcacc cccagagctg ggtgcaccag attgccctga ggatggaggt gctgggctgt 4920 gaggcccagg acctgtactg aggatccaat aaaatatctt tattttcatt acatctgtgt 4980 gttggttttt tgtgtgtttt cctgtaacga tcgggctcga gcgcaggaac ccctagtgat 5040 ggagttggcc actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgccc gggctttgcc 5100 cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc ag 5132

Claims

재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 벡터,
염화나트륨 (NaCl),
염화칼륨 (KCl),
인산이나트륨 (Na₂HPO₄),
인산일칼륨 (KH₂PO₄),
염화마그네슘 (MgCl₂),
폴리올, 및
폴록사머
를 포함하며,
임의로 약 0.1 mM 이하의 염화칼슘을 포함하고 약 7.1 내지 약 7.5의 pH를 갖는 제약 조성물.
제1항에 있어서, 폴리올이 수크로스인 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 폴록사머가 폴록사머 188인 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 약 0.1 내지 약 2.0 mM 염화마그네슘을 함유하는 조성물.
제4항에 있어서, 약 0.5 mM 이상의 염화마그네슘을 함유하는 조성물.
제4항에 있어서, 약 1.4 mM 염화마그네슘을 함유하는 조성물.
제4항에 있어서, 약 1.3 mM 초과의 염화마그네슘을 함유하는 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 약 150 내지 약 200 mM, 임의로 약 172 mM, 염화나트륨을 함유하는 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 약 2.5 내지 약 3.0 mM, 임의로 약 2.7 mM, 염화칼륨을 함유하는 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 약 5 내지 약 10 mM, 임의로 약 8 mM, 인산이나트륨을 함유하는 조성물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1.0 내지 약 2.0 mM, 임의로 약 1.5 mM, 인산일칼륨을 함유하는 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 약 0.5% 내지 약 2% (w/v), 임의로 약 1% (w/v), 수크로스를 함유하는 조성물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 약 0.01% 내지 약 0.1% (w/v), 임의로 약 0.05% (w/v), 폴록사머 188을 함유하는 조성물.
재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 벡터,
약 171.81 mM 염화나트륨,
약 2.68 mM 염화칼륨,
약 8.10 mM 인산이나트륨,
약 1.47 mM 인산일칼륨,
약 1.40 mM 염화마그네슘,
약 1.00% (w/v) 수크로스, 및
약 0.05% (w/v) 폴록사머 188
을 포함하며,
임의로 약 0.1 mM 이하의 염화칼슘을 포함하고 약 7.1 내지 약 7.5의 pH를 갖는 제약 조성물.
재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 벡터,
약 172 mM 염화나트륨,
약 2.68 mM 염화칼륨,
약 8.10 mM 인산이나트륨,
약 1.47 mM 인산일칼륨,
약 0.49 mM 염화마그네슘,
약 1.00% (w/v) 수크로스, 및
약 0.05% (w/v) 폴록사머 188
을 포함하며,
임의로 약 0.1 mM 이하의 염화칼슘을 포함하고 약 7.1 내지 약 7.5의 pH를 갖는 제약 조성물.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV가 치료 단백질에 대한 발현 카세트를 포함하는 게놈을 포함하는 것인 제약 조성물.
제16항에 있어서, 치료 단백질이 인간 인자 VIII 폴리펩티드인 조성물.
재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 벡터이며, 여기서 rAAV가 인간 인자 VIII 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트를 포함하는 게놈을 포함하는 것인, rAAV 벡터,
약 171.81 mM 염화나트륨,
약 2.68 mM 염화칼륨,
약 8.10 mM 인산이나트륨,
약 1.47 mM 인산일칼륨,
약 1.40 mM 염화마그네슘,
약 1.00% (w/v) 수크로스, 및
약 0.05% (w/v) 폴록사머 188
을 포함하며,
임의로 약 0.1 mM 이하의 염화칼슘을 포함하고 약 7.1 내지 약 7.5의 pH를 갖는 제약 조성물.
재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 벡터이며, 여기서 rAAV가 인간 인자 VIII 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트를 포함하는 게놈을 포함하는 것인, rAAV 벡터,
약 172 mM 염화나트륨,
약 2.68 mM 염화칼륨,
약 8.10 mM 인산이나트륨,
약 1.47 mM 인산일칼륨,
약 0.49 mM 염화마그네슘,
약 1.00% (w/v) 수크로스, 및
약 0.05% (w/v) 폴록사머 188
을 포함하며,
임의로 약 0.1 mM 이하의 염화칼슘을 포함하고 약 7.1 내지 약 7.5의 pH를 갖는 제약 조성물.
제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 인자 VIII 폴리펩티드가 서열식별번호: 1을 포함하는 것인 조성물.
제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV의 게놈이 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 131-5,024를 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, mL당 약 1.0E+12 내지 약 1.0E+14 벡터 게놈 (vg), 임의로 mL당 약 1.0E+13 내지 약 5.0E+13 vg의 rAAV를 함유하는 조성물.
제22항에 있어서, mL당 약 1.0E+13 vg을 함유하는 조성물.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV가 AAV6 캡시드 단백질, 임의로 AAV2의 역위 말단 반복부 (ITR)를 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 조성물 5-10 mL, 임의로 6.4 mL를 포함하는 바이알.
제25항에 있어서, 시클로-올레핀 공중합체로 제조되는 바이알.
제25항 또는 제26항에 있어서, 제 위치에 열가소성 엘라스토머 마개를 갖는 바이알.
치료 단백질을 필요로 하는 환자에게 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 치료 단백질을 필요로 하는 환자를 치료하는 방법.
인자 VIII의 혈청 수준의 증가를 필요로 하는 인간 대상체에게 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항의 제약 조성물, 또는 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항의 바이알의 전체 내용물을 정맥내 투여하는 것을 포함하는, 인자 VIII의 혈청 수준의 증가를 필요로 하는 인간 대상체에서 인자 VIII의 혈청 수준을 증가시키는 방법.
제29항에 있어서, 인간 대상체가 혈우병 A를 갖는 것인 방법.
혈우병 A의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에게 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항의 제약 조성물, 또는 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항의 바이알의 전체 내용물을 정맥내 투여하는 것을 포함하는, 혈우병 A의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 혈우병 A를 치료하는 방법.
제28항 내지 제31항 중 어느 한 항의 방법에서 인간 대상체를 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 제약 조성물의 용도.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항의 방법에서 인간 대상체를 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물.